JP2022121640A - Novel strains of pseudozyma antarctica - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）の新規菌株及び栄養要求性変異株、及び、それらの菌株に由来する目的のタンパク質を発現するＰ．アンタクティカの形質転換体及びそれを用いた目的のタンパク質の生産方法、並びに、安定化された生分解性プラスチック分解酵素を取得する方法に関する。 The present invention provides novel strains and auxotrophic mutants of Pseudozyma antarctica, and P. elegans expressing proteins of interest derived from those strains. The present invention relates to a transformant of Antactica, a method for producing a target protein using the transformant, and a method for obtaining a stabilized biodegradable plastic-degrading enzyme.
葉面から取得できる多くの酵母が、生分解性プラスチック分解能力を有することが見出されている（特許文献１）。これらのうちシュードザイマ属の葉面酵母が優れており、中でもＰ．アンタクティカは、生分解性プラスチック分解能力が特に優れており、この酵母から生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥが、単離同定されている（非特許文献１）。そして、ＰａＥ生産能の高い菌株を用いて、ＰａＥを大量生産する技術も開発されている（特許文献２）。さらに、Ｐ．アンタクティカに遺伝子導入し、異種タンパク質を製造することも試みられている（特許文献３）。 Many yeasts obtainable from foliage have been found to have the ability to decompose biodegradable plastics (Patent Document 1). Among these, foliar yeast of the genus Pseudozyma is superior, and among them P. Antactica has a particularly excellent ability to decompose biodegradable plastics, and a biodegradable plastic degrading enzyme PaE has been isolated and identified from this yeast (Non-Patent Document 1). A technique for mass-producing PaE using a strain with high PaE-producing ability has also been developed (Patent Document 2). Furthermore, P.I. An attempt has also been made to introduce a gene into Antactica to produce a heterologous protein (Patent Document 3).
また、外来の遺伝子を組換えた微生物を培養してタンパク質を生産する場合には、当該組換え微生物の漏洩を完全に抑えるための設備と生産、精製、及び廃液処理の工程が求められているため、慎重な取り扱いが必要であるとともに、特に規模が大きい場合に一般的に用いられる微生物除去のための濾過の工程では、微生物を完全除去したという証明が困難で、さらなる精製工程で除菌する必要がある。一方、宿主となる微生物自身の遺伝子を利用してクローニングしたセルフクローニング株を利用してタンパク質を生産する場合には、上記設備の設置や生産工程などで、その微生物は、組換え体としての管理は必要とされず、野生株と同等に扱うことが可能となる。 In addition, when a foreign gene-recombined microorganism is cultured to produce a protein, facilities and processes for production, purification, and waste liquid treatment are required to completely prevent leakage of the recombinant microorganism. Therefore, careful handling is required, and it is difficult to prove that microorganisms have been completely removed in the filtration process, which is commonly used to remove microorganisms, especially when the scale is large. There is a need. On the other hand, when producing a protein using a self-cloning strain cloned using the host microorganism's own genes, the microorganism is managed as a recombinant during the installation of the above equipment and production process. is not required and can be treated in the same way as wild strains.
生分解性プラスチック分解能力を有する酵母の従来の培養方法では、当該酵母の培養液に対し高い通気量が必要とされ、通気量が少なくなると酵素生産性が低下するという問題があった。通気にかかるコストは、培養にかかる電気コストに占める割合が非常に大きく、かつ培養装置の容量を大きくした場合には通気量を増大させることには、技術的な限界がある。したがって、低通気量でも生分解性プラスチック分解酵素などのタンパク質を効率よく生産するＰ．アンタクティカの新規菌株が求められている。 A conventional method for culturing yeast capable of decomposing biodegradable plastics requires a high aeration rate for the yeast culture solution, and there is a problem that enzyme productivity decreases when the aeration rate decreases. The cost for aeration accounts for a very large proportion of the cost of electricity for culture, and there is a technical limit to increasing the amount of aeration when the capacity of the culture apparatus is increased. Therefore, P. elegans, which efficiently produces proteins such as biodegradable plastic-degrading enzymes, even at low aeration. There is a need for new strains of Antactica.
また、Ｐ．アンタクティカを外来遺伝子由来のタンパク質を製造する宿主として利用するために、抗生物質耐性遺伝子と目的のタンパク質を発現する遺伝子カセットを含むプラスミドを導入して、抗生物質を用いた培地上に生育する形質転換体を選択した場合、この従来の方法で取得した形質転換体を、当該抗生物質を含まない培地中で培養をすると、一度は導入されたプラスミドが培養中に菌体から抜け落ちる。この問題を解決するために、Ｐ．アンタクティカの染色体上に抗生物質耐性遺伝子と目的のタンパク質を発現する遺伝子カセットを挿入した場合は、抗生物質を含まない培地でも遺伝子が保持されることが期待できる。しかし、実際には培養後の細胞に挿入した遺伝子が見つからない場合が多かった。これは、従来の偽菌糸を形成するＰ．アンタクティカでは、遺伝子が導入された１細胞を単離することが難しいため、又は、Ｐ．アンタクティカが増殖する過程で当該導入遺伝子を含まない細胞の増殖が優勢になるためであると考えられた。このように、従来は、形質転換体から安定して外来遺伝子由来のタンパク質を生産することができなかった。Ｐ．アンタクティカのセルフクローニング株を作製するための栄養要求性変異株を作製する際にも同様であり、従来の菌株を親株として利用していた場合には、おそらく偽菌糸を形成して増殖する過程で、遺伝子の欠損を含まないゲノムを有する菌体の増殖が優勢となることで、野生型のゲノムを有する菌株しか得ることができなかった。したがって、導入した遺伝子又は変異のある遺伝子を安定して維持できるＰ．アンタクティカの新規菌株が求められている。 Also, P.I. In order to use Antactica as a host for producing a protein derived from a foreign gene, a plasmid containing an antibiotic resistance gene and a gene cassette that expresses the target protein is introduced and transformed to grow on a medium using antibiotics. When the strain is selected, if the transformant obtained by this conventional method is cultured in a medium that does not contain the antibiotic, the once-introduced plasmid will drop out of the strain during the culture. To solve this problem, P.S. When an antibiotic resistance gene and a gene cassette expressing a target protein are inserted into the chromosome of Antactica, it can be expected that the gene will be retained even in a medium containing no antibiotics. In practice, however, there were many cases in which the inserted gene was not found in cells after culture. This is due to the fact that the conventional pseudohyphae-forming P. Since it is difficult to isolate a single transfected cell in P. antactica, This is thought to be due to the fact that the growth of cells not containing the transgene becomes dominant during the growth process of Antactica. Thus, conventionally, it has not been possible to stably produce foreign gene-derived proteins from transformants. P. The same is true when creating auxotrophic mutants for creating self-cloning strains of Antactica. However, only strains with wild-type genomes could be obtained due to the dominant proliferation of bacterial cells with genomes that do not contain gene deletions. Therefore, P. cerevisiae capable of stably maintaining introduced genes or mutated genes. There is a need for new strains of Antactica.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、タンパク質を効率よく発現し、かつ導入した遺伝子又は変異のある遺伝子を安定して維持できる（すなわち栄養要求性変異株及び形質転換体などの菌株の作製が可能である）Ｐ．アンタクティカの新規菌株を見出し、本発明を完成させた。そして、当該新規菌株の特性や変異株取得の培養条件を検討した結果、Ｐ．アンタクティカ以外のシュードザイマ属菌についても、従来実現されていなかった栄養要求性変異株及び形質転換体の作製が可能となった。また、一連の実験の過程で、生分解性プラスチック分解酵素を安定化する方法を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示すＰ．アンタクティカの新規菌株及びその栄養要求性変異株、及び、シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株、並びに、それらの菌株に由来し目的のタンパク質を発現するシュードザイマ属菌の形質転換体及びそれを用いた目的のタンパク質の生産方法、並びに、生分解性プラスチック分解酵素を安定化する方法を提供するものである。
〔１〕シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）ＧＢ－４（０）株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９２）。
〔２〕シュードザイマ・アンタクティカＧＢ－４（０）株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９２）の栄養要求性変異株。
〔３〕リジン要求性又はウラシル要求性である、前記〔２〕に記載の栄養要求性変異株。
〔４〕シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株であって、ＬＹＳ２、ＬＹＳ１２、及び／又はＬＹＳ２０の塩基配列の少なくとも一部に変異を有するか、又は、ＵＲＡ３及び／又はＵＲＡ５の塩基配列の少なくとも一部に変異を有することを特徴とする、栄養要求性変異株。
〔５〕ＬＹＳ１２タンパク質のＭｅｔ１～Ｇｌｕ１９５をコードする遺伝子の少なくとも一部の欠失を有するか、又は、ＵＲＡ３塩基配列の１１３番目のＣの置換、８６７番目のＣの置換、及び／又は６１４番目のＴの欠失を有する、前記〔４〕に記載の栄養要求性変異株。
〔６〕前記シュードザイマ属菌が、偽菌糸を形成しないシュードザイマ属の菌株である、前記〔４〕又は〔５〕に記載の栄養要求性変異株。
〔７〕目的のタンパク質を発現するシュードザイマ属菌の形質転換体であって、
前記形質転換体が、栄養要求性変異株の形質転換体であり、
前記形質転換体が、遺伝子カセットを少なくとも１つ有し、
前記遺伝子カセットが、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置していることを特徴とする、形質転換体。
〔８〕前記目的のタンパク質が、シュードザイマ属菌のタンパク質、又は、シュードザイマ属菌以外の生物のタンパク質である、前記〔７〕に記載の形質転換体。
〔９〕前記目的のタンパク質をコードする遺伝子で使用されているコドンが、シュードザイマ属菌が使用するコドンに最適化されている、前記〔７〕又は〔８〕に記載の形質転換体。
〔１０〕シュードザイマ・アンタクティカＧＢ－４（０）Ｌ１－Ｓ１２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９３）、ＧＢ－４（０）ＰＧＢ４８０株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６３８）、ＧＢ－４（０）ＰＧＢ４６９株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６３９）、及びＧＢ－４（０）ＰＧＢ４７４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６４０）からなる群から選択される、シュードザイマ・アンタクティカの形質転換体。
〔１１〕目的のタンパク質を生産する方法であって、
シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株を用意する工程、
前記栄養要求性変異株に、遺伝子カセットを少なくとも１つ導入する工程、及び、
前記遺伝子カセットを導入した栄養要求性変異株を培養して、前記目的のタンパク質を生産する工程、
を含み、
前記遺伝子カセットが、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置していることを特徴とする、方法。
〔１２〕安定化された生分解性プラスチック分解酵素を取得する方法であって、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加して、前記生分解性プラスチック分解酵素を安定化する又は沈殿させる工程、及び、
前記安定化した又は沈殿した生分解性プラスチック分解酵素を回収する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
〔１３〕前記エタノール添加工程の前に、前記生分解性プラスチック分解酵素を濃縮する工程をさらに含む、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕前記生分解性プラスチック分解酵素を、前記〔１１〕に記載の方法に従って生産する工程をさらに含む、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の方法。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that they can efficiently express proteins and stably maintain introduced genes or mutated genes (that is, auxotrophic mutants and transformants). It is possible to prepare strains such as P. A new strain of Antactica was discovered, and the present invention was completed. Then, as a result of examining the characteristics of the new strain and the culture conditions for acquiring the mutant strain, P. For Pseudozyma spp. other than Antactica, it has become possible to produce auxotrophic mutants and transformants, which had not been realized before. Also, in the course of a series of experiments, they discovered a method for stabilizing biodegradable plastic-degrading enzymes, and completed the present invention. That is, the present invention provides the following P.I. A new strain of Antactica, an auxotrophic mutant thereof, an auxotrophic mutant of Pseudozyma, and a transformant of Pseudozyma that expresses a target protein derived from these strains, and using the same A method for producing a target protein and a method for stabilizing a biodegradable plastic-degrading enzyme are provided.
[1] Pseudozyma antarctica strain GB-4(0) (accession number NITE P-02392).
[2] An auxotrophic mutant strain of Pseudozyma antactica GB-4(0) (accession number NITE P-02392).
[3] The auxotrophic mutant of [2] above, which is auxotrophic for lysine or uracil.
[4] An auxotrophic mutant strain of the genus Pseudozyma, which has a mutation in at least part of the nucleotide sequence of LYS2, LYS12, and/or LYS20, or at least one of the nucleotide sequences of URA3 and/or URA5 An auxotrophic mutant characterized by having a mutation in the region.
[5] having a deletion of at least part of the gene encoding Met1 to Glu195 of the LYS12 protein, or substitution of the 113th C, the 867th C of the URA3 nucleotide sequence, and/or the 614th The auxotrophic mutant of [4] above, which has a T deletion.
[6] The auxotrophic mutant according to [4] or [5] above, wherein the Pseudozyma genus fungus is a strain of the genus Pseudozyma that does not form pseudohyphae.
[7] A transformant of the genus Pseudozyma that expresses a protein of interest,
the transformant is a transformant of an auxotrophic mutant,
the transformant has at least one gene cassette;
The gene cassette comprises a gene encoding the protein of interest, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant, and encodes the protein of interest. A transformant, wherein the gene is located downstream of the promoter.
[8] The transformant according to [7] above, wherein the target protein is a Pseudozyma protein or a protein from an organism other than Pseudozyma.
[9] The transformant of [7] or [8] above, wherein the codons used in the gene encoding the protein of interest are optimized for codons used by Pseudozyma spp.
[10] Pseudozyma antactica GB-4(0) L1-S12 strain (accession number NITE P-02393), GB-4(0) PGB480 strain (accession number NITE P-02638), GB-4(0) PGB469 strain (Accession No. NITE P-02639), and GB-4(0) strain PGB474 (Accession No. NITE P-02640).
[11] A method for producing a protein of interest, comprising:
preparing an auxotrophic mutant of Pseudozyma spp.
introducing at least one gene cassette into the auxotrophic mutant; and
culturing the auxotrophic mutant into which the gene cassette has been introduced to produce the desired protein;
including
The gene cassette comprises a gene encoding the protein of interest, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant, and encodes the protein of interest. A method, characterized in that the gene is located downstream of said promoter.
[12] A method for obtaining a stabilized biodegradable plastic-degrading enzyme,
preparing a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme;
adding ethanol to a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme to stabilize or precipitate the biodegradable plastic-degrading enzyme;
recovering the stabilized or precipitated biodegradable plastic-degrading enzyme;
A method, comprising:
[13] The method according to [12] above, further comprising a step of concentrating the biodegradable plastic-degrading enzyme before the step of adding ethanol.
[14] The method according to [12] or [13] above, further comprising the step of producing the biodegradable plastic-degrading enzyme according to the method according to [11] above.
本発明に従えば、Ｐ．アンタクティカの新規菌株により、安定な形質転換体又は安定な栄養要求性変異株の作製が可能となる。また、Ｐ．アンタクティカ以外のシュードザイマ属菌の栄養要求性変異株の作製も可能となる。そして、種々のシュードザイマ属菌の栄養要求性変異株により、抗生物質耐性遺伝子に頼らない形質転換体の作製又はセルフクローニング株の作製が可能となる。さらに、目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含む遺伝子カセットであって、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置している遺伝子カセットを、シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株に導入することにより、目的のタンパク質を効率的に生産することができる。加えて、生分解性プラスチック分解酵素の精製にエタノールを使用することで、生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液の殺菌効果と共在する他のタンパク質の変性が期待でき、当該溶液中への形質転換体の混入を防止するとともに、当該溶液の安定性を向上することができる。 According to the invention, P. New strains of Antactica allow the generation of stable transformants or stable auxotrophic mutants. Also, P.I. It is also possible to produce auxotrophic mutants of Pseudozyma spp. other than Antactica. Various auxotrophic mutant strains of the genus Pseudozyma enable preparation of transformants or self-cloning strains that do not rely on antibiotic resistance genes. Furthermore, a gene cassette comprising a gene encoding a protein of interest, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of an auxotrophic mutant, wherein the gene cassette encodes the protein of interest. A target protein can be efficiently produced by introducing a gene cassette in which a gene is located downstream of the promoter into an auxotrophic mutant strain of the genus Pseudozyma. In addition, by using ethanol to purify the biodegradable plastic-degrading enzyme, the sterilization effect of the solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme and the denaturation of other proteins that coexist can be expected. While preventing contamination of the transformant, the stability of the solution can be improved.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のシュードザイマ・アンタクティカ（Ｐ．アンタクティカ）の新規菌株は、ＧＢ－４（０）株であり、これは本件特許出願の直前に初めて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたものである（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９２）。本明細書に記載の「シュードザイマ・アンタクティカ」とは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素などを産生し得るものである。前記Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は、寄託されるまでは本発明者らの管理下で保管されており、たとえ譲渡の申出があったとしても本発明者らはその申出に応じる意志はなかったし、実際に他人に譲渡されたこともなかった。
The present invention will now be described in more detail.
The novel strain of Pseudozyma antactica (P. antactica) of the present invention is the GB-4(0) strain, which was first deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary just before the filing of the present patent application. (Accession No. NITE P-02392). The “Pseudozyma antactica” described in this specification is a type of Pseudozyma genus (yeast) that can inhabit the leaves of grasses such as rice and wheat, and produces biodegradable plastic-degrading enzymes. It is what you get. The P.I. The Antactica GB-4(0) strain was kept under the control of the inventors until it was deposited, and even if there was an offer of transfer, the inventors had no intention of accepting the offer. and was never actually transferred to another person.
ある態様では、本発明は、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の栄養要求性変異株に関する。本明細書に記載の「栄養要求性変異株」とは、突然変異により栄養要求性に変化が生じた菌株のことをいう。また、本明細書に記載の「突然変異」又は「変異」とは、特定の遺伝子において、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列に変化が生じるように、１以上の塩基が欠失、置換、及び／又は付加されることをいう。 In one aspect, the present invention provides P. It relates to an auxotrophic mutant of Antactica strain GB-4(0). The term "auxotrophic mutant strain" as used herein refers to a strain that has altered auxotrophy due to mutation. In addition, the term "mutation" or "mutation" as used herein refers to the deletion, substitution, substitution, or deletion of one or more bases in a specific gene so as to cause a change in the amino acid sequence of the protein encoded by the gene. and/or added.
本発明の栄養要求性変異株では、特定の栄養素（アミノ酸及び塩基など）を合成する酵素が機能していないため、当該栄養素が欠けている環境下では生育することができない。
前記栄養要求性変異株は、いずれの栄養に対する要求性が変化したものであってもよく、特に制限される必要はないが、例えば、リジン要求性又はウラシル要求性であってもよい。前記栄養要求性変異株がリジン要求性である場合には、当該変異株は、シュードザイマ属菌におけるリジンの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＬＹＳ４、ＬＹＳ９、ＬＹＳ１２、及び／又はＬＹＳ２０の塩基配列の少なくとも一部に変異を有していてもよい。前記栄養要求性変異株がウラシル要求性である場合には、当該変異株は、シュードザイマ属菌におけるウラシルの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、ＵＲＡ３及び／又はＵＲＡ５の塩基配列の少なくとも一部に変異を有していてもよい。Ｐ．アンタクティカのリジンの生合成に関わる酵素及びウラシルの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の塩基配列、並びにそれらの推定アミノ酸配列は、以下のとおりである。
In the auxotrophic mutant of the present invention, enzymes that synthesize specific nutrients (such as amino acids and bases) are not functioning, and therefore cannot grow in an environment lacking such nutrients.
The auxotrophic mutant strain may have altered auxotrophy to any nutrient, and is not particularly limited, and may be auxotrophic to lysine or uracil, for example. When the auxotrophic mutant is lysine auxotrophic, the mutant contains genes encoding enzymes involved in lysine biosynthesis in Pseudozyma spp., such as LYS1, LYS2, LYS4, LYS9, LYS12, / Or at least part of the nucleotide sequence of LYS20 may have mutations. When the auxotrophic mutant is uracil auxotrophic, the mutant has at least one nucleotide sequence of a gene encoding an enzyme involved in uracil biosynthesis in Pseudozyma spp., for example, URA3 and/or URA5. You may have a mutation in the part. P. Nucleotide sequences of genes encoding enzymes involved in lysine biosynthesis and enzymes involved in uracil biosynthesis in Antactica, and deduced amino acid sequences thereof are as follows.
・ＬＹＳ１の配列
ATGTCTGCCGCCGCCAACCGACAGCCCCTCTACCTCCGCTGCGAGATGAAGCCGGCCGAGCATCGTGCCGCGCTCACGCCCACCACCGCCAAGAAGCTCATCGAGGCCGGCTTCGACATCACCGTCGAGTCGGACCCGCAGCGCATCTTTGACGACAAGGAGTACGCCGACGTCGGCTGCACCATCGCCAAGCACAACACCTTCCACTCGCTCCCCAAGCACATCCCCATCATCGGCCTCAAGGAGCTCGAGGAGCCCGGTCCGGATCTGCCGCACACGCACATCCAGTTTGCGCACTGCTACAAGAAGCAGGCCGGCTGGGTCGACGTGCTCGGCCGCTTCAAGCGCGGCGGCGGAAAGCTCTACGATCTCGAGTTCCTCGAGGACAGCAACGGCCGTCGTGTCGCTGCGTTTGGCTGGCACGCCGGATTCGCCGGTGCGGCGCTCGGCCTGCTGGCGCTCGCCGAGCAGGTGCAGGGTGCCGAGCGCCGTCTGGGCCCGCAGAAGGCGTACCCGAACGAGCAGGCGCTCATCGCTCACGCCAAGCAGCAGATCGAGCACATCCGCAACTCGCGCGCCGACGGCAAGGTCAAGGCGCTCGTCGTGGGTGCGCTCGGCAGGTGCGGTCGGGGCGCCATCGACTTTTTCGAAAAGGCCGGCGTGGCGCCCGAAGACATTGTGCGCTGGGACATGAAGGAGACCTCGGCCAAGCACGGTCCGTACCAGGAGCTGCTCGACGTCGACATCTTTGTCAACTGCATCTACCTCACCTCCAAGATCCCGCCCTTCCTGGACGAGGCGACCATCCAAGCGGCGGGTGCCGAGCGCCGTCTCGGCGTGGTGGTGGACGTGTCGTGCGATACCACCAACCCCAACAACCCGCTGCCCATCTACAGCATCAACACCACCTTTGACAAGCCCACCGTCGACGTCGACACGGGTGCAGGCAACCCGGCGCTCAGCGTCATCTCGATCGACCACCTCCCCACGCTGCTCCCGCGCGAGAGCTCCGAGGGCTTCAGCAACGACCTCCTCCCCAGCCTGCTCCAGCTGCCCCTCGTGCTCGGCAAGGACACCACGCAGCTCGACACGCTCGAAGAGGGCAAGGGCGCCGTGTGGCAGCGCGCCGAAAAGCTCTTCCGACACCACCTCGCAGACGCAGAGAAGAACGGCGCCTGA（配列番号１）
・ＬＹＳ１タンパク質の推定アミノ酸配列
MSAAANRQPLYLRCEMKPAEHRAALTPTTAKKLIEAGFDITVESDPQRIFDDKEYADVGCTIAKHNTFHSLPKHIPIIGLKELEEPGPDLPHTHIQFAHCYKKQAGWVDVLGRFKRGGGKLYDLEFLEDSNGRRVAAFGWHAGFAGAALGLLALAEQVQGAERRLGPQKAYPNEQALIAHAKQQIEHIRNSRADGKVKALVVGALGRCGRGAIDFFEKAGVAPEDIVRWDMKETSAKHGPYQELLDVDIFVNCIYLTSKIPPFLDEATIQAAGAERRLGVVVDVSCDTTNPNNPLPIYSINTTFDKPTVDVDTGAGNPALSVISIDHLPTLLPRESSEGFSNDLLPSLLQLPLVLGKDTTQLDTLEEGKGAVWQRAEKLFRHHLADAEKNGA（配列番号２）
・Sequence of LYS1
(SEQ ID NO: 1)
・Deduced amino acid sequence of LYS1 protein
MSAAANRQPLYLRCEMKPAEHRAALTPTTAKKLIEAGFDITVESDPQRIFDDKEYADVGCTIAKHNTFHSLPKHIPIIGLKELEEPGPDLPHTHIQFAHCYKKQAGWVDVLGRFKRGGGKLYDLEFLEDSNGRRVAAFGWHAGFAGAALGLLALAEQVQGAERRLGPQKAYPNEQALIAHAKQQIEHIRNSRADGKVKALVVGALGRCGRGAIDFFEKAGVAPEDIVRWDMKETSAKHGPYQELLDVDIFVNCIYLTSKIPPFLDEATIQAAGAERRLGVVVDVSCDTTNPNNPLPIYSINTTFDKPTVDVDTGAGNPALSVISIDHLPTLLPRESSEGFSNDLLPSLLQLPLVLGKDTTQLDTLEEGKGAVWQRAEKLFRHHLADAEKNGA（配列番号２）
・ＬＹＳ２の配列
ATGGCGTCTTCCTCAGCGTTGCAGGCGAGCTTGGATCGATGGTCGGCGCGGCTGACCTCGCTTCCAAGCATCGCACTGCCCACCGACTATCCACGACCTGCCACCTCGCAGCTCGTACAGGCACTCTCGTCGTCGACGCTCTCCTCGGCCACAAGAAAGGACCTCGTGCGTCTGGCTCTCCACCACGAGCTCGACCTGCATCCCGCCGAGCACGCTGATGATGACGAGGACAACGCGAGCCCGACGCCGTTCCACCTGCTCCTCGCCGCGTTCTGCGTGCTCCTTCACCGATACACAGGCGACACGGACCTCGTCATTGGCTCGTCCAACCCATACACGGGCGAGCCTCTCATCCTCAGGATCCCCATCGAGCCCAACGATCCCTTCTGGCAGATCGTCCGCCGCATACAGCAGGTCGAGAAGGAGGCGGCCGCCGATGCCGTGCCGTACGACGAGATCGTCAAGCGCGTCGAGGCCGAGCGTGCCGAGCGAGAGGGCCCGCTGCCCGAAGGCGTGCAGAGCGCACCCATCTTCCGCGTCCGCTTCTTCGACGAGACAGGCGGCAAGGCTCGCAACTTCATGCAGTCGACATCGCTCACCACCGACCTCACCGTCTTCCTCACCAAGCCCGGTGCCACACCCGGCGACGACTCGGCCAACGCGGCCACCCCTGCGGAATCGGCCACGCCTTCGTCCCACACGTTCCGCGACTCGTTGGTGCCCAACATCGCCGTGCACCTGTCGTACAACTCGCTGCTCTTCTCCTCGCAGCGCATGCAGCTCATCCTCGCCCAGCTCTCCCAGCTCATCTCCGTCGCTGCATCCAACCCAGCCGCCGCCGTCGGCAGCCTGCCCATCCGCACGCCGCAAGAGAACGCATTCCTGCCGGACCCCACCAAGGACCTCGAGTGGTGCGGATTCCGCGGCGCCATCACACAGATCTTTGAGCGCAACGCACGCGCGCACCCGGACCGCAGGTGCATCGTCGAGTCGCTTGCCGACGACTCGGGCTCGCTCGCCGAGCCCTCGGCTCCGGCAAGCCGCGTGCGCGAAATCACCTACGGCCAGCTCGACCGCGCCTCCAACGTGGTCGCTCACCATCTCCTCCAGGCAGGTGTCCAGCGCGAGGAGGTCGTTACGACCTACGCCCACCGTGGTGTCGACCTCGTCGTCGCTGTTCTCGGTACGCTCAAGGCCGGCGCGACATTCAGCGTGATCGACCCGGCGTACCCGCCTTCGCGCCAGAACATCTACCTCCAGGTCGCCAAGCCTCGCGCCCTGATCGTGCTGGCCAAGGCAGGCGTCCTGCAGCCCTCGGTGCGCAAGTGCATCCAGGACGAGCTCGAACTCCGCACCGAGGTCCCAGCGCTCGAGCTGCTCGATGACGGCTCCGTTCGGGGTGGCGCTGCGTCGCAAGGCGGTGCTGATGTGCTCGAACAGCAGCAGGCGCTGGCGGGCGAGAGCACCAACGTCGTGCTGGGTCCCGACAGCGTGGGTACGCTCTCGTTCACCTCCGGATCCACCGGCATTCCCAAGGGTGTCAAGGGACGCCACTTTTCGCTCACCCACTTCTTCCCCTGGATGGGCGAGCGCTTCGGCCTCGGAGCGCACGAGCGATTCACCATGCTTTCCGGTATCGCCCACGACCCCATCCAGCGCGACATCTTCACTCCGCTCTTCTTTGGCGCCGAGCTGCACATCCCCACATCCGAGGATATCGGTACGCCTGGCCGTCTCGCCGAGTGGATGGCGGCGACCAAGGCGACCGTCACGCACCTCACCCCCGCCATGGGTCAGCTGCTGAGTGCGCAGGCGACGGCGCTGATCCCTTCGCTTCGCAACGCCTTCTTTGTGGGTGACGTGCTCACCAAGCGCGACTGCACGCGTCTGCAGGCGCTTGCCGCCAACGTCTGCATCATCAACATGTACGGCACCACCGAGACGCAGCGTGCGGTGAGCTACTTTGCCATCCCTCCCGTCAGCACCTCGACCACCTTCCTGCAGACGCAGAAGGACATCATGCCCGCCGGACAAGGAATGATCAACGTCCAGCTGCTCGTCGTCAACCGCAACGAGCGCACCGCCACCTGCGCCGTGGGCGAAGTCGGAGAGATCTACGTCCGCAGCGGTGGCTTGGCCGAGGGTTACCTTGGACCCCCGGAGGTGACGGCTGAAAAGTTCATGCCCAACTTCCTCGCGCCCAACCTCAGCTTCCCCGATACCATCAAGGACAAGCCCGAGGGTCAGTTCTGGAAGGGTATCCGCGACCGCATGTACAAGACGGGTGACCTGGGTCGCTACCTCGCCGACGGCACCGTCGAGTGCACGGGCCGTGCCGACGACCAGATCAAGATCCGCGGCTTCCGCATCGAGCTCGGCGAGATCGACACGCACCTTTCGCGCCACCCGCACGTGCGCGAGAACGTGACGCTCGTACGTCGCGACAAGGACGAGGAGAAGGTGCTCGTTTCTTACTTTGTGCCCGGCGCCGGTGCTGCCGAGTTCGAGGAGCAGGTCACCGAGGACGACGAGGGCGCAGCGGCGGCAGGAGGCAAGGCCGCCCGCGACGCCATGCTCGTCAAGGGCATGCGCCGTTACCGCACGCTCATCAAGGACATCCGCGACCACCTCAAGCGGAAGCTGCCGGCCTACTCGGTGCCGACGCTGTTCGTTCCGCTGCACAAGATGCCGCTCAACCCCAACGGCAAGATCGACAAGCCTGCGCTGCCCTTCCCCGACACCGCCATGGTGGCCGCTGTGGGCTCGGGCAGCTCGTCCGGTGGCAAGAACGGTGCGGACGCTGCGGCTGCGCTGGCGGCTGCTTCGCCAACCGAGCGCTCCGTAACGGAGCTATGGTCGCGATTGCTGCCCAACGCACCCTCGCCGATCCCGCTCGACGAGAGCTTCTTCGACCTCGGAGGCCACTCGATCCTGGCCACGCGCCTGGTGTTCGAGATGCGCAAGCAGTTTGTCATCAACGTGCCTCTTGGAGTTGTCTTCGACGCTCCCACTGTTCGAGGTCTCGCCAAGGCTGTCGACCAGCTGCGCCAGGCCGATCTTGGCCTGGGTGCTTCGCAAGCCAACGGTTCGGCGGCCTCGGCCAAGCCGAGCGAGGAGGCGAACCTGGACGAGAACTACGGCGCCGACGTGGCAACGCTGACGCCGAGCCTGCCCGAGTCGTTTGCGGGTGACAAGGTCAAGACGGCTGCGGCAGGACCACGCACCGTGCTGGTGACGGGTGTCACTGGCTTCTTGGGCGCCTTTATCCTGTACGACTTGCTGACCAAGCGCGCGTCGAGCGTTGCCAAGGTGTACGCGCATGTGCGAGCCAAGGACGAGGCGAACGCGCTCGAGCGTCTGCGCGAGGGCTGCAAGGGCCGAGGCATCTGGGACGACAAGTGGGTGAGCGAGGGACGTCTCGAGGTGGTTCTGGGTGACCTGGCGGCACCGCAGCGCCTGGGCATGTCGGAGGCGGTGTACGCCAAGCTGGCGGACGAGGTGGACGACATCCTGCACAACGGTGCTCTCGTGCACTGGGTGTACCCCTACAGCAAGCTGCGTGCTGCCAATGTGGGCTCGACGATCTGTGCGATCAAGCTGTGCAACACGGGCAAGAAGGCCAAGACGCTCACGTTCGTGTCGAGTACCTCGGCGCTGGATACCGACCACTACATCCGACTGTCGGACTCGATCGTGCACGGTCAGGACCCTGCGCAGAATGGATCGGCGGAGCAGCTGCACGGTGTGCCCGAGACGGACGACATCGAGGCCAACAGCCGCGGCCTCACCACGGGCTACGGTCAGTCCAAGTGGGTGGCAGAGAAGCTCATCATGATCGCTGCGTCGCGCGGACTCAAGGCGTCGATCGTTCGACCGGGCTACGTCGTGGGTGACTCCACGACGGCGGTGACCAACACGGACGACTTCCTCTGGCGTCTCGTCAAGGGCTCGATCCAGCTGGGCTTGGTCCCCGATATGCACAACCCGATCAACATGGTGCCCGTCGACCATGTGGCGAGGATCGCCACGCTGGCTTGCCTCAACAATGCGCTGGAGCTCGACACGATCAACAAGACGCCTGGCACCAACGCCAAGGTGTTCCACGTGACCAACCACCCGAGCATCCGATTCAACGACATGCTCGGCCAGCTCAGCCGCTACGGCTGGAGGGTGGAAAAGACCGAGTACGTGCACTGGCGCGCGAGGCTCGAGGAGCACGTGCTCAGCACGGGCTCGGGCTCGGTCGAGGACAACGCGCTGTTCCCGCTGCTGCACTTTGTGCTGGACGACTTGCCGACGTCGACCAAGTCGCCTGAGCTGGACGACCGCCACACGCAGGCGATCCTCGACGCTGCCTCCGAGGGCAAAGCCCAAGGCACGGTCATGGGCGTCGACCGCTCGCTCGTTGGGACGTACCTCGCCTGGCTGCTGGCGGTTGGCTTCCTGCCTGCGCCGTCGCAGGCGGATGCGGAACCGCTGCAGCTTGCCAACATCGGCACAGAGATGAAGGCCATCGGCCGTGGATCCGCCAACTAG（配列番号３）
・ＬＹＳ２タンパク質の推定アミノ酸配列
MASSSALQASLDRWSARLTSLPSIALPTDYPRPATSQLVQALSSSTLSSATRKDLVRLALHHELDLHPAEHADDDEDNASPTPFHLLLAAFCVLLHRYTGDTDLVIGSSNPYTGEPLILRIPIEPNDPFWQIVRRIQQVEKEAAADAVPYDEIVKRVEAERAEREGPLPEGVQSAPIFRVRFFDETGGKARNFMQSTSLTTDLTVFLTKPGATPGDDSANAATPAESATPSSHTFRDSLVPNIAVHLSYNSLLFSSQRMQLILAQLSQLISVAASNPAAAVGSLPIRTPQENAFLPDPTKDLEWCGFRGAITQIFERNARAHPDRRCIVESLADDSGSLAEPSAPASRVREITYGQLDRASNVVAHHLLQAGVQREEVVTTYAHRGVDLVVAVLGTLKAGATFSVIDPAYPPSRQNIYLQVAKPRALIVLAKAGVLQPSVRKCIQDELELRTEVPALELLDDGSVRGGAASQGGADVLEQQQALAGESTNVVLGPDSVGTLSFTSGSTGIPKGVKGRHFSLTHFFPWMGERFGLGAHERFTMLSGIAHDPIQRDIFTPLFFGAELHIPTSEDIGTPGRLAEWMAATKATVTHLTPAMGQLLSAQATALIPSLRNAFFVGDVLTKRDCTRLQALAANVCIINMYGTTETQRAVSYFAIPPVSTSTTFLQTQKDIMPAGQGMINVQLLVVNRNERTATCAVGEVGEIYVRSGGLAEGYLGPPEVTAEKFMPNFLAPNLSFPDTIKDKPEGQFWKGIRDRMYKTGDLGRYLADGTVECTGRADDQIKIRGFRIELGEIDTHLSRHPHVRENVTLVRRDKDEEKVLVSYFVPGAGAAEFEEQVTEDDEGAAAAGGKAARDAMLVKGMRRYRTLIKDIRDHLKRKLPAYSVPTLFVPLHKMPLNPNGKIDKPALPFPDTAMVAAVGSGSSSGGKNGADAAAALAAASPTERSVTELWSRLLPNAPSPIPLDESFFDLGGHSILATRLVFEMRKQFVINVPLGVVFDAPTVRGLAKAVDQLRQADLGLGASQANGSAASAKPSEEANLDENYGADVATLTPSLPESFAGDKVKTAAAGPRTVLVTGVTGFLGAFILYDLLTKRASSVAKVYAHVRAKDEANALERLREGCKGRGIWDDKWVSEGRLEVVLGDLAAPQRLGMSEAVYAKLADEVDDILHNGALVHWVYPYSKLRAANVGSTICAIKLCNTGKKAKTLTFVSSTSALDTDHYIRLSDSIVHGQDPAQNGSAEQLHGVPETDDIEANSRGLTTGYGQSKWVAEKLIMIAASRGLKASIVRPGYVVGDSTTAVTNTDDFLWRLVKGSIQLGLVPDMHNPINMVPVDHVARIATLACLNNALELDTINKTPGTNAKVFHVTNHPSIRFNDMLGQLSRYGWRVEKTEYVHWRARLEEHVLSTGSGSVEDNALFPLLHFVLDDLPTSTKSPELDDRHTQAILDAASEGKAQGTVMGVDRSLVGTYLAWLLAVGFLPAPSQADAEPLQLANIGTEMKAIGRGSAN（配列番号４）
・Sequence of LYS2
(SEQ ID NO: 3)
・Deduced amino acid sequence of LYS2 protein
(SEQ ID NO: 4)
・ＬＹＳ４の配列
ATGCGGCAGCAGCTGGCGGCTTCGGGGAAATGCCGAGATTGGGCTGCAGCCCACAACTCTCTTTTGAGCCACGTCCAAAGGCCCACTTTCAAATCGACACGAGAAGGCTTCTCCCTTCCTCCCATCCAAAGCACGACGCTTGCATTGCCGCTTCTCACCACTACCTCGCTCCGCATCGCCCAGCGTCGCATCATCATGAGGGCTGCAAACATGCTGCGCCTCGGCGCTTCCCGGCTCTCGACGCCGCTGCTTCGTCGCAGCCTCGCCACGCACGCTGCGGTCAACCCGGCTAGCGGCACGTACAACCTCGTCGAAAAGATCGTGCAGAAGTACGCCGTGGACCAAGCGCCAGGATCGCACGTCAAGTCGGGTGACTACGTCTCCATCCGCCCCGGCACCGTCATGACGCACGACAACACCGGGCCCGTCATCTCCAAGTTCGGCTCGATCGGCGCCACGTCGATCTACAACCCGGACCAGGTGGTGTTTGCGCTGGACCACGACGTGCAGAACAAGTCGGCCAAGAACCTGGAAAAGTACAGCAAGATCGAGAGCTTTGCGCGCAAGCATGGTATCGACTTTTACCCTGCCGGGCGCGGTATCGGCCACCAGGTGCTGGTCGAGGAGGGCTATGCTTTCCCGCAGACGCTGGCGGTGGCAAGTGACTCGCACTCCAACATGTACGGCGGTGTCGGCTGTCTCGGTACACCCATCGTGCGCACGGATGCGGCGGCGATCTGGGCGACCGGCCAGACATGGTGGCAGATCCCCGAGGTGGTCAAGGTCGAGCTCAAGGGTCAGCTGCCCAAGGGTGTCACTGGCAAGGATGTGATCGTGGCGCTCTGCGGCTACTTCAACCAAGACCAGGTGCTGAATGCTGCCATCGAGTTCCACGGCTCAGGTCTTTCTGCGCTCTCGATCGAGGAGAGGCTGGCGATTGCCAACATGACCACCGAATGGGGTGCGCTTGCTGGTCTCTTCCCCACGGACGACGTCACGCTCGGCTGGTACGAGAAGCAGATCCGCAAGCGCGACAAGCTCGAGTTCCAGATCGGCTCGTCGCCCTCGCCGTCCGGCTCACACCCGCGTCTGAACATGCACCGACTCGACGAGCTCTCGCGCACGCTCCTCCGCCCGGATGCCGACGCGCTCTACTCGAAGCACCTCACGCTCGACCTCGCCACGCTCGTCCCGCACGTGAGCGGGCCGAACTCGGTCAAGGTGTCGACGCCGCTCGACGAGCTGGCGCACCAGAACATCGCCATCAACAAGGCGTATCTCGTGTCGTGCGTCAACTCGCGCGCGTCCGATCTCAAGGCGGCCGCCGACGTCATCCGCGGCAAGAAGGTCGCCAAGGGCGTCGAGTTCTACGTGGCAGCCGCGAGCAGTGTGGTACAGCGCGAGGCAGAGGAGGCAGGTGACTGGGGCGCCCTGATGGCCGCAGGCGCCAAGCCGTTGCCTGCGGGATGCGGACCTTGCATCGGCCTCGGCGTGGGTCTGCTCGAGGACGGCGAGGTGGGCATCTCGGCGACCAACAGGAACTACAAGGGCAGGATGGGCAGTCCCAACGCCCAGGCGTACCTCGCCTCGCCCGCAGTGGTGGCGGCGTCGGCGATTGAGGGCAAGATCTGCGGTCCTTCGGATCTGGACCCTTCGTTGCTGCCTCCCTCGCGTGGCCTCAAGTACTCGATCTCGACCAGTGCCGATGCAGCCTCTGCGGCGTCATCCTCGGCCTCGACCGACGCAGCTGGTGTCGAAGTGCTTCCTTCGTTCCCCAAGTCTTTCTCGGGCCCCTTGATCTTTGCGCCGCAGGACAACCTCAACACCGACGGCATCTACCCGGGCAAGTACACGTACCAAGACGACATTACGCCCGACAAACAAGCCGAAGTGGTCATGGAGAACTACGACGCCACATTTGCCTCGACTGTTGCCTCGCTCCGCACCAGCAGCAGTGCAGGGGGTTCGGACGGCGTCAAGCTCGGACCTGTTTTGCTGGGTGGGTACAACTTTGGCACGGGCAGTTCGCGAGAGCAGGCAGCTACGGCTCTCAAGTACGCCGGTGTTCCACTCGTGCTCGCCGGTAGCTTCGGCGACATCTTCAAGCGCAACGCGATCAACAACGGTCTCATCTGCCTCGAGTCGCACGAGCTCGTCCAGGACCTCACCGCGCTCTACCTCGGATCCAGGGACGCCGTTCGAAACCAAAAGGCCATTCTGCTCGACCAGTCCAACGTGCAAATCAACTCGGCCACGGGCGAGATCAACCTCTCCTACACCGCTCCTGACGGATCCAAGGTCAACAAGAAGTACACCGCCAAGCCTGCAGGCATCGGCAAGAGCGTCCAGGAGATCTACACCGCTGGCGGCCTCGAAAAGTGGGTCAAGGAGCGCATCTGA（配列番号５）
・ＬＹＳ４タンパク質の推定アミノ酸配列
MRQQLAASGKCRDWAAAHNSLLSHVQRPTFKSTREGFSLPPIQSTTLALPLLTTTSLRIAQRRIIMRAANMLRLGASRLSTPLLRRSLATHAAVNPASGTYNLVEKIVQKYAVDQAPGSHVKSGDYVSIRPGTVMTHDNTGPVISKFGSIGATSIYNPDQVVFALDHDVQNKSAKNLEKYSKIESFARKHGIDFYPAGRGIGHQVLVEEGYAFPQTLAVASDSHSNMYGGVGCLGTPIVRTDAAAIWATGQTWWQIPEVVKVELKGQLPKGVTGKDVIVALCGYFNQDQVLNAAIEFHGSGLSALSIEERLAIANMTTEWGALAGLFPTDDVTLGWYEKQIRKRDKLEFQIGSSPSPSGSHPRLNMHRLDELSRTLLRPDADALYSKHLTLDLATLVPHVSGPNSVKVSTPLDELAHQNIAINKAYLVSCVNSRASDLKAAADVIRGKKVAKGVEFYVAAASSVVQREAEEAGDWGALMAAGAKPLPAGCGPCIGLGVGLLEDGEVGISATNRNYKGRMGSPNAQAYLASPAVVAASAIEGKICGPSDLDPSLLPPSRGLKYSISTSADAASAASSSASTDAAGVEVLPSFPKSFSGPLIFAPQDNLNTDGIYPGKYTYQDDITPDKQAEVVMENYDATFASTVASLRTSSSAGGSDGVKLGPVLLGGYNFGTGSSREQAATALKYAGVPLVLAGSFGDIFKRNAINNGLICLESHELVQDLTALYLGSRDAVRNQKAILLDQSNVQINSATGEINLSYTAPDGSKVNKKYTAKPAGIGKSVQEIYTAGGLEKWVKERI（配列番号６）
・Sequence of LYS4
(SEQ ID NO:5)
・Deduced amino acid sequence of LYS4 protein
(SEQ ID NO: 6)
・ＬＹＳ９の配列
ATGGGCGTCATCACTCACCCCAACATTCGCGATGGATGGTTTTACGAGACCAACTCGCAATGGCCCGGTCAGGCCATGAGCCTCCAGGTGCAGCGCATCCTCCACCACGAGAAGTCGCTCTTCCAGGATGTGCTCGTCTTCGAGTCCACCACCTTCGGCAACGTCCTCGTCCTTGACGGCGTTATCCAGTGCACCGAGCGTGACGAGTTCTCCTACCAGGAGATGATTGCCCACCTCCCCATCGCCTCGCACCCCAACCCCGAGCGCGTTCTCGTAATCGGCGGCGGTGACGGCGGTGTCCTCCGCGAGGTCGTCAAGCACGACTCGGTCAAGGAGGCCATTCTCTGCGACATTGACGAGGCTGTCCCCCGTGTCTCCCAGCAGTACCTTCCCAAGATGGCCGAGGGTCTCAACCACCCCAAGTCCAAGGTCATCATCGGCGACGGCTTCGCTTTCCTCAAGGACCCCAAGAACAAGGCCAGCTTCGACGTCATCATCACCGACTCCTCCGACCCGGTCGGCCCCGCAGAGGTGCTCTTCCAGCAGCCCTACTTCGCCCTGCTCAAGGAGGCCCTCAAGCCCGGAGGACACATCTCCACCCAGGCCGAGTGTGTCTGGATCCACCTCAACCTCATCGGCGAGCTCCGCCGCTCCACCAAGGAGCTCTTCCCCGTCGCCGACTACGCCTTCACCACCATCCCCACCTACCCCTCCGGTCAGATCGGCTTCGTCGTCTGCTCGCTCGACGCCAACCGCAACGTTCGCGAGCCCCTCCGCCAGGTGCCCGACTGCCGATACTACAACTCGGAGGTGCACAAGGCTTCCTTTATCGTCCCCGAGTTCGCTCGCAAGGTCATTGAGGAGGGTGCTCCCGCCCCTGGCCGTGTGATCCCCACTGGTGAGGGCAATGCCAAGGCTCAGCGTGCTCCCAAGAAGATCCTCCTCCTCGGCTCCGGCTACGTCGCCAAGCCCTTCGCCGAGTACGTCACCCGCTTCCCCGAGTACAGCCTCACCGTCGCCTCGGTCAAGATCGAGCACTCGCAGCGCCTCATCGAGGGCCTCCACAACGCCAACGCCACCTCGGTCGACGTCAACGACCCTGCCGCACTCTCGGCGCTGATCAAGGGCCACGACGTTGTCATCTCGCTCATCCCTTACATCTACCATGCCTCGGTCATCAAGGCCGCTTGCGAGCACAAGGTCAACGTAGTCACCACCTCGTACGTCTCGGACGCTATCCGCGAGCTCGAGCCCGAGATCAAGAAGGCCGGCATCACCGTCATGAACGAGATCGGTCTCGACCCCGGTCTCGACCACCTCTACGCCGTCAAGGCCATCGACGACGTGCACGCCGAGGGCGGAAAGATCAAGTCCTTCCTCTCCTACTGCGGTGGTCTGCCTGCCCCCGAGGCGGCCGACAACCCGCTCGGATACAAGTTCTCCTGGTCGTCGCGCGGTGTGCTTCTCGCACTCCGAAACACGGCCAAGTTCTGGCAGGACGGCAAGGAGCTCACTGTCTCGGGTCAGGAGCTCATGGCCGCTGCCCAGAGCTTCTACATCAACCCTGCCTTCGCCTTTGTCGCCTACCCCAACCGTGACTCGACTCCTTTCAAGCAGTGGTACAACATCCCCGAGGCCGAGACTGTGATCCGCGGTACGCTCCGATACCAGGGCTTCCCCGAGTTCATCCTCGCCCTCGTCAAGCTCGGCTTCCTCGACGAGGAGGCCAAGGACTTCCTTGCCTACGGTACCAAGGCCTCGTGGGCTGACGTCACCGCCAAGATGGTCGGTGCCGCCTCCGCTGCCGAGACCGACCTGATCGCTGCCATCAAGACCAAGGTCTCGTTCAAGTCGGCTCAGGAGGAGGAGACCATCATCCGCGGTCTGCGCTGGCTCGACCTCTTCTCCACCAAGGCCCACGTCACCGTGCGTGGCACCGCCCAGCAGGAGGCCGGCAAGGTGGCCGGCAACCCGCTCGACTCGCTCTGCGCTACCCTCGAGGAGAAGTGCGCCTACGCCCCCGGCGAGCGCGACATGGTCATGCTCCAGCACAAGTTCGAGATCGAGACTGCCAACGGCGAGCACAAGACCCTCACCTCGACGCTGCTCGACTACGGTATTCCCCACGGAACCTCGTCGATGGCTAAGCTCGTCGGTGTCCCTTGCGCCATTGCTACCCGCCTCATCCTCGAGGGCCACCCGGCTCTCACCAAGGTCGGTATCCTGGCTCCTTACACCAAGGACATCTGCGATCCCATCCGTCTCGAGCTCGAGAAGGAGGGCATTGCCCTCGAGGAGCGCTACGTCTAG（配列番号７）
・ＬＹＳ９タンパク質の推定アミノ酸配列
MGVITHPNIRDGWFYETNSQWPGQAMSLQVQRILHHEKSLFQDVLVFESTTFGNVLVLDGVIQCTERDEFSYQEMIAHLPIASHPNPERVLVIGGGDGGVLREVVKHDSVKEAILCDIDEAVPRVSQQYLPKMAEGLNHPKSKVIIGDGFAFLKDPKNKASFDVIITDSSDPVGPAEVLFQQPYFALLKEALKPGGHISTQAECVWIHLNLIGELRRSTKELFPVADYAFTTIPTYPSGQIGFVVCSLDANRNVREPLRQVPDCRYYNSEVHKASFIVPEFARKVIEEGAPAPGRVIPTGEGNAKAQRAPKKILLLGSGYVAKPFAEYVTRFPEYSLTVASVKIEHSQRLIEGLHNANATSVDVNDPAALSALIKGHDVVISLIPYIYHASVIKAACEHKVNVVTTSYVSDAIRELEPEIKKAGITVMNEIGLDPGLDHLYAVKAIDDVHAEGGKIKSFLSYCGGLPAPEAADNPLGYKFSWSSRGVLLALRNTAKFWQDGKELTVSGQELMAAAQSFYINPAFAFVAYPNRDSTPFKQWYNIPEAETVIRGTLRYQGFPEFILALVKLGFLDEEAKDFLAYGTKASWADVTAKMVGAASAAETDLIAAIKTKVSFKSAQEEETIIRGLRWLDLFSTKAHVTVRGTAQQEAGKVAGNPLDSLCATLEEKCAYAPGERDMVMLQHKFEIETANGEHKTLTSTLLDYGIPHGTSSMAKLVGVPCAIATRLILEGHPALTKVGILAPYTKDICDPIRLELEKEGIALEERYV（配列番号８）
・Sequence of LYS9
(SEQ ID NO: 7)
・Deduced amino acid sequence of LYS9 protein
(SEQ ID NO: 8)
・ＬＹＳ１２の配列（下線部はイントロン）
ATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTGGTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAGTACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATGGTAAGCCCCATCCTCCGTCTTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAGGGCGAGCCGGTCCACGGTTCGGCGCCCGATATCGCGGGTCAGGGCAAGGCGAACCCGATCGCCTCGATCCGCTCCGCCGCCCTCATGCTCGAATACATGGGCTACACCGAGCCTGCGCTCAAGATCTACACGGCCGTCGACCAGGTCATCCGCGAGGGCAAGTACCTCACCCCAGACCTCGGCGGATCCGCCACCACCACCCAGTGCGAAGAGGCCATCCTCAAAAAGATCAACGCCTAG（配列番号９）
・ＬＹＳ１２タンパク質の推定アミノ酸配列
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYEPTVTICHKSNVLSVTDGLFRTSVRGVYEKDQKANGGAGRYEGVKLNEQLVDSMVYRLFREPEVFDVVVAPNLYGDIVSDAAAALVGSLGLVPSVNAGDNFFMGEPVHGSAPDIAGQGKANPIASIRSAALMLEYMGYTEPALKIYTAVDQVIREGKYLTPDLGGSATTTQCEEAILKKINA（配列番号１０）
・ LYS12 sequence (intron is underlined)
ATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTG GTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAG TACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATG GTAAGCCCCATCCTCCGTC TTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAG GGCGAGCCGGTCCACGGTTCGGCGCCCGATATCGCGGGTCAGGGCAAGGCGAACCCGATCGCCTCGATCCGCTCCGCCGCCCTCATGCTCGAATACATGGGCTACACCGAGCCTGCGCTCAAGATCTACACGGCCGTCGACCAGGTCATCCGCGAGGGCAAGTACCTCACCCCAGACCTCGGCGGATCCGCCACCACCACCCAGTGCGAAGAGGCCATCCTCAAAAAGATCAACGCCTAG（配列番号９）
・Deduced amino acid sequence of LYS12 protein
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYEPTVTICHKSNVLSVTDGLFRTSVRGVYEKDQKANGGAGRYEGVKLNEQLVDSMVYRLFREPEVFDVVVAPNLYGDIVSDAAAALVGSLGLVPSVNAGDNFFMGEPVHGSAPDIAGQGKANPIASIRSAALMLEYMGYTEPALKIYTAVDQVIREGKYLTPDLGGSATTTQCEEAILKKINA（配列番号１０）
・ＬＹＳ２０の配列
ATGTGTGATCACTCCGAACCCTCCGCTATCCAGCAGGTCAACGGCACCGCCCCCGACACCCATGTCGCCATCGACACCTCGGCCCCCAACACCAACGGCGCCGCCAACGGTGCCAACGGTGCCCTCGCCACGGCAGACAACGGAAACGTAGGCTCCGTACAGCCCTTCAACACGCGCTACTCGGACTTCCTCTCCAACGTATCCAACTTCAAGATCATCGAGTCCACCCTCCGCGAGGGCGAGCAGTTCGCCAACGCCTTCTTCGACACCGAGACCAAGATCAAGATCGCCAAGGCGCTCGACAAGTTCGGCGTCGACTGCATCGAGCTCACCTCCCCCGCCGCCTCCGAGCAGTCGCGCAAGGACTGCGAGGCCATCTGCAAGCTCGGCCTCAAGGCCAAAGTCATCACCCACATCCGCTGCCACATGGACGACGCCCGCATCGCCGTAGAGACGGGCGTCGACGGCGTCGACGTCGTCATGGGCACCTCCAAGTTCCTCCGCGAGTTCTCGCACGGCAAGGACATGACCTACATCACCAAGACCGCCATCGAGGTCATCCAGTTTGTCAAGTCCAAGGGCATCGAGATCCGCTTCTCCACCGAAGACTCCTTCCGCTCCGACCTCGTCGACCTGCTCAGCATCTACCAGGCCGTCGACAAGGTCGGCGTCAACCGCGTCGGCATCGCAGACACCGTCGGCGTCGCAAACCCAAGACAGGTCTACGACCTCGTCCGCACCCTCCGCGGCGTCGTCGGCTGCGACATCGAGTGCCACTTCCACAACGACACCGGCTGCGCCATCGCCAACGCCTACACCGCCCTCGAGGCCGGCGCCACCCACGTAGACACCTCGGTGCTCGGCATCGGCGAGCGCAACGGCATCCCCTCGCTCGGCGGCTTCATCGCACGCATGTACACCGCCGACCGCGAATACGTGATGAGCAAGTACAACCTCAAGGCGCTGCGCGAGGTCGAGAACCTCGTCGCCGAGGCGGTCCAGATCCAGGTGCCCTTCAACAACTACGTCACCGGCTACTGCGCCTTCACCCACAAGGCCGGCATCCACGCCAAGGCCATCCTCGCCAACCCGTCCACATACGAGATCATCCGCCCCGAGGACTTTGGCATGAGCCGCTACGTCTCCATCGGACACCGCCTCACCGGCTGGAACGCCGTCAAGTCGAGGTGCGAGCAGCTCGAGCTCAACCTCACCGAGGACCAGGTCAAGGAGGTCACCGCCAAGATCAAGCAGCTCGCAGACGTGCGCGAGCAGACCATGGAGGACGTCGACTCGATTCTCAGGAACTACGCGCGCGCCATCGAGAACGGCACCGCCTAA（配列番号１１）
・ＬＹＳ２０タンパク質の推定アミノ酸配列
MCDHSEPSAIQQVNGTAPDTHVAIDTSAPNTNGAANGANGALATADNGNVGSVQPFNTRYSDFLSNVSNFKIIESTLREGEQFANAFFDTETKIKIAKALDKFGVDCIELTSPAASEQSRKDCEAICKLGLKAKVITHIRCHMDDARIAVETGVDGVDVVMGTSKFLREFSHGKDMTYITKTAIEVIQFVKSKGIEIRFSTEDSFRSDLVDLLSIYQAVDKVGVNRVGIADTVGVANPRQVYDLVRTLRGVVGCDIECHFHNDTGCAIANAYTALEAGATHVDTSVLGIGERNGIPSLGGFIARMYTADREYVMSKYNLKALREVENLVAEAVQIQVPFNNYVTGYCAFTHKAGIHAKAILANPSTYEIIRPEDFGMSRYVSIGHRLTGWNAVKSRCEQLELNLTEDQVKEVTAKIKQLADVREQTMEDVDSILRNYARAIENGTA（配列番号１２）
・Sequence of LYS20
(SEQ ID NO: 11)
- Deduced amino acid sequence of LYS20 protein
MCDHSEPSAIQQVNGTAPDTHVAIDTSAPNTNGAANGANGALATADNGNVGSVQPFNTRYSDFLSNVSNFKIIESTLREGEQFANAFFDTETKIKIAKALDKFGVDCIELTSPAASEQSRKDCEAICKLGLKAKVITHIRCHMDDARIAVETGVDGVDVVMGTSKFLREFSHGKDMTYITKTAIEVIQFVKSKGIEIRFSTEDSFRSDLVDLLSIYQAVDKVGVNRVGIADTVGVANPRQVYDLVRTLRGVVGCDIECHFHNDTGCAIANAYTALEAGATHVDTSVLGIGERNGIPSLGGFIARMYTADREYVMSKYNLKALREVENLVAEAVQIQVPFNNYVTGYCAFTHKAGIHAKAILANPSTYEIIRPEDFGMSRYVSIGHRLTGWNAVKSRCEQLELNLTEDQVKEVTAKIKQLADVREQTMEDVDSILRNYARAIENGTA（配列番号１２）
・ＵＲＡ３の配列（下線部はイントロン）
ATGTCGAGCATCACCCTCCAGACGTACGCATCACGCGCGGCCAAGCAGCCCAACGCCGCCGCCAAGGCGCTGCTCGAGTGCATCGAGCGCAAGCAGTCCAACCTGTGCGTCTCGGTCGACGTGACCAACAAGCAGGACCTGCTCGACGTGTGCGATGCCGTCGGCCCAGACGTGTGCCTGGTCAAGACGCACATCGACATTGTCGAGGATTTTGACATCGACCTCGTCCAGCAGCTCACCGCGCTCAGCCAGAAGCACGACTTTCTCATCTTCGAGGACCGCAAGTTTGCCGACATTGGTAAGTCCATGCGATCGTCCACTCGAAGTGCCTGTGCACCCCGCTGACACGAGCTTACCCTGGCGCATTTGCATCTACAGGCAACACGGCAAGCCTGCAGTACTCGTCGGGCGTGCACAAGATTGCGTCGTGGTCGCACATCACCAACGCGCATCTGGTGCCTGGACCGGGCGTCATCAGCGGTCTCGCCAAGGTGGGCCAACCACTCGGACGCGGCCTTCTGCTGCTCGCCGAGATGAGCTCGGCAGGCGCGCTCACCAAGGGTTCCTACACGCAGGCGTGTGTCGACGAGGCCAAGAAGGACACCACCGGCTTTGTCTGTGGCTTCATCGCCATGTCGCGCGTCGACGAGCGCGAGGGCCCCAACACGGAGCGCGACCTGCTCATCCTCACACCGGGCGTCGGCCTCGACGTCAAGGGCGATGCCATGGGCCAACAGTACCGCACGCCCGACCAGGTCATCCGTGAAAGCGGCTGCGACGTCATCATCGTCGGTAGGGGTATCTACGGCGCTCTCATGACCGAAGAGGGCAAGGCCGACAAGAAGGCGGCGTTCGACAAGGTCAGGCAACAGGGTTCGCGGTACAAGAAGGCGGGTTGGGAGGCCTACCTCGCCCGTCTTGGTCAGAAGTAG（配列番号１３）
・ＵＲＡ３タンパク質の推定アミノ酸配列
MSSITLQTYASRAAKQPNAAAKALLECIERKQSNLCVSVDVTNKQDLLDVCDAVGPDVCLVKTHIDIVEDFDIDLVQQLTALSQKHDFLIFEDRKFADIGNTASLQYSSGVHKIASWSHITNAHLVPGPGVISGLAKVGQPLGRGLLLLAEMSSAGALTKGSYTQACVDEAKKDTTGFVCGFIAMSRVDEREGPNTERDLLILTPGVGLDVKGDAMGQQYRTPDQVIRESGCDVIIVGRGIYGALMTEEGKADKKAAFDKVRQQGSRYKKAGWEAYLARLGQK（配列番号１４）
・ URA3 sequence (introns are underlined)
ATGTCGAGCATCACCCTCCAGACGTACGCATCACGCGCGGCCAAGCAGCCCAACGCCGCCGCCAAGGCGCTGCTCGAGTGCATCGAGCGCAAGCAGTCCAACCTGTGCGTCTCGGTCGACGTGACCAACAAGCAGGACCTGCTCGACGTGTGCGATGCCGTCGGCCCAGACGTGTGCCTGGTCAAGACGCACATCGACATTGTCGAGGATTTTGACATCGACCTCGTCCAGCAGCTCACCGCGCTCAGCCAGAAGCACGACTTTCTCATCTTCGAGGACCGCAAGTTTGCCGACATTG GTAAGTCCATGCGATCGTCCACTCGAAGTGCCTGTGCACCCCGCTGACACGAGCTTACCCTGGCGCATTTGCATCTACAG （配列番号１３）
・Deduced amino acid sequence of URA3 protein
MSSITLQTYASRAAKQPNAAAKALLECIERKQSNLCVSVDVTNKQDLLDVCDAVGPDVCLVKTHIDIVEDFDIDLVQQLTALSQKHDFLIFEDRKFADIGNTASLQYSSGVHKIASWSHITNAHLVPGPGVISGLAKVGQPLGRGLLLLAEMSSAGALTKGSYTQACVDEAKKDTTGFVCGFIAMSRVDEREGPNTERDLLILTPGVGLDVKGDAMGQQYRTPDQVIRESGCDVIIVGRGIYGALMTEEGKADKKAAFDKVRQQGSRYKKAGWEAYLARLGQK（配列番号１４）
前記遺伝子における変異部位は、当該遺伝子がコードしているタンパク質の機能を低下させるものである限り、特に限定はされないが、例えば、前記遺伝子における変異は、ＬＹＳ１２タンパク質のＭｅｔ１～Ｇｌｕ１９５をコードする遺伝子の少なくとも一部の欠失であってもよく、又は、ＵＲＡ３の１１３番目のＣの置換（例えばＧへの置換）、８６７番目のＣの置換（例えばＴへの置換）、及び／又は６１４番目のＴの欠失であってもよい。なお、本明細書においては、シュードザイマ属菌の遺伝子の名称は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で知られている遺伝子ホモログの名称をそのまま使用していることもある。そして、特にＰ．アンタクティカの遺伝子について言及する際には、当該遺伝子名の頭に「Ｐａ」を付すこともある。例えば、Ｓ．セレヴィシエのＬＹＳ１２又はＵＲＡ３に相同性を示すＰ．アンタクティカの遺伝子を、それぞれ「ＬＹＳ１２」及び「ＵＲＡ３」と単純に呼ぶこともあるし、「ＰａＬＹＳ１２」及び「ＰａＵＲＡ３」と呼ぶこともある。 The mutation site in the gene is not particularly limited as long as it reduces the function of the protein encoded by the gene. It may be at least a partial deletion, or substitution of C at position 113 (eg, substitution with G), substitution of C at position 867 (eg, substitution with T), and/or substitution at position 614 of URA3. It may be a deletion of T. In the present specification, the name of the gene of the genus Pseudozyma may be the name of the gene homologue known in Saccharomyces cerevisiae. And especially P.S. When referring to an Antactica gene, the name of the gene may be prefixed with "Pa". For example, S. P. cerevisiae showing homology to LYS12 or URA3 of P. cerevisiae. The Antactica genes are sometimes simply referred to as 'LYS12' and 'URA3', respectively, or 'PaLYS12' and 'PaURA3'.
ある態様では、本発明は、シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株に関しており、当該栄養要求性変異株は、ＬＹＳ２、ＬＹＳ１２、及び／又はＬＹＳ２０塩基配列の少なくとも一部に変異を有するか、又は、ＵＲＡ３及び／又はＵＲＡ５塩基配列の少なくとも一部に変異を有する。前記遺伝子における変異の種類は、当該遺伝子がコードしているタンパク質の機能を低下させるものである限り、特に限定はされないが、例えば、ＬＹＳ１２タンパク質のＭｅｔ１～Ｇｌｕ１９５をコードする遺伝子の少なくとも一部の欠失であるか、又は、ＵＲＡ３の１１３番目のＣの置換（例えばＧへの置換）、８６７番目のＣの置換（例えばＴへの置換）、及び／又は６１４番目のＴの欠失であってもよい。前記栄養要求性変異株を作製する親株としては、例えばＰ．アンタクティカ、Ｐ．フロキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）、Ｐ．ルグローサ（ｒｕｇｕｌｏｓａ）、Ｐ．アフィディス（ａｐｈｉｄｉｓ）、及びＰ．ツクバエンシスなどのシュードザイマ属菌の種々の菌株を採用することができるが、偽菌糸を形成しないシュードザイマ属の菌株が好ましい。本明細書に記載の「偽菌糸」とは、菌の出芽によって生じた菌糸であって、娘細胞が母細胞と一端において密接しつつ細長い細胞に延長し、これらの末端からさらなる出芽によって新しい細長い細胞が生じるという工程が繰り返されて形成した長い糸状の構造のことをいう。前記親株は、特に好ましくは、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株、Ｐ．アンタクティカＯＭＭ６２－２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２３９）、Ｐ．フロキュローサ（ｆｌｏｃｃｕｌｏｓａ）ＪＣＭ１０３２１株、又はＰ．ツクバエンシス（ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ１０３２４株である。 In one aspect, the present invention relates to an auxotrophic mutant of Pseudozyma spp., wherein the auxotrophic mutant has a mutation in at least part of the LYS2, LYS12, and/or LYS20 nucleotide sequence, or At least part of the URA3 and/or URA5 nucleotide sequence has a mutation. The type of mutation in the gene is not particularly limited as long as it reduces the function of the protein encoded by the gene. or a substitution of C at position 113 (e.g., a substitution to G), a substitution of C at position 867 (e.g., a substitution of T), and/or a deletion of T at position 614 of URA3 good too. As a parent strain for producing the auxotrophic mutant strain, for example, P. Antactica, P. flocculosa, P. rugulosa, P. aphidis, and P. Various strains of the genus Pseudozyma, such as Tsukubaensis, can be employed, but strains of the genus Pseudozyma that do not form pseudohyphae are preferred. As used herein, "pseudohyphae" are hyphae produced by fungal budding in which daughter cells extend into elongated cells in close contact with the mother cell at one end and from these ends new elongated cells are formed by further budding. A long filamentous structure formed by repeating the process of cell formation. Said parent strain is particularly preferably P. Antactica strain GB-4(0), P. Antactica strain OMM62-2 (accession number NITE P-02239), P. flocculosa strain JCM10321, or P. It is tsukubaensis JCM10324 strain.
前記シュードザイマ属菌又はＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株から栄養要求性変異株を取得する方法としては、当技術分野で知られている種々の方法を、特に制限なく採用することができる。例えば、紫外線照射などによって突然変異を誘発したり、天然の環境で生じた変異株をスクリーニングしたりすることによって、前記栄養要求性変異株を取得してもよい。 The Pseudozyma spp. or P. As a method for obtaining an auxotrophic mutant from the Antactica GB-4(0) strain, various methods known in the art can be employed without particular limitation. For example, the auxotrophic mutant strain may be obtained by inducing mutation by ultraviolet irradiation or the like, or by screening mutant strains generated in a natural environment.
ある態様では、本発明は、目的のタンパク質を発現するシュードザイマ属菌の形質転換体に関している。前記形質転換体は、シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株に、前記目的のタンパク質を発現する遺伝子カセットを導入することで作製されるものであり、この遺伝子カセットを少なくとも１つ有している。前記遺伝子カセットは、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含んでおり、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、前記プロモーターの下流に位置している。前記シュードザイマ属菌のＸＹＮ１は、キシラナーゼをコードしている遺伝子であり、前記シュードザイマ属菌のＦＲＥ１は、鉄還元酵素（Ｆｅｒｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）様タンパク質をコードしているＳ・セレヴィシエのＦＲＥ１と相同性が高い遺伝子である。また、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子は、当該栄養要求性相補遺伝子のプロモーターの下流に位置していてもいいし、他のプロモーターの下流に位置していてもよい。そして、前記遺伝子カセットは、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、ターミネーター（例えば、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１などのターミネーター）を任意で含んでもよい。なお、前記遺伝子カセットを構成する遺伝子のすべてが、形質転換される前記栄養要求性変異株と同じ種に由来する場合、作製された形質転換体はセルフクローニング株になる。セルフクローニング株は、組換え体としての厳格な管理が要求されず、野生株と同等に扱うことができる。 In one aspect, the invention relates to a transformant of Pseudozyma that expresses a protein of interest. The transformant is prepared by introducing a gene cassette that expresses the target protein into an auxotrophic mutant strain of the genus Pseudozyma, and has at least one gene cassette. The gene cassette contains a gene encoding the protein of interest, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant, A coding gene is located downstream of the promoter. XYN1 of the genus Pseudozyma is a gene encoding xylanase, and FRE1 of the genus Pseudozyma is highly homologous to FRE1 of S. cerevisiae, which encodes a ferric reductase-like protein. Gene. In addition, the gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant strain may be located downstream of the promoter of the auxotrophic complementing gene, or may be located downstream of another promoter. The gene cassette may optionally include a terminator (for example, a terminator such as Pseudozyma XYN1 or FRE1) downstream of the gene encoding the target protein. When all of the genes constituting the gene cassette are derived from the same species as the auxotrophic mutant to be transformed, the produced transformant is a self-cloning strain. Self-cloning strains do not require strict control as recombinants and can be treated in the same way as wild strains.
前記遺伝子カセットを複数有する形質転換体は、前記栄養要求性変異株に前記遺伝子カセットを導入する際に、たまたま複数の遺伝子カセットが導入されたことで作製されたものであってもいいし、前記遺伝子カセットを１つ有する形質転換体を一度作製した後に、同じ遺伝子カセットを繰り返し導入することによって作製されたものであってもよい。前記遺伝子カセットを複数有する形質転換体は、前記目的のタンパク質を、より大量に発現することが期待される。 The transformant having a plurality of gene cassettes may be produced by accidental introduction of a plurality of gene cassettes when the gene cassettes are introduced into the auxotrophic mutant, or It may be produced by once producing a transformant having one gene cassette and then repeatedly introducing the same gene cassette. A transformant having a plurality of the gene cassettes is expected to express the target protein in a larger amount.
ある態様では、本発明は、目的のタンパク質を生産する方法に関しており、シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株を用意する工程、前記栄養要求性変異株に、遺伝子カセットを少なくとも１つ導入する工程、及び、前記遺伝子カセットを導入した栄養要求性変異株を培養して、前記目的のタンパク質を生産する工程を含んでいる。前記遺伝子カセットは、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置している。また、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子は、当該栄養要求性相補遺伝子のプロモーターの下流に位置していてもいいし、他のプロモーターの下流に位置していてもよい。そして、前記遺伝子カセットは、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、ターミネーター（例えば、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１などのターミネーター）を任意で含んでもよい。 In one aspect, the present invention relates to a method for producing a protein of interest, comprising the steps of providing an auxotrophic mutant strain of Pseudozyma spp., introducing at least one gene cassette into the auxotrophic mutant strain, and culturing the auxotrophic mutant into which the gene cassette has been introduced to produce the desired protein. The gene cassette contains a gene encoding the protein of interest, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant, and encodes the protein of interest. A gene is located downstream of the promoter. In addition, the gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant strain may be located downstream of the promoter of the auxotrophic complementing gene, or may be located downstream of another promoter. The gene cassette may optionally include a terminator (for example, a terminator such as Pseudozyma XYN1 or FRE1) downstream of the gene encoding the target protein.
本発明のシュードザイマ属菌の形質転換体に発現させる目的のタンパク質又は本発明の方法で生産する目的のタンパク質としては、種々のタンパク質を特に制限なく採用することができ、シュードザイマ属菌のタンパク質を採用してもよく、シュードザイマ属菌以外の生物のタンパク質を採用してもよい。前記シュードザイマ属菌のタンパク質は、例えば、生分解性プラスチック分解酵素であるクチナーゼ様酵素１（ＣＬＥ１）（Ｐ．アンタクティカのＣＬＥ１を特に「ＰａＥ」又は「ＰａＣＬＥ１タンパク質」ともいう）、リパーゼＡ、又はリパーゼＢであってもよい。前記シュードザイマ属菌以外の生物のタンパク質は、例えば、ルシフェラーゼ、異種の酵母や糸状菌の生分解性プラスチック分解酵素、又はアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の酵素だけでなく、抗体の抗原認識部位等の有用なタンパク質であってもよい。また、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子で使用されているコドンとしては、前記形質転換体が利用することができるものである限り、種々のコドンを特に制限なく採用することができるが、当該コドンは、シュードザイマ属菌が高頻度で使用するコドンに最適化されていてもよく、及び／又は、望ましいＧＣ含量を与えるように最適化されていてもよい。シュードザイマ属菌が高頻度で使用する前記コドンは、例えば、８％キシロース又は８％グルコース含有培地で培養したＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の全ＲＮＡをマイクロアレイで分析して得られた遺伝子発現プロファイルから、キシロースを含む培地で培養したときにだけ転写量が高くなる上位２０位までの遺伝子を選び出し、それらの遺伝子におけるコドンの使用頻度を調べることで同定してもよい。前記ＧＣ含量は、例えば、４５～７５％であってもよく、好ましくは５０～７０％、より好ましくは５５～６７％である。前記コドン及び／又は前記ＧＣ含量を最適化することで、前記目的のタンパク質の発現効率を高めることができる。 As the target protein to be expressed in the Pseudozyma genus transformant of the present invention or the target protein to be produced by the method of the present invention, various proteins can be employed without particular limitation, and a Pseudozyma genus protein is employed. Alternatively, proteins from organisms other than Pseudozyma may be employed. The protein of the genus Pseudozyma is, for example, a biodegradable plastic-degrading enzyme, cutinase-like enzyme 1 (CLE1) (CLE1 of P. antactica is also specifically referred to as "PaE" or "PaCLE1 protein"), lipase A, or lipase It may be B. Proteins of organisms other than Pseudozyma spp. include, for example, luciferase, biodegradable plastic-degrading enzymes of heterologous yeasts and filamentous fungi, enzymes such as amylase, protease, lipase, cellulase, antigen recognition sites of antibodies, etc. of useful proteins. In addition, as the codon used in the gene encoding the target protein, various codons can be employed without particular limitation as long as they can be used by the transformant. may be optimized for codons frequently used by Pseudozyma spp. and/or may be optimized to provide desired GC content. Said codons frequently used by Pseudozyma spp. are e.g. From the gene expression profile obtained by analyzing the total RNA of Antactica strain GB-4(0) with a microarray, the top 20 genes whose transcription levels are high only when cultured in a medium containing xylose are selected. may be identified by examining codon usage in the genes of The GC content may be, for example, 45-75%, preferably 50-70%, more preferably 55-67%. By optimizing the codon and/or the GC content, the expression efficiency of the target protein can be increased.
本発明のＰ．アンタクティカの形質転換体の具体的な例としては、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のリジン要求性変異株であるＬ１株に由来するＬ１－Ｓ１２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９３）が挙げられる。宿主である前記Ｌ１株では、ＰａＬＹＳ１２塩基配列の前半（５’末端側）の６７２ｂｐを含む７８２７ｂｐが欠損し、細胞内のリジン生合成経路が機能しなくなっている。前記Ｌ１－Ｓ１２株は、Ｐ．アンタクティカの生分解性プラスチック分解酵素であるＰａＥ（ＰａＣＬＥ１タンパク質）をコードする遺伝子を、Ｐ．アンタクティカのキシラナーゼ遺伝子ＰａＸＹＮ１のプロモーター及びターミネーターの間に備え、かつＰａＬＹＳ１２のプロモーター及びターミネーターの間にＰａＬＹＳ１２が配置された配列が接続されている遺伝子カセットを前記Ｌ１株に導入し、遺伝子導入された細胞を選択した後、生分解性プラスチック分解酵素活性（ＰａＥ活性）を指標としてスクリーニングすることによって取得された、ＰａＥ高発現株である。なお、前記遺伝子カセットを構成するＰａＥをコードする遺伝子（ＰａＣＬＥ１）、ＰａＸＹＮ１のプロモーター及びターミネーター、ＰａＬＹＳ１２、並びに、ＰａＬＹＳ１２のプロモーター及びターミネーターは、いずれもＰ．アンタクティカに由来する遺伝子であるので、前記Ｌ１－Ｓ１２株は、セルフクローニング株である。 P. of the present invention. A specific example of a transformant of P. antactica is P. antactica. L1-S12 strain (accession number NITE P-02393) derived from L1 strain, which is a lysine-requiring mutant strain of Antactica strain GB-4(0). In the host L1 strain, 7827 bp including 672 bp in the first half (5' end side) of the PaLYS12 base sequence is deleted, and the intracellular lysine biosynthetic pathway does not function. The L1-S12 strain is a P. The gene encoding PaE (PaCLE1 protein), a biodegradable plastic-degrading enzyme from P. A gene cassette having a sequence in which PaLYS12 is arranged between the promoter and terminator of the xylanase gene PaXYN1 of Antactica and interposed between the promoter and terminator of PaLYS12 is introduced into the L1 strain, and the transfected cells are grown. After selection, it is a highly PaE-expressing strain obtained by screening using biodegradable plastic-degrading enzyme activity (PaE activity) as an index. The PaE-encoding gene (PaCLE1), the promoter and terminator of PaXYN1, the promoter and terminator of PaLYS12, and the promoter and terminator of PaLYS12, which constitute the gene cassette, are all derived from P. The L1-S12 strain is a self-cloning strain because the gene is derived from Antactica.
本発明のＰ．アンタクティカの形質転換体の別の具体的な例としては、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のリジン要求性変異株であるＬ１株に由来するＧＢ－４（０）ＰＧＢ４８０株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６３８）及びＧＢ－４（０）ＰＧＢ４７４株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６４０）、並びに、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株であるＰＧＢ３７１株に由来するＧＢ－４（０）ＰＧＢ４６９株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２６３９）が挙げられる。これらの形質転換体に導入された遺伝子カセットは、Ｐ．アンタクティカに由来するＤＮＡ配列のみで構成されていたので、当該形質転換体は、セルフクローニング株である。 P. of the present invention. Another specific example of a transformant of P. antactica is P. antactica transformant. GB-4(0) PGB480 strain (accession number NITE P-02638) and GB-4(0) PGB474 strain (accession number NITE P-02640), and P.S. GB-4(0) PGB469 strain (accession number NITE P-02639) derived from PGB371 strain, which is a uracil-requiring mutant strain of Antactica GB-4(0) strain. The gene cassette introduced into these transformants was P. This transformant is a self-cloning strain because it was composed only of DNA sequences derived from Antactica.
ある態様では、本発明は、安定化された生分解性プラスチック分解酵素を取得する方法に関しており、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加して、前記生分解性プラスチック分解酵素を安定化する又は沈殿させる工程、及び、前記安定化した又は沈殿した生分解性プラスチック分解酵素を回収する工程を含んでいる。多くのタンパク質は、エタノールにより変性し、溶液中で沈殿を形成して失活するが、前記生分解性プラスチック分解酵素は、エタノールにより沈殿を形成して一時的に失活するものの、前記生分解性プラスチック分解酵素を水又は緩衝液中に再溶解すれば、当該酵素は再び活性を取り戻す。加えて、前記生分解性プラスチック分解酵素は、エタノール溶液中で安定に保存することができる。このように、エタノールを使用すれば、Ｐ．アンタクティカなどの酵母の培養液中に回収した生分解性プラスチック分解酵素を、効率よく精製及び濃縮し、かつ安定に保存することが可能となる。前記エタノールの添加後の終濃度は、前記生分解性プラスチック分解酵素の精製及び濃縮を目的とする場合、当該酵素が沈殿により回収できる限り特に制限されないが、例えば、約５０％～約９９％であってもよく、好ましくは約７５％～約９０％である。前記生分解性プラスチック分解酵素の沈殿は、遠心分離法又はろ過（ろ別）などによって回収して、沈殿の状態で保管してもよい。また、前記生分解性プラスチック分解酵素の活性を安定に保存することを目的とする場合は、当該酵素は沈殿してもしなくてもよく、前記エタノールの添加後の終濃度は、例えば、約１％～９０％であってもよく、好ましくは約５％～７０％、特に好ましくは約１０％～５０％である。沈殿を形成しないが安定化されている生分解性プラスチック分解酵素は、エタノールを添加した後の溶液としてそのまま回収して、溶液の状態で保管してもよい。 In one aspect, the present invention relates to a method for obtaining a stabilized biodegradable plastic-degrading enzyme, comprising: preparing a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme; adding ethanol to stabilize or precipitate the biodegradable plastic-degrading enzyme; and recovering the stabilized or precipitated biodegradable plastic-degrading enzyme. Many proteins are denatured by ethanol, form a precipitate in a solution, and are inactivated. If the plastic-degrading enzyme is redissolved in water or buffer, the enzyme regains its activity. In addition, the biodegradable plastic-degrading enzyme can be stably stored in an ethanol solution. Thus, if ethanol is used, P. It is possible to efficiently purify and concentrate biodegradable plastic-degrading enzymes collected in the culture medium of yeast such as Antactica, and to store them stably. The final concentration of ethanol after addition is not particularly limited as long as the enzyme can be recovered by precipitation when the purpose is to purify and concentrate the biodegradable plastic-degrading enzyme. There may be, preferably from about 75% to about 90%. The sediment of the biodegradable plastic-degrading enzyme may be recovered by centrifugation or filtration (filtering) and stored in the sediment state. Further, when the purpose is to stably preserve the activity of the biodegradable plastic-degrading enzyme, the enzyme may or may not be precipitated, and the final concentration after the addition of ethanol is, for example, about 1 % to 90%, preferably about 5% to 70%, particularly preferably about 10% to 50%. A biodegradable plastic-degrading enzyme that does not form a precipitate but is stabilized may be recovered as it is as a solution after adding ethanol, and may be stored in the form of a solution.
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加する工程は、終濃度が約１０％～約９０％（好ましくは約３０～約８０％、特に好ましくは約６５％～約７５％）となるようにエタノールを添加する工程、及び、終濃度が約５０％～約９９％（好ましくは約７５％～約９０％）となるようにエタノールを添加する工程を含んでもよい。一般に、エタノールには殺菌作用があり、特にエタノールの濃度を約６５％～約７５％とすれば、最も効果的にエタノールによる殺菌作用が奏されるので、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液のエタノール濃度を、一時的に約６５％～約７５％などの殺菌作用が奏される範囲の濃度に調整して殺菌処理を施した後に、前記生分解性プラスチック分解酵素を沈殿により回収するための所定の濃度に調整することで、Ｐ．アンタクティカなどの酵母の培養液中に生産された生分解性プラスチック分解酵素を精製しつつ、当該培養溶液中に混入している可能性のある前記生分解性プラスチック分解酵素の産生菌体を殺すことができると期待できる。前記生分解性プラスチック分解酵素は、屋外の圃場で使用済みの生分解性プラスチック製農業用マルチフィルム等を分解するために使用される場合もあるので、遺伝子操作を受けた菌体を殺すことによって、当該菌体が自然界中に拡散することを防ぐことが期待できる。 The step of adding ethanol to the solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme has a final concentration of about 10% to about 90% (preferably about 30% to about 80%, particularly preferably about 65% to about 75%). and adding ethanol to a final concentration of about 50% to about 99% (preferably about 75% to about 90%). In general, ethanol has a bactericidal action, and especially when the concentration of ethanol is about 65% to about 75%, the bactericidal action of ethanol is most effective. After sterilizing by temporarily adjusting the concentration of ethanol in the range of about 65% to about 75% where sterilization action is exhibited, to recover the biodegradable plastic degrading enzyme by precipitation By adjusting the concentration of P.P. While purifying a biodegradable plastic-degrading enzyme produced in a culture solution of yeast such as Antactica, killing the biodegradable plastic-degrading enzyme-producing cells that may be mixed in the culture solution. can be expected. The biodegradable plastic-degrading enzyme is sometimes used to decompose biodegradable plastic agricultural mulch films used in outdoor fields. , it can be expected to prevent the microbial cells from diffusing in the natural world.
本発明の取得方法は、前記エタノール添加工程の前に、前記生分解性プラスチック分解酵素を濃縮する工程を含んでもよい。前記濃縮の手段としては、当技術分野で通常用いられる手段を特に制限されることなく使用することができ、例えば、前記濃縮工程は、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を限外濾過に供する工程、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液に硫酸アンモニウムを添加して沈殿を形成させ、当該沈殿を回収する工程、又は、前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を凍結乾燥に供する工程などを含んでもよく、これらの工程の任意の組み合わせを含んでもよい。生分解性プラスチック分解酵素を含む微生物培養液に対して、例えば終濃度が約９０％になるまでエタノールを添加することは技術的には可能であるものの、大量のエタノールが必要となる。一方、エタノールを添加する前に限外濾過、硫酸アンモニウム、又は凍結乾燥などによって前記生分解性プラスチック分解酵素を濃縮しておけば、比較的少量のエタノールを使用すれば足りるので、エタノール添加操作が容易になる。前記硫酸アンモニウムの添加後の終濃度は、前記生分解性プラスチック分解酵素が沈殿により回収できる限り特に制限されないが、例えば、約４０％飽和～約１００％飽和であってもよく、好ましくは約５０％飽和～約８０％飽和である。 The obtaining method of the present invention may include a step of concentrating the biodegradable plastic-degrading enzyme before the step of adding ethanol. As the concentration means, any means commonly used in the art can be used without particular limitation. adding ammonium sulfate to a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme to form a precipitate and recovering the precipitate; or subjecting the solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme to freeze-drying. and any combination of these steps. Although it is technically possible to add ethanol to a microbial culture solution containing a biodegradable plastic-degrading enzyme, for example, to a final concentration of about 90%, a large amount of ethanol is required. On the other hand, if the biodegradable plastic-degrading enzyme is concentrated by ultrafiltration, ammonium sulfate, freeze-drying, or the like before adding ethanol, it is sufficient to use a relatively small amount of ethanol, and the ethanol addition operation is easy. become. The final concentration of ammonium sulfate after addition is not particularly limited as long as the biodegradable plastic-degrading enzyme can be recovered by precipitation. Saturated to about 80% saturated.
本発明の取得方法は、前記生分解性プラスチック分解酵素を、本発明の目的のタンパク質を生産する方法に従って生産する工程をさらに含んでもよい。 The acquisition method of the present invention may further include the step of producing the biodegradable plastic-degrading enzyme according to the method of producing the target protein of the present invention.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
〔実施例１〕Ｐ．アンタクティカの新規菌株
（１）Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の低通気量条件下でのタンパク質生産能
日本国茨城県産のイネのもみ殻（農業生物資源ジーンバンク、ＪＰ番号２０３１１９）から、生分解性プラスチックであるポリブチルサクシネート（ＰＢＳ）マルチフィルム及びポリブチレンサクシネート－コ－アジペート（ＰＢＳＡ）マルチフィルムを分解する活性を有する菌、すなわち生分解性プラスチック分解酵素であるＰａＥを産生する菌として、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２３９２）及びＰ．アンタクティカＧＢ－４（１）Ｗ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ－２２１５５）を単離した。
[Example 1] P.I. Antactica novel strain (1) P. Ability of Antactica strain GB-4(0) to produce protein under low aeration conditions. As a bacterium that has activity to decompose succinate (PBS) mulch film and polybutylene succinate-co-adipate (PBSA) mulch film, that is, bacterium that produces PaE, which is a biodegradable plastic degrading enzyme, P. Antactica strain GB-4(0) (accession number NITE P-02392) and P. Antactica GB-4(1) W strain (accession number FERM P-22155) was isolated.
これらの菌株を異なる通気量でジャー培養したときの培養液中のＰａＥ活性を図１に示す。１０ＬＰＭの通気量で培養した場合、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の培養液とＰ．アンタクティカＧＢ－４（１）Ｗ株の培養液とは、ほぼ同等のＰａＥ活性を示した。一方、２ＬＰＭの通気量で培養した場合、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（１）Ｗ株の培養液中のＰａＥ活性は、１０ＬＰＭの通気量で培養した場合と比較して低下したが、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の培養液中のＰａＥ活性はほとんど変化しなかった。したがって、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は、通気量の低い培養条件下でも、タンパク質を生産する能力が高いことがわかった。 FIG. 1 shows the PaE activity in the culture medium when these strains were cultured in jars at different aeration rates. When cultured at an aeration rate of 10 LPM, P. Antactica GB-4(0) strain culture medium and P. The culture solution of Antactica GB-4(1) W strain showed almost the same PaE activity. On the other hand, when cultured at an aeration rate of 2LPM, P. The PaE activity in the culture medium of Antactica strain GB-4(1)W was reduced compared to the case of culturing at an aeration rate of 10 LPM. The PaE activity in the culture medium of Antactica strain GB-4(0) hardly changed. Therefore, P.I. Antactica strain GB-4(0) was found to have a high ability to produce protein even under low aeration culture conditions.
（２）Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の導入遺伝子保持能
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株及びＰ．アンタクティカＴ－３４株に、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド（ｐＵＸＶ１－ｎｅｏ）を導入して形質転換した。その形質転換効率（ＤＮＡ１μｇあたりの形質転換体数）を計算すると、Ｐ．アンタクティカＴ－３４株では、１．４形質転換体／μｇＤＮＡであったのに対し、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株では、５７．４形質転換体／μｇＤＮＡだった。したがって、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は、形質転換効率が高いことがわかった。
(2) P.S. Ability of Antactica strain GB-4(0) to carry the transgene P.S. Antactica strain GB-4(0) and P. Antactica strain T-34 was transformed by introducing a plasmid (pUXV1-neo) containing a neomycin resistance gene. Calculating its transformation efficiency (number of transformants per μg of DNA), P. Antactica strain T-34 had 1.4 transformants/μg DNA, whereas P. For Antactica strain GB-4(0) it was 57.4 transformants/μg DNA. Therefore, P.I. Antactica strain GB-4(0) was found to have high transformation efficiency.
微分干渉装置が付いた光学顕微鏡で各菌体の形態を観察すると（詳細は後述の実施例３（６）を参照）、Ｐ．アンタクティカＴ－３４株は、増殖中に偽菌糸を形成しているが（図２Ｆ）、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は、偽菌糸をほとんど形成せずに出芽して増殖した後に、娘細胞が母細胞から切り離されていることがわかった（図２Ａ）。偽菌糸を形成する菌株の場合は、増殖中に偽菌糸から連鎖した複数の細胞が生じ得る。そのため、遺伝子操作を行った後、選択培地に生育したコロニーには、連鎖した細胞由来の導入された遺伝子を保持している形質転換体と、当該遺伝子を保持していない非形質転換体が混在していると考えられる。これに対して、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は偽菌糸をほとんど形成しないため、導入された遺伝子を保持した細胞だけが、選択培地上で増殖しやすいのではないかと考えられる。このように、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株は、タンパク質生産能が高く、かつ導入遺伝子保持能も優れているので、この菌株を所望のタンパク質生産のために利用することができる。また、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株を栄養要求性変異株の作製のために使用し、当該変異株を所望のタンパク質生産のために利用することもできる。 Observation of the morphology of each bacterial cell with an optical microscope equipped with a differential interference device (see Example 3 (6) below for details) revealed that P. Antactica strain T-34 forms pseudohyphae during growth (Fig. 2F), whereas P. Antactica strain GB-4(0) was found to be detached from the mother cell after budding and growing with little formation of pseudohyphae (Fig. 2A). For strains that form pseudohyphae, multiple cells chained from the pseudohyphae may arise during growth. Therefore, after genetic manipulation, the colonies grown on the selective medium contain a mixture of transformants that retain the introduced gene derived from linked cells and non-transformants that do not retain the gene. it seems to do. On the other hand, P.I. Since the Antactica strain GB-4(0) hardly forms pseudohyphae, it is thought that only cells that retain the introduced gene are likely to proliferate on the selective medium. Thus, P.I. Since the Antactica GB-4(0) strain has a high protein-producing ability and an excellent transgene-carrying ability, this strain can be used for desired protein production. Also, P.I. Antactica strain GB-4(0) can also be used for the production of auxotrophic mutants, which can be utilized for desired protein production.
〔実施例２〕Ｐ．アンタクティカのリジン要求性変異株の作製
（１）目的
Ｐ．アンタクティカの栄養素の合成遺伝子を破壊した栄養要求性変異株を作製する。この失われた栄養要求性を相補する遺伝子を遺伝子導入ベクターのマーカーとして利用することで、セルフクローニング株を選択することも可能となる。まずは、リジン要求性変異株を作製する。
[Example 2] P.I. Preparation of lysine-auxotrophic mutants of Antactica (1) Purpose An auxotrophic mutant is created by disrupting the nutrient synthesis gene of Antactica. By using a gene that complements this lost auxotrophy as a marker for a gene transfer vector, it is also possible to select a self-cloning strain. First, a lysine-requiring mutant strain is produced.
（２）材料
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・ＹＭ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．３質量％
モルトエキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．３質量％
ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．５質量％
グルコース １．０質量％
・ＳＤ培地
アミノ酸と（ＮＨ4）2ＳＯ4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．１７質量％
グルコース ２．０質量％
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５質量％
・ＳＤ ｗ／ｏ ＡＡ＆ＡＳ培地
アミノ酸と（ＮＨ4）2ＳＯ4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．１７質量％
グルコース ２．０質量％
・ＳＤ ＮａＮＯ3培地
アミノ酸と（ＮＨ4）2ＳＯ4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．１７質量％
ＮａＮＯ3 ０．２質量％
グルコース ２．０質量％
(2) Materials The composition of the medium used in this example was as follows.
・ YM medium yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 0.3% by mass
Malt extract (manufactured by Difco Laboratories) 0.3% by mass
Peptone (manufactured by Difco Laboratories) 0.5% by mass
Glucose 1.0% by mass
・SD medium Bactoyeast nitrogen base (Difco Laboratories) containing no amino acids and (NH 4 ) 2 SO 4 0.17% by mass
Glucose 2.0% by mass
( NH4 ) 2SO4 0.5% by mass
・SD w/o AA&AS medium Bactoyeast nitrogen base (manufactured by Difco Laboratories) containing no amino acids and (NH 4 ) 2 SO 4 0.17% by mass
Glucose 2.0% by mass
・SD NaNO 3 medium Bactoyeast nitrogen base (manufactured by Difco Laboratories) containing no amino acids and (NH 4 ) 2 SO 4 0.17% by mass
NaNO3 0.2% by mass
Glucose 2.0% by mass
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・Ｌｙｓ１２－ｐｒｏ－６１８ Ｆ
5'-GACATATGAGTGGACAGGCGTGTTCCACAGACAG-3'（配列番号１５）
・Ｌｙｓ１２－ｔｅｒ＋１７８２ Ｒ
5'-GAGAATTCCGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3'（配列番号１６）
・Ｌｙｓ２０－２１－６１８ Ｆ１
5'-TGTGGCAAAAAGCGGCCCAGCGCCA-3'（配列番号１７）
・Ｌｙｓ２０－２１＋１８０２ Ｒ４
5'-TCTGAAGCAGGTCAAGACTTTTGTT-3'（配列番号１８）
・ＬＹＳ２ ｐｒｏ Ｆ
5'-GATGTGGAGTCCATTGCTGTTGTCGAC-3'（配列番号１９）
・ＬＹＳ２ ｔｅｒ Ｒ
5'-CAAATCCCTTCTTTCGTCCCTCGGCT-3'（配列番号２０）
The base sequences of the primers used in this example were as follows.
・Lys12-pro-618F
5'-GACATATGAGTGGACAGGCGTGTTCCACAGACAG-3' (SEQ ID NO: 15)
・Lys12-ter+1782 R
5'-GAGAATTCCGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3' (SEQ ID NO: 16)
・Lys20-21-618 F1
5'-TGTGGCAAAAAGCGGCCCAGCGCCA-3' (SEQ ID NO: 17)
・Lys20-21+1802 R4
5'-TCTGAAGCAGGTCAAGACTTTTGTT-3' (SEQ ID NO: 18)
・LYS2 pro F
5′-GATGTGGAGTCCATTGCTGTTGTCGAC-3′ (SEQ ID NO: 19)
・LYS2 ter R
5'-CAAATCCCTTCTTTCGTCCCTCGGCT-3' (SEQ ID NO: 20)
（３）紫外線照射による栄養要求性変異株の取得
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株を５ｍＬのＹＭ培地を含む試験管に接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで、２４時間振とう培養した。この培養液１ｍＬを３０ｍＬの冷滅菌水を含むシャーレに加え、スターラーで撹拌しながら、６０秒間紫外線を照射した。遠心分離によって紫外線照射した菌体を全量回収し、５ｍＬのＹＭ培地に再懸濁した後、３０℃、１６０ｒｐｍで、３時間の回復培養を行った。回復培養後の培養液１ｍＬを回収し、菌体を滅菌水で２回洗浄した後、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍの合成培地に基づく最少培地（ＳＤ）から窒素源となる硫酸アンモニウムを除いた培地（ＳＤ ｗ／ｏ ＡＡ＆ＡＳ培地）５ｍＬを含む試験管に加え、３０℃、１６０ｒｐｍで、４．５時間振とう培養し、窒素飢餓と細胞増殖の休止を促した。窒素飢餓処理した細胞を回収し、菌体を滅菌水で２回洗浄した後、ＳＤ培地の窒素源として硝酸ナトリウムを用いたＳＤ ＮａＮＯ3培地４ｍＬで再懸濁した。これを３０℃、１６０ｒｐｍで、３時間振とう培養し、栄養要求性ではない細胞の増殖を促した。この培養液に５００μＬのナイスタチン溶液（１００μｇ／ｍＬ）を加え、さらに３０℃、１６０ｒｐｍで、１時間振とう培養することで、栄養要求性ではない増殖中の細胞を死滅させた（ナイスタチン濃縮）。ナイスタチン濃縮処理液を冷滅菌水で１０3倍に希釈した後、５０μＬずつＹＭ寒天培地（２質量％の寒天を含むＹＭ培地）に塗布した。これを３０℃で２日間静置培養すると、１枚のシャーレあたり約２００個のコロニーが出現した。増殖してきた約３６００個のコロニーについて、ＹＭ寒天培地上及びＳＤ寒天培地（２質量％の寒天を含むＳＤ培地）上にレプリカを作製した。その結果、ＹＭ寒天培地上では増殖できるがＳＤ培地上では増殖できない３種の菌株を取得したので、これらを各種のアミノ酸を添加した最少培地へ移植した。そうすると、当該菌株は、いずれもリジンを加えた培地上でのみ生育を回復したことから、リジン要求性変異株であると考えられた。各菌株を、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）－Ｌ１株、ＧＢ－４（０）－Ｌ８株、及びＧＢ－４（０）－Ｌ１４株と名付けた。
(3) Acquisition of auxotrophic mutants by ultraviolet irradiation Antactica strain GB-4(0) was inoculated into a test tube containing 5 mL of YM medium and cultured with shaking at 30° C. and 160 rpm for 24 hours. 1 mL of this culture solution was added to a petri dish containing 30 mL of cold sterilized water, and the mixture was irradiated with ultraviolet rays for 60 seconds while stirring with a stirrer. All the UV-irradiated cells were collected by centrifugation, resuspended in 5 mL of YM medium, and then subjected to recovery culture at 30° C. and 160 rpm for 3 hours. After recovery culture, 1 mL of the culture solution was collected, and the cells were washed twice with sterilized water. medium) and cultured with shaking at 30°C and 160 rpm for 4.5 hours to promote nitrogen starvation and cessation of cell growth. Nitrogen-starved cells were harvested and the cells were washed twice with sterile water and then resuspended in 4 mL of SD NaNO 3 medium using sodium nitrate as the nitrogen source for the SD medium. This was cultured with shaking at 30° C. and 160 rpm for 3 hours to promote proliferation of non-auxotrophic cells. 500 μL of nystatin solution (100 μg/mL) was added to this culture solution, and the culture was further shaken at 30° C. and 160 rpm for 1 hour to kill proliferating cells that are not auxotrophic (nystatin concentration). After diluting the concentrated
（４）取得したリジン要求性変異株の変異遺伝子の同定
パン酵母Ｓ．セレヴィシエのリジン合成関連の遺伝子情報に基づき、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノム情報から、相同遺伝子ＰａＬＹＳ１、ＰａＬＹＳ２、ＰａＬＹＳ４、ＰａＬＹＳ９、ＰａＬＹＳ１２、ＰａＬＹＳ２０を見出した。Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅させた各遺伝子を、取得した３種の菌株（Ｌ１株、Ｌ８株、及びＬ１４株）に導入し、最小培地における増殖が回復するかどうか調べた。その結果、Ｌ１株は、ＰａＬＹＳ１２遺伝子断片（Ｌｙｓ１２－ｐｒｏ－６１８ Ｆ及びＬｙｓ１２－ｔｅｒ＋１７８２ Ｒをプライマーとして使用）を導入した場合に増殖が回復したことから、ＰａＬＹＳ１２変異株と同定された。Ｌ８株は、ＰａＬＹＳ２０遺伝子断片（Ｌｙｓ２０－２１－６１８ Ｆ１及びＬｙｓ２０－２１＋１８０２ Ｒ４をプライマーとして使用）を導入した場合に増殖が回復したことから、ＰａＬＹＳ２０変異株と同定された。Ｌ１４株は、ＰａＬＹＳ２遺伝子断片（ＬＹＳ２ ｐｒｏ Ｆ及びＬＹＳ２ ｔｅｒ Ｒをプライマーとして使用）を導入した場合に増殖が回復したことから、ＰａＬＹＳ２変異株と同定された。
(4) Identification of Mutant Gene of Acquired Lysine-requiring Mutant S. cerevisiae Based on the genetic information related to lysine synthesis in P. cerevisiae, From the genome information of Antactica strain GB-4(0), homologous genes PaLYS1, PaLYS2, PaLYS4, PaLYS9, PaLYS12 and PaLYS20 were found. P. Each gene amplified by PCR from the genomic DNA of the Antactica GB-4 (0) strain is introduced into the three strains obtained (L1 strain, L8 strain, and L14 strain), and whether the growth in the minimal medium recovers. I checked. As a result, the L1 strain was identified as a PaLYS12 mutant because growth was restored when the PaLYS12 gene fragment (Lys12-pro-618 F and Lys12-ter+1782 R were used as primers) was introduced. The L8 strain was identified as a PaLYS20 mutant because growth was restored when the PaLYS20 gene fragment (Lys20-21-618 F1 and Lys20-21+1802 R4 were used as primers) was introduced. The L14 strain was identified as a PaLYS2 mutant because growth was restored when the PaLYS2 gene fragment (LYS2 pro F and LYS2 ter R were used as primers) was introduced.
また、Ｌ１株のゲノム配列を解読し、親株であるＧＢ－４（０）株のゲノム配列と比較した。その結果、Ｌ１株では、ＰａＬＹＳ１、ＰａＬＹＳ２、ＰａＬＹＳ４、ＰａＬＹＳ９、及びＰａＬＹＳ２０は健全であったが、ＰａＬＹＳ１２塩基配列の前半（５’末端側）の以下に示す６７２ｂｐ（下線部はイントロン）及び当該遺伝子の上流側の配列を含む７８２７ｂｐが欠損していることがわかった。 In addition, the genome sequence of the L1 strain was decoded and compared with the genome sequence of the parent strain GB-4(0) strain. As a result, in the L1 strain, PaLYS1, PaLYS2, PaLYS4, PaLYS9, and PaLYS20 were healthy, but the following 672 bp (underlined intron) of the first half (5' end side) of the PaLYS12 base sequence and the gene It was found that 7827 bp including the upstream sequence was deleted.
ATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTGGTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAGTACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAG（配列番号２１） ATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTG GTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAG TACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAG（配列番号２１）
上記欠損部分の推定アミノ酸配列は以下のとおりである。
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYE（配列番号２２）
The deduced amino acid sequence of the deleted portion is as follows.
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYE (SEQ ID NO: 22)
〔実施例３〕リジン要求性株を利用した生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥ高生産セルフクローニング株の作製
（１）目的
前述のＬ１株を宿主として選択し、ＰａＬＹＳ１２を遺伝子導入マーカーとして用いて、同種の細胞の遺伝子のみで構成したタンパク質高生産用カセットを導入し、セルフクローニングによるタンパク質高生産システムを構築する。Ｐ．アンタクティカでは、キシロース存在下でＰａＸＹＮ１プロモーター制御下の遺伝子が強力に発現誘導されることがわかっている（国際公開第２０１４／１０９３６０号）。そこで、ＰａＸＹＮ１プロモーターの制御下でＰａＥを生産させるセルフクローニング株を作製する。
[Example 3] Production of self-cloning strain with high production of biodegradable plastic-degrading enzyme PaE using lysine-requiring strain (1) Purpose A high protein production system is constructed by self-cloning by introducing a high protein production cassette composed only of the genes of the cells. P. In Antactica, it is known that the expression of genes under the control of the PaXYN1 promoter is strongly induced in the presence of xylose (International Publication No. 2014/109360). Therefore, a self-cloning strain is constructed that produces PaE under the control of the PaXYN1 promoter.
（２）材料
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・ＳＤＰ寒天培地
アミノ酸と（ＮＨ4）2ＳＯ4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．１７質量％
グルコース ２．０質量％
０．５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4溶液 ５ｍＬ／Ｌ
寒天 ２．０質量％
・ＸＹ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） １質量％
キシロース ６質量％
・３ｘＦＭＭ（Ｆｕｎｇａｌ ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）８％キシロース培地
ＮａＮＯ3 ０．２質量％
ＫＨ2ＰＯ4 ０．０６質量％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０６質量％
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．３質量％
キシロース ８．０質量％
・ＹＰＸ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） １質量％
バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ２質量％
キシロース ８質量％
・３ｘＦＭＭ（Ｆｕｎｇａｌ ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地
ＮａＮＯ3 ０．２質量％
ＫＨ2ＰＯ4 ０．０６質量％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０６質量％
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．３質量％
ＰＢＳＡエマルジョン＊ ０．５質量％
キシロース ８．０質量％
寒天 ２質量％
＊ビオノーレエマルジョンＥＭ－３０１（ＰＢＳＡ）（昭和電工株式会社製）
(2) Materials The composition of the medium used in this example was as follows.
・SDP agar medium Bactoyeast nitrogen base (Difco Laboratories) containing no amino acids and (NH 4 ) 2 SO 4 0.17% by mass
Glucose 2.0% by mass
0.5M Na2HPO4 solution 5mL /L
Agar 2.0% by mass
・ XY medium yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 1% by mass
・3xFMM (Fungal minimum medium) 8% xylose medium NaNO 3 0.2% by mass
KH2PO4 0.06 % by mass
0.06 % by mass of MgSO4.7H2O
Yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 0.3% by mass
Xylose 8.0% by mass
・ YPX medium yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 1% by mass
Bactopeptone (manufactured by Difco Laboratories) 2% by mass
・3xFMM (Fungal minimum medium)-0.5% PBSA emulsion ・8% xylose agar medium NaNO 3 0.2 mass%
KH2PO4 0.06 % by mass
0.06 % by mass of MgSO4.7H2O
Yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 0.3% by mass
PBSA emulsion * 0.5 mass%
Xylose 8.0% by mass
* Bionol Emulsion EM-301 (PBSA) (manufactured by Showa Denko K.K.)
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・ＰＬＹＳ１２ Ｆ－１
5'-ACGGCCAGTGAATTCGTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3'（配列番号２３）
・ＴＬＹＳ１２－ＴＸＹＮ Ｒ
5'-AAAGAGAACGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3'（配列番号２４）
・ＰＸＹＮ Ｆ
5'-ACCGAGCTCGAATTCCACGCCACGTTCGATACCGAC-3'（配列番号２５）
・ＰＸＹＮ－ＰａＥＧ Ｒ
5'-AACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTGGG-3'（配列番号２６）
・ＴＸＹＮ－ＰａＥＧ Ｆ
5'-AGGGATAATCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTAT-3'（配列番号２７）
・ＴＸＹＮ－ＴＬＹＳ１２ Ｒ
5'-ACTTCTCGTTCTCTTTTTGCCAGGTGTTGGACT-3'（配列番号２８）
・ＰａＥＧ Ｆ
5'-ACCTTACGATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3'（配列番号２９）
・ＰａＥＧ Ｒ
5'-ACGACGGATTATCCCTGAAGAGCCTTGATACCG-3'（配列番号３０）
・Ｍ１３ Ｆ
5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'（配列番号３１）
・Ｍ１３ Ｒ
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'（配列番号３２）
・ＬＹＳ１２ Ｆ－１０００
5'-GTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3'（配列番号３３）
・ＰＸＹＮ－１５１３ Ｆ
5'-CACGCCACGTTCGATACCGAC-3'（配列番号３４）
The base sequences of the primers used in this example were as follows.
・PLYS12 F-1
5'-ACGGCCAGTGAATTCGTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3' (SEQ ID NO: 23)
・TLYS12-TXYN R
5'-AAAGAGAACGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3' (SEQ ID NO: 24)
・PXYN F
5'-ACCGAGCTCGAATTCCACGCCACGTTCGATACCGAC-3' (SEQ ID NO: 25)
・PXYN-PaEG R
5′-AACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTTGGG-3′ (SEQ ID NO: 26)
・TXYN-PaEG F
5′-AGGGATAATCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTAT-3′ (SEQ ID NO: 27)
・TXYN-TLYS12 R
5′-ACTTCTCGTTCTCTTTTTTTGCCAGGTGTTGGACT-3′ (SEQ ID NO: 28)
・PaEGF
5′-ACCTTACGATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3′ (SEQ ID NO: 29)
・PaEG R
5'-ACGACGGATTATCCCTGAAGAGCCTTGATACCG-3' (SEQ ID NO: 30)
・M13F
5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 31)
・M13R
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 32)
・LYS12F-1000
5'-GTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3' (SEQ ID NO: 33)
・PXYN-1513F
5′-CACGCCACGTTCGATACCGAC-3′ (SEQ ID NO: 34)
（３）ＰａＥ高発現用遺伝子カセットの作製
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示すプライマーを用いて、リジン合成遺伝子ＰａＬＹＳ１２及びそのプロモーター及びターミネーター、ＰａＸＹＮ１のプロモーター（ＰＸＹＮ）、ＰａＸＹＮ１のターミネーター（ＴＸＹＮ）、並びにＰａＥをコードする遺伝子であるＰａＣＬＥ１のセルフクローニング用の遺伝子断片を増幅した。
ＰａＬＹＳ１２（プロモーター及びターミネーターを含む）、ＰＸＹＮ、ＴＸＹＮ、及びＰａＣＬＥ１の遺伝子配列は以下のとおりである。
・ＰａＬＹＳ１２（プロモーター及びターミネーターを含む）（２７８１ｂｐ（構造遺伝子領域１３１３ｂｐ、プロモーター領域９９９ｂｐ、及びターミネーター領域４６９ｂｐ）；下線部はイントロン）
CGTACATATAGTTGGCCGCTGCATATACACAACCTTGTGGCAGTCTCCCTCGTCTTCAACACTTACTCCGTACGATCCATGCCCGCGCTCACGAAAGTCATCGTAGATGACCAATGACTGAGATTGTTCAAGTGTGGTTGAGCATTACGCAAACGGAATGAGACTCACACATGTACGCGTGCTTCCTTCAACCTGATCAGCCTCTGCACCGTCGTCGTCCATCCCGGACTCTTGTGTTGCTCCGTGCTGCTGCAGTCGTAAGGGCCCAAGATCGACAACGGTGCGGTGCAACACCAAAACAGTTCCTTCCTTGGGCATCATGCAATTCATCGGTCACACTGTCAATCCCCAATCCTCGAACCGTCCTGTCGGACTGTCTGCAGTGGACAGGCGTGTTCCACAGACAGAACCCACAGGTGGCTGCGCGATGCCGCGAGTCTTCCACAAAAATTGAGGCGCAGTGGATATCCACGTCTCCTCCCACACGAAGACCGTCTGCATTTCGGCCCGATCTATAGACTCGAGACAAGATGGCATTACGAGCCGCCGTGTGAAGACGCTCAAAGTGCAAAGATCTTGTCCAGAAAAAAAAAAGGAAGGATGCGGGAGAGCACCAAAAAAAGACAAAAAGGAATGACCAGCCTGGGGCTCGAACCCAGAATCTCCTGATTAGCGGCTGTTCACGAAGAACAGAACGTCGTAGTCAGACGCCTTACCATTGGGCCAACCGGCCTTTGTTGAAAGCAGGCTAGAACATTGCATACATATAGACGTAGACCAGATCCAAAGAGTCATTTCGATCCGACCACCTCCGACGAGCTGGAAGACCTGAAAACCAGCCGTGACTCGCTTGGCGCGGGTGCATCGGCAGGGCAGGGAAGGGTGGACAAGGCACAAGGCGAGCCCGGGAAAATGCCGAAGCTGTCCAACCGATTGCCCCTTCTTCTTCCACCCCCACCTAGACCTCTTGCTTTGCTCGTCCCACCCACACAGTCCAAGATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTGGTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAGTACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATGGTAAGCCCCATCCTCCGTCTTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAGGGCGAGCCGGTCCACGGTTCGGCGCCCGATATCGCGGGTCAGGGCAAGGCGAACCCGATCGCCTCGATCCGCTCCGCCGCCCTCATGCTCGAATACATGGGCTACACCGAGCCTGCGCTCAAGATCTACACGGCCGTCGACCAGGTCATCCGCGAGGGCAAGTACCTCACCCCAGACCTCGGCGGATCCGCCACCACCACCCAGTGCGAAGAGGCCATCCTCAAAAAGATCAACGCCTAGATCGTCACTCAGCCCTGAGGCACCAAAAATCTTCTCTTCGCCTTGTCTCTTCCATTTGGGAAATCAATCGCATGCCCACCTCACTCTTCGCGCCTCTGGATTCCAATGTTCCGATGCGGCTTGGCAAGTGCTCAACTGAGGACTGAGTTTTGTGAACTGGAATCGGATGCAAAATGAATGTTGGGCATTGCAGAGAGGGGCGACACATGATGCGATGACTCTGCTCGCTTCAACGGGGAGCGAGGACGCTATTTTTATTTACAGGCCAAGTCGGGAGGAAAGCTGATCTTGGCGAAAGGGGAAGACCTACTTGCGGATGGCGTAAGCGGTCTGGCGATCGGAGCCGGCCTGGCCGCGCTCGGTCAAGCCGAGACCGTATCGGCGCAGCCTGATGGCCTGGACGGTGATGAAGCCGCTGGTGGCAGCCGAGTCGAAGCCACCCTGCTCGTCCATGGAGGTGAACTTCTCG（配列番号３５）
The gene sequences of PaLYS12 (including promoter and terminator), PXYN, TXYN, and PaCLE1 are as follows.
- PaLYS12 (including promoter and terminator) (2781 bp (structural gene region 1313 bp, promoter region 999 bp, and terminator region 469 bp); underlined intron)
GTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAG TACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATG GTAAGCCCCATCCTCCGTCTTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAG （配列番号３５）
・ＰＸＹＮ（１５１３ｂｐ）
GAATTCCACGCCACGTTCGATACCGACCAGCCACTCACAGCACACGCCAGCGTCGGTGGCAGCGACAATCTTGCGCGCGTCACCCGCCGAGGCGTTGAGCTCGACATCCACATCGACGTCTTTGCTGCGTCTTCTGGATCGAAGCTGGTGATGCGACAGATCATCACAATTCTCGCCCTCGGACCGTCTGCACCGCGGTCGAAAGCACCACCACCTGCAGAGTCACTCGATCGACCGCGCAAGGATGCGGACTACACGAGCACGGGCACGATCAAGATGCACTCGACCTCGCCGCGCGCATGGTGCCGCGTGTGCGGCGACTACAATCCGATCCACGTCTCGTCGCTGCTCGCGCGCCTGTTCGGCTTCCGCGGCAAGATCGCGCACGGCAACCATGTCGTAGCGCACCTGCTGCATCTGGTCTCGTCCGCTTCTGGGCCAGGTTCTGTGCGCGAGATTACCGACACTAGCAAGGGAAAGCGTTGGTGGATCGAGATGCACTTTAAGCGGCCTATGATTTTGCCACTTCAGCTCGAGGCACAGATCGCCGTCGACAATACAGGGGCGGAATGGAGGTGCAGCGGTGCTAAGGACGACAAGGTTTACGTTCAGGGTTCCATCGGCGCTCTGTAACATTGAGCTAAGGACGGTGCAGTGCATCGTGCAACCAAGCAGTGTTTCGTGTCGCAGTTCCGGAAGAATCACAGAACGGGACATGGCCCTCCGATTCTTCGCAGTGGTGTGACTGGTGAGTCCGACTGGATCTTGATCGCGGGAATCTATGGGGTGCAGTCGAGAAGCGAGCTTCGGCTGAGTGCTGTGCGGGGAGCCGATGCAGACCGGCGACGTTTCAGCCACGAGGCGTGTCACCTCGCGCTCATCTCGGCGTGGCGTCTTTGCGCATGGCTGAAGCTTTGGCTCTGACAACCAACCTAGTCGCTACAGCTTTGATGCGTGGTAACGAGGCAACCGCGAAGGATACCGAAGCATGACAGACAGCAGGGATGGCTCGGAGCCTAAGTTGATCGAAAAGGGTTGCAGTGCGAATCGCGTTTATGCACAACCCCGCTTCGCTTAGGCCATGCATCTGGAAGCGTAATGCTTGCACCGTGGCGCTCCAACGAACCGGTTTGGCGCTAACCATAATGGGCGTGTGGTTGTCAGGCAGCGCACGGACAGCCAGCGTGCGATACTGTGCACCAGGGTCGCCGGTGTCACATAGGTGCCTACTGCAGCATCGTGCCGCGATGGAAGCTCGGCGTGATTCAGCTGATCGTGGGCCAGGTCAGACTTGAACCCCAGCGGTTATCGCTGTAGCAGCACTACCGGCAGGTGGCCCTTGCAATGTACATGGTCCGGACACTACTTTGCCGGTCTCACTGTAATGCTGTACCCAGCATCAAGCTCTTGGAAGGTATAAAGGGACGACGTCGTCGTATCTGCTCGAGTACCTAGCCCAACGAACCCAAAGGAACCCATCGAACAGGACCCAAAACGCCAAACAAACCTTACG（配列番号３６）
・PXYN (1513bp)
(SEQ ID NO: 36)
・ＴＸＹＮ（３００ｂｐ）
TCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTATGATGCATCGGGACCCGAGTCCACCATGCAATCCAGATACGAGTGTTGCTCTCTTCTTGGCTCACTTTACGCGTCTGTTTGAGTGGGGCGCGGGGAGGAAAAAAGGCTGAGTTCGCTGGGCCACGCGCGTGGAAGCAAGACTGCTGCTGAGCCCTTTTTCTCTTGCGCTGAGAGAGTCGCGGCGTGCGGCCCCTTTTTTTATTAATACTAATATTATAGACTCTGAAGGAAATCGCGCTCGTGGTCAGTCGAGTCCAACACCTGGCAAAAAGAGAA（配列番号３７）
・TXYN (300bp)
TCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTATGATGCATCGGGACCCGAGTCCACCATGCAATCCAGATACGAGTGTTGCTCTCTTCTTGGCTCACTTTACGCGTCTGTTTGAGTGGGGCGCGGGGAGGAAAAAAGGCTGAGTTCGCTGGGCCACGCGCGTGGAAGCAAGACTGCTGCTGAGCCCTTTTTCTCTTGCGCTGAGAGAGTCGCGGCGTGCGGCCCCTTTTTTTATTAATACTAATATTATAGACTCTGAAGGAAATCGCGCTCGTGGTCAGTCGAGTCCAACACCTGGCAAAAAGAGAA（配列番号３７）
・ＰａＣＬＥ１（６７５ｂｐ）
ATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCGCCCTCGTCCTTGCCGCCGCTGGTCTCGTGCAGGCTGCTCCGCTCCAGGAGCGTGCTGGCTGTTCGTCGTACGTCATCATCAACACTCGCGGTACCAGCGAGCCTCAGGGTCCCTCGGTCGGCTTCCGGACCATGAACACCCGCATTCGCTCCGCCGTTTCGGGTGGCTCCGAATACGACACCGTCTACCCAGCCGGTATCGACCAGAACTCGGCCCAGGGTACTGCCAACATCGTGGCCCAGGTCAAGGCCGGTCTGGCCCGCAACCCCAACACGTGCTTCCTCCTCGAGGGCTACTCCCAGGGCGCCGCTGCCACCTGCAATGCCCTTCCTCAGCTTACTGGTGCGGCGTTCGACGCCGTCAAGGGTGTCATTCTTATCGGCAACCCCGAACACAAGCCCAACCTCGCTTGCAACGTCGATGGTAACGGTGGCAAGACCACCTTCAGCGCCAGAGGTATCTCGGCTGCTTTCACCCAGGGCGTCCCCTCCAACTGGGTCTCCAAGACGCTCGACATCTGCATCTACGGCGACGGAGTTTGCGACGTCAGCTCCGGATTCGGAATCACCCCCCAGCACCTTACCTACGGATACAACACCAACGTTCAGACCATGGGCGCCAACTTCGGTATCAAGGCTCTTCAGGGATAA（配列番号３８）
- PaCLE1 (675bp)
(SEQ ID NO: 38)
上記４種の遺伝子断片を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて、ＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９に結合した。作製したプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αにヒートショック法で導入し、これをアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播いて３７℃で培養した。一晩で増殖してきたコロニーについて、上記遺伝子断片の作製に使用したプライマーセットを用いてコロニーＰＣＲを行い、４種の遺伝子断片が正しく導入されているコロニーを選び出して、約５．３ｋｂｐの遺伝子断片含むプラスミドｐＰａＬＹＳ１２Ｘ－ＰａＥＧを作製した。当該プラスミド中のＰａＥの高発現用カセットの構成を図３に示す。ＰａＥをコードする遺伝子ＰａＣＬＥ１は、キシラナーゼプロモーター及びターミネーターの間に位置しており、ＰａＬＹＳ１２の塩基配列（２種のイントロンを含む）は、ＰａＬＹＳ１２のプロモーター及びターミネーターの間に位置している。 The above four gene fragments were ligated to EcoRI-cleaved plasmid pUC19 using In-fusion HD cloning kit (Clontech). The prepared plasmid was introduced into Escherichia coli DH5α by the heat shock method, which was plated on ampicillin-containing LB agar medium and cultured at 37°C. Colonies that have grown overnight are subjected to colony PCR using the primer set used for the preparation of the above gene fragments. A plasmid containing pPaLYS12X-PaEG was generated. FIG. 3 shows the structure of the high expression cassette for PaE in the plasmid. The PaCLE1 gene encoding PaE is located between the xylanase promoter and terminator, and the PaLYS12 nucleotide sequence (including two introns) is located between the PaLYS12 promoter and terminator.
（４）リジン要求性変異株を用いたＰａＥ高生産株の作製
上記プラスミドｐＰａＬＹＳ１２Ｘ－ＰａＥＧを鋳型にし、Ｍ１３ ＦとＭ１３ Ｒをプライマーとして用いたＰＣＲで遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片５μｇを、ＧＢ－４（０）株のリジン要求性変異株であるＬ１株にエレクトロポーレーションにより導入し、リン酸２ナトリウムを含むＳＤ（ＳＤＰ）寒天培地上に塗布後、３０℃で培養した。２日後に、プレート一枚当たり約２０個の大きいコロニーが出現した（疑似陽性と思われる小コロニーは１００個程度）。このうち８０コロニーをランダムに新たなＳＤＰ寒天培地に釣菌した。釣菌した形質転換体についてそれぞれ、５ｍＬのＹＸ培地を含む試験管に１白金耳接種し、３０℃、１６０ｒｐｍで、３日間振とう培養した。
(4) Preparation of PaE high-producing strain using lysine-requiring mutant A gene fragment was amplified by PCR using the plasmid pPaLYS12X-PaEG as a template and M13 F and M13 R as primers. 5 μg of the resulting gene fragment was introduced into the L1 strain, which is a lysine-auxotrophic mutant of the GB-4(0) strain, by electroporation, and spread on an SD (SDP) agar medium containing disodium phosphate. Cultured at 30°C. After 2 days, about 20 large colonies appeared per plate (about 100 small colonies considered to be false positives). Of these, 80 colonies were randomly picked onto a new SDP agar medium. One loopful of each of the fished transformants was inoculated into a test tube containing 5 mL of YX medium, and cultured with shaking at 30° C. and 160 rpm for 3 days.
形質転換した各菌株について３回の培養を独立して繰り返し、培養上清のＰａＥの酵素活性（ＰａＥ活性）を調べた。ＰａＥ活性の測定は、従来の方法に従って行った。すなわち、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に、吸光度（ＯＤ６６０）が約０．６５となるようにＰＢＳＡエマルジョンを懸濁した。その水懸濁液１．９ｍＬを口径１３ｍｍの試験管に入れ、上記培養上清を適宜希釈して１００μＬ加え、３０℃、１８０ｒｐｍで１５分間振とうし、水懸濁液の吸光度を測定した。酵素活性の単位として、１分間当たりに吸光度を１．０減少させる酵素量を１Ｕと定義した。 Three cultures were independently repeated for each transformed strain, and the enzyme activity of PaE (PaE activity) in the culture supernatant was examined. PaE activity was measured according to conventional methods. That is, the PBSA emulsion was suspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) so that the absorbance (OD660) was about 0.65. 1.9 mL of the aqueous suspension was placed in a test tube with a diameter of 13 mm, and 100 μL of the above-mentioned culture supernatant was appropriately diluted, added, shaken at 30° C. and 180 rpm for 15 minutes, and the absorbance of the aqueous suspension was measured. As a unit of enzyme activity, the amount of enzyme that reduces the absorbance by 1.0 per minute was defined as 1 U.
ＰａＥ活性値が高い複数の形質転換体を選抜し、これらの菌株とＧＢ－４（０）株とをそれぞれフラスコ培養して、ＰａＥ活性及び乾燥菌体質量を比較した。具体的には、ＹＭ培地５ｍＬを含む試験管に、選抜株又はＧＢ－４（０）株を１白金耳植菌し、３０℃、１６０ｒｐｍ、２４時間で前培養を行った。３ｘＦＭＭ－８％キシロース培地２０ｍＬを含む１００ｍＬ容三角フラスコに前培養液を２００μＬ接種し、３０℃、１４０ｒｐｍで、９６時間振とう培養を行った。各株について３回の培養を独立して繰り返し、各培養液上清液のＰａＥ活性を測定した。また、培養後の各株の菌体を遠心分離により回収し、乾燥させて、その質量を計測した。これらの結果を表２に示す。
Ｌ１－Ｓ９株、Ｌ１－Ｓ１２株、Ｌ１－Ｓ２４株、Ｌ１－Ｓ３３株、Ｌ１－Ｓ４９株、及びＬ１－Ｓ７６株の培養上清は、ＧＢ－４（０）株の培養上清よりもＰａＥ活性が高かったので、これらの菌株は、ＰａＥ高発現用遺伝子断片導入株として使用することができる。特に、Ｌ１－Ｓ３３株、Ｌ１－Ｓ４９株、及びＬ１－Ｓ７６株の培養上清は高いＰａＥ活性を示し、Ｌ１－Ｓ１２株の培養上清が最も高いＰａＥ活性を示した。従来、カビなどの研究では、外来遺伝子の染色体中への挿入位置によって、当該遺伝子の発現量が異なる場合があることが知られているので、本実施例においても、各菌株間でＰａＥ活性が異なった理由としては、本実施例で使用した遺伝子カセットの染色体への挿入位置が、菌株ごとに異なっていたためであろうと考えられる。 The culture supernatants of strains L1-S9, L1-S12, L1-S24, L1-S33, L1-S49, and L1-S76 have higher PaE than the culture supernatant of strain GB-4(0). Since the activity was high, these strains can be used as gene fragment-introduced strains for high expression of PaE. In particular, the culture supernatants of strains L1-S33, L1-S49, and L1-S76 exhibited high PaE activity, and the culture supernatant of strain L1-S12 exhibited the highest PaE activity. Conventionally, in research on fungi, etc., it is known that the expression level of a foreign gene may differ depending on the insertion position of the foreign gene into the chromosome. The reason for the difference is considered to be that the insertion position of the gene cassette used in this example into the chromosome was different for each strain.
（５）リジン要求性変異株を用いた別のＰａＥ高生産株の作製
ベクター由来の配列を一切含まず、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株由来の配列のみを含む遺伝子導入用の遺伝子断片を、次の２通りの方法で作製した。
（ｉ）上記項目（３）で作製したプラスミドｐＰａＬＹＳ１２Ｘ－ＰａＥＧを大腸菌ＤＨ５αで増幅し、増幅したプラスミドを抽出して制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した。この遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＰａＥの高発現用カセットを含む５２６８ｂｐの遺伝子断片のみを回収及び精製した。
（ｉｉ）上記項目（３）で作製したプラスミドｐＰａＬＹＳ１２Ｘ－ＰａＥＧを鋳型にし、ＬＹＳ１２ Ｆ－１０００とＰＸＹＮ－１５１３ Ｆをプライマーとして用いたＰＣＲで遺伝子断片を増幅した。増幅した遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＰａＥの高発現用カセットを含む５２６２ｂｐの遺伝子断片のみを回収及び精製した。
(5) Construction of another PaE high-producing strain using a lysine-requiring mutant, P. A gene fragment for gene transfer containing only sequences derived from Antactica strain GB-4(0) was prepared by the following two methods.
(i) The plasmid pPaLYS12X-PaEG prepared in item (3) above was amplified with E. coli DH5α, and the amplified plasmid was extracted and treated with the restriction enzyme EcoRI. This gene fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and only the 5268 bp gene fragment containing the high expression cassette of PaE was recovered and purified.
(ii) Using the plasmid pPaLYS12X-PaEG prepared in item (3) above as a template, a gene fragment was amplified by PCR using LYS12 F-1000 and PXYN-1513 F as primers. The amplified gene fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and only the 5262 bp gene fragment containing the high PaE expression cassette was recovered and purified.
上記（ｉ）又は（ｉｉ）の方法で得られた遺伝子断片を、ＧＢ－４（０）株のリジン要求性変異株であるＬ１株に導入し、ＳＤＰ寒天培地上に塗布後、３０℃で培養した。当該培地上で良好な生育を示した株（（ｉ）１８３株及び（ｉｉ）１３０株）を、３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地に接種し、３０℃で２～３日培養後のハロの大きさを計測した。それぞれ３回実施し、ハロの直径とコロニーの直径の差（［ハロの直径］－［コロニーの直径］）の平均値が３．５以上である菌株を選抜した（（ｉ）１１５株及び（ｉｉ）７６株）。 The gene fragment obtained by the method (i) or (ii) above was introduced into the L1 strain, which is a lysine-auxotrophic mutant of the GB-4(0) strain. cultured. Strains that showed good growth on the medium ((i) 183 strains and (ii) 130 strains) were inoculated onto a 3xFMM-0.5% PBSA emulsion/8% xylose agar medium and incubated at 30°C for 2-3 days. The size of the halos after day-long culture was measured. Each was performed three times, and strains with an average value of the difference between the halo diameter and the colony diameter ([halo diameter] - [colony diameter]) of 3.5 or more were selected ((i) 115 strains and ( ii) 76 strains).
選抜した菌株をＹＰＸ培地に移し、２ｍＬディープウェルプレートで６６時間培養して、その上清のＰａＥ活性を評価した。ＰａＥ活性の測定は、上記（４）に記載の方法を一部改変（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーに代えて２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）を使用し、試験管に代えてマイクロプレートを使用）して実施した。ＰａＥ活性値が高い複数の形質転換体（（ｉ）４株及び（ｉｉ）８株）を選抜した。 Selected strains were transferred to YPX medium, cultured in 2 mL deep well plates for 66 hours, and the PaE activity of the supernatant was assessed. The PaE activity was measured by partially modifying the method described in (4) above (using 25 mM HEPES buffer (pH 7.3) instead of Tris-HCl buffer and using microplates instead of test tubes). implemented. A plurality of transformants with high PaE activity values ((i) 4 strains and (ii) 8 strains) were selected.
選抜した合計１２株の形質転換体と、コントロールとしてＬ１株にＬＹＳ１２遺伝子のみを導入した株（Ｌ１－Ｌｙｓ１２－１）とを、ＹＰＸ培地を２０ｍＬ含む１００ｍＬ容フラスコにそれぞれ２００μＬずつ接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間回転振とう培養した。各株について３回の培養を独立して繰り返し、各培養液上清液のＰａＥ活性を測定した。ＰａＥ活性の測定は、上記（４）に記載の方法を一部改変（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーに代えて２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）を使用）して実施した。また、培養後の各株の菌体を遠心分離により回収し、乾燥させて、その質量を計測した。これらの結果を表３に示す。 A total of 12 selected transformants and a strain (L1-Lys12-1) in which only the LYS12 gene was introduced into the L1 strain as a control were inoculated into 100 mL flasks containing 20 mL of YPX medium, 200 μL each, and incubated at 30 ° C. , and cultured with rotary shaking at 200 rpm for 72 hours. Three cultures were independently repeated for each strain, and the PaE activity of each culture supernatant was measured. PaE activity was measured by partially modifying the method described in (4) above (using 25 mM HEPES buffer (pH 7.3) instead of Tris-HCl buffer). In addition, after culturing, the cells of each strain were collected by centrifugation, dried, and weighed. These results are shown in Table 3.
遺伝子断片を上記（ｉ）及び（ｉｉ）のどちらの方法で作製しても、当該遺伝子断片を導入した菌株の培養上清は、いずれもコントロールであるＬ１－Ｌｙｓ１２－１株よりもＰａＥ活性が高かったので、これらの菌株は、ＰａＥ高発現用遺伝子断片導入株として使用することができる。特に、Ｌ１－１－３株（ＧＢ－４（０）ＰＧＢ４７４株）及びＬ１－２－１０７株（ＧＢ－４（０）ＰＧＢ４８０株）の培養上清は、他の形質転換体と比較して高いＰａＥ活性を示した。 Regardless of which method (i) or (ii) is used to prepare the gene fragment, the culture supernatant of the strain into which the gene fragment has been introduced has higher PaE activity than the control L1-Lys12-1 strain. These strains can be used as gene fragment-introduced strains for high PaE expression. In particular, the culture supernatants of the L1-1-3 strain (GB-4 (0) PGB474 strain) and L1-2-107 strain (GB-4 (0) PGB480 strain) were compared with other transformants. It showed high PaE activity.
〔実施例４〕Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性変異株の作製
（１）目的
野生型のＳ．セレヴィシエは、ピリミジン生合成経路の中間代謝物のアナログである５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）とウラシルを添加したＳＤ寒天培地では生育できず、ウラシル生合成関連遺伝子（ＵＲＡ３）に変異を有するウラシル要求性変異株のみが生育することができる。この性質を利用して、効率的にＳ．セレヴィシエのウラシル要求性変異株を取得する方法が報告されている（Ｂｏｅｋｅ ＪＤら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８４），１９７，３４５）。また、Ｓ．セレヴィシエのウラシル要求性株を宿主とし、ウラシル生合成遺伝子を遺伝子導入用のマーカー遺伝子として用いて形質転換した場合、当該マーカー遺伝子を形質転換体から除去することが可能である（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．２９３－２９８）。そのため、形質転換及びマーカー遺伝子の除去を繰り返して、複数の遺伝子を同一個体の染色体上に導入することができる。一方、Ｐ．アンタクティカについては、ウラシル要求性変異株は未だ報告されていない。したがって、本実施例では、Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性変異株の取得を試みた。このような変異株は、セルフクローニングなど有用な育種へ利用できる可能性がある。
[Example 4] P.I. Generation of uracil auxotrophic mutants of Antactica (1) Purpose Wild-type S. cerevisiae cerevisiae cannot grow on SD agar medium supplemented with 5-fluoroorotic acid (5-FOA), an intermediate metabolite in the pyrimidine biosynthetic pathway, and uracil, and has a mutation in the uracil biosynthesis-related gene (URA3). Only uracil-requiring mutants can grow. Utilizing this property, S. A method for obtaining a uracil-requiring mutant of S. cerevisiae has been reported (Boeke JD et al., Mol. Gen. Genet. (1984), 197, 345). Also, S. When a uracil-requiring strain of C. cerevisiae is used as a host and a uracil biosynthetic gene is used as a marker gene for gene introduction, the marker gene can be removed from the transformant (Christine Guthrie ed., Methods in enzymes, vol.194, Guide to yeast genetics and molecular biology, p.293-298). Therefore, multiple genes can be introduced onto the chromosome of the same individual by repeating transformation and marker gene removal. On the other hand, P.I. No uracil-requiring mutant strain of Antactica has been reported yet. Therefore, in this embodiment, P.I. An attempt was made to obtain a uracil-requiring mutant of Antactica. Such mutant strains may be used for useful breeding such as self-cloning.
（２）材料
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・ＹＰＤ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） １質量％
バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ２質量％
グルコース ２質量％
・ＹＭ寒天培地
２．０質量％の寒天を含むＹＭ培地
・ＳＤ寒天培地
２．０質量％の寒天を含むＳＤ培地
・ＳＤ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地
アミノ酸と（ＮＨ4）2ＳＯ4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製） ０．１７質量％
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５質量％
グルコース ２質量％
ウラシル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製） １０００ｍｇ／Ｌ
５’－フルオロオロチン酸（Ｗａｋｏ社製） １０００ｍｇ／Ｌ
寒天 ２質量％
(2) Materials The composition of the medium used in this example was as follows.
・ YPD medium yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 1% by mass
Bactopeptone (manufactured by Difco Laboratories) 2% by mass
・YM agar medium: YM medium containing 2.0 % by mass of agar ・SD agar medium: SD medium containing 2.0% by mass of agar Base (manufactured by BD bioscience) 0.17% by mass
( NH4 ) 2SO4 0.5% by mass
Uracil (manufactured by Sigma-Aldrich) 1000 mg / L
5′-fluoroorotic acid (manufactured by Wako) 1000 mg / L
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・ＰａＵＲＡ３－６５１
5'-CGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3'（配列番号３９）
・ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃ
5'-GTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3'（配列番号４０）
・ＰａＵＲＡ３－３００
5'-GCTGCAGCTGCAGCTCTCCAAGCTG-3'（配列番号４１）
・ＰａＵＲＡ３＋１５０
5'-GTGCGATGCCGTCGGCCCAGAC-3'（配列番号４２）
The base sequences of the primers used in this example were as follows.
・PaURA3-651
5'-CGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3' (SEQ ID NO: 39)
・PaURA3+1449c
5'-GTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3' (SEQ ID NO: 40)
・PaURA3-300
5′-GCTGCAGCTGCAGCTCTCCAAGCTG-3′ (SEQ ID NO: 41)
・PaURA3+150
5′-GTGCGATGCCGTCGGCCCAGAC-3′ (SEQ ID NO: 42)
（３）Ｐ．アンタクティカのＵＲＡ３相同配列（ＰａＵＲＡ３）の抽出
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノム配列から、Ｓ．セレヴィシエ由来のＵｒａ３タンパク質と８２％の相同性があるタンパク質をコードする遺伝子配列を抽出した。これをＰａＵＲＡ３と名付けた。ＰａＵＲＡ３の塩基配列は前述のとおり（配列番号１３）である。
(3) P.S. Extraction of the URA3 homologous sequence (PaURA3) of Antactica P. From the genome sequence of strain Antactica GB-4(0), S. A gene sequence encoding a protein with 82% homology to the Ura3 protein from S. cerevisiae was extracted. This was named PaURA3. The base sequence of PaURA3 is as described above (SEQ ID NO: 13).
（４）紫外線（ＵＶ）の照射によるＰ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株の取得
１）ＰａＵＲＡ３変異候補株の取得
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株を、２ｍＬのＹＰＤ液体培地を含む試験管中で、３０℃、１５０ｒｐｍで、一晩振とう培養した。菌体を遠心分離し、濁度（６００ｎｍ）が１．０になるように液体の最小培地に懸濁し、この懸濁液のうち２００μＬをＳＤ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地に塗布した。これにＵＶランプの光を３分間照射した後、３０℃で５日間培養した。その結果、１２個のコロニーが得られた。
(4) P.I. by irradiation with ultraviolet (UV) light. Acquisition of uracil-requiring mutant strain of Antactica GB-4(0) strain 1) Acquisition of PaURA3 mutation candidate strain P.1. Antactica strain GB-4(0) was cultured overnight with shaking at 30° C. and 150 rpm in a test tube containing 2 mL of YPD liquid medium. The cells were centrifuged and suspended in a liquid minimal medium so that the turbidity (600 nm) was 1.0, and 200 μL of this suspension was spread on SD+U+FOA medium. After irradiating this with UV lamp light for 3 minutes, it was cultured at 30° C. for 5 days. As a result, 12 colonies were obtained.
２）ＰａＵＲＡ３変異株の選抜
上記１）で取得した１２個のコロニーの増殖を、ＹＭ寒天培地又はＳＤ寒天培地で観察した。これらの内１株（Ｎｏ．８）はどの培地でも増殖し、また別の１株（Ｎｏ．９）はどの培地でも増殖しなかったため、これら２株は目的の栄養要求性変異株では無いと判断した。他の株は、ＳＤ寒天培地上では増殖しない一方でＹＭ寒天培地では増殖し、かつＳＤ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地でも増殖したため、ウラシル要求性であることが期待された。
2) Selection of PaURA3 Mutants The growth of the 12 colonies obtained in 1) above was observed on YM agar medium or SD agar medium. One of these strains (No. 8) grew in any medium, and another strain (No. 9) did not grow in any medium, so these two strains were not the desired auxotrophic mutants. It was judged. The other strains were expected to be uracil auxotrophs because they did not grow on SD agar medium but grew on YM agar medium and also grew on SD+U+FOA medium.
ウラシル要求性を示した１０株に対して、ＰａＵＲＡ３遺伝子断片を導入し、ＳＤ寒天培地に塗布して形質転換体の出現を観察した。具体的には、ＹＰＤ液体培地で培養したＰ．アンタクティカの細胞を、４０質量％のポリエチレングリコール３３５０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．２Ｍの酢酸リチウム、及び０．１Ｍのジチオトレイトールを含む形質転換バッファーに懸濁した。ＰａＵＲＡ３遺伝子断片は、ＰａＵＲＡ３－６５１及びＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃをプライマーとして使用し、ＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより作製した。Ｐ．アンタクティカの細胞懸濁液に、一本鎖サケ***ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びＰａＵＲＡ３遺伝子断片を添加して、３７℃で６０分間静置した後に、ＳＤ寒天培地に塗布し、３０℃で静置培養を行った。 A PaURA3 gene fragment was introduced into 10 strains exhibiting uracil auxotrophy, and an SD agar medium was plated to observe the appearance of transformants. Specifically, P. spp. cultured in YPD liquid medium. Antactica cells were suspended in transformation buffer containing 40% by weight polyethylene glycol 3350 (Sigma-Aldrich), 0.2 M lithium acetate, and 0.1 M dithiothreitol. The PaURA3 gene fragment was generated by PCR from GB-4(0) strain genomic DNA using PaURA3-651 and PaURA3+1449c as primers. P. Single-stranded salmon sperm DNA (ssDNA) (manufactured by Sigma-Aldrich) and PaURA3 gene fragment were added to the cell suspension of Antactica, allowed to stand at 37° C. for 60 minutes, and then spread on SD agar medium. Static culture was performed at 30°C.
形質転換体が出現した場合、導入されたＰａＵＲＡ３によってウラシル要求性が相補されたと考えられるため、取得した変異株をＰａＵＲＡ３が機能しない変異体であるとみなすことができる。ＰａＵＲＡ３遺伝子断片の導入の結果、３株（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、及びＮｏ．７）は、形質転換体が安定して出現し、他のものは形質転換体が多くは現れなかったため、当該３株はＰａＵＲＡ３に変異を有するウラシル要求性変異株であることがわかった。中でもＮｏ．２の株は、形質転換体であるコロニーの出現効率が良かったため、ＰＧＢ０４５株と名付け、以降の研究に使用した。プライマーＰａＵＲＡ３－３００又はＰａＵＲＡ３＋１５０でＰａＵＲＡ３周辺の配列を解析した結果、ＰＧＢ０４５株では、ＰａＵＲＡ３遺伝子の８６７番目のＣがＴに変わっており、ストップコドンが生じていることがわかった。残りの７株については、ＰａＵＲＡ３ではなくＰａＵＲＡ５の変異が推測される。 When a transformant appears, it is considered that the introduced PaURA3 complements the uracil auxotrophy, and thus the obtained mutant can be regarded as a mutant in which PaURA3 does not function. As a result of the introduction of the PaURA3 gene fragment, three strains (No. 1, No. 2, and No. 7) stably produced transformants, and the other strains did not produce many transformants. These three strains were found to be uracil-requiring mutant strains having mutations in PaURA3. Among them, No. The strain No. 2 was named PGB045 strain and used for the subsequent studies because the efficiency of colony emergence as a transformant was high. As a result of analyzing the sequence around PaURA3 using primers PaURA3-300 or PaURA3+150, it was found that in the PGB045 strain, C at position 867 of the PaURA3 gene was changed to T, resulting in a stop codon. For the remaining 7 strains, mutations in PaURA5 rather than PaURA3 are assumed.
（５）ＰａＵＲＡ３自然変異株の取得
紫外線照射による変異株の作製においては、目的遺伝子以外の染色体部位にも変異が生じる可能性があり、その結果、酵素生産や増殖、ストレス耐性に悪影響を与える場合がある。一方、変異頻度が低い天然の環境から得たＰａＵＲＡ３変異株であれば、染色体上のＰａＵＲＡ３以外の部位は健全である可能性が高い。しかし、野生型のＧＢ－４（０）株をＳＤ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地上に塗布しただけでは、増殖するコロニーはなく、天然のＰａＵＲＡ３変異株は取得できない。そこで、自然変異株の選抜効率が高くなるように、培地の組成を調製した。
(5) Acquisition of PaURA3 natural mutants In the production of mutants by ultraviolet irradiation, mutations may occur in chromosomal sites other than the target gene, and as a result, enzyme production, growth, and stress resistance may be adversely affected. There is On the other hand, in the case of a PaURA3 mutant obtained from a natural environment with a low mutation frequency, there is a high possibility that sites other than PaURA3 on the chromosome are healthy. However, when the wild-type GB-4(0) strain was simply spread on SD+U+FOA medium, no growing colonies were observed, and a natural PaURA3 mutant strain could not be obtained. Therefore, the composition of the medium was adjusted so as to increase the selection efficiency of spontaneous mutant strains.
２倍濃度のＹＭ培地に、ウラシル及びＦＯＡを、終濃度がそれぞれ（ａ）２５０ｍｇ／ｍＬ及び１０００ｍｇ／ｍＬ、又は、（ｂ）６００ｍｇ／Ｌ及び２０００ｍｇ／Ｌとなるように加えて、平板培地（ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ）を作製した。Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株を、５ｍＬのＹＭ培地中で３０℃、１６０ｒｐｍで、２４時間振とう培養し、その培養液５０μＬを、口径９ｃｍの各ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ寒天培地上に塗布したところ、培地（ａ）からは４０個のコロニーが出現し、培地（ｂ）からは１０個のコロニーが出現した。培地（ａ）のコロニーのうち２つがＳＤ培地で生育しないものであり、培地（ｂ）のコロニーの全てがＳＤ培地で生育しないものだった。 A plate medium ( YM+U+FOA) was prepared. P. Antactica strain GB-4(0) was cultured in 5 mL of YM medium at 30° C. and 160 rpm with shaking for 24 hours, and 50 μL of the culture medium was spread on each YM+U+FOA agar medium with a diameter of 9 cm. 40 colonies emerged from a) and 10 colonies from medium (b). Two of the colonies on medium (a) did not grow on SD medium and all of the colonies on medium (b) did not grow on SD medium.
ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃ及びＰａＵＲＡ３－３００をプライマーとして用いたＰＣＲによりＰａＵＲＡ３遺伝子断片を調製し、ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地上に出現したコロニー由来の細胞に形質転換した。その結果、培地（ａ）のコロニー由来の１株及び培地（ｂ）のコロニー由来の２株が、形質転換後にＳＤ培地上での増殖を回復した。ＰａＵＲＡ３がウラシル要求性を相補したＧＢ－４（０）株由来のこれら３株は、ＰａＵＲＡ３変異株と考えられ、それぞれＰＧＢ３７１株、ＰＧＢ３７３株、及びＰＧＢ３７８株と名付けた。 A PaURA3 gene fragment was prepared by PCR using PaURA3+1449c and PaURA3-300 as primers and transformed into cells derived from colonies that appeared on YM+U+FOA medium. As a result, one strain derived from the colony on medium (a) and two strains derived from the colony on medium (b) recovered growth on SD medium after transformation. These three strains derived from strain GB-4(0), in which PaURA3 complemented the uracil auxotrophy, were considered PaURA3 mutant strains and designated strains PGB371, PGB373, and PGB378, respectively.
プライマーＰａＵＲＡ３－３００又はＰａＵＲＡ３＋１５０でＰａＵＲＡ３周辺の配列を解析した結果、ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地（ａ）から選抜したＰＧＢ３７１株では、ＰａＵＲＡ３遺伝子の６１４番目の塩基Ｔが欠損することにより、フレームシフトが生じていた。ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地（ｂ）から選抜したＰＧＢ３７３及びＰＧＢ３７８では、ＰａＵＲＡ３の１１３番目のＣがＧに変わっており、その結果、３８番目のアミノ酸配列のセリンがトリプトファンに変化していることがわかった。ＰＧＢ３７３及びＰＧＢ３７８は、ＧＢ－４（０）株を、ＹＭ液体培地を入れた１つの容器で培養後、同じ選択培地に塗布して取得したものであるので、変異が生じた１つの細胞に由来する子孫である可能性が考えられる。残りの７株（ＰＧＢ３７２、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８０、３８１、及び３８２）については、ＰａＵＲＡ３ではなくＰａＵＲＡ５の変異が推測される。 As a result of analyzing the sequence around PaURA3 using primers PaURA3-300 or PaURA3+150, the PGB371 strain selected from the YM+U+FOA medium (a) exhibited a frameshift due to deletion of T at position 614 of the PaURA3 gene. In PGB373 and PGB378 selected from YM+U+FOA medium (b), 113th C of PaURA3 was changed to G, and as a result, it was found that serine at 38th amino acid sequence was changed to tryptophan. PGB373 and PGB378 were obtained by culturing the GB-4(0) strain in one vessel containing a YM liquid medium and then coating it on the same selective medium, so they are derived from one mutated cell. It is conceivable that they may be descendants of For the remaining 7 strains (PGB372, 374, 375, 376, 377, 379, 380, 381 and 382) mutations in PaURA5 but not in PaURA3 are speculated.
（６）さらなるウラシル要求性変異株の取得
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株以外のシュードザイマ属菌についても、ウラシル要求性変異株の取得を試みた。まず、各種菌を５ｍＬのＹＭ培地中で３０℃、１６０ｒｐｍで、２４時間振とう培養し、ＹＭ培地で生育したときの形態を微分干渉装置が付いた光学顕微鏡で観察した。Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株（図２Ａ）、Ｐ．アンタクティカＯＭＭ６２－２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２３９）（図２Ｂ）、Ｐ．フロキュローサＪＣＭ１０３２１株（図２Ｃ）、及びＰ．ツクバエンシスＪＣＭ１０３２４株（図２Ｉ）は、偽菌糸を形成していなかったのに対して、Ｐ．アンタクティカＪＣＭ３９４１株（図２Ｄ）、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（１）Ｗ株（図２Ｅ）、Ｐ．アンタクティカＴ－３４株（図２Ｆ）、Ｐ．ルグローサＪＣＭ１０３２３株（図２Ｇ）、及びＰ．アフィディスＪＣＭ１０３１８株（図２Ｈ）は、偽菌糸を形成していた。
(6) Acquisition of additional uracil-requiring mutants P.S. An attempt was made to obtain uracil-requiring mutant strains of Pseudozyma spp. other than the Antactica GB-4(0) strain. First, various bacteria were shake-cultured in 5 mL of YM medium at 30° C. and 160 rpm for 24 hours, and the morphology when grown in YM medium was observed with an optical microscope equipped with a differential interference device. P. Antactica strain GB-4(0) (Fig. 2A), P. Antactica strain OMM62-2 (accession number NITE P-02239) (Fig. 2B), P. flocculosa strain JCM10321 (Fig. 2C), and P. tsukubaensis strain JCM10324 (Fig. 2I) did not form pseudohyphae, whereas P. tsukubaensis strain JCM10324 (Figure 2I) did not form pseudohyphae. Antactica strain JCM3941 (Fig. 2D), P. Antactica GB-4(1) W strain (Fig. 2E), P. Antactica strain T-34 (Fig. 2F), P. lugrosa strain JCM10323 (Fig. 2G), and P. Aphidis strain JCM10318 (Fig. 2H) formed pseudohyphae.
次に、上記ＹＭ培地での培養液５０μＬを、口径９ｃｍのＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ寒天培地（ｂ；６００ｍｇ／Ｌのウラシル及び２０００ｍｇ／ＬのＦＯＡを含む）の上に塗布した。そして、この培地（ｂ）上で生育したコロニーの中から、ＳＤ培地上では生育しない菌株、すなわちウラシル要求性変異株を選別した。当該変異株の取得数を、親株の形態の観察結果と併せて以下の表４に示す。
表４に示されているように、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株以外のシュードザイマ属菌を使用した場合でも、ウラシル要求性変異株を取得することができた。特に、偽菌糸を形成しないシュードザイマ属の菌株は、偽菌糸を形成する菌株に比べて、ウラシル要求性変異株の取得効率が高かった。本実施例の（４）に記載の方法と同様にして、Ｐ．アンタクティカＯＭＭ６２－２株から取得したウラシル要求性変異株にＰａＵＲＡ３を導入した。すなわち、ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃ及びＰａＵＲＡ３－３００をプライマーとして用いたＰＣＲによりＧＢ－４（０）株ゲノムＤＮＡから増幅させたＰａＵＲＡ３遺伝子断片を、上記変異株に形質転換すると、６株中２株はＳＤ培地上で生育するようになったので、当該２株はＵＲＡ３に変異を有する自然変異株であることがわかった。 As shown in Table 4, P. Even when Pseudozyma spp. other than Antactica strain GB-4(0) was used, uracil-requiring mutant strains could be obtained. In particular, strains of the genus Pseudozyma that do not form pseudohyphae were more efficient in obtaining uracil-requiring mutants than strains that form pseudohyphae. In the same manner as the method described in (4) of this example, P. PaURA3 was introduced into the uracil-requiring mutant obtained from the Antactica OMM62-2 strain. That is, when the PaURA3 gene fragment amplified from the GB-4(0) strain genomic DNA by PCR using PaURA3+1449c and PaURA3-300 as primers was transformed into the above mutant strain, 2 out of 6 strains appeared on SD medium. These two strains were found to be natural mutant strains having mutations in URA3, since they began to grow.
また、偽菌糸を形成するＰ．アンタクティカＴ－３４株では、今までウラシル要求性変異株を作製することができなかった。しかし、ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ寒天培地（ｂ）を用いた選抜により、頻度は低いものの、１株のウラシル要求性変異株を取得することができた。この株にＧＢ－４（０）株ゲノムＤＮＡから増幅させたＰａＵＲＡ３遺伝子断片を形質転換すると、ＳＤ培地上で生育するようになったことから、当該菌株はＵＲＡ３に変異を有する自然変異株であることがわかった。さらに、Ｐ．ツクバエンシスＪＣＭ１０３２４株のウラシル要求性を示した６株に、ＧＢ－４（０）株ゲノムＤＮＡから増幅させたＰａＵＲＡ３遺伝子断片を形質転換すると、２株がＳＤ培地上で生育するようになったので、当該２株はＵＲＡ３に変異を有する自然変異株であることがわかった。 Also, P. cerevisiae forming pseudohyphae. In the Antactica T-34 strain, it has not been possible to generate uracil-requiring mutants so far. However, by selection using YM+U+FOA agar medium (b), one uracil-requiring mutant strain could be obtained, although the frequency was low. When this strain was transformed with the PaURA3 gene fragment amplified from the GB-4(0) strain genomic DNA, it grew on the SD medium. I understood it. Furthermore, P.I. When 6 strains of the Tsukubaensis JCM10324 strain that showed uracil auxotrophy were transformed with the PaURA3 gene fragment amplified from the GB-4(0) strain genomic DNA, 2 strains grew on the SD medium. , the two strains were found to be natural mutant strains having mutations in URA3.
このように、ＹＭ＋Ｕ＋ＦＯＡ培地（ｂ）を使用することで、様々なシュードザイマ属菌のウラシル要求性変異株を取得することができる。そして、取得されたウラシル要求性変異株の中から各菌のＵＲＡ３相同遺伝子に変異が生じたものを選抜することも可能であり、選抜したＵＲＡ３変異株のウラシル要求性を、ＧＢ－４（０）株ゲノムＤＮＡから増幅させたＰａＵＲＡ３遺伝子断片で相補することもできる。従って、種々のシュードザイマ属菌について、ＵＲＡ３変異株を取得し、ＰａＵＲＡ３を遺伝子導入マーカーに用いた外来遺伝子の導入による形質転換が可能であることが示された。 Thus, by using the YM+U+FOA medium (b), various Pseudozyma spp. uracil-requiring mutant strains can be obtained. Then, among the obtained uracil auxotrophic mutants, it is also possible to select those in which the URA3 homologous gene of each bacterium is mutated. ) strain genomic DNA. Therefore, it was shown that various Pseudozyma strains can be transformed by obtaining URA3 mutant strains and introducing foreign genes using PaURA3 as a gene introduction marker.
〔実施例５〕ウラシル要求性を利用した生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥ高生産セルフクローニング株の作製
（１）目的
Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株は、異種生物由来の遺伝子を使わない遺伝子操作（セルフクローニング）に使用することができる。本実施例では、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥを大量生産するセルフクローニング株を作製する。
[Example 5] Production of self-cloning strain with high production of biodegradable plastic-degrading enzyme PaE utilizing uracil auxotrophy (1) Purpose The uracil-requiring mutant strain of Antactica strain GB-4(0) can be used for genetic engineering (self-cloning) without using genes derived from heterologous organisms. In this example, a self-cloning strain that mass-produces the biodegradable plastic-degrading enzyme PaE is prepared.
（２）材料
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース平板培地（実施例３（２）に記載のとおり）
(2) Materials The composition of the medium used in this example was as follows.
・3xFMM-PBSA emulsion ・8% xylose plate medium (as described in Example 3 (2))
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・ＰａＣＬＥ１－６２７
5'-GATTCGATACATGGCGTCTCTG-3'（配列番号４３）
・ＰａＵＲＡ３（＋９００－９３２）－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃ
5'-GAGGCCTACCTCGCCCGTCTTGGTCAGAAGTAGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'（配列番号４４）
・ＰａＵＲＡ３－３００（実施例４（２）に記載のとおり）
・ＰａＸＹＮ１－６０９
5'-GGCTGAAGCTTTGGCTCTGACA-3'（配列番号４５）
・ＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＸＹＮ１－１ｃ
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTGGG-3'（配列番号４６）
・ＰａＣＬＥ１＋１
5'-ATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3'（配列番号４７）
・ＰａＵＲＡ３－２００
5'-CCCATTTCTTCCGGTTCACGTGAGC-3'（配列番号４８）
・ＰａＵＲＡ３－１００
5'-TTTGCCTTTGCATGACATTCGCACG-3'（配列番号４９）
・ＳＩｕ－ＰａＣＬＥ１－１５７５
5’-TCATCGATGAATTCGCGTACGATATGCAGCCAATC-3’（配列番号５０）
・ＳＩｄｃ－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃ
5’-CCAGTGTCGAAAACGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'（配列番号５１）
・ＨｉｎｄＩＩＩ－ＰａＵＲＡ３－６５１
5’-CCGCCAGCTGAAGCTCGAGCTGCGACACCTCGA-3’（配列番号５２）
・ＸｂａＩ－ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃ
5’-CGCCTTTTCGTCTAGGTGGCCATTGGCCGTGAC-3’（配列番号５３）
・ＮｄｅＩｕ－ＰａＣＬＥ１＋１７６
5’-GACAATATGTCCATACCGCCGTTTCGGGTGGCTCC-3’（配列番号５４）
・ＮｄｅＩｄｃ－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃ
5’-TGAGAGTGCACCATACACTACCTGTTGCGTTCGTA-3’（配列番号５５）
・ＰａＣＬＥ１－１５７４
5'-CGTACGATATGCAGCCAATCGC-3'（配列番号５６）
・ＰａＵＲＡ３－６５１（実施例４（２）に記載のとおり）
The base sequences of the primers used in this example were as follows.
・PaCLE1-627
5'-GATTCGATACATGGCGTCTCTG-3' (SEQ ID NO: 43)
・PaURA3 (+900-932)-
5′-GAGGCCTACCTCGCCCGTCTTGGTCAGAAGTAGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3′ (SEQ ID NO: 44)
・PaURA3-300 (as described in Example 4 (2))
・PaXYN1-609
5′-GGCTGAAGCTTTGGCTCTGACA-3′ (SEQ ID NO: 45)
・PaCLE1+25c-PaXYN1-1c
5′-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTGGG-3′ (SEQ ID NO: 46)
・
5′-ATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3′ (SEQ ID NO: 47)
・PaURA3-200
5'-CCCATTTCTTCCGGTTCACGTGAGC-3' (SEQ ID NO: 48)
・PaURA3-100
5'-TTTGCCTTTGCATGACATTCGCACG-3' (SEQ ID NO: 49)
・SIu-PaCLE1-1575
5'-TCATCGATGAATTCGCGTACGATATGCAGCCAATC-3' (SEQ ID NO: 50)
・SIdc-
5'-CCAGTGTCGAAAACGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3' (SEQ ID NO: 51)
・HindIII-PaURA3-651
5'-CCGCCAGCTGAAGCTCGAGCTGCGACACCTCGA-3' (SEQ ID NO: 52)
・XbaI-PaURA3+1449c
5′-CGCCTTTTCGTCTAGGTGGCCATTGGCCGTGAC-3′ (SEQ ID NO: 53)
・NdeIu-PaCLE1+176
5′-GACAATATGTCCATACCGCCGTTTCGGGTGGCTCC-3′ (SEQ ID NO: 54)
・NdeIdc-
5'-TGAGAGTGCACCATACACTACCTGTTGCGTTCGTA-3' (SEQ ID NO: 55)
・PaCLE1-1574
5'-CGTACGATATGCAGCCAATCGC-3' (SEQ ID NO: 56)
・PaURA3-651 (as described in Example 4 (2))
（３）セルフクローニング用の遺伝子配列の作製
ＰａＵＲＡ３を選抜マーカーに用いて、Ｐ．アンタクティカ由来の配列のみで構成されるＰａＥ高発現用の遺伝子断片を導入するために、それぞれのプロモーター領域及びターミネーター領域を含んだＰａＵＲＡ３遺伝子とＰａＣＬＥ１遺伝子とを、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を利用した遺伝子導入法（Ｈｏｓｈｉｄａら、Ｙｅａｓｔ（２０１４）、３１、２９－４６）を応用して接続する。この方法に従えば、外部から導入した２種の遺伝子断片を生体内で接続させ、その接続された遺伝子断片を保有する菌株だけを培地上に生育させて回収することができる。
(3) Preparation of gene sequence for self-cloning Using PaURA3 as a selection marker, P. In order to introduce a gene fragment for high expression of PaE composed only of sequences derived from Antactica, non-homologous end joining (NHEJ) was applied to the PaURA3 gene and PaCLE1 gene, each of which contains the respective promoter and terminator regions. They are connected by applying a gene introduction method (Hoshida et al., Yeast (2014), 31, 29-46). According to this method, two types of gene fragments introduced from the outside can be connected in vivo, and only strains having the connected gene fragments can be grown on a medium and recovered.
まず、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＰａＣＬＥ１－６２７及びＰａＵＲＡ３（＋９００－９３２）－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃをプライマーとして用いて、ＰａＣＬＥ１の遺伝子断片を増幅した。このＰａＣＬＥ１遺伝子断片においては、ＰａＣＬＥ１遺伝子の３’末端側に、ＰａＵＲＡ３の遺伝子配列の一部が逆向きに付加されている（図４左上）。次に、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＰａＵＲＡ３－３００及びＰａＵＲＡ３＋８９９ｃをプライマーとして用いて、ＰａＵＲＡ３の遺伝子断片を増幅した。このＰａＵＲＡ３遺伝子断片においては、ＰａＵＲＡ３遺伝子の３’末端側の配列が欠けており（図４右上）、このままではＰａＵＲＡ３として機能しない。これら２種の遺伝子断片を、ＰａＵＲＡ３に変異を有するＰＧＢ０５０株に同時に導入し、導入細胞内での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって結合された両遺伝子断片を含む菌株、すなわち機能するＰａＵＲＡ３を有する菌株を（図４）、ＳＤ培地に生育した形質転換体として取得した。ＰａＣＬＥ１とＰａＵＲＡ３の接続を、コロニーＰＣＲによって評価し、接続が認められた形質転換体をＰＧＢ３５７と名付けた。 First, P.I. A gene fragment of PaCLE1 was amplified from chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) using PaCLE1-627 and PaURA3(+900-932)-PaCLE1+1426c as primers. In this PaCLE1 gene fragment, a portion of the PaURA3 gene sequence is added in the opposite direction to the 3' end of the PaCLE1 gene (Fig. 4, upper left). Next, P.I. A gene fragment of PaURA3 was amplified from chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) using PaURA3-300 and PaURA3+899c as primers. This PaURA3 gene fragment lacks the 3' terminal sequence of the PaURA3 gene (Fig. 4, upper right), and does not function as PaURA3 as it is. These two gene fragments are simultaneously introduced into the PGB050 strain having a mutation in PaURA3, and a strain containing both gene fragments joined by non-homologous end joining (NHEJ) in the introduced cell, that is, a strain having functional PaURA3. (Fig. 4) was obtained as a transformant grown on SD medium. Connection between PaCLE1 and PaURA3 was evaluated by colony PCR, and a transformant in which connection was observed was named PGB357.
（４）セルフクローニング株の作製
シュードザイマ属菌（酵母）では、キシロース存在下でＰａＸＹＮ１プロモーター制御下の遺伝子が強力に発現誘導されることが知られている。そこで、ウラシル要求性を利用して、ＰａＸＹＮ１プロモーター制御下でＰａＥを生産するセルフクローニング株を作製することにした。このために、フュージョンＰＣＲを行い、ＰａＸＹＮ１プロモーターとＰａＣＬＥ１（ＰａＥの構造遺伝子）を繋げた遺伝子カセットを作製する。
(4) Preparation of self-cloning strain In Pseudozyma spp. (yeast), it is known that the expression of genes under the control of the PaXYN1 promoter is strongly induced in the presence of xylose. Therefore, we decided to construct a self-cloning strain that produces PaE under the control of the PaXYN1 promoter by utilizing the uracil auxotrophy. For this purpose, fusion PCR is performed to prepare a gene cassette connecting the PaXYN1 promoter and PaCLE1 (the structural gene of PaE).
まず、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＰａＸＹＮ１－６０９及びＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＸＹＮ１－１ｃをプライマーとして用いて、ＰａＸＹＮ１プロモーター遺伝子を増幅した。次に、ＰＧＢ３５７の染色体ＤＮＡから、ＰａＵＲＡ３－３００及びＰａＣＬＥ１＋１をプライマーとして用いて、ＰａＣＬＥ１及びＰａＵＲＡ３を含んだ遺伝子断片を増幅した。そして、これら２つの遺伝子断片を、フュージョンＰＣＲによって接続した（図５）。ＰａＸＹＮ１プロモーター側のプライマーとしては、ＰａＸＹＮ１－６０９を使用した。一方で、ＰａＵＲＡ３側のプライマーとしては、ＰａＵＲＡ３－３００だけでなく、増幅するプロモーター配列がＰａＵＲＡ３－３００よりも短いＰａＵＲＡ３－２００又はＰａＵＲＡ３－１００も使用して、プロモーターの長さの異なる３種の遺伝子断片を作製した（図５）。これは、ＰａＵＲＡ３のプロモーター配列を削り、発現を弱めることで、一度に複数の遺伝子断片が導入されないと十分な量のＰａＵＲＡ３が産生できず、選択培地上で増殖できない状況を作り出すことを意図したものである。そうすることで、複数の遺伝子断片が導入された形質転換体、すなわちＰａＥを大量に産生することのできる形質転換体を取得できることが期待される。作製した遺伝子カセットを、ＰＧＢ０４５株（紫外線照射で取得したＰａＵＲＡ３変異株）及びＰＧＢ３７１株（ＰａＵＲＡ３自然変異株）に導入し、形質転換体（セルフクローニング株）を取得した。 First, P.I. The PaXYN1 promoter gene was amplified from the chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) using PaXYN1-609 and PaCLE1+25c-PaXYN1-1c as primers. Next, a gene fragment containing PaCLE1 and PaURA3 was amplified from the chromosomal DNA of PGB357 using PaURA3-300 and PaCLE1+1 as primers. These two gene fragments were then connected by fusion PCR (Fig. 5). PaXYN1-609 was used as a primer on the PaXYN1 promoter side. On the other hand, as primers on the PaURA3 side, not only PaURA3-300 but also PaURA3-200 or PaURA3-100, which have a shorter promoter sequence than PaURA3-300, were used to amplify three genes with different promoter lengths. Fragments were generated (Fig. 5). This is intended to create a situation in which sufficient amounts of PaURA3 cannot be produced unless multiple gene fragments are introduced at once by cutting the promoter sequence of PaURA3 and attenuating its expression, making it impossible to grow on a selective medium. is. By doing so, it is expected that a transformant into which a plurality of gene fragments have been introduced, that is, a transformant capable of producing a large amount of PaE can be obtained. The prepared gene cassette was introduced into the PGB045 strain (PaURA3 mutant strain obtained by ultraviolet irradiation) and the PGB371 strain (PaURA3 spontaneous mutant strain) to obtain transformants (self-cloning strains).
（５）セルフクローニング株のＰａＥ活性の評価
取得した形質転換体を、ＰＢＳＡを含んだ平板培地（３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・８質量％キシロース）に塗布し、ＰＢＳＡの分解を評価した。この平板培地は、従来用いていた２層の培地（３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・大豆油重層平板培地；要すれば後述の実施例７も参照）に比べて多くのＰＢＳＡエマルジョンを含むため、ＰＢＳＡを分解して透明な領域（ハロ）を形成させるためには、より多くのＰＢＳＡ分解酵素が必要となる。また、炭素源にキシロースを用いているので、ＰａＸＹＮ１プロモーター制御下の遺伝子を強力に発現誘導する。この培地上で上記形質転換体を３０℃で培養すると、３日目には、ハロを形成する形質転換体が観察され、６日目にはハロがより明確に観察されるようになった。ＰａＣＬＥ１及びＰａＵＲＡ３の遺伝子配列を含むが、プロモーターの長さが異なる３種類の遺伝子断片のいずれかを導入した形質転換体について、コロニーを５０個ずつ観察し、ＰＢＳＡエマルジョンを分解して比較的明確なハロの形成が観察されたコロニーの数を数えた。ＰａＵＲＡ３紫外線変異株であるＰＧＢ０４５株に遺伝子導入して取得した形質転換体についての結果を表５に示す。
(5) Evaluation of PaE Activity of Self-Cloned Strains The obtained transformants were spread on a plate medium containing PBSA (3×FMM-PBSA emulsion, 8 mass % xylose), and PBSA degradation was evaluated. This plate medium contains more PBSA emulsion than the conventional two-layer medium (3xFMM-PBSA emulsion/soybean oil overlay plate medium; if necessary, see Example 7 below), so PBSA is degraded. more PBSA-degrading enzyme is required to form a clear region (halo). Moreover, since xylose is used as a carbon source, it strongly induces the expression of genes under the control of the PaXYN1 promoter. When the above transformant was cultured on this medium at 30° C., on the third day, a transformant forming a halo was observed, and on the sixth day, the halo was observed more clearly. 50 colonies were observed for each transformant into which one of the three types of gene fragments containing the gene sequences of PaCLE1 and PaURA3 but having different promoter lengths was introduced, and the PBSA emulsion was decomposed to give a relatively clear expression. The number of colonies in which halo formation was observed was counted. Table 5 shows the results of transformants obtained by gene introduction into the PGB045 strain, which is a PaURA3 ultraviolet mutant strain.
表５に示されているように、当初の予測どおり、短いプロモーターを用いた断片を導入した方が、大きいハロを形成するコロニーの取得率が高い傾向があった。続いて、ＰａＵＲＡ３－２００を用いて増幅した断片を導入した２－５０株と、ＰａＵＲＡ３－１００を用いた断片を導入した３－３６株を選び、これらを３０ｍＬの３ｘＦＭＭ－８質量％キシロースを含む３００ｍＬ容三角フラスコに植菌した。そして、２４、４８、及び７２時間培養後に培養上清中のＰａＥ活性を測定した。 As shown in Table 5, as initially expected, introduction of a fragment using a short promoter tended to result in a higher yield of colonies forming a large halo. Subsequently, the 2-50 strain into which the fragment amplified using PaURA3-200 was introduced and the 3-36 strain into which the fragment using PaURA3-100 was introduced were selected, and these were added to 30 mL of 3xFMM-8% by mass xylose. A 300 mL Erlenmeyer flask was inoculated. After culturing for 24, 48, and 72 hours, the PaE activity in the culture supernatant was measured.
ＰａＥ活性の測定は、実施例３（４）に記載の方法と同様にして行った。その結果を表６に示す。
表６から理解できるように、親株と比較して、遺伝子導入株ではＰａＥ活性が上昇していたので、ＰａＥの生産性が向上しているものと考えられる。また、ＰａＵＲＡ３自然変異株であるＰＧＢ３７１株に遺伝子導入して取得した形質転換体についても、ＰａＵＲＡ３プロモーターを短くすることにより、導入した遺伝子の発現量が高い菌株が取得される傾向が高く、ＰＧＢ０４５株を親株として用いた上述の実験結果と同様の実験結果が得られた。 As can be understood from Table 6, the PaE activity was increased in the transgenic strain compared to the parent strain, and thus the PaE productivity is considered to be improved. In addition, regarding the transformant obtained by introducing the gene into the PGB371 strain, which is a PaURA3 natural mutant, there is a high tendency to obtain a strain with a high expression level of the introduced gene by shortening the PaURA3 promoter, and the PGB045 strain. As the parent strain, the same experimental results as those described above were obtained.
（６）別のセルフクローニング株の作製
（６－１）プラスミドの作製
ＥＵＲＯＳＣＡＲＦより提供されたｐＡＧ３２プラスミド（図６左）を、ＳａｃＩによって処理して線状化した。また、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＳＩｕ－ＰａＣＬＥ１－１５７５及びＳＩｄｃ－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ＰａＣＬＥ１の遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片を、上記線状化ｐＡＧ３２にクローニングして、プラスミドｐＹＴ０２６（図６中）を作製した。
(6) Preparation of another self-cloning strain (6-1) Preparation of plasmid The pAG32 plasmid (Fig. 6, left) provided by EUROSCARF was treated with SacI to linearize it. Also, P.I. A gene fragment of PaCLE1 was amplified from chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) by PCR using SIu-PaCLE1-1575 and SIdc-PaCLE1+1426c as primers. This gene fragment was cloned into the linearized pAG32 to generate plasmid pYT026 (in FIG. 6).
そして、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＰａＵＲＡ３－６５１及びＸｂａＩ－ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃをプライマーとし用いたＰＣＲによって、ＰａＵＲＡ３の遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩによって線状化したｐＹＴ０２６にクローニングして、プラスミドｐＹＴ１０８（図６右）を作製した。このｐＹＴ１０８では、ｐＹＴ０２６中に存在していた薬剤耐性遺伝子ｈｐｈＭＸ４が、Ｐ．アンタクティカ由来のＰａＵＲＡ３で置換されている。 And P.S. A gene fragment of PaURA3 was amplified from chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) by PCR using HindIII-PaURA3-651 and XbaI-PaURA3+1449c as primers. This gene fragment was cloned into pYT026 linearized with restriction enzymes HindIII and XbaI to generate plasmid pYT108 (FIG. 6, right). In this pYT108, the drug resistance gene hphMX4 present in pYT026 was transformed into P. PaURA3 from Antactica has been substituted.
（６－２）遺伝子カセットのドナー株の作製
ＰａＣＬＥ１とＰａＵＲＡ３が接続された遺伝子カセット（ＰａＣＬＥ１－ＰａＵＲＡ３ｃ）を効率よく利用できるようにするため、ＰａＣＬＥ１－ＰａＵＲＡ３ｃのドナー株を作製した。
すなわち、制限酵素ＥｃｏＲＶによってｐＹＴ１０８を線状化し、ＰａＣＬＥ１－１５７４及びＰａＵＲＡ３－６５１をプライマーとしたＰＣＲによって、ＰａＣＬＥ１－ＰａＵＲＡ３ｃを作製した。この遺伝子断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離及び抽出して、ＰＧＢ０４５株（紫外線照射で取得したＰａＵＲＡ３変異株）に導入し、形質転換体ＰＧＢ４５９株を作製した。このＰＧＢ４５９株をドナー株として使用する。
(6-2) Preparation of Gene Cassette Donor Strain In order to efficiently use the gene cassette (PaCLE1-PaURA3c) in which PaCLE1 and PaURA3 are connected, a PaCLE1-PaURA3c donor strain was prepared.
Specifically, pYT108 was linearized with the restriction enzyme EcoRV, and PaCLE1-PaURA3c was prepared by PCR using PaCLE1-1574 and PaURA3-651 as primers. This gene fragment was separated and extracted by agarose gel electrophoresis and introduced into the PGB045 strain (PaURA3 mutant strain obtained by ultraviolet irradiation) to prepare the transformant PGB459 strain. This PGB459 strain is used as the donor strain.
（６－３）セルフクローニング株の作製
Ｐ．アンタクティカＧＢ４－（０）株の染色体ＤＮＡより、ＰａＸＹＮ１－６０９及びＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＸＹＮ１－１ｃをプライマーとして用いて、ＰａＸＹＮ１プロモーター遺伝子を増幅した。次に、ＰＧＢ４５９株の染色体ＤＮＡより、ＰａＣＬＥ１＋１及びＰａＵＲＡ３－６５１をプライマーとして用いて、ＰａＣＬＥ１－ＰａＵＲＡ３ｃ遺伝子断片を増幅した。そして、これら２つの遺伝子断片を、ＰａＸＹＮ１－６０９及びＰａＵＲＡ３－１００をプライマーとして用いたフュージョンＰＣＲによって接続した。このようにして作製されたＰａＸＹＮ１プロモーター及びＰａＣＬＥ１－ＰａＵＲＡ３ｃを含む遺伝子カセットを、ＰＧＢ３７１株（ＰａＵＲＡ３自然変異株）に導入し、形質転換体（セルフクローニング株）を取得した。
(6-3) Preparation of self-cloning strain P.S. The PaXYN1 promoter gene was amplified from the chromosomal DNA of Antactica strain GB4-(0) using PaXYN1-609 and PaCLE1+25c-PaXYN1-1c as primers. Next, the PaCLE1-PaURA3c gene fragment was amplified from the chromosomal DNA of the PGB459 strain using PaCLE1+1 and PaURA3-651 as primers. These two gene fragments were then connected by fusion PCR using PaXYN1-609 and PaURA3-100 as primers. The gene cassette containing the PaXYN1 promoter and PaCLE1-PaURA3c thus prepared was introduced into the PGB371 strain (PaURA3 natural mutant strain) to obtain a transformant (self-cloning strain).
（６－４）セルフクローニング株のＰａＥ活性の評価
取得した形質転換体を、ＰＢＳＡを含んだ平板培地（３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・８質量％キシロース）に塗布し、ＰＢＳＡの分解を評価した。その結果、ハロを形成する複数の形質転換体が観察され、このうち特にＰＧＢ４６９株は、他の形質転換体よりも大きいハロを示した。
(6-4) Evaluation of PaE Activity of Self-Cloned Strains The obtained transformants were spread on a plate medium containing PBSA (3×FMM-PBSA emulsion, 8 mass % xylose), and PBSA degradation was evaluated. As a result, a plurality of transformants forming a halo were observed, among which the PGB469 strain in particular exhibited a larger halo than the other transformants.
なお、Ｓ．セレヴィシエなどの他の酵母で示されているように、ウラシル要求性を指標とした遺伝子組換えでは、使用したＵＲＡ３などのマーカー遺伝子を菌体から削除し、同じマーカー遺伝子を繰り返し使用して、１つの菌体に複数の発現カセットを導入することができる。Ｐ．アンタクティカの場合でも、この方法を利用することによって、より多くの発現カセットを有する菌株の作製が可能であると見込まれる。 It should be noted that S. As shown in other yeasts such as cerevisiae, in genetic recombination with uracil auxotrophy as an index, the used marker gene such as URA3 is deleted from the bacterial cell, and the same marker gene is repeatedly used to produce 1 Multiple expression cassettes can be introduced into one cell. P. Even in the case of Antactica, it is expected that it will be possible to create strains with more expression cassettes by using this method.
〔実施例６〕Ｐ．アンタクティカ培養液中の生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥの安定化と濃縮
（１）目的
遺伝子組み換えやセルフクローニング等でＰ．アンタクティカからＰａＥ等の酵素を含む培養液を得た後でも、培養ろ液の状態では、保存、流通過程で目的酵素が安定に保たれている必要がある。また、製造工程で酵素生産菌であるＰ．アンタクティカが、完全に除去ができていない場合や、雑菌が混入すれば、取得した培養ろ液が腐敗する恐れもある。そのため、本実施例では、ＰａＥの活性を極力安全かつ簡便な方法によって長期間安定に保つ方法を確立することを目的とする。また、組換え生物による環境汚染防止の観点から、培養液を（ＰａＥの活性を保ちつつ）無菌化または完全に殺菌する方法を確立することを目的とする。さらに、製品流通コスト低減のため、ＰａＥ溶液の濃縮・コンパクト化を検討する。
[Example 6] P.I. Stabilization and concentration of biodegradable plastic-degrading enzyme PaE in Antactica culture medium (1) Purpose Even after obtaining a culture medium containing an enzyme such as PaE from Antactica, the target enzyme must be stably maintained in the state of the culture filtrate during storage and distribution processes. In the manufacturing process, enzyme-producing bacteria, P. If Antactica is not completely removed, or if it is contaminated with various bacteria, the obtained culture filtrate may spoil. Therefore, the object of this example is to establish a method for keeping the activity of PaE stable for a long period of time by a method that is as safe and simple as possible. Another object of the present invention is to establish a method for sterilizing or completely sterilizing a culture solution (while maintaining PaE activity) from the viewpoint of preventing environmental contamination by recombinant organisms. Furthermore, in order to reduce product distribution costs, we will consider concentrating and compacting the PaE solution.
（２）ＰａＥのエタノールによる沈殿特性
室温（約２０℃）下で、ＰａＥを含むＰ．アンタクティカの培養液とエタノールとを、体積比１００：０（０％エタノール）、７５：２５（２５％エタノール）、５０：５０（５０％エタノール）、３０：７０（７０％エタノール）、又は１０：９０（９０％エタノール）で混合し、変性沈殿物が生じるかどうか調べた。上記培養液としては、Ｌ１－Ｓ１２株の培養上清液をフィルターで濾過し、菌体を除去したろ液を用いた。すると、０％エタノール及び２５％エタノールでは沈殿は生じなかったが、エタノール濃度５０％以上では、エタノール濃度を上げるに従って多くの沈殿が生じた。この沈殿物を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離して回収し、エタノールと混合前の培養液の体積と同量の水で再溶解して、５０％エタノール沈殿物再溶解液（試料Ａ）、７０％エタノール沈殿物再溶解液（試料Ｂ）、及び９０％エタノール沈殿物再溶解液（試料Ｃ）を作製した。そして、上記培養ろ液及び試料Ａ～ＣのＰａＥ活性とタンパク質濃度を測定し、以下の式に従って、ＰａＥ活性の回収率（活性回収率）、タンパク質沈殿率、及び、比活性を計算した。
活性回収率＝１００×再溶解液の全ＰａＥ活性／培養液の全ＰａＥ活性
タンパク質沈殿率＝１００×再溶解液の総タンパク質量／培養ろ液の総タンパク質量 比活性＝１００×（再溶解液の全ＰａＥ活性／再溶解液の総タンパク質量）／（培養液の全ＰａＥ活性／培養ろ液の総タンパク質量）
＝活性回収率×培養ろ液の総タンパク質量／再溶解液の総タンパク質量
なお、本実施例におけるＰａＥ活性（Ｕ／ｍＬ）とは、３０℃下で、２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）中におけるＰＢＳＡエマルジョンの分解活性のことをいい、全ＰａＥ活性とは、前記ＰａＥ活性に試料の体積（ｍＬ）を乗じたものをいう。ＰａＥのエタノールによる沈殿特性の試験結果を表７に示す。
(2) Properties of precipitation of PaE by ethanol At room temperature (approximately 20°C), P.E. Antactica culture medium and ethanol at a volume ratio of 100:0 (0% ethanol), 75:25 (25% ethanol), 50:50 (50% ethanol), 30:70 (70% ethanol), or 10: 90 (90% ethanol) and checked to see if a denatured precipitate formed. As the culture medium, the filtrate obtained by filtering the culture supernatant of the L1-S12 strain with a filter to remove the cells was used. No precipitation occurred with 0% ethanol and 25% ethanol, but with an ethanol concentration of 50% or more, more precipitation occurred as the ethanol concentration increased. The precipitate was collected by centrifugation at 10,000 x g for 10 minutes, redissolved in the same amount of water as the volume of the culture solution before mixing with ethanol, and redissolved in 50% ethanol precipitate (sample A ), a 70% ethanol precipitate redissolved solution (sample B), and a 90% ethanol precipitate redissolved solution (sample C) were prepared. Then, the PaE activity and protein concentration of the culture filtrate and samples A to C were measured, and the PaE activity recovery rate (activity recovery rate), protein precipitation rate, and specific activity were calculated according to the following formulas.
Activity recovery rate = 100 × total PaE activity of redissolved solution / total PaE activity of culture solution Protein precipitation rate = 100 × total protein amount of redissolved solution / total protein amount of culture filtrate Specific activity = 100 × (redissolved solution total PaE activity/total protein amount of reconstituted solution)/(total PaE activity of culture medium/total protein amount of culture filtrate)
= activity recovery rate × total protein amount of culture filtrate/total protein amount of redissolution solution The PaE activity (U/mL) in this example refers to a 25 mM Tris/HCl buffer (pH 9.0) at 30°C. 0), and the total PaE activity is the PaE activity multiplied by the sample volume (mL). Table 7 shows the test results for the precipitation properties of PaE with ethanol.
表７に示されているように、エタノール濃度を上げると、活性回収率も、タンパク質回収率も増加し、９０％エタノールではほぼ完全に活性が回収された。このことは、ＰａＥは高濃度のエタノールによって一時的に変性・沈殿するが、当該沈殿を適切な溶媒によって再溶解すれば、その活性を回復することができることを示している。 As shown in Table 7, increasing the concentration of ethanol increased both activity recovery and protein recovery, with 90% ethanol almost completely recovering activity. This indicates that PaE is temporarily denatured and precipitated by high-concentration ethanol, but its activity can be recovered by redissolving the precipitate in an appropriate solvent.
（３）ＰａＥのエタノール耐性
室温（約２０℃）下で、ＰａＥを含むＬ１－Ｓ１２株の培養ろ液とエタノールとを、体積比１００：０（０％エタノール）、９０：１０（１０％エタノール）、７５：２５（２５％エタノール）、５０：５０（５０％エタノール）、２５：７５（７５％エタノール）、又は１０：９０（９０％エタノール）で混合した。これらの混合液をそのまま室温に放置して、当該混合液中のＰａＥ活性の経時的な変化を調べた。沈殿が生じたものについては、活性測定直前にタッチミキサーでよく撹拌して均質化した後にサンプリングした。その結果を表８に示す。
(3) Ethanol tolerance of PaE At room temperature (about 20 ° C.), the culture filtrate of the L1-S12 strain containing PaE and ethanol were added at a volume ratio of 100: 0 (0% ethanol), 90: 10 (10% ethanol ), 75:25 (25% ethanol), 50:50 (50% ethanol), 25:75 (75% ethanol), or 10:90 (90% ethanol). These mixed solutions were allowed to stand at room temperature as they were, and changes in PaE activity in the mixed solutions over time were examined. Precipitates were sampled after homogenization by stirring well with a touch mixer immediately before activity measurement. Table 8 shows the results.
表８に示されているように、７０日間室温で放置した後であっても、培養ろ液にエタノールを添加すると、混合液中のＰａＥ活性は、無添加の場合と比較して顕著に安定に保たれていた。そして、特に長期間の保管時には、１０～５０％などの緩和なエタノール条件が好ましいと考えられる。なお、５０％飽和硫安沈殿物、７０％エタノール沈殿物、及び９０％エタノール沈殿物の電気泳動の結果などを考慮すると、９０％エタノールに溶解する画分には、Ｐ．アンタクティカの培養液に由来する大量のキシラナーゼが含まれていると考えられたが、実際にはこの画分からは、キシラナーゼ活性が検出されなかったので、当該キシラナーゼは、９０％エタノール存在下で失活した可能性がある。このように、ＰａＥ以外のタンパク質は、エタノール処理によって不可逆的に変性又は沈殿した可能性が十分に考えられる。そうすると、エタノール処理を行うと、ＰａＥを不安定にする原因となり得るプロテアーゼのような酵素を失活させたり、微生物の繁殖を抑制したりすることによって、ＰａＥの安定化が可能になるものと考えられる。 As shown in Table 8, even after standing at room temperature for 70 days, when ethanol was added to the culture filtrate, the PaE activity in the mixture was significantly more stable than when it was not added. was kept in And, especially during long-term storage, mild ethanol conditions such as 10 to 50% are considered preferable. Considering the results of electrophoresis of 50% saturated ammonium sulfate precipitate, 70% ethanol precipitate, and 90% ethanol precipitate, the fraction soluble in 90% ethanol contains P. It was thought that a large amount of xylanase derived from the Antactica culture medium was contained, but in fact, no xylanase activity was detected from this fraction, so the xylanase was inactivated in the presence of 90% ethanol. could have done. Thus, it is highly possible that proteins other than PaE were irreversibly denatured or precipitated by ethanol treatment. Therefore, it is thought that ethanol treatment can stabilize PaE by inactivating enzymes such as proteases that can cause PaE to become unstable and by suppressing the growth of microorganisms. be done.
（４）硫安沈殿による濃縮後のエタノールの添加
ＰａＥを含むＬ１－Ｓ１２株の培養ろ液に、硫酸アンモニウムを５０％飽和に達するまで添加した。生じた沈殿（５０％飽和硫安沈殿物）を回収し、硫酸アンモニウム添加前の培養上清の体積と同量の水で再溶解して、５０％飽和硫安沈殿物の再溶解液（試料Ｄ）を作製した。ＰａＥは、試料Ｄ中に９５．０％回収された（表９）。また、上記５０％飽和硫安沈殿物を７０％エタノールで懸濁し、不溶物を遠心して除去した後、エタノールをさらに加えてその濃度を９０％とした。生じた沈殿を回収し、硫酸アンモニウム添加前の培養上清の体積と同量の水で再溶解して、５０％飽和硫安沈殿物／７０％エタノール可溶性／９０％エタノール沈殿物の再溶解液（試料Ｅ）を作製した。ＰａＥは、試料Ｅ中に９０％以上回収された（表９）。そして、比活性は３．５倍近くに上昇したので（表９）、本方法によってＰａＥの精製度を上げることができた。
(4) Addition of Ethanol After Concentration by Ammonium Sulfate Precipitation Ammonium sulfate was added to the culture filtrate of strain L1-S12 containing PaE until reaching 50% saturation. The resulting precipitate (50% saturated ammonium sulfate precipitate) was recovered and redissolved in the same amount of water as the volume of the culture supernatant before the addition of ammonium sulfate to obtain a redissolved 50% saturated ammonium sulfate precipitate (sample D). made. PaE was recovered 95.0% in sample D (Table 9). Also, the above 50% saturated ammonium sulfate precipitate was suspended in 70% ethanol, the insoluble matter was removed by centrifugation, and ethanol was further added to adjust the concentration to 90%. The resulting precipitate was collected and redissolved in the same amount of water as the volume of the culture supernatant before the addition of ammonium sulfate to obtain a redissolved solution of 50% saturated ammonium sulfate precipitate/70% ethanol soluble/90% ethanol precipitate (sample E) was produced. PaE was recovered over 90% in sample E (Table 9). And the specific activity increased nearly 3.5-fold (Table 9), indicating that the purification of PaE could be increased by this method.
また、５０％硫安沈殿物を７０％エタノールで処理することで、即効的かつ強力な殺菌作用が奏されるので、上述の方法は、微生物繁殖による腐敗の防止や、組換え生物による環境汚染の防止に有効であると考えられる。Ｐ．アンタクティカの培養ろ液からＰａＥを回収するという目的だけを考えれば、当該培養ろ液に濃度が９０％になるまでエタノールを直接添加してもよいが、硫安沈殿物を作製して試料の体積を減らしてからエタノールによる沈殿操作を行うことで、エタノールの使用量を少なくすることができる。 In addition, by treating the 50% ammonium sulfate precipitate with 70% ethanol, an immediate and strong bactericidal action is exhibited, so the above-mentioned method prevents spoilage due to microbial growth and prevents environmental pollution by recombinant organisms. It is considered to be effective in prevention. P. Considering only the purpose of recovering PaE from the culture filtrate of Antactica, ethanol may be added directly to the culture filtrate until the concentration reaches 90%. The amount of ethanol used can be reduced by performing the precipitation operation with ethanol after reducing the amount.
〔実施例７〕ウラシル要求性変異株を用いたプロモーターの評価法の作製とＰ．アンタクティカの新規プロモーターの選定
（１）目的
シュードザイマ属酵母の遺伝子組換えを利用して、効率良いタンパク質の生産系を構築するためには、適切なプロモーター制御下で、目的のタンパク質の遺伝子を発現させる必要がある。本実施例では、シュードザイマ属酵母のプロモーター活性を評価する系を構築する。具体的には、ＰａＥの遺伝子であるＰａＣＬＥ１の上流に検討対象のプロモーター配列を挿入したレポーターアッセイ用の遺伝子カセットを作製する。一方で、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のＰａＵＲＡ３変異株を親株に用いて、ＰａＣＬＥ１遺伝子を破壊した菌株を作製する。この菌株に、ＰａＵＲＡ３をマーカーに用いて上記遺伝子カセットを導入し、ＰａＥの生分解性プラスチック分解活性をプロモーター強度の指標とした評価系を構築する。
また、例えば、培地の成分や細胞の状態にかかわらず、安定して遺伝子を発現させるプロモーター制御下でタンパク質を生産させることができれば便利である。そのようなプロモーターを、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株で探索するため、複数の炭素源条件下でＧＢ－４（０）株を培養し、その細胞を用いた網羅的遺伝子発現解析を行って、安定的に発現している遺伝子を選定する。そして、ＰａＥをレポーターに用いた評価系を用いて、Ｐ．アンタクティカにおいて安定的に発現するプロモーターの選抜を試みる。
[Example 7] Creation of a promoter evaluation method using a uracil-requiring mutant and Selection of a novel promoter for Antactica (1) Purpose In order to construct an efficient protein production system using genetic recombination of yeast of the genus Pseudozyma, the gene of the target protein is expressed under the control of an appropriate promoter. There is a need. In this example, a system for evaluating the promoter activity of yeast of the genus Pseudozyma is constructed. Specifically, a gene cassette for reporter assay is prepared by inserting the promoter sequence of interest upstream of PaCLE1, which is the PaE gene. On the other hand, P.I. A PaURA3 mutant strain of Antactica strain GB-4(0) is used as a parent strain to prepare a strain in which the PaCLE1 gene is disrupted. The above gene cassette is introduced into this strain using PaURA3 as a marker, and an evaluation system is constructed in which the biodegradable plastic decomposition activity of PaE is used as an indicator of promoter strength.
Also, for example, it would be convenient if a protein could be produced under the control of a promoter that stably expresses a gene regardless of medium components or cell conditions. Such promoters are known from P. In order to explore with the Antactica GB-4 (0) strain, we cultured the GB-4 (0) strain under multiple carbon source conditions, performed comprehensive gene expression analysis using the cells, and stably expressed select genes that are Then, using an evaluation system using PaE as a reporter, P. Attempt to select promoters stably expressed in Antactica.
（２）材料
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・ＰｖｕＩＩ－ＰａＣＬＥ１＋１９６８ｃ
5'-GAACGCGGCCGCCAGTGTGTCTTGTCGTTGTACAC-3'（配列番号５７）
・ＰｖｕＩＩ－ＰａＣＬＥ１＋６１３
5'-TGAACGTTGGTGTTGTATCCCTGAAGCTTCGTACG-3'（配列番号５８）
・ＥｃｏＲＶ－ＰａＣＬＥ１＋２６３ｃ
5'-GAATTCATCGATGATGCCACGATGTTGGCAGTACCCT-3'（配列番号５９）
・ＥｃｏＲＶ－ＰａＣＬＥ１－１０７４
5'-ACTAGTGGATCTGATAACGTTGCCGATCCGCAGTCTC-3'（配列番号６０）
・ＳａｌＩ－ＰａＵＲＡ３－６５１
5'-TACGCTGCAGGTCGACGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3'（配列番号６１）
・ＳａｃＩ－ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃ
5'-TCATCGATGAATTCGGTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3'（配列番号６２）
・ＥｃｏＲＩ－ＰａＣＬＥ１－１５７４
5'-TATCATCGATGAATTCGTACGATATGCAGCCAATC-3'（配列番号６３）
・ＥｃｏＲＩ－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃ
5'-AATGGCCACCGAATTCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'（配列番号６４）
・ＰａＣＬＥ１－１５７４（実施例５（２）に記載のとおり）
・ＰａＵＲＡ３－３００（実施例４（２）に記載のとおり）
・ＰａＦＲＥ１－９０３
5'-GCCGGAGTGATTCATGATTCGA-3'（配列番号６５）
・ＰａＸＹＮ１－６０９（実施例５（２）に記載のとおり）
・ＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＸＹＮ１－１ｃ（実施例５（２）に記載のとおり）
・ＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＦＲＥ１－１ｃ
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCTTGATCTATCGAGGCCCCGCACGA-3'（配列番号６６）
・ＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＣＴＲ１－１ｃ
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATGCCGGAGTGATTCATGATTCGAATC-3'（配列番号６７）
・ＰａＴＤＨ３－１５００
5'-CCATTGCAGGTCTCGACATCAC-3'（配列番号６８）
・ＰａＣＬＥ１＋２５ｃ－ＰａＴＤＨ３－１ｃ
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATTTTTGAGATGATGGATGGGGAGTGT-3'（配列番号６９）
・ＰａＣＴＲ１－９０３
5'-CTTGATCTATCGAGGCCCCGCA-3'（配列番号７０）
(2) Materials The base sequences of the primers used in this example were as follows.
・PvuII-PaCLE1+1968c
5′-GAACGCGGCCGCCAGTGTGTCTTGTCGTTGTACAC-3′ (SEQ ID NO: 57)
・PvuII-PaCLE1+613
5'-TGAACGTTGGTGTTGTATCCCTGAAGCTTCGTACG-3' (SEQ ID NO: 58)
・EcoRV-PaCLE1+263c
5′-GAATTCATCGATGATGCCACGATGTTGGCAGTACCCT-3′ (SEQ ID NO: 59)
・EcoRV-PaCLE1-1074
5′-ACTAGTGGATCTGATAACGTTGCCGATCCGCAGTCTC-3′ (SEQ ID NO: 60)
・SalI-PaURA3-651
5'-TACGCTGCAGGTCGACGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3' (SEQ ID NO: 61)
・SacI-PaURA3+1449c
5'-TCATCGATGAATTCGGTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3' (SEQ ID NO: 62)
・EcoRI-PaCLE1-1574
5'-TATCATCGATGAATTCGTACGATATGCAGCCAATC-3' (SEQ ID NO: 63)
・EcoRI-
5′-AATGGCCACCGAATTCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3′ (SEQ ID NO: 64)
・PaCLE1-1574 (as described in Example 5 (2))
・PaURA3-300 (as described in Example 4 (2))
・PaFRE1-903
5'-GCCGGAGTGATTCATGATTCGA-3' (SEQ ID NO: 65)
・PaXYN1-609 (as described in Example 5 (2))
・PaCLE1+25c-PaXYN1-1c (as described in Example 5 (2))
・PaCLE1+25c-PaFRE1-1c
5′-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCTTGATCTATCGAGGCCCCGCACGA-3′ (SEQ ID NO: 66)
・PaCLE1+25c-PaCTR1-1c
5′-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATGCCGGAGTGATTCATGATTCGAATC-3′ (SEQ ID NO: 67)
・PaTDH3-1500
5'-CCATTGCAGGTCTCGACATCAC-3' (SEQ ID NO: 68)
・PaCLE1+25c-PaTDH3-1c
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATTTTTGAGATGATGGATGGGGAGTGT-3' (SEQ ID NO: 69)
・PaCTR1-903
5'-CTTGATCTATCGAGGCCCCGCA-3' (SEQ ID NO: 70)
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・大豆油重層平板培地の組成
上層（炭素源及びＰＢＳＡエマルジョン）
ＰＢＳＡエマルジョン＊ １．０質量％
大豆油（和光純薬） １．０質量％
寒天 １．５質量％
＊ビオノーレエマルジョンＥＭ－３０１（ＰＢＳＡ）（昭和電工株式会社製）
下層（３ｘＦＭＭ培地、炭素源を除いた組成）
ＮａＮＯ3 ０．２質量％
ＫＨ2ＰＯ4 ０．０６質量％
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０６質量％
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ０．３質量％
（作製方法）
上層の原料を、スターラーを入れた三角フラスコ内で溶解し、殺菌した。９ｃｍシャーレに約１５ｍＬの下層平板培地を作り、固まった後に４５℃のインキュベーター内に保存し、約５ｍＬの上層を重層した。このとき、上層はスターラーで撹拌し、油が均一に混ざるようにした。
The composition of the medium used in this example was as follows.
・3xFMM-PBSA emulsion ・Composition upper layer of soybean oil overlay plate medium (carbon source and PBSA emulsion)
PBSA emulsion * 1.0% by mass
Soybean oil (Wako Pure Chemical Industries) 1.0% by mass
Agar 1.5% by mass
* Bionol Emulsion EM-301 (PBSA) (manufactured by Showa Denko K.K.)
Lower layer (3xFMM medium, composition excluding carbon source)
NaNO3 0.2% by mass
KH2PO4 0.06 % by mass
0.06 % by mass of MgSO4.7H2O
Yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 0.3% by mass
(Manufacturing method)
The raw material of the upper layer was dissolved in an Erlenmeyer flask containing a stirrer and sterilized. About 15 mL of lower layer plate culture medium was prepared in a 9 cm Petri dish, and after hardening, it was stored in an incubator at 45° C. and overlaid with about 5 mL of upper layer. At this time, the upper layer was stirred with a stirrer so that the oil was uniformly mixed.
・レポーターアッセイ用ＹＰＤ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） １質量％
ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ２質量％
グルコース ８質量％
（寒天 ２質量％）
・レポーターアッセイ用ＹＰＸ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） １質量％
ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製） ２質量％
キシロース ８質量％
（寒天 ２質量％）
・ YPD medium for reporter assay Yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 1% by mass
Peptone (manufactured by Difco Laboratories) 2% by mass
(
・ YPX medium for reporter assay Yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 1% by mass
Peptone (manufactured by Difco Laboratories) 2% by mass
(
（３）遺伝子破壊によるＰａＥ非生産株の作製
Ｐ．アンタクティカ染色体上にある内在性のＰａＣＬＥ１をｎａｔＭＸ４で破壊して（置き換えて）、ＰａＥ非産生株を作製する。このｎａｔＭＸ４は、Ｓ．セレヴィシエを用いた実験で最近使われるようになった、ノウルセオトリシン（ｃｌｏｎＮＡＴ）耐性遺伝子である。ＰａＣＬＥ１破壊用のコンストラクトとして、ＰａＣＬＥ１の上流配列と下流配列の間にｎａｔＭＸ４を挟んだ遺伝子配列を作製するために、ＫＯＤ ＦＸ酵素（東洋紡）を使ったＰＣＲによって、ＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡからＰａＣＬＥ１周辺配列を増幅し、ｎａｔＭＸ４がクローニングされたプラスミド（ｐＡＧ２５：ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから研究用に入手）に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔを使用してクローニングした。
(3) Preparation of PaE non-producing strain by gene disruption The endogenous PaCLE1 on the antactica chromosome is disrupted (replaced) with natMX4 to create a PaE non-producing strain. This natMX4 is S. It is a nourseothricin (clonNAT) resistance gene recently used in experiments using S. cerevisiae. As a construct for disrupting PaCLE1, in order to create a gene sequence with natMX4 sandwiched between the upstream and downstream sequences of PaCLE1, the chromosome of GB-4(0) strain was analyzed by PCR using KOD FX Enzyme (Toyobo). The PaCLE1 peripheral sequence was amplified from DNA and cloned into the natMX4-cloned plasmid (pAG25: obtained from EUROSCARF for research) using the In-Fusion HD cloning kit.
まず、ＰｖｕＩＩ－ＰａＣＬＥ１＋１９６８ｃとＰｖｕＩＩ－ＰａＣＬＥ１＋６１３をプライマーとして用い、ＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲで遺伝子断片を増幅し、取得した遺伝子断片をＰｖｕＩＩで消化したｐＡＧ２５にクローニングし、得られたプラスミドをｐＹＴ００７と名付けた。さらに、ｐＹＴ００７をＥｃｏＲＶで消化し、ＥｃｏＲＶ－ＰａＣＬＥ１＋２６３ｃとＥｃｏＲＶ－ＰａＣＬＥ１－１０７４をプライマーとしたＰＣＲで取得した遺伝子断片をクローニングして、得られたプラスミドをｐＹＴ０１２と名付けた。ＮｏｔＩで消化したｐＹＴ０１２を、ＰＧＢ０４５株にリチウム法で導入した。取得した形質転換体の中から、３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・大豆油重層平板培地上でＰＢＳＡの分解を示さない菌株を選別し、ＰＧＢ０５０株と名付けた。 First, using PvuII-PaCLE1+1968c and PvuII-PaCLE1+613 as primers, a gene fragment was amplified by PCR using chromosomal DNA of strain GB-4(0) as a template, and the obtained gene fragment was cloned into pAG25 digested with PvuII. , the resulting plasmid was named pYT007. Furthermore, pYT007 was digested with EcoRV, and a gene fragment obtained by PCR using EcoRV-PaCLE1+263c and EcoRV-PaCLE1-1074 as primers was cloned, and the resulting plasmid was named pYT012. NotI-digested pYT012 was introduced into strain PGB045 by the lithium method. A strain that did not show PBSA degradation on a 3xFMM-PBSA emulsion/soybean oil overlay plate medium was selected from the obtained transformants and named PGB050 strain.
（４）ＰａＥを指標としたレポーターアッセイ用遺伝子配列の作製
まず、ＰａＵＲＡ３を遺伝子導入のマーカーとして利用するために、ｐＡＧ２５のｎａｔＭＸ４をＰａＵＲＡ３と置換したプラスミドを用意する。クローニングするためのＰａＵＲＡ３断片は、ＳａｌＩ－ＰａＵＲＡ３－６５１とＳａｃＩ－ＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃをプライマーとしたＰＣＲで取得した。これを、ＳａｃＩ及びＳａｌＩで消化したｐＡＧ２５にクローニングし、得られたプラスミドをｐＹＴ０１９と名付けた。
(4) Preparation of Gene Sequence for Reporter Assay Using PaE as Index First, in order to use PaURA3 as a marker for gene introduction, a plasmid is prepared by replacing natMX4 of pAG25 with PaURA3. A PaURA3 fragment for cloning was obtained by PCR using SalI-PaURA3-651 and SacI-PaURA3+1449c as primers. This was cloned into pAG25 digested with SacI and SalI and the resulting plasmid was named pYT019.
次に、ＰａＣＬＥ１導入用のコンストラクトを作製する。Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ－ＰａＣＬＥ１－１５７４とＥｃｏＲＩ－ＰａＣＬＥ１＋１４２６ｃをプライマーとしたＰＣＲでＰａＣＬＥ１遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＹＴ０１９にクローニングしてプラスミドを取得し、得られたプラスミドをｐＹＴ０４０と名付けた。 Next, a construct for introducing PaCLE1 is prepared. P. A PaCLE1 gene fragment was amplified from the chromosomal DNA of Antactica strain GB-4(0) by PCR using EcoRI-PaCLE1-1574 and EcoRI-PaCLE1+1426c as primers. This gene fragment was cloned into EcoRI-digested pYT019 to obtain a plasmid, which was named pYT040.
（５）ＧＢ－４（０）株の恒常性プロモーターの選抜と、ＰａＥを利用したレポーターアッセイによるプロモーターの評価
１）Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株の培養物の発現解析による候補プロモーター配列の選定
ＧＢ－４（０）株を、８質量％のグルコース又はキシロースを含む５０ｍＬの液体培地（０．６質量％のＮａＮＯ3、０．０６質量％のＫＨ2ＰＯ4、０．０６質量％のＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３質量％の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製））を含む５００ｍＬ容三角フラスコに接種後、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間及び１６８時間培養した。この細胞からＲＮＡを抽出し、ＧＢ－４（０）株のマイクロアレイ解析に供した。
(5) Selection of a constitutive promoter in the GB-4(0) strain and evaluation of the promoter by a reporter assay using PaE 1) P.C. Selection of Candidate Promoter Sequences by Expression Analysis of Cultures of Antactica GB-4(0) 3 , after inoculation into a 500 mL Erlenmeyer flask containing 0.06% by mass of KH 2 PO 4 , 0.06% by mass of MgSO 4 .7H 2 O, and 0.3% by mass of yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) , 30° C., 200 rpm for 24 hours and 168 hours. RNA was extracted from the cells and subjected to strain GB-4(0) microarray analysis.
各培養条件でのマイクロアレイ解析結果に基づき、いずれの条件下で培養しても安定してＲＮＡ量の多いＯＲＦを探索した。このとき、ＧＢ－４（０）株ゲノム配列のアノテーション情報を参考にして、タンパク質の機能が推測されるＯＲＦでは、鉄還元酵素（Ｆｅｒｒｉｃ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）様タンパク質をコードしているＳ．セレヴィシエのＦＲＥ１遺伝子と相同性が高いＰａＦＲＥ１及びＳ．セレヴィシエの銅のトランスポーターであるＣＴＲ１の遺伝子と相同性が高いＰａＣＴＲ１を見出し、これらのプロモーターに着目した。それぞれのプロモーター配列を、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノム配列から抽出し、お互いに比較した結果、各プロモーター配列は、ＧＢ－４（０）株のゲノム配列上では共通した領域であり、互いに逆の向きで利用されていることがわかった。また、Ｓ．セレヴィシエのグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムであるＴｄｈ３の遺伝子のプロモーターは、Ｓ．セレヴィシエでは発現量が高く安定したプロモーターとしてよく利用されることから、当該ＴＤＨ３に相同性が高いＰ．アンタクティカの遺伝子（ＰａＴＤＨ３）のプロモーターにも着目し、これらのプロモーターの機能を調べることにした。比較の対象としては、ＰａＣＬＥ１のプロモーター及びキシロース誘導性であることが公知の高発現なキシラナーゼ（ＰａＸＹＮ１）のプロモーターを採用した。 Based on the results of microarray analysis under each culture condition, we searched for ORFs that stably produce a large amount of RNA regardless of culture conditions. At this time, referring to the annotation information of the GB-4(0) strain genome sequence, S. cerevisiae, which encodes a ferric reductase-like protein, was identified in the ORF whose protein function was inferred. PaFRE1 and S. cerevisiae, which are highly homologous to the FRE1 gene of S. cerevisiae. PaCTR1, which is highly homologous to the gene of CTR1, which is a copper transporter in S. cerevisiae, was found, and attention was focused on these promoters. Each promoter sequence was obtained from P. As a result of extracting from the genome sequence of Antactica GB-4(0) strain and comparing with each other, each promoter sequence is a common region on the genome sequence of GB-4(0) strain, and is used in the opposite direction to each other. It was found that Also, S. The promoter of the gene for Tdh3, an isoenzyme of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of S. cerevisiae, is from S. cerevisiae. Since it is often used as a stable promoter with a high expression level in P. cerevisiae, it is highly homologous to the TDH3. We also focused on the promoters of the Antactica gene (PaTDH3) and decided to investigate the functions of these promoters. For comparison, the promoter of PaCLE1 and the promoter of highly expressed xylanase (PaXYN1), which is known to be inducible to xylose, were used.
２）レポーターアッセイ系の構築
ＧＢ－４（０）株のゲノムから、これらの着目した遺伝子断片を取得するために、ＫＯＤ ｐｌｕｓを用いたＰＣＲを行った。具体的には、ＰａＣＬＥ１－１５７４とＰａＵＲＡ３－３００をプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＴＹ０４０からＰａＣＬＥ１プロモーターを評価するための遺伝子断片を作製した（図７右上）。
2) Construction of Reporter Assay System In order to obtain these gene fragments of interest from the GB-4(0) strain genome, PCR was performed using KOD plus. Specifically, a gene fragment for evaluating the PaCLE1 promoter was prepared from pTY040 by PCR using PaCLE1-1574 and PaURA3-300 as primers (upper right of FIG. 7).
ＰａＸＹＮ１、ＰａＦＲＥ１、ＰａＣＴＲ１、及びＰａＴＤＨ３プロモーター評価用の遺伝子断片は、フュージョンＰＣＲによって作製した。具体的には、ＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、各プロモーター遺伝子を増幅した（図７左上）。このときに使用したプライマーは、表１０のとおりだった。なお、ＰａＦＲＥ１プロモーター及びＰａＣＴＲ１プロモーターは、同じプライマーで増幅されるが、互いに向きの異なるプロモーターである。
次に、ＰａＣＬＥ１＋１とＰａＵＲＡ３－３００をプライマーとして、ｐＴＹ０４０から、ＰａＣＬＥ１プロモーターを含まないＰａＣＬＥ１の遺伝子断片を増幅した（図７上段中央）。この遺伝子断片を、フュージョンＰＣＲによってそれぞれのプロモーター遺伝子と接続した（図７）。また、ＰａＣＬＥ１を含まずにマーカー遺伝子のみを含む対照用遺伝子断片を作製するため、ＰａＵＲＡ３－３００とＰａＵＲＡ３＋１４４９ｃをプライマーとして、ＧＢ－４（０）株の染色体ＤＮＡから、ＰａＵＲＡ３の遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。本試験例で使用したプライマーは、表１１のとおりだった。
各遺伝子のプロモーター領域の配列は以下のとおりだった。
・ＰａＦＲＥ１のプロモーター領域の配列
GCCGGAGTGATTCATGATTCGAATCTGTCGATCGGGGCGAAGTCCAAGTGATGAGATGAGGCCGCGAATCGAGCGGGCGAGACGTGACGAGTTTACGATGGTGGCAAGAGACGAAGCGCAAAAGTCTCGTGGTGTCGCTATTGGGTATATAGTTGCCTCTGTTTGGTTGCTCGACAACGACCGGCGAGTTTAGTGCAGCGAAACAAGCTTGATTGTAGCTTTCCGTTGGTGCACGCAGCATTCGCCACTTTTCGTTCCATGCACTCCCACTGTCCGTACCCGCGCTCAAGCCTTTCAACACCAAGGCACAGTCGAGGCTACGGAGGCGACCGGCGCCTTTCGGCCTGATGCCAAGAAGTCTGGCTCGTCCCGACTCGGAGCGTTTTCCCCTTCCTCGCGCACCTCAACCGCACTGTTCCATGGCGTGTTTCTGACAGCTCACGGACCCTGAGCTCTACTGCGCTACCGAATTTCTGGTTTGGGCCTCGTCTAGCAAGCGAGGCGGCCCTGGAGCTCCTCGACACCATCCCCTCGGAGCCTTTTTTTTTCCACGACGTCGCTCGTTTGGCAAAGGCTCCGAGTCTCACGCTCGGAACGTGGCGCGTTACAAGACGAGCTTTGCTGTCGGTCTCGGCAAGGGAACAATGGTGTGGGATAACGCTTGCACAGGAAGGATCCGAACGAATCATGTCGACTGCTCAGCATGGAACCGTCAGGCAAACGCTTCTTGGCGTTGCAAGTACCGCTACAACAAAGCTTCACAGATTCTGAGCCCTCTTACTTTGTTTGCCACCACCCAACGAAGCAAGAGTTAATAAAGCTGGAGCACGATAGCTGCTCTCAAGAGCCCCGTCCCTCCGCCGAAACACCAGCCTCCTTCGTGCGGGGCCTCGATAGATCAAG（配列番号７１）
The sequence of the promoter region of each gene was as follows.
・Sequence of promoter region of PaFRE1
(SEQ ID NO: 71)
・ＰａＣＴＲ１のプロモーター領域の配列
CTTGATCTATCGAGGCCCCGCACGAAGGAGGCTGGTGTTTCGGCGGAGGGACGGGGCTCTTGAGAGCAGCTATCGTGCTCCAGCTTTATTAACTCTTGCTTCGTTGGGTGGTGGCAAACAAAGTAAGAGGGCTCAGAATCTGTGAAGCTTTGTTGTAGCGGTACTTGCAACGCCAAGAAGCGTTTGCCTGACGGTTCCATGCTGAGCAGTCGACATGATTCGTTCGGATCCTTCCTGTGCAAGCGTTATCCCACACCATTGTTCCCTTGCCGAGACCGACAGCAAAGCTCGTCTTGTAACGCGCCACGTTCCGAGCGTGAGACTCGGAGCCTTTGCCAAACGAGCGACGTCGTGGAAAAAAAAAGGCTCCGAGGGGATGGTGTCGAGGAGCTCCAGGGCCGCCTCGCTTGCTAGACGAGGCCCAAACCAGAAATTCGGTAGCGCAGTAGAGCTCAGGGTCCGTGAGCTGTCAGAAACACGCCATGGAACAGTGCGGTTGAGGTGCGCGAGGAAGGGGAAAACGCTCCGAGTCGGGACGAGCCAGACTTCTTGGCATCAGGCCGAAAGGCGCCGGTCGCCTCCGTAGCCTCGACTGTGCCTTGGTGTTGAAAGGCTTGAGCGCGGGTACGGACAGTGGGAGTGCATGGAACGAAAAGTGGCGAATGCTGCGTGCACCAACGGAAAGCTACAATCAAGCTTGTTTCGCTGCACTAAACTCGCCGGTCGTTGTCGAGCAACCAAACAGAGGCAACTATATACCCAATAGCGACACCACGAGACTTTTGCGCTTCGTCTCTTGCCACCATCGTAAACTCGTCACGTCTCGCCCGCTCGATTCGCGGCCTCATCTCATCACTTGGACTTCGCCCCGATCGACAGATTCGAATCATGAATCACTCCGGC（配列番号７２）
・Sequence of the promoter region of PaCTR1
(SEQ ID NO: 72)
・ＰａＴＤＨ３のプロモーター領域の配列
CCATTGCAGGTCTCGACATCACGGCTTGGCACGACAGTTACATTGCCGGTAAAGCGGTGGTGTGCTGCATCGCTTGTCGCCTAAAGTGTGGGGTAGCACGCCATCGCGAGGTCCTCGTGGGGGGAGCTGTCGAGGCTTCGGGCCAACCTGTCAAGCTGTCGATCGGGCATGATCTGATTGAGAGAAAGACAAGTGTAGGCCGATCAGATCGCAAGAGGCTGTAATATATTGTTAGACCGAAGCACAATTGGATCCAAAACCGCGACCACCAAAGCCGCTTTCCCCCGCGATGGGTGTAGAAGGCCTGCCCGTATGCCCCCGAAGCATTCAGTCCATTCGGGTGCAGGAGAACTTCACGACATCGGGCTGATCCGCGCGTGAACGATAGAAAGCGAGGCTGAAGCTCGACTTGAAGCCTGACTGTTCGGCATAAACGGACAGGTGGTGCAGTCGCAGTTTGCTGGTCAAGCTCCGTGAATGCCTTTGCCAGTCGCCTCGGAAAGATCCTTCTGGCTTTCCGGATCGAACGACACAGCGACGGCCCTCCGCTTGCACCCGCATCTCCACCCGCACCCCGCACTAGGCTCATGCGCTCCTGCCCCTCTCTCTTTCACCCGCCAAATCGGAAGCAAACACACCCGGAGTCCCTACCGGATGTATTGCATTGTGTCGAGAATCCAAGGCGGCGGCGGCAGTGAGCGGGCTGAAGCGTGGTGACGCCAGTCAGCCTCCCCCTGCCTGTCTGCCGCTTTGCACTGTGTAGCCTCCTCCTTTTGCGACTGCTGCTCGGCTTCTCGCCCGACTACGCTTCACTCGGCCGTTGCTTACTGTGCTCAGATCTGATCGACTAGCACACCGCAGCATACCCAACAAATCAGCGCTCGGTGATAAGAAGAAAGTGCAGCCAAAAAAGGAGAGAGAAAGTCTCACCGAGAGAGAGTCACTGTTGCGCCGAGGAGAGAGCGAGCAGGCAGGGTCTTGCGAGGCGCAGCGCAACTGCACTGATCTTCAAGTGATAACGTTGCTCAGAGGCTCCACATGACCCTTGGAGTTCAAGTGCTGCGCGGCTTTTTTTGAAATGGGGATTAGATGTCTTTTTCAAAGCTGGACGCTCGGATCAGCTTGATTGGGCAGTGGAGCCAAGAGCGATCAGCCCGTGCATTTCCAAGAGCTTCTGCGGTGGGAGAGCGCAGAGAGAGTGGGCATTATTCAGAAGATCGATTGTTCACAGTCGAGAGGAGCAGGCGGACCTGCGCGGTCACCGCGGTGCTCTCCGGGCCCGTCAGCAGTCATCCTTTGGCTCGGCTCGCTCCGCCACTGGCTTTGCGCAGAGGCCAGCCAGCAGCACCAGCAGCAGCAGCGAGCAGTGTTGGGCGACGCAGACCCGCACCCTCCTGCAGGCGCAAAGCGATCAAAAGTGCGTGTCCGCTTCGTCTCTTCTTCCTTCTGCTCCACCATCGAATCTTCTTCGTGTCACACTCCCCATCCATCATCTCAAAA（配列番号７３）
・Sequence of the promoter region of PaTDH3
(SEQ ID NO: 73)
上述のようにして作製した遺伝子断片を、それぞれＰＧＢ０５０株に導入し、３ｘＦＭＭ－ＰＢＳＡエマルジョン・大豆油重層平板培地上でＰＢＳＡの分解を示す形質転換体を取得した。取得した形質転換体を使用して、各プロモーター配列の機能を評価した。具体的には、（１）形質転換していないＧＢ－４（０）株、（２）ＰａＸＹＮ１プロモーター／ＰａＥ導入ＰＧＢ０５０株、（３）ＰａＣＬＥ１プロモーター／ＰａＥ導入ＰＧＢ０５０株、（４）ＰａＴＤＨ３プロモーター／ＰａＥ導入ＰＧＢ０５０株、（５）ＰａＣＴＲ１プロモーター／ＰａＥ導入ＰＧＢ０５０株、（６）ＰａＦＲＥ１プロモーター／ＰａＥ導入ＰＧＢ０５０株、又は、（７）マーカー遺伝子のみを導入したＰＧＢ０５０株を、レポーターアッセイ用ＹＰＤ培地（８質量％のグルコースを含む）又はレポーターアッセイ用ＹＰＸ培地（８質量％のキシロースを含む）を２ｍＬ使用して、試験管で４８時間振とう培養し、その培養上清のＰａＥ活性を定量した。その結果を図８に示す。いずれのプロモーターも、グルコース又はキシロース存在下で機能することが確認できたが、特にＰａＦＲＥ１プロモーター（試料６）は、使用した糖に関わらず高いＰａＥ活性を示したため、機能の高いプロモーターであることが期待できた。 The gene fragments prepared as described above were each introduced into the PGB050 strain, and transformants exhibiting PBSA degradation on a 3xFMM-PBSA emulsion/soybean oil overlay plate medium were obtained. Using the obtained transformants, the function of each promoter sequence was evaluated. Specifically, (1) untransformed GB-4(0) strain, (2) PaXYN1 promoter/PaE-introduced PGB050 strain, (3) PaCLE1 promoter/PaE-introduced PGB050 strain, (4) PaTDH3 promoter/PaE The introduced PGB050 strain, (5) the PaCTR1 promoter/PaE introduced PGB050 strain, (6) the PaFRE1 promoter/PaE introduced PGB050 strain, or (7) the PGB050 strain introduced with only the marker gene was added to YPD medium for reporter assay (8 mass% of glucose) or YPX medium for reporter assay (containing 8% by mass of xylose) was cultured in a test tube with shaking for 48 hours, and the PaE activity of the culture supernatant was quantified. The results are shown in FIG. All promoters were confirmed to function in the presence of glucose or xylose, and the PaFRE1 promoter (Sample 6) in particular showed high PaE activity regardless of the sugar used, suggesting that it is a highly functional promoter. I expected it.
Claims (3)
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加して、前記生分解性プラスチック分解酵素を安定化する又は沈殿させる工程、及び、
前記安定化した又は沈殿した生分解性プラスチック分解酵素を回収する工程、
を含むことを特徴とする、方法。 A method for obtaining a stabilized biodegradable plastic-degrading enzyme, comprising:
preparing a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme;
adding ethanol to a solution containing the biodegradable plastic-degrading enzyme to stabilize or precipitate the biodegradable plastic-degrading enzyme;
recovering the stabilized or precipitated biodegradable plastic-degrading enzyme;
A method, comprising:
前記栄養要求性変異株に、遺伝子カセットを少なくとも１つ導入する工程、及び、
前記遺伝子カセットを導入した栄養要求性変異株を培養して、前記生分解性プラスチック分解酵素を生産する工程をさらに含み、
前記遺伝子カセットが、前記生分解性プラスチック分解酵素をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のＸＹＮ１又はＦＲＥ１のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記生分解性プラスチック分解酵素をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置している、請求項１又は２に記載の方法。 preparing an auxotrophic mutant of Pseudozyma spp.
introducing at least one gene cassette into the auxotrophic mutant; and
further comprising the step of culturing the auxotrophic mutant introduced with the gene cassette to produce the biodegradable plastic-degrading enzyme;
The gene cassette comprises a gene encoding the biodegradable plastic-degrading enzyme, a Pseudozyma XYN1 or FRE1 promoter, and a gene that complements the auxotrophy of the auxotrophic mutant, and is biodegradable. 3. The method according to claim 1 or 2, wherein a gene encoding a plastic-degrading enzyme is located downstream of said promoter.
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