JP2022099419A - 形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法 - Google Patents

形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法 Download PDF

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Abstract

【課題】目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製する。【解決手段】目的遺伝子を組み入れる部位と、一対の相同組換え配列と、一対のエンドヌクレアーゼ標的配列と、カウンターセレクションマーカーとを備える。【選択図】図１

Description

本発明は、宿主に対して目的遺伝子を導入する際に使用される形質転換用プラスミド、当該形質転換用プラスミドを用いた形質転換体の製造方法、当該形質転換用プラスミドを用いた形質転換方法に関する。
一般に、宿主細胞に外部から目的遺伝子を導入する技術を形質転換或いは遺伝子組換えと呼び、当該目的遺伝子が導入された細胞を形質転換体或いは組換え体と呼ぶ。形質転換技術を利用して形質転換体を効率よく作製することで、例えば、合成生物学的手法を利用して微生物代謝工学の加速・効率化を進めることができる。ここで、合成生物学的手法とは、生産宿主の設計・構築・評価・学習のサイクルを迅速に回すことで成立する技術である。なかでも、酵母や原核生物を宿主とした合成生物学においては、効率的な宿主構築、すなわち組換え微生物を効率的に作製できることが重要な課題の一つである。
酵母を宿主とした形質転換には、目的遺伝子を組み込んだ環状プラスミドを使用する方法と、目的遺伝子を含む線状ベクターを使用する方法とに大別される。環状プラスミドを用いて目的遺伝子を酵母に導入することは容易で、10-2程度の高効率で形質転換酵母を作製することができる(非特許文献１)。一方、線状ベクターを使用して目的遺伝子を酵母に導入する場合、相同組換えによって目的遺伝子をゲノムに組み込む必要があるため、10-6程度の効率でしか形質転換酵母を作製することができない(非特許文献２)。
環状プラスミドを用いて目的遺伝子を酵母に導入する方法は、上述のように効率が良いものの、環状プラスミドが脱落する場合もあり、安定的な組換え酵母を作製することができない。一方、線状ベクターを用いて目的遺伝子を酵母に導入する方法では、目的遺伝子がゲノムに組み込まれるために安定的ではあるが、上述のように効率の良い方法とは言えない。
ゲノムに対する目的遺伝子の導入効率を向上させるために、ゲノムにおける導入予定部位にホーミングエンドヌクレアーゼ等の標的特異的エンドヌクレアーゼの標的配列を予め導入し、当該部位の２本鎖を切断しておく技術が知られている（非特許文献２）。また、標的特異的エンドヌクレアーゼに代えて、CRISPR-Cas9やTALEN等の任意の塩基配列を切断できる技術を用いて、同様にゲノムにおける導入予定部位の２本鎖を切断しておく技術が知られている（非特許文献３）。このように、目的遺伝子を導入する部位の２本鎖を切断しておくことで相同組換え効率を10-2～10-1程度まで向上させることが可能とされている。
しかしながら、これら目的遺伝子の導入効率を向上させる方法では、ゲノムにおける導入予定部位にエンドヌクレアーゼの標的配列を予め導入する必要があり、或いは、標的部位に対するガイドRNA等を作製する必要があった。このように、これら目的遺伝子の導入効率を向上させる方法は、目的遺伝子を含む相同組換え用DNA断片を作製し、これを用いて形質転換する以外に様々な工程を必要とする複雑な方法であった。
また、特許文献１には、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識配列をテロメアシード配列で挟み込んだ構成のイントロンを有する選抜マーカーを備えるプラスミドが開示されている。特許文献１に開示された当該プラスミドは、ホーミングエンドヌクレアーゼが発現することで環状プラスミドから線状分子に変換され、末端のテロメアシード配列により安定して存在できる。
さらに、原核生物の大腸菌においては、プラスミドを用いた形質転換効率は極めて高いが、環状或いは線状ベクター用いた相同組換えによるゲノム改変は酵母と比較して極めて効率が悪い。そこで、相同組換え効率を向上させるために、λファージの相同組換え機構であるRed recombinaseのオペロンを含むプラスミドをあらかじめ導入した大腸菌を作製し、その株に直鎖ベクターを導入する方法が標準的に採用されている（非特許文献４）。また、本方法は乳酸菌やコリネ菌にも採用されている（非特許文献５、６）。しかし、本方法では形質転換を2回行う必要があるため作業が複雑になる問題点があった。
US 2016/0017344
Gietz, R.D., et al."High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method." Nature Protocols. 2 (2007): 31-34. Storici, F, et al."Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (2003): 14994-14999. DiCarlo,J.E., et al."Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems."Nucleic Acids Res. 41 (2013): 4336-4343. Zhang, Y., et al."A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli."Nature Genetics 20 (1998): 123-128. Peng, Y., et al."Prophage recombinases-mediated genome engineering in Lactobacillus plantarum." Microb Cell Fact. 14 (2015): 154. Huang, Y., et al."Recombineering using RecET in Corynebacterium glutamicum ATCC14067 via a self-excisable cassette." Sci Rep 7 (2017): 7916.
しかしながら、上述した何れの手法も、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することはできないといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することができる形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列と、カウンターセレクションマーカーとを備える形質転換用プラスミド。
（２）上記エンドヌクレアーゼ標的配列の二本鎖を特異的に切断する標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現可能に有することを特徴とする（１）記載の形質転換用プラスミド。
（３）上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを特徴とする（２）記載の形質転換用プラスミド。
（４）上記エンドヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼが特異的に認識する配列であることを特徴とする（３）記載の形質転換用プラスミド。
（５）上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御する誘導型プロモーターを有することを特徴とする（２）記載の形質転換用プラスミド。
（６）上記部位に組み入れられた上記目的遺伝子を有することを特徴とする（１）～（５）いずれかに記載の形質転換用プラスミド。
（７）上記（６）記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程と、
上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が上記宿主のゲノムに組み込まれ、上記目的遺伝子が発現する形質転換体を選抜する工程とを有し、
上記カウンターセレクションマーカーが機能することにより、上記目的遺伝子を組み入れた状態の形質転換用プラスミドを有する宿主が致死となることを特徴とする形質転換体の製造方法。
（８）上記（６）記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程を有し、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が発現するとともに、上記カウンターセレクションマーカーが機能することにより、上記目的遺伝子を組み入れた状態の形質転換用プラスミドを有する宿主が致死となることを特徴とする形質転換方法。
（９）上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記宿主のゲノムに目的遺伝子を組み入れることを特徴とする（８）記載の形質転換方法。
本発明に係る形質転換用プラスミドを利用することで、カウンターセレクションマーカーが機能することによって、形質転換用プラスミドから目的遺伝子を含む領域が切り出されなかった宿主が致死となるため、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を効率よく作製することができる。
また、本発明に係る形質転換体の製造方法は、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用するため、カウンターセレクションマーカーが機能することによって、形質転換用プラスミドから目的遺伝子を含む領域が切り出されなかった宿主が致死となり、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を効率よく作製することができる。
さらに、本発明に係る形質転換方法は、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用することで、カウンターセレクションマーカーが機能することによって、形質転換用プラスミドから目的遺伝子を含む領域が切り出されなかった宿主が致死となり、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を作製する優れた形質転換効率を達成することができる。
本発明に係る形質転換用プラスミドの要部を模式的に示す構成図である。 本発明に係る形質転換用プラスミドの一構成例を模式的に示す構成図である。 本発明に係る形質転換用プラスミドを用いて目的遺伝子をゲノムに組み込むメカニズムを模式的に示す構成図である。 実施例２で作製した形質転換用プラスミドを模式的に示す構成図である。
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係る形質転換用プラスミドは、図１に示すように、目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とカウンターセレクションマーカーとを備える。目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列は、目的遺伝子のセンス鎖を基準とすると、5’側から3’側に向かって、一方のエンドヌクレアーゼ標的配列（第１のエンドヌクレアーゼ標的配列と称しても良い）、一方の相同組換え配列（第１の相同組換え配列と称しても良い）、目的遺伝子を組み入れる部位、他方の相同組換え配列（第２の相同組換え配列と称しても良い）及び他方のエンドヌクレアーゼ標的配列（第２のエンドヌクレアーゼ標的配列と称しても良い）の順で並んでいる。カウンターセレクションマーカーは、これら目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とは独立して、形質転換用プラスミドに含まれていれば良い。
カウンターセレクションマーカーとは、例えば、発現することで細胞を死に至らしめる機能を有する遺伝子であって、マーカーとして利用される遺伝子を意味する。この場合、カウンターセレクションマーカーを有する細胞は、特定の条件下でカウンターセレクションマーカー遺伝子が発現することで致死となる。よって、カウンターセレクションマーカーを有する細胞とカウンターセレクションマーカーを有しない細胞が混在するときに、特定の条件下で生育した細胞をセレクションマーカーを有しない細胞として選択することができる。
また、カウンターセレクションマーカーとしては、例えば、特定の条件下で遺伝子の発現が抑制されることで細胞を死に至らしめる機能を有する遺伝子であってもよい。この場合、カウンターセレクションマーカーが機能するとは、特定の条件下でカウンターセレクションマーカー遺伝子の発現が抑制され、細胞が致死となることを意味する。よってこの場合もまた、カウンターセレクションマーカーを有する細胞とカウンターセレクションマーカーを有しない細胞が混在するときに、特定の条件下で生育した細胞をセレクションマーカーを有しない細胞として選択することができる。
具体的に、大腸菌を宿主とする場合、カウンターセレクションマーカーとしては枯草菌由来のsacB遺伝子を利用することができる。sacB遺伝子産物であるレバンシュークラーゼは、ショ糖をレバンに変換する活性を持つ。大腸菌などのグラム陰性菌では、レバンがペリプラズム層に蓄積すると死に至るため、sacB遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用することができる。
また、他の例としては、フェニルアラニルtRNA合成酵素のα-サブユニット(PheS)の変異体をカウンターセレクションマーカーとして利用するものが挙げられる。PheSの変異体は、フェニルアラニン類縁体である4-クロロ-D,L-フェニルアラニンを取り込むため、PheSの変異体を発現する細胞は正常なポリペプチドが合成できなくなる。正常なポリペプチドが合成できない結果、当該PheSの変異体を発現する細胞は4-クロロ-D,L-フェニルアラニンの存在下で死に至る。このように、生合成されるタンパク質分子中にアミノ酸の類縁体を導入することでその機能を損なわせ、細胞を死に至らしめることができる。このような方法に利用できる変異遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用することができる。
さらに、他の例として、チミジンキナーゼ遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用することもできる。チミジンキナーゼ遺伝子は、5-フルオロ-2-デオキシウリジン（5FU）を毒性の代謝物である5-フルオロデオキシウリジン-5'-一リン酸に変換し、チミジル酸シンターゼ阻害し、チミンの生合成を阻害する。したがって、チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞は、5FUの存在下でチミン生合成が阻害され致死となる。
他にも、プラスミドpSC101の複製開始点RepAの温度感受性変異遺伝子をカウンターセレクションマーカーとして利用することができる。この温度感受性変異遺伝子を有するプラスミドを保持する細胞は、37℃を超える温度での培養により細胞増殖が阻害される。このように、温度感受性変異遺伝子を有するプラスミドを用いて細胞を形質転換し、上記温度帯で培養することによって、プラスミドが脱落した細胞のみを選択的に増殖させることができる。
さらにまた、トキシン-アンチトキシンのシステムをカウンターセレクションマーカーとして利用することもできる。通常、アンチトキシン遺伝子が発現している状態では、トキシン遺伝子が発現することによる細胞死は抑制されている。したがって、アンチトキシン遺伝子の発現を抑制すれば、トキシン遺伝子の発現による効果を顕在化させることができ、細胞死を誘導することができる。例えば、内在するアンチトキシン遺伝子を標的遺伝子とするアンチセンスRNAを、アンチトキシン遺伝子のmRNAの一部に対して相補的な延塩基配列として設計し、条件特異的にアンチセンスRNAを誘導させれば、アンチトキシン遺伝子の翻訳を妨げることができ、その結果、トキシン遺伝子の発源によって細胞を死に至らしめることができる。
一方、形質転換用プラスミドにおいて、目的遺伝子を組み入れる部位とは、目的遺伝子を含む核酸断片を組み入れるための領域を意味する。よって、目的遺伝子を組み入れる部位は、具体的な塩基配列に限定されず、例えば、１又は複数の制限酵素標的配列とすることができる。また、目的遺伝子とは、宿主ゲノムに導入する予定の核酸を意味する。よって、目的遺伝子は、特定のタンパク質をコードする塩基配列に限定されず、siRNA等をコードする塩基配列、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサー等の転写調節領域の塩基配列、転移RNA(tRNA)やリボソームRNA(rRNA)等をコードする塩基配列など、あらゆる塩基配列からなる核酸を含む意味である。
また、目的遺伝子は、発現可能な状態で上記部位に組み込まれることが好ましい。発現可能な状態とは、宿主生物において所定のプロモーターの制御下に発現されるように、目的遺伝子とプロモーターとを連結して上記部位に組み込むことを意味する。
さらに、目的遺伝子には、プロモーター及びターミネーター、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
一対の相同組換え配列とは、宿主ゲノムにおける所定の領域に対して相同性を有する一対の核酸領域を意味する。一対の相同組換え配列が、相同性を有する宿主ゲノムとの間でそれぞれ交叉することで、当該一対の相同組換え配列に挟み込まれる目的遺伝子を宿主ゲノムに組み入れることができる。したがって、一対の相同組換え配列としては、具体的な塩基配列には何ら限定されないが、例えば、宿主ゲノムに存在する所定の遺伝子の上流領域及び下流領域と相同性の高い塩基配列とすることができる。この場合、形質転換用プラスミドと宿主ゲノムとの間に相同組換えが生じると、当該遺伝子が宿主ゲノムから欠失するため、当該遺伝子の欠失による表現型を観察することで相同組換えの成否を判断することができる。
例えば、一対の相同組換え配列として、アデニン生合成経路に関与するADE1遺伝子のコーディング領域より上流の領域と、同ADE1遺伝子のコーディング領域より下流の領域とすることができる。この場合、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムとの間で相同組換えが生じると、アデニンの中間代謝産物の5－アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、その重合したポリリボシルアミノイミダゾールに起因して形質転換体が赤く着色する。よって、この赤い着色を検出することで、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムとの間で相同組換えが生じたことを判定することができる。
ここで、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムの組換え領域との間は、相同組換えしうる（交叉しうる）程度に高い配列同一性を有している。各領域間の塩基配列の同一性は、従来公知の配列比較ソフト：blastn等を使用して計算することができる。各領域間の塩基配列は、６０％以上の同一性を有していればよく、８０％以上が好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上の同一性を有していることが最も好ましい。
また、一対の相同組換え配列は、それぞれ同じ長さでも良いし、異なる長さでも良い。これら一対の相同組換え配列は、相同組換えしうる（交叉しうる）程度の長さであればよく、例えば、各々０．１ｋｂ～３ｋｂであることが好ましく、更には０．５ｋｂ～３ｋｂであることが好ましく、特に０．５ｋｂ～２ｋｂであることが好ましい。
ところで、本発明に係る形質転換用プラスミドは、上述した一対の相同組換え配列の外側（なお、一対の相同組換え配列に挟まれる目的遺伝子を内側としたときの外側）にエンドヌクレアーゼ標的配列を有している。エンドヌクレアーゼ標的配列とは、エンドヌクレアーゼが認識する塩基配列を意味する。
エンドヌクレアーゼとしては、特に限定されず、所定の塩基配列を認識して二本鎖DNAを切断する活性を有する酵素を広く意味する。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、制限酵素、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（MN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）等を挙げることができる。また、ホーミングエンドヌクレアーゼとしては、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ（I-という接頭語が付く）及びインテインに含まれるエンドヌクレアーゼ（PI-という接頭語が付く）の両者を含む意味である。ホーミングエンドヌクレアーゼとしては、より具体的にI-Ceu I、I-Sce I、I-Onu I、PI-Psp I及びPI-Sce Iを挙げることができる。なお、これら具体的なエンドヌクレアーゼが特異的に認識する標的配列、すなわちエンドヌクレアーゼ標的配列は公知であり、当業者であれば適宜入手することができる。
また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、図２に示すように、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子とを含むものであってもよい。なお、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は、誘導型プロモーターに限定されず、恒常発現型プロモーターを使用してもよい。
このエンドヌクレアーゼ遺伝子は、上述した一対のエンドヌクレアーゼ標的配列を特異的に認識して二本鎖を切断する活性を有する酵素をコードしている。すなわち、エンドヌクレアーゼ遺伝子としては、制限酵素遺伝子、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子、Cas9ヌクレアーゼ遺伝子、メガヌクレアーゼ遺伝子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ遺伝子等を挙げることができる。
誘導型プロモーターとは、特定の条件下で発現誘導する機能を有するプロモーターを意味する。誘導型プロモーターとしては、特に限定されないが、例えば特定の物質の存在下ン発現誘導するプロモーター、特定の温度条件で発現誘導するプロモーター、各種ストレスに応答して発現誘導するプロモーター等を挙げることができる、使用するプロモーターは、形質転換する宿主に応じて適宜選択することができる。
例えば、誘導型プロモーターとしては、GAL1及びGAL10などのガラクトース誘導性プロモーター、テトラサイクリン又はその誘導体の添加又は除去で誘導するTet-onシステム/Tet-off系プロモーター、HSP10、HSP60、HSP90などの熱ショックタンパク質（HSP）をコードする遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。また、誘導型プロモーターとしては、銅イオンの添加で活性化するCUP1プロモーターを用いることもできる。さらに、誘導型プロモーターとしては、宿主が大腸菌等の原核細胞である場合、IPTGで誘導するlacプロモーター、コールドショックで誘導するcspAプロモーター、アラビノースで誘導araBADプロモーター等を挙げることができる。
また、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現制御は、誘導型プロモーターや恒常発現型プロモーターといったプロモーターによる方法に限定されず、例えばDNA組換え酵素を使用する方法を適用しても良い。DNA組換え酵素を用いて、遺伝子の発現のオン・オフを行う方法としては、例えば、FLEx switch法（A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.Atasoy et al. The Journal of Neuroscience, 28, 7025-7030, 2008.）を挙げることができる。FLEx switch法では、DNA組換え酵素によりプロモーター配列の向きを変える組換えを起こさせることで、遺伝子の発現のオン・オフを行うことができる。
一方、本発明に係る形質転換用プラスミドは、従来公知の入手可能なプラスミドに基づいて作製することができる。このようなプラスミドとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられる。
また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、さらに複製開始点や、自律複製配列(ARS)、セントロメア配列（CEN）を含むことができる。これらを含むことで宿主細胞に導入された後に安定的に複製することができる。また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、選抜マーカーを含むことができる。選抜マーカーとしては、特に限定されず、例えば薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求性マーカー遺伝子を挙げることができる。これら選抜マーカーを含むことで、形質転換用プラスミドが導入された宿主細胞を効率的に選択することができる。
以上のように構成された形質転換用プラスミドを使用することで、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することができる。形質転換体を作製するには、先ず、目的遺伝子を組み入れる部位（図１）に目的遺伝子を組み入れる。このようにして、目的遺伝子を有する形質転換用プラスミドを、定法に従って宿主細胞に導入する。その後、図３に模式的に示すように、誘導型プロモーターの制御下で発現したエンドヌクレアーゼにより、一対のエンドヌクレアーゼ標的配列において二本鎖が切断され、一対の相同組換え配列に挟み込まれた目的遺伝子を含む核酸断片が切り出される。切り出された核酸断片は、当該核酸断片における一対の相同組換え配列と宿主ゲノムにおける相同組換え配列との間で交叉し、ゲノム内に組み込まれる。これにより、目的遺伝子をゲノムに組み込んだ安定した形質転換体を作製することができる。
このとき、目的遺伝子を組み入れた形質転換用プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法、例えば塩化カルシウム法、コンピテントセル法、プロトプラスト又はスフェロプラスト法、電気パルス法等を適宜使用することができる。その後、形質転換用プラスミドが選抜マーカーを有する場合には、選抜マーカーを用いて形質転換用プラスミドが導入された宿主細胞を選抜することができる。
また、誘導型プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼを発現させるには、誘導型プロモーターに応じて適宜条件を設定する。例えば、誘導型プロモーターとしてGAL1及びGAL10などのガラクトース誘導性プロモーターを使用した場合には、形質転換用プラスミドを導入した宿主細胞を培養する培地にガラクトースを添加する、或いは当該宿主細胞をガラクトース含有培地に移して培養することで、エンドヌクレアーゼを発現誘導することができる。また、誘導型プロモーターとして熱ショックタンパク質（HSP）をコードする遺伝子のプロモーターを使用する場合には、形質転換用プラスミドを導入した宿主細胞を培養する際に所望のタイミングで熱ショックを負荷することで、当該タイミングでエンドヌクレアーゼを発現誘導することができる。
また、上述した形質転換用プラスミドでは、一対の相同組換え配列を、所定の遺伝子の上流領域及び下流領域と相同性の高い塩基配列とした場合には、相同組換えによって、目的遺伝子を含む断片がゲノムに組み込まれるとともに当該所定の遺伝子がゲノムから欠失することとなる。よって、当該所定の遺伝子の欠失に起因する表現型を観察することで、目的遺伝子を含む核酸断片がゲノムに組み込まれたか否かを判定することができる。例えば、所定の遺伝子としてADE1遺伝子を利用した場合、目的遺伝子を含む核酸断片がゲノムに組み込まれると、ADE1遺伝子がゲノムから欠失することとなる。その結果、宿主には5－アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、その重合したポリリボシルアミノイミダゾールに起因して形質転換体が赤く着色する。よって、この赤い着色を検出することで、目的遺伝子を含む核酸断片が宿主のゲノムに組み込まれたことを判定することができる。
なお、上述した例では、形質転換用プラスミドが誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子とを有する構成としたが、本発明に係る形質転換用プラスミドは、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有しない構成であってもよい。この場合、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する発現ベクターを別途準備し、本発明に係る形質転換用プラスミドとともに宿主細胞に導入すればよい。この場合でも、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する発現ベクターと、目的遺伝子を有する形質転換用プラスミドとが導入された宿主細胞において、エンドヌクレアーゼ遺伝子が誘導型プロモーターの制御下に発現することで、図３に示したように、一対の相同組換え配列に挟み込まれた目的遺伝子を含む核酸断片が切り出され、目的遺伝子をゲノムに組み込んだ形質転換体を作製することができる。また、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子をあらかじめ導入した宿主細胞を用いれば、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有しない形質転換用プラスミドの構成であってもよい。
なお、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用した形質転換方法、形質転換体の製造方法は、特に限定されず、如何なる宿主細胞に対しても適用することができる。宿主細胞としては、糸状菌や酵母等の真菌、大腸菌や枯草菌等の細菌、植物細胞、ほ乳類や昆虫を含む動物細胞を挙げることができる。酵母としては、特に限定されないが、サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する酵母、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）に属する酵母、カンジダ属（Candida）に属する酵母、ピキア属（Pichia）に属する酵母、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）に属する酵母、ハンセヌラ属（Hansenula）に属する酵母等を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Saccharomyces boulardii）等のサッカロマイセス属に属する酵母に適用することができる。細菌としては、特に限定されないが、バチルス属（Bacillus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、エスケリキア属（Escherichia）、テルムス属（Thermus）、リゾビウム属（Rhizobium）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）に属する細菌等が挙げることができる。
特に、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用した形質転換方法、形質転換体の製造方法においては、形質転換用プラスミドがカウンターセレクションマーカーを有している。カウンターセレクションマーカーの発現により、目的遺伝子が切り出されずに環状プラスミドに組み込まれたままの状態の宿主を致死とすることができる。本発明に係る形質転換用プラスミドを利用した場合、目的遺伝子がゲノムDNAに組み込まれず、図１や図２に示したように、環状プラスミドとして宿主細胞に存在する場合がある。仮に、形質転換用プラスミドがカウンターセレクションマーカーを有しない場合、目的遺伝子の発現や目的遺伝子とともに導入した選択マーカーに基づいて形質転換細胞を選択すると、目的遺伝子がゲノムDNAに組み込まれず、環状プラスミドとして存在する細胞も選択される（偽陽性）。
なお、目的遺伝子がエンドヌクレアーゼによって切り出された場合には、図３に示すように、形質転換用プラスミドは線状となるため、複製されることなく細胞の増殖とともに脱落していくこととなる。よって、目的遺伝子がエンドヌクレアーゼによって切り出された場合には、カウンターセレクションマーカーの影響なく、目的遺伝子の発現や目的遺伝子とともに導入した選択マーカーに基づいて陽性として選択される。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
［方法］
1.供試株
供試した菌株は、NEB社の大腸菌 NEB Turbo Competent E. coliである。
2.大腸菌ゲノム導入用ベクターの作製
作製したベクターは、テトラサイクリンで誘導されるS. cerevisiae由来のホーミングエンドヌクレアーゼのI-SceI遺伝子（SCEI）とカウンターセレクション用の枯草菌由来のsacB遺伝子(NCBIアクセスNo. 936413)、I-SceIの2か所の認識配列の間にゲノム導入用の相同組換え配列を含むDNA断片が挿入された配列で構成される大腸菌と酵母のシャトルベクターpUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacB（図２参照）である。pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacBには、トランスポゾンTn10 (NCBIアクセスNo.AP000342)由来のTetリプレッサー遺伝子(tetR)、テトラサイクリンで誘導可能なtetAプロモーターに連結されたSCEI遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ゲノム導入用の相同組換え配列として、大腸菌MG1655株(NCBIアクセスNo.NC_000913.3)araB遺伝子配列及びaraA遺伝子配列、相同組換えで導入される遺伝子としてGFP相同遺伝子（但し、プロモーター配列等遺伝子発現に必要な配列含まないので、遺伝子自体は発現しない；NCBIアクセスMI085862)、相同組換え用のマーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子配列（smRマーカー,NCBIアクセスNo. X12870）、sacB遺伝子が、pUC19系のベクターに挿入されている（図２参照）。このベクターは、別途作製していたpRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクター（下記［参考例１］）から、P_LtetOプロモーターと酵母の自律複製配列（ARS）とセントロメア配列（CEN）を除いた部分を使用した。なお、araB、araA、GFP相同遺伝子、及びsmRマーカー配列は2か所のホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの切断認識配列の間に挿入されており、テトラサイクリンの含まれる培地で誘導されるtetAプロモーターに付加されているSCEI遺伝子が発現することによって、切り出すことができる。大腸菌細胞内で切り出された断片は、相同組換えにより、ゲノムに導入される（図３参照）。
各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成した（表１）。これらプライマーを用いて、pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA、もしくは合成DNA配列を鋳型として、目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合して最終目的のベクターを作製した。
Figure 2022099419000002
3.大腸菌ゲノム相同組換えの方法と導入効率の確認
pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacBを用いて、NEB Turbo Competent E. coliに形質転換を行い、アンピシリンでプラスミド導入コロニーを選抜した。次にプラスミド導入株を、スペクチノマイシンとアンヒドロテトラサイクリン（50ng/ml）を含むLB培地に塗布し、ホーミングエンドヌクレアーゼを誘導させ、ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの切断認識配列の間のDNA断片を切り出し、相同組換え用のスペクチノマイシンマーカーでゲノムDNAと相同組換えしたコロニーを選抜した。さらに、選抜したコロニーを10％スクロースとスペクチノマイシンとアンヒドロテトラサイクリン（50ng/ml）を含むLB培地でカウンターセレクションを行った。なお、カウンターセレクションに使用しているsacB遺伝子産物であるレバンシュークラーゼはショ糖をレバンに変換し、レバンがペリプラズム層に蓄積することにより細胞が死に至ることが知られている。ショ糖の非存在下では致死性を示さないことから、ショ糖の有無によりsacB遺伝子を含むベクターの除去が可能である。
生育したコロニーは大腸菌ゲノムと相同組換えによって組み込まれたDNA断片と間（図３におけるプライマー組合わせA）及び、相同組換えによって組み込まれたDNA断片を挟むゲノムの両側（図３におけるプライマー組み合わせB）からPCRを行い、両PCRで増幅バンドが確認でき、且つプライマー組み合わせBの場合で導入DNA断片分の長さが増加し、野生型の長さのバンドが消失したコロニーをゲノム相同組換え体コロニーとしてカウント、両PCRで増幅バンドが確認でき、且つプライマー組み合わせBの場合で導入DNA断片分の長さが増加したものと野生型の長さの両方のバンドを確認できるコロニーを非組換え細胞混入コロニー、野生型の長さのバンドのみ確認できるコロニーを偽陽性コロニーとしてカウント相同組換え体コロニーの取得効率を計算した。使用したプライマーの配列を表２に示した。
Figure 2022099419000003
［結果・考察］
本実施例では、pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacBベクター導入株について、テトラサイクリンによるホーミングエンドヌクレアーゼ誘導後でもスペクチノマイシン耐性を維持する細胞を40コロニー選抜した。さらに、sacB遺伝子によるカウンターセレクションを行い、カウンターセレクション前後のコロニーをPCRで相同組換え効率を調べた（表３）。試験の結果、カウンターセレクション前では偽陽性コロニーが50%を超えることが判明した。これは、ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの切断認識配列の間のDNA断片がゲノムDNAに組み込まれず、環状の形質転換用プラスミドが残存する宿主細胞（非組換え細胞混入コロニー）が多数存在することを意味する。また、非組換え細胞混入コロニーの存在は、コロニーが成長する過程で徐々に相同組換えが起こり、結果的に非組換え細胞混入コロニーになったと考えられることから、カウンターセレクションによるゲノム相同組換え細胞の濃縮工程は非組換え細胞の混入を除去する効果的方法であると考えられる。
Figure 2022099419000004
〔参考例１〕
本参考例１では、実施例で使用したpRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターの作製方法を説明する。このpRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターを作製するにあたり、先ず、pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターを作製した。次に、当該ベクターから、pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターを作製した。そして、このpRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-SceベクターからpRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターを作製した。
＜pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターの作製＞
メチオニン欠乏条件又はガラクトースで誘導されるS. cerevisiae由来のホーミングエンドヌクレアーゼのI-SceI（SCEI遺伝子、NCBIアクセスNo 854590）と、一対のI-SceI標的配列（エンドヌクレアーゼ標的配列）の間にゲノム導入用の一対の相同組換え配列を含むDNA断片が挿入された配列で構成されるYEp型の酵母シャトルベクターpRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-SceとpRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceとを作製した。
pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceには、MET25プロモーターとCYC1ターミネーターが付加されたSCEI遺伝子（COX5B遺伝子のイントロンが挿入され、全長を酵母の核ゲノムのコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列）、nourseothricin耐性遺伝子を含む遺伝子配列（natマーカー）、ゲノム導入用の相同組換え配列として、ADE1遺伝子の5’側末端より上流約1000bpの領域の遺伝子配列（5U_ADE1）及びADE1遺伝子3’側末端より下流の約950bpの領域のDNA配列（3U_ADE1）、相同組換え用のマーカー遺伝子として、Ashbya gossypii由来のTEF1プロモーターとTEF1ターミネーターが付加されたG418耐性遺伝子を含む遺伝子配列（G418マーカー）が、pRS436GAPベクター（NCBIアクセスNo.AB304862）からURA3遺伝子、TDH3プロモーター、CYC1ターミネーターを除いたベクターに挿入されている。
各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成した（表４）。これらプライマーを用いて、S. cerevisiae OC-2株ゲノム又は合成DNAを鋳型として、目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、pRS436GAPベクターにクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
目的のpRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceは、MET25プロモーターの代わりにGAL1プロモーターが付加されたSCEI遺伝子が挿入されており、炭素源がガラクトースの培地でSCEI遺伝子は発現し、I-SceI標的配列の間に挿入された配列を切り出すことが可能である。本ベクターは、pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceもしくは、S. cerevisiae OC-2株ゲノムを鋳型に目的のDNA断片を増幅（使用プライマーは表４）、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いてDNA断片を結合して作製した。
Figure 2022099419000005
＜pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターの作製＞
pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターの作製に使用するpRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターは、上記pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceから2μmプラスミド由来の複製起点を削除し、代わりに自律複製配列（ARS）とセントロメア配列（CEN）が挿入した、細胞内のコピー数が1コピーに保持されるベクターである。
pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAベクターは、テトラサイクリンで誘導されるS. cerevisiae由来のホーミングエンドヌクレアーゼのI-SceI遺伝子（SCEI）と、I-SceIの2か所の認識配列の間にゲノム導入用の相同組換え配列を含むDNA断片が挿入された配列で構成される大腸菌と酵母のシャトルベクターである。pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araAには、トランスポゾンTn10 (NCBIアクセスNo.AP000342)由来のTetリプレッサー遺伝子(tetR)、テトラサイクリンで誘導可能なLtetO-1プロモーター(Lutz, R. and Bujard, H. “Independent and Tight Regulation of Transcriptional Units in Escherichia Coli Via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 Regulatory Elements” Nucleic Acids Research, 25 (1997): 1203-1210)に連結されたSCEI遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ゲノム導入用の相同組換え配列として、大腸菌MG1655株(NCBIアクセスNo.NC_000913.3)araB遺伝子配列及びaraA遺伝子配列、相同組換えで導入される遺伝子としてGFP相同遺伝子（但し、プロモーター配列等遺伝子発現に必要な配列含まないので、遺伝子自体は発現しない；NCBIアクセスMI085862)、相同組換え用のマーカー遺伝子として、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子配列（smRマーカー,NCBIアクセスNo. X12870）が酵母シャトルベクターに挿入されている。この酵母シャトルベクターとしては、別途作製していたpRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターから、GAL1プロモーター、CYC1ターミネーター、ADE1 5’相同組換え配列、G418マーカー遺伝子及びADE1 3’相同組換え配列を除いたベクターを使用した。
各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成した（表５）。これらプライマーを用いて、MG1655株ゲノム、pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce、プラスミドTEF-Dasher GFP（ATUM社）、もしくは合成DNA配列を鋳型として、目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合して最終目的のベクターを作製した。
Figure 2022099419000006
〔実施例２〕
［方法］
1.供試株
供試した菌株は、1倍体の実験酵母S. cerevisiae BY4742株である。
2.酵母ゲノム導入用ベクターの作製
作製したプラスミドは、ガラクトースで誘導されるS. cerevisiae由来のホーミングエンドヌクレアーゼのI-SceI （SCEI遺伝子）、カウンターセレクション用のマーカーであるチミジンキナーゼ、I-SceIの2か所の認識配列の間にゲノム導入用の相同組換え配列を含むDNA断片が挿入された配列で構成されるYCp型の酵母シャトルベクターpYC（TK-SAT）-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce（図４）である。pYC（TK-SAT）-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceには、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターが付加されたSCEI遺伝子（COX5B遺伝子のイントロンが挿入され、全長を酵母の核ゲノムのコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列）、TPI1プロモーターとBNA4ターミネーターが付加された単純ヘルペスウイルス1型チミジンキナーゼ遺伝子（全長を酵母の核ゲノムのコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列、図４中「TK」）、ゲノム導入用の相同組換え配列として、ADE1遺伝子の5’側末端より上流約1000bpの領域の遺伝子配列（5U_ADE1）及びADE1遺伝子3’側末端より下流の約950bpの領域のDNA配列（3U_ADE1）、相同組換え用のマーカー遺伝子として、Ashbya gossypii由来のTEF1プロモーターとTEF1ターミネーターが付加されたG418耐性遺伝子を含む遺伝子配列（G418マーカー）が、含まれている。なお、5U_ADE1と3U_ADE1及びG418マーカー配列は2か所のホーミングエンドヌクレアーゼI-SceI認識配列の間に挿入されており、炭素源がガラクトースの培地で誘導されるGAL1プロモーターに付加されているSCEI遺伝子により切り出すことが可能である。
各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成し（表６）、それらを用いて、pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce(後述する参考例２)、S. cerevisiae OC-2株ゲノム、もしくは合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて各DNA断片を結合して目的のプラスミドを作製した。
Figure 2022099419000007
3.酵母ゲノム相同組換えの方法と導入効率の確認
作製したYC（TK-SAT）-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターを用いて、Akada(Akada, R. et al. “Elevated temperature greatly improves transformation of fresh and frozen competent cells in yeast“ BioTechniques 28 (2000): 854-856.)らの方法にて、S. cerevisiae BY4742株の形質転換を行い、G418を含むYPD寒天培地でプラスミドとして導入されたコロニーを選抜した。なお、生育したコロニーはすべて白色のコロニーであった。次にプラスミド導入株を、G418を含むYPGa（炭素源がガラクトース）寒天培地に塗布し、ホーミングエンドヌクレアーゼを誘導させ、ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの切断認識配列の間のDNA断片を切り出し、G418でゲノムDNAと相同組換えしたコロニーを選抜して、コロニーの着色でADE1遺伝子破壊株をカウントした。ADE1遺伝子はアデニン生合成経路の遺伝子であり、その破壊株は、アデニンの中間代謝産物の5－アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、5－アミノイミダゾールが重合したポリリボシルアミノイミダゾールが赤く着色する。よって、目視により容易にADE1破壊株の判別が可能である。さらに、白いコロニーであるADE1非破壊株を、5-フルオロ-2-デオキシウリジン(50μg/ml)を含むSD培地に塗布して生育を確認した。チミジンキナーゼ遺伝子は5FUを毒性の代謝物に変換するため、チミジンキナーゼ遺伝子を持つ細胞は、5FUを含む培地では致死となる。5FUの非存在下では致死性を示さないことから、5FUを含む培地に生育させることによりTK遺伝子を含むプラスミドの除去が可能である。
［結果・考察］
pYC（TK-SAT）-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceベクターをプラスミドとして導入した株から、ホーミングエンドヌクレアーゼを誘導し、ADE1遺伝子座への相同組換え効率を調べた結果、高効率にADE1遺伝子座と相同組換えをしたものの、低頻度ではあるが白コロニーの偽陽性コロニーも生じた（表７）。偽陽性コロニーの3株に関して、5FU培地に移して選抜した結果、2株は死滅したことから、それら2株は、ホーミングヌクレーアーゼによるプラスミドからの切り出しが行われずプラスミドが残存したため、残りの１株はADE1以外の領域と非相同的に組換えを起こしたため、カウンターセレクションでは除去できなかった可能性が高いと推定される。本結果から、カウンターセレクションによるゲノム相同組換え細胞の濃縮工程は非ゲノム組換え細胞の混入を除去する効果的方法であると考えられた。
Figure 2022099419000008
〔参考例２〕
本参考例２では、実施例で使用したpRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceの作製方法を説明する。pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceは、pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceから2μmプラスミド由来の複製起点を削除し、代わりに自律複製配列（ARS）とセントロメア配列（CEN）が挿入した、細胞内のコピー数が1コピーに保持されるベクターである。本ベクターは、RS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce もしくは、S. cerevisiae OC-2株ゲノムを鋳型に目的のDNA断片を増幅（使用プライマーは表８）、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いてDNA断片を結合して作製した。
なお、pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceには、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターが付加されたSCEI遺伝子（COX5B遺伝子のイントロンが挿入され、全長を酵母の核ゲノムのコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列）、nourseothricin耐性遺伝子を含む遺伝子配列（natマーカー）、ゲノム導入用の相同組換え配列として、ADE1遺伝子の5’側末端より上流約1000bpの領域の遺伝子配列（5U_ADE1）及びADE1遺伝子3’側末端より下流の約950bpの領域のDNA配列（3U_ADE1）、相同組換え用のマーカー遺伝子として、Ashbya gossypii由来のTEF1プロモーターとTEF1ターミネーターが付加されたG418耐性遺伝子を含む遺伝子配列（G418マーカー）が、YEp型の酵母シャトルベクターであるpRS436GAP（NCBIアクセスNo. AB304862）からURA3遺伝子、TDH3プロモーター、CYC1ターミネーターを除いたベクターに挿入されている。なお、5U_ADE1と3U_ADE1及びG418マーカー配列は2か所のホーミングエンドヌクレアーゼI-SceI認識配列の間に挿入されており、炭素源がガラクトースの培地で誘導されるGAL1プロモーターに付加されているSCEI遺伝子により切り出すことが可能である。
各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成した（表８）。これらプライマーを用いて、S. cerevisiae OC-2株ゲノム又は合成DNAを鋳型として、目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、pRS436GAPベクターにクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
Figure 2022099419000009

Claims (9)

  1. 目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列と、カウンターセレクションマーカーとを備える形質転換用プラスミド。
  2. 上記エンドヌクレアーゼ標的配列の二本鎖を特異的に切断する標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現可能に有することを特徴とする請求項１記載の形質転換用プラスミド。
  3. 上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の形質転換用プラスミド。
  4. 上記エンドヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼが特異的に認識する配列であることを特徴とする請求項３記載の形質転換用プラスミド。
  5. 上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御する誘導型プロモーターを有することを特徴とする請求項２記載の形質転換用プラスミド。
  6. 上記部位に組み入れられた上記目的遺伝子を有することを特徴とする請求項１～５いずれか一項記載の形質転換用プラスミド。
  7. 請求項６記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程と、
    上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が上記宿主のゲノムに組み込まれ、上記目的遺伝子が発現する形質転換体を選抜する工程とを有し、
    上記カウンターセレクションマーカーが機能することにより、上記目的遺伝子を組み入れた状態の形質転換用プラスミドを有する宿主が致死となることを特徴とする形質転換体の製造方法。
  8. 請求項６記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程を有し、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が発現するとともに、上記カウンターセレクションマーカーが機能することにより、上記目的遺伝子を組み入れた状態の形質転換用プラスミドを有する宿主が致死となることを特徴とする形質転換方法。
  9. 上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記宿主のゲノムに目的遺伝子を組み入れることを特徴とする請求項８記載の形質転換方法。

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