JP2022079617A - 免疫グロブリン重鎖コーディング配列におけるdh-dh再構成が可能な非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第62/685,203号(2018年6月14日出願)、第62/702,206号(2018年7月23日出願)、および第62/812,580号(2019年3月1日出願)の35 U.S.C.第119(3)に基づく利益を主張するものであり、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の公的な写しは、ASCIIフォーマットの配列表としてEFS-Webを介してファイル名「10347_ST25.txt」として電子的に提出され、そのファイルは、2019年6月13日に作成され、約50キロバイトのサイズであり、明細書と同時に作成されている。このASCIIフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(a)少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変(VH)遺伝子セグメント、
(b)23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントを含む操作されたDH領域、
(c)少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖結合(JH)遺伝子セグメント、を含む。
(a)少なくとも一つの再構成されていないVH遺伝子セグメントは、
(i)再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメント、
(ii)再構成されていないヒトVH2-1遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメント、ならびに/または
(iii)再構成されていないヒトVH3-74から再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントに渡り、それらを含む全ての機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメント、例えば、生殖系列配置の全ての機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメント、場合により、げっ歯類Adam6遺伝子は、再構成されていないヒトVH2-1とVH6-1遺伝子セグメントの間で偽遺伝子を置換する、を含み;
(b)操作されたDH領域は、5’から3’に:
(i)一つまたは複数、例えば、複数の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメント、複数の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの各々は、その5’および3’末端に12merのRSSが隣接する、およびその5’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH遺伝子セグメント、場合により、複数の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントは、生殖系列配置で、再構成されていないヒトDH1-1遺伝子セグメントと再構成されていないヒトDH1-26の間に渡り、それらを含む再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含み、および/またはその5’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒト遺伝子セグメントは、ヒトDH3-3遺伝子セグメントであり、例えば、操作されたDHは、5’末端の23merのRSSに作動可能に結合されたDH3-3で置換された、再構成されていないヒトDH7-27遺伝子セグメントを除き、生殖系列配置の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む;
(ii)その3’末端で23merのRSSと作動可能に結合された少なくとも一つのヒトDH遺伝子セグメント、および一つ以上、例えば、複数のヒトDH遺伝子セグメント、一つ以上のヒトDH遺伝子セグメントの各々は、その5’および末端と3’末端で12merのRSSと隣接し、場合により、その3’末端で23merのRSSと作動可能に結合された少なくとも一つのヒトDH遺伝子セグメントは、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたDH2-2遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメントを含み、および/または一つまたは複数のヒトDH遺伝子セグメントは、再構成されていないヒトDH1-1遺伝子セグメントと再構成されていないヒトDH7-27遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含むDH遺伝子セグメントを含み、場合により、操作されたDHは、再構成されていないヒトDH2-2、DH2-8、およびDH2-15遺伝子セグメントは、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたDH2-2遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、およびその3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメントを除き、生殖系列配置で、再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む;
(iii)または(b)(i)と(b)(ii)の組み合わせを含み;
(c)少なくとも一つの再構成されていないJH遺伝子セグメントは、
(i)再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、
(ii)再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、および/または
(iii)再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、例えば、再構成されていないヒトJH1遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH2遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH3遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、およびJH6遺伝子セグメントは、生殖系列配置である、を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンVH領域(少なくとも一つの機能的VH遺伝子セグメント、操作されたVH領域、および少なくとも一つの機能的JH遺伝子セグメントを含む)は、ヒト免疫グロブリンVH領域であり、例えば、23merのRSSに作動可能に結合されたDH遺伝子セグメントを含む、各遺伝子セグメント(例えば、その中の各VH、DH、およびJH遺伝子セグメント)は、ヒト(VH、DH、またはJH)遺伝子セグメントである。
(a)少なくとも、再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトVH3-74と再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの間にげっ歯類Adam6遺伝子、例えば(例えば、げっ歯類Adam6遺伝子は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に位置する)を含む、機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリー
(b)生殖系列配置で、再構成されていないヒトDH1-1遺伝子セグメントと再構成されていないヒトDH1-26遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、5’から3’に再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたDH領域、および5’末端の23merのRSSに作動可能に結合された再構成されていないヒトDH3-3遺伝子セグメント、例えば、5’末端の23merのRSSに作動可能に結合された再構成されていないヒトDH3-3遺伝子セグメントで置換されている、再構成されていないヒトDH7-27遺伝子セグメントを除く、生殖系列配置で再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
(c)少なくとも再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、を含む。
(a)少なくとも、再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトVH3-74と再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの間にげっ歯類Adam6遺伝子、例えば(例えば、げっ歯類Adam6遺伝子は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に位置する)を含む、機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリー
(b)生殖系列配置で、再構成されていないヒトDH1-1遺伝子セグメントと再構成されていないヒトDH1-26遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、5’から3’に再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたDH領域、および5’末端の23merのRSSに作動可能に結合された再構成されていないヒトDH3-3遺伝子セグメント、例えば、5’末端の23merのRSSに作動可能に結合された再構成されていないヒトDH3-3遺伝子セグメントで置換されている、再構成されていないヒトDH7-27遺伝子セグメントを除く、生殖系列配置で再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
(c)再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、を含む。
(a)少なくとも、再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないヒトVH3-74と再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの全てまたは一部、例えば、場合により、二つの再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの間にげっ歯類Adam6遺伝子、例えば(例えば、げっ歯類Adam6遺伝子は、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に位置する)を含む、機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリー
(b)5’から3’に、再構成されていないヒトDH1-1遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたDH2-2遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトDH3-16遺伝子セグメントと再構成されていないヒトDH7-27遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含む、ヒト操作されたDH領域、場合により、操作されたDHは、再構成されていないヒトDH2-2、DH2-8、およびDH2-15遺伝子セグメントは、それぞれ、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたDH2-2遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、およびその3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメントで置換されていることを除き、生殖系列配置で、再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、および(c)再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、例えば、再構成されていないヒトJH1遺伝子セグメント、再構成されていないJH2ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないJH3ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないJH4ヒト遺伝子セグメント、再構成されていないJH5ヒト遺伝子セグメント、および再構成されていないJH6ヒト遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、およびJH6遺伝子セグメントは、生殖系列配置にある、を含む。
本発明の範囲は、本明細書に添付される請求の範囲により規定されるものであり、本明細書に記載される特定の実施形態により限定されない。当分野の当業者は、本開示を読むことで、かかる記載される実施形態に対し均等であり得る様々な改変、または別の手段で請求の範囲内にあり得る様々な改変を認識するであろう。概して、専門用語は、明確な別段の示唆がない限り、当技術分野で理解されている意味に従う。特定の用語の明示的な定義は、本明細書におよび以下に提供されるが、本明細書全体にわたる特定の例におけるこれらの用語および他の用語の意味は、文脈から当業者に明らかとなるであろう。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。本明細書内またはその関連部分内に引用されている参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
coli)、バチルス属(Bacillus spp.)、ストレプトマイセス属(Streptomyces spp.)などの株)、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞(例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)など)、植物細胞、昆虫細胞(例えば、SF-9、SF-21、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)など)、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。
P.,2000,Immunology Today 21:371-378;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,2002,Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.,2002,BioTechniques 29:128-145)、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体(例えば、Taylor,L.D.,et al.,1992,Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Little M.et al.,2000,Immunology Today 21:364-370;Kellermann S.A.and Green L.L.,2002,Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Murphy,A.J.,et al.,2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14):5153-5158を参照のこと、その各々が、その全体が参照により本明細書に援用される)、または選択された配列要素の相互スプライシングを伴うその他の任意の手段によって調製、発現、生成もしくは単離されたポリペプチドを意味する。
本発明は、とりわけ、ヒト免疫グロブリンの一つ以上の部分(機能的フラグメント、結合部分など)をコードする異種遺伝物質を有するトランスジェニックまたは操作された非ヒト動物を提供し、その異種遺伝物質は、異種遺伝物質が、重鎖定常(CH)遺伝子と作動可能に結合されるように、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座に挿入される。かかる非ヒト動物は、再構成されたV(DD)J配列によりコードされる抗体を生成する能力を示すことが意図されている。かかる非ヒト動物が、野生型免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座(または自然界で出現する免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座)から生成された免疫グロブリン重鎖可変CDR3多様性を有する抗体集団と比較して、CDR3多様性が増加した重鎖可変領域によって特徴付けられる抗体集団を示すことも意図されている。したがって、提供される非ヒト動物は、特定の抗原、特に、従来(または野生型)の抗体により結合が好ましくない一つ以上のエピトープにより特徴付けられる、低いおよび/または乏しい免疫原性または抗原に結合する、抗体ベースの治療の開発に特に有用である。特に、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域におけるDH領域の一つ以上のDHセグメント(例えば、5’または3’)に隣接する23merの組み換えシグナル配列の導入、これにより、VDJ組み換え中にDHとDHセグメントの再構成の能力をもたらし、および単一のDHセグメントを含むVDJ組み換えから生成された抗体と比較して、より長いアミノ酸長により特徴付けられ得る、重鎖可変領域、特に、CDR3領域を有する抗体の発現を包含する。こうしたトランスジェニック非ヒト動物は、確立されている創薬技術の標的能を超えて疾患標的を結合させる抗体および/または抗体ベースの治療薬を特定し、開発するためのインビボシステムを提供する。さらに、こうしたトランスジェニック非ヒト動物は、ヒトに影響を及ぼす種々の疾患および/または疾患病状の中核をなすタンパク質-タンパク質相互作用を破壊することに重点を置くか、または破壊するように設計された、抗体および/または抗体ベースの治療薬の開発に有用な動物モデル系を提供する。
免疫グロブリン合成に関与する遺伝子は、動物の全ての細胞において見出され、染色体に沿って順次位置する、遺伝子セグメントに配置される。遺伝するヒト遺伝子セグメントの構成、例えば、ヒト遺伝子セグメントの生殖系列配置、例えば、ヒトの生殖系列ゲノム(例えば、次世代に受け継がれるゲノム)におけるヒト遺伝子セグメントの順序は、Lefranc,M.-P.,Exp.Clin.mmunogenet.,18,100-116(2001)において見いだされ、それはその全体が参照により本明細書に組込まれ、生殖系列配置においてヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座内で見出される機能的遺伝子セグメントおよび偽遺伝子も示す。いくつかの遺伝子成分が関与する、一連の組み換え現象は、遺伝子セグメント(例えば、V、DおよびJ)の順序付けられた配列から免疫グロブリンをアセンブルするのを助ける。遺伝子セグメントのこのアセンブリは、不正確であるとして知られ、それ故に、免疫グロブリン多様性は、異なる遺伝子セグメントの組み合わせ、および不正確な結合を通じた固有の結合の形成の両方により達成される。さらに、多様性は、免疫グロブリンの可変領域配列が、抗原に対する親和性および特異性を増加させるよう改変されている、体細胞超変異として知られるプロセスを通して生成される。免疫グロブリン分子は、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖とから構成されるY字型のポリペプチドであり、その各々は、二つの構造成分、一つの可変ドメインおよび一つの定常ドメインを有する。それは、遺伝子セグメントのアセンブリによって形成される重鎖および軽鎖の可変ドメインである一方、定常ドメインは、RNAスプライシングを通じて可変ドメインに融合される。遺伝子セグメントをアセンブル(または結合)する機序は、重鎖および軽鎖について類似するが、1回の結合現象のみが、軽鎖(すなわち、VからJ)に必要となる一方、2回の現象が、重鎖に必要となる(すなわち、DからJおよびVからDJ)。
本発明は、特定の抗原は、低いおよび/または乏しい免疫原性と関連し、故に、抗体ベースの治療のための不十分な標的であるという認識に基づく。実際に、多数の疾患標的(例えば、ウイルス、チャンネルタンパク質)は、難治性であるか、または新薬の開発にはつながらないと特徴付けられてきた。したがって、本発明は、確立された薬物開発テクノロジーおよび/またはアプローチに付随する課題を克服する抗体および抗体ベースの治療を開発するためのインビボシステムの作製に基づく。一部の実施形態では、本発明は、一つ以上のDH RSSが、12merのDH-12merのフォーマットから12merのDH-23merまたは23merのDH-12merのフォーマットに変更されるか、修飾されるか、または操作さ、これにより、参照インビボシステムで観察されるDHからDHへの組み換えと比較して、増加した頻度でのDHからDHへの組み換えを可能にする、操作されたDH領域を含む、免疫グロブリン遺伝子座、特に、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座の存在により特徴付けられるインビボシステムを提供する。本開示は、ゲノムが、操作されたDH領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むトランスジェニックげっ歯類の構築を具体的に示し、その操作されたDH領域は、増加した頻度のDH-DH組み換えを可能にする一つ以上のDHセグメントの各々と比べて位置しる23merのRSSに各々作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントを含む。本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の操作されたDH領域を生成するために、各々が5’または3’の23merのRSSに作動可能に結合された任意の数のDHセグメント(例えば、従来または合成)を達成するように合わせることができる。操作されたDH領域は、一度、免疫グロブリン重鎖可変領域に統合される(すなわち、VHおよびJH遺伝子セグメントならびに/または一つ以上の定常領域と作動可能に結合して配置される)と、例えば、特定の抗原への結合を指示するための加えられた多様性を有する重鎖(すなわち、長いCDR3、例えば、重鎖CDR3配列の少なくとも95%は、少なくとも14アミノ酸長である)により特徴付けられる抗体を生成するための、VHおよびJH遺伝子セグメントの一つより多いDHセグメントとの組み換えを提供する。一部の実施形態では、かかる重鎖可変領域は、ウイルス、チャンネルタンパク質、GPCRなどの届きにくいエピトープにアクセスする能力を有する。
多くの場合、本明細書に記載の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含有するポリヌクレオチド分子、特に、各々が、5’または3’の23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントは、適当な宿主細胞においてポリヌクレオチド分子を複製するために、ベクター、好ましくは、DNAベクターに挿入される。
非ヒト動物のゲノム中の免疫グロブリン重鎖可変領域内でDHとDH組み換えを可能にする一つ以上のDHセグメントに隣接する23merのRSSの統合から生じる長いアミノ酸長によって特徴付けられる、重鎖CDR3多様性を有する抗体を発現する非ヒト動物が、提供される。本明細書に記載の適当な例には、げっ歯類、特に、マウスが含まれる。一つ以上のDHセグメントは、多くの実施形態では、異種DHセグメント(例えば、ヒトDHセグメント)を含む。野生型または参照非ヒト動物と比較して、増加した頻度でDHとDH組み換えが可能な当該DHセグメントを含有する非ヒト動物、非ヒト胚および細胞を作製するための非ヒト動物、胚、細胞およびターゲティング構築物も提供される。
antibodies、PNAS USA 97:722~727;その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
(a)内在性重鎖遺伝子座に:
(i)内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域、再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の再構成されていないヒト重鎖可変領域VH遺伝子セグメント(例えば、全ての機能的ヒト再構成されていないヒトVH遺伝子セグメント)、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントを含む、
場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントは、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント(例えば、全ての機能的ヒトDH遺伝子セグメント)および/または一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメント(例えば、全ての機能的ヒトJH遺伝子セグメント)である、
(ii)内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト(ヒト化)重鎖可変領域、拘束性の再構成されていないヒト(ヒト化)重鎖可変領域は、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントと作動可能に結合された単一の再構成されていないヒト重鎖可変領域VH遺伝子セグメントから本質的になる、場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントおよび一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントは、それぞれ、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントおよび/または一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントである、
(iii)内在性重鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾された再構成されていないヒト(ヒト化)重鎖可変領域、ヒスチジン修飾された再構成されていないヒト(ヒト化)重鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む、(iv)内在性重鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト(ヒト化)重鎖可変領域を含む重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、内在性重鎖定常領域は、(1)軽鎖と関連するIgMアイソタイプをコードするインタクトな内在性IgM遺伝子、および(2)機能的CH1ドメインをコードする配列を欠く非IgM遺伝子、例えばIgG遺伝子を含む、非IgM遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるCH1ドメインを欠く非IgMアイソタイプをコードする;
および/または
(b)内在性軽鎖遺伝子座に:
(i)内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域、再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の再構成されていないヒト軽鎖可変領域VL遺伝子セグメント(例えば、全ての機能的ヒト再構成されていないヒトVL遺伝子セグメント)および一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントを含む、
場合により、一つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントは、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメント(例えば、全ての機能的ヒトJHL遺伝子セグメント)である、
場合により、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内在性免疫グロブリン軽鎖カッパ(κ)遺伝子座であり、再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ(Vκ)および結合κ(Jκ)遺伝子セグメントを含み、内在性軽鎖定常領域は、内在性κ鎖定常領域配列であり、および/または内在性免疫グロブリン軽鎖軽鎖遺伝子座は、内在性免疫グロブリン軽鎖ラムダ(λ)であり、再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ(Vλ)遺伝子セグメントおよび結合λ(Jλ)遺伝子セグメントを含み、内在性軽鎖定常領域は、内在性λ鎖定常領域配列であり、場合により、内在性免疫グロブリン軽鎖λ遺伝子座は、(a)一つ以上のヒトVλ遺伝子セグメント、(b)一つ以上のヒトJλ遺伝子セグメント、および(c)一つ以上のヒトCλ遺伝子セグメントを含み、(a)および(b)は、(c)およびげっ歯類免疫グロブリン軽鎖定常(Cλ)遺伝子セグメントに作動可能に結合され、内在性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、一つ以上のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー(Eλ)、および一つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー(Eλ)を含み、場合により、三つのヒトEλを含む、
(ii)内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された再構成されたヒト(ヒト化)軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列、再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントと再構成されたヒト軽鎖可変領域VL遺伝子セグメントを含む、
(iii)内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合された拘束性の再構成されていないヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、拘束性の再構成されていないヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、一つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントに作動可能に結合された二つ以下の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントを含む、
(iv)内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成されていないヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、ヒスチジン修飾再構成されていないヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成されていないヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む;または
(v)内在性軽鎖定常領域に作動可能に結合されたヒスチジン修飾再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、ヒスチジン修飾再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンでの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、を含むように修飾されたマウスを含み、
場合により、マウスはさらに、
(i)マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈するように、機能的ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖遺伝子座;および/または
(ii)場合により、再構成可変領域遺伝子の少なくとも10%が、鋳型には無い付加を含むように、抗原受容体の多様性を増すために外来性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含み、
そのマウスは、既に記載されている。例えば、米国特許第8,697,940号、第8,754,287号、第9,204,624号、第9,334,334号、第9,801,362号、第9,332,742号、および第9,516,868号、米国特許出願公開第20110195454号、第20120021409号、第20120192300号、第20130045492号、第20150289489号、第20180125043号、第20180244804号、PCT特許出願公開第2019/113065号、第2017210586号および第2011163314号、Leeら、(2014年)Nature Biotechnology 32:356を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトVH遺伝子セグメント、本発明のヒト操作されたDH遺伝子領域、およびヒトJH遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内在性免疫グロブリン遺伝子座、免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に作動可能に結合され、および/または
ヒトVL遺伝子セグメント、およびヒトJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内在性鎖遺伝子座、免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に作動可能に結合される、を含む、遺伝子修飾された非ヒト動物を含む。
A1号、第2012-0021409 A1号、第2012-0192300 A1号、第2013-0045492 A1号、第2013-0185821 A1号、第2013-0198880 A1号、第2013-0302836 A1号、第2015-0059009 A1号;国際特許出願公開第2011/097603号、第2012/148873号、第2013/134263号、第2013/184761号、第 2014/160179号、第2014/160202号として記載される一つ以上の修飾(例えば、交雑または複数の遺伝子ターゲティング戦略を介して)さらに含む。
様々なインビトロ技術およびインビボ技術が、抗体ベースの治療薬を生み出すために開発されてきた。詳細には、インビボ技術は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を備えたトランスジェニック動物(すなわち、げっ歯類)であって、遺伝子が、動物のゲノムにランダムに組み込まれている(例えば、米国特許第5,569,825号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる)か、または動物の内在性免疫グロブリン定常領域と作動可能に結合された内在性免疫グロブリン遺伝子座に寸分たがわずに配置されている、動物の生成を特徴としてきた(例えば、米国特許第8,502,018号、第8,642,835号、第8,697,940号、および第8,791,323号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる)。両方のアプローチは、ヒトへの使用に有望な抗体治療候補の生成に、よい結果をもたらしてきた。さらに、両方のアプローチは、インビボで生成された抗体レパートリーから抗体候補が選択されるという点で、インビトロアプローチよりも優れており、この選択には、宿主免疫システムの内部環境内での抗原に対する親和性および特異性の選択が含まれる。このように、抗体は、インビトロ技術に付随し得る人工環境またはインシリコ予測ではなく、自然提示された抗原に(関連する生物学的エピトープおよび表面内で)結合するものである。インビボ技術から得られる頑強な抗体レパートリーにも関わらず、複合体(例えば、ウイルス、チャンネルポリペプチド)または細胞質抗原に対する抗体は、依然として困難なままである。さらに、種(例えば、ヒトおよびマウス)間で高い程度の配列同一性を共有するポリペプチドに対する抗体を生成することも、免疫寛容に起因して課題のままである。
本発明はさらに、本明細書に記載の、少なくとも一つの非ヒト動物、非ヒト細胞、DNAフラグメント、および/またはターゲティングベクターを充填した一つ以上の容器を含むパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法(例えば調査方法)において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、(a)ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、(b)使用に関する説明書、またはその両方、または二つ以上の実体の間の物質および/または生物製品(例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞)の移送を支配する契約書、を反映している。
本実施例は、げっ歯類(例えば、マウス)などの非ヒト動物のゲノム内への挿入のためのターゲティングベクターの構築を説明する。特に、本実施例で説明する方法は、ゲノムが、操作したDH領域は、各々、5’または3’の23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントを含む、操作した重鎖多様性(DH)領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類(例えば、マウス)のゲノムへの挿入のためのターゲティングベクターの生成を示す。本実施例では、三つのターゲティングベクターを記載する:5’の23merのRSSに作動可能に結合し、一つのヒトJHセグメントに作動可能に結合した近位(または3’)DHセグメントを含む操作したDH領域を含有する、第1のターゲティングベクター、5’の23merのRSSに作動可能に結合し、三つのヒトJHセグメントに作動可能に結合した近位(または3’)DHセグメントを含む操作したDH領域を含有する、第2のターゲティングベクター、および各々、3’の23merのRSSと関連し、六つのヒトJHセグメントに作動可能に結合した、三つのDHセグメントを含む操作したDH領域を含有する、第3のターゲティングベクター(図2)。これらのターゲティングベクターの各々を生成し、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域内に別々に挿入した(図3、5、7)。以下に記載する通りされるように、操作したDH領域を、重鎖可変(VH)および重鎖結合(JH)セグメントと作動可能に結合し、VDJ組み換え時に、DH-DH組み換えから生じるCDR3を有する抗体を発現させた。
簡潔に述べると、第1のターゲティングベクターを、複数のヒトDHセグメント、およびヒトDH7-27の場所にに位置付けられた合成ヒトDH3-3セグメントを含有するゲノムDNAフラグメントを使用して構築した。インビトロCas9/GA修飾のためのドナーを、新規合成(Blue Heron Bio)により作製し、5’から3に:(a)DH7-27の5’の12merのRSSの上流350bpから始まる100bpの相同アーム、(b)ネオマイシン耐性カセットの挿入のためのAgeIおよびXhoI部位、(c)DH7-27の5’末端の12のRSSの上流の250bpの領域、(d)5’末端の23merのRSS(JH4由来)および3’末端の12merのRSS(DH3-3由来)で操作した、合成ヒトDH3-3セグメント、および(3)JH5の3bp下流で始まる、100bpの相同ボックスを含む。loxp-UbC-Em7-Neo-loxpカセット、例えば、loxP部位特異的組み換え認識部位が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、大腸菌およびマウスES細胞での選択を可能にするためのAgeIおよびXhoI部位へのライゲーションにより、合成DHセグメントの上流および下流約250bpに置いた。ネオマイシンカセットを含むこの23:DH3-3:12/JH6ドナー(配列番号61)を使用して、二つのCas9:gRNA複合体を使用してインビトロCas9/GAによりBACを修飾した。修飾に先立ち、BACは、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスのキメラIgH遺伝子座と配列が同一であった(例えば、JH遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む6394対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む1460対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図3および4を参照)。具体的には、BACは、最も近位のヒトVH遺伝子(VH6-1)から始まり、27個のヒトDH遺伝子、全6個のヒトJH遺伝子、マウスIgHイントロンエンハンサー(Eμ)、マウスIgMスイッチ領域(Sμ)、およびマウスIgM遺伝子の最初の4個のエクソンを含む1460対立遺伝子と同一であった。BACはまた、スペクチノマイシン(spec)耐性カセットおよび約29kbの、VH6-1遺伝子から上流のヒト遺伝子間配列を含んでいた。ヒトとマウスの結合は、ヒトJH6遺伝子の3’の222bpおよびマウスEμエンハンサーの5’の490bpである。GAを介した23:D3-3:12/JH6ドナーのBACへの挿入は、DH7-7遺伝子セグメントの操作した23:D3-3:12セグメントでの置換およびJH1、JH2、JH3、JH4、およびJH5遺伝子セグメントの欠失を含む、最終23:D3-3:12/JH6ターゲティングベクターを生じた(図2)。表1は、23:DH3-3:12/JH6ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したgRNA、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
同様の方法で、第1のターゲティングベクター(23:DH3-3:12/JH4-6)を、複数のヒトDHセグメント、およびヒトDH7-27の場所に位置付けられた合成ヒトDH3-3セグメントを含有する同じゲノムDNAフラグメントを使用して構築した。しかしながら、この第2のターゲティングベクターは、六つのヒトJHセグメントのうちの三つ(すなわち、JH4、JH5、JH6)を含んでいた。最終23:DH3-3:12/JH4-6ターゲティングベクターを生成するために、ドナーを使用して、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスのキメラIgH遺伝子座と配列が同一のBACを修飾した(例えば、JH遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む6394対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む1460対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図3および4を参照)。ドナーは、5’から3に:(a)D7-27の5’末端の12merのRSSの上流350bpから始まる100bpの相同アーム、(b)ネオマイシン耐性カセットの挿入のためのAgeIおよびXhoI部位、(c)D7-27の5’末端の12のRSSの上流の250bpの領域、(d)5’末端の23merのRSS(JH4由来)および3’末端の12merのRSS(DH3-3由来)で操作した、合成ヒトDH3-3セグメント、および(e)JH3の3bp下流で始まる、100bpの相同ボックスを含んでいた。loxp-UbC-Em7-Neo-loxpカセット、例えば、loxP部位特異的組み換え認識部位が隣接したネオマイシン耐性遺伝子を、大腸菌およびマウスES細胞での選択を可能にするためのAgeIおよびXhoI部位へのライゲーションにより、合成DHセグメントの上流約250bpに置いた。ネオマイシンカセットを含む、配列番号52として記載するヌクレオチド配列を含むこの23:D3-3:12/JH4-6ドナーを使用して、1460対立遺伝子と配列が同一なBACを修飾した(図3および図4)。具体的には、BACは、最も近位のヒトVH遺伝子(VH6-1)から始まり、27個のヒトDH遺伝子、全6個のヒトJH遺伝子、マウスIgHイントロンエンハンサー(Eμ)、マウスIgMスイッチ領域(Sμ)、およびマウスIgM遺伝子の最初の4個のエクソンを含む1460対立遺伝子と同一であった。BACはまた、スペクチノマイシン(spec)耐性カセットおよび約29kbの、VH6-1遺伝子から上流のヒト遺伝子間配列を含んでいた。ヒトとマウスの結合は、ヒトJH6遺伝子の3’の222bpおよびマウスEμエンハンサーの5’の490bpである。二つのCas9:gRNA複合体を使用したインビトロCas9/GAを介した23:D3-3:12/JH4-6ドナーのBACへの挿入は、DH7-7遺伝子セグメントの操作した23:D3-3:12セグメントでの置換およびJH1、JH2、およびJH3遺伝子セグメントの欠失を含む、最終23:D3-3:12/JH4-6ターゲティングベクター(図2)を生じた。表2は、23:DH3-3:12/JH6ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したgRNA、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
簡潔に述べると、第3のターゲティングベクターを、各々、12merの5’RSSおよび23merの3’RSSを有する、三つのDH2ファミリー遺伝子セグメント(DH2-2、DH2-8およびDH2-15)を含む複数のDHヒトセグメントを含有するDNAフラグメントを使用して構築した。最初に、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスのキメラIgH遺伝子座と配列が同一のBAC(例えば、JH遺伝子セグメントを欠き、内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む6394対立遺伝子、および内在性マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列に作動可能に結合したヒト化可変領域を含む1460対立遺伝子に対してヘテロ接合性である、VELOCIMMUNE(登録商標)マウスの例示的な非限定的な内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を示す、図3および4を参照)。具体的には、BACは、最も近位のヒトVH遺伝子(VH6-1)から始まり、大腸菌およびマウスES細胞における選択のため第1のヒトDHセグメント(DH1-1)の512bp上流の、loxP部位特異的組み換え認識部位が隣接したloxp-UbC-Em7-Neo-loxpカセット、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子に挿入するための細菌相同組み換え(BHR)を使用して修飾した、全27種のヒトDH遺伝子、全6種のヒトJH遺伝子、マウスIgHイントロンエンハンサー(Eμ)、マウスIgMスイッチ領域(Sμ)、およびマウスIgM遺伝子の最初の4つのエクソンを含む、1460対立遺伝子と同一であった。この得られたBACを、続いて、インビトロCas9/GAを使用して三つのドナーで修飾した。
1. 5’から3’に、DH2-2の5’末端の12 RSSの1419bp上流から始まる50bpの相同ボックス、複数のクローニング部位(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、ヒトVH1-69(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC;T->A、G->C;配列番号151)からもたらされた推定3’末端の23merのRSSにより置換した3’末端の12merのRSSを有する修飾したD2-2遺伝子、およびD2-2の3’末端の23merのRSSの863bpの下流で終わる50bp相同ボックスを含有した、DH2-2の修飾のための第1のドナー。DH2-2の修飾のためのこの第1のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号70として記載する。DH領域は、約10kbの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な40bpの配列が挿入した;一つは、5’相同ボックスの74bp下流であり、もう一つは、3’相同ボックスの40bp上流であった。これらの固有の40merを、PCR/配列決定プライマーおよびTaqmanプローブの結合部位として使用し、図2の塗りつぶしていない長方形「1」および「2」で示し、それぞれ、配列番号73および配列番号74として記載したヌクレオチド配列を含む。
2. 5’から3’に、DH2-8の5’末端の12 RSSの552bp上流から始まる50bpの相同ボックス、複数のクローニング部位(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、ヒトVH1-69(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC;T->A、G->C;配列番号151)からもたらされた推定3’末端の23merのRSSにより置換した3’末端の12merのRSSを有する修飾したD2-8遺伝子、およびD2-8の3’末端の23merのRSSの867bpの下流で終わる50bp相同ボックスを含有した、DH2-8の修飾のための第2のドナー。DH2-8の修飾のためのこの第2のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号71として記載する。DH領域は、約10kbの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な40bpの配列が挿入した;一つは、5’相同ボックスの74bp下流であり、もう一つは、3’相同ボックスの40bp上流であった。これらの固有の40merを、PCR/配列決定プライマーおよびTaqmanプローブの結合部位として使用し、図2の塗りつぶしていない長方形「10」および「16」で示し、それぞれ、配列番号75および配列番号76として記載したヌクレオチド配列を含む。
3. 5’から3’に、DH2-15の5’末端の12 RSSの391bp上流から始まる50bpの相同ボックス、複数のクローニング部位(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、ヒトVH1-69(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC;T->A、G->C;配列番号151)からもたらされた推定3’末端の23merのRSSにより置換した3’末端の12merのRSSを有する修飾したD2-15遺伝子、およびD2-15の3’末端の23merのRSSの867bpの下流で終わる50bp相同ボックスを含有した、DH2-15の修飾のための第3のドナー。DH2-2の修飾のためのこの第3のドナーのヌクレオチド配列を、配列番号72として記載する。DH領域は、約10kbの四つの直接リピートからなるため、スクリーニング用の固有のプライマーおよびプローブの設計は、非常に困難である。この問題を克服するために、二つの固有な40bpの配列が挿入した;一つは、5’相同ボックスの74bp下流であり、もう一つは、3’相同ボックスの40bp上流であった。これらの固有の40merを、PCR/配列決定プライマーおよびTaqmanプローブの結合部位として使用し、図2の塗りつぶしていない長方形「8」および「18」で示し、それぞれ、配列番号77および配列番号78として記載したヌクレオチド配列を含む。
3種のドナーでのインビトロCas9/GA修飾後、最終ターゲティングベクターは、5’から3’に、ヒト可変領域DNA、ネオマイシン選択カセット、各々、5’で12merのRSSが、3’で23merのRSSが隣接した、三つのヒトDHセグメント操作したヒトDH領域、六つのヒトJHセグメントを含有する、49kbの5’相同アーム、およびマウス重鎖イントロンエンハンサー(Ei)およびマウスIgM定常領域遺伝子を含有する24kbの3’相同アームを含有していた。(図2)。表3は、12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2-15:23/JH1-6ターゲティングベクターの正確な構築を決定するために使用したgRNA、プライマーおよびプローブの配列を提供する。
本実施例は、ゲノムが、操作した重鎖多様性(DH)領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む非ヒト動物(例えば、げっ歯類)の作製を示し、操作したDH領域は、各々、23merのRSSに作動可能に結合した一つ以上のDHセグメントを含む。
免疫表現型
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(n=3、26% C57BL/6、23% 129S6/SvEvTac 51% Balb/cAnNTac、例えば、米国特許第8,502,018号および第8,642,835号を参照)、
6643het/6800het/1293hoマウス(23:DH3-3:12/JH6ターゲティングベクターで修飾した、25% C57BL/6NTac、25% 129S6/SvEvTac、50% Balb/cAnNTac;図4を参照;n=3);
6643het/6798het//1293hoマウス(23:DH3-3:12/JH4-6ターゲティングベクターで修飾した、25% C57BL/6NTac、25% 129S6/SvEvTac、50% Balb/cAnNTac;図6を参照;n=3);または
20188ho/1293hoマウス(12:DH2-2:23|12:DH2-8:23|12:DH2.1523/JH1-6ターゲティングベクターで修飾した、25%
C57BL/6NTac、25% 129S6/SvFvTac、50% Balb/cAnNTac;n=3)。
骨髄を遠心分離により大腿骨から収集した。脾臓および骨髄調製物由来の赤血球を、ACK溶解緩衝液(Gibco)で溶解し、続いて2%FBSを含む1×PBSで洗浄した。単離した細胞(1×106個)を、選択した抗体カクテルと4℃で30分間インキュベーションした。染色1:ラット抗マウスCD43-FITC(Biolegend 121206、クローン1B11)、ラット抗マウスc-kit-PE(Biolegend
105808、クローン2B8)、ラット抗マウスIgM-PeCy(eBiosciences 25-5790-82、クローンII/41)、ラット抗マウスIgD-PerCP-Cy5.5(Biolegend 405710、クローン11-26c.2a)、ラット抗マウスCD3-PB(Biolegend 100214、クローン17-A2)、ラット抗マウスB220-APC(eBiosciences 17-0452-82、クローンRA3-6B2)、およびラット抗マウスCD19-APC-H7(BD 560143、クローン1D3)。染色2:ラット抗マウスkappa-FITC(BD 550003、クローン187.1)、ラット抗マウスlambda-PE(Biolegend 407308、クローンRML-42)、ラット抗マウスIgM-PeCy(eBiosciences 25-5790-82、クローンII/41)、ラット抗マウスIgD-PerCP-Cy5.5(Biolegend 405710、クローン11-26c.2a)、ラット抗マウスCD3-PB(Biolegend 100214、クローン17-A2)、ラット抗マウスB220-APC(eBiosciences 17-0452-82、クローンRA3-6B2)、およびラット抗マウスCD19-APC-H7(BD 560143、クローン1D3)。染色後に、細胞を洗浄し、2%のホルムアルデヒド中で固定した。データ収集をBD LSRFORTESSA(商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)で行い、FLOWJO(商標)ソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析した。
本実施例は、ゲノムが、本明細書に記載の操作したDH領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類における抗体の生成を示す。本実施例に記載される方法、および/または当該技術分野で周知の免疫方法を使用して、本明細書に記載の操作したDH領域を含有するげっ歯類を、必要に応じて、ポリペプチドもしくはそのフラグメント(例えば、所望のエピトープからもたらされたペプチド)、またはポリペプチドもしくはそのフラグメントの組み合わせで免疫化することができる。
本発明の少なくとも一つの実施形態のこのような記述されたいくつかの側面を持つ、様々な修正、変更、および改善を当業者であれば容易に思いつくことが当業者には理解されるはずである。このような修正、変更、および改善は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、前述の説明および図面は例示のみとしてのものであり、本発明は以下の請求項によって詳細に記述される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
23merの組み換えシグナル配列(RSS)に作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントを含む、操作された重鎖多様性(DH)遺伝子セグメントを含む、ヌクレオチド分子。
(項目2)
ヌクレオチド配列が、(i)23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントおよび(ii)一方の端で12merのRSSが、他の端で別の12merのRSSが隣接した、再構成されていないDH遺伝子セグメントを含む操作されたDH領域を含み、
前記(i)23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントおよび前記(ii)一方の端で12merのRSSが、他の端で別の12merのRSSが隣接した再構成されていないDH遺伝子セグメントが、(i)および(ii)が、12/23規則に従ってDH-DH組み換え事象において結合できるように、作動可能に結合され、
場合により、前記操作されたDH領域が、ヒトDH遺伝子セグメントのみを含む、項目1に記載のヌクレオチド分子。
(項目3)
前記ヌクレオチド分子が、
(a)前記操作されたDH領域の上流であり、作動可能に結合された少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変(VH)遺伝子セグメント、
(b)前記操作されたDH領域の下流であり、作動可能に結合された少なくとも一つの再構成されていない免疫グロブリン重鎖結合(JH)遺伝子セグメント、または
(c)(a)と(b)との組み合わせをさらに含む、項目2に記載のヌクレオチド分子。
(項目4)
前記少なくとも一つのVH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントを含み、前記少なくとも一つのJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせを含む、項目3に記載のヌクレオチド分子。
(項目5)
前記少なくとも一つの再構成されていないJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントを含む、項目3または4に記載のヌクレオチド分子。
(項目6)
前記少なくとも一つの再構成されていないJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH1遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH2遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH3遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、およびJH6遺伝子セグメントが、生殖系列配置にある、項目3~5のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目7)
少なくとも一つの再構成されていないVH遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、前記再構成されていないヒトVH3-74と再構成されていないヒトVH1-6遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、項目3~6のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目8)
一つ以上の機能的げっ歯類Adam6遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上の機能的げっ歯類Adam6遺伝子が、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に位置し、および/またはヒトAdam6遺伝子を置換する、項目1~7のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目9)
前記23merのRSSが、前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントの5’末端に隣接する、項目1~8のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目10)
前記23merのRSSが、前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、項目1~9のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目11)
23merのRSSに作動可能に結合された、前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントが、
(a)23merのRSS作動可能に結合されたヒトDH3-3遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH3-3遺伝子セグメントの5’末端に隣接する、
(b)23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-2遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-2遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、
(c)23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-8遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、
(d)23merのRSSに作動可能に結合されたヒト2-15遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-15遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、または
(e)(a)~(d)の任意の組み合わせを含む、項目1~10のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目12)
配列番号52として記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む、項目1~11のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目13)
配列番号61として記載される配列を含むヌクレオチド配列を含む、項目1~11のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目14)
配列番号70として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、項目1~13のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目15)
配列番号71として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、項目1~14のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目16)
配列番号72として記載されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含む、項目1~15のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目17)
作動可能な結合で5’から3’に;
(a)一つ以上の再構成されていないヒトVH遺伝子セグメント;
(b)5’から3’に
(i)一つ以上の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメント、前記一つ以上のヒトDH遺伝子セグメントの各々が、その5’および3’末端で12merのRSSが隣接する、および
(ii)その5’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH3-3遺伝子セグメントを含む23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントを含む、操作されたDH領域;および
(c)一つ以上の再構成されていないヒトJH遺伝子セグメント、を含む、ヌクレオチド分子。
(項目18)
作動可能な結合で5’から3’に;
(a)一つ以上の再構成されていないヒトVH遺伝子セグメント;
(b)操作されたDH領域、前記操作されたDH領域が、5’から3’に
(i)その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのヒトDH2遺伝子セグメントを含む、23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメント、場合により、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのヒトDH2遺伝子セグメントは、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-2遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、その3’末端で23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメント、またはその任意の組み合わせを含む、および
(ii)一つ以上のヒトDH遺伝子セグメント、前記一つ以上のヒトDH遺伝子セグメントの各々が、その5’および3’末端で12merのRSSが隣接している、を含む;および
(c)一つ以上の再構成されていないヒトJH遺伝子セグメント、を含む、ヌクレオチド分子。
(項目19)
前記一つ以上の再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントが、5’から3’に、再構成されていないヒトVH1-2遺伝子セグメントおよび再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントを含み、前記ヌクレオチドは、前記再構成されていないヒトVH1-2遺伝子セグメントと前記再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に一つ以上の機能的げっ歯類Adam6遺伝子をさらに含み、前記再構成されていないヒトVH1-2遺伝子セグメント、前記一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子、および再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントが、連続している、項目17または18に記載のヌクレオチド分子。
(項目20)
前記一つ以上の再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、再構成されていないヒトVH3-74遺伝子セグメントと再構成されていないヒトVH1-6遺伝子セグメントの間に渡り、されらを含む、機能的な再構成されていないヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、項目17~19のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目21)
前記一つ以上の再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントを含む、項目17~20のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目22)
前記一つ以上の再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントを含む、項目21に記載のヌクレオチド分子。
(項目23)
前記一つ以上の再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントが、再構成されていないヒトJH1遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH2遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH3遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、およびJH6遺伝子セグメントが、生殖系列配置にある、項目22に記載のヌクレオチド分子。
(項目24)
その3’末端に、重鎖免疫グロブリン定常領域(CH)またはその一部をさらに含む、項目1~23のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目25)
前記CHが、げっ歯類CH領域またはその一部である、項目24に記載のヌクレオチド分子。
(項目26)
前記げっ歯類CH領域またはその一部が、げっ歯類イントロンエンハンサー領域およびげっ歯類IgM遺伝子を含む、項目25に記載のヌクレオチド分子。
(項目27)
薬物選択カセットをさらに含み、
前記薬物選択カセットが、23merのRSSに作動可能に結合された前記DH遺伝子セグメントの上流に位置し、
前記薬物選択カセットが、一つ以上の部位特異的組み換え部位と場合により隣接する、項目1~26のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子。
(項目28)
免疫グロブリン重鎖配列との相同な組み換えを可能にするよう配置された5’および3’相同アームを含み、場合により、前記免疫グロブリン重鎖配列が、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座に位置し、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域、またはその組み合わせを含む、項目1~27のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子を含む、ターゲティングベクター。
(項目29)
DH-DH組み換えを操作するために免疫グロブリン重鎖可変領域を修飾する方法であって、
一つ以上の再構成されていないDH遺伝子セグメントを含むDH領域を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程、再構成されていないDH遺伝子セグメントの各々が、一方の端で12merのRSSが、他の端で別の12merのRSSが隣接する、
23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントをさらに含むように前記DH領域を修飾する工程を含む、方法。
(項目30)
前記一つ以上の再構成されていないDH遺伝子セグメントが、一つ以上の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含む、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記一つ以上の再構成されていないDH遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置で、前記生殖系列ヒトDH1-1と前記生殖系列ヒトDH7-27遺伝子セグメントの間に渡り、それらを含む、全ての機能的生殖系列ヒトDH遺伝子セグメントを含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
修飾工程が、
(a)23merのRSSに作動可能に結合されたDH遺伝子セグメントを有する前記一つ以上の再構成されていないDH遺伝子セグメントの少なくとも一つ、
(b)23merのRSSを有する再構成されていないDH遺伝子セグメントに隣接する前記二つの12merのRSSの少なくとも一つ、または
(c)(a)と(b)の組み合わせ、を置換する工程を含む、項目29~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、少なくとも一つの再構成されていないJH遺伝子セグメントを含むJH領域をさらに含み、
前記JH領域が、前記DH領域に作動可能に結合され、
前記一つ以上の再構成されていないDH遺伝子セグメントの少なくとも一つを、前記23merのRSSに作動可能に結合され前記DH遺伝子セグメントで置換する工程が、前記JH領域内に含まれる少なくとも一つの再構成されていないJH遺伝子セグメントで欠失する工程を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記JH領域が、ヒト生殖系列JH1遺伝子セグメント、ヒト生殖系列JH2遺伝子セグメント、ヒト生殖系列JH3遺伝子セグメント、ヒト生殖系列JH4遺伝子セグメント、ヒト生殖系列JH5遺伝子セグメント、およびヒト生殖系列JH6遺伝子セグメントを含むヒト生殖系列JH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含み、場合により、前記ヒト生殖系列JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、およびJH6遺伝子セグメントが、生殖系列配置にあり、
前記JH領域内に含まれる少なくとも一つの生殖系列JH遺伝子セグメントの欠失が、前記再構成されていないヒトJH1、JH2、およびJH3遺伝子セグメントの欠失、場合により、前記JH4およびJH5遺伝子セグメントの欠失をさらに含む、項目33に記載の方法。
(項目35)
23merのRSSに作動可能に結合され前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントが、
(a)23merのRSS作動可能に結合されたヒトDH3-3遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH3-3遺伝子セグメントの5’末端に隣接する、
(b)23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-2遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-2遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、
(c)23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-8遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、
(d)23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメント、場合により、前記23merのRSSが、前記DH2-15遺伝子セグメントの3’末端に隣接する、または
(e)(a)~(d)の任意の組み合わせを含む、項目29~34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
置換される前記少なくとも一つの再構成されていないDH遺伝子セグメントが、前記DH領域の最も3’の再構成されていないDH遺伝子セグメントを含む、項目32~35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
置換される前記少なくとも一つの再構成されていないDH遺伝子セグメントが、23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントに対応するDH遺伝子セグメントを含む、項目32~36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
項目1~27のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子、項目28に記載のターゲティングベクター、または項目29~37のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目39)
項目1~27のいずれか一項に記載の核酸、項目28に記載のターゲティングベクター、項目29~37のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域、または項目38に記載の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含み、場合により、げっ歯類生殖系列ゲノムである、げっ歯類ゲノム。
(項目40)
(i)再構成されていない重鎖可変(VH)遺伝子セグメント、
(ii)操作された重鎖可変領域多様性(DH)領域、前記操作されたDH領域が、一つ以上の生殖系列DH遺伝子セグメントおよび23mer組み換えシグナル配列(RSS)に作動可能に結合された一つ以上のDH遺伝子セグメントを含む、および
(iii)再構成されていない重鎖結合(JH)遺伝子セグメント、を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、げっ歯類生殖系列ゲノムであって、
(i)~(iii)が、組み換え時に、前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする再構成された重鎖可変領域配列を含み、場合により、前記再構成された重鎖可変領域配列が、VH(DH-DH)JH組み換え現象後に形成される、げっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目41)
23mer組み換えシグナル配列(RSS)に作動可能に結合された前記一つ以上のDH遺伝子セグメントが、3’の23merのRSSに作動可能に結合されたDHセグメントを含む、項目40に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目42)
23mer組み換えシグナル配列(RSS)に作動可能に結合された前記一つ以上のDH遺伝子セグメントが、5’の23merのRSSに作動可能に結合されたDHセグメントを含む、項目40または41に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目43)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、ヒトVH、DH、およびJH遺伝子セグメントのみを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域である、項目40~42のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目44)
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合されている、項目43に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目45)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、場合により、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖遺伝子座の、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域である、項目44に記載のげっ歯生殖系列ゲノム。
(項目46)
前記再構成されていないVH遺伝子セグメントが、場合により、生殖系列配置の、VH3-74~VH6-1の間に渡り、それらを含む、機能的生殖系列ヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリーを含む、項目40~45のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目47)
前記再構成されていない重鎖JH遺伝子セグメントが、ヒトJH6遺伝子セグメントを含む、項目40~46のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目48)
げっ歯類生殖系列ゲノムが、内在性Adam6遺伝子を欠く、項目40~47のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目49)
一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上のげっ歯類内在性Adam6遺伝子が、内在性げっ歯類Adam6遺伝子を含む、項目40~47のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目50)
前記一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子が、二つのヒトVH遺伝子セグメントの間に挿入される、項目49に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目51)
前記一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子が、ヒトVH1-2遺伝子セグメントとヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に挿入される、項目50に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目52)
前記一つ以上の一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子が、ヒトAdam6偽遺伝子の代わりに挿入される、項目49に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目53)
前記一つ以上の一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子が、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトDH遺伝子セグメントの間に挿入される、項目49に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目54)
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子をさらに含む、項目39~53のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目55)
前記操作されたDH領域に対してホモ接合性であることを特徴とする、項目39~54のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目56)
前記操作されたDH領域に対してヘテロ接合性であることを特徴とする、項目39~54のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目57)
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、項目39~56のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノム。
(項目58)
項目39~57のいずれか一項に記載のげっ歯類生殖系列ゲノムを含む、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目59)
前記げっ歯類またはげっ歯類細胞が、ラット、マウス、ラット細胞、またはマウス細胞である、項目58に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目60)
前記げっ歯類細胞が、げっ歯類胚性幹細胞である、項目58または59に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目61)
項目60に記載のげっ歯類胚性幹細胞から生成される、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目62)
再構成された重鎖VH(DHA-DHB)JHコード配列を含む体細胞ゲノムをさらに含み、
場合により、前記再構成された重鎖VH(DHA-DHB)JH遺伝子セグメントが、IgM定常領域遺伝子配列に作動可能に結合され、および/またはDHAまたはDHBが、23merのRSSに作動可能に結合された前記DH遺伝子セグメントまたはその一部からもたらされ、DHAまたはDHBの少なくとも9コの塩基対が、23merのRSSに作動可能に結合された前記DH遺伝子セグメントの少なくとも9コの塩基対またはその一部およびその各々と同一である、項目58~61のいずれか一項に記載のげっ歯類、げっ歯類胚、またはげっ歯類細胞。
(項目63)
前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖VDJコード配列の少なくとも95%が、少なくとも10アミノ酸長のCDR3を有し、場合により、前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖VDJ遺伝子配列の少なくとも70%が、少なくとも11アミノ酸長のCDR3を有し、場合により、前記げっ歯類における全ての再構成された重鎖VDJ遺伝子配列の少なくとも15%が、少なくとも14アミノ酸長のCDR3を有する、項目58~62のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目64)
参照げっ歯類におけるDH-DH組み換えの頻度と比較して、少なくとも少なくとも3倍増加した頻度のDH-DH組み換えを示すことを特徴とする、項目58~63のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目65)
ゲノムが、操作されたDH領域を含むげっ歯類を作製する方法であって、項目60に記載の胚性幹細胞からげっ歯類を作製することを含む、方法。
(項目66)
ゲノムが、操作されたDH領域を含むげっ歯類を作製する方法であって、
(a)各々、23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDH遺伝子セグメントを含むDNAフラグメントを含む、げっ歯類胚性幹細胞のゲノムを修飾する工程、場合により、前記DNAフラグメントが、項目1~27のいずれか一項に記載のヌクレオチド分子、項目28に記載のターゲティングベクター、項目30~37のいずれか一項に記載の方法に従って修飾された免疫グロブリン重鎖可変領域、または項目38に記載の免疫グロブリン重鎖を含む、
(b)(a)の前記修飾されたげっ歯類胚性幹細胞を使用してげっ歯類を生成する工程、を含む、方法。
(項目67)
ゲノムが、操作されたDH領域を含む、げっ歯類を作製する方法であって、
23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDHセグメントを含むように免疫グロブリン重鎖可変領域の再構成されていないDH領域を修飾する工程、前記再構成されていないDH領域が、一つ以上の生殖系列DH遺伝子セグメントをさらに含む、
これにより、前記げっ歯類を作製する工程を含む、方法。
(項目68)
修飾する工程が、前記一つ以上の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを置換する工程、場合により、一つ以上のJH遺伝子セグメントを、23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントで置換する工程を含む、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域であり、場合により、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域が、少なくとも一つのVH遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖VH遺伝子クラスター、一つ以上の再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖DH領域、および一つの再構成されていないヒトJH遺伝子セグメントを含む再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子クラスターを含み、前記再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖DH領域が、23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントを含むように修飾される、項目67または68記載の方法。
(項目70)
前記修飾する工程が、
(i)機能的ヒトVH遺伝子セグメント、場合により、VH3-74~VH6-1に渡り、それらを含む、全ての前記機能的ヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、場合により、全ての前記機能的ヒトVH遺伝子セグメントが、生殖系列配置で位置する、
(ii)23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントで置換されるDH7-27を除き、再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、および
(iii)少なくとも、再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメント、および場合により、少なくとも再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントと、を含む前記免疫グロブリン重鎖可変領域を生じる、項目69に記載の方法。
(項目71)
23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントが、5’-23merのRSSに作動可能に結合された DH3-3遺伝子セグメントを含む、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記修飾する工程が、
(i)機能的ヒトVH遺伝子セグメント、場合により、VH3-74~VH6-1に渡り、それらを含む、全ての機能的ヒトVH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、場合により、全ての前記機能的ヒトVH遺伝子セグメントが、生殖系列配置で位置する、
(ii)再構成されていないDH2-2、DH2-8、およびDH2-15遺伝子セグメントを除き、再構成されていないヒトDH遺伝子セグメントの完全なレパートリー、その各々が、23merのRSSに作動可能に結合された少なくとも一つのDH遺伝子セグメントで置換される、および
(iii)再構成されていないヒトJH遺伝子セグメント、場合により、再構成されていないヒトJH1遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH2遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH3遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH4遺伝子セグメント、再構成されていないヒトJH5遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトJH6遺伝子セグメントの完全なレパートリー、を含む前記免疫グロブリン重鎖可変領域をもたらす、項目69に記載の方法。
(項目73)
23merのRSSに作動可能に結合された前記少なくとも一つのDH遺伝子セグメントが、3’23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-2遺伝子セグメント、3’23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-8遺伝子セグメント、または3’23merのRSSに作動可能に結合されたヒトDH2-15遺伝子セグメントを含み、場合により、前記再構成されていないDH2-2、DH2-8、およびDH2-15遺伝子セグメントが、それぞれ、3’末端の23merのRSSに作動可能に結合された前記ヒトDH2-2遺伝子セグメント、3’末端の23merのRSSに作動可能に結合された前記ヒトDH2-8遺伝子セグメント、および3’末端の23merのRSSに作動可能に結合された前記ヒトDH2-15遺伝子セグメントで置換される、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記免疫グロブリン重鎖可変領域が、
(a)一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子をさらに含み、場合により、前記一つ以上のげっ歯類Adam6遺伝子が、二つの再構成されていないVH遺伝子セグメントの間、場合により、再構成されていないヒトVH1-2遺伝子セグメントと再構成されていないヒトVH6-1遺伝子セグメントの間に位置する、および/または
(b)免疫グロブリン重鎖定常領域に作動可能に結合され、場合により、前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域、場合により、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内在性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域である、項目67~73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、項目65~74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
抗体を作製するか、またはそれをコードする核酸を得る方法であって、
げっ歯類を抗原で免疫する工程、前記げっ歯類が、各々、23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントを含む操作されたDH領域を含む生殖系列ゲノムを含み、場合により、前記げっ歯類が、項目58~64のいずれか一項に記載のげっ歯類である、
前記げっ歯類が、前記抗原に結合する抗体、またはそれをコードする核酸を含む前記抗原に対する免疫応答を生じさせる工程を含む、方法。
(項目77)
前記げっ歯類またはげっ歯類細胞から、前記抗体、またはそれをコードする核酸を回収することをさらに含む、項目76に記載の方法。
(項目78)
前記げっ歯類細胞が、B細胞またはハイブリドーマである、項目76に記載の方法。
(項目79)
各々、23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントが、5’23merのRSSに作動可能に結合されたDH遺伝子セグメントを含む、項目76~78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
各々、23merのRSSに作動可能に結合された一つ以上のDHセグメントが、3’23merのRSSに作動可能に結合されたDH遺伝子セグメントを含む、項目76~79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、項目76~80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
げっ歯類重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に結合された再構成重鎖VH(DHA-DHB)JHコード配列を含む、げっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座であって、場合により、前記再構成重鎖は、DHAおよびDHBの各々が、それぞれ、最大1個のヌクレオチド変異で、第1および第2の生殖系列DH遺伝子セグメントと40%の同一性を示すため、高度変異される、および/またはVH(DHA-DHB)JHコード配列と決定される、げっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
(項目83)
前記DHB遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列DH3-3遺伝子セグメントからもたらされる、項目82に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
(項目84)
前記DHA遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列DH2-2、DH2-8またはDH2-15遺伝子セグメントからもたらされる、項目82に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
(項目85)
前記再構成重鎖VH(DHA-DHB)JHコード配列が、20を超えるアミノ酸長のCDR3をコードする、項目82~84のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
(項目86)
前記JH遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列JH6遺伝子セグメントからもたらされる、項目82~85のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム、核酸または免疫グロブリン遺伝子座。
(項目87)
項目82~86のいずれか一項に記載のゲノム、核酸、または免疫グロブリン遺伝子座を含む、げっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目88)
前記げっ歯類が、ラットもしくはマウスであるか、または前記げっ歯類細胞が、ラット細胞もしくはマウス細胞である、項目87に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目89)
前記げっ歯類細胞が、げっ歯類B細胞である、項目87または88に記載のげっ歯類またはげっ歯類細胞。
(項目90)
骨髄腫細胞と融合された、項目89に記載のげっ歯類B細胞を含む、ハイブリドーマ。
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- 明細書に記載の発明。
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