JP2022078064A - 糖タンパク質ホルモン受容体変異 - Google Patents

糖タンパク質ホルモン受容体変異 Download PDF

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Abstract

【課題】1つ以上の変異を含み、同等の野生型又は断片に対して増大した熱安定性を有する、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。【解決手段】この1つ以上の変異は、好ましくは、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内、又はTSHRの残基22～260(TSHR260)内であるか、或いは、膜貫通ドメイン(TMD)内であってよい。本発明の変異体TSHR又はその断片は、好ましくは、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。本発明の変異体TSHR又はその断片は、所定の温度でのその半減期により決定される場合、同等の野生型TSHR又は断片よりも、より大きい熱安定性を有し、且つ活性を保持しつつ精製され得る。本発明の変異体TSHR又はその断片を利用する方法、キット及び使用も提供される。【選択図】図９

Description

（発明の分野）
本発明は、概して、糖タンパク質ホルモン受容体に関し、排他的ではないが特に甲状腺
刺激ホルモン(TSH)受容体(TSHR)に関する。本発明は、かかる受容体の、特にTSHRの調製
品の熱安定性を向上する、変異、特に単一点変異に関する。更に、本発明は、かかる調製
品の安定性をなお更に向上するために、一緒に組み合わせられた単一点変異に関する。本
発明はまた、自己免疫、特にTSHR自己免疫に関連した疾患を診断、経過観察及び予測する
ために、TSHR自己抗体(TRAb)などの自己抗体の存在を検出するための、TSHR調製品を含む
、熱安定性の糖タンパク質ホルモン受容体の調製品を使用する方法にも関する。
（背景）
（TSH受容体）
TSHRは、G-タンパク質共役受容体(GPCR)ファミリーの一員であり、且つ以下の3つのド
メインからなる：細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)、ヒンジ領域、及び細胞内C-
末端を伴う膜貫通ドメイン(TMD)(Nunez Miguel Rらの文献、(2004) Thyroid, 14: 991-10
11)。TSHR260は、残基22-260からなり、且つLRDのほとんどを包含している、TSHRのサブ
ドメインである(Sanders Jらの文献、(2007) Thyroid 17:395-410)。TSHR260は、完全長T
SHRと同様にTRAbへの結合を示す(Rees Smith Bらの文献、(2009) Hormone and Metabolic
Research, 41: 448-455、及びWO 2010/073012)。
甲状腺において、TSHRは、甲状腺濾胞上皮細胞の基底膜上に存在する。TSHのTSHRへの
結合は、G-タンパク質のTSHRへの結合に関与しているTSHRシグナル伝達カスケードの活性
化を開始し、その後サイクリックAMP経路の刺激、並びに甲状腺ホルモン(サイロキシン；
T4及びトリヨードサイロニン；T3)の合成が続く(Sanders Jらの文献、(1997) 「バリエレ
の臨床内分泌代謝(Balliere's Clinical Endocrinology and Metabolism)」、TF Davies
編集、11: 451-479；Balliere Tindall刊, London、及びLatif Rらの文献、(2009) Endoc
rinology and Metabolism Clinics of North America, 38: 319-341)。
（自己免疫甲状腺疾患）
自己免疫甲状腺疾患は、有病率が100,000名あたり600～1000名の最も一般的な自己免疫
状態の一つである(Jacobson DLらの文献、(1997) Clinical Immunology and Immunopatho
logy, 84: 223-243、及びCooper GSらの文献、(2009) Journal of Autoimmunity, 33: 19
7-207)。自己免疫システムにより標的化される主要な甲状腺自己抗原は、甲状腺ペルオキ
シダーゼ(TPO)、サイログロブリン(Tg)及びTSHRである。TPO自己抗体(TPOAb)及びサイロ
グロブリン自己抗体(TgAb)は、橋本甲状腺炎、グレーヴス病及び分娩後甲状腺炎(PPT)を
含む、様々な形のAITDの甲状腺自己免疫の血清学的マーカーである(Rees Smith Bらの文
献、(2007) Thyroid, 17: 923-938)。TRAbは、TSHR自己免疫の、特にグレーヴス病のマー
カーである。更にTRAbは、グレーヴス病の病理に関わっている。TRAbの2つの主要な型が
存在する：刺激型及び遮断型(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲、及びRees Smith Bら
の文献、(2009) 前掲)。
甲状腺刺激性自己抗体は、TSHRに結合し、TSHの作用を模倣し、これにより甲状腺を刺
激し、高レベルのT4及びT3を産生し；これらの自己抗体はまた、刺激活性又はTSH作動活
性を伴うTRAbとしても説明されている(Rees Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。甲状腺機
能のフィードバック制御メカニズムは、甲状腺刺激性自己抗体の存在下で、最早有効では
なく、且つ患者は、血清中の過剰な甲状腺ホルモン及びそれらの代謝の帰結により特徴付
けられる、活動が亢進した甲状腺の臨床症状を呈する。この状態は、グレーヴス病として
知られている。刺激活性を伴うTRAbはまた、眼窩後組織中のTSHRとも相互作用することが
でき、且つグレーヴス病の眼徴候の発達に寄与する(Seethalakshimi, I及びBahn Rの文献
、(2012) Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 26:281-289、並びにRees Smith B、S
anders J及びFurmaniak Jの文献、(2008) Biomarkers Med, 2: 567-576)。強力な甲状腺
刺激因子として作用するヒトモノクローナル自己抗体(hMAb TSHR1；M22とも称される)は
、EP 1565493B1において詳述されている。WO 2008/025991A1において説明されたように、
TSHR260に結合したM22 Fabの複合体の構造は、分解能2.55ÅでのX-線結晶解析により解明
されている。TSHR260-M22複合体の構造の解析は、互いの相互作用に関与した受容体と刺
激性自己抗体残基に関する詳細な情報を提供する。
強力な甲状腺刺激活性を伴う更なるヒトモノクローナル自己抗体(K1-18)は、WO 2010/0
73012に説明されている。
遮断型TRAbは、刺激性自己抗体よりも、AITD患者においてより少ない頻度で出現する。
遮断型自己抗体は、TSHRへ結合し、TSHが受容体へ結合することを防止するが、TSHR活性
を刺激する能力は有さない。結果的に、甲状腺ホルモン(T4及びT3)の形成及び分泌は、大
きく低下され、且つこの型のTRAbを伴う患者は、活動の低下した甲状腺の臨床症状(甲状
腺機能低下症)を呈する。遮断型自己抗体は、遮断活性又はTSH拮抗活性を伴うTRAbとして
知られている(Rees Smith Bらの文献、(1988) Endocrine Reviews, 9: 106-121、及びRee
s Smith Bらの文献、(2007) 前掲)。TSH拮抗活性を伴うTSHRに対するヒト自己抗体(5C9)
は、WO 2008/099185A1において詳細に説明されており、且つ強力なTSHR遮断活性を伴う更
なるヒトモノクローナル自己抗体(K1-70)は、WO 2010/073012において説明されている。T
SHR260との複合体中のK1-70 Fabの構造は、Sanders Pらの文献((2011) Journal of Molec
ular Endocrinology, 46: 81-99)に説明されたように、X-線結晶解析により解明されてい
る。TSHR260-K1-70構造は、分子レベルでTSHRとTSHR遮断性自己抗体の間の結合配置を示
している。TSHR260-M22とTSHR260-K1-70の構造の比較は、TSHRとの刺激性及び遮断性自己
抗体の相互作用における類似性及び差異に関する独自の洞察を提供する(Nunez Miguel R
らの文献、(2012) Journal of Molecular Endocrinology, 49: 137-151)。M22と強力な相
互作用を形成するがK1-70とは形成しない重要なアミノ酸残基として出現するTSHR-R255は
、様々なヒト及び動物TSHR抗体の刺激活性並びに患者血清中の刺激性抗体に関して報告さ
れたR255の重要性と一致する(Sanders Jらの文献、(2006) Thyroid, 16: 1195-1206、及
びWO 2006/016121)。
（TSHR抗体の検出方法）
刺激活性又は遮断活性を持つ患者TRAbは、互いに及びTSH結合部位と重なるTSHR LRD上
の領域に結合することは、当該技術分野において良く実証されている。しかし、様々な血
清中に存在する自己抗体と接触するTSHR残基には、微妙な差異が存在する(Rees Smith B
らの文献、(2007) 前掲)。ヒトモノクローナル自己抗体M22及びK1-70は、AITD患者におけ
るTRAbの代表であることも、実証されている(Sanders Jらの文献、(2007) 前掲、Rees Sm
ith Bらの文献、(2009) 前掲、Evans Mらの文献、(2010) Clinical Endocrinology, 73:
404-412、Nunez Miguelらの文献、(2012) 前掲)。TSH及びTRAbとのTSHR相互作用の原理は
、患者TSHR自己抗体を検出するために、様々なアッセイにおいて利用されている。
TRAbの測定は、グレーヴス病及び他の甲状腺障害の診断及び管理において重要である。
現在4種類のアッセイが、TRAbの測定に使用されている：
a) TSH受容体の調製品へのTSH又はヒトモノクローナルTRAbの結合を阻害する患者血清T
RAbの能力を測定する、競合結合アッセイ；
b) 培養物中のTSH受容体を発現している細胞を刺激するTRAbの能力を測定する、バイオ
アッセイ；
c) TRAbと標識されたTSH受容体調製品との免疫沈降；並びに
d) 二価TRAbが、1本のアームでELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合し、
且つ他方のアームで液相TSHR260-アルカリホスファターゼ融合タンパク質(TSHR260-AP)へ
結合し、架橋を形成する、架橋型アッセイ。
かかるアッセイを使用するTSH受容体自己抗体の測定は、下記の参考文献に説明されて
いる：
Sanders Jらの文献、(1997) 前掲、
Sanders Jらの文献、(1999) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84
: 3797-3802、
Rees Smith Bらの文献、(2004) Thyroid, 14: 830-835、
Rees Smith Bらの文献、 (2009) 前掲。
（TSHR安定性を向上する戦略）
本発明者らは、TSHR及びTSHR260などのタンパク質は、安定性が悪く、且つ精製時に変
性されることを理解している。従って、より熱安定したタンパク質、例えば、より熱安定
したTSHR260及び完全長TSHRは、以下を含む多くの適用を有するであろう：
a) 高度に精製されたTSHR260及び完全長TSHRの使用可能な(enabling)生成、
b) TRAbを検出するために改善されたアッセイの設計、
c) 抗体の安定化を伴わずに、高度に精製されたTSHR260の使用可能な結晶化、
d) 新規へ薬物スカフォールドを同定するための、リガンド-フリーTSHR260の結晶を、
断片ライブラリーへ入れ(soak into)、引き続きX-線結晶解析することによる、薬物の設
計、
e) TSHR260の外側の完全長TSHRの領域の増大した熱安定性を得るための戦略の設計。
天然のタンパク質は、それらの本来の環境において機能するのに十分に安定しているが
、産業用途に必要な条件の範囲下では最適には熱安定性でないことが多い。タンパク質操
作法、特に変異誘発は、可溶性タンパク質及び膜タンパク質の両方の熱安定性を向上する
ために、使用されている。変異誘発によりタンパク質の熱安定性を向上する先行する戦略
には、以下の2種のアプローチの一方が関与している：タンパク質に対する熱安定化作用
に関して、(i)少数の理論的に設計された変異を試験すること、又は(ii)無作為に又は体
系的にのいずれかで生成された多数の変異を試験すること(Dodevski I及びPluckthun Aの
文献、(2011) Journal of Molecular Biology, 408: 519-655；Serrano-Vega MJらの文献
、(2008) Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 105: 877-88
2)。
本発明は、最も熱安定性を向上する可能性のある変異を確定する本発明者らの研究(表1
)に従い、特にTSHRへ、及び特別にはTSHR260へ導入された変異を説明している：
・β-シートにおいて、アミノ酸残基の位置及び環境は、二次構造の決定に重要な極性
及び非極性残基の周期性を伴うβ-シートの形成及び安定性において、重要な役割を果た
す(Xiong Hらの文献、(1995) Proceedings of the National Academy of Sciences of th
e USA, 92: 6349-6353)。β-鎖の好ましい残基周期性は、「0＋0－0＋0」であり、ここで
「0」は、Ile又はThrなどの非極性残基であり、「+」は陽性残基、好ましくはArgであり
、並びに「-」は陰性残基、好ましくはAspである。
・ロイシンリッチドメイン(LRD)は、ロイシンリッチ反復(LRR)モチーフの一般的なコン
センサス配列LxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxxを有し、ここで「L」はLeu、Ile、Val又はPheで
あり、「N」はAsn、Thr、Ser又はCysであり、「o」は非極性であり、並びに「x」は非保
存残基である(Matsushima Nらの文献、(2010) BMC Microbiology, 10: 235-245)。残基は
、このモチーフに合わせるために、変異することができる。
・タンパク質を安定化又は脱安定化する傾向があるアミノ酸を、コンピュータによるか
、中等温度好性生物及び好熱性生物における相同タンパク質の配列の比較若しくはそれら
のプロテオームのアミノ酸組成の比較によるか、又は実験的に、変異体の熱力学特性の測
定によるかのいずれかにより確定する。異なる残基は、それらがタンパク質の表面又はコ
ア上のいずれにあるかによって(Yokota Kらの文献、(2006) Science and Technology of
Advanced Materials, 7: 255-262)、又は二次構造要素におけるそれらの位置によって(Xi
ong H, らの文献、(1995) 前掲；Vogt Gらの文献、(1997) Journal of Molecular Biolog
y, 269: 631-643；Minor DL及びKim PSの文献、(1994) Nature 367: 660-663、並びにMin
or DL及びKim PSの文献、(1994) Nature, 371: 264)、異なる安定化作用を有する。安定
化残基は、表面上のGlu、Lys、Arg及びTyr残基、並びにコア内のAlaを含み；他方で、Gln
、Met、Cys及びSer及びAsnは、脱安定化する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの
文献、(2000) Journal of Biological Chemistry, 275: 32383-32386；Kim CA及びBerg J
Mの文献、(1993) Nature, 362:267-270；Kumar Sらの文献、(2000) Journal of Biomolec
ular Structure & Dynamics, 17 Suppl 1: 79-85；Minor D及びKim PSの文献、1994a+b
前掲；Montanucci Lらの文献、(2008) Bioinformatics, 24: i190-i195；Pack SP及びYoo
YJの文献、(2004) Journal of Biotechnology, 111: 269-277；Smith CKらの文献、(199
4) Biochemistry 33: 5510-5517；Szilagy A及びZavodsky Pの文献(2000) Structure, 8:
493-504；Vogt Gらの文献、(1997) 前掲；Yokota Kらの文献、(2006) 前掲)。
・好熱性生物は、中等温度好性生物よりも、より多い帯電された残基、及びより少ない
極性非帯電残基を有する傾向がある(Cambillau C及びClaverie J-Mの文献、(2000) 前掲)
。イオン対の数及び配置は、タンパク質の熱安定性の向上において大きな役割を果たす(V
etriani CDLらの文献、(1998) Proceedings of the National Academy of Sciences of U
SA, 95: 12300-12305；Kumar Sらの文献、(2000) 前掲；Montanucciらの文献、(2008) 前
掲；Szilagy A及びZavodsky Pの文献、(2000) 前掲)。これは恐らく、好熱性タンパク質
における高頻度のGlu及びLysを説明している。
・異なる生物のタンパク質相同体のコンセンサス配列への残基の変異は、可能性のある
熱安定化変異を確定するために、使用することができる。これを使用し、5℃～36℃の見
かけの融解温度(Tm)の上昇を伴う、免疫グロブリンドメイン、GroELミニシャペロン、p53
及びフィターゼを含む、広範なタンパク質のより熱安定性変異体を作出することができる
(Lehmann M及びWyss Mの文献、(2001) Current Opinion in Biotechnology, 12: 371-375
において検証)。
・好適な骨格ねじれ角を持つ残基は、タンパク質の剛性、従って安定性を向上するため
にProへ、又は左巻きらせん形構造の残基の拘束されたねじれ角を減少するためにGlyへの
いずれかに変異することができる(Vielle C及びZiekus GJの文献、(2001) Microbiology
and Molecular Biology Reviews, 65:1-43)。
・コンピュータモデリングを、タンパク質の熱安定性に対する変異の作用を予測するた
めに使用することができるが、得られた結果は定まらない。
特に本発明に記載されたTSHR260などの、TSHR及びその断片の熱安定性を向上するため
の新規戦略は、熱安定性アッセイと組合せた、残基毎に理論的アプローチ(先に列挙した)
の組合せにより決定された別のアミノ酸に変異された、ポリペプチドTSHR260(アミノ酸残
基M22-L260)の理論的-系統的変異誘発(rational-scanning mutagenesis)を使用した。記
載された新規戦略は、4つの工程に関与している：(i) 変異体を得るための、PCRによる部
位特異的変異誘発、(ii) CHO-K1細胞の一過性トランスフェクションによる、TSHR260変異
体の発現、(iii) タンパク質の発現及び熱安定性の評価、(iv) 工程(iii)において確定さ
れた最も安定した変異体の熱安定性曲線の分析。
最も熱安定している単一変異を組合せ、更にもっとTSHR260の熱安定性を増大する、TSH
R260の二重、三重、四重、五重及び六重変異体を作製した。
TSHR260の熱安定性を増大する単一変異及び組合せ変異は、更に完全長TSHRの熱安定性
を増大することもわかった。
同様に、熱安定化する変異は、TSHRの膜貫通ドメイン(TMD)において確定された。最も
安定した六重TSHR260変異体由来の6つの変異は、熱安定化するTMD変異と組合せて、完全
長TSHRとして発現された。これらの完全長TSHR変異体の熱安定性は、熱安定性曲線の分析
を使用し試験し、且つTMDの最も熱安定化する変異を組合せ、完全長TSHRの熱安定性を更
に増大した。
向上した熱安定性を伴う完全長TSHR変異体及びその断片は、患者血清中のTSHR自己抗体
を検出するアッセイにおいて使用することができ、且つ活性型で精製することができる。
（関連した先行する特許出願）
EP 1565493B1に記載された発明は、強力な刺激活性及びTSHRとのその相互作用を伴うヒ
トモノクローナル自己抗体(M22又はhMAb TSHR1)の特性に関する詳細を提供する。M22 Fab
とTSHR LRDの間の相互作用は、WO 2008/025991A1に記載されたように、これら2つの分子
間の複合体のX線回折分析(分解能2.55Å)から分子レベルで解析される。
WO 2006/016121A1は、スクリーニングされる患者からの体液試料中の患者血清刺激型TS
HR自己抗体、患者血清遮断型TSHR自己抗体及びTSHの、差別的スクリーニング及び確定に
おいて使用することができる、少なくとも1つの点変異を含む、変異されたTSHR調製品を
開示している。
TSHR遮断活性を伴うマウスMAb(9D33)の作製及び特徴決定は、WO 2004/050708A2に記載
されている。9D33は、TSHRへ、高い親和性(2×1010L/mol)で結合し、且つ刺激活性又は遮
断活性を伴う、TSH、hMAb TSHR1(M22)及び患者血清TRAbの効果的拮抗物質である。
WO 2008/099185A1は、患者血清中のTSH及び刺激性TRAbの効果的拮抗物質である、TSHR
に対するヒトMAb(5C9)の単離及び特徴決定を開示している。5C9は、TSHR構成的活性を阻
害することが予想外にわかり、これは甲状腺刺激ホルモン又はM22の非存在下で試験シス
テムにおいてTSHRによりサイクリックAMPを生成すると言われている。更に、5C9は、TSHR
活性化変異に関連した、TSHR基本活性(すなわち、TSHの非存在下での活性)の増加を阻害
することがわかった。
WO 2010/073012は、患者の末梢血リンパ球からの、強力な刺激活性を伴う更なるヒトモ
ノクローナル自己抗体(K1-18)、及び強力なTSHR拮抗物質であるヒトモノクローナル自己
抗体(K1-70)の単離及び特徴決定を開示している。K1-18及びK1-70は、患者の血清中に認
められる、各々刺激活性及び遮断活性を伴うTRAbの特徴を有する。この発明は、反対の活
性(刺激及び遮断)を伴うTRAbが、単独の患者の血清中に同時に存在することができること
の最初の証拠を提供する。更にWO 2010/073012に記載された発明は、二価抗体が、1本の
アームでELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合し、且つ他方のアームで液相T
SHR260-アルカリホスファターゼへ結合し、架橋を形成する、架橋原理を基にTRAbを測定
する、新規アッセイを説明している。
（発明の概要）
本発明は、排他的ではなく全般的にTSHRに関し、且つ排他的ではないが特に残基22-260
の間のTSHR配列(TSHR260)に関する(図3及び4；配列番号:3及び4)。本発明の更なる態様は
、残基毎に理論的アプローチの組合せにより決定された別のアミノ酸に変異される、特に
新規の理論的-系統的変異誘発アプローチを使用し、アミノ酸変異を設計するための、特
にTSHR260におけるアミノ酸変異に関する。更に本発明は、数多くの変異体を作製し且つ
試験するためのハイスループット法に関する。本発明の一態様は、排他的ではないが特に
、野生型TSHR260(TSHR260-WT)に対するより大きい熱安定性により特徴付けられた単一ア
ミノ酸変異を含むTSHR260を作製することに関する。
別の本発明の態様は、二重変異を含むTSHR260を作出するための、2つの単一アミノ酸変
異の組合せの設計、作製及び試験に関する。本発明の一態様は、排他的ではないが特に、
単一変異を含むTSHR260及びTSHR260-WTに対するより大きい熱安定性により特徴付けられ
る、二重変異を含むTSHR260に関する。
本発明の別の態様は、排他的ではないが特に、単一アミノ酸変異の三重、四重、五重及
び六重の組合せを含むTSHR260の設計、作製及び試験に関する。本発明のこれらの態様は
、排他的ではないが特に、より少ない数の変異を含むTSHR260及びTSHR260-WTに対する増
大した熱安定性により特徴付けられる、変異されたTSHR260の作製に関する。
一態様において、本発明は、まだ未発見のTSHR配列において安定化変異を確定するのに
成功するアプローチが、理論的アプローチ又はコンピュータによるモデリングにより選択
された少数の残基のみを有することを説明する。
一態様において、本発明は、TSHR260の重要な生物活性に関する。この生物活性は、TSH
R自己抗体、特にTSHR刺激性ヒトモノクローナル自己抗体M22へ結合する能力に関する。本
発明は、TSHR260のM22へ結合する能力を介して測定されたTSHR260の熱安定性を増大する
、特異的且つ新規の単一、二重、三重、四重、五重及び六重の変異を説明する。これらの
本発明の態様は、増大した熱安定性を有し且つM22及び他のTSHR自己抗体に結合する能力
を保持する、新規の変異されたTSHR260調製品に関する。
本発明の別の態様において、TSHR260の熱安定性を増大した新規の単一及び組合せ変異
は、驚くべきことに、完全長TSHR(図1及び2；配列番号:1及び2)の熱安定性も増大するこ
とがわかった。完全長TSHRの中の変異は、TSHRの熱安定性は増大するが、その生物活性(
すなわち、TSHRを刺激するリガンドの能力)又はそのTRAbに結合する能力には影響を及ぼ
さなかった。
本発明の更なる態様は、TSHR自己抗体を検出する改善された方法の設計及び開発に関す
る。本発明の一態様において、排他的ではないが特に、水溶液において安定なTSHR260調
製品が、アッセイキットフォーマットにおいて、体液中に存在するTSHR自己抗体に結合す
るために利用される。本発明の別の態様において、安定化変異を含む完全長TSHRの安定し
た調製品が、アッセイキットフォーマットにおいて体液中に存在するTSHR自己抗体に結合
するために利用される。更なる態様において、安定した完全長TSHRは、TSH又はTSHR刺激
性抗体への結合に反応するTSHR生体活性を検出する改善された手段を提供する。この生体
活性は、安定したTSHRを発現している細胞株におけるサイクリックAMP生成を刺激するこ
とができるが、これに限定されない。
TSHRの安定した調製品の更なる適用は、AITD患者の体液中に存在するTSHR自己抗体を中
和する新たな機会に関する。これらの適用は、インビトロ又はインビボにおいて、体液を
、例えば、安定したTSHR260調製品と、例として安定した完全長TSHR調製品と接触させる
ことであるが、これらに限定されるものではない。加えて、TSHR260よりもより少ないア
ミノ酸を含むTSHR調製品は、TSHR260と完全長TSHRの中間の配列を含むTSHR調製品と同じ
変異により、安定化され得る。ヒトTSHRの調製品が通常好ましいが、他の種のTSHR調製品
は、同じ方式で安定化され得る。本発明のなお更なる態様は、他の類似のタンパク質の、
特に他の糖タンパク質ホルモン受容体(FSHR及びLHR(図11；それぞれ、配列番号:57及び58
)の安定性を向上する新規機会を開く。
（発明の説明）
本発明の一態様に従い、1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR
)又はその断片が提供され、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断片に対して
増大した熱安定性を有する。この変異は、好ましくは点変異である。以下において、使用
される用語「変異体」は、完全長TSHR及び任意のその断片、例えば断片TSHR260(図3及び4
；配列番号:3及び4)の両方を指す。熱安定性が更に以下において、考察され、且つ定義さ
れる。
好適には、TSHR断片は、抗原断片であるものであり、特にTSHR自己抗体に、特にTSHR刺
激性ヒトモノクローナル自己抗体M22に、結合する能力を保持するものである。好適な断
片は、TSHR260、並びにより小さい長さの配列及びTSHR260と完全長TSHRの間の中間の長さ
のものを含む。TSHR418(残基22～418)は、このような断片の別の例である。
本発明の一態様において、変異体TSHR又はその断片は、完全長TSHRであるか、又は完全
長TSHRと比べ変異体中に存在するアミノ酸の数により測定された場合、完全長TSHRの長さ
の少なくとも70％以上、少なくとも80％以上、若しくは少なくとも90％以上を含む。
好ましくは、1つ以上の変異は、TSHR又はその断片の細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイ
ン(LRD)内にある。より好ましくは、1つ以上の変異は、TSHR又はその断片の残基22～260(
TSHR260)内にある。
好ましい態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、哺乳動物種に由来し、特
にその一つは、ヒトTSHR(配列番号:1及び2)由来であるか、又はこれから誘導される。し
かし、任意の他の好適な種が使用されてよく、且つ他のそのような種は、サル、ブタ、ウ
シ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又はウマのTSHR(各々、配列番号:47-56)を含む
。
好ましくは、本発明の変異体TSHR又はその断片は、TSHR自己抗体、特にTSHR自己抗体M2
2、K1-70又はK1-18に結合する。
一態様において、本発明は、変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性(
本明細書において更に規定する)が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも1.5倍以上
大きい、変異体TSHR又はその断片を提供する。好ましくは、変異体の42℃での半減期によ
り決定される熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、1.7、又は2、又は
3、又は3.5、又は5倍以上大きい。上記の形態は、排他的ではないが特に、ただ一つの単
一点変異を含む変異体に適用する。
変異体TSHR又はその断片(TSHR260など)の半減期は、同等の野生型TSHR又はその断片の
半減期と比べ、試験温度で、TSHRに対する抗体又は自己抗体に結合する能力を保持する変
異体TSHR又はその断片(又は同等の野生型タンパク質)の量を決定する結合アッセイにおい
て、好適に測定される。
本発明の変異体TSHR又はその断片は、任意の数の単一点変異を含むことができるが、本
発明者らは、1～6つの単一点変異を使用することを選んだ。本発明の好ましい態様におい
て、変異体は、以下の変異のいずれか一つから選択された、1、2、3、4、5又は6つの点変
異を含む：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F
、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(図5及び6；それぞれ、配列番号:11-25
、27-43、45及び46)。しかし望ましいならば、上記のものとは異なる点変異を選択するこ
とができ、且つ本発明の一態様は、決定されるべき任意の特定の点変異、又は点変異の組
合せの熱安定性を使用可能にする結合アッセイの提供であることは、理解されるであろう
。本発明の一態様において、変異体は、ただ一つの単一点変異を含む。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、二重点変異(すなわち、2つの
単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる二重点変異体の42℃での半減期により決定
される熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、3.5、又は5、又は7、又
は9倍以上大きい。或いは、かかる二重点変異体の50℃でのその半減期により決定される
熱安定性は、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも、3、又は5、又は6、又は8、又は
10倍以上大きい。
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、三重点変異(すなわち、3つ
の単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる三重点変異の50℃での半減期により決定
される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体(配列番号:45)の半減期よりも
、9、又は12、又は15倍以上大きい。より熱安定性の変異(3つ以上の単一点変異を含むこ
とが多い)と野生型TSHR260(これについては比較的高い温度での半減期の意味のある測定
が難しい)の間で比較可能とするために、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体を、野生
型TSHR260(TSHR260-WT)と比較することができる。TSHR260-I253Rは、42℃での熱安定性を
TSHR260-WTよりも3.0±0.4倍向上し、すなわちTSHR260の42℃での半減期を53±6分間だけ
増加した(例えば、表3及び表7のデータ参照)。これはまた、50℃での熱安定性を、TSHR26
0-WTよりも2.85±0.13倍向上した。
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、四重点変異(すなわち4つの
単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる四重点変異体の50℃での半減期により決定
される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、20、又は30、
又は50倍以上大きい。或いは、かかる四重点変異体の55℃でのその半減期により決定され
る熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、12、又は20、又は
30倍以上大きい。
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、五重点変異(すなわち5つの
単一点変異のみ)を含む。好ましくは、かかる五重点変異体の55℃での半減期により決定
される熱安定性は、単一点変異I253Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、40、又は70、
又は100倍以上大きい。
更なる態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、六重点変異を含む。好まし
くは、かかる六重点変異体の55℃での半減期により決定される熱安定性は、単一点変異I2
53Rを含むTSHR260変異体の半減期よりも、500、又は750、又は900倍以上大きい。或いは
、かかる六重点変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性は、四重点変異I2
53R＋D143P＋R112P＋D151Eを含むTSHR260変異体(本明細書ではJMG45と称され(各々、配列
番号:45、36、34、37)、これは、TSHR260-WTのそれの174倍の60℃での予測される熱安定
性を有する)の半減期よりも、3倍以上大きいか、又は55℃で四重点変異I253R＋D143P＋R1
12P＋D151Eを含むTSHR260変異体の半減期よりも、1.2倍以上大きい。完全長TSHR変異体が
、本発明の任意の態様において、望ましいならば使用される。ヒト、マウス又はブタの完
全長TSHR変異体が、特に好ましく、且つ良好な熱安定性を有することが示されている。更
なる態様において、本発明の変異体TSHRは、完全長TSHR変異体であり、ここでこの変異体
の50℃でのその半減期により決定される熱安定性は、同等の野生型完全長TSHRの半減期よ
りも、3、又は5倍以上大きい。
好ましい態様において、完全長TSHR変異体は、TSHRの残基22～260(TSHR260)内に、3つ
以上の点変異を含む。
本発明の特に好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブド
メインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる。この文脈において本質的になる
とは、好適にはTSHR260と少なくとも80％の配列同一性が、好ましくは90％の配列同一性
が、より好ましくは95％の配列同一性が存在することを意味する。
一態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、好ましくは以下のいずれかの単
一点変異を含む：P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T
、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y。当業者に理解されるように、
「P28E」とは、TSHRの配列位置28でのアミノ酸プロリン(P)がグルタミン酸(E)への変異、
などを意味する。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、2つの点変異を含み、その一
つはI253R(配列番号:45)であり、その二番目は、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P
、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、又はR255Yである
。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、3つの点変異を含み、その一
つはI253R(配列番号:45)であり、その二番目はD143P(配列番号:36)であり、その三番目は
P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W
のひとつである。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、4つの点変異を含み、その一
つはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、並びにその三番目はR112P(配列番号:34)で
あり、並びにその四番目は、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170Wのひとつである
。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、5つの点変異を含み、その一
つはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、その三番目はR112Pであり、その四番目はD
151E(配列番号:37)又はH63C(配列番号:32)であり、並びにその五番目は、L59F、(H63C又
はD151E)、S166T及びV169R(それぞれ、配列番号:30、32、37、38及び41)のひとつである
。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、6つの変異を含み、そのひと
つはI253Rであり、その二番目はD143Pであり、その三番目はR112Pであり、その四番目はD
151Eであり、その五番目はH63Cであり、並びにその六番目は、S166T又はV169Rのいずれか
である。
別の態様において、本発明の変異体TSHR又はその断片は、P28E、L59F、T62V、H63C、L6
4Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R
及びR255Yのいずれかから選択された1、2、3、4、5又は6つの点変異を含むことができる
。
一つの好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR260からなり、且つ同
等の野生型は、野生型TSHR260からなる。
本発明の変異体の特に好ましい特徴は、モノクローナルTSHR抗体、特に自己抗体の、該
変異体への結合が、同じモノクローナルTSHR抗体又は自己抗体の同等の野生型TSHR又は断
片への結合と比べた場合に、影響されない、又は実質的に影響されないことである。
本発明はまた、医薬品における使用のための本発明の変異体TSHR又はその断片を提供す
る。本発明の変異体の数多くの医学的及び治療上の使用が、存在する。例えば、本発明は
、TSHRモノクローナル自己抗体及び患者TRAbの検出における使用のための、本発明の変異
体TSHR又はその断片を提供する。同じく、循環患者TRAbを吸収するために治療的有効量で
使用するための、本発明の変異体TSHR又はその断片を提供する。
本発明はまた、小型分子薬物のための新規スカフォールドを同定するために小型-分子
断片スクリーニングするための、本発明の変異体TSHR又はその断片の使用も提供する。
本発明はまた、対象におけるTSH受容体への免疫応答に関連した自己免疫疾患を治療す
るインビトロ方法も提供し、この方法は、対象の血液の試料を、本発明の変異体TSHR又は
その断片がそれに結合している固相カラムを通過させること、及び該血液中の循環TRAbを
、該変異体TSHR又はその断片上に吸収させることを含む。
本発明はまた、変異体が検出可能な標識を含む、本発明の変異体TSHR又はその断片を提
供する。この標識は、例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素
からなる群から選択され得る。かかる標識は、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融
合(以下に更に説明)を介して又は化学標識によるなど、任意の好適な様式により追加され
得る。当業者は、必要な関連技術、及び好適な標識の独自性を熟知しているであろう。
好ましい態様において、この標識は、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標
識を含む。最も好ましくは、アルカリホスファターゼ標識が利用される。
好ましい態様において、標識された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260から
なるか、又はこれから本質的になる。特定の好ましい変異体は、TSHR受容体のサブドメイ
ンTSHR260とアルカリホスファターゼ(AP)標識からなるものであり、本明細書においてTSH
R260-AP-Xと称され、ここで「X」は、変異体中の1以上のアミノ酸変異を指す。
標識された変異体又はその断片は、本明細書記載のアミノ酸点変異の1以上を含み得る
。当業者に理解されるように、変異は、標識の前又は後のいずれかで、野生型TSHR又はそ
の断片へ導入することができる。
本発明はまた、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモ
ン受容体(TSHR)又はその断片も提供し、ここで該変異体TSHRは、同等の野生型TSHR又は断
片に対して増大した熱安定性を有する。
好ましくは、変異体TSHR又はその断片は、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べ
た該変異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくと
も70％以上、又は少なくとも80％以上、又は少なくとも90％以上含む。
好ましい態様において、1以上のTMD変異を伴う変異体TSHR又は断片は、膜貫通ドメイン
内ではない、1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以上の追加的変異は、本明細書記
載の本発明に従う。この1つ以上の追加的変異は、例えば、本明細書記載の本発明の態様
に従い、TSHR260サブドメイン内であってよい。好ましくは、この追加的変異は、膜貫通
ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含む。好ましくは、かかる変異
はTSHR260サブドメイン内にある。
一態様において、該追加的変異は、六重点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I2
53R (TSHR-JMG55)(それぞれ、配列番号:32、34、36、37、41及び45)を含む。
好ましくは、本発明は、膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメインで
はない該追加的変異のみを含む同等の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断
片に対して、増大した熱安定性を提供する、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又は
その断片を提供する。従ってここで「同等な」変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)は
、話題の変異体と同一であり、結果的に膜貫通ドメイン内の追加的変異のいずれかを欠く
以外は同じ変異を含む。類似の文脈で本明細書を通じて使用される用語「同等な」とは、
変更すべき所は変更して、同じ意味を有する。
一態様において、本発明は、変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が
、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも
、1.2倍以上大きい、又は1.3倍以上大きい、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含
む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。
別の態様において、本発明は、変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性
が、六重変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)を含むTSHR変異体
の半減期よりも、1.2倍以上大きい、又は1.3倍以上大きい、膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ
以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片を提供する。
好ましくは、前記態様において、この変異体の33℃でのその半減期により決定される熱
安定性は、2倍以上大きいか、又は3倍以上大きいか、又は5倍以上大きい。
熱安定性は、一般に以下に規定されるが、例えば、図14b、c及びdにそれぞれ示した安
定性アッセイA、B、又はCにより測定されてよい。
好ましくは、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、膜貫通
ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定性アッセイCにより測
定された該変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性は、膜貫通ドメイン(T
MD)内にT477I(配列番号:97)、V595I(配列番号:100)又はI648L(配列番号:103)から選択さ
れた単一点変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.1倍以上大きい。
別の好ましい態様において、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその
断片は、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞれ示
された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された該変異体の55℃でのその半
減期により決定される熱安定性は、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I、V595I又はI648Lから
選択された単一点変異のみを含む同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい
。
好ましくは、本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、TMD内
の該2つの点変異の少なくとも一つが、T477I、V595I、及びI648Lから選択される。
好ましくは、膜貫通ドメイン(TMD)内に変異を有する本発明の変異体TSHR又はその断片
は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L
、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678A(それぞれ、配列番
号:89-108)のいずれかから選択される単一点変異を含む。これらの変異の2つ以上はまた
、組合せられてもよい。
好ましくは、膜貫通ドメイン(TMD)内に変異を有する本発明の変異体TSHR又はその断片
は、2つの点変異を含み、その一つはT477I又はV595I又はI648Lであり、並びにその二番目
は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L
、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L、Y678Aから選択される異
なる変異である。
別の態様において、本発明はまた、1つ以上の変異を含む変異体甲状腺刺激ホルモン受
容体(TSHR)又はその断片を精製する方法であって、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型
TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が：
i)変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工程
；
ii)精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む方法を、提供する。
この組成物は、精製されるべき変異体タンパク質を含む任意の適した組成物又は配合物
であってよい。例えばこれは、水溶液を含んでよい。これは培養物上清－例えば、変異体
タンパク質を生成するために使用された細胞培養物由来の上清を含んでよい。
精製されるべき変異体TSHR又はその断片は、例えば、本明細書記載の本発明の変異体TS
HR又はその断片のタンパク質のいずれか一つであってよい。好ましくは、変異体は、TSHR
受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、且つ好ましくは
下記の変異のセットのひとつも含み得る：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)。
好ましくは、このカラムクロマトグラフィーは、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマ
トグラフィーなどの、イオン交換クロマトグラフィーを含む。標準のクロマトグラフィー
装置及びプロセスを、使用することができ、且つこのようなものは、当業者には明らかで
あろう。驚くべきことに、本発明者らは、本発明の及び本明細書記載の変異体タンパク質
は、それらの野生型同等物とは異なり、実際に、それらの増大した熱安定性のために、前
記方法で精製され得ることを発見した。このことは、本発明の態様を形成する。
好ましくは、本発明の精製方法は更に、工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又は
その断片を含む組成物を、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する工程を含む。
任意の好適なアフィニティクロマトグラフィーを使用してよいが、好ましい態様において
、アフィニティクロマトグラフィーは、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び／又は
金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む。一方又は両方を使用してよい。
特に好ましい態様において、前記の本発明の精製方法は：
i)該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーにより精製する工程；
ii)該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製す
る工程；
iii)任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーに
より更に精製する工程；
iv)精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む。
好ましくは、工程(ii)の抗体は、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合す
る抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。任意の好適な抗体を使用することができ
る。14C4は、一つの好ましいマウスモノクローナル抗体である。
好ましい態様において、前記工程(iii)は、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィー
の使用を含むが、他の好適な金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムを使用し
てもよい。
別の好ましい態様において、本発明の精製方法は、アフィニティクロマトグラフィーが
、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり、且つ同じく任意にpH5.0±0.2での溶出緩
衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2での溶出緩衝液による溶出を含む。
好ましくは、本発明の精製方法において、変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR26
0からなるか、又はこれから本質的になる。好ましくは、該変異体は、下記の変異のセッ
トを含む：
H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R。
本発明の更なる態様において、変異体TSHR又はその断片の精製は、該変異体又はその断
片に結合された抗体、又は該変異体又はその断片との複合体中の抗体を必要とはしない。
本発明は、機能性の活性タンパク質が、それに結合又は複合された抗体による精製時に、
変異体又はその断片を安定化させる必要がなく、精製を介して生成され得るよう、安定性
が増大した変異体を提供する。
本発明の一態様において、排他的ではないが特に、水溶液中で安定しているTSHR260調
製品、特にTSHR260-JMG55調製品が、TSHR260結合ELISAにおいて高い活性を伴う調製品を
得るために精製される(図12aに示した)。
本発明の変異体TSHRタンパク質の増大した熱安定性は、例えば、本明細書記載の精製方
法による、それらの精製を可能にする。かかる活性タンパク質の精製は、これまでは実現
できなかった。従って本発明は、これまで実現不可能な純度及び活性レベルで、TSHR260
タンパク質を含む、TSHRタンパク質を、提供する。これらは新規生成物である。本明細書
において使用される「精製された」変異体TSHR又はその断片は、少なくとも1つの精製工
程に供されている変異体TSHR又はその断片をいうことが意図されている。1又は複数の精
製工程は、タンパク質を精製するための任意の好適な精製であってよく、且つこのような
ものは、当業者には明らかであろう。例えば、本明細書に記載及び請求された精製工程を
使用することができるが、他の好適な精製が排除されるものではなく、望ましいならば使
用することができる。
本発明の別の態様に従い、本明細書記載の本発明の精製方法により得られた、本明細書
記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片が提供される。変異体TSHR又はその断
片はまた、本発明の精製方法により入手可能である。他の精製方法を使用し、本発明者ら
の精製された変異体を生成することは、可能である。
従って関連する態様において、本発明はまた、TSHR活性アッセイにおいて該精製された
変異体の活性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定した培養物上清由来の未精製の変異
体の活性よりも大きいことを特徴とする、本明細書記載の本発明の精製された変異体TSHR
又はその断片も提供する。この上清は、該変異体タンパク質の発現及び分泌に使用された
好適な細胞培養物(例えば本明細書記載のような)由来であることが好ましいであろう。TS
HR活性アッセイは、同じ条件を使用する正確に同じアッセイ(すなわち、同一アッセイ)が
、未精製及び精製の両方の試料について使用されるならば、試験される変異体の活性の測
定をもたらすことが可能である、いずれか好適なアッセイであってよい。当業者には明ら
かであるように、数多くの好適なアッセイの例が、本明細書においてもたらされる。特に
適したアッセイは、図12a、12d、及び13cに示されたものである。
TSHR活性アッセイにおける活性は、例えば試料容積あたりの活性の量－例えば単位/ml
など、いずれか好適な様式で、表現することができる。好適には、この活性は、タンパク
質量あたりの活性単位－例えば単位/mgとして測定される変異体の比活性である。
好ましい態様において、本発明は、TSHR活性アッセイにおける該精製された変異体の活
性が、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性
と比べ、500倍以上大きいことを特徴とする、本明細書記載の本発明の精製された変異体T
SHR又はその断片を提供する。この活性は、同じTSHR活性アッセイにおいて測定された培
養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、実際により高くてよく、例えばこの活性は
、1000倍以上大きい、又は5000倍以上大きくてよい。好ましくは、この活性は、単位/mg
タンパク質の比活性として表現又は測定される。
好ましくは、未精製の変異体の活性は、上清の何らかの希釈又は濃縮を伴わずに、培養
物から直接収集された培養物上清から測定されるが、望ましいならば－希釈又は濃縮が、
単位/mgタンパク質の比活性に換算して表現される場合に測定された活性に影響を及ぼさ
ないのであれば、これを行うことができることは、理解されるであろう。
好ましくは、TSHR活性アッセイは、該変異体が、TSHR抗体又は自己抗体に結合する能力
を測定する。いずれか好適な抗体又は自己抗体を使用することができ、且つ好適なTSHR自
己抗体は、M22、K1-70又はK1-18を含む(本明細書記載のような)。
好ましくは、TSHR活性アッセイは、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験さ
れるべき変異体を含む。好ましくは、試験されるべき変異体は、ELISAプレート上に間接
的に結合又はコーティングされる。例えば、これは、TSHRに結合するが、TSHRそれ自身の
通常の結合は妨害しない抗体を使用し、実現され得る。好ましくは、この抗体は、TSHR細
胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合する、モノクローナル抗体である。いずれか
好適な抗体を使用してよい。14C4は、一つの好ましいマウスモノクローナル抗体であるが
、理解されるように、他のものを使用してよい。
好ましい態様において、TSHR活性アッセイは、図12a又は図13cに示されたアッセイを含
む。その活性が試験されるべき変異体がELISAプレートに直接結合されることが可能であ
る場合には、図12dに示された型のアッセイが使用されてよい。好ましくは、本発明の精
製された変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又
はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつを含む：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)。
特に好ましい態様において、本発明は、変異体が、以下の変異のセットを含む、本明細
書記載の本発明の精製された変異体TSHR又はその断片を、提供する：H63C＋R112P＋D143P
＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37
、41及び45)。
本発明の精製された変異体TSHR又はその断片は、本明細書記載の検出可能な標識も含ん
でよい。
同じく、変異体又はその断片が、脱グリコシル化され、且つ例えばTSHR活性アッセイに
おいて測定されるような活性を保持している、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激
ホルモン受容体(TSHR)又はその断片も提供される。かかるアッセイの例は、本明細書にお
いて、且つ同じく精製された変異体の活性に関して上記に説明されている。いずれか好適
なTSHR活性アッセイが、使用されてよい。例えば、図12a又は図13cに示されたアッセイは
、活性を測定するために使用されてよい。この活性は、脱グリコシル化されない変異体又
はその断片の活性の、少なくとも70％以上、少なくとも80％以上、又は少なくとも90％以
上であることが好ましい。一部の場合において、この活性は、ほとんど減少されないか、
又は脱グリコシルされない変異体又はその断片の活性と同じ、若しくは本質的に同じであ
ることができる。
原則として、脱グリコシル化は、本明細書に記載及び請求された変異体甲状腺刺激ホル
モン受容体(TSHR)又はその断片のいずれかひとつに適用されることができるが、本発明者
らは、この変異体が少なくとも二重点変異を含むことを好む。特定のレベルの安定性が必
要とされ、且つ本明細書記載の種類の試験は、各場合において脱グリコシル化後に、変異
体タンパク質の活性を決定することができるであろう。本発明者らは、十分な活性を保持
しつつ、脱グリコシル化されることが可能である、少なくともひとつの二重点変異、又は
一部の場合においては少なくともひとつの三重点変異を有する変異体を予測する。理解さ
れるように、脱グリコシル化は、糖残基をタンパク質から除去し、より容易に結晶化でき
るようにする。いずれか好適な脱グリコシル化プロセスを使用することができ、且つ好適
な技術の一つは、以下に詳述されている。
本発明の脱グリコシル化された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなる
か、又はこれから本質的になり、且つ下記の変異のセットのひとつを含み：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：
しかし前述のように、脱グリコシル化は、原則として本明細書に記載及び請求された変異
体のいずれか一つに適用され得る。
本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片と、被検
自己抗体の試料を接触させることを含む、TSHRに対する被検自己抗体を検出するための、
診断方法を含む方法も、提供される。TSHR260変異体、特にアルカリホスファターゼで標
識されたものの使用は、特に好ましい。点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253
R (JMG55)を含むTSHR260は、特に好ましい。
被検抗体は、いずれか好適な給源から由来することができる。好ましくは、被検自己抗
体の試料は、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離される。試料は、ヒト
を含む任意の種－例えば、ヒト患者血清に由来することができる。好適には、試料は、ヒ
ト又は動物の患者の血清を含む。
本発明はまた、TSHRに対する被検自己抗体を検出するための、診断方法を含む、方法を
提供し、この方法は：
a) 対象由来の試料、例えば体液試料を提供する工程；
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、本発明
の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片である工程；
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該試料、例えば体液試料と接
触させ、これにより該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給
源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する工程；
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で
形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又
は引き続き固形支持体に固定される工程；
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供
し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)
の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)に
おいて形成された複合体の存在を検出する工程：を含む。
TSHRの第一の給源は、完全長TSHR、又はTSHR260を含む断片を含む、TSHRのいずれか好
適な形(野生型又は変異型)であることができるが、好ましくは(b)において提供されるTSH
Rの第一の給源は、TSH受容体の1以上のエピトープ又はTSH受容体の1以上のエピトープを
含むポリペプチドを含む完全長TSHRである。望ましいならば、(b)において提供されるTSH
Rの第一の給源は、本明細書記載の本発明の変異体TSHR又はその断片である。従って本発
明の方法のTSHRの第一及び第二の両方の給源は、望ましいならば、本明細書に記載及び請
求される本発明の変異体TSHR又はその断片であってよい。
好ましい態様において、変異体TSHR又はその断片は、TSHR受容体のサブドメインTSHR26
0からなるか、又はこれから本質的になるが、原則として本明細書記載の変異体TSHR又は
その断片のいずれかであることができる。
標識手段は、TSHRの第二の給源を標識するいずれか好適な手段を含むことができ、且つ
好適な手段並びにそれらの適用及び使用の方法は、当業者に公知であろう。この標識は、
例えば、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択さ
れ得る。かかる標識は、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合(以下に更に説明)を
介して又は化学標識によるなど、任意の好適な様式により追加され得る。当業者は、必要
な関連技術、及び好適な標識の独自性を熟知しているであろう。
好ましい態様において、標識は、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を
含む。最も好ましくは、アルカリホスファターゼ標識が利用される。
好ましい態様において、標識された変異体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260から
なるか、又はこれから本質的になる。特定の好ましい変異体は、TSHR受容体のサブドメイ
ンTSHR260及びアルカリホスファターゼ(AP)標識からなるものであり、TSHR260-AP-Xと称
され、ここで「X」は、変異体中の1以上のアミノ酸変異を指す。
好ましくは、標識手段は、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む。
好ましくは、変異体は、標識手段により直接標識され－例えば、TSHR260は、アルカリ
ホスファターゼ(AP)標識又はビオチンにより直接化学的に標識される。
好ましい態様において、それにより該TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定
手段は、モノクローナル抗体、組換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む。例として
は、抗体4E31(本明細書に記載の)であるが、いずれか好適な抗体を使用してよい。
固形支持体は、いずれか好適な支持体であってよいが、好ましくはプレート、例えば、
ELISAプレート、又はELISAプレートウェルである。
本発明はまた、TSHRに対する被検自己抗体を検出するキットも提供し、該キットは：
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、本明細書記載の本発
明の変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であるもの；
c)該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試料
と、同時に又は連続して接触させる手段であり、これにより該TSHRに対する抗体が、[第
一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する手段
；
d)工程(c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、工程(c)の前
に、又は同時に、又は引き続き固形支持体へ固定するための固定手段；
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された工程(c)において形成
された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可
能な標識手段；並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(c)において形成された複
合体の存在を検出する手段：を含む。
このキットは、例えば、対応する方法に関連する先に記載した特徴のいずれか1つ以上
を含むことができる。
特に望ましいならば、(a)に提供されるTSHRの第一の給源は、本明細書記載の本発明の
変異体TSHR又はその断片である。従って本発明のキット中のTSHRの第一及び第二の両方の
給源は、望ましいならば、本明細書に記載及び請求された本発明の変異体TSHR又はその断
片であることができる。本発明はまた、本明細書記載の本発明の変異体甲状腺刺激ホルモ
ン受容体(TSHR)又はその断片がそれらに直接又は間接に結合されている固形支持体を提供
する。
好ましくは、本発明の固形支持体は、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、
又はこれから本質的になる、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片がそれ
らに結合されている。
好ましい態様において、本発明の固形支持体は、以下の変異のセットの一つを含む、変
異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片がそれらに結合されている：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)。
従って、本発明は、特に、TSHRモノクローナル自己抗体及び患者血清TRAbを検出するた
めの、ELISAプレートウェル上に直接コートされたTSHR260の安定して精製された変異体、
特にTSHR260-JMG55の使用を提供する。かかる変異体は、望ましいならば、アルカリホス
ファターゼ(AP)標識などの、検出可能な標識を含んでよい。
好適には、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片は、該固形支持体へ直
接結合される。
好ましい態様において、支持体は、1個以上のウェルを含むELISAプレートである。
本発明はまた、本発明の固形支持体を含むキットも提供する。
本発明はまた、TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbを検出するための、本発明の
固形支持体又は固形支持体を含む本発明のキットの使用も提供する。
（図面の説明）
本発明のTSHR分子及び方法は、ここで、単なる例証として、添付図面、図1～30を参照
し、説明する：
図1は、ヒト(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:1)を示す。 図2は、ヒト(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。 図3は、ヒト(野生型)TSHR260断片のDNA配列(配列番号:3)を示す。 図4は、ヒト(野生型)TSHR260断片のアミノ酸配列(配列番号:4)を示す。 図5は、熱安定化するTSHR単一変異のDNA配列(配列番号:11-28)を示す。 図6は、熱安定化するTSHR単一変異のアミノ酸配列(配列番号:29-46)を示す。 図7は、(a)42℃、(b)50℃、(c)50℃、(d)55℃及び(e)60℃で加熱した、TSHR260変異体に関する、TSHR260熱安定性アッセイの結果の5つの代表的例を示す。 図8は、50℃で、14C4 Fab2プレート上で加熱した、完全長TSHR変異体の熱安定性を示す。 図9は、略画形式でTSHR260ドメインを図示し、且つスティック立体構造で最も熱安定化する変異の未変性の残基の位置を示す。 図10は、ヒト、ミドリザル、アカゲザル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマのTSHRアミノ酸配列(それぞれ、配列番号:2、47-56)のアラインメントを示す。 図11は、ヒトTSHRアミノ酸配列とヒトFSHR及びヒトLHR(それぞれ、配列番号:2、57及び58)のアラインメントを示す。 図12は、以下のTSHR260に関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR260-結合アッセイ；(b)TSHR260熱安定性アッセイ；(c)TSHR260へのM22-POD結合の阻害；及び、(d)TSHR260-JMG55コートされたELISAプレートウェルアッセイ。 図13は、以下のTSHR260-APに関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR260-AP架橋ELISA；(b)TSHR260-AP熱安定性アッセイ；及び(c)TSHR260-AP架橋阻害ELISA。 図14は、以下のTSHRに関与するアッセイの概略図を示す：(a)TSHR-結合アッセイ；(b)TSHR安定性アッセイA；(c)TSHR安定性アッセイB；(d)TSHR安定性アッセイC；及び(e)TSHRへのM22-POD結合の阻害。 図15は、TSHR260-APのDNA配列(配列番号:59)を示す。 図16は、TSHR260-APのアミノ酸配列(配列番号:60)を示す。 図17は、ブタ(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:61)を示す。 図18は、ブタ(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:62)を示す。 図19は、マウス(野生型)TSHRのDNA配列(配列番号:63)を示す。 図20は、マウス(野生型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:64)を示す。 図21は、ブタ(変異型)TSHRのDNA配列(配列番号:65)を示す。 図22は、ブタ(変異型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:66)を示す。 図23は、マウス(変異型)TSHRのDNA配列(配列番号:67)を示す。 図24は、マウス(変異型)TSHRのアミノ酸配列(配列番号:68)を示す。 図25は、(a)TSHR260(野生型)、(b)14C4 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(c)25E1 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(d)2H11 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(e)23H4 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(f)36F11 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、(g)9B7 IgGとの複合体中のTSHR260(野生型)、並びに(h)ストリームラインDEAE又はストリームラインHSTのいずれかのマトリクス上のTSHR260-JMG55の、精製に関する装加プール及び溶出プールの、図13(c)に例示された架橋阻害ELISAアッセイにより測定された活性を示す。 図26は、ストリームラインHST精製されたTSHR260-JMG55の14C4-アフィニティクロマトグラフィー後の、溶出画分中のTSHR260-JMG55活性の分布を示す。 図27は、3ラウンドのカラム精製(ストリームラインHST、14C4-アフィニティ及びニッケル-アフィニティクロマトグラフィー)後の、精製されたTSHR260-JMG55-5.0(低比活性)及び精製されたTSHR260-JMG55-4.5(高比活性)の、染色した12％非還元SDS-PAGEゲルを示す。レーン1：分子量マーカー；レーン2：TSHR260(野生型)培養物上清対照；レーン3：昆虫細胞培養培地対照；レーン4：精製されたTSHR260-JMG55-5.0(2.4μg)；及びレーン5：精製されたTSHR260-JMG55-4.5(3.0μg)。 図28は、エンドグリコシダーゼF3を異なる濃度で使用する、精製されたTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化を示す(染色した12％非還元SDS-PAGEゲル)。(A)レーン1：分子量マーカー；レーン2：昆虫細胞培養培地陰性対照；レーン3：ニッケル-アフィニティ精製されたTSHR260-JMG55-4.5(未処置)；レーン4-6：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、40mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5；レーン7-9：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、0mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5。(B)レーン1：分子量マーカー；レーン2：昆虫細胞培養培地陰性対照；レーン3：ニッケル-アフィニティ精製したTSHR260-JMG55-4.5(未処置)；レーン4-6：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーション後の、60mU エンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5；レーン7-9：それぞれ、24時間、72時間及び120時間インキュベーションした後の、80mUエンドグリコシダーゼF3/mgのTSHR260-JMG55-4.5。 図29は、TSHR-JMG55のTMD内で作製された熱安定化する単一アミノ酸変異のDNA配列(配列番号:69-88)を示す。 図30は、TSHR-JMG55のTMD内で作製された熱安定化する単一アミノ酸変異のアミノ酸配列(配列番号:89-108)を示す。
（方法）
（TSHR260変異のコンピュータモデリング）
コンピュータモデリングは、Discovery studios v3.5 (Accelrys Software社、Accelry
s Ltd, Cambridge, CB4 0WN, UK)により、Calculate Mutation Energy Stabilityプロト
コールを使用し、行った。TSHR260-M22 Fab複合体の結晶構造(PDBコード：3G04；RCSBタ
ンパク質データバンクからwww.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4で入
手可能)を、全ての変異に関する初期モデルとして使用し、M22のTSHR260への結合を妨害
しない変異が選択されたことを確実にした。TSHR260構造の各残基を、その他の19の可能
なアミノ酸の各々に変異し、この変異エネルギーデータを収集し比較した。
コンピュータモデリングデータは、どの標的残基が各位置で最も安定化される可能性が
あるかを推定するために、安定化変異の他の予測と組合せて使用した。これらの他の予測
は、数多くの要因を基にした：
1. Pro又はGlyアミノ酸に関して好ましい立体構造を予測する残基のねじれ角、
2. 他の生物及び他の糖タンパク質からのTSHRコンセンサス配列、
3. LRR及び／又はβ-シートにおける残基の位置、
4. タンパク質の表面又はコア中の残基の位置。
（プライマーデザイン）
プライマーを、点変異をTSHR260へ導入するために、PrimerXウェブサイト(www.bioinfo
rmatics.org/primerx/index.htm)を使用し、設計した。このタンパク質-ベースのプライ
マーデザインの選択肢を、QuikChange SDMプロトコールを使用し、且つそれらのオーバー
ハングが2～10残基であるプライマー対を選択して、使用した。プライマーは、融解温度7
3℃～84℃(理想的には76℃より高い)を有し、長さ27～49塩基対であり、且つGC含量33％
～70％(理想的には40％より大きい)を有した。プライマーは、Sigma Genosys社(Haverhil
l, CB9 8QP, UK)から、10μM水溶液中で、96-ウェルフォーマット中に注文した。
（変異誘発、プラスミドDNA調製及び精製）
TSHR260-6His鋳型構築体(ヒトTSHRのコーディングアミノ酸1-260；野生型TSHR 260のヌ
クレオチド配列及びアミノ酸配列の各々については、図3(配列番号:3)及び4(配列番号:4)
を参照)を、鋳型として完全長ヒトTSHR(Oda Yらの文献、(1998) Journal of Molecular E
ndocrinology, 20: 233-244)を使用し、6個のHisタグをC末端へ追加し、先に増幅した。T
SHRの残基1-260は、完全長TSHRから、BamHI制限部位をヒトTSHRアミノ酸1-260のN末端に
、及び1個のアミノ酸リンカー(Asn)、6個のHisタグ、停止コドン及びXbaI制限部位をC末
端に追加する2種のプライマー
Figure 2022078064000002
 により増幅した。このPCR産物を、BamHI及びXbaI制限部位を使用し、pcDNA3.1+へクロー
ニングした。
TSHR260配列における変異(図5；配列番号:11-28及び図6；配列番号:29-46)は、QuikCha
nge II方式(Agilent Technologies UK社, Stockport, SK8 3GR)によるポリメラーゼ連鎖-
反応(PCR)を使用する部位特異的変異誘発により、作製した。変異誘発は、KODホットスタ
ートポリメラーゼキット(Novagen from VWR International社, Lutterworth, LE17 4XN,
UK)を使用し、96-ウェルプレートフォーマットで行った。鋳型としてTSHR260-6Hisか、又
は好適なベクターpcDNA3.1+中のTSHR260変異体を使用し、50μLのPCR反応物を、各反応物
の最終濃度が下記であるように、設定した：1×KOD緩衝液、0.2mM dNTP、1.5mM MgSO4、0
.02U/μL KODホットスタートポリメラーゼ、9％v/v DMSO(Sigma Aldrich社, Poole, BH12
4QH)、0.2ng/μL鋳型DNA、0.3μMフォワードプライマー及び0.3μMリバースプライマー
。下記のPCRプログラムを試行した：94℃で2分間の変性；94℃で15秒間の変性、68℃で1
分間のアニーリング、68℃で8分間の伸長を18サイクル；引き続き、68℃で7分間の伸長の
最終工程。この鋳型を、2μL DpnI (Fisher Scientific社, Loughborough, LE11 5RG)に
よる、37℃で少なくとも3時間のインキュベーションにより、消化した。
PCR反応物1μLを、1.5mLマイクロチューブ又は96-ウェル細胞培養クラスター丸底プレ
ート(Nunc社, Roskilde, デンマーク)の中で、30μL XL1ブルーコンピテント細胞へ添加
し、氷上で30分間インキュベーションした。細胞を、42℃で90秒間ヒートショックさせ、
氷へ移し、ルリアブロス(LB)培地200μLを添加した。細胞を、37℃で1時間インキュベー
ションし、その後アンピシリン(100μg/mL)を含有するLB寒天プレート上に塗沫した。30
回を超える形質転換が同時に実行された時点で、アンピシリン(100μg/mL)を含有するLB
寒天を、48区画を備えたQ-トレープレート(Molecular Dimensions社, Newmarket, CB8 7S
Q, UK)へ注ぎ、使用した。プレートを、37℃で一晩インキュベーションし、コロニーを成
長させた。
各形質転換から2つのコロニーを採取し、且つ15mL Falconチューブ又は24-ウェルディ
ープ-ウェルブロック(Promega UK社, Southampton, SO16 7NS, UK)中で、100μg/mLアン
ピシリンを含むLB培地7mL中で、37℃で一晩成長させた。プラスミドDNAを、Qiagen Plasm
idPlus 96 Miniprep Kit (Qiagen社, Manchester, M15 6SH, UK)又はWizard PlusMinipre
p DNA精製システム(Promega社)を使用し、一晩培養物の細胞ペレットから抽出し、所望の
変異の存在を確認するために、変異したTSHR260 cDNAを、Source Bioscience社(Cambridg
e, CB4 0WU, UK)により配列決定した。変異体TSHR260-6Hisを含む大腸菌株のストックを
、一晩培養物のアリコートへ、グリセロール(最終濃度14％)の添加後、-70℃で維持した
。
（PCRを使用する特異的アミノ酸変異の完全長ヒトTSHR配列への導入）
標準クローニング手順に従い、TSHR完全長ヌクレオチド配列(Oda Yらの文献、(1998)
前掲)を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)へ、BamHI及びXhoI制限部位を用いてクロ
ーニングした。完全長配列内の変異を、変異誘発を96ウェルプレートフォーマットの代わ
りに0.2mL PCRチューブ内で行う以外は、TSHR260変異に関して先に記載したQuikChange I
I方式によるPCRを使用する部位特異的変異誘発により、作製した。PCR反応物を、形質転
換し、増大し、これらの変異を、TSHR260 PCR産物に関して前述のように配列決定するこ
とにより検証した。完全長野生型TSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について、各
々、図1(配列番号:1)及び図2(配列番号:2)参照。
（Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェク
ション）
トランスフェクションの1日前に、1.5×105個CHO-K1細胞/ウェルを、24-ウェル細胞培
養プレート(Nunc社)へプレーティングした。トランスフェクトされるべき各ウェルに関し
て、pcDNA3.1+(0.2μg/μL)中の5μL TSHR260-6His変異体を、20μL Optipro SFM(Life T
echnologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)と混合した。Optipro SFM 22.5μL中に希釈したF
reestyle Max試薬(Life Technologies社)2.5μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、
室温で10～20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混合物40μLを、24-ウェ
ルプレート中のCHO-K1細胞に添加し、37℃で40～48時間インキュベーションした。その後
培地へと分泌された発現されたTSHRタンパク質を、13000rpmで2分間の遠心分離により収
集し、細胞デブリを除去し、上清を-70℃で保存した。
TSHR260-WT標準は、pcDNA3.1+中のTSHR260-6Hisによる90％コンフルエンスCHO-K1細胞
を含む80cm2フラスコのトランスフェクションにより作製した。pcDNA3.1+(1μg/μL)中の
20μL TSHR260-6Hisを、Optipro SFM(Life Technologies社)480μLに添加した。Optipro
SFM 450μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies社)50μLを、DNA/Optipro
SFM混合物へ添加し、室温で10～20分間インキュベーションした。DNA/Freestyle Max混
合物1mLを、CHO-K1細胞の80cm2フラスコへ添加し、37℃で40～48時間インキュベーション
した。その後培地へと分泌された発現されたTSHR260-6Hisタンパク質を、3000rpmで30分
間の遠心分離により収集し、細胞デブリを除去し、上清を-70℃で保存した。これは、100
U/mLと規定された。TSHR260-結合アッセイ(下記参照)において検出したように、更にTSHR
260-WT標準試料を、最初のTSHR260-WT標準と同じ濃度に希釈した。
（Flp-Inシステムを使用する完全長TSHR構築体のCHO細胞へのトランスフェクション）
Flp-In-CHO細胞(Invitrogen社, Paisley, PA4 9RF, UK；O'Gorman, S.、Fox, D. T.及
びWahl, G. M.の文献、(1991) Science, 251: 1351-1355)のコンフルエンスフラスコを使
用し、抗生物質を含まない、DMEM(Invitrogen社)、10％ウシ胎仔血清(FCS)(Invitrogen社
)、1×L-グルタミン(Invitrogen社)及び1×非必須アミノ酸(NEAA)(Invitrogen社)の入っ
た24ウェルプレートのウェルに1×105～1.5×105個細胞/ウェルで播種した。細胞を、37
℃、5％CO2及び湿度＞95％で一晩インキュベーションした。
pcDNA5.1/FRT TSHR DNA(前記)及びpOG44 DNA(Invitrogen社)を希釈し、滅菌水中に、各
々、0.01μg/mL及び0.1μg/mLの溶液を生じた。pOG44 DNA及びTSHR DNAを、(1)9μLのpOG
44、10μLのTSHR DNA及び31μLのオプチメムI(Invitrogen社)；(2)8μLのpOG44、20μLの
TSHR DNA及び22μLのオプチメムI；(3)9.5μLのpOG44、5μLのTSHR DNA及び35.5μLのオ
プチメムI：の3つの異なる濃度で混合し：、且つ室温で5分間インキュベーションした。
オプチメムI中に1：25希釈したリポフェクタミン(Invitrogen社)50μLを、各チューブ(前
記1-3)に添加し、且つ室温で20分間インキュベーションした。その後各インキュベーショ
ン混合物を、95％コンフルエンスのFlp-In-CHO細胞の1ウェル(24ウェルプレート中)に添
加し、前述の条件下で一晩インキュベーションした。その後培養培地を除去し、DMEM、10
％FCS、1×L-グルタミン、1×NEAA及び1×ペニシリン(100u/mL)/ストレプトマイシン(100
μg/mL)(Invitrogen社)に交換し、続けて一晩インキュベーションした。その後細胞を、1
×トリプシン/EDTA溶液(Invitrogen社)を用い、ウェルから剥離させ、4つの新規ウェルへ
分け、600μg/mLヒグロマイシン(Invitrogen社)を添加した前述の培地において成長させ
た。
pOG44プラスミドDNA及びpcDNA5.1/FRT TSHRの両方でトランスフェクションされた細胞
は、TSHRをFlp-In-CHO細胞ゲノムへ挿入し、ヒグロマイシン耐性をこの細胞へ付与するこ
とが可能であり、そのためヒグロマイシン選択培地において成長することができる。Invi
trogen社からのFlp-Inシステムを、本発明者らの構築体中のTSHRが、pOG44により、Flp-I
n-CHO細胞のFRT部位に挿入されるように設計する。Flp-In-CHO細胞は、1細胞につき1つの
Flp-In部位を含み、そのためTSHR DNAは、各実験においてゲノム内で同じ場所に挿入され
、且つこれは1細胞につき1コピーとして存在するであろう。このシステムは、最適発現レ
ベルを伴う細胞に関する細胞コロニースクリーニング(その後の安定した細胞株を見つけ
るための細胞クローニング)は不要であるという利点を有する。結果的に、ヒグロマイシ
ン選択培地中で成長する変異されたTSHRを発現している細胞は、迅速に増大され、且つ様
々なアッセイにおいて使用できる。
（TSHR260結合アッセイにおいて使用される抗体）
（14C4）
TSHR260-結合アッセイにおいて使用される14C4 TSHRマウスモノクローナル抗体は、cDN
A免疫化により調製した。簡単には、6～8週齢のNMRI(非近交系)マウスに、10μMカルディ
オトキシン100μLを、筋肉内注射し、その5日後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR；Odaら
の文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔
で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)
。TSHRに結合する125I-標識したTSHの阻害により、マウス出血液(bleeds)を、TSHR抗体の
存在下について試験した(RSR社, Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナ
ル抗体を、血清中最高TSHR抗体力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離
した脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(X63_Ag8.653；ECACC, Porton Down, UK)と比1：2
で混合し、先に説明された方法(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(1980)
Journal of immunological methods, 35, 1-21)に従い、10％DMSO及び50％PEG(Sigma Al
drich社, Poole, UK)を用いて融合した。細胞を、DMEM(ハイブリッドを選択するためにHA
Tを含有する20％ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、48-ウェルプレートにプレーティ
ングした。14C4を得るために、細胞培養物由来の上清を、125I-TSH標識されたTSHR複合体
の免疫沈降により、TSHR抗体に関してスクリーニングした。これらのアッセイにおいて、
完全長TSHRは、125I-TSHを用いて標識し、125I-TSH-TSHR複合体を形成する。125I-TSH-TS
HR複合体は、TSHと同時にTSHRへの結合が可能である抗体により結合される。次にこの複
合体を、標準PEG沈降技術を用い、沈殿させることができ、ペレット中の放射能を測定す
る。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要なモノクロー
ナル抗体を発現しているクローンを得る。14C4 IgGは、TSHRの凸面上の立体配座エピトー
プに結合し、同時にTSH又は患者TRAbのTSHRの凹面への結合を可能にする。14C4は、RSR社
(Cardiff, UK)から入手可能である(www.rsrltd.com)。
（M22タンパク質データバンク(PDB)寄託番号3G04）
(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3go4)
M22(hMAb TSHR1)は、グレーヴス病患者由来の末梢血リンパ球から得られた、ヒト甲状
腺刺激モノクローナル自己抗体である(Sandersらの文献、(2003) Lancet 362: 126-128)
。簡単に述べると、リンパ球を、甲状腺機能亢進症で高レベルのTSHR自己抗体(グレーヴ
ス病が原因)を有する19歳男性の末梢血20mLから単離した。これらのリンパ球を、エプス
タイン・バー・ウイルスにより感染させ、標準技術(Hayakawa Nらの文献、(2002) Autoim
munity, 35: 343-55)を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5；ECACC, Porto
n Down, UK)と融合させた。これらの細胞を、48-ウェルプレートにプレーティングし、上
清を、TSHRコートされたチューブに結合する125I-TSHの阻害によりスクリーニングした(
アッセイ RSR社, Cardiff, UK)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体M22を産生す
る単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。M22(hMAb TSHR1
)は、甲状腺刺激抗体に関するWHO第2回国際標準NIBSCコード：08/204として、当該技術分
野において周知である(Burns Cらの文献、(2010)、甲状腺刺激抗体に関する提唱された第
2回国際標準のWHO国際協同研究、生物学的標準化に関する専門家会議、Geneva、2010年10
月18～22日、WHO/BS/10.214、下記で入手可能：www.who.int/biologicals/expert_commit
tee/BS_2142_Thyroid_Stimulating_Autoantibody.pdf)。M22(hMAb TSHR1)は、RSR社(Card
iff, UK(前掲))から購入可能である。
（熱安定性）
本発明の文脈において、熱安定性は、一般に言われるように、変異体TSHR又はその断片
(TSHR260変異体など)が、指定された時間、所定の温度に曝された後で、その正常な生物
活性を保持する能力である。好適には、温度曝露後に残存する活性変異体タンパク質の割
合により決定することができる。活性変異体タンパク質の量の一つの好適な測定は、結合
アッセイにおいて、抗体又は自己抗体をTSHRへ結合する能力を保持する変異体タンパク質
の割合である。従って所定の温度への曝露後に残存する活性変異体タンパク質の量は、時
間の関数として測定することができ、且つその温度での熱安定性曲線－例えば図7に示し
たもの－が得られる。従って変異体タンパク質の半減期－すなわち、活性タンパク質の量
がその最初の値の50％まで低下する(すなわち、50％は失活又は変性される)のに要する時
間－が、誘導され得る。変異体タンパク質の半減期は、タンパク質の熱安定性の簡便な定
量的測定をもたらし、且つこれは、熱安定性が増大又は減少したかを評価するために、同
等の変異されないTSHR又はその断片(すなわち、野生型TSHR又はその断片、例えば野生型T
SHR260など)の半減期と比較することができる。
好適な結合アッセイは、例えば、試験される変異体TSHR又はその断片に結合されたプレ
ート、及びTSHRに対する標識された抗体又は自己抗体、並びにそのような本発明のアッセ
イフォームの一部を含むことができる。試験される変異体は、抗体の変異体タンパク質へ
の結合を妨害しない様式で、プレートへ好適に結合される。変異体は、例えばいずれか好
適な抗体を使用しプレートへ結合されてよく、且つそのような抗体のひとつは前述の14C4
である。当業者には明らかであるように、結合された標識された抗体の量を用い、活性変
異体タンパク質の量を示すことができる。好ましくは、M22(前述のような)など、TSHRに
対する標識されたモノクローナル自己抗体を使用し、アッセイされる変異体タンパク質へ
結合する。かかるアッセイの原理は、例えば、図12a及び12b、図13a及び13b、並びに図14
a、b、c及びdに示されている。先の図面に示されたアッセイの具体的詳細は変動するが、
各場合における変異体タンパク質の熱安定性は、TSHRに対する抗体又は自己抗体(M22など
)に結合する能力を保持しているタンパク質の量を測定することにより、変異体タンパク
質と野生型を比較することにより誘導することができる。
本発明において、用語「熱安定性」及び「熱安定な」(及び「増大した熱安定性」など
の関連用語全て)は、試験温度でのTSHRに対する抗体又は自己抗体に結合する能力を保持
している変異体TSHR又はその断片(又は同等の野生型タンパク質)の量を決定する結合アッ
セイにおいて、同じ条件下で測定した、同等の野生型TSHR又はその断片の半減期と比較し
た、変異体TSHR又はその断片(TSHR260など)の半減期に関する定量的意味であることは理
解されるべきである。好ましくは、この変異体の結合能の試験に使用される自己抗体は、
M22、K1-70又はK1-18である。
前述のように変異体TSHR又はその断片の半減期を決定することができるいずれか好適な
結合アッセイを、使用することができる。本発明の目的のために、本発明者らは、この種
の特異的結合アッセイを利用し、且つこれらは以下に完全に説明されている。これらの結
合アッセイは、原則として、任意の変異体TSHR又は断片(完全長、TSHR260、又はTSHR260
よりも長いか短い配列長のいずれか)の熱安定性を決定するために利用することができる
。
TSHR260変異体などのTSHRの断片に関して、本発明者らは、下記の熱安定性プロトコー
ル及びTSHR260-結合アッセイを利用し、熱安定性を決定した。本発明は、主にTSHR260変
異体に関して説明されているが、熱安定性プロトコール及び結合アッセイは、同じ様式で
配列長が変動する他のTSHR断片に使用することができることは理解されるであろう。
完全長TSHR及び完全長変異体に関して、本発明者らは、以下の「14C4-Fab2 ELISAプレ
ート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性」及び「完全長TSHR変異体の熱安
定性」において説明されたものに類似の、しかし改変された結合アッセイを利用した。こ
のアッセイにおいて、大きな差異は、完全長試料は、試験温度まで加熱する前に、プレー
トに結合されることである。
（TSHR260-結合アッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2
CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4 Fa
b2 (Jeffreys Jらの文献、(2002) Thyroid, 12: 1051-1061、及びSanders Jらの文献、(2
007) 前掲)の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベ
ーションした。ウェルは、洗浄緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス pH7.8；1％v/v トリトンX
-100)により3回洗浄し、且つ被験試料(一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞か
ら収集されたTSHR260-6His)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間インキュベーショ
ンし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。次にウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL(50
mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)
及び健常血液ドナー血清プール(NPS)75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上
で、1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後、これらのウェルの内
容物を空にし、ウェルを洗浄し、M22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD、RS
R社, Cardiff, CF23 8HE, UK)の100μLを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間
インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジ
ジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。50μLの0.5
M H2SO4の添加により、反応を停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で
450nmで測定した(図12a)。
（結合及び安定性スクリーン）
一過性トランスフェクションされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR260-6His試料を、CH
O-K1培地((-)DMEM、10％FBS、2×グルタチオン、1×ペニシリン／ストレプトマイシン、1
×NEAA)中に、1/4希釈した。各試料に関して、100μLアリコートを、42℃で30分間加熱し
、その間二番目の同一試料を氷上に維持した。次に試料を、TAT緩衝液(50mM NaCl、10mM
トリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)中に1/5希釈
し、150μLアリコートを、前述のように実行したTSHR260-結合アッセイに2つ組で適用し
た(図12a)。検出されたTSHRタンパク質の量(前記TSHR260結合アッセイ参照)を、i)TSHR26
0-WT標準の割合、及びii)加熱後に残存する活性TSHRタンパク質の画分として表現した。
これを、加熱後に残存するTSHR260-WT標準の画分と比較し、TSHR260-WT標準安定性の割合
として変異体安定性を生じた。検出された活性TSHRタンパク質の量が、正確に決定される
にはあまりにも高いか低い場合は、この結合アッセイを、TSHR260変異体の異なる希釈で
繰り返した。
（TSHR260変異体の熱安定性）
CHO-K1細胞において一過性に発現され且つ前述のように上清から収集されたTSHR260変
異体を、CHO-K1培地中に25％TSHR260-WT標準(前記参照)まで希釈した。100μLアリコート
を、37℃で0～30日間、又は42℃、50℃、55℃、若しくは60℃で0～3時間加熱した。次に
試料を、TAT緩衝液(試料87.5μL＋TAT緩衝液350μL)中に1/5で希釈し、150μLアリコート
を、2つ組で前述のTSHR260-結合アッセイ(図12b)に適用した。アッセイデータを、時間に
対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、且つ変異体の半減期(t1/2)を計算し、
TSHR260-WT、TSHR260-I253R又はTSHR260-JMG45と比較した(表5に規定)。
（発現されたTSHRの総量(活性＋不活性)を決定するドットブロットアッセイ）
TSHR260変異体の発現レベルを、Bio-Dotマイクロ濾過装置(Bio-Rad Laboratories社, H
emel Hempstead, HP2 7DX, UK)を使用する、ドットブロットアッセイにより決定した。前
述のトランスフェクトされた細胞培養物から収集したTSHR260-6His調製品の50μLアリコ
ートを、Bio-Dot装置に適用し、重力流により、ニトロセルロースメンブレンを通した。
続いて、これらの試料を、重力流により、リン酸緩衝食塩水(PBS、8g/L NaCl、1.15g/Lリ
ン酸水素二ナトリウム、0.2g/Lリン酸二水素カリウム、0.2g/L塩化カリウム、pH7.4)50μ
Lと共に流した。次にメンブレン上の試料を、洗浄緩衝液(PBS中0.5％(v/v)Tween)400μL
により洗浄し、真空を適用し、メンブレンを通して洗浄緩衝液を吸引した。次にメンブレ
ンを、Bio-Dot装置から取り外し、PBS中の0.1mg/Lポリ酢酸ビニルとのインキュベーショ
ンにより、穏やかに振盪しながら、1分間ブロックした。このメンブレンを、洗浄緩衝液
で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、抗体緩衝液(PBS中180g/L D-グルコース、10
％(v/v)ウシ胎仔血清、10％(v/v)～87％グリセロール、0.5％(v/v)Tween)中に希釈した一
次抗体であるTSHRモノクローナル抗体18C5-IgG(0.01mg/mL)又は8E2-IgG(0.02mg/mL)(Jeff
reys Jらの文献、(2002) 前掲)と共に、室温で振盪しながら1時間インキュベーションし
た。再度メンブレンを、洗浄緩衝液で洗浄し(3×3分間、室温、振盪しながら)、その後PB
S中の二次抗体であるヤギ抗-マウスHRP(0.04μg/mL, Sigma社)と共に室温で振盪しながら
1時間インキュベーションした。再度洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄した後(3×3分間、室
温、振盪しながら)、メンブレンを、化学発光基質であるSuper Signal West Pico Stable
Peroxide(ThermoScientific社)及びSuper Signal West Pico Luminal Enhancer (Thermo
Scientific社)と共にインキュベーションした。
18C5-IgG及び8E2-IgGは、TSHR260の線状エピトープに結合し、そのためそれらの結合は
、TSHRタンパク質のアンフォールディングにより影響を受けない。18C5-IgGは、TSHR残基
246-260により形成された線状エピトープを認識するが、8E2-IgGは、TSHR260のN-末端の
残基36-42上の線状エピトープに結合する。これら2つの抗体を組合せて使用すると、変異
誘発後のTSHRタンパク質フォールディングにおける可能性のある変化に関わりなく、ブロ
ット上のTSHR260の検出(すなわち、活性＋不活性TSHRの検出)が可能である。
（14C4-Fab2 ELISAプレート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性）
完全長野生型TSHR及び変異型TSHR(JMG37、JMG45及びJMG52)の「オン-プレート」安定性
を試験するために、96-ウェルMaxisorp ELISAプレート(Nunc社)を、以下のようにコート
した。14C4 Fab2を、コーティング緩衝液中に1μg/mLまで希釈し、96-ウェルELISAプレー
トの各ウェルへ、150μLアリコートとした。これを、室温で3時間インキュベーションし
、引き続き4℃で一晩インキュベーションした。ELISAプレートウェルを、洗浄緩衝液で3
回洗浄し、未結合の抗体を除去した。野生型及び変異型TSHR試料を、-80℃から取り出し
、室温で解凍し、氷上に配置した(0℃)。次にTSHR試料を、TAT緩衝液中に希釈した。各希
釈物150μLを、4個のELISAプレートウェルへピペッティングし、4℃で一晩インキュベー
ションした。プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、14C4 Fab2に結合していないTSHRを除
去した。TAT緩衝液を、各ウェルに添加し(150μL)、次に接着プレートカバーを適用して
、ウェルを密封した。次に各プレートを、42℃又は50℃に設定したインキュベーター内に
配置した。96-ウェルプレートの1ストリップ(8ウェル)を、各プレートから、5、10、15、
20、30、45、60、90、120及び180分後に取り外し、スペアELISAプレートラックに挿入し
、これを次に氷上に維持した。180分間の時間経過が完了した後、受容体希釈緩衝液を、E
LISAウェルから吸引した。
次にアッセイ緩衝液(75μL)を、各ウェルに添加し、引き続き健常血液ドナー血清プー
ル(75μL)を添加し、室温(20～25℃)で、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しな
がら、1時間インキュベーションした。ウェル内容物を廃棄し、1回洗浄緩衝液で洗浄し、
M22-POD(RSR社)の100μLを、各ウェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベー
ションした後、プレートウェルを、洗浄緩衝液で2回、次に水で1回洗浄した。その後テト
ラメチルベンジジン100μLを、各ウェルに添加し、25分間インキュベーションした。この
反応を、50μlの0.5M H2SO4で停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で
450nmで測定した(安定性アッセイA、図14b)。
（TSHR260及び完全長TSHR変異体に結合するM22-POD、K1-18-POD及びK1-70-POD）
Maxisorp ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 F
ab2の150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーシ
ョンした。TSHR260変異体を、CHO-K1培地中に希釈し、次にTAT緩衝液中に1/5希釈した。
或いは、完全長TSHR変異体を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェルを洗浄し、TSHR260又は完
全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、且つ室温で1時間インキュベーションし
、TSHR260又は完全長TSHRを14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、アッ
セイ緩衝液75μL及び健常血液ドナー血清75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪
機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空
にし、ウェルを洗浄し、100μLのM22-POD(RSR社)、K1-18ペルオキシダーゼコンジュゲー
ト(K1-18-POD；RSR社)又はK1-70ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD；RSR社)の
濃度範囲10μg/mL～1ng/mLと共に、インキュベーションした。振盪せずに室温で25分間イ
ンキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン100μL
を添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2S
O4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450n
mで読み取った。非特異的結合に関して、CHO-K1培地を、TAT緩衝液中に希釈し、TSHR260
変異体又は完全長TSHR変異体に関するように、陰性対照として、ウェルに適用し、変動す
る濃度のM22-POD、K1-18 POD又はK1-170 PODとのインキュベーションを含む、同じ様式で
処理した。GraphPad Prism(GraphPad Software社, La Jolla, CA, USA)を使用し、M22-PO
D、K1-18-POD及びK1-70-PODに関する結合曲線をプロットし、マッチした濃度のM22-POD、
K1-18 POD又はK1-70 PODとインキュベーションしたTSHR260又はTSHR試料のOD450から、陰
性CHO-K1対照のOD450を減算することにより、非特異的結合について補正した。非線形回
帰(1-部位特異的結合飽和曲線)を使用し、平衡結合定数(Kd)を計算し、これは、受容体(
完全長TSHR又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(M22-POD、K1-18-
POD又はK1-70-POD)の濃度である。Kdは、1/Kaに等しく、ここでKaは親和定数である(図12
a及び図14a)。
（TSHR260-結合アッセイにおけるTSHR260変異体へのM22-POD結合のM22 IgG、K1-18 IgG
、K1-70 IgG及びTRAb陽性患者血清での阻害）
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150
μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。TSH
R260-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55を、培地中に希釈し、引
き続きTAT緩衝液中に1/5希釈した。ウェルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウ
ェルに適用し、室温で1時間インキュベーションし、TSHR260を14C4-Fab2へ結合させた。
次にこれらのウェルを洗浄し、アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希
釈したM22 IgG、K1-18 IgG若しくはK1-70 IgG (1000ng/mL～0.1ng/mL)の75μLと共に、室
温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションし
た。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μ
Lを各ウェルに添加した。振盪せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレート
ウェルを再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに
室温で25分間インキュベーションした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停
止し、各ウェルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図12c)。
（完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のM22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG及びTRAb陽性患
者血清での阻害）
ELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液中の1μg/mL 14C4 Fab2の150
μLアリコートでコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩インキュベーションした。完
全長TSHR-WT、TSHR-JMG37、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52を、TAT緩衝液中に希釈した。ウェ
ルを洗浄し、完全長TSHR被験試料150μLを、各ウェルに適用し、4℃で一晩インキュベー
ションし、完全長TSHR変異体を14C4-Fab2へ結合させた。次にこれらのウェルを洗浄し、
アッセイ緩衝液75μL及びTRAb陽性患者血清又はNPS中に希釈したM22 IgG、K1-18 IgG若し
くはK1-70 IgG(1000ng/mL～0.1ng/mL)の75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪
機上で1分間に500回振盪しながら、インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空
にし、ウェルを洗浄し、89.5ng/mL M22-POD(RSR社) 100μLを各ウェルに添加した。振盪
せずに室温で25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続き
テトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に振盪せずに室温で25分間インキュベーショ
ンした。この反応を、0.5M H2SO4の50μLの添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELI
SAプレートリーダー上で、450nmで読み取った(図14e)。
（TSHR刺激の分析）
Flp-Inシステムを使用する変異されたTSHR構築体のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)
細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに記載されている。
TSH、モノクローナルTRAb(M22及びK1-18)及び患者血清が、ヒトTSHRによりトランスフ
ェクトされたCHO細胞におけるサイクリックAMPの生成を刺激する能力を、WO2004/050708A
2に記載されたように試験した。TSHR変異体を発現しているCHO細胞を、96-ウェルプレー
トに、2～3×105個細胞/ウェルでプレーティングし、100％コンフルエンスとなるまで48
時間成長させた。被験試料(TSH、M22-Fab、K1-18 IgG又は患者血清)を添加し(サイクリッ
クAMPアッセイ緩衝液、すなわち、1g/Lグルコース、20mM HEPES、222mMショ糖、15g/Lウ
シ血清アルブミン及び0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含有するNaCl非含有ハ
ンクス緩衝塩溶液(pH7.4)中に希釈した100μL)、且つ37℃で1時間インキュベーションし
た。被験溶液の除去後、細胞を、200μL溶解緩衝液(0.37％HCl、1％(v/v)トリトンX-100)
と、室温で振盪しながら30分間インキュベーションすることにより溶解し、溶解液中のサ
イクリックAMP濃度を、Enzo Life Sciences社からのダイレクトサイクリックAMP Elisaキ
ットを用いてアッセイした。結果は、細胞溶解液(200μL)中のサイクリックAMPのpmol/mL
として表した。これらの実験は、野生型TSHRを発現しているCHO細胞を使用し実行された
類似実験と比較した。各アッセイは、少なくとも2回実行した。GraphPad Prismを使用し
、非線形回帰を用い、TSH、M22及びK1-18のデータに対し、用量-反応曲線をフィットさせ
た。これは、各作用物質(TSH又はモノクローナルTRAb)のEC50、すなわち、最大とベース
ラインのサイクリックAMP濃度の間の半分の反応を生じる作用物質の濃度を計算すること
が可能であった。
（ヒトTSHRタンパク質配列の他の生物のTSHRタンパク質配列、並びにヒトFSHR配列及び
ヒトLHR配列に対するアラインメント）
ミドリザル、アカゲザル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ及びウマ
由来のTSHRのタンパク質配列(図10；配列番号:47-56)並びにヒトFSHR(図11；配列番号:57
)及びヒトLHR(図 11；配列番号:58)由来のタンパク質配列を、Uniprotデータベースから
入手し、DNAStar MegAlign(v. 9.1, DNAStar社, Madison, WI, USA)を用い、ヒトTSHRの
タンパク質配列(図2；配列番号:2)と並置した。
（TSHR260-アルカリホスファターゼ(TSHR260-AP)構築体の作製）
本発明の標識された変異体の一例(アルカリホスファターゼ標識を含むTSHR260)を、以
下に説明しているが、望ましいならば、異なる標識及び異なる長さの変異体TSHR(完全長T
SHRを含む)を使用することができることは理解されるであろう。他の標識は、例えば、酵
素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から選択されてよく、
このようなものは当該技術分野において公知である。かかる標識は、いずれか適切な様式
、例えば、好適な構築体を使用する遺伝子融合を介して(更に以下に記載)又は化学標識に
より、追加することができる。当業者は、特定の標識に必要な関連技術を熟知しているで
あろう。いずれか好適なビオチン化プロセスに関与するビオチン標識を、使用してよい。
TSHR260-アルカリホスファターゼ(phosphate)(AP)構築体の作製に使用される方法は、W
O2010/073012A2に記載されており、その引用は更なる詳細を示すことができる。
TSHR260構築体(ヒトTSHRのコーディングアミノ酸1-260；アミノ酸1-21はリーダー配列
である)(各々、野生型TSHR260のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列について図3及び4；
配列番号:3及び4)を、完全長ヒトTSHRを鋳型として用いて増幅し(Oda Y,らの文献、1998.
Journal of Molecular Endocrinology, 20: 233-244)、クローニングベクターpSEAP2-ba
sic(Clontech社)を鋳型として使用し、分泌型アルカリホスファターゼのコーディング配
列(17アミノ酸のアルカリホスファターゼリーダー配列を除く)に連結した。2つのPCR反応
を実行し、第一のものは、N-末端にEcoRI制限部位、及び1つのアミノ酸リンカー(アスパ
ラギン)及びC-末端に分泌型アルカリホスファターゼの最初の8アミノ酸(17アミノ酸リー
ダー配列を除く)を追加する、特異的プライマー
Figure 2022078064000003
 (Sigma Genosys社)により、増幅された完全長TSHRを使用した。第二のPCRは、分泌型アル
カリホスファターゼのN-末端にTSHRのアミノ酸254-260及び1アミノ酸リンカー(アスパラ
ギン)、並びに6ヒスチジンタグ、停止コドン、及び分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子
のC-末端にXhoI制限部位を追加する、プライマー
Figure 2022078064000004
 により増幅された、クローニングベクターpSEAP2-basicを使用し、実行した。これらのPC
R反応は、94℃で1分間、40℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル、その後72℃で7分間で
行った。PCR産物を、1％アガロースゲル上を泳動させ、DNAを、製造業者の指示に従いGen
eclean IIキット(Anachem社, Luton)を用いて抽出した。その後精製されたPCR産物1及び2
を使用し、全TSHR260-アルカリホスファターゼ遺伝子を構築するために、第三のPCRを設
定した。このPCR 3反応は、PCR 1産物200ng及びPCR 2産物200ngを含み、PCR 3は、94℃で
1.5分間、65℃で1.5分間及び72℃で1.5分間で7サイクル実行した。その後温度を、再度94
℃まで2分間上昇させ、プライマー1及びプライマー4を添加し、その後94℃で1分間、52℃
で1分間及び72℃で2分間を30サイクル行った。PCR 3産物は、EcoRI及びXhoI制限部位を用
い、pFastBac1へクローニングし、且つ変異の存在を、サンガー-クールソン法(Sanger F
らの文献、1997. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74:
5463-5467)による配列決定を用い証明した。組換えDNAは、WO2008/025991A1に記載のよう
に、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系(Invitrogen社, UK)を用いて作製し、Sf-9細胞へ
トランスフェクトし、組換えバキュロウイルスストックを入手し且つ増幅した。TSHR260-
APは、WO2008/025991A1に記載のように昆虫細胞において発現した。
（安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製）
特異的変異をTSHR260-AP構築体のTSHR配列(図15及び16；配列番号:59及び60)へ導入す
るために使用した方法は、TSHR260変異に関して先に説明したものである。TSHR変異(図5
及び6；配列番号:14、16、18、19、20、23、27、32、34、36、37、38、41及び45)は、TSH
R260-AP構築体へ逐次導入し、以下に詳述した8種の異なる構築体(TSHR260-AP-I253R、TSH
R260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-
JMG55、TSHR-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)を生じた。アミノ酸残基の番号付けは、そ
のアミノ酸が未変性の野生型TSHR配列において認められる位置を指す：
TSHR260-AP-I253R＝TSHR260-AP＋I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
TSHR260-AP-JMG22＝TSHR260-AP＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び4
5)
TSHR260-AP-JMG37＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、
27、34、36及び45)
TSHR260-AP-JMG45＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:1
6、18、19、27、34、36、37及び45)
TSHR260-AP-JMG52＝TSHR260-AP＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配
列番号:16、18、19、23、27、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG55＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び
6；配列番号:14、16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)
TSHR260-AP-JMG57＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列
番号:14、16、18、23、27、32、34、36、41及び45)
TSHR260-AP-JMG58＝TSHR260-AP＋H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列
番号:14、16、18、20、27、32、34、36、38及び45)。
（TSHR260-AP架橋ELISAにおいて使用される抗体）
（4E31）
4E31抗体は、TSHRのC-末端の残基603-764(C-TSHR)に対するマウスモノクローナル抗体
であり、これは完全長TSHRをELISAプレートウェル上に固定するために使用することがで
きる(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)。マウスの免疫化のために、C-TSHR
を、標準プロトコールを使用し、グルタチオンS-転移酵素(GST)との融合タンパク質とし
て、大腸菌において発現させた(Oda Yらの文献、(1998) 前掲)。最後の162アミノ酸をコ
ードしているcDNAの3’末端(1809-2295 bp)は、pGEX2Tベクター(Pharmacia Biotech社, S
t. Albans ALI 3AW UK)において、GST融合タンパク質とインフレームでクローニングした
。pGEX-2T/C-TSHRプラスミドで形質転換した大腸菌(UT580株)を一晩培養したものを、2×
YTG培地(16g/Lトリプトン、10g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、20g/L グルコース、pH7.0)へ1
/5希釈し、30℃で3時間インキュベーションした。その後、C-TSHR/GST融合タンパク質発
現を誘導するために、イソプロピル-3-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度1mM
となるよう添加し、引き続き更に3時間インキュベーションした。この細菌ペレットを、1
％(v/v)トリトンX-100を含有するPBS(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.44g/L Na2HPO4、0.24g/
L KH2PO4、pH7.4)中に再浮遊させ、氷上で1分間3回音波処理した。封入体をペレット化し
、4M尿素で洗浄し、8M尿素中で可溶化させ、還元条件下の9％ポリアクリルアミドゲル(SD
S-ポリアクリルアミド電気泳動、SDS-PAGE)上で分離した。C-TSHR/GST融合タンパク質(MW
44kDa)を、0.1M NaHCO3及び0.1％ SDS(pH7.8)中のポリアクリルアミドゲル切片から電気
溶出させ、50mMトリス-HCl(pH8.0)に対し透析し、-70℃でアリコートで保存した。
4E31抗体は、電気溶出したC-TSHR/GST融合タンパク質による免疫化により調製した。簡
単には、BALB Cマウスを、TSHR抗体の力価が高くなるまで、50μg C-TSHR/GST/1匹マウス
/1回注射で、免疫化した。このマウス出血液を、インビトロ転写/翻訳システムにおいて
生成された35S-標識されたTSHRを基にした、免疫沈降アッセイを用いて試験した(Prentic
eらの文献、(1997) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84:1288-1292
)。標準技術を用い、マウス脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系(X63_Ag8.653；ECACC, Port
on Down, UK)と融合させ、クローニングし、モノクローナル抗体を分泌する安定したハイ
ブリドーマを作製した(Odaらの文献、(1998) 前掲)。4E31は、RSR社(Cardiff, UK (前掲)
)から購入可能である。
（K1-70）
K1-70は、甲状腺機能低下症患者の末梢血リンパ球から入手された、TSHRに対する遮断
型ヒトモノクローナル自己抗体である(Evansらの文献、(2010) Clinical Endocrinology,
73: 404-412；EP2367850)。簡単には、リンパ球を、54歳の甲状腺機能低下症で高レベル
のTSHR抗体を持つ患者の末梢血20mLから単離した。リンパ球を、エプスタイン・バー・ウ
イルスにより感染させ、標準技術を使用し、マウス/ヒトハイブリッド細胞株(K6H6/B5；E
CACC, Porton Down, UK)と融合させた(Hayakawa Nらの文献、(2002) 前掲)。これらの細
胞を、48-ウェルプレート上にプレーティングし、TSHRコートされたチューブに結合する1
25I-TSHの阻害を基にしたアッセイを使用し、上清をスクリーニングした(アッセイキット
はRSR社(Cardiff, UK)から入手可能)。次に陽性ウェルを、高濃度のTSHR自己抗体K1-70を
生成する単独コロニーが単離されるまで、限界希釈により再クローニングした。K1-70は
、RSR社(Cardiff, UK (前掲))から購入可能である。
（M22）
詳細は先の「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」に記載。
（TSHR260-APを基にした架橋ELISA）
架橋ELISAを、先に記した方法を基に使用した(図13a、Rees Smith, Bらの文献、(2009)
前掲、WO2010/073012A2)。このELISAは、二価TSHR抗体の、ELISAプレートウェル上にコ
ートされたTSHRに対する1つの抗原結合部位に、及び液相中のTSHR260-APへの他の抗原結
合部位に、結合する能力、すなわち、架橋を形成する能力を基にしている。CHO細胞にお
いて発現された完全長界面活性剤-可溶化された受容体の形のTSHRを、前述のC-末端抗体4
E31を介して、ELISAプレートウェル上にコートした(Bolton, Jらの文献、(1999) 前掲)。
このアッセイにおいて、出発緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス(pH7.8)；1g/L BSA；50mg/L
正常マウスIgG；1％トリトンX-100(pH7.8))75μL及び被験試料(健常血液ドナー血清のプ
ール中に希釈した又はアッセイ緩衝液[50mM NaCl、20mM トリス(pH7.8)、1％トリトンX-1
00、1g/L BSA]中に希釈した患者血清又はモノクローナル抗体)75μLを、完全長界面活性
剤-可溶化されたTSHRによりコートされたELISAプレートウェルに添加し、室温で2時間、
振盪しながら(500rpm)インキュベーションした。次に、ウェルの内容物を除去し、ウェル
を洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続
きTSHR260-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μ
Lを添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空
にし、洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts社, El
y, Cambridge UK)100μLを添加し、このプレートを暗所で45分間インキュベーションした
。その後、停止溶液(1M NaOH)100μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおい
て405nmで読み取った。結果を、OD405nm吸光度値として表し、各試料中のTRAbの濃度を、
ヒトモノクローナルTSHR自己抗体K1-70により作製された標準曲線を使用し、計算した。
（TSHR260-AP変異体の熱安定性）
前述のように昆虫細胞において発現され且つ上清から収集されたTSHR260-AP変異体(配
列番号に関して「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)を、0.2g/L
MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈し、TSHR260-AP架橋ELISAにおい
て好適な吸光度を生じた(図13b)。150μLアリコートを、50℃、60℃、又は65℃で、0～3
時間加熱した。試料100μLを、2つ組で、前述のTSHR260-AP架橋ELISAに適用した(図13b)
。アッセイデータを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、変異体の
半減期(t1/2)を計算し、TSHR260-AP WT(図15及び16；配列番号:59及び60)、TSHR260-AP-J
MG22又はTSHR260-AP-JMG45(「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」にお
いて先に規定)と比較した。
（TSHR260架橋阻害ELISA）
前述のTSHR260架橋ELISAは、複合されないTSHR260及びTSHR260-Mab複合体を検出する阻
害ELISAを形成するために改変することができる(図13c)。このアッセイにおいて、出発緩
衝液(TRAb ELISAについて記載；Bolton J,らの文献、(1999) 前掲)75μL及び1μg/mL M22
IgG又は1μg/mL K1-70 IgGの75μLを、完全長界面活性剤-可溶化TSHRでコートされたELI
SAプレートウェルへ添加し、且つ室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーション
した。次にウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8
)、1％トリトンX-100)で洗浄し、引き続き被験試料(すなわち、非標識化TSHR260又はTSHR
260-Mab複合体)を1ウェルにつき100μL添加した。室温で1時間振盪しながら(500rpm)イン
キュベーションした後、ウェルの内容物を除去し、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、TSHR26
0-AP(0.2g/L MgCl2-6H2O及び2g/L BSAを含有する洗浄緩衝液中に希釈した)100μLを添加
した。室温で30分間振盪しながら(500rpm)インキュベーションした後、ウェルを空にし、
洗浄し(3回)、且つp-ニトロフェニルリン酸(pNpp)基質(Europa Bioproducts Ltd, Ely, C
ambridge UK) 100μLを添加し、このプレートを45分間インキュベーションした。その後
、停止溶液(1M NaOH)50μLを添加し、吸光度を、ELISAプレートリーダーにおいて405nmで
読み取った。未標識のTSHR260を含む被験試料による標識されたTSHR260結合(すなわち、T
SHR260-AP)の阻害は、以下のように表現した：100×(1－緩衝液のみの405nmの吸光度に対
する被験試料の405nm吸光度の比)。
最初の出発材料と、陰イオン又は陽イオン交換のいずれかのクロマトグラフィー上で精
製した後の溶出したTSHR260のプールの、異なる容積でのTSHR260活性の比較を容易にする
ために、各被験試料の活性は、希釈していない溶出物質に対する希釈係数として表した。
（ヒトTSHRの凸面に対するモノクローナル抗体の作製）
TSHR260の部分精製において使用したTSHRの凸面に対する2H11、25E1、23H4、9B7及び36
F11 TSHRマウスモノクローナル抗体を、cDNA免疫化により調製した。簡単には、6～8週齢
のOF1(非近交系)マウスに、10μMカルディオトキシン100μlを、筋肉内注射し、その5日
後完全長TSHR cDNA (pRC/CMVhTSHR；Odaらの文献、(1998) 前掲)100μgにより、筋肉内免
疫化した。TSHR DNA免疫化は、3週間間隔で、合計5回注射を繰り返した(Hasanらの文献、
(1999) J. Immunol. Methods, 229:1-22)。TSHRに結合するビオチン-標識した14C4 IgGの
阻害により、マウス出血液を、TSHRの凸面に対する抗体の存在について試験した(RSR社,
Cardiff, UKにより製造されたアッセイ)。モノクローナル抗体を、血清中に最高TSHR抗体
力価を持つマウス由来の脾臓細胞を用いて作製した。単離した脾臓細胞を、マウス骨髄腫
細胞系(Sp2/O-Ag14))と、標準手順(de St Groth, S. F.及びScheidegger, D.の文献、(19
80) Journal of Immunological Methods, 35, 1-21)を用い、融合した。細胞を、DMEM(ハ
イブリッドを選択するためにHATを含有する15％ウシ胎仔血清を補充した)中で培養し、96
-ウェルプレートにプレーティングした。TSHRの凸面に対する抗体を得るために、細胞培
養物由来の上清を、ELISAプレートウェル上にコートされたTSHRに結合するビオチン標識
された14C4 IgGの阻害により、スクリーニングした。完全長TSHRが4E31(TSHRのC末端に対
する抗体)を使用しELISAプレートウェルに結合されるこれらのアッセイにおいて、培養物
上清中のTSHR抗体は、固定されたTSHRへ結合し、且つTSHRの凸面に対する抗体(すなわち
、14C4結合部位と重複している)を含むウェルは、ビオチン標識化された14C4のTSHRへの
結合を阻害する。陽性ウェル由来の細胞を、限界希釈により2回再クローニングし、必要
なモノクローナル抗体を発現しているクローンを得る。
（TSHR260及びTSHR260-JMG55の調製）
High-Five(商標)昆虫細胞(Invitrogen社からのBTI-TN-5B1-4)を、Insect Xpress培地(L
onza社)において維持した。2L又は0.2Lの振盪-フラスコに、細胞密度およそ1.00×106個
細胞/mLで播種し、27℃で一晩(その時点以降、温度は23℃に低下した)110rpmでインキュ
ベーションした。細胞を、バキュロウイルスストックにより、Bac-to-Bacシステム(Invit
rogen社)を用いて、感染多重度(MOI)0.012pfu/mLで感染させた。TSHR260(図4；配列番号:
4)又はTSHR260-JMG55のいずれかを含む培養物上清を、感染後120時間で、500gで10分間の
4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagn
ostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後精製まで-70℃で貯蔵した。
（異なるモノクローナル抗体の存在下でのTSHR260の調製）
High-Five(商標)昆虫細胞を、およそ96時間後に、TSHRモノクローナル抗体(14C4、2H11
、25E1、36F11、9B7又は23H4 IgG)の2mg/Lを培養培地に添加した以外は、TSHR260につい
て前述したように培養し、且つ感染させた。TSHR260-TSHR Mab複合体を含む培養物上清を
、感染後120時間で、500gで10分間の4℃での遠心分離により収集した。上清200mLにつき
完全プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社, Lewes, UK)1錠を添加し、その後個々の
複合体のPIによって決まる陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによ
る精製まで、-70℃で貯蔵した。
（TSHR260の精製）
TSHR260を含む培養物上清(100mL)を、HPLC等級の水により1：1希釈し、2Mトリスを用い
、pH9.0に調節し、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために、ストリームラ
インDEAEマトリクス15mLの上に装加した。このカラムを、10mMトリス-HCl(pH9.0)、50mM
NaClにより洗浄し、引き続き500mM NaCl及び10mMトリス-HCl(pH9.0)により溶出した。溶
出した物質を、50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH8.0)に対して透析した。溶出画分中のTSHR
260の存在は、アミノ酸246-260内のTSHRエピトープと反応性であるマウスモノクローナル
抗体(TSHR MAb 18C5、Jeffreys Jらの文献、2002) 前掲)(10μg/mL)を使用する、ウェス
タンブロット分析、及びTSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定した活性(図13c)により確認
した。
（14C4、2H11、25E1、23H4、36F11又は9B7 TSHRモノクローナル抗体の存在下でのTSHR2
60の精製）
TSHR260-14C4-IgG複合体を含有する培養物上清(200mL)を、未複合のTSHR260に関して前
述したように、HPLC等級の水により1：1希釈し、2Mトリスを用い、pH9.0に調節し、スト
リームラインDEAEマトリクス15mLの上に装加し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより
精製した。
TSHR260-2H11-IgG、TSHR260-25E1-IgG、TSHR260-23H4-IgG、TSHR260-36F11-IgG又はTSH
R260-9B7-IgG複合体を含有する培養物上清(600mL)を、500mM NaH2PO4によりpH6.3に調節
し、陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製のために、ストリームラインダイレクト
HSTマトリクス10mL上に装加した。このカラムを、50mM NaH2PO4(pH6.0)、50mM NaClによ
り洗浄し、引き続き50mM NaH2PO4(pH7.0)、50mM NaClにより洗浄し、次に50mM NaH2PO4(p
H8.0)、50mM NaClに溶出した。溶出画分中のTSHR260の存在は、アミノ酸246-260内のTSHR
エピトープと反応性であるマウスモノクローナル抗体18C5(TSHR-MAb 18C5、Jeffreys Jら
の文献、(2002) 前掲) (10μg/mL)を使用する、ウェスタンブロット分析、及びTSHR260架
橋阻害ELISAにおいて測定した活性(図13c)により確認した。
（TSHR260-JMG55の精製）
下記のものと同等な精製を、本発明の他の変異体に使用することができる。TSHR260-JM
G55は、以下を使用するカラムクロマトグラフィーの3ラウンドにより精製した：a)ストリ
ームラインダイレクトHSTマトリクス上の陽イオン交換クロマトグラフィー；b)セファロ
ースに結合した14C4上のモノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィー；及び、c)
ニッケル-アフィニティクロマトグラフィー。TSHR260-JMG55を含有する培養物上清(12L)
を、500mMリン酸ナトリウム(NaH2PO4)により、pH6.0に調節した。ツイーン80を最終濃度0
.015％v/vまで添加し、培養物上清を、ストリームライン25拡張床クロマトグラフィーシ
ステム(GE Healthcare社)中のストリームラインダイレクトHSTマトリクス75mL上に装加し
た。2つの更なる12Lのバッチを、個別の実験において同じ様式で処理した。
このカラムを、0.015％v/vツイーン80を含有する50mM NaH2PO4(pH6.0)、50mM NaClで洗
浄し、引き続き0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH7.0)で
洗浄し、次に0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)によ
り溶出した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、アミノ酸36-42内のTSHRエピトープと
反応するマウスモノクローナル抗体8E2(TSHR-MAb 8E2、Jeffreys J らの文献、(2002) 前
掲)(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおいて
測定された活性により確認した(図12a)。試料はまた、TSHR260及びTSHR260-IgG複合体の
ストリームライン精製と比較するために、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて分析した(図13c
)。
TSHR260-JMG55は、CNBr-活性化セファロース4B(Sigma社)に結合された、TSHR細胞外ド
メインのアミノ酸22-261内の立体配座エピトープに結合するマウスモノクローナル抗体14
C4を使用する、アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製した(Jeffreys Jらの文
献、(2002) 前掲)。特に、3つのストリームラインカラム溶出物からプールされたTSHR260
-JMG55を、7mLの14C4-アフィニティカラム上に装加し、0.015％v/vツイーン80を含有する
100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)により洗浄した。14C4-アフィニティカラムは、pH5.
0の溶出緩衝液(100mM NaCl、100mMクエン酸塩、0.015％v/vツイーン80)、引き続きpH4.5
の溶出緩衝液により、連続溶出した。溶出画分を、等量の中和緩衝液(0.5mMトリス-HCl(p
H8.0)、0.015％v/vツイーン80)に収集し、引き続き0.015％v/vツイーン80を含有する100m
M NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透析した。pH5.0で溶出された画分(TSHR260-JMG55-5.0
)及びpH4.5で溶出された画分(TSHR260-JMG55-4.5)を個別にプールし、透析した。これら
の溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗体8E2(10μg/mL)を使用
するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイを使用し測定された活性により
確認した(図12a)。
透析されたTSHR260-JMG55-4.5は、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを用い、
更に精製した。TSHR260-JMG55は、最終濃度10mMイミダゾール(pH8.0)に調節し、Akta 10
プラットフォーム(GE Healthcare社)を使用するNiNTA-HiTrap 1mL固定化金属アフィニテ
ィカラム(IMAC)HPカラム(GE Healthcare社)上に装加し、洗浄緩衝液(100mM NaCl、50mMト
リス-HCl(pH8.0)、0.015％v/vツイーン80)中の10mMイミダゾール(pH8.0)により洗浄し、
洗浄緩衝液中の150mMイミダゾール(pH8.0)により溶出した。溶出したTSHR260-JMG55-4.5
をプールし、0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透
析し、-70℃で貯蔵した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗
体8E2(10μg/mL)を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおい
て測定された活性により確認した(図12a)。精製されたTSHR260-JMG55-4.5の濃度は、1吸
光度単位は、TSHR260-JMG55の1.43mg/mLと等しいこと(この吸光係数は、DNASTAR Protean
V.9.1.0を用いて得られる)を基に、280nmの吸光度から計算した。この濃度は、SimplyBl
ue SafeStain(Invitrogen社)により染色した、12％非還元SDS-PAGEゲル上を泳動した物質
のImage Labソフトウェア(Bio-Rad社)を使用するデンシトメーター分析により確認した。
透析されたTSHR260-JMG55-5.0も、IMACニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを用
い、更に精製した。TSHR260-JMG55-5.0は、Akta 10プラットフォーム(GE Healthcare社)
を使用するNiNTA-HiTrapカラム(GE Healthcare社)上に装加し、洗浄緩衝液により洗浄し
、次に洗浄緩衝液中の150mMイミダゾール(pH8.0)により溶出した。溶出したTSHR260 JMG5
5-5.0は、次に0.015％v/vツイーン80を含有する100mM NaCl、50mMトリス-HCl(pH8.0)へ透
析した。溶出画分中のTSHR260-JMG55の存在は、マウスモノクローナル抗体8E2(10μg/mL)
を使用するウェスタンブロット分析、及びTSHR260-結合アッセイにおいて分析された活性
により確認した(図12a)。精製されたTSHR260-JMG55-5.0の濃度は、1吸光度単位は、TSHR2
60-JMG55の1.43mg/mLと等しいこと(この吸光係数は、DNASTAR Protean V.9.1.0を用いて
得られる)を基に、280nmの吸光度から計算した。この濃度は、SimplyBlue SafeStain(Inv
itrogen社)により染色した、12％非還元SDS-PAGEゲル上を泳動した物質のImage Labソフ
トウェア(Bio-Rad社)を使用するデンシトメーター分析により確認した。
（TSHR260-JMG55-4.5コートされたELISAプレートウェルアッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(5μg/mL
BSAを含有する15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.
2)中の精製したJMG55-TSHR260-4.5の4μg/mL又は0.4μg/mLの150μLアリコートでコート
し、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス(
pH7.8)；1％v/v トリトンX-100)で3回洗浄し、引き続き250μLのポスト-コート緩衝液(15
4mM NaCl、58mMショ糖、3g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウム)により1時間インキュベーシ
ョンした。ウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、アッセイ緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(
pH7.8)、1％v/v トリトンX-100、1g/L BSA) 75μL及び健常血液ドナー血清プール(NPS) 7
5μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながらインキュ
ベーションした。その後、ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、濃度範囲(0.25～7
.5μg/mL)の100μLのM22 Fab-ペルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD, RSR社, Cardif
f, CF23 8HE, UK)、K1-70 IgG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-70-POD)又はK1-18 I
gG-ペルオキシダーゼコンジュゲート(K1-18-POD)のいずれかを、各ウェルに添加した。室
温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを再度洗浄し、引き続
きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、更に室温で25分間、振盪せずにインキュベー
ションした。反応を、50μLの0.5M H2SO4の添加により停止し、各ウェルの吸光度を、ELI
SAプレートリーダー上で450nmで読み取った(図12d)。
（TSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化）
脱グリコシル化は、本発明の他の変異体へ、下記のように適用することができる。脱グ
リコシル化反応は、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)中で、エンドグリコシダーゼF3(En
do F3, Sigma社)及び5μgのTSHR260-JMG55-4.5の0mU/mg、40mU/mg、60mU/mg及び80mU/mg(
Endo F3:TSHR260-JMG55-4.5 比)を用いて、20℃で、24時間、72時間及び120時間行った。
これらの反応は、12％非還元SDS-PAGE上で、SimplyBlue SafeStain (Invitrogen社)染色
及びTSHRマウスモノクローナル抗体8E2を使用するウェスタンブロットにより、分析した
。TSHR260-JMG55-4.5の分子量の何らかの変化を、Mark12分子量マーカー(Invitrogen社)
を用いて決定した。TSHR260-JMG55-4.5の活性は、脱グリコシル化後、TSHR260-結合アッ
セイにより決定した(図12a)。
（PCRを使用する完全長マウス及びブタTSHR配列への特異的アミノ酸変異の導入）
ブタTSHR完全長ヌクレオチド配列(図17；配列番号:61)を、ブタの甲状腺cDNAライブラ
リー(EP 1021721B1)からクローニングした。簡単には、総RNAを、酸フェノールグアニジ
ン法(P Chomczynski、N Sacchiの文献；グアニジウムチオシアン酸-フェノール-クロロホ
ルム抽出によるRNA単離の単工程法(Single step method of RNA isolation by guanidini
um thiocyanate-phenol-chloroform extraction)；Analytical Biochemistry, 1987；162
: 156-159)を用い、ブタ甲状腺組織2.5gから調製した。mRNAを、DynalビーズmRNA精製キ
ット(Dynal Biotec社；Wirral, CH62 3QL, UK)を用いて調製した。このmRNAを使用し、Za
pExpress cDNA GigapackクローニングキットIII(Stratagene社, Cambridge CB4 4DF UK)
を使ってcDNAライブラリーを作製した。4種の変性オリゴヌクレオチドを、公知のTSHR配
列(マウス、ラット、ヒト、イヌ及びウシ)に作製し、ブタTSHRの2つの断片を、PCRを使用
し増幅した。これらを配列決定し、それらのTSHR cDNAとの相同性を検証し、且つ完全長
ブタTSHRクローンのcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用した。3種の完全
長クローンを入手し、完全に配列決定した。標準クローニング手順を使用し、ブタTSHR c
DNAのコーディング配列を、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)のBamHI及びNotI制限部
位へクローニングした。アミノ酸配列は、図18(配列番号:62)参照。
マウスTSHR完全長ヌクレオチド配列(図19；配列番号:63)を、5'末端のBamHI制限部位及
び3'末端のNotI制限部位を持つように合成し(Geneart, Life Technologies社, Paisley,
UK)、且つ標準クローニング手順を使用し、pcDNA5.1/FRTベクター(Invitrogen社)へクロ
ーニングした。アミノ酸配列は、図20(配列番号:64)参照。
完全長マウス及びブタのTSHR配列中の変異は、ヒトTSHR260について先に説明したQuikC
hange II方式によるPCRを使用する、部位特異的変異誘発により、作製した。変異型ブタT
SHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、各々図21及び22(配列番号:65及び6
6)を、並びに変異型マウスTSHRのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列については、各々図
23及び24(配列番号:67及び68)を参照されたい。ブタ及びマウスTSHRにおけるJMG55と同等
のアミノ酸変異については、表54を参照されたい。
完全長TSHR構築体のFlp-In CHO細胞への安定したトランスフェクションは、「Flp-Inシ
ステムを使用する完全長TSHR構築体のCHO細胞へのトランスフェクション」において先に
詳細に説明したように、実行した。
（完全長マウス及びブタTSHR(野生型及び変異体)の熱安定性）
完全長マウス及びブタTSHRの野生型及び変異体の熱安定性を、「完全長TSHR変異体の熱
安定性」において以下に説明した(図14c)ような、55℃で加熱された4E31-コートされたプ
レートに結合されたTSHRが関与している、安定性アッセイBにおいて試験した(図14c)。
（TSH及びM22による刺激に対する反応におけるマウス及びブタの野生型及び変異型TSHR
の分析）
Flp-Inシステムを使用する、野生型及び変異型TSHR構築体のチャイニーズハムスター卵
巣(CHO)細胞へのトランスフェクションは、WO2006/016121Aに説明されている。
TSH及び甲状腺刺激モノクローナル抗体M22の、野生型及び変異型マウス及びブタTSHRを
発現しているCHO細胞におけるサイクリックAMPの生成を刺激するの能力を、ヒトTSHRに関
する「TSHR刺激の分析」において先に説明したように試験した。
（界面活性剤可溶化された完全長野生型及び変異型TSHRの調製）
完全長野生型又は変異型TSHR(ヒト、ブタ又はマウス)を発現しているCHO細胞を、コン
フルエンスまで成長させ、175cm2細胞培養フラスコから剥離し、且つこの細胞ペレットを
、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を含有する50mM NaCl、10mMトリス-HCl(pH7
.5)により洗浄し、その後同じ緩衝液中でホモジナイズした。12000gで30分間4℃での遠心
分離後、細胞膜を、1％トリトンX-100の添加以外はホモジナイゼーションに使用したもの
と同じ緩衝液(およそ4×108個細胞について緩衝液4mL)中で可溶化した。可溶化された受
容体調製品を、90000gで2時間、4℃で遠心分離し、上清を-70℃で貯蔵した。
（完全長野生型及び変異型TSHRへのTSH結合の分析）
Maxisorpアッセイチューブ(Nunc社)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO
3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の10μg/mL 4E31-Fab2の200μLアリ
コートによりコートし、37℃で90分間、その後4℃で一晩インキュベーションした。ウェ
ルを、アッセイ緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス-HCl(pH7.8)、1％トリトン-X-100)により3
回洗浄した。完全長TSHR調製品を、アッセイ緩衝液中に希釈し、200μLアリコートを、4E
31-コートされたチューブ内で、4℃で一晩インキュベーションした。ウェルは、アッセイ
緩衝液で3回洗浄した。アッセイ緩衝液中の非標識TSH 50μL、125I-標識されたTSH(アッ
セイ緩衝液中30,000cpm)50μL及び出発緩衝液(50mM NaCl；20mMトリス-HCl(pH7.8)、1％
トリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)50μLを、コートされたチューブに適用
し、室温で2時間、穏やかに振盪しながらインキュベーションし、アッセイ緩衝液1mLで2
回洗浄し、ガンマカウンターにおいてカウントした。結合TSH、対、結合／未結合TSHの濃
度を、プロットし(G Scatchardの文献、(1949)、Annals of the New York Academy of Sc
iences, 51: 660-672)、会合定数を誘導した。
（TSHR-JMG55のTMDにおける熱安定化変異）
更にTSHRのLRDにおいて確定された熱安定化変異に対し、TSHR-JMG55のTMDの配列を試験
し、更なる熱安定化変異が、TSHRのこのドメインで確定できるかどうかを決定した。以下
の3つの原理を使用し、TSHRのTMD内の可能性のある熱安定化変異を予測した：i) 他の生
物のTSHR相同体のコンセンサス配列を使用し、可能性のある熱安定化変異を確定した；ii
) TSHRのより低い基本cAMPシグナル伝達活性を生じる変異(SSFAデータベースから検索(ww
w.ssfa-gphr.de)；Kreuchwig Aらの文献、(2013) Mol Endocrinol. 8: 1357-63)を、これ
らは、GPCRに関して、活性立体構造よりもより熱安定性であるTSHRの不活性立体構造を安
定化し得るので、試験した；並びに、iii) 他のGPCR、すなわち、β1-アドレナリン受容
体(β1AR、Serrano-Vegaらの文献、(2008) PNAS, 105: 877-82；Miller JL及びTate CGの
文献、(2011) J. Mol. Bio. 413: 628-38)、A2Aアデノシン受容体(A2AR；Dore ASらの文
献、(2011) Structure, 19: 1283-93)、NTS1ニューロテンシン受容体(NTS1R；Egloff Pら
の文献、(2014) PNAS, 111: E655-62；Shibata Yらの文献、(2009) J. Mol. Bio. 390: 2
62-277)、及びコルチコトロピン-放出因子受容体-1(CRF1R；Hollenstein Kらの文献、(20
13) Nature, 499: 438-443)において熱安定化するとして確定された変異を、TSHRへ移入
した。合計で56種の可能性のある熱安定化変異が、確定され：10種のTSHRコンセンサス変
異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、及び1種の変異Y601A、これは、
TSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方である
(表59)。
標準クローニング手順に従い、TSHR-JMG55完全長ヌクレオチド配列を、BamHI及びXhoI
制限部位を使用し、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen社)へクローニングした。完全長TSH
R-JMG55配列中の変異を、TSHR260変異について先に説明したQuikChange II方式のPCRを使
用し、部位特異的変異誘発により作製した。このPCR反応は、形質転換し、増大し、且つ
これらの変異は、TSHR260 PCR産物に関して先に説明したように配列決定することにより
検証した。大量のプラスミドDNAを、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地における、50
mL培養物の成長により、得た。プラスミドDNAは、Qiagen Plasmid Plus Midi Kit(Qiagen
社, Manchester, M15 6SH, UK)を用い、一晩培養した細胞ペレットから抽出した。
（Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフ
ェクション）
トランスフェクションの前日に、2.2×105個CHO-K1細胞/ウェルを、90mm細胞培養皿(Nu
nc社)へ播種した。トランスフェクトされるべき各90mm皿について、pcDNA3.1(+)中のTSHR
-JMG55変異体30μgを、Optipro SFM (Life Technologies社, Paisley, PA4 9RF, UK)600
μLと混合した。Optipro SFM 540μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies
社)60μLを、各DNA/Optipro SFM混合物へ添加し、室温で10～20分間インキュベーション
した。1200μL DNA/Freestyle Max混合物を、90mm皿中のCHO-K1細胞へ添加し、37℃で40
～48時間インキュベーションした。細胞単層を4mL PBSですすぐことにより、TSHR-TMD変
異体を発現しているCHO-K1細胞を収集し、次にスクレーピングによりこれらの細胞を1mL
PBS中に収集し、細胞を移した。これらの細胞を、1.5mLバイアル中で、13000rpmで1分間
遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを-70℃で貯蔵した。必要ならば、各細胞ペレ
ットを、可溶化緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、完全プロ
テアーゼ阻害剤(Roche社))1mL中に懸濁することにより可溶化し、且つ氷上で少なくとも3
0分間インキュベーションした。その後この物質は、直ちに使用するか、又は-70℃で貯蔵
した。
TSHR-JMG55標準は、pcDNA3.1+中のTSHR-JMG55により、90％コンフルエンスのCHO-K1細
胞を含む80cm2フラスコでトランスフェクトすることにより作製した。各80cm2フラスコに
ついて、pcDNA3.1中のTSHR-JMG55の40μgを、Optipro SFM(Life Technologies社)800μL
と混合し、次にOptipro SFM 720μL中に希釈したFreestyle Max試薬(Life Technologies
社)80μLを、DNA/Optipro SFM混合物に添加し、室温で10～20分間インキュベーションし
た。DNA/Freestyle Max混合物1.6mLを、CHO-K1細胞の各80cm2フラスコへ添加し、37℃で4
0～48時間インキュベーションした。細胞単層をPBS 10mLですすぐことにより、TSHR-JMG5
5標準を発現しているCHO-K1細胞を各80cm2フラスコから収集し、次にスクレーピングによ
りこれらの細胞をPBS 2mL中に収集し、細胞を移した。全てのフラスコからの細胞をプー
ルし、1.5mLバイアル中1mLアリコートで、アリコート化した。細胞を、13000rpmで1分間
遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを-70℃で貯蔵した。必要ならば、各細胞ペレ
ットを、可溶化緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、完全プロ
テアーゼ阻害剤(Roche社))500μL中に懸濁することにより可溶化し、且つ氷上で少なくと
も30分間インキュベーションした。その後この物質は、直ちに使用するか、又は-70℃で
貯蔵した。TSHR-JMG55標準は希釈し、これが14C4-コートされたELISAプレートウェルによ
るTSHR-結合アッセイ(下記「TSHR-結合アッセイ」に記載、図14a)において、「Freestyle
Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」にお
いて規定したような、14C4-コートされたELISAプレートウェルによるTSHR260-結合アッセ
イ(図12a)でもたらされるTSHR260-WT標準と同じ活性をもたらすようにした。これは14C4-
活性100U/mLを有するものとして規定した。同様に、4E31-コートされたELISAプレートウ
ェルへのTSHR結合アッセイ(図14a)においてアッセイした同じ試料を使用し、4E31-活性10
0U/mLと規定した。更に各々、14C4-及び4E31-コートされたELISAプレートウェルによるTS
HR-結合アッセイにおいて検出した時に、TSHR-JMG55標準試料を、第一のTSHR-JMG55標準
と同じ濃度になるよう希釈した。
（TSHR-結合アッセイに使用した抗体）
(4E31)
「TSHR260-AP架橋ELISAにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(14C4)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
(M22)
「TSHR260結合アッセイにおいて使用した抗体」において先に詳述した。
（TSHR-結合アッセイ）
Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティング緩衝液(15mM Na2
CO3、35mM NaHCO3、1.5mM NaN3、0.01g/Lフェノールレッド、pH9.2)中の1μg/mL 14C4-Fa
b2(Jeffreys Jらの文献、(2002) 前掲、及びSanders Jらの文献、(2007) 前掲)又は1μg/
mL 4E31-Fab2(EP 1021721B1、Boltonらの文献、(1999) 前掲)の150μLアリコートにより
コートし、室温で3時間、次に4℃で一晩インキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液
(50mM NaCl；20mMトリス(pH7.8)；1％v/vトリトンX-100)で3回洗浄し、且つTAT緩衝液(50
mM NaCl、10mMトリス(pH7.8)、1％v/vトリトンX-100、1g/L BSA、0.2g/Lアジ化ナトリウ
ム)中に希釈した被験試料(一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR
)150μLを、各ウェルに適用し、室温で1時間又は4℃で一晩インキュベーションし、TSHR
を、14C4-Fab2又は4E31-Fab2コートされたプレートへ結合させた。
次にこれらのウェルを、洗浄し、アッセイ緩衝液(50mM NaCl、20mMトリス(pH7.8)、1％
v/vトリトンX-100、1g/L BSA、50mg/L正常マウスIgG)75μL及び健常血液ドナー血清プー
ル(NPS)75μLと共に、室温で1時間、ELISAプレート振盪機上で1分間に500回振盪しながら
インキュベーションした。その後ウェルの内容物を空にし、ウェルを洗浄し、M22 Fab-ペ
ルオキシダーゼコンジュゲート(M22-POD, RSR社, Cardiff, CF23 8HE, UK)100μLを各ウ
ェルに添加した。室温で振盪せずに25分間インキュベーションした後、プレートウェルを
、再度洗浄し、引き続きテトラメチルベンジジン100μLを添加し、室温で振盪せずに25分
間更にインキュベーションした。反応を、0.5M H2SO4 50μLの添加により停止し、各ウェ
ルの吸光度を、ELISAプレートリーダー上で450nmで読み取った(図14a)。
各変異体に関して、14C4-コートされたプレート及び4E31-コートされたプレートの両方
に結合したアッセイにおけるそれらの活性を測定し、「Freestyle Max試薬を使用するTSH
R260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」及び「Freestyle Max試薬を
使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」において規定
されたような、TSHR260-結合アッセイにおいて14C4-コートされたプレートに結合されたT
SHR260-WT標準(100U/mL)と同じ活性を持つように希釈された14C4-コートされたプレート
に結合されたTSHR-JMG55標準と比較した。
（完全長TSHR変異体の熱安定性）
TSHR変異体の熱安定性を、以下の3つの異なる様式で測定した：A) 14C4-コートされたE
LISAプレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14b)；B) 4E31-コートされたELISA
プレートウェルに結合されたTSHR変異体の加熱(図14c)；及び、C) 溶液中のTSHR変異体の
加熱、その後アッセイのためのそれらの4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合
(図14d)。
熱安定性アッセイA及びB：Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コ
ーティング緩衝液中の14C4-Fab2(熱安定性アッセイA)1μg/mL又は4E31-Fab2(熱安定性ア
ッセイB)1μg/mLの150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、その後4℃で一晩イ
ンキュベーションした。ウェルを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、TAT緩衝液に希釈された被験
試料(一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞から収集されたTSHR)150μLを、各ウェル
に適用し、4℃で一晩インキュベーションし、TSHRを14C4-又は4E31-コートされたELISAプ
レートウェルに結合させた。プレートを、洗浄緩衝液で3回洗浄し、14C4-Fab2又は4E31-F
ab2に結合していないあらゆるTSHRを除去した。TAT緩衝液を、各ウェルに添加し(150μL)
、その後接着プレートカバーを適用し、ウェルを密封した。その後各プレートを、45℃又
は55℃に設定した水浴中に配置した。最大180分の期間の後、96-ウェルプレートの1スト
リップ(8ウェル)を、各プレートから取り外し、スペアELISAプレートラックに挿入し、そ
の後これを氷上で維持した。180分の時間経過が完了した後、この受容体希釈緩衝液を、E
LISAプレートウェルから吸引し、前述のTSHR-結合アッセイ(図14a)を継続した。アッセイ
データを、時間に対してプロットし、指数関数曲線にフィットさせ、変異体の半減期(t1/
2)を計算し、TSHR-JMG55又は別のTSHR変異体と比較した。
熱安定性アッセイC：Maxisorp 96-ウェルELISAプレート(Nunc社)のウェルを、コーティ
ング緩衝液中の4E31-Fab2 1μg/mLの150μLアリコートによりコートし、室温で3時間、そ
の後4℃で一晩インキュベーションした。CHO-K1細胞において一過性に発現されたTSHR変
異体を、可溶化緩衝液中に希釈した。100μLアリコートを、33℃又は40℃で0～2時間加熱
した。その後試料を、TAT緩衝液(試料83.3μL＋TAT緩衝液250μL)中に1/4希釈し、150μL
アリコートを、2つ組で、4E31-コートされたELISAプレートウェルに適用し、これを洗浄
緩衝液で3回洗浄し、TSHR-結合アッセイ(図14a)を前述のように実行した。アッセイデー
タを、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰式にフィットさせた。10、30及び12
0分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、計算し、且つTSHR-JMG55又は他のTSHR
変異体と比較し、10、30及び120分での生存比を生じた。
（結果）
（単一変異）
本発明者らの実験において、TSHR260の239の単一変異体を調製し、発現させた。特にそ
のアミノ酸のMet22からLeu260までの各残基を変異させたものは、各位置で最も熱安定で
あると推定した(表1)。これらの変異体を、TSHR260-結合アッセイにおいて結合及び安定
性について、スクリーニングした(図12a、b、表2)。このスクリーンで確定された64種の
最良候補の42℃での半減期を決定し、且つ野生型TSHR260(TSHR260-WT、平均t1/2＝30.7±
1.1分)と比較し、変異体とTSHR260-WTの間の半減期の差(Δt1/2)、及び変異体半減期とTS
HR260-WT半減期の間の安定性比を生じた(表3)。これらの熱安定性曲線は、42℃でのタン
パク質の半減期の17分間の増加をもたらし、TSHR260-WTの熱安定性が少なくとも60％有意
に向上された、17種の変異を確定した(P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D
143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y)(図5及び6
；配列番号:11-25、27-43、45及び46)(表3)。最良の単一変異体I253R(配列番号:45)は、4
2℃での熱安定性をTSHR260-WTよりも3.0±0.4倍向上し、すなわち、42℃でのTSHR260の半
減期を、53±6分だけ増大した(図7a)。これはまた、50℃での熱安定性をTSHR260-WTより
も2.85±0.13倍向上した。
驚くべきことに、最良の熱安定化作用を有した17種の変異は、TSHR260構造全体に分布
しているが(図9)、ほとんどは、凸面上、又はLRDの凸面と凹面の端部にあった。7種は凸
面上にあり(P142I、D143P、S166T、I167F、P168Y、V169R、及びN170W)、6種はLRDの端部
にあり(T62V、H63C、L64Y、R112P、T179C、R255Y)；3種のみが、凹面上にあり(L59F、D15
1E及びI253R)、並びにP28Eは、結晶構造においては認められない。Leu59及びIle253は、
凹側にあるが、結晶構造においてM22-Fabとは相互作用しない(PDBコード3G04；Sanders J
らの文献、(2007) 前掲)。これらの熱安定化変異体の、Asp151は、M22-Fabと直接相互作
用し、結晶構造において示された塩橋を形成する、唯一の残基である。結果的に、Asp151
は、塩橋相互作用を維持するように、別の陰性アミノ酸Gluへ変異される。
（ドットブロット結果(発現されたTSHRの総量、すなわち、活性＋不活性TSHRを決定す
るため)）
TSHR260-結合アッセイにおいて検出されたTSHR260の量は、異なる変異体について変動
し(TSHR260-WTの0％～1000％)、従って発現された各変異体の総量は、ドットブロットア
ッセイを使用し測定した。ドットブロットアッセイの結果は、表4に示している。ドット
ブロットアッセイにより測定された発現レベルは、TSHR260-WTに対して規定し、且つ同じ
くTSHR260-WTに対して規定したTSHR260-結合アッセイの結果と比較した。TSHR260-結合ア
ッセイの結果とドットブロットの結果の間の比は、(TSHR260-結合÷ドットブロット)で計
算し、ドットブロットアッセイにおいて検出されたTSHR260の総量と、TSHR260-結合アッ
セイにおいて検出された活性TSHR260の量の間に大きい解離が存在する場合を決定した。
（二重変異体）
TSHR260の二重変異体は、表5に示したように、変異P142I(配列番号:35)及びI253R(配列
番号:45)を、最良の安定化変異に加えることにより作製し；変異体JMG1－JMG15及びJMG31
は、P142Iを伴う二重変異体である。変異体JMG15－JMG29は、I253Rを伴う二重変異体であ
る。P142Iは大きい熱安定化の影響を有し、TSHR260の熱安定性を5倍向上するが、これは
非常に低レベルで発現された。この低い発現レベルはまた、P142Iを含む二重変異体の場
合にも認められた。従って、更なる変異誘発及び熱安定性アッセイは、I253R変異体にの
み継続した。
P142I同様、単一変異体T62V、L64Y、P142I、I167F、P168Y、N170W及びT179Cは、低い発
現レベルを有し(表4)、このことは、これらの変異を含む二重及び三重変異体においても
認められた。実際問題として、これらは、更なる変異体組合せには、使用しなかった。
二重変異の安定性は、42℃(表6)及び50℃(表7)の両方で測定した。試験した二重変異は
全て、TSHR260-WT及び単一変異体TSHR260-I253Rに比べ熱安定性を向上した。最も熱安定
性の二重変異体は、JMG22(I253R＋D143P)(各々、配列番号:45及び36)であり、これは、TS
HR260-WTの熱安定性を42℃で9.3±0.5倍及び50℃で15.1±0.7倍向上し、各々、半減期261
±45分及び23.8±0.7分をもたらした(図7a、b)。
（三重変異体）
変異体JMG30－JMG42は、変異D143P(配列番号:36)を最も安定化している二重変異に加え
た、TSHR260の三重変異体である(表5)。2種の三重変異体I167F＋D143P＋I253R及びT179C
＋D143P＋I253Rは、それらの各二重変異体JMG25(I167F＋I253R)及びJMG29(T179C＋I253R)
は発現レベルが悪かったので、作製しなかった。
熱安定性曲線を、50℃で三重変異体について確立し、I253Rの50℃での熱安定性と比較
した(表8)。最も熱安定性の三重変異体は、JMG37(I253R＋D143P＋R112P)(各々、配列番号
:45、36及び34)であり、これは、50℃での半減期69±3分を有し、且つTSHR260-I253Rより
も16.6±0.5倍大きい熱安定性であった(図7b、c)。
（四重変異体）
変異体JMG43－JMG48は、変異R112P(配列番号:34)を最も安定化している三重変異体に加
えた、TSHR260の四重変異体である(表5)。熱安定性曲線を、50℃及び55℃で四重変異体に
ついて決定し、これらの温度でのI253Rの熱安定性と比較した(表8及び表9)。最も熱安定
性の四重変異体は、JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)(各々、配列番号:45、36、34及
び37)であり、これは、50℃での半減期226±31分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも58±6
倍大きい熱安定性であった(図7c)。55℃で、これは半減期27±3分を有し、且つTSHR260-I
253Rよりも54±7倍大きい熱安定性であった(図7d)。60℃で、これは、半減期2.40±0.16
分を有した。
（五重変異体）
変異体JMG49－JMG52は、D151E(配列番号:37)を四重変異体に加えた、TSHR260の五重変
異体である(表5)。最も熱安定性の五重変異体は、JMG52(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V
169R)(各々、配列番号:45、36、34、37及び41)であった(表9及び表10)。これは、55℃で
の半減期66±12分を有し、且つTSHR260-I253Rよりも125.1±0.6倍大きい熱安定性であっ
た(図7d)。60℃で、これは半減期7.1±0.6分を有し、且つTSHR260-JMG45よりも3.0±0.2
倍大きい熱安定性であった(図7e)。
（六重変異体）
六重変異は、五重変異体JMG50にS166T(配列番号:38)又はV169R(配列番号:41)変異を加
えることにより作製し、JMG54(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H63C＋S166T)(各々、配列
番号:45、36、34、37、32及び38)及びJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H63C＋V169R)
(各々、配列番号:45、36、34、37、32及び41)を生じた(表5及び表10)。これらは、55℃で
正確に測定するにはあまりにも熱安定性であり、そのため熱安定性は60℃で測定した(図7
e)。JMG54は、60℃で半減期9.6±1.5分を有し、TSHR260-JMG45よりも4.0 ±0.4倍大きい
熱安定性であった。JMG55は、60℃で半減期13±3分を有し、TSHR260-JMG45よりも5.2±0.
9倍大きい熱安定性であった。JMG55は、TSHR260-JMG45よりも5.2倍大きい熱安定性であり
、これはTSHR260-I253Rよりも56倍より大きい熱安定性であり、これは次にTSHR260-WTよ
りも3.1倍より大きい熱安定性であった。他の熱安定性比の比較は、要素の安定性比を、
積算し、全体の熱安定性比を得ることができることを示唆している(表12)。従って、JMG5
5は、TSHR260-WTよりもおよそ900倍大きい熱安定性である。
（37℃での熱安定性）
最も安定した単一、二重、三重、四重、五重及び六重TSHR260変異体(I253R、JMG22(I25
3R＋D143P)、JMG37(I253R＋D143P＋R112P)、JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、JMG52
(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)及びJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋
H63C))の熱安定性を、TSHR260-WTに対し37℃で測定した。これらの変異体の半減期を、37
℃での熱安定性曲線から計算し、且つ表11に示している。表11はまた、TSHR260-WTと比較
した各変異体の安定性比も示している。これらは、他の温度で観察された安定性比(表12)
と一致する。
（温度範囲で最も熱安定な変異体の熱安定性の比較）
TSHR260-WTと比較した変異体の安定性比は、異なる温度で、すなわち、42℃及び50℃で
、大きくは変化しない。50℃以上では、TSHR260-WTは安定ではなく、これは参照調製品と
して使用することはできない。従って、より好適な変異体を、代わりに選択した。次に参
照としてのこのより安定した変異体で得られた安定性比を、TSHR260-WTと比べ安定した参
照変異体の安定性比で積算した(表12)。例えば、JMG37は、55℃で、TSHR260-WTよりも3.1
倍より熱安定性であるI253Rよりも12.0±0.9倍より熱安定性である。従って、JMG37は、5
5℃でTSHR260-WTよりも12.0×3.1＝37±3倍より熱安定性であると計算され、これは37℃
でのTSHR260-WTに対する測定された熱安定性比(34±5倍)に良く対応している。
（14C4プレート上にコートされた完全長TSHR及び変異体の熱安定性）
14C4-Fab2でコートされたELISAプレートに結合された完全長TSHR-WT(配列番号:2)、TSH
R-JMG37(配列番号:45、36、34)、TSHR-JMG45(配列番号:45、36、34、37)、TSHR-JMG52(配
列番号:45、36、34、37、41)及びTSHR-JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)の熱安
定性を、プレートを42℃又は50℃で加熱することにより、決定した。予想外に、完全長TS
HR変異体であるTSHR-JMG37、TSHR-JMG45、TSHR-JMG52及びTSHR-JMG55は、TSHR-WTよりも
かなりより熱安定性であった(表13、表14)。50℃で、TSHR-WTは半減期33分を有し、TSHR-
JMG37は半減期110分を有し、且つTSHR-WTよりも3.4倍熱安定性であり、TSHR-JMG45は半減
期173分を有し、且つTSHR-WTよりも5.3倍熱安定性であり、TSHR-JMG52は半減期175分を有
し、且つTSHR-WTよりも5.4倍熱安定性であり、並びにTSHR-JMG55は半減期226分を有し、T
SHR-WTよりも6.9倍熱安定性である(図8)。
（TSHR260及び完全長TSHR変異体に結合するM22-POD, K1-18-POD及びK1-70-POD）
TSHR260変異体及び完全長TSHRに結合するM22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODを、TSHR26
0変異体又は完全長TSHR変異体によりコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオ
キシダーゼコンジュゲート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動
し、並びに基質テトラメチルベンジジンと一緒にインキュベーションすることによるTRAb
-ペルオキシダーゼコンジュゲートの結合を検出することにより、試験した。受容体(TSHR
又はTSHR260変異体)の半分がリガンドに結合されるリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の
濃度である結合定数(Kd)を、TSHR260-WT又は適切なら完全長TSHR-WTの結合定数に対して
決定した。試験した変異は、M22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのいずれかへの完全長TSH
R又はTSHR260の結合に影響を及ぼさなかった(表15から表21)。
（TSHR260変異体及び完全長TSHR変異体へ結合するM22-PODのK1-18 IgG及びK1-70 IgG阻
害）
M22-PODとのインキュベーション前に、受容体(TSHR260変異体及び完全長TSHR変異体)を
、M22と同じ部位で結合する変動する濃度のK1-18 IgG及びK1-70 IgGとインキュベーショ
ンすることは、M22-POD結合の阻害を測定し、且つこれは受容体－抗体相互作用が、熱安
定化変異により影響を受けたかどうかを示す。K1-18 IgG及びK1-70 IgGは、M22-PODのTSH
R260変異体及び完全長TSHR変異体への結合を、各々、TSHR260-WT及び完全長TSHR-WTへの
結合と同じ程度、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体
のTSHR260又は完全長TSHRへの結合には影響を及ぼさないことを指摘している(表22から表
25)。
（TRAb陽性患者血清によるTSHR260及び完全長TSHR変異体へのM22-POD結合の阻害）
TSHR260及び完全長TSHRの熱安定化された変異体が、患者血清中のTRAbを検出するアッ
セイにおける使用に適しているかどうかを決定するために、患者血清が、M22-PODのTSHR2
60-WT、TSHR260-JMG52、TSHR260-JMG55、完全長TSHR-WT、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52への
結合を阻害する能力を、測定した(図12c、図14e)。患者血清は、M22-PODのTSHR260-JMG52
及びTSHR260-JMG55への結合を、TSHR260-WTへの結合と同様に阻害した(表27、表29)。更
に、患者血清は、M22-PODの完全長TSHR-JMG45及び完全長TSHR-JMG52への結合を、完全長T
SHR-WTへの結合と同様に阻害した(表28、表29)。従って、熱安定性TSHR260又は完全長TSH
R変異体は、患者血清中のTRAbを検出するアッセイにおける使用に適している。
（TSHR刺激の分析）
TSH、M22 Fab及びK1-18 IgGによる完全長TSHR及び完全長TSHR変異体(FlpIn CHO細胞に
おいて発現される)の刺激を、異なる濃度範囲のTSH、M22-Fab又はK1-18 IgGを使用し生成
されたサイクリックAMPの量を測定することにより、決定した。各アッセイにおいて、TSH
R変異体の刺激を、同じアッセイにおいて検出されたTSHR-WTの刺激と比較した。EC50、す
なわち最大刺激反応の50％を生じる作用物質(TSH、M22-Fab、又はK1-18 IgG)の濃度を、
各変異体について計算し、TSHR-WTと比較した(表30から表39)。驚くべきことに、これら
の変異は、TSH、M22又はK1-18による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対する、顕著
な作用を有さなかったが、四重変異体TSHR-JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、五重変
異体TSHR-JMG52(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)及び六重変異体TSHR-JMG55(I253R
＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C)について、TSHR-WTと比べ、M22のEC50において小
さい増加が存在した(表38)。
TRAb陽性患者血清による完全長TSHR-WT、TSHR-JMG45及びTSHR-JMG52の刺激も、測定し
、これを健常血液ドナー血清の作用と比較した。患者血清による変異された完全長TSHRの
刺激は、TSHR-WTの刺激と非常に似ていた(表40及び表41)。
（熱安定化ヒトTSHR変異の他の種からのTSHR及び他の糖タンパク質ホルモン受容体への
移入可能性）
異なる哺乳動物種から現在入手可能なTSHR配列の間には、高い配列相同性(86～97.5％
配列同一性)が存在する。このことは、ヒトTSHR(hTSHR)において確定された熱安定化変異
のほとんどは、これらの相同体において熱安定化することを示唆している。表42は、熱安
定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたアミノ酸のほとんどは、種を超えて保
存されることを示している。Pro28、Leu59、Thr62、Leu64、Arg112、Pro142、Asp143、As
p151、Ser166、Pro168、Asn170、Thr179及びIle253は、全ての種を超えて保存されている
(表42)。熱安定化変異H63Cの場合、63位は、Hisではなく、イヌTSHRにおいてはGlnであり
、且つアカゲザル及びミドリザルの両方においてはArgである。これらの残基は、His及び
Cysの両方と極めて異なるので、Cysへの変異が、依然熱安定化するかどうかを予測するこ
とは困難である。マウス、ラット及びヒツジの熱安定化変異I167Fに関して、167位は、Il
eではなくValである。Ile及びValは両方共類似した脂肪族アミノ酸であるので、恐らくPh
eへの変異は依然、熱安定化するであろう。熱安定化変異V169Rの場合、169位は、ブタ、
ウシ、ネコ、イヌ、ヒツジ及びウマのTSHR配列においてはAlaであり、これはヒトにおい
て存在する脂肪族Valに類似しており、従って、Argへの変異も、これらのTSHRにおいて熱
安定化するであろうと予想される。対照的に、マウス及びラットにおいて、残基169はGlu
であり、これはArgのように帯電された残基であり、従ってArgへの変異は、ヒトTSHRにお
けるような、劇的な安定化作用を有さないだろう。熱安定化変異R255Yに関して、マウス
及びラットは、255位に、他のTSHR配列に存在するArgではなく、Lysを有し、これらは両
方共正帯電したアミノ酸である。従ってTyrへの変異は依然、255位で熱安定化することが
できるだろう。
hTSHR(配列番号:2)と他の糖タンパク質hFSHR(配列番号:57)(50％配列同一性)及びhLHR(
配列番号:58)(53.3％配列同一性)の間には、比較的低い配列同一性が存在する。しかし、
配列アラインメント(図11)は、hTSHR中の熱安定化するように変異された残基の多くは、h
FSHR及びhLHRにおいて同じ又は類似の残基に対応していることを、指摘している。従って
、多くの熱安定化変異が、恐らく移入可能であろう(表43)。FSHRにおいて、T56V、L58Y、
N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S172C及びR247Yは、熱安定化されるであろ
うと予想される。LHRにおいて、対応する変異P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、
I164F、P165Y、N167W、S176C及びI249Rは、熱安定化されると予想される。
（TSHR260-変異体の更なる熱安定化）
更に2種の熱安定性五重TSHR260変異体を作製し、熱安定性について試験し：TSHR260-JM
G57(I253R＋D143P＋R112P＋V169R＋H63C)(各々、配列番号:45、36、34、41及び32)及びTS
HR260-JMG58(I253R＋D143P＋R112P＋S166T＋H63C)(各々、配列番号:45、36、34、38及び3
2)は、それぞれ、55℃での半減期40±2分及び31.4±0.4分を有し、四重変異体TSHR260-JM
G45よりも熱安定性は1.64±0.07倍及び1.28±0.05倍である。TSHR260-JMG57及びTSHR260-
JMG58はまた、M22-POD結合アッセイの阻害において、患者血清を検出する能力を維持して
いる(図12c、表44)。
（架橋ELISAにおいてアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合するM22
IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgG）
本アッセイ(図13a)は、固定された完全長野生型TSHRとアルカリホスファターゼ標識さ
れたTSHR260変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-
AP-JMG45、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG
58)の間に架橋を形成する、ヒトモノクローナル刺激型TSHR自己抗体(M22 IgG及びK1-18 I
gG)並びにヒトモノクローナル遮断型TSHR自己抗体(K1-70 IgG)の二価の特性に頼っている
(配列番号については「安定化アミノ酸変異を含むTSHR260-AP構築体の作製」参照)。健常
血液ドナー血清のプール中に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て、
類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APに結合した(表45a-c；
e-g)。更に、アッセイ緩衝液に希釈した場合、M22 IgG、K1-70 IgG及びK1-18 IgGは全て
、類似した用量依存的様式でTSHR260-AP変異体及び野生型TSHR260-APへ結合した(表46a-c
；e-g)。健常血液ドナー血清又はアッセイ緩衝液中に希釈したGADに対する陰性対照ヒト
モノクローナル自己抗体(5B3 IgG)を、結合について試験した(表45d及び表46d)。5B3 IgG
(陰性対照抗体)と野生型TSHR260-AP又はTSHR260-AP変異体のいずれかの間に、結合は認め
られなかった(健常血液ドナー血清中に希釈したものについては吸光度値0.0016-0.033、
及びアッセイ緩衝液中に希釈したものについては0.001-0.034)。これらの実験は、刺激活
性又は遮断活性のいずれかを持つヒトモノクローナルTSHR自己抗体のアルカリホスファタ
ーゼ標識されたTSHR260変異体へ結合する能力を明らかにしている。
（架橋ELISAにおいてアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260変異体へ結合するTRAb
陽性及びTRAb陰性血清）
12種のTRAb陽性患者血清(G1-G12)及び11種のTRAb陰性患者血清(N1-N11)を、二価で結合
し、且つ固定された完全長TSHRとアルカリホスファターゼ標識されたTSHR260 (TSHR260-A
P)変異体(TSHR260-AP-I253R、TSHR260-AP-JMG22、TSHR260-AP-JMG37、TSHR260-AP-JMG45
、TSHR260-AP-JMG52、TSHR260-AP-JMG55、TSHR260-AP-JMG57及びTSHR260-AP-JMG58)の間
に架橋を形成するそれらの能力について試験した(図13a)。TRAb陽性及びTRAb陰性血清の
結合は、野生型及び変異体TSHR260-APの両方について類似していた(表47a)。各患者血清
についてのTRAb濃度を計算するためのK1-70 IgG標準曲線の使用は、変異体TSHR260-AP構
築体について計算したTRAb濃度は、野生型TSHR260-APアッセイの平均に匹敵することを示
した(表47b)。野生型TSHR260-APで決定された平均TRAb濃度に比べた、各TSHR260-AP変異
体で得られたアッセイ結果についてピアソン相関を行い、良好なr-値を生じ(表47c)、こ
れは患者血清TRAbは、野生型TSHR260-AP及びTSHR260-AP変異体へ同様の様式で結合するこ
とを明らかにしている。
（TSHR260-AP変異体の熱安定性）
TSHR260-AP変異体の半減期(t1/2)を、2つ組測定を用い、各TSHR260-AP構築体について
、各温度で、時間経過データ(0時間－3時間)を指数関数曲線にフィットすることにより計
算した(図13b)。試験した各構築体の、各温度での半減期を、表48に示している。各TSHR2
60-AP変異体に関する半減期を、TSHR260-AP-JMG45(65℃)、TSHR260-AP-JMG22(60℃)又はT
SHR260-AP-WT(50℃)の半減期と比較した。これから、予測された安定性比を計算し、TSHR
260-AP-WTと比較した各TSHR260-AP変異体の全般的安定性を示すことができる。TSHR260-A
P-JMG22、TSHR260-AP-JMG45及びTSHR260-AP-JMG55は、TSHR260-AP-WTよりも、各々、およ
そ11倍、66倍及び165倍大きい半減期を有した。TSHR260-AP-WTとTSHR260-AP変異体の間の
安定性の増大は、アルカリホスファターゼ融合タンパク質を伴わないTSHR260と比べ減少
されたが、TSHR260-AP構築体の熱安定性は、アルカリホスファターゼを伴わない同等の構
築体よりも大きかった。50℃でのTSHR260-AP-WTの半減期は、野生型TSHR260(アルカリホ
スファターゼを伴わず)の半減期よりも2.9倍大きかった。同様に、60℃でTSHR260-AP-JMG
45及びTSHR260-AP-JMG55は、アルカリホスファターゼを伴わない同等のTSHR260構築体よ
りも、各々、3.2倍及び1.5倍大きい半減期を有した。
（野生型TSHR260の精製）
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用する精製の後、溶出した野生型TSHR260プール
は、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて、陰イオン交換カラム上に装加された最初の物質より
も、およそ1/80の活性を含んだ(図25a)。これらの結果は、野生型TSHR260は、精製の間、
本質的に不安定であり、陰イオン交換クロマトグラフィー精製のわずか1ラウンドの後、1
/80までの活性の喪失を伴うことを確認している。
（TSHRモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1、 23H4、36F11又は9B7)との複合体中の
野生型TSHR260の精製）
先に本発明者らは、TSHR260(野生型)は、ヒトモノクローナル甲状腺刺激性自己抗体M22
との複合体において、安定化され、精製され及び結晶化され得ることを示した(WO 2008/0
25991A1)。M22は、TSHR260断片へ高親和性(5×1010L/mol)で結合するが、容易に解離せず
、且つTSHR260断片への患者血清自己抗体の結合を阻害する(EP 1565493B1、Nakatakeらの
文献、(2006) Thyroid, 16: 1077-1084)。従って、TSHR260-M22の複合体の形成及び精製
は、患者自己抗体のTSHRへの結合を検出するアッセイシステムにおいて使用するため又は
他の目的のための複合されないTSHR260の精製方法としては、使用することができない。
イオン交換クロマトグラフィーによる14C4 IgG、25E1 IgG、2H11 IgG、36F11 IgG又は9
B7 IgG(TSHRとの結合についてM22と競合しないTSHRの凸面に対するTSHRモノクローナル抗
体)との複合体中の野生型TSHR260の精製は、TSHR260-AP架橋阻害ELISAにおける分析後、
装加物質と比べ、溶出した物質において類似の活性(1/2未満への減少)を示した(図13c、
各々、図25b、c、d、f及びg)。しかし23H4 IgG(TSHRの凸面に対する更なるモノクローナ
ル抗体)は、TSHR260架橋阻害ELISAにおいて測定された、カラム上に装加された最初の物
質のおよそ1/15の少ない活性を含み、陽イオン交換クロマトグラフィー後の溶出された物
質により、野生型TSHR260を安定化する効果が少なかった(図25e)。これらの実験は、異な
るTSHRマウスモノクローナル抗体(14C4、2H11、25E1若しくは23H4、36F11 IgG又は9B7 Ig
G；これらは患者血清自己抗体の結合部位から離れたTSHRの凸面に結合する)との複合体中
の野生型TSHR260の精製は、イオン交換クロマトグラフィーの1ラウンドの間に、野生型TS
HR260を安定化することができたことを示している。
（TSHR260-JMG55の精製）
TSHR260-JMG55を含有する昆虫細胞培養物上清36Lの陽イオン交換クロマトグラフィーに
よる最初の精製は、TSHR260結合アッセイにおいて測定した30U/mgから15,872U/mgへの、T
SHR260-JMG55の比活性の529倍の増加を示した(図12a、表49)。TSHR260-JMG55の単位は、
「Freestyle Max試薬を使用するTSHR260変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクシ
ョン」において説明したように、TSHR260標準に対して規定される。
TSHR260架橋阻害ELISAにおける最初の装加物質及びストリームラインカラムから溶出さ
れたプールの分析(図13c)は、装加物質と比べ溶出されたプールにおける類似した活性(総
活性のおよそ1/3～1/4への減少)を示した(図25h)。
TSHR MAb 14C4アフィニティカラムを使用するTSHR260-JMG55の更なる精製は、2つの異
なる型のTSHR260-JMG55の精製を生じた(図26)。pH5.0での14C4-アフィニティカラムでの
溶出は、低い比活性12,041U/mgを有する、精製されたTSHR260-JMG55-5.0をもたらしたの
に対し、pH4.5での溶出は、高い比活性11,443,46U/mgを有する、精製されたTSHR260-JMG5
5-4.5をもたらした(表49)。ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを使用する高活性
のTSHR260-JMG55-4.5の最終精製は、精製されたタンパク質の比活性を6,414,000U/mgまで
増大し、最初の培養物上清と比べ全般的精製レベル213,708をもたらした(表49及び表50a)
。対照的に、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを使用する低活性のTSHR260-JMG5
5-5.0の最終精製は、精製されたタンパク質の比活性20,361U/mgをもたらし、最初の培養
物上清と比べ全般的精製レベル679をもたらした(表49及び表50b)。
これら2つの型の精製されたTSHR260-JMG55は、12％非還元SDS PAGE上でおよそ34kDaで
の1本のバンドとして泳動した(図27)。最後の精製の後、高比活性(6,414,000U/mg)のTSHR
260-JMG55-4.5の0.665mg及び低比活性(20,361U/mg)のTSHR260-JMG55-5.0の0.927mgを得た
。
K1-18-POD、K1-70-POD及びM22-PODは、精製されたJMG55-TSHR260-4.5コートされたELIS
Aプレートウェルに、用量依存的様式で結合した(表51)。
（TSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化）
Endo F3非含有の脱グリコシル化緩衝液中の精製されたTSHR260-JMG55-4.5の1、3及び5
日間の20℃でのインキュベーションは、分子量が減少しないことを示した(図28A)。対照
的に、40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgのEndo F3によるTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル
化は、各々、120時間、72時間及び24時間での分子量のおよそ2kDaの最大減少を生じた(図
28A及び28B)。20℃で120時間インキュベーションした後の脱グリコシルされたTSHR260-JM
G55-4.5の活性の分析は、TSHR260-結合アッセイにおいて決定し(図12a)、且つ-70℃で貯
蔵した未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性と比較した(表52)。TSHR260-JMG55-4.5
の無酵素(0mU/mg)、酵素40mU/mg、60mU/mg又は80mU/mgとのインキュベーションは、それ
ぞれ、未処置の精製TSHR260-JMG55-4.5物質の活性の、111％、100％、104％及び104％を
生じた。
精製したTSHR260-JMG55-4.5タンパク質は、その活性を保持し、且つ3ラウンドのカラム
クロマトグラフィー(ストリームラインHST、14C4アフィニティ及びニッケルアフィニティ
クロマトグラフィー)の後安定化し、且つEndo F3による脱グリコシル化により、およそ2k
Daの糖残基が除去された。
野生型TSHR260とは対照的に、TSHR260-JMG55変異型TSHRは、TSHRモノクローナル抗体を
添加することなく、3ラウンドのカラムクロマトグラフィー(ストリームラインHST、14C4
アフィニティクロマトグラフィー、その後のニッケルアフィニティクロマトグラフィー)
により、巧く精製することができ、安定した複合体を形成する。活性TSHR260-JMG55の2つ
の異なる型を、培養物上清から精製し、これは比活性6,414,000U/mgを有する高比活性型(
TSHR260-JMG55-4.5)及び比活性20,361U/mg(315倍低い)を有する低比活性型であった。脱
グリコシルされ精製されたTSHR260-JMG55-4.5は、TSHR260-結合アッセイにおいて活性が
あるという知見は、更にこの変異型TSHR断片の増大した安定性を確認した。
（熱安定性ヒトTSHR変異のマウス及びブタTSHRへの移入可能性）
最も熱安定性の高いヒトTSHR変異体であるJMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R
＋H63C)の同等の変異を、マウスTSHR(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋E169R＋H63C)(図23
；ヌクレオチド配列は配列番号:67及び図24；アミノ酸配列は配列番号:68)及びブタTSHR(
I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋A169R＋H63C)(図21；ヌクレオチド配列は配列番号:65及び
図22；アミノ酸配列は配列番号:66)へ移入した(表54)。6つの変異型残基中の5つは、ヒト
、マウス及びブタのTSHRで同一であった。残基169のみ、種間で異なり：ヒトTSHRにおい
てこれはバリンであり、マウスTSHRにおいてこれはグルタミン酸であり、且つブタTSHRに
おいてこれはアラニンである。マウス及びブタの両方のTSHR残基169は、ヒトTSHR-JMG55
におけるようにアルギニンへ変異された。完全長変異体マウスTSHR及びブタTSHRを、熱安
定性125I-TSHとの結合親和性及びCHO細胞へトランスフェクトされた場合の刺激に対する
反応性に関して、それぞれの完全長野生型TSHRと比較した。
（完全長野生型並びに変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの熱安定性）
完全長野生型及び変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの熱安定性を、安定性アッセイBに
おいて45℃で測定した(図14c)。安定性アッセイBは、TSHR変異体の4E31-コートされたプ
レートへの一晩の結合、その後のプレートの水浴中45℃での最大3時間の加熱に関与して
いる。加熱後に残存する活性TSHRの割合は、TSHR-結合アッセイにおいて測定する(図14a
、表55)。
これらの変異は、マウスTSHRの熱安定性を6.3倍増大した(半減期2.15分から13.6分へ)
。ブタTSHRの熱安定性において、同様の増大が存在した(半減期3.6分から12.1分へは、熱
安定性の3.34倍の向上をもたらす)。変異型ヒトTSHR(TSHR-JMG55、半減期184分)は、野生
型ヒトTSHR(半減期4.8分)よりも、熱安定性が39倍より大きかった。このことは、ヒトTSH
Rにおいて認められる熱安定化変異は、他の種からTSHRへ移入可能であり、且つそれらの
熱安定性を向上するが、この熱安定性の向上は、ヒトTSHR-JMG55について観察される熱安
定性の向上ほど大きくないことを示している。
（CHO細胞において発現されたマウス及びブタの野生型及び変異型TSHRの刺激）
完全長野生型マウス及びブタTSHR並びに完全長マウス及びブタTSHR-JMG55同等変異体の
、TSH及びM22 Fabによる刺激(表54)(Flp-In CHO細胞において発現された)を、2種のTSHR
作用物質(TSH又はM22-Fab)の異なる濃度範囲で生成されたサイクリックAMPの量を測定す
ることにより、評価した。各アッセイにおいて、TSHR変異体の刺激は、TSHR-WTの刺激と
比較した(同じアッセイにおいて測定)。EC50、すなわち最大刺激反応の50％を生じる作用
物質の濃度を、各変異体について算出し、且つTSHR-WTと比較した(表56及び表57)。完全
長ヒトTSHR-WT及び完全長ヒトTSHR-JMG55変異と同様に、JMG55の同等な変異は、同等のマ
ウス又はブタTSHR-WTと比べ、TSH又はM22による刺激に反応したサイクリックAMP生成に対
する顕著な作用を有さなかった。
（125I-TSHの野生型及び変異型の可溶化完全長ヒト、マウス及びブタTSHRへの結合親和
性）
ヒト、マウス及びブタの野生型TSHR(CHO細胞において発現され且つ界面活性剤可溶化さ
れた)への125I-TSH結合は、各々、類似した親和定数1.80×109L/mol、1.58×109L/mol及
び1.99×109L/molを生じた(表58)。界面活性剤可溶化された完全長変異型ヒト(JMG55)、
マウス及びブタTSHR(JMG55同等物；表54)への125I-TSH結合も、同じく野生型TSHRに比し
類似した親和定数(各々、0.98×109L/mol、0.87×109L/mol及び1.25×109L/mol)を示した
。このことは、TSHの完全長TSHRへの結合は、異なるTSHR種においてJMG55同等なTSHR変異
により影響されないことを示している。
（TSHR-JMG55の膜貫通ドメイン(TMD)への単一変異の熱安定化作用）
合計で56種のTSHRの膜貫通ドメイン内の可能性のある熱安定化変異を確定した：10種の
TSHRコンセンサス変異、19種のTSHR不活性化変異、26種のGPCR熱安定化変異、並びに1種
のTSHRにおいて不活性化し且つβ1-アドレナリン受容体において熱安定化するの両方であ
る変異(Y601A)(表59)。これらの単一変異を、既にLRDに位置した6つの熱安定化変異(I253
R、D143P、R112P、D151E、H63C及びV169R) (配列番号:45、36、34、37、32及び41)を含む
、完全長TSHR-JMG55に加えた。
これらの変異体は、14C4-コートされたプレート又は4E31-コートされたプレートへ結合
される場合に、アッセイにおいて活性の異なる相対レベルを示した(図14a)。このことは
、これらの変異の一部は、TSHRのこれらの抗体への結合に影響を及ぼすことを示唆してい
る。この理由で、アッセイの両方の型における変異体の活性を試験し、且つこれらの試料
を、適宜希釈し、各アッセイにおいて、類似のOD450測定値を生じた(2.0～2.5のOD450)。
D460A及びS505Aは、それらの熱安定性を決定するのに十分な高い活性を有さなかった。14
C4熱安定性アッセイ(A)における低活性のために、C600Rの熱安定性は、4E31熱安定性アッ
セイにおいてのみ決定することができた(B及びC)。
14C4-Fab2又は4E31-Fab2でコートされたELISAプレートに結合された完全長TSHR-JMG55
及び変異体の熱安定性は、3つの異なる様式で測定した。安定性アッセイAは、4℃で一晩
のインキュベーション、及びその後のウェルの水浴中55℃で最大2時間の加熱による、TSH
R変異体の14C4-コートされたELISAプレートウェルへの結合に関与している(図14b)。同様
に、安定性アッセイBは、4℃で一晩のインキュベーション、及びその後のウェルの水浴中
55℃で最大2時間の加熱による、TSHR変異体の4E31-コートされたELISAプレートウェルへ
の結合に関与している(図14c)。対照的に、安定性アッセイCは、溶液中TSHR変異体の33℃
で最大2時間の加熱、それに続く4E31-コートされたELISAプレートウェルへの結合に関与
している(図14d)。全ての場合において、加熱後残存する活性TSHRの割合は、TSHR-結合ア
ッセイにおいて測定される(図14a)。
TSHR260野生型及びTSHR260変異体は、TSHRの小型の球形のドメインである。この比較的
単純な場合において、経時的熱によるタンパク質の不活性化は、一相指数関数的減衰曲線
と正確にフィットし、それから半減期(t1/2)が算出される。しかし、完全長TSHRは、多ド
メインタンパク質であり、従ってタンパク質のフォールディング状態とアンフォールディ
ング状態の間に、遷移状態が存在する。結果的に、タンパク質が溶液中で加熱される安定
性アッセイCにおいて(図14d)、TSHRのアンフォールディングは、二相減衰、すなわち、タ
ンパク質の減衰が一方は速く他方は遅い2つの減衰プロセスの和であるものとしてより良
くモデル化され、アンフォールディングプロセスを説明する2つのパラメータ「半減期(遅
)」及び「半減期(速)」、並びに減衰プロセスのパーセントが速い減衰プロセスにより説
明される第三のパラメータ「パーセントファスト(PercentFast)」を生じる。3つのパラメ
ータを直接比較することは、より一層複雑であり、従ってこれらの比較は、10、30及び12
0分間の加熱後に残存する活性TSHRの割合について成される。或いは、TSHRがその活性の5
0％を失う時点を決定することにより、見かけの半減期が概算される。安定性アッセイA及
びBの場合(図14a及び図14b)、TSHRドメインの一方は、抗体14C4又は4E31により、プレー
トに係留される。このことは、一相指数関数的減衰により密接に似ている熱-不活性化プ
ロセスにつながり、こうしてこれらのアッセイにおけるTSHR変異体の半減期を決定及び比
較することができる。全てのアッセイに関して、TSHR-JMG55の熱安定性は、同じ実験で測
定され、且つ各TSHR変異体の半減期比を決定するために使用される。
驚くべきことに、試験した変異のほとんどは、少なくとも1種の安定性アッセイにおい
て熱安定性であった(半減期比≧1.3)。アッセイした54種の変異のうちわずかに2種C599S
及びI622Aが、3種全ての熱安定性アッセイにおいて中立又は不安定化していた(表60)。TS
HR-JMG55の20種のうち、最も熱安定な変異は、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M46
3V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V
、S671A、Y678L及びY678Aである(図29、30、配列番号:69-88(DNA)及び89-108(タンパク質
))。これらは、TSHR-JMG55の安定性を、安定性アッセイAにおいて最大4.5倍、安定性アッ
セイBにおいて最大1.6倍、及び安定性アッセイCにおいて最大15倍まで増大した。
（TSHR-JMG55のTMDにおける二重変異の熱安定性）
3種の単一TSHR-JMG55 TMD変異体T477I、V595I及びI648L(図30；各々、配列番号:97、10
0及び103)は、3つの熱安定性アッセイ全てにおいて熱安定性をかなり増大したので、これ
らを更なる変異誘発のために選択した。これらの3種の変異は、互いに及び他の最も熱安
定化する単一変異(n＝17)と組合せて、TSHR-JMG55の二重変異体を形成した(表61並びに図
29及び30；各々、配列番号:69-88及び配列番号:89-108)。変異体JMG59からJMG73は、T477
Iと組合せ、変異体JMG74からJMG92は、V595Iと組合せ、及びJMG93からJMG111は、I648Lと
組合せる。JMG66とJMG82は同一であり(JMG55＋T477I＋V595I)、JMG68とJMG101は同一であ
り(JMG55＋T477I＋I648L)、並びにJMG87とJMG104は同一である(JMG55＋V595I＋I648L)。
構築体JMG85(JMG55＋V595I＋C600R)は、変異V595I及びC600Rは非常に近く且つ恐らく互い
に干渉するので、作製しなかった。
これらの二重変異体JMG59からJMG111は全て、熱安定性アッセイCフォーマットにおいて
アッセイし(図14d)、且つ同じアッセイにおける単一変異体T477I、V595I又はI648Lの熱安
定性と比較した(表62)。15種のT477I二重変異体(JMG59からJMG73)のうちの5種は、T477I
に対し熱安定化された(半減期比≧1.1として規定)。18種のV595I二重変異体(JMG74からJM
G92)のうちの12種は、V595Iに対し熱安定化され、且つ19種のI648L二重変異体(JMG93から
JMG111)のうちの12種は、I648Lに対し熱安定化された(JMG111は、熱安定性アッセイにお
いて試験されるのに十分に活性ではなかった)。JMG87[JMG55(配列番号:45、36、34、37、
32、41)＋V595I(配列番号:100)＋I648L(配列番号:103)]、JMG90[JMG55(配列番号:45、36
、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋S671A(配列番号:106)]及びJMG91[JMG55(配列
番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋Y678L(配列番号:107)]は、熱安
定性アッセイCにおいて最も熱安定化しているV595I変異体であった。
V595I二重変異体(JMG74からJMG92)は最も熱安定化し、且つ14C4及び4E31アッセイにお
ける活性の差異がT477I二重変異体について認められたものと同じように大きいものを有
さないので、JMG74からJMG92変異体は、安定性アッセイA及びBにおいて更に分析した(図1
4b、c；表63)。これらの変異体は全て、V595Iに対するこれらの熱安定性アッセイのうち
の少なくとも1種において、熱安定化された。安定性アッセイAにおける半減期は、TSHR-J
MG55-V595Iに関する55℃で27分から、JMG82(JMG55＋V595I＋T477I)[JMG55(配列番号:45、
36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋T477I(配列番号:97)]に関する59分まで増
大した。安定性アッセイBにおいて最も熱安定化した変異体は、JMG84(JMG55＋V595I＋K56
5L)[JMG55(配列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:
99)]であり、55℃での半減期38分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iの半減期18分を2.4倍
向上した。しかし、JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)及びJMG84(JMG55＋V595I＋K565L)は、3
種の熱安定性アッセイの全てにおいて、最良の熱安定性を持つオールラウンドの変異体と
して選択された。安定性アッセイAにおいて、JMG91は、55℃での半減期48分を有し、これ
はTSHR-JMG55-V595Iを1.8倍向上し、安定性アッセイBにおいて、これは55℃での半減期30
分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.7倍向上し、並びに安定性アッセイCにおいて、こ
れは33℃での半減期108分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを2.1倍向上した。これは、33
℃での、10分、30分及び120分後の、各々、生存率80％、64％及び49％と同等であり、こ
れは安定性を、各々、1.3、1.1及び1.3倍増大する。安定性アッセイAにおいて、JMG84は
、55℃での半減期44分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを1.6倍向上し、安定性アッセイB
において、これは55℃での半減期38分を有し、これはTSHR-JMG55-V595Iを2.4倍向上し、
並びに安定性アッセイCにおいて、これは33℃での半減期102分を有し、これはTSHR-JMG55
-V595Iを1.6倍向上する。これは、33℃での、10分、30分及び120分後の、各々、生存率72
％、60％及び48％と同等であり、これは安定性を、各々、1.1、1.1及び1.4倍増大する。
（TSHR-JMG55のTMDにおける三重変異の熱安定性）
TSHR-JMG91及びTSHR-JMG84は、二重TSHR変異体熱安定性アッセイにおいて熱安定化され
た15種の単一変異と組み合わせた(表61)。安定性アッセイCにおけるこれらの変異体の増
大した熱安定性のために、可溶化されたTSHR変異体を、先に使用した33℃の代わりに、40
℃で加熱した。三重変異体の一部は、安定性アッセイA及びBにおいて、二重変異体TSHR-J
MG91(JMG55＋V595I＋Y678L)又はTSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K565L)に対し熱安定化される
のに対し、TSHR-JMG84上に構築された完全長TSHR-JMG55の三重TMD変異体(JMG127からJMG1
42)のみ、熱安定性アッセイCにおいて40℃で熱安定化される(表64)。TSHR-JMG55の三重変
異体の全般的に最大の熱安定化は、TSHR-JMG131(JMG55＋V595I＋K565L＋N455A)[JMG55(配
列番号:45、36、34、37、32、41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)＋N455A (
配列番号:93)]である。安定性アッセイAにおいて、TSHR-JMG131は、55℃での半減期60分
を有し、これはTSHR-JMG84の半減期38±4分を1.5倍向上した。55℃での安定性アッセイB
において、TSHR-JMG131は、半減期32分を有し、これはTSHR-JMG84の半減期23±7分を1.1
倍向上した。40℃での安定性アッセイCにおいて、TSHR-JMG131は、47分の半減期を有し、
これは、40℃で半減期14±3分を有するTSHR-JMG84よりも熱安定性が3.5倍上回る。
（TSHR TMD変異体に結合するM22-POD、K1-70-POD及びK1-18-POD）
完全長TSHR変異体、TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K565L
)及びTSHR-JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)に結合するM22-POD、K1-18-POD及びK1-70-PODを
、TSHR変異体でコートされたELISAプレートに結合するTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲ
ート(すなわち、M22-POD、K1-18 POD又はK1-70 POD)の濃度を変動し、且つ基質テトラメ
チルベンジジンとのインキュベーションによりTRAb-ペルオキシダーゼコンジュゲートの
結合を検出することにより、試験した(図14a)。結合定数(Kd)、すなわち、受容体の半分
がリガンドに結合するリガンド(TRAb-ペルオキシダーゼ)の濃度を、決定した(表65)。試
験した変異は、TSHR-JMG55と比べ、TSHR変異体のM22-POD、K1-18-POD又はK1-70-PODのい
ずれかへの結合に影響を及ぼさなかった(表65から表67)。
（M22 IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG又はTRAb陽性患者血清による完全長TSHR-JMG55変異
体へのM22-POD結合の阻害）
完全長TSHR-JMG55変異体TSHR-JMG55、TSHR-JMG55-V595I、TSHR-JMG84(JMG55＋V595I＋K
565L)及びTSHR-JMG91(JMG55＋V595I＋Y678L)へのM22-POD結合の阻害を、TSHR変異体をM22
IgG、K1-18 IgG、K1-70 IgG又はTRAb陽性患者血清とインキュベーションし、その後M22-
PODとインキュベーションすることにより、決定した(図14e)。M22 IgG、K1-18 IgG、K1-7
0 IgG及びTRAb陽性患者血清は、M22-PODの完全長TSHR変異体への結合を、TSHR-JMG55と同
じ程度に、阻害する。これらの結果は、これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体の完全
長TSHRへの結合に影響を及ぼさないことを示している(表68から表70)。同様に、TRAb陽性
患者血清は、TSHR-JMG55と類似した、TSHR-JMG55変異体へのM22-POD結合の阻害を示す(表
71)。従って、これらの完全長TSHR変異体は、患者血清中のTRAbを検出するためのアッセ
イにおける使用に適している。
（TMD領域の熱安定化ヒトTSHR変異の他の種由来のTSHR及び他の糖タンパク質ホルモン
受容体への移入可能性）
表72は、熱安定性を向上するためにヒトTSHRにおいて変異されたTMD内に位置したアミ
ノ酸のほとんどは、ヒト、マウス及びブタのTSHRを超えて保存されていることを示してい
る。Glu409、Asp410、His443、Leu452、Asn455、Met463、Tyr466、Leu467、Thr477、Gln4
89、Lys565、Cys600、Tyr601、Lys660、Tyr667、Ser671及びTyr678は、全ての種を超えて
保存されている。残基595は、ヒト及びマウスにおいてはValであるが、しかしブタにおい
てはThrである。ブタTSHRにおけるThr595のIleへの変異は恐らく、熱安定化されるであろ
う。残基648は、ヒトにおいてはIleであるが、マウス及びブタにおいてはLeuである。従
って、マウス及びブタのTSHRは、既にhTSHRにおけるI648L熱安定化変異の標的残基を有す
る。別の脂肪族残基であるValへの変異は、熱安定性を変更し得る。
ヒトTSHR(配列番号:2)、FSHR(配列番号:57)及びLHR(配列番号:58)の配列アラインメン
ト(図11)は、hTSHR中の多くの熱安定化するよう変異された残基は、hFSHR及びhLHRにおけ
る同じ又は類似の残基に対応していることを指摘している。結果的に、TSHRのTMDに位置
した熱安定化変異のほとんどは、FSHR及びLHRの同等の残基に移入された場合に、恐らく
、熱安定化される(表73)。唯一の差異は以下である：FSHRにおいてはGln391であり、LHR
においてはArg388である、His443；FSHRにおいてはIle411である、Met463；FSHRにおいて
はSer596であり、LHRにおいてはAla593である、Ile648；並びに、FSHRにおいてはHis615
であり、LHRにおいてはTyr612である、Tyr667。これらの同等の変異の一部は、依然熱安
定化され得る。
（まとめと結論）
本発明は、理論的-系統的変異誘発を基に、TSHRなどの、糖タンパク質ホルモン受容体
タンパク質の熱安定性を向上する新規アプローチを示す。ここで、わずかな安定化する変
異を理論的に設計するアプローチは、TSHR配列中の熱安定化位置を確定するために、タン
パク質内の各残基をアラニンへ変異する系統的変異誘発アプローチの力と組合せられる。
理論的-系統的変異誘発アプローチにおいて、TSHRタンパク質における各位置に関して、
最も可能性のある安定化変異(コンピュータ法又は理論的方法の組合せにより、本発明者
らにより予測された)が、作製され、且つ熱安定化特性について試験される。本発明にお
いて、ハイスループット法は、最も熱安定化する変異を確定するために、多くの変異体を
作製し且つスクリーニングすることを可能にする。これは、その他の点で可能性のあるも
のよりも、TSHR配列中のより熱安定化する変異の確定を可能にした。本発明に記載の方法
は、他のタンパク質の熱安定性を向上するために適用することもできる。本発明の方法は
、特に、TSHR260の熱安定性を最大900倍向上する、より熱安定性のTSHR260変異体を作製
するためにうまく組合せられるTSHR260の17種の大いに熱安定化する変異(P28E、L59F、T6
2V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T、I167F、P168Y、V169R、N170W、T
179C、I253R及びR255Y)の確定が可能である(図5及び6；配列番号:11-25、27-43、45及び4
6)。これらの変異体は依然、TSHR260-WTと類似の方式で、TSHRを刺激するヒト自己抗体M2
2に結合する。最も安定化した単一(TSHR260-I253R)(配列番号:45)、二重(TSHR260-JMG22
：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36))、三重(TSHR260-JMG37：I253R(配列番号:45
)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34))、四重(TSHR260-JMG45：I253R(配列番号:4
5)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:37))、五重(TSHR260-JM
G52：I253R(配列番号:45)＋D143P(配列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:
37)＋V169R(配列番号:41))、並びに六重(TSHR260-JMG55：I253R(配列番号:45)＋D143P(配
列番号:36)＋R112P(配列番号:34)＋D151E(配列番号:37)＋V169R(配列番号:41)＋H63C(配
列番号:32))のTSHR260変異体の熱安定性は、各々、TSHR260の熱安定性を、およそ3.1、13
、42、174、450、700及び900倍向上する。更に、完全長TSHRの場合、三重(TSHR-JMG37：I
253R＋D143P＋R112P)、四重(TSHR-JMG45：I253R＋D143P＋R112P＋D151E)、五重(TSHR-JMG
52：I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R)、並びに六重(TSHR260-JMG55：I253R＋D143P＋
R112P＋D151E＋V169R＋H63C)のTSHR変異体は、完全長野生型TSHRに対する熱安定性を向上
する。
これらの変異は、モノクローナルTSHR抗体(M22、K1-18及びK1-70)のTSHR260又は完全長
TSHRへの結合に影響を及ぼさない。更に、TRAb陽性患者血清は、M22-PODのTSHR260変異体
及び完全長TSHR変異体への結合を、各々、野生型TSHR260及び完全長TSHRと同じ程度に阻
害する。また更に、M22-Fab、K1-18 IgG及びTSHは、野生型TSHRについて認められるのと
同様の様式で、Flp-In CHO細胞において発現された完全長TSHR変異体におけるサイクリッ
クAMPの生成を刺激する。
TSHR調製品の、特にTSHR260の熱安定性の増大は、TSHR260のフォールディング状態を維
持するために、それに結合した抗体を必要とせずにその活性を保持しつつ、変異体の、特
にTSHR260の最も熱安定性の高い変異体の、TSHR260-JMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E
＋V169R＋H63C；各々、配列番号:45、36、34、37、41及び32)の、均質までの精製を可能
にする。これは、立体構造上活性のあるTSHR260がそれに結合した抗体を伴わずに精製さ
れた最初の時である。エンドグリコシダーゼF3を使用し精製された物質が脱グリコシル化
された後、TSHR260-JMG55は依然活性があった。精製された及び脱グリコシル化されたの
両方のTSHR260-JMG55物質は、患者血清中のTSHR自己抗体を検出するための改善されたア
ッセイにおいて、使用することができる。
これらの熱安定化変異はまた、例えば、アッセイにおいて使用するためにTSHR260に結
合された検出可能な標識アルカリホスファターゼからなる、融合タンパク質TSHR260-APへ
、移入可能であった。熱安定化TSHR260-AP変異体、TSHR260-AP-JMG22(I253R＋D143P；配
列番号:45及び36)、TSHR260-AP-JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；配列番号:45、36、
34及び37)並びにTSHR260-AP-JMG55(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋V169R＋H63C；配列番
号:45、36、34、37、41及び42)は、TSHR260-APの熱安定性を、各々、およそ11、66、又は
165倍向上する。これらのTSHR260-AP変異体は依然、野生型TSHR260-APと同程度にTRAb抗
体(M22、K1-18、K1-70及びTRAb陽性患者血清)に結合することができる。これらの構築体
は、患者血清中のTSHR自己抗体を検出するためのTSHR260-AP架橋ELISAにおける使用に有
益である。他の検出可能な標識もまた、使用することができ、且つこれは、TSHR260及び
完全長TSHRについて確定された熱安定化変異はまた、これらの標識された構築体の熱安定
性も増大させ、従って広範な適用におけるそれらの使用が可能であることを予想させる。
本発明において開示された熱安定化変異の多くは、驚くべきものであり、且つコンピュ
ータモデリング又は構造試験の単独によっては、予測されなかった。
本発明の一部として説明された実験は、モデリングソフトウェアを使用することの限定
された有用性を強調している。コンピュータにより予測された変異体の熱安定性は、主に
2つの状況において使用された。第一に、理論的変異誘発についての2種以上の選択肢が存
在する場合、Discovery Studiosを使用し、どの変異が特定位置において恐らく最も熱安
定性であるかを予測した。第二に、単独残基について明確な理論的変異が存在しない場合
、Discovery Studiosソフトウェアを使用し、最も熱安定性の変異、又は全ての変異が脱
安定化された場合、最も少なく脱安定化される変異を予測した。このソフトウェアは、そ
の他の点では試験され得ない多くの熱安定化変異(例えば、H63C、S84F、P142I、D143P、P
168Y、N170W及びR255Y)の確定において、一部使用される。しかし一部の残基に関して、
いずれか他のアミノ酸への変異誘発は、脱安定化されると予測された。これらの場合にお
いて、多くの脱安定化変異からの最も少ない脱安定化の予測が、選択された。驚くべきこ
とに、これらの一部は、最も安定化する変異(例えば、T62V、L64Y、P142I及びI167F)の一
部であることがわかった。実際には脱安定化された安定化されるべきと予測された変異の
多くの例も存在し、これはコンピュータモデリングの限界及び実験的研究の必要要件を説
明しており、このことは、ここで本発明において開示された方法を使用することにより可
能になる。
本発明のもっとも成功する戦略の一つは、プロリン残基のその構造への除去及び導入で
ある。全体で23種の中5種のプロリンへの又はプロリンからの変異(22％)(すなわち、P28E
、R112P、P142I、D143P及びP168Y)は、かなりTSHR260を安定化するが、しかし非常に低レ
ベルで又は完全に発現されない23種中8種の変異体(35％)の構造に対し非常に破壊的でも
あり得る。それに五員環を持つプロリンは、-63°±15°に拘束された骨格二面角φ、並
びに非常に拘束されたプロリン残基の前の残基のねじれ角を伴う、非常に剛性の構造を有
する。このタンパク質骨格の減少した可動性は、これに最低の配座エントロピーをもたら
し、その結果その幾何構造(geometry)が好ましい場合、アミノ酸のプロリンとの交換は、
より熱安定性のTSHRを生じる。しかし、その幾何構造が好ましくない場合、プロリン残基
は、ねじれ角を制限することにより、その構造へひずみを導入することができる。そのよ
うなプロリン残基の他のより可動性のあるアミノ酸との置換は、ひずみを解放し、より熱
安定性の残基を作製する。
第二の本発明の成功した戦略は、表面残基の帯電残基への変異である。P28E、D151E、V
169R及びI253Rは全て、タンパク質の表面への帯電残基の導入又は変更に関与している。
特に、V169R及びI253Rは、hFSHRにおける脂肪族表面残基の類似残基への変異に関与して
おり、両方の場合において類似残基はArgである。
完全長TSHRの更なる安定化変異は、TSHRの膜貫通ドメイン(TMD)において確定された。T
SHRのTMD領域において確定された20種の最も熱安定化の大きい変異は、以下である：E409
K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、
C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671A、Y678L及びY678A(図29及び30；配列番号:69
-88(DNA)及び配列番号:89-108(タンパク質))。これらは、TSHR-JMG55の安定性を、安定性
アッセイAにおいて最大4.5倍、安定性アッセイBにおいて最大1.6倍、及び安定性アッセイ
Cにおいて最大15倍増大する。これらは組合せられて、完全長TSHRの熱安定性を更に増大
するTMD内に位置した変異を伴う、二重変異体(例えば、TSHR-JMG91(JGM55(配列番号:45、
36、34、37、32及び41)＋V595I(配列番号:100)＋Y678L(配列番号:107))及びTSHR-JGM84(J
GM55(配列番号:45、36、34、37、32及び41)＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)
))並びに三重変異体(例えば、TSHR-JMG131(JMG55(配列番号:45、36、34、37、32及び41)
＋V595I(配列番号:100)＋K565L(配列番号:99)＋N455A(配列番号:93)))を形成する。
本発明の差し迫った重要な結果は、熱安定性TSHR調製品の最初の生成である。これは、
完全長TSHR及びより短い配列からなる他のTSHR調製品の安定性に、変異の作用を適用する
新たな機会を開いている。かかるTSHR調製品は、より高い温度で試行され得る改善された
手動の及び自動のアッセイシステム(患者TRAbの検出のための)の作製に有用であろう。更
に、熱安定性TSHR調製品は、精製されることができ、且つかかる純粋な調製品の利用可能
性は、TSHRの構造の研究及び新規療法の開発との関わりにおいて重要であろう。
(表）
(表1) TSHR260における単一アミノ酸変異
Figure 2022078064000005
Figure 2022078064000006
Figure 2022078064000007
特定の変異を実行する理由は、以下である：ねじれ角－TSHR260結晶構造の骨格のねじ
れ角の試験により決定された、Pro又はGlyへの変異に関して正しい骨格構造を伴う残基の
変異；コンセンサス－様々な種を超えたTSHR、又は3種の糖タンパク質ホルモン受容体の
いずれかの、コンセンサス配列への変異。同じく、甲状腺機能低下症を引き起こすことが
報告されている1種の天然のTSHR変種P27T；β-シート－交互の極性、非極性の周期性が維
持されるようなβ-鎖残基の変異誘発、コア残基はIleへ変異され、表面残基は、Thr、Asp
又はArgへ変異される；LRR－ロイシンリッチ反復モチーフLxxLxLxxNxLxxLpxxoFxxLxxの一
般的コンセンサス配列と一致するための変異であり、ここで「L」はLeu、Ile、Val又はPh
eであり、「N」は、Asn、Thr、Ser又はCysであり、「o」は、非極性残基であり、且つ「x
」は、非保存の残基である(Matsushima、Miyashita、Mikami及びKurokiの文献、2010)；
表面－Glu(又は既にGluである場合はAsp)へ変異された表面残基、帯電した残基の性質は
、ArgのLysへの、及びLysのArgへの変異により維持される；コア－コア残基の変異、Ile
及びAlaのValへの、GlyのGlnへの、他の残基のAlaへの変異；DS－Discovery Studiosソフ
トウェアを使う、分子モデリングにより安定化されると予測された変異。
(表2) M22-ペルオキシダーゼのTSHR260への結合を基にしたアッセイ(TSHR260-結合アッ
セイ)において評価されるTSHR260の安定性に対する単一変異の作用
Figure 2022078064000008
Figure 2022078064000009
Figure 2022078064000010
CHO-K1細胞において発現された各TSHR260変異について、TSHR260アッセイ(図12a)にお
けるM22-結合は、42℃で30分間の加熱後に残存する活性タンパク質の割合により決定され
る、TSHR260-WT及び安定性の割合として表され(図12b)、TSHR260-WT安定性の割合(％WT)
として表される。安定性が増大する変異の安定性スクリーンの結果は、太字で示す。これ
らの変異は、変異体の半減期を決定する熱安定性アッセイにおいて試験した(図12b)。
M22は、TSHRに対するヒトモノクローナル自己抗体である。
(表3) TSHR260-結合アッセイにおいて決定された42℃でのTSHR260変異体の半減期
Figure 2022078064000011
Figure 2022078064000012
各変異体の半減期は、アリコートを42℃で加熱し、2時間の期間について間隔をあけて
アッセイすることにより決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合ア
ッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WTの熱安定
性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WTの半減期に対す
る、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。太字は、最も熱安定化する変異体であ
り、これらは二重変異体を作製するために使用した。nは、各試料について独立した実験
において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する
平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした
)は、それに関連したSEMを有さない。
(表4) ドットブロットアッセイにより測定した、TSHR260-WTに対するTSHR260変異体の発
現レベル(TSHR変異体の総量、すなわち、活性＋不活性)の分析、並びにTSHR260-WTに対す
るTSHR260-結合アッセイにおけるそれらの活性。
Figure 2022078064000013
Figure 2022078064000014
Figure 2022078064000015
Figure 2022078064000016
Figure 2022078064000017
Figure 2022078064000018
nd＝決定されず
ドットブロット及びTSHR260-結合アッセイ(図12a)の結果は、各々、TSHR260-WTに対し
て表した(％WT)。変異体は、以下のように、TSHR260-結合アッセイとドットブロットアッ
セイ(総TSHR変異体タンパク質)の間の比により分類した：(a)TSHR260-結合データとドッ
トブロット発現データの間にほとんど又は全く差がない；(b)TSHR260-結合は、ドットブ
ロット発現よりもかなり大きい(TSHR260-結合／ドットブロット＞2.5)；又は、(c)ドット
ブロット発現は、TSHR260-結合よりもかなり大きい(TSHR260-結合／ドットブロット＜0.4
)。TSHR260-結合アッセイの結果とドットブロットの結果が両方共低い場合(20％WT未満)
、これらは分類しなかった。安定性比は、変異体の半減期を基にしたが、これが測定され
なかった場合は、変異体が42℃で30分間加熱された場合の安定性スクリーンデータ(TSHR2
60-WTの割合として(％WT))を列挙した(*)。
(表5) 二重、三重、四重、五重及び六重TSHR260変異体を作製するための単一TSHR260変
異の組合せ
Figure 2022078064000019
Figure 2022078064000020
完全長TSHR中の対応する変異は、TSHR-JMGxとして規定し、ここでxは、TSHR260におけ
る各変異の番号である。
(表6) 42℃で測定したTSHR260二重変異体の熱安定性
Figure 2022078064000021
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG18、JMG25
、JMG29及びJMG31は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合を示したので、熱安定
性の決定は不可能であった。JMG21の熱安定性は、42℃では測定しなかった。JMG30は、42
℃でのみ試験した三重変異体である。
各変異体の半減期は、アリコートを42℃で加熱し、3時間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WT及びTSHR260-I2
53Rの熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WT及びTSHR260-I253R
の半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。TSHR260-結合アッセイ
において結合の良好なレベルを持つ最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、
各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも
2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でア
ッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
(表7) 50℃で測定したTSHR260二重変異体の熱安定性
Figure 2022078064000022
JMG1、JMG3、JMG5、JMG6、JMG7、JMG8、JMG10、JMG11、JMG12、JMG13、JMG14、JMG15、
JMG18、JMG25、JMG29及びJMG31は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合を示した
ので、熱安定性の決定は不可能であった。JMG21の熱安定性は、TSHR260-I253Rのみ同じ実
験で決定し、TSHR260-WTは決定しなかった。
各変異体の半減期は、アリコートを50℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-WT及びTSHR260-I2
53Rの熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-WT及びTSHR260-I253R
の半減期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期比を決定した。TSHR260-結合アッセイ
において結合の良好なレベルを持つ最も熱安定化している変異体は、太字で示す。nは、
各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも
2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でア
ッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
(表8) 50℃で測定した三重及び四重TSHR260変異体の熱安定性
Figure 2022078064000023
基本の変異体は、それを三重変異体及び四重変異体が基にした、各々、二重変異体JMG2
2(I253R＋D143P；表5)又は三重変異体JMG37(I253R＋D143P＋R112P；表5)をいう。JMG34、
JMG36、JMG40、JMG42及びJMG48は、TSHR260-結合アッセイにおいて低すぎる結合(TSHR260
-WTの＜16％)を示したので、熱安定性の決定は不可能であった。
各変異体の半減期は、アリコートを50℃で加熱し、3時間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定した(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-I253Rの熱安定性
を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-I253Rの半減期と比べた、半減期の
差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異体は、太字で示す
。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少
なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2
つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
(表9) 55℃で測定した四重、五重及び六重TSHR260変異体の熱安定性
Figure 2022078064000024
基本の変異体は、生じる四重、五重及び六重変異体が基にした、各々、三重変異体JMG3
7(I253R＋D143P＋R112P；表5)、四重変異体(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；表5)又は五重
変異体JMG50(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H62C；表5)をいう。JMG48は、TSHR260-結合
アッセイにおいて検出可能な結合を有さなかったので、熱安定性の決定は不可能であった
。六重変異体JMG54及びJMG55は、55℃で正確に半減期を決定するにはあまりにも安定して
いた。
各変異体の半減期は、アリコートを55℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-I253R及びTSHR260
-JMG37の熱安定性を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-I253Rの半減期と
比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異
体は、太字で示す。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数で
ある。結果は、少なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ
実行された実験(2つ組でアッセイした)は、それに関連したSEMを有さない。
(表10) 60℃で測定した五重及び六重TSHR260変異体の熱安定性
Figure 2022078064000025
基本の変異体は、生じる四重、五重及び六重変異体が基にした、各々、三重変異体JMG3
7(I253R＋D143P＋R112P；表5)、四重変異体JMG45(I253R＋D143P＋R112P＋D151E；表5)又
は五重変異体JMG50(I253R＋D143P＋R112P＋D151E＋H62C；表5)をいう。
各変異体の半減期は、アリコートを60℃で加熱し、2時間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。各実験において、TSHR260-JMG45の熱安定性
を測定し、これを使用し、同じ実験におけるTSHR260-JMG45の半減期と比べた、半減期の
差(Δt1/2)及び半減期安定性比を決定した。最も熱安定化している変異体は、太字で示す
。nは、各試料について独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少
なくとも2回繰り返した実験に関する平均±SEMとして表す。
(表11) 37℃で測定したTSHR260-WT、TSHR260-I253R、JMG22、JMF37、JMG45、JMG52、JMG
54及びJMG55の熱安定性曲線
Figure 2022078064000026
各変異体の半減期は、アリコートを37℃で加熱し、37日間かけて間隔をあけてアッセイ
することにより、決定する(図12b)。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR260-結合アッセイ
により決定し、時間に対してプロットした。同じ実験において測定したTSHR260-WTの半減
期と比べた、半減期の差(Δt1/2)及び半減期安定性比を示している。nは、各試料につい
て独立した実験において半減期を測定した回数である。結果は、少なくとも2回繰り返し
た実験に関する平均±SEMとして表す。a:1回のみ実行された実験(2つ組でアッセイした)
は、それに関連したSEMを有さない。
Figure 2022078064000027
(表13) 14C4プレート上の42℃での完全長TSHR変異体の熱安定性
Figure 2022078064000028
結果は、450nmでの吸光度、及び非加熱試料の450nmでの吸光度の割合の両方で表す。1
回の実験における4つ組の測定の平均±SD。
(表14) 14C4プレート上の50℃での完全長TSHR変異体の熱安定性
Figure 2022078064000029
結果は、450nmでの吸光度、及び非加熱試料の450nmでの吸光度の割合の両方で表す。1
回の実験における4つ組の測定の平均±SD。各変異体に関する50℃での半減期及び完全長T
SHR-WTに対する安定性比を、列挙する。
Figure 2022078064000030
Figure 2022078064000031
Figure 2022078064000032
(表18) 完全長TSHR変異体へのM22-POD結合
Figure 2022078064000033
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD4
50測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとし
て表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより
決定した。
(表19) 完全長TSHR変異体へのK1-18-POD結合
Figure 2022078064000034
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD4
50測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとし
て表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより
決定した。
(表20) 完全長TSHR変異体へのK1-70-POD結合
Figure 2022078064000035
結果は、各変異体について、非特異的結合を減算した、450nmでの吸光度、及び最大OD4
50測定値の割合(％最大値)を、1回の実験における2つ組での測定に関する、平均±SDとし
て表している。Kdは、GraphPad Prismによる、データの飽和結合曲線へのフィットにより
決定した。
(表21) M22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODの結合に対する変異の作用のまとめ(TSHR60-W
T又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000036
 n.d.＝測定されず
Figure 2022078064000037
Figure 2022078064000038
(表24) 完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のK1-18 IgGによる阻害
Figure 2022078064000039
結果は、450nmでの吸光度、及びM22-POD結合の阻害率を、1回の実験における2つ組での
測定に関する、±SDとして表している。
(表25) 完全長TSHR変異体へのM22-POD結合のK1-70 IgG による阻害
Figure 2022078064000040
結果は、450nmでの吸光度、及びM22-POD結合の阻害率を、1回の実験における2つ組での
測定に関する、±SDとして表している。
(表26) TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合のK1-18 IgG及びK1-70 IgG阻害に対
する変異の作用のまとめ(TSHR60-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000041
(表27) 患者血清によるTSHR260変異体へのM22-POD結合の阻害
Figure 2022078064000042
結果は、1回の実験における2つ組測定に関する、450nmでの吸光度±SD及びM22-POD阻害
率として、表している。
(表28) 患者血清による完全長TSHR変異体へのM22-POD結合の阻害
Figure 2022078064000043
結果は、1回の実験における2つ組測定に関する、450nmでの吸光度±SD及びM22-POD結合
の阻害率として、表している。
(表29) TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合の正常血清及びTRAb陽性患者血清の
阻害に対する変異の作用のまとめ(TSHR60-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000044
(表30) 野生型TSHR及びTSHR-JMG37(I253R+D143P+D151E)を発現しているCHO細胞における
サイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクローナル
抗体の作用
Figure 2022078064000045
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.62ng/mL、EC50(TSH)＝1.02ng/mL。TSHR-JMG37
に関して：EC50(M22)＝0.94ng/mL、EC50(TSH)＝0.39ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して: EC50(M22)＝2.13ng/mL、EC50(TSH)＝0.77ng/mL。TSHR-JMG37
に関して：EC50(M22)＝3.10ng/mL、EC50(TSH)＝0.86ng/mL。
(表31) 野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞に
おけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモノクロ
ーナル抗体の作用
Figure 2022078064000046
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.52ng/mL、EC50(TSH)＝0.82ng/mL。TSHR-JMG45
に関して：EC50(M22)＝5.37ng/mL、EC50(TSH)＝0.84ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(M22)＝1.97ng/mL、EC50(TSH)＝0.64ng/mL。TSHR-JMG45
に関して：EC50(M22)＝4.03ng/mL、EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
(表32) 野生型TSHR及びTSHR-JMG52 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCH
O細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒトモ
ノクローナル抗体の作用
Figure 2022078064000047
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.92ng/mL、EC50(TSH)＝0.42ng/mL。TSHR-JMG52
に関して：EC50(M22)＝3.72ng/mL、EC50(TSH)＝0.43ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して: EC50(M22)＝1.40ng/mL、EC50(TSH)＝0.67ng/mL。TSHR-JMG52
に関して：EC50(M22)＝3.27ng/mL、EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
(表33) 野生型TSHR及びTSHR-JMG55(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)を発現してい
るCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(M22)及びTSHヒ
トモノクローナル抗体の作用
Figure 2022078064000048
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.53ng/mL、EC50(TSH)＝1.11ng/mL。TSHR-JMG52
に関して：EC50(M22)＝2.87ng/mL、EC50(TSH)＝0.934ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(M22)＝1.30ng/mL、EC50(TSH)＝0.445ng/mL。TSHR-JMG52
に関して：EC50(M22)＝3.90ng/mL、EC50(TSH)＝0.609ng/mL。
(表34) 野生型TSHR及びTSHR-JMG37 (I253R+D143P+D151E)を発現しているCHO細胞におけ
るサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR(K1-18)及びTSHヒトモノクロー
ナル抗体の作用
Figure 2022078064000049
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMP緩衝液中
に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝13.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.64ng/mL。TSHR-JMG
37に関して：EC50(K1-18)＝11.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.53ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)＝12.8ng/mL、EC50(TSH)＝0.71ng/mL。TSHR-JMG3
7に関して：EC50(K1-18)＝11.1ng/mL、EC50(TSH)＝0.58ng/mL。
(表35) 野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞に
おけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及びTSHヒトモノク
ローナル抗体の作用
Figure 2022078064000050
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝12.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.57ng/mL。TSHR-JMG
45に関して：EC50(K1-18)＝22.5ng/mL、EC50(TSH)＝0.63ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(K1-18)＝17.8ng/mL、EC50(TSH)＝0.82ng/mL。TSHR-JMG4
5に関して：EC50(K1-18)＝16.0ng/mL、EC50(TSH)＝0.77ng/mL。
(表36) 野生型TSHR及びTSHR-JMG52 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCH
O細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及びTSHヒ
トモノクローナル抗体の作用
Figure 2022078064000051
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝17.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.69ng/mL。TSHR-JMG
52に関して：EC50(K1-18)＝14.9ng/mL、EC50(TSH)＝0.51ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝14.3ng/mL、EC50(TSH)＝1.00ng/mL。TSHR-JMG
52に関して：EC50(K1-18)＝19.7ng/mL、EC50(TSH)＝0.99ng/mL。
(表37) 野生型TSHR及びTSHR-JMG55 (I253R+D143P+R112P+D151E+V169R+H63C)を発現して
いるCHO細胞におけるサイクリックAMP生成の刺激に対する異なる濃度のTSHR (K1-18)及び
TSHヒトモノクローナル抗体の作用
Figure 2022078064000052
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリ
ックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝11.1ng/mL、EC50(TSH)＝0.50ng/mL。TSHR-JMG
55に関して：EC50(K1-18)＝14.3ng/mL、EC50(TSH)＝0.48ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して：EC50(K1-18)＝12.0ng/mL、EC50(TSH)＝0.62ng/mL。TSHR-JMG
55に関して：EC50(K1-18)＝28.2ng/mL、EC50(TSH)＝0.81ng/mL。
(表38) TSH、M22-Fab及びK1-18 IgGによる変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞の刺
激に対する変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
Figure 2022078064000053
(表39a) 変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞のM22-Fab及びTSH刺激のEC50に対する
変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
Figure 2022078064000054
EC50は、最大シグナル伝達反応の半分を生じるのに必要なリガンドの濃度である。LogE
C50は、2～10回の独立した実験からの平均±SDとして示している。
(表39b) 変異型完全長TSHRを発現しているCHO細胞のK1-18 IgG及びTSH刺激のEC50に対す
る変異の作用(TSHR-WTに対して)のまとめ
Figure 2022078064000055
EC50は、最大シグナル伝達反応の半分を生じるのに必要なリガンドの濃度である。LogE
C50は、2～10回の独立した実験からの平均±SDとして示している。
(表40) 野生型TSHR及びTSHR-JMG45(I253R+D143P+R112P+D151E)を発現しているCHO細胞に
おけるサイクリックAMPレベル。サイクリックAMP生成の刺激に対する正常血清及び患者血
清の作用。
Figure 2022078064000056
結果は、NPSによる基本刺激に対する比として表し、且つ3回の測定の平均±SDである。
(表41) 野生型TSHR及びTSHR-JMG52(I253R+D143P+R112P+D151E+V169R)を発現しているCHO
細胞におけるサイクリックAMPレベル。サイクリックAMP生成の刺激に対する正常血清及び
患者血清の作用。
Figure 2022078064000057
結果は、NPSによる基本刺激に対する比として表し、且つ3回の測定の平均±SDである。
(表42) ヒトTSHRの熱安定化アミノ酸残基の、他の哺乳動物TSHR配列における同等のTSHR
アミノ酸残基と比較した分析
Figure 2022078064000058
熱安定化するよう変異された残基のほとんどは、異なる種由来のTSHRを超えて、良く保
存されている。ヒトTSHRとは異なる残基には、ハイライトを付けている。相同体間の配列
変化のほとんどは、類似の特性を持つアミノ酸、例えば塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族
アミノ酸へである。結果的に、本発明者らがヒトTSHR260及びヒト完全長TSHRにおいて認
めた熱安定化変異は、同じく表42に示した他の哺乳動物種において熱安定性である可能性
がある。*:最も熱安定性のTSHR260変異体JMG55を含む、6種の最も熱安定化変異を、示し
ている。
(表43) ヒトTSHRの熱安定化アミノ酸残基の、ヒトFSHR及びヒトLHRにおける同等のTSHR
アミノ酸残基と比較した分析
Figure 2022078064000059
hTSHR(配列番号:2)と同一である、hFSHR(配列番号:57)及びhLHR(配列番号:58)における
残基は、太字で示す。これらに加え、受容体間で異なる残基の多くは、類似の特性を持つ
アミノ酸、例えば塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸に制限されている。これらの
残基には、ハイライトを付け、hTSHRからの類似の熱安定化変異の移入が、hFSHR及び／又
はhLHRにおいて熱安定化される可能性がある残基を示している。*:最も熱安定性のTSHR26
0変異体JMG55を含む、6種の最も熱安定化変異を、示している。
(表44) 患者血清によるTSHR260変異体へのM22-POD結合の阻害
Figure 2022078064000060
結果は、450nmでの吸光度(平均±SD；n=2)及びM22-POD結合の阻害率として示している
。
Figure 2022078064000061
Figure 2022078064000062
Figure 2022078064000063
Figure 2022078064000064
Figure 2022078064000065
Figure 2022078064000066
Figure 2022078064000067
Figure 2022078064000068
Figure 2022078064000069
Figure 2022078064000070
Figure 2022078064000071
Figure 2022078064000072
Figure 2022078064000073
(表49) 2つの異なる型のTSHR260-JMG55の精製及び比活性のまとめ
Figure 2022078064000074
TSHR260活性は、TSHR260-結合アッセイ(図12a)における試料の活性である。比活性は、
試料のタンパク質濃度(mg/mL)で除算した、TSHR260-結合アッセイにおける試料の活性(U/
mL)であり、タンパク質1mgの活性をもたらす。精製レベルは、出発物質(ストリームライ
ン装加)の比活性により除算した、各工程での精製された物質の比活性である。
Figure 2022078064000075
(表51) TSHRモノクローナル自己抗体(K1-70、K1-18及びM22)の精製TSHR260-JMG55-4.5で
コートされたELISAプレートウェルへの結合
Figure 2022078064000076
(表52) エンドグリコシダーゼF3による脱グリコシル化後のTSHR260結合アッセイにおけ
るTSHR260-JMG55-4.5活性の分析
Figure 2022078064000077
TSHR260活性は、「TSHR260-結合アッセイ」及び「Freestyle Max試薬を使用するTSHR26
0変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション」で規定された、TSHR260標準と比
較した、TSHR260-結合アッセイにおける試料の活性である(図12a)。
(表53) ニッケル-アフィニティ精製後のTSHR260-JMG55-4.5の脱グリコシル化
Figure 2022078064000078
(表54) マウス及びブタTSHRにおけるhTSHR-JMG55変異の同等残基
Figure 2022078064000079
hTSHR-JMG55の熱安定化変異された残基のほとんどは、マウス及びブタ由来のTSHRで、
良く保存されている。169位の残基のみが、種を超えて異なる。残基169は、ヒトにおいて
バリン、マウスにおいてグルタミン酸、及びブタにおいてアラニンである。
(表55) 完全長野生型及び変異型マウス、ブタ及びヒトTSHRの45℃での熱安定性
Figure 2022078064000080
各構築体の半減期は、TSHR調製品の4E31-コートされたプレートへの結合、その後のこ
のプレートの最大3時間の水浴中45℃での加熱による、安定性アッセイBにおいて測定した
。活性TSHRタンパク質の量は、TSHR-結合アッセイ(図14c)により決定した。結果は、時間
に対してプロットし、二相指数関数的減衰曲線にフィットさせた。半減期は、TSHRがその
活性の半分を喪失する時間である。示された結果は、平均±SD、n＝2である。
(表56) 野生型又は変異型のいずれかのマウスTSHRを発現しているCHO細胞におけるcAMP
生成の刺激に対する様々な濃度のM22 IgG及びTSHの作用
Figure 2022078064000081
示された結果は、3つ組の測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMPアッセイ緩
衝液中に希釈した。mTSHR-WTに関して：EC50(M22)＝13.09ng/ml；EC50(TSH)＝0.81ng/ml
。mTSHR-変異型に関して：EC50(M22)＝20.36ng/ml；EC50(TSH)＝1.41ng/ml。変異型mTSHR
は、ヒトTSHR変異体JMG55を基にした。マウスTSHRにおける変異したアミノ酸は、ヒトTSH
R-JMG55構築体において変異したアミノ酸に類似しており、且つH63C；R112P；D143P；D15
1E；E169R(hTSHR V169Rに類似)及びI253Rを含んでいた。
(表57) 野生型又は変異型のいずれかのブタTSHRを発現しているCHO細胞におけるcAMP生
成の刺激に対する様々な濃度のM22 IgG及びTSHRの作用
Figure 2022078064000082
示された結果は、3つ組の測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMPアッセイ緩
衝液中に希釈した。pTSHR-WTに関して：EC50(M22)＝6.23ng/ml；EC50(TSH)＝0.79ng/ml。
mTSHR-変異型に関して；EC50(M22)＝6.53ng/ml；EC50(TSH)＝1.04ng/ml。変異型pTSHRは
、ヒトTSHR変異体JMG55を基にした。ブタTSHRにおける変異したアミノ酸は、ヒトTSHR-JM
G55構築体において変異したアミノ酸に類似しており、且つH63C；R112P；D143P；D151E；
A169R(hTSHR V169Rに類似)及びI253Rを含んでいた。
(表58) 異なる種(ヒト、マウス及びブタ)由来の完全長野生型及び変異型TSHRへのTSH結
合に関する会合定数
Figure 2022078064000083
2つ組で測定した1回の実験から算出した会合定数。
(表59) TSHR-JMG55のTMDで作製された単一アミノ酸変異
Figure 2022078064000084
(表60) TMDに単一変異を有するTSHR-JMG55変異体の安定性
Figure 2022078064000085
Figure 2022078064000086
またこれらのTSHR変異体は全て、6つの変異JMG55：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C
及びV169Rを含む。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISA
プレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイAにおける
使用に関して、試料は、14C4活性10U/mLまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freest
yle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション
」の項を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISA
プレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイBにおける
使用に関して、試料は、4E31活性10U/mLまで希釈し、且つ安定性アッセイCにおける使用
に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Freest
yle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクション
」を参照されたい。
c:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、14C4-プレート(安定性アッセ
イA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレートウェル(安定性アッセイB、図14c)のTSH
R変異体によるコーティングにより決定される。結合したTSHRを伴うプレートのストリッ
プは、55℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより
決定し、時間に対してプロットし、且つ指数関数的減衰曲線にフィットさせた。各実験に
おいて、TSHR-JMG55の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同じ実験におけ
るTSHR-JMG55変異体の半減期と比較した半減期比を決定した。
d:安定性アッセイC(図14d)において、各TSHR-JMG55変異体の可溶化されたアリコートを
、溶液中、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイに
より決定し、時間に対してプロットし、且つ二相指数関数的減衰曲線にフィットさせた。
10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR-JMG55変異体の割合を、算出し、且つTSHR-
JMG55と比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失する
時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55の見かけの半減期によ
り除算することにより、半減期比を算出した。
太字は、二重変異体の作製に使用した、20種の最も熱安定化している変異体である。実
験は、2つ組でアッセイされた各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。「n.d.
」＝決定されず(determined)。
(表61) 二重、三重及びTSHR-JMG55変異体を作製するためのTSHR-JMG55 TMDにおける単一
変異の組合せ
Figure 2022078064000087
Figure 2022078064000088
列挙した全てのTSHR変異体は、6つの変異JMG55：I253R、D143P、R112P、D151E、H63C及
びV169Rを含む。
JMG66は、JMG82と同一であり、JMG68は、JMG101と同一であり、及びJMG87は、JMG104と
同一である。変異V595I及びC600Rは、非常に近く且つ恐らく互いに干渉することが見込ま
れるので、JMG85構築体は作製されなかった。
(表62) TMDに二重変異を有するTSHR-JMG55変異体の熱安定性：安定性アッセイC
Figure 2022078064000089
Figure 2022078064000090
表61で規定したTSHR変異体。
a:14C4活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、14C4-コートされたELISA
プレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。U/mlの定義に関しては、「
Freestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェク
ション」を参照されたい。
b:4E31活性は、TSHR結合アッセイにおいて検出されたような、4E31-コートされたELISA
プレートウェルに結合した場合の、非加熱試料の活性である。安定性アッセイCにおける
使用に関しては、試料は、最終濃度12.5U/mlまで希釈した。U/mlの定義に関しては、「Fr
eestyle Max試薬を使用する完全長TSHR変異体のCHO-K1細胞への一過性トランスフェクシ
ョン」を参照されたい。
c:安定性アッセイCにおいて、各TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中、33
℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより
決定し、時間に対してプロットした(図14d)。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TS
HR変異体の割合を、算出し、且つJMG59からJMG73についてTSHR-JMG55-T477Iと、JMG74か
らJMG92の場合はTSHR-JMG55-V595Iと、又はJMG93からJMG111についてはTSHR-JMG55-I648L
と比較した。加えて、見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分を喪失す
る時点である。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG55-T477I、TSHR-JMG55
-V595I又はTSHR-JMG55-I648Lの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算
出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。
「n.d.」＝決定されず。
(表63) TSHR-JMG55のTMDに二重変異を有する変異体(JMG74からJMG92)の熱安定性：安定
性アッセイA、B及びC
Figure 2022078064000091
表61で規定したTSHR変異体。
a:安定性アッセイA及びBにおいて、各変異体の半減期は、最初に、14C4-コートされたE
LISAプレートウェルへの(安定性アッセイA、図14b)又は4E31-コートされたELISAプレート
ウェル(安定性アッセイB、図14c)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSHR
を伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体T
SHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。各
実験において、TSHR-JMG55-V595Iの熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを使用し、同
じ実験におけるTSHR-JMG55-V595Iの半減期と比較した各変異体に関する半減期比を決定し
た。
b:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中
、33℃で最大2時間加熱した。活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定
し、時間に対してプロットした。10、30及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の
割合を、算出し、且つTSHR-JMG55-V595Iと比較した。見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異
体が、その活性の半分を喪失する時点である。これを使用し、同じ実験において測定した
TSHR-JMG55-V595Iの見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
全体で最も熱安定化変異体であるJMG91及びJMG84は、太字で示し、且つこれらを、三重
変異体作製の基本として使用した。実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおい
て、各変異体について1回行った。「n.d.」＝決定されず。
(表64) TSHR-JMG55のTMDに三重変異を有する変異体(JMG112からJMG142)の熱安定性：安
定性アッセイA、B及びC
Figure 2022078064000092
表61で規定したTSHR変異体。
a:安定性アッセイA(図14b)及びB(図14c)において、各変異体の半減期は、最初に、14C4
-コートされたELISAプレートウェルへの(安定性アッセイA)又は4E31-コートされたELISA
プレートウェル(安定性アッセイB)への変異体の結合により測定した。結合した変異体TSH
Rを伴うプレートウェルのストリップは、55℃で最大2時間加熱した。残存する活性変異体
TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイにより決定し、時間に対してプロットした。
各実験において、TSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の熱安定性(半減期、t1/2)を測定し、これを
使用し、同じ実験におけるTSHR-JMG91又はTSHR-JMG84の半減期と比較した各変異体に関す
る半減期比を決定した。
c:安定性アッセイC(図14d)において、TSHR変異体の可溶化されたアリコートを、溶液中
、40℃で最大2時間加熱した。残存する活性TSHRタンパク質の量を、TSHR-結合アッセイに
より決定し、時間に対してプロットし、二相指数関数的減衰曲線にフットさせた。10、30
及び120分間加熱後に残存する活性TSHR変異体の割合を、算出し、且つTSHR-JMG91又はTSH
R-JMG84と比較した(JMG112からJMG126はTSHR-JMG91と比較し、且つJMG127からJMG142はTS
HR-JMG84と比較した)。同じく見かけの半減期は、TSHR-JMG55変異体が、その活性の半分
を喪失する時点と決定した。これを使用し、同じ実験において測定したTSHR-JMG91又はTS
HR-JMG84の見かけの半減期により除算することにより、半減期比を算出した。
実験は、(2つ組でアッセイされた)各アッセイにおいて、各変異体について1回行った。
「n.d.」＝決定されず。
Figure 2022078064000093
Figure 2022078064000094
Figure 2022078064000095
Figure 2022078064000096
Figure 2022078064000097
Figure 2022078064000098
Figure 2022078064000099
(表72) マウス及びブタTSHRにおけるhTSHR-JMG55変異の同等残基
Figure 2022078064000100
hTSHR-JMG55の熱安定化変異された残基のほとんどは、マウス及びブタ由来のTSHRで良
く保存されている。595位及び648位の残基のみが、種を超えて異なる。残基595は、ヒト
及びマウスにおいてはバリンであるが、ブタにおいてはトレオニンである。残基648は、
ヒトにおいてはイソロイシンであるが、マウス及びブタにおいてはロイシンである。
(表73) ヒトFSHR及びヒトLHRの同等なアミノ酸残基と比較したヒトTSHRのTMDの熱安定化
アミノ酸残基の分析
Figure 2022078064000101
hTSHR(配列番号:2)と同一である、hFSHR(配列番号:57)及びhLHR(配列番号:58)の残基は
、太字で示している。これらに加え、これらの受容体間の多くの残基の差異は、類似の特
性を持つアミノ酸、例えば、塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸に限定される。hT
SHRからhFSHR及びhLHRへの類似の熱安定化変異の移入は、これらの受容体の熱安定性を向
上する可能性がある。
(表21) M22-POD、K1-18 POD及びK1-70 PODの結合に対する変異の作用のまとめ(TSHR26
0-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000149
 n.d.＝測定されず
(表26) TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合のK1-18 IgG及びK1-70 IgG阻害に対
する変異の作用のまとめ(TSHR260-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000150
(表29) TSHR260又は完全長TSHR-WTへのM22-POD結合の正常血清及びTRAb陽性患者血清の
阻害に対する変異の作用のまとめ(TSHR260-WT又は完全長TSHR-WTに対して)
Figure 2022078064000151
示されている結果は、3つ組測定の平均±SDである。*:2つ組で測定。試料は、サイクリックAMP緩衝液中に希釈した。
実験1：TSHR-WTに関して：EC50(M22)＝1.53ng/mL、EC50(TSH)＝1.11ng/mL。TSHR-JMG55
に関して：EC50(M22)＝2.87ng/mL、EC50(TSH)＝0.934ng/mL。
実験2：TSHR-WTに関して:EC50(M22)＝1.30ng/mL、EC50(TSH)＝0.445ng/mL。TSHR-JMG55
に関して：EC50(M22)＝3.90ng/mL、EC50(TSH)＝0.609ng/mL。
示された結果は、3つ組の測定の平均±SDである。試料は、サイクリックAMPアッセイ緩
衝液中に希釈した。pTSHR-WTに関して：EC50(M22)＝6.23ng/ml；EC50(TSH)＝0.79ng/ml。
pTSHR-変異型に関して；EC50(M22)＝6.53ng/ml；EC50(TSH)＝1.04ng/ml。変異型pTSHRは
、ヒトTSHR変異体JMG55を基にした。ブタTSHRにおける変異したアミノ酸は、ヒトTSHR-JM
G55構築体において変異したアミノ酸に類似しており、且つH63C；R112P；D143P；D151E；
A169R(hTSHR V169Rに類似)及びI253Rを含んでいた。
hTSHR(配列番号:2)と同一である、hFSHR(配列番号:57)及びhLHR(配列番号:58)の残基は
、太字で示している。これらに加え、これらの受容体間の多くの残基の差異は、類似の特
性を持つアミノ酸、例えば、塩基性、酸性、脂肪族又は芳香族アミノ酸に限定される。hT
SHRからhFSHR及びhLHRへの類似の熱安定化変異の移入は、これらの受容体の熱安定性を向
上する可能性がある。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であって
、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する
、前記変異体TSHR又はその断片。
（構成２）
前記1つ以上の変異が、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内にある、構
成1記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３）
前記1つ以上の変異が、TSHRの残基22～260(TSHR260)内にある、構成1又は2記載の変異
体TSHR又はその断片。
（構成４）
前記TSHR又はその断片が、哺乳動物種に由来する、構成1～3のいずれか一項記載の変異
体TSHR又はその断片。
（構成５）
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR由来であるか、又はこれから誘導される、構成4記
載の変異体TSHR又はその断片。
（構成６）
前記TSHR又はその断片が、サル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又
はウマのTSHR(配列番号:47-56)由来であるか、又はこれらから誘導される、構成4記載の
変異体TSHR又はその断片。
（構成７）
TSHR自己抗体に結合する、構成1～6のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成８）
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、構成7記載の変異体TSHR又はその断
片。
（構成９）
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも1.5倍以上大きい、構成1～8のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１０）
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片
の半減期よりも2倍以上大きい、構成9記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１１）
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片
の半減期よりも3倍以上大きい、構成9又は10記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１２）
前記変異体が、単一点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１３）
前記変異体が、二重点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１４）
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも3.5倍以上大きい、構成13記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１５）
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも5倍以上大きい、構成13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１６）
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも7倍以上大きい、構成13、14又は15記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１７）
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも3倍以上大きい、構成13～16のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１８）
前記変異体が、三重点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１９）
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253Rを含
むTSHR260変異体の半減期よりも9倍以上大きい、構成18記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成２０）
前記変異体が、四重点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成２１）
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも20倍
以上大きい、構成20記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成２２）
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも12倍
以上大きい、構成20記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成２３）
前記変異体が、五重点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成２４）
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも40倍
以上大きい、構成23記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成２５）
前記変異体が、六重点変異を含む、構成1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成２６）
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも800
倍以上大きいか、又は四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19
(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも1.
2倍以上大きい、構成25記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成２７）
前記変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、四重点変異I253R＋D14
3P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパ
ク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも3倍以上大きい、構成25記載の変異体TSHR又は
その断片。
（構成２８）
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型完全長TS
HRの半減期よりも3倍以上大きい、完全長TSHR変異体である、構成1～11のいずれか一項記
載の変異体TSHR。
（構成２９）
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも5倍以上大きい、構成28記載の変異体TSHR。
（構成３０）
前記変異体が、TSHRの残基22～260(TSHR260)内に、3つ以上の点変異を含む、構成28又
は29記載の変異体TSHR。
（構成３１）
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、構成1～27のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３２）
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T
、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA
)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかからの単一点変異を含む、構成1
～12又は28～29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３３）
前記変異体が、2つの点変異を含み、その一方がI253Rであり、その二番目が、構成32記
載の様々な変異である、構成1～11又は13～17又は28～29又は31のいずれか一項記載の変
異体TSHR又はその断片。
（構成３４）
前記変異体が、3つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がP28E、L59F、T62V、H6
3C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W(配列番号:11-17、19-2
5及び28(DNA)、配列番号:29-35、37-43及び46(タンパク質))のひとつである、構成1～11
又は18～19又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３５）
前記変異体が、4つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がR112P(配列番号:16及
び34)であり、並びにその四番目が、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170W(配列番
号:12、14、19、20、23及び24(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41及び42(タンパク質))
のひとつである、構成1～11又は20～22又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
（構成３６）
前記変異体が、5つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)で
あり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)又はH63C(配列番号:14及び32)であり、並
びにその五番目が、L59F、H63C、D151E、S166T及びV169R(配列番号:12、14、19、20、23(
DNA)、配列番号:30、32、37、38、41(タンパク質))のひとつである、構成1～11又は23～2
4又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３７）
前記変異体が、6つの変異を含み、そのひとつがI253Rであり、その二番目がD143P(配列
番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD1
51E(配列番号:19及び37)であり、その五番目がH63C(配列番号:14及び32)であり、並びに
その六番目がS166T(配列番号:20及び38)又はV169R(配列番号:23及び41)のいずれかである
、構成1～11又は25～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３８）
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T
、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA
)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかから選択された1、2、3、4、5又
は6の単一点変異を含む、構成1～37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成３９）
前記変異体が、TSHR260からなり、且つ同等の野生型が、野生型TSHR260からなる、構成
31～37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４０）
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、構成1～8又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成４１）
前記変異体へのモノクローナルTSHR抗体又はTSHの結合が、同じモノクローナルTSHR抗
体の同等の野生型TSHR又は断片への結合と比べた場合に、影響されないか、又は実質的に
影響されない、構成1～40のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４２）
前記変異体が、検出可能な標識を含む、構成1～41のいずれか一項記載の変異体TSHR又
はその断片。
（構成４３）
前記標識が、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から
選択される、構成42記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４４）
前記標識が、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む、構成42又は43
記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４５）
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、構成41、42、43又は44記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４６）
前記変異体が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、構成45記載の変異体TSHR又は
その断片。
（構成４７）
前記変異体が、構成32～40のいずれか一項以上に記載の1つ以上の変異を含む、構成46
記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４８）
前記変異体が、2つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の50℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、
構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成４９）
前記変異体が、4つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の60℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも50倍以上大きい、
構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５０）
前記変異体が、6つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の65℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも100倍以上大きい
か又は150倍以上大きい、構成45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５１）
前記熱安定性が、図12bに示された安定性アッセイにより測定される、構成1～50のいず
れか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５２）
膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片であって、ここ
で該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記
変異体TSHR又はその断片。
（構成５３）
前記変異体TSHR又はその断片が、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べて、該変
異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくとも70％
以上、少なくとも80％以上、若しくは少なくとも90％以上を含む、構成52記載の変異体TS
HR又はその断片。
（構成５４）
前記変異体が、膜貫通ドメイン内ではない1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以
上の追加的変異が、構成2～51のいずれか一項以上に記載されている、構成52又は53記載
の変異体TSHR又はその断片。
（構成５５）
前記追加的変異が、膜貫通ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含
み、この2つ以上の追加的変異が、構成2～51のいずれか一項以上に記載されている、構成
54記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５６）
前記追加的変異が、六重点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG5
5)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タ
ンパク質))を含む、構成55記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５７）
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変
異のみを含む、同等の変異体TSHR又はその断片に対して、増大した熱安定性を提供する、
構成54、55又は56記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５８）
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、膜貫通ドメイン内では
ない該追加的変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも1.2倍以上大きいか、
又は1.3倍以上大きい、構成54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成５９）
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、六重変異H63C＋R112P
＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)
、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含むTSHR変異体の半減期よりも、
1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、構成54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR
又はその断片。
（構成６０）
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、2倍以上大きい、構成5
8又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成６１）
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、3倍以上大きいか、又
は5倍以上大きい、構成58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成６２）
前記熱安定性が、図14dに示された安定性アッセイCにより測定される、構成58～61のい
ずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成６３）
前記熱安定性が、図14b及び図14cにおいてそれぞれ示された、安定性アッセイA又は安
定性アッセイBのいずれかにより測定される、構成58～61のいずれか一項記載の変異体TSH
R又はその断片。
（構成６４）
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定
性アッセイCにより測定された33℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性
が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又
はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断
片の半減期よりも、1.1倍以上大きい、構成54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
（構成６５）
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞ
れ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期に
より決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び
97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点
変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい、構成54～57の
いずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成６６）
前記TMD内の2つの点変異の少なくとも一方が、T477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列
番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択される、構成64又は65記載の変
異体TSHR又はその断片。
（構成６７）
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定
性アッセイCにより測定された40℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性
が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且
つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択
される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又
は2倍以上大きいか、又は3倍以上大きい、構成54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又
はその断片。
（構成６８）
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞ
れ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期に
より決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV59
5I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK
565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減
期よりも、1.2倍以上大きい、構成54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片
。
（構成６９）
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y
466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671
A、Y678L、Y678A (配列番号:69-88(DNA)、配列番号:89-108(タンパク質))のいずれかから
選択される単一点変異を含む、構成52～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片
。
（構成７０）
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、2つの点変異を含み、その一つがT477I(配列番号
:77及び97)又はV595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)であり、並び
にその二番目が、構成69記載の様々な変異である、構成52～57のいずれか一項記載の変異
体TSHR又はその断片。
（構成７１）
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、3つの点変異を含み、その一つがV595L(配列番号
:80及び100)であり、並びにその二番目が、Y678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番
号:79及び99))であり、並びにその三番目が、構成69記載の様々な変異である、構成52～5
7のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成７２）
1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片の精製方法であって、ここで該変異体TSH
Rが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が：
i) 変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工
程；
ii) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、前記方法。
（構成７３）
前記組成物が、培養物上清を含む、構成72記載の方法。
（構成７４）
前記変異体TSHR又はその断片が、構成2～71のいずれか一項記載のものである、構成72
又は73記載の方法。
（構成７５）
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なり、且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、構成74記載の方法。
（構成７６）
前記カラムクロマトグラフィーが、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマトグラフィー
を含む、構成72～75のいずれか一項記載の方法。
（構成７７）
前記工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又はその断片を含む組成物を、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製する工程を更に含む、構成72～76のいずれか一項記載
の方法。
（構成７８）
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び／
又は金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む、構成77記載の方法。
（構成７９）
前記方法が：
i) 該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーにより精製する工程；
ii) 該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製す
る工程；
iii) 任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィー
により更に精製する工程；
iv) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、構成72～78のいずれか一
項記載の方法。
（構成８０）
前記工程(ii)の抗体が、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合するモノク
ローナル抗体である、構成79記載の方法。
（構成８１）
前記工程(iii)が、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを含む、構成79又は80記
載の方法。
（構成８２）
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり
、且つ任意にpH5.0±0.2の溶出緩衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2の溶出緩衝液に
よる溶出を含む、構成77～81のいずれか一項記載の方法。
（構成８３）
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なり、且つH63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18
、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、構成72～82のいずれ
か一項記載の方法。
（構成８４）
構成72～83のいずれか一項記載の方法により得られた、構成2～71のいずれか一項記載
の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成８５）
構成72～83のいずれか一項記載の方法により入手可能な、構成2～71のいずれか一項記
載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成８６）
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、構成84又は85記載の精製された変異体TSHR又はその断片
。
（構成８７）
前記変異体が、構成42～46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、構成84、85又
は86記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成８８）
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにお
いて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性よりもより大きいことを特徴とす
る、構成1～71のいずれか一項又は構成84～87のいずれか一項記載の精製された変異体TSH
R又はその断片。
（構成８９）
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにお
いて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、500倍以上大きいことを
特徴とする、構成1～71のいずれか一項又は構成84～87のいずれか一項記載の精製された
変異体TSHR又はその断片。
（構成９０）
前記活性が、1000倍以上大きい、構成89記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９１）
前記活性が、5000倍以上大きい、構成89又は90記載の精製された変異体TSHR又はその断
片。
（構成９２）
前記活性が、タンパク質1mgあたりの活性として表現された比活性である、構成88～91
のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９３）
前記TSHR活性アッセイが、該変異体のTSHR自己抗体へ結合する能力を測定する、構成88
～92のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９４）
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、構成93記載の精製された変異体TSH
R又はその断片。
（構成９５）
前記TSHR活性アッセイが、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験されるべき
変異体を含む、構成88～94のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９６）
前記TSHR活性アッセイが、図12a又は図13cに示されたアッセイを含む、構成88～95のい
ずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９７）
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ構成86に示された変異のセットの一つを含む、構成88～96のいずれか一項記載の精製
された変異体TSHR又はその断片。
（構成９８）
前記変異体が、H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、
16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、構成88～97の
いずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
（構成９９）
前記変異体又はその断片が、脱グリコシル化されている、構成1～71又は構成84～98の
いずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１００）
前記変異体が、少なくともひとつの二重点変異を含む、構成99記載の変異体TSHR又はそ
の断片。
（構成１０１）
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、構成99又は100記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１０２）
TSHRに対する被検自己抗体を検出するための診断方法であって、該方法が、被検自己抗
体の試料を、構成1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片と接触
させることを含む、前記診断方法。
（構成１０３）
前記被検自己抗体の試料が、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離され
た、構成102記載の診断方法。
（構成１０４）
前記試料が、ヒト又は動物の患者の血清を含む、構成102又は103記載の診断方法。
（構成１０５）
前記方法が：
a) 対象由来の体液試料を提供する工程；
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、構成1
～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である工程；
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これ
により該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含
む1種以上の複合体を形成する工程；
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で
形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又
は引き続き固形支持体に固定される工程；
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供
し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)
の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)に
おいて形成された複合体の存在を検出する工程：を含む、構成102、103又は104記載の診
断方法。
（構成１０６）
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、TSH受容体の1以上のエピトー
プ、又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む、完全長TSHRである、
構成105記載の診断方法。
（構成１０７）
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、構成1～71又は84～101のいず
れか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、構成105記載の診断方法。
（構成１０８）
前記TSHRの第一の給源又はTSHRの第二の給源のいずれか、又は両方の変異体TSHR又はそ
の断片が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、
構成102～106のいずれか一項記載の診断方法。
（構成１０９）
前記標識手段が、構成42～46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、構成105～1
08のいずれか一項記載の診断方法。
（構成１１０）
前記変異体が、標識手段により、直接標識される、構成109記載の診断方法。
（構成１１１）
前記標識手段が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、構成109又は110記載の診断
方法。
（構成１１２）
前記TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段が、モノクローナル抗体、組
換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む、構成105～111のいずれか一項記載の診断方
法。
（構成１１３）
前記TSHRに対する被検自己抗体を検出するためのキットであって、該キットが：
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、構成1～71又は84～1
01のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片であるもの；
c) 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試
料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、
[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する
手段；
d) (c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、(c)の前に、又
は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段；
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された(c)において形成され
た複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な
標識手段；並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、(c)において形成された複合体
の存在を検出する手段：を含む、前記キット。
（構成１１４）
構成106～112のいずれか一項以上に記載の特徴のいずれかひとつ以上を含む、構成113
記載のキット。
（構成１１５）
前記(a)において提供された該TSHRの第一の給源が、構成1～71又は84～101のいずれか
一項記載の変異体TSHR又はその断片である、構成113又は構成114記載のキット。
（構成１１６）
構成1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片がそれに直接又は
間接に結合された固形支持体。
（構成１１７）
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、構成116記載の固形支持体。
（構成１１８）
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、構成116又は117記載の固形支持体。
（構成１１９）
前記変異体が、該支持体に直接結合される、構成116～118のいずれか一項記載の固形支
持体。
（構成１２０）
前記支持体が、1個以上のウェルを含むELISAプレートである、構成116～119のいずれか
一項記載の固形支持体。
（構成１２１）
構成116～120のいずれか一項記載の固形支持体を含む、キット。
（構成１２２）
前記TSHRに対するモノクローナル自己抗体若しくはそれらの断片、TSHRに対する組換え
抗体又は患者のTRAbを検出するための、構成116～120のいずれか一項記載の固形支持体、
又は、構成121記載のキットの使用。
（構成１２３）
医薬品中での使用のための、構成1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又
はその断片。
（構成１２４）
前記TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbの検出において使用するための、構成1
～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１２５）
循環している患者TRAbを吸収させるために治療的有効量で使用するための、構成1～71
又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
（構成１２６）
小型分子薬物の新規スカフォールドを同定するための小型-分子断片スクリーニングの
ための、構成1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片の使用。
（構成１２７）
構成1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片へ結合されている
固相カラムを通して対象の血液の試料を通過させ、且つ該変異体TSHR又はその断片上に該
血液中の循環TRAbを吸収させることを含む、対象におけるTSH受容体に対する免疫応答に
関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法。
（構成１２８）
下記の点変異の1以上：T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S17
2C、R247Y、E357K、D358K、Q391N、L400Y、N403A、I411V、Y414F,L415P、T425I、Q437H、
K513L、V543I、C548R、Y549F、S596L、K608D、H615V、S619A、Y626L及びY626A：を含む、
変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片。
（構成１２９）
下記の点変異の1以上：P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167
W、S176C、I249R、E354K、D355K、R388N、L397Y、N400A、M408V、Y411F、L412P、T422I、
Q434H、K510L、V540I、C545R、Y546F、A593L、K605D、Y612V、S616A、Y623L又はY623A：
を含む、変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
（構成１３０）
それぞれ、ヒトFSHR又はLHRである、構成128記載の変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSH
R)又はその断片、若しくは、構成129記載の変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断
片。
（構成１３１）
a. 図6(配列番号:29-46)又は図30(配列番号:89-108)に示された変異体TSHR又はその断
片のアミノ酸配列をコードしている、図5(配列番号:11-28)又は図29(配列番号:69-88)に
示された、ヌクレオチド配列；
b. コードの縮重のために、コドン配列において(a)の任意の配列とは異なるヌクレオチ
ド配列；
c. (a)の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列；
d. (a-c)の任意の配列の断片を含むヌクレオチド配列；
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、(a)の配列と異なり、且つ変異体
TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列：を含むポリヌク
レオチド。
（構成１３２）
構成131記載のポリヌクレオチドを保有し、且つ宿主生物のゲノムへこのポリヌクレオ
チドを導入することが可能である、生物学的機能性ベクターシステム。
（構成１３３）
構成131記載のポリヌクレオチドで形質転換される宿主細胞。


Claims (133)

1つ以上の変異を含む、変異体甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)又はその断片であって
、ここで該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する
、前記変異体TSHR又はその断片。
前記1つ以上の変異が、TSHRの細胞外ロイシン-リッチ反復ドメイン(LRD)内にある、請
求項1記載の変異体TSHR又はその断片。
前記1つ以上の変異が、TSHRの残基22～260(TSHR260)内にある、請求項1又は2記載の変
異体TSHR又はその断片。
前記TSHR又はその断片が、哺乳動物種に由来する、請求項1～3のいずれか一項記載の変
異体TSHR又はその断片。
前記TSHR又はその断片が、ヒトTSHR由来であるか、又はこれから誘導される、請求項4
記載の変異体TSHR又はその断片。
前記TSHR又はその断片が、サル、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒツジ又
はウマのTSHR(配列番号:47-56)由来であるか、又はこれらから誘導される、請求項4記載
の変異体TSHR又はその断片。
TSHR自己抗体に結合する、請求項1～6のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、請求項7記載の変異体TSHR又はその
断片。
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも1.5倍以上大きい、請求項1～8のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片
の半減期よりも2倍以上大きい、請求項9記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の42℃での半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片
の半減期よりも3倍以上大きい、請求項9又は10記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、単一点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体が、二重点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも3.5倍以上大きい、請求項13記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも5倍以上大きい、請求項13又は14記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の42℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも7倍以上大きい、請求項13、14又は15記載の変異体TSHR又はその断片
。
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも3倍以上大きい、請求項13～16のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体が、三重点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253Rを含
むTSHR260変異体の半減期よりも9倍以上大きい、請求項18記載の変異体TSHR又はその断片
。
前記変異体が、四重点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも20倍
以上大きい、請求項20記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも12倍
以上大きい、請求項20記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、五重点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも40倍
以上大きい、請求項23記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、六重点変異を含む、請求項1～11のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体の55℃でのその半減期により決定される熱安定性が、単一点変異I253R(配列
番号:27及び45、それぞれ、DNA及びタンパク質)を含むTSHR260変異体の半減期よりも800
倍以上大きいか、又は四重点変異I253R＋D143P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19
(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも1.
2倍以上大きい、請求項25記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の60℃でのその半減期により決定される熱安定性が、四重点変異I253R＋D14
3P＋R112P＋D151E(配列番号:27、18、16、19(DNA)及び配列番号:45、36、34、37(タンパ
ク質))を含むTSHR260変異体の半減期よりも3倍以上大きい、請求項25記載の変異体TSHR又
はその断片。
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型完全長TS
HRの半減期よりも3倍以上大きい、完全長TSHR変異体である、請求項1～11のいずれか一項
記載の変異体TSHR。
前記変異体の50℃でのその半減期により決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は
断片の半減期よりも5倍以上大きい、請求項28記載の変異体TSHR。
前記変異体が、TSHRの残基22～260(TSHR260)内に、3つ以上の点変異を含む、請求項28
又は29記載の変異体TSHR。
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、請求項1～27のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T
、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA
)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかからの単一点変異を含む、請求項
1～12又は28～29又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、2つの点変異を含み、その一方がI253Rであり、その二番目が、請求項32
記載の様々な変異である、請求項1～11又は13～17又は28～29又は31のいずれか一項記載
の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、3つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がP28E、L59F、T62V、H6
3C、L64Y、R112P、P142I、D151E、S166T、P168Y、V169R及びN170W(配列番号:11-17、19-2
5及び28(DNA)、配列番号:29-35、37-43及び46(タンパク質))のひとつである、請求項1～1
1又は18～19又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、4つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、並びにその三番目がR112P(配列番号:16及
び34)であり、並びにその四番目が、L59F、H63C、D151E、S166T、V169R及びN170W(配列番
号:12、14、19、20、23及び24(DNA)、配列番号:30、32、37、38、41及び42(タンパク質))
のひとつである、請求項1～11又は20～22又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又
はその断片。
前記変異体が、5つの点変異を含み、その一つがI253R(配列番号:27及び45)であり、そ
の二番目がD143P(配列番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)で
あり、その四番目がD151E(配列番号:19及び37)又はH63C(配列番号:14及び32)であり、並
びにその五番目が、L59F、H63C、D151E、S166T及びV169R(配列番号:12、14、19、20、23(
DNA)、配列番号:30、32、37、38、41(タンパク質))のひとつである、請求項1～11又は23
～24又は28～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、6つの変異を含み、そのひとつがI253Rであり、その二番目がD143P(配列
番号:18及び36)であり、その三番目がR112P(配列番号:16及び34)であり、その四番目がD1
51E(配列番号:19及び37)であり、その五番目がH63C(配列番号:14及び32)であり、並びに
その六番目がS166T(配列番号:20及び38)又はV169R(配列番号:23及び41)のいずれかである
、請求項1～11又は25～31のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、P28E、L59F、T62V、H63C、L64Y、R112P、P142I、D143P、D151E、S166T
、I167F、P168Y、V169R、N170W、T179C、I253R及びR255Y(配列番号:11-25、27及び28(DNA
)、配列番号:29-43、45及び46(タンパク質))のいずれかから選択された1、2、3、4、5又
は6の単一点変異を含む、請求項1～37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、TSHR260からなり、且つ同等の野生型が、野生型TSHR260からなる、請求
項31～37のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、請求項1～8又は31のいずれか一項記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体へのモノクローナルTSHR抗体又はTSHの結合が、同じモノクローナルTSHR抗
体の同等の野生型TSHR又は断片への結合と比べた場合に、影響されないか、又は実質的に
影響されない、請求項1～40のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、検出可能な標識を含む、請求項1～41のいずれか一項記載の変異体TSHR
又はその断片。
前記標識が、酵素標識、同位体標識、化学発光標識、蛍光標識及び色素からなる群から
選択される、請求項42記載の変異体TSHR又はその断片。
前記標識が、アルカリホスファターゼ(AP)標識又はビオチン標識を含む、請求項42又は
43記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、請求項41、42、43又は44記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、請求項45記載の変異体TSHR又
はその断片。
前記変異体が、請求項32～40のいずれか一項以上に記載の1つ以上の変異を含む、請求
項46記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、2つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の50℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも5倍以上大きい、
請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、4つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の60℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも50倍以上大きい、
請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、6つ以上の点変異を含み、且つここで該変異体の65℃でのその半減期に
より決定される熱安定性が、同等の野生型TSHR又は断片の半減期よりも100倍以上大きい
か又は150倍以上大きい、請求項45、46又は47記載の変異体TSHR又はその断片。
前記熱安定性が、図12bに示された安定性アッセイにより測定される、請求項1～50のい
ずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
膜貫通ドメイン(TMD)内に1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片であって、ここ
で該変異体TSHRが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有する、前記
変異体TSHR又はその断片。
前記変異体TSHR又はその断片が、完全長TSHRであるか、又は完全長TSHRに比べて、該変
異体中に存在するアミノ酸の数により測定される時、完全長TSHRの長さの少なくとも70％
以上、少なくとも80％以上、若しくは少なくとも90％以上を含む、請求項52記載の変異体
TSHR又はその断片。
前記変異体が、膜貫通ドメイン内ではない1つ以上の追加的変異を更に含み、この1つ以
上の追加的変異が、請求項2～51のいずれか一項以上に記載されている、請求項52又は53
記載の変異体TSHR又はその断片。
前記追加的変異が、膜貫通ドメイン内ではない、少なくとも2つ以上の追加的変異を含
み、この2つ以上の追加的変異が、請求項2～51のいずれか一項以上に記載されている、請
求項54記載の変異体TSHR又はその断片。
前記追加的変異が、六重点変異H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG5
5)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タ
ンパク質))を含む、請求項55記載の変異体TSHR又はその断片。
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の1つ以上の変異が、膜貫通ドメイン内ではない該追加的変
異のみを含む、同等の変異体TSHR又はその断片に対して、増大した熱安定性を提供する、
請求項54、55又は56記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、膜貫通ドメイン内では
ない該追加的変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも1.2倍以上大きいか、
又は1.3倍以上大きい、請求項54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、六重変異H63C＋R112P
＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (TSHR-JMG55)(配列番号:14、16、18、19、23及び27(DNA)
、配列番号:32、34、36、37、41及び45(タンパク質))を含むTSHR変異体の半減期よりも、
1.2倍以上大きいか、又は1.3倍以上大きい、請求項54～57のいずれか一項記載の変異体TS
HR又はその断片。
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、2倍以上大きい、請求
項58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体の33℃でのその半減期により決定される熱安定性が、3倍以上大きいか、又
は5倍以上大きい、請求項58又は59記載の変異体TSHR又はその断片。
前記熱安定性が、図14dに示された安定性アッセイCにより測定される、請求項58～61の
いずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記熱安定性が、図14b及び図14cにおいてそれぞれ示された、安定性アッセイA又は安
定性アッセイBのいずれかにより測定される、請求項58～61のいずれか一項記載の変異体T
SHR又はその断片。
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定
性アッセイCにより測定された33℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性
が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列番号:80及び100)又
はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点変異のみを含む、同等のTSHR又は断
片の半減期よりも、1.1倍以上大きい、請求項54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又
はその断片。
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に2つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞ
れ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期に
より決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内にT477I(配列番号:77及び
97)、V595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択された単一点
変異のみを含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.5倍以上大きい、請求項54～57
のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記TMD内の2つの点変異の少なくとも一方が、T477I(配列番号:77及び97)、V595I(配列
番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)から選択される、請求項64又は65記載の
変異体TSHR又はその断片。
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14dに示された安定
性アッセイCにより測定された40℃でのその半減期により決定される該変異体の熱安定性
が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV595I(配列番号:80及び100)であり、且
つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番号:79及び99)から選択
される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減期よりも、1.2倍以上大きいか、又
は2倍以上大きいか、又は3倍以上大きい、請求項54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR
又はその断片。
変異体が、膜貫通ドメイン(TMD)内に3つの点変異を含み、ここで図14b及び14cにそれぞ
れ示された安定性アッセイA又は安定性アッセイBにより測定された55℃でのその半減期に
より決定される該変異体の熱安定性が、膜貫通ドメイン(TMD)内に、その第一の変異がV59
5I(配列番号:80及び100)であり、且つその第二の変異がY678L(配列番号:87及び107)又はK
565L(配列番号:79及び99)から選択される二重点変異を含む、同等のTSHR又は断片の半減
期よりも、1.2倍以上大きい、請求項54～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断
片。
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、E409K、D410K、H443N、L452Y、N455A、M463V、Y
466F、L467P、T477I、Q489H、K565L、V595I、C600R、Y601F、I648L、K660D、Y667V、S671
A、Y678L、Y678A (配列番号:69-88(DNA)、配列番号:89-108(タンパク質))のいずれかから
選択される単一点変異を含む、請求項52～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断
片。
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、2つの点変異を含み、その一つがT477I(配列番号
:77及び97)又はV595I(配列番号:80及び100)又はI648L(配列番号:83及び103)であり、並び
にその二番目が、請求項69記載の様々な変異である、請求項52～57のいずれか一項記載の
変異体TSHR又はその断片。
前記膜貫通ドメイン(TMD)内の変異が、3つの点変異を含み、その一つがV595L(配列番号
:80及び100)であり、並びにその二番目が、Y678L(配列番号:87及び107)又はK565L(配列番
号:79及び99))であり、並びにその三番目が、請求項69記載の様々な変異である、請求項5
2～57のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
1つ以上の変異を含む変異体TSHR又はその断片の精製方法であって、ここで該変異体TSH
Rが、同等の野生型TSHR又は断片に対して増大した熱安定性を有し、該方法が：
i) 変異体又はその断片を含む組成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製する工
程；
ii) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、前記方法。
前記組成物が、培養物上清を含む、請求項72記載の方法。
前記変異体TSHR又はその断片が、請求項2～71のいずれか一項記載のものである、請求
項72又は73記載の方法。
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なり、且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、請求項74記載の方法。
前記カラムクロマトグラフィーが、陽イオン交換又は陰イオン交換クロマトグラフィー
を含む、請求項72～75のいずれか一項記載の方法。
前記工程i)の前又は後のいずれかに、該変異体又はその断片を含む組成物を、アフィニ
ティクロマトグラフィーにより精製する工程を更に含む、請求項72～76のいずれか一項記
載の方法。
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィー及び／
又は金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項77記載の方法。
前記方法が：
i) 該変異体又はその断片を含む組成物を、陽イオン交換又は陰イオン交換カラムクロ
マトグラフィーにより精製する工程；
ii) 該変異体又はその断片を、抗体アフィニティクロマトグラフィーにより更に精製す
る工程；
iii) 任意に、該変異体又はその断片を、金属イオンアフィニティクロマトグラフィー
により更に精製する工程；
iv) 精製された変異体又はその断片を収集する工程：を含む、請求項72～78のいずれか
一項記載の方法。
前記工程(ii)の抗体が、TSHR細胞外ドメイン内の立体配座エピトープに結合するモノク
ローナル抗体である、請求項79記載の方法。
前記工程(iii)が、ニッケル-アフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項79又は80
記載の方法。
前記アフィニティクロマトグラフィーが、抗体アフィニティクロマトグラフィーであり
、且つ任意にpH5.0±0.2の溶出緩衝液による溶出が先行する、pH4.5±0.2の溶出緩衝液に
よる溶出を含む、請求項77～81のいずれか一項記載の方法。
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なり、且つH63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18
、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、請求項72～82のいず
れか一項記載の方法。
請求項72～83のいずれか一項記載の方法により得られた、請求項2～71のいずれか一項
記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
請求項72～83のいずれか一項記載の方法により入手可能な、請求項2～71のいずれか一
項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、請求項84又は85記載の精製された変異体TSHR又はその断
片。
前記変異体が、請求項42～46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、請求項84、
85又は86記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにお
いて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性よりもより大きいことを特徴とす
る、請求項1～71のいずれか一項又は請求項84～87のいずれか一項記載の精製された変異
体TSHR又はその断片。
前記精製された変異体のTSHR活性アッセイにおける活性が、同じTSHR活性アッセイにお
いて測定された培養物上清由来の未精製の変異体の活性と比べ、500倍以上大きいことを
特徴とする、請求項1～71のいずれか一項又は請求項84～87のいずれか一項記載の精製さ
れた変異体TSHR又はその断片。
前記活性が、1000倍以上大きい、請求項89記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記活性が、5000倍以上大きい、請求項89又は90記載の精製された変異体TSHR又はその
断片。
前記活性が、タンパク質1mgあたりの活性として表現された比活性である、請求項88～9
1のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記TSHR活性アッセイが、該変異体のTSHR自己抗体へ結合する能力を測定する、請求項
88～92のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記TSHR自己抗体が、M22、K1-70又はK1-18である、請求項93記載の精製された変異体T
SHR又はその断片。
前記TSHR活性アッセイが、ELISAプレートに直接又は間接に結合された試験されるべき
変異体を含む、請求項88～94のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記TSHR活性アッセイが、図12a又は図13cに示されたアッセイを含む、請求項88～95の
いずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ請求項86に示された変異のセットの一つを含む、請求項88～96のいずれか一項記載の
精製された変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、
16、18、19、23、27、32、34、36、37、41及び45)の変異のセットを含む、請求項88～97
のいずれか一項記載の精製された変異体TSHR又はその断片。
前記変異体又はその断片が、脱グリコシル化されている、請求項1～71又は請求項84～9
8のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
前記変異体が、少なくともひとつの二重点変異を含む、請求項99記載の変異体TSHR又は
その断片。
前記変異体が、TSHRのサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になり、
且つ下記の変異のセットのひとつ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、請求項99又は100記載の変異体TSHR又はその断片。
TSHRに対する被検自己抗体を検出するための診断方法であって、該方法が、被検自己抗
体の試料を、請求項1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片と接
触させることを含む、前記診断方法。
前記被検自己抗体の試料が、かかる被検自己抗体を含むと考えられる対象から単離され
た、請求項102記載の診断方法。
前記試料が、ヒト又は動物の患者の血清を含む、請求項102又は103記載の診断方法。
前記方法が：
a) 対象由来の体液試料を提供する工程；
b) TSHR又はその断片の第一の給源の1種以上を提供する工程；
c) TSHRの第二の給源の1種以上を提供する工程であって、ここで第二の給源は、請求項
1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である工程；
d) 該TSHRの第一及び第二の給源を、同時に又は連続して該体液試料と接触させ、これ
により該TSHRに対する抗体が、[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含
む1種以上の複合体を形成する工程；
e) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、固定手段を提供し、これにより工程(d)で
形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源が、工程(d)の前に、又は同時に、又
は引き続き固形支持体に固定される工程；
f) 工程(d)の前に又は同時に又は引き続き、直接又は間接に検出可能な標識手段を提供
し、これにより工程(d)で形成された複合体中に存在する該TSHRの第二の給源に、工程(d)
の前に、又は同時に、又は引き続きかかる直接又は間接標識手段を提供する工程；並びに
g) 該体液試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、工程(e)に従い工程(d)に
おいて形成された複合体の存在を検出する工程：を含む、請求項102、103又は104記載の
診断方法。
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、TSH受容体の1以上のエピトー
プ、又はTSH受容体の1以上のエピトープを含むポリペプチドを含む、完全長TSHRである、
請求項105記載の診断方法。
前記工程(b)において提供されたTSHRの該第一の給源が、請求項1～71又は84～101のい
ずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片である、請求項105記載の診断方法。
前記TSHRの第一の給源又はTSHRの第二の給源のいずれか、又は両方の変異体TSHR又はそ
の断片が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的になる、
請求項102～106のいずれか一項記載の診断方法。
前記標識手段が、請求項42～46のいずれか一項記載の検出可能な標識を含む、請求項10
5～108のいずれか一項記載の診断方法。
前記変異体が、標識手段により、直接標識される、請求項109記載の診断方法。
前記標識手段が、アルカリホスファターゼ(AP)標識を含む、請求項109又は110記載の診
断方法。
前記TSHRの第一の給源が固形支持体へ固定される固定手段が、モノクローナル抗体、組
換え抗体、合成抗体又はそれらの断片を含む、請求項105～111のいずれか一項記載の診断
方法。
前記TSHRに対する被検自己抗体を検出するためのキットであって、該キットが：
a) TSHR又はその断片の1種以上の第一の給源；
b) TSHRの1種以上の第二の給源であって、ここで該第二の給源が、請求項1～71又は84
～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片であるもの；
c) 該TSHRの第一及び第二の給源を、TSHRに対する被検自己抗体を含むと考えられる試
料と、同時に又は連続して接触させる手段であって、これにより該TSHRに対する抗体が、
[第一の給源のTSHR]-[TSHR抗体]-[第二の給源のTSHR]を含む1種以上の複合体を形成する
手段；
d) (c)において形成された複合体中に存在する該TSHRの第一の給源を、(c)の前に、又
は同時に、又は引き続き、固形支持体へ固定するための固定手段；
e) 該複合体の形成の前に、又は同時に、又は引き続き標識された(c)において形成され
た複合体中に存在する該TSHRの第二の給源を、直接又は間接に標識するための検出可能な
標識手段；並びに
f) 該試料中のTSHR抗体の存在の指標を提供するために、(c)において形成された複合体
の存在を検出する手段：を含む、前記キット。
請求項106～112のいずれか一項以上に記載の特徴のいずれかひとつ以上を含む、請求項
113記載のキット。
前記(a)において提供された該TSHRの第一の給源が、請求項1～71又は84～101のいずれ
か一項記載の変異体TSHR又はその断片である、請求項113又は請求項114記載のキット。
請求項1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片がそれに直接又
は間接に結合された固形支持体。
前記変異体が、TSHR受容体のサブドメインTSHR260からなるか、又はこれから本質的に
なる、請求項116記載の固形支持体。
前記変異体が、下記の変異のセットの一つ：
1) I253R (図5及び6；配列番号:27及び45)
2) D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:18、27、36及び45)
3) R112P＋D143P＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、27、34、36及び45)
4) R112P＋D143P＋D151E＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、27、34、36、37及
び45)
5) R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:16、18、19、23、27、3
4、36、37、41及び45)
6) H63C＋R112P＋D143P＋D151E＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、19
、23、27、32、34、36、37、41及び45)
7) H63C＋R112P＋D143P＋V169R＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、23、27、32
、34、36、41及び45)
8) H63C＋R112P＋D143P＋S166T＋I253R (図5及び6；配列番号:14、16、18、20、27、32
、34、36、38及び45)：を含む、請求項116又は117記載の固形支持体。
前記変異体が、該支持体に直接結合される、請求項116～118のいずれか一項記載の固形
支持体。
前記支持体が、1個以上のウェルを含むELISAプレートである、請求項116～119のいずれ
か一項記載の固形支持体。
請求項116～120のいずれか一項記載の固形支持体を含む、キット。
前記TSHRに対するモノクローナル自己抗体若しくはそれらの断片、TSHRに対する組換え
抗体又は患者のTRAbを検出するための、請求項116～120のいずれか一項記載の固形支持体
、又は、請求項121記載のキットの使用。
医薬品中での使用のための、請求項1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR
又はその断片。
前記TSHRモノクローナル自己抗体又は患者TRAbの検出において使用するための、請求項
1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
循環している患者TRAbを吸収させるために治療的有効量で使用するための、請求項1～7
1又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片。
小型分子薬物の新規スカフォールドを同定するための小型-分子断片スクリーニングの
ための、請求項1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片の使用。
請求項1～71又は84～101のいずれか一項記載の変異体TSHR又はその断片へ結合されてい
る固相カラムを通して対象の血液の試料を通過させ、且つ該変異体TSHR又はその断片上に
該血液中の循環TRAbを吸収させることを含む、対象におけるTSH受容体に対する免疫応答
に関連した自己免疫疾患を治療するインビトロ方法。
下記の点変異の1以上：T56V、L58Y、N106P、P136I、D137P、Q145E、I160F、N163W、S17
2C、R247Y、E357K、D358K、Q391N、L400Y、N403A、I411V、Y414F,L415P、T425I、Q437H、
K513L、V543I、C548R、Y549F、S596L、K608D、H615V、S619A、Y626L及びY626A：を含む、
変異体卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)又はその断片。
下記の点変異の1以上：P33E、L56F、V61Y、K109P、P139I、D140P、I164F、P165Y、N167
W、S176C、I249R、E354K、D355K、R388N、L397Y、N400A、M408V、Y411F、L412P、T422I、
Q434H、K510L、V540I、C545R、Y546F、A593L、K605D、Y612V、S616A、Y623L又はY623A：
を含む、変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はその断片。
それぞれ、ヒトFSHR又はLHRである、請求項128記載の変異体卵胞刺激ホルモン受容体(F
SHR)又はその断片、若しくは、請求項129記載の変異体黄体化ホルモン受容体(LHR)又はそ
の断片。
a. 図6(配列番号:29-46)又は図30(配列番号:89-108)に示された変異体TSHR又はその断
片のアミノ酸配列をコードしている、図5(配列番号:11-28)又は図29(配列番号:69-88)に
示された、ヌクレオチド配列；
b. コードの縮重のために、コドン配列において(a)の任意の配列とは異なるヌクレオチ
ド配列；
c. (a)の任意の配列の対立遺伝子変動を含むヌクレオチド配列；
d. (a-c)の任意の配列の断片を含むヌクレオチド配列；
e. ヌクレオチド塩基の変異、欠失又は置換のために、(a)の配列と異なり、且つ変異体
TSHR又はその断片のアミノ酸配列をコードしている、ヌクレオチド配列：を含むポリヌク
レオチド。
請求項131記載のポリヌクレオチドを保有し、且つ宿主生物のゲノムへこのポリヌクレ
オチドを導入することが可能である、生物学的機能性ベクターシステム。
請求項131記載のポリヌクレオチドで形質転換される宿主細胞。
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