JP2022076831A - Method for detecting hbv-derived cccdna by digital pcr, and reagent for detecting hbv-derived cccdna - Google Patents

Abstract

To provide a method for accurately detecting HBV-derived cccDNA by digital PCR.SOLUTION: The inventive method for detecting HBV-derived cccDNA by digital PCR includes the steps of: the step for allocating a DNA-containing sample into micro compartments, and a detection step for detecting an amplification of HBV-derived cccDNA using a primer, and a hybridization of a resultant amplified product and a probe for HBV-derived cccDNA, for the DNA-containing sample allocated into the micro compartments. The allocated biological sample is a sample untreated with DNA decomposition enzyme.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、デジタルＰＣＲによるＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法およびＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出用試薬に関する。 The present invention relates to a method for detecting HBV-derived ccDNA by digital PCR and a reagent for detecting HBV-derived ccDNA.

Ｂ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus: ＨＢＶ）は、その感染が急性肝炎または慢性肝炎の発症の原因となり、長期化すると、肝硬変および肝細胞癌に到ることが知られている。 It is known that hepatitis B virus (HBV) causes liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma when its infection causes the development of acute hepatitis or chronic hepatitis, and if it is prolonged.

ＨＢＶは、通常、成熟型DNA (relaxed circular DNA: ｒｃＤＮＡ)の状態で存在する。そして、ＨＢＶが細胞に感染し、細胞質から核内に侵入すると、宿主である細胞の持っている酵素等で複製中間体である共有結合性閉環状ＤＮＡ（covalently closed circular DNA: ｃｃｃＤＮＡ）に変化する。これがＲＮＡに転写され、転写されたＲＮＡは、細胞質に放出され、ウイルスが持っている逆転写酵素により再度ＤＮＡ（relaxed circular DNA: ｒｃＤＮＡ）に転写され、成熟型のＨＢＶとして細胞外に放出される。ＨＢＶ感染に対する現在の治療薬は、前記逆転写酵素に対する阻害剤が一般的であり、これによって、ＲＮＡからＤＮＡへの再度の転写（ｒｃＤＮＡへの転写）を阻害し、複製されたＨＢＶが細胞外に放出することを抑制している。しかしながら、この治療薬では、核内に存在するｃｃｃＤＮＡが除去できないため、投与を中断すると、ｃｃｃＤＮＡからＲＮＡに転写が起こり、その後、ＲＮＡからｒｃＤＮＡへの逆転写も再開されてしまう。このため、逆転写酵素による工程よりも上流に作用する治療薬、具体的にはｃｃｃＤＮＡの合成阻害等、核内のｃｃｃＤＮＡを除去する治療薬の開発が望まれている。 HBV usually exists in the state of mature circular DNA (rcc). When HBV infects a cell and invades the nucleus from the cytoplasm, it changes to covalently closed circular DNA (ccDNA), which is a replication intermediate, by an enzyme possessed by the host cell or the like. .. This is transcribed into RNA, and the transcribed RNA is released into the cytoplasm, transcribed again into DNA (relaxed circular DNA: rcDNA) by the reverse transcriptase possessed by the virus, and released extracellularly as mature HBV. .. Current therapeutic agents for HBV infection are generally inhibitors against the reverse transcriptase, which inhibits re-transcription from RNA to DNA (transcription to rcDNA), thereby causing the replicated HBV to be extracellular. It suppresses the release to. However, since the ccDNA present in the nucleus cannot be removed with this therapeutic agent, when administration is interrupted, transcription occurs from ccDNA to RNA, and then reverse transcription from RNA to rcDNA is also resumed. Therefore, it is desired to develop a therapeutic drug that acts upstream from the step by reverse transcriptase, specifically, a therapeutic drug that removes ccDNA in the nucleus, such as inhibition of ccDNA synthesis.

このような新たな治療薬の開発にあたっては、複製中間体であるｃｃｃＤＮＡを精度良く検出することが重要となる。しかしながら、ｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡとは、前者が不完全な環状の二本鎖ＤＮＡであるのに対して、後者が完全な二本鎖ＤＮＡであるという違いのみであり、塩基配列は共通している。このためｒｃＤＮＡとｃｃｃＤＮＡとの区別はサザンブロット法等を用いて行われているが、同法はＰＣＲに比べ非常に工程が複雑で、熟練の技術が必要である。また数コピーレベルで検出し分けることは困難との問題がある。 In developing such a new therapeutic agent, it is important to accurately detect ccDNA, which is a replication intermediate. However, the only difference between r cDNA and cc cDNA is that the former is an incomplete circular double-stranded DNA, while the latter is a complete double-stranded DNA, and the base sequences are common. For this reason, the distinction between r cDNA and cc cDNA is performed by using the Southern blotting method or the like, but this method is much more complicated than PCR and requires skillful techniques. In addition, there is a problem that it is difficult to detect and distinguish at several copy levels.

そこで、現在、ＰＣＲを利用した検出が試みられており、特に、微量な分子の分別能力に優れることから、デジタルＰＣＲによるｃｃｃＤＮＡの検出が試みられている（非特許文献１）。 Therefore, at present, detection using PCR is being attempted, and in particular, detection of cccDNA by digital PCR is being attempted because of its excellent ability to separate trace molecules (Non-Patent Document 1).

Gian Paolo Caviglia et ai. Quantitation of HBV cccDNA in anti-HBc-positive liver donors by droplet digital PCR: A new tool to detect occult infection. Journal of Hepatology 2018; vol. 69; 301-307.Gian Paolo Caviglia et ai. Quantitation of HBV cccDNA in anti-HBc-positive liver donors by droplet digital PCR: A new tool to detect occult infection. Journal of Hepatology 2018; vol. 69; 301-307.

そこで、本発明は、デジタルＰＣＲによりＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡをより精度良く検出する方法の提供を目的とし、さらに、それに用いる検出用試薬の提供を目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for detecting HBV-derived ccDNA with higher accuracy by digital PCR, and further to provide a detection reagent used for the method.

前記目的を達成するために、本発明のデジタルＰＣＲによるＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡ（以下、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡという）の検出方法は、ＤＮＡ含有試料を微小区画に分配する工程と、前記微小区画に分配した前記ＤＮＡ含有試料について、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプライマーを用いた増幅、および得られた増幅産物とＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプローブとのハイブリダイズを検出する検出工程とを含み、前記分配する生体試料が、ＤＮＡ分解酵素で処理されていない試料であることを特徴とする。 In order to achieve the above object, the method for detecting HBV-derived ccDNA (hereinafter referred to as HBVccDNA) by digital PCR of the present invention includes a step of distributing a DNA-containing sample into micro-compartments and the DNA-containing sample distributed into the micro-compartments. The biological sample to be distributed is a sample not treated with a DNA degrading enzyme, which comprises an amplification using a primer for HBVcc cDNA and a detection step for detecting a hybrid between the obtained amplification product and a probe for HBVcc cDNA. It is characterized by being.

本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡ（ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ）の検出用試薬は、配列番号６の塩基配列からなるプローブを含むことを特徴とする。 The reagent for detecting HBV-derived cc cDNA (HBVcc cDNA) of the present invention is characterized by containing a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6.

ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出においては、前述のように、試料中に同じ塩基配列のＨＢＶ由来ｒｃＤＮＡ（以下、ＨＢＶｒｃＤＮＡ）が共存することによって、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出精度が低下すると考えられていた。特に、ＨＢＶｒｃＤＮＡの存在量は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡに比べ圧倒的に多い。このため、ＰＣＲを利用したＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出において、ＤＮＡ分解酵素によりＨＢＶｒｃＤＮＡを予め分解することは、当業者にとって必須の工程であった。これに対して、本発明者らは、メカニズムは不明であるが、ＤＮＡ含有試料について、ＤＮＡ分解酵素による前処理を行うことなくデジタルＰＣＲを行うことによって、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡをより精度良く検出できることを見出し、発明を確立するに到った。本発明によれば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを精度良く検出できるため、例えば、ＨＢＶ感染の評価、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを除去する治療剤の評価等に有効に利用できる。 In the detection of HBVcc cDNA, as described above, it was considered that the coexistence of HBV-derived rcDNA (hereinafter referred to as HBVrcDNA) having the same base sequence in the sample reduces the detection accuracy of HBVcc cDNA. In particular, the abundance of HBVrc cDNA is overwhelmingly higher than that of HBVcc cDNA. Therefore, in the detection of HBVcc cDNA using PCR, pre-degrading HBVrc cDNA with a DNA degrading enzyme has been an indispensable step for those skilled in the art. On the other hand, although the mechanism is unknown, the present inventors have found that HBVcc cDNA can be detected more accurately by performing digital PCR on a DNA-containing sample without pretreatment with a DNase. It came to establish the invention. According to the present invention, since HBVcc cDNA can be detected with high accuracy, it can be effectively used, for example, for evaluation of HBV infection, evaluation of a therapeutic agent for removing HBVcc cDNA, and the like.

本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。 Unless otherwise specified, the terms used herein may be used in the meaning commonly used in the art.

（１）デジタルＰＣＲによるＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出方法
本発明のデジタルＰＣＲによるＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出方法は、前述のように、ＤＮＡ含有試料を微小区画に分配する工程と、前記微小区画に分配した前記ＤＮＡ含有試料について、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプライマーを用いた増幅、および得られた増幅産物とＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプローブとのハイブリダイズを検出する検出工程とを含み、前記分配するＤＮＡ含有試料が、ＤＮＡ分解酵素で処理されていない試料であることを特徴とする。 (1) Method for detecting HBVcc cDNA by digital PCR The method for detecting HBVcc cDNA by digital PCR of the present invention comprises a step of distributing a DNA-containing sample into micro-compartments and the DNA-containing sample distributed into the micro-compartment as described above. , Amplification using a primer for HBVcc cDNA, and a detection step for detecting hybridization of the obtained amplification product with a probe for HBVcc cDNA, wherein the DNA-containing sample to be distributed is a sample not treated with DNA degrading enzyme. It is characterized by being.

本発明の検出方法は、ＤＮＡ含有試料について、ＤＮＡ分解酵素による処理を行うことなく、デジタルＰＣＲに供することが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明において、前記ＤＮＡ分解酵素による処理を行わないとは、例えば、外部からＤＮＡ分解酵素を添加することなくデジタルＰＣＲを行うことであり、具体的には、例えば、生体試料からのＤＮＡの抽出時における外来のＤＮＡ分解酵素の共存、抽出後のＤＮＡ含有物への外来のＤＮＡ分解酵素の添加、本発明の検出方法における前記分画工程および前記検出工程において、外来のＤＮＡ分解酵素を共存させないことを意味する。 The detection method of the present invention is characterized in that a DNA-containing sample is subjected to digital PCR without being treated with a DNase, and other steps and conditions are not limited. In the present invention, not performing the treatment with the DNA degrading enzyme means, for example, performing digital PCR without adding a DNA degrading enzyme from the outside, and specifically, for example, extracting DNA from a biological sample. Coexistence of foreign DNase at the time, addition of foreign DNase to the DNA content after extraction, foreign DNase does not coexist in the fractionation step and the detection step in the detection method of the present invention. Means that.

本発明の検出方法に供するＤＮＡ含有試料は、例えば、試料に対してＤＮＡ抽出処理を行うことによって得られたＤＮＡ含有物である。前記試料は、例えば、組織または細胞等の生体由来試料があげられる。前記組織は、例えば、肝臓組織であり、前記細胞は、例えば、肝臓細胞である。前記試料は、例えば、生体から採取した組織または細胞でもよく、前記試料は、例えば、生体から採取され、単離（単一化）された細胞株でもよい。前記細胞株は、例えば、肝臓細胞株でもよいし、ＨＢＶに感染させた細胞株でもよく、後者の場合、前記細胞株の種類は、特に制限されず、例えば、肝臓細胞株等があげられる。 The DNA-containing sample used in the detection method of the present invention is, for example, a DNA-containing substance obtained by subjecting the sample to a DNA extraction process. Examples of the sample include biological samples such as tissues or cells. The tissue is, for example, liver tissue, and the cell is, for example, hepatocyte. The sample may be, for example, a tissue or cell collected from a living body, and the sample may be, for example, a cell line collected from a living body and isolated (unified). The cell line may be, for example, a liver cell line or an HBV-infected cell line. In the latter case, the type of the cell line is not particularly limited, and examples thereof include a liver cell line.

前記ＤＮＡ含有試料は、例えば、前述のように、組織または細胞から、ＤＮＡ抽出処理を行うことにより調製できる。ＤＮＡ抽出の方法は、特に制限されず、例えば、市販のＤＮＡ抽出試薬が使用でき、これらの説明書にしたがって処理できる。 The DNA-containing sample can be prepared, for example, by performing a DNA extraction process from a tissue or cell as described above. The method of DNA extraction is not particularly limited, and for example, a commercially available DNA extraction reagent can be used, and processing can be performed according to these instructions.

このようにして調製される前記ＤＮＡ含有試料は、外来のＤＮＡ分解酵素と共存させることなく、微小区画に分配する前記分配工程に供される。前記デジタルＰＣＲにおける前記ＤＮＡ含有試料の分配とは、例えば、前記ＤＮＡ含有試料のＤＮＡを限界希釈して微小区画内に分配させることをいい、前記微小区画のそれぞれには、例えば、ターゲットＤＮＡが０分子または１分子程度となるのが一般的である。前記微小区画とは、例えば、微小孔等のウェルでもよいし、液滴でもよい。前記ウェルの容積は、例えば、０．７～０．９ｎＬ、０．７～０．８μＬ、０．７７５～０．８０５ｎＬであり、前記液滴の体積は、例えば、０．７～０．９ｎＬ、０．７～０．８ｎＬである。前記ＤＮＡ含有試料は、例えば、デジタルＰＣＲに必要な試薬を含む反応液と混合し、この混合液を、前記ウェルに分配したり、油層に導入してWater-in-oilの液滴とすることで、前記微小区画とすることができる。前記液滴は、例えば、マイクロ流体チップ等を利用して調製することができる。前記デジタルＰＣＲに液滴を使用する場合、各液滴が反応系となるため、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）ともいう。 The DNA-containing sample prepared in this manner is subjected to the distribution step of distributing to a small section without coexisting with a foreign DNA degrading enzyme. Distributing the DNA-containing sample in the digital PCR means, for example, limiting the DNA of the DNA-containing sample to be distributed in the micro-compartment, and in each of the micro-compartments, for example, the target DNA is 0. Generally, it is a molecule or about one molecule. The microsection may be, for example, a well such as a micropore or a droplet. The volume of the well is, for example, 0.7 to 0.9 nL, 0.7 to 0.8 μL, 0.775 to 0.805 nL, and the volume of the droplet is, for example, 0.7 to 0.9 nL. , 0.7-0.8 nL. The DNA-containing sample may be mixed with, for example, a reaction solution containing a reagent necessary for digital PCR, and this mixed solution may be distributed to the wells or introduced into an oil layer to form water-in-oil droplets. Therefore, it can be made into the minute section. The droplets can be prepared using, for example, a microfluidic chip or the like. When droplets are used for the digital PCR, each droplet serves as a reaction system, and thus is also referred to as droplet digital PCR (ddPCR).

前記デジタルＰＣＲに必要な試薬は、特に制限されず、一般的なものとして、例えば、プライマー、プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰ等があげられる。プライマーは、例えば、フォワードプライマー、リバースプライマー、またはこれらのセットが使用できる。前記プライマーは、例えば、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの配列に基づいて適宜設定できる。前記プローブも、例えば、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの配列に基づいて適宜設定できる。また、後述の検出工程において、増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズの検出に蛍光シグナルを利用できることから、前記試薬は、蛍光試薬を含むことが好ましい。前記蛍光試薬は、例えば、ハイブリダイズした二本鎖に結合する蛍光物質（例えば、SYBR（商標）Green等の色素）でもよいし、前記プローブを標識化する蛍光物質でもよい。後者の場合は、前記プローブとして、前記蛍光物質で標識化された標識化プローブを使用することが好ましい。前記プライマーおよび前記プローブについては、具体例を後述する。これらの試薬を、例えば、緩衝液等の水性溶媒に混合することで前記反応液を調製できる。 The reagents required for the digital PCR are not particularly limited, and general examples include primers, probes, DNA polymerases, dNTPs, and the like. As the primer, for example, a forward primer, a reverse primer, or a set thereof can be used. The primer can be appropriately set based on, for example, the sequence of HBV-derived ccDNA. The probe can also be appropriately set based on, for example, the sequence of HBV-derived ccDNA. Further, since the fluorescent signal can be used for detecting the hybridization between the amplification product and the probe in the detection step described later, the reagent preferably contains a fluorescent reagent. The fluorescent reagent may be, for example, a fluorescent substance that binds to a hybridized double strand (for example, a dye such as SYBR ™ Green) or a fluorescent substance that labels the probe. In the latter case, it is preferable to use a labeled probe labeled with the fluorescent substance as the probe. Specific examples of the primer and the probe will be described later. The reaction solution can be prepared by mixing these reagents with an aqueous solvent such as a buffer solution.

つぎに、本発明の検出方法は、前記微小区画に分配した前記ＤＮＡ含有試料について、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプライマーを用いた増幅、および得られた増幅産物とＨＢＶｃｃｃＤＮＡに対するプローブとのハイブリダイズを検出する検出工程を行う。前記プライマーを用いた増幅および前記プローブを用いた検出は、一般的なデジタルＰＣＲの方法によって行うことができる。前記プライマーを用いた増幅は、例えば、一般的な、サーマルサイクラーを用いたＰＣＲの方法が採用できる。また、前記プローブを用いた検出は、例えば、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズに基づく蛍光シグナルの測定等により、前記微小区画ごとに行うことができる。 Next, the detection method of the present invention comprises an amplification step using a primer for HBVcc cDNA and a detection step for detecting hybridization between the obtained amplification product and a probe for HBVcc cDNA in the DNA-containing sample distributed in the micro-compartment. conduct. Amplification using the primer and detection using the probe can be performed by a general digital PCR method. For amplification using the primer, for example, a general PCR method using a thermal cycler can be adopted. Further, the detection using the probe can be performed for each micro-compartment, for example, by measuring a fluorescence signal based on the hybridization between the amplification product and the probe.

前記増幅および前記ハイブリダイズの検出によって、前記ＤＮＡ含有試料に含まれるＨＢＶｃｃｃＤＮＡを検出することができる。本発明におけるＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出は、例えば、定性分析でもよいし定量分析であってもよい。従来、前述のように、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出の妨げとなっていたＨＢＶｒｃＤＮＡを消去するために、ＤＮＡ分解酵素による処理が必須であったが、本発明においては、ＤＮＡ分解酵素による処理を行うことなく、前記デジタルＰＣＲを行うことによって、メカニズムは不明であるが、前記ＤＮＡ含有試料中のＨＢＶｃｃｃＤＮＡを精度よく検出することが可能である。このように、本発明によれば、精度に優れたＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出が可能になったため、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを消去するような新たなＨＢＶ治療薬の開発において、より精度の良い評価が可能になるといえる。 By the amplification and the detection of the hybridization, the HBVcc cDNA contained in the DNA-containing sample can be detected. The detection of HBVcc cDNA in the present invention may be, for example, qualitative analysis or quantitative analysis. Conventionally, as described above, treatment with a DNA degrading enzyme has been essential in order to eliminate HBVrcDNA that hindered the detection of HBVcc cDNA, but in the present invention, treatment with a DNA degrading enzyme is not performed. By performing the digital PCR, although the mechanism is unknown, it is possible to accurately detect HBVcc cDNA in the DNA-containing sample. As described above, according to the present invention, it is possible to detect HBVcc cDNA with excellent accuracy, so that it can be said that more accurate evaluation is possible in the development of a new HBV therapeutic agent such as erasing HBVcc cDNA, for example. ..

（２）プライマー
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出方法には、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの配列に基づいて設計したプライマーが使用できる。本発明のプライマーは、例えば、フォワードプライマーのみでもよいし、リバースプライマーのみでもよいが、フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマーセットが好ましい。 (2) Primer As the method for detecting HBVcc cDNA of the present invention, for example, a primer designed based on the sequence of HBVcc cDNA can be used. The primer of the present invention may be, for example, only a forward primer or only a reverse primer, but a primer set of a forward primer and a reverse primer is preferable.

ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの配列は、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）にアクセッションＮｏ．Ｄ１２９８０で登録されている（配列番号１）。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡは、前述のように閉鎖完全二重鎖であり、前記配列番号１は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの（＋）鎖である。 The sequence of HBVcc cDNA is stored in the database (GenBank) at Accession No. It is registered in D12980 (SEQ ID NO: 1). The HBVcc cDNA is a closed complete double chain as described above, and SEQ ID NO: 1 is the (+) chain of the HBVcc cDNA.

前記プライマーは、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの特定領域を増幅するように設定できる。前記特定領域は、例えば、（＋）鎖の場合、配列番号１における１５９２番目～１８３６番目を含む領域（以下、（＋）鎖特定領域）が好ましく、（－）鎖の場合、前記（＋）鎖特定領域に対する相補的な領域（以下、（－）鎖特定領域）が好ましく、前記特定領域の長さは、例えば、３０～４００塩基である。具体例として、前記特定領域のうち、前記（＋）鎖特定領域は、例えば、配列番号１における１５５０番目～１８８２番目の配列、１５５０番目～１９００番目の配列、１５４５番目～１８８２番目の配列、１５４５番目～１９００番目の配列等があげられる。前記（－）鎖特定領域は、前記（＋）鎖特定領域の配列に対する相補配列があげられる。 The primer can be set, for example, to amplify a specific region of HBVcc cDNA. For example, in the case of the (+) chain, the specific region is preferably a region containing the 1592th to 1836th positions in SEQ ID NO: 1 (hereinafter, the (+) chain specific region), and in the case of the (−) chain, the above-mentioned (+). A region complementary to the chain specific region (hereinafter, (-) chain specific region) is preferable, and the length of the specific region is, for example, 30 to 400 bases. As a specific example, among the specific regions, the (+) chain specific region is, for example, the 1550th to 1882th sequence, the 1550th to 1900th sequence, the 1545th to 1882th sequence, 1545 in SEQ ID NO: 1. The 1st to 1900th sequences and the like can be mentioned. The (-) chain specific region may be a complementary sequence to the sequence of the (+) chain specific region.

前記プライマーと前記鋳型におけるアライメントされる対象領域との相補性は、特に制限されず、前記プライマーが、デジタルＰＣＲの反応において、鋳型であるＨＢＶｃｃｃＤＮＡおよびその増幅物にアニーリングできればよい。前記プライマーと前記対象領域との相補性は、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、１００％である。 The complementarity between the primer and the region of interest to be aligned in the template is not particularly limited, as long as the primer can anneal to the template HBVcc cDNA and its amplification in the reaction of digital PCR. The complementarity between the primer and the target region is, for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, and 100%.

ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの（＋）鎖を鋳型とした場合、フォワードプライマーは、例えば、配列番号１の１５４５番目～１５７０番目における連続する１８～３０塩基長の配列が例示できる。具体例としては、例えば、配列番号２または３の塩基配列からなるフォワードプライマーがあげられ、配列番号２の暗記配列からなるフォワードプライマーが好ましい。
配列番号２（1550-1570）：5’-cgtctgtgccttctcatctgc-3’
配列番号３（1545-1563）：5’-ctccccgtctgtgccttct-3’ When the (+) chain of HBVcc cDNA is used as a template, the forward primer may be, for example, a sequence having a continuous 18 to 30 base lengths at positions 1545 to 1570 of SEQ ID NO: 1. Specific examples include a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or 3, and a forward primer consisting of the memorized sequence of SEQ ID NO: 2 is preferable.
SEQ ID NO: 2 (1550-1570): 5'-cgtctgtgccttctcatctgc-3'
SEQ ID NO: 3 (1545-1563): 5'-ctccccgtctgtgccttct-3'

ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの（＋）鎖を鋳型とした場合、リバースプライマーは、例えば、配列番号１の１８６３番目～１９００番目に対する相補鎖において、連続する１８～３０塩基長の配列が例示できる。具体例としては、例えば、配列番号４または５の塩基配列からなるリバースプライマーがあげられ、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーが好ましい。
配列番号４（1882-1863）：5’-gcacagcttggaggcttgaa-3’
配列番号５（1883-1900）：5’-gccccaaagccacccaag-3’ When the (+) strand of HBVcc cDNA is used as a template, the reverse primer may be, for example, a sequence having a continuous 18 to 30 base length in the complementary strand to the 1863th to 1900th sequences of SEQ ID NO: 1. Specific examples include a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 or 5, and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 is preferable.
SEQ ID NO: 4 (1882-1863): 5'-gcacagcttggaggcttgaa-3'
SEQ ID NO: 5 (1883-1900): 5'-gccccaaagccacccaag-3'

本発明のプライマーの組み合わせは、特に制限されず、例えば、配列番号２のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーとの組合せ、配列番号３のフォワードプライマーと配列番頭５のリバースプライマーとの組合せ、配列番号２のフォワードプライマーと配列番号５のリバースプライマーとの組合せ、配列番号３のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーとの組合せ等があげられ、好ましくは、配列番号２のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーとの組合せである。 The combination of the primers of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 2 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4, a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, and the sequence. Examples thereof include a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 2 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5, a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 3 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4, and preferably the forward primer of SEQ ID NO: 2 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4. It is a combination with the reverse primer of.

（３）プローブ
本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出方法には、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの配列に基づいて設計したプローブが使用できる。本発明のプローブは、例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの（＋）鎖にハイブリダイズする配列でもよいし、（－）鎖にハイブリダイズする配列でもよい。 (3) Probe As the method for detecting HBVcc cDNA of the present invention, for example, a probe designed based on the sequence of HBVcc cDNA can be used. The probe of the present invention may be, for example, a sequence that hybridizes to the (+) strand of HBVcc cDNA, or may be a sequence that hybridizes to the (−) strand.

本発明のプローブは、例えば、前記プライマーにより増幅される前記特定領域の配列に基づいて設計したプローブ、具体的には、前記（＋）鎖特定領域または前記（－）鎖特定領域に基づいて設計したプローブが使用できる。本発明のプローブは、例えば、配列番号１における１５４５番目～１９００番目の領域内（好ましくは、１５９２番目～１８３６番目の領域内または１６０２番目～１８２６番目の領域内）に対して、または、前記領域に対する相補配列からなる相補領域内に対して、ハイブリダイズするプローブが好ましい。前記プローブの長さは、例えば、１５～３５塩基長があげられる。 The probe of the present invention is designed based on, for example, a probe designed based on the sequence of the specific region amplified by the primer, specifically, the (+) chain specific region or the (-) chain specific region. Can be used with the probe. The probe of the present invention can be used, for example, with respect to the region 1545 to 1900 (preferably within the region 1592 to 1836 or the region 1602 to 1826) in SEQ ID NO: 1, or said to the region. A probe that hybridizes within a complementary region consisting of a complementary sequence to is preferred. The length of the probe may be, for example, 15 to 35 base lengths.

前記プローブと前記プローブがハイブリダイズする対象領域（前記特定領域において前記プローブとアライメントする領域）との相補性は、特に制限されず、前記プローブが、前記検出工程において、前記増幅物における前記対象領域にハイブリダイズできればよい。前記プローブと前記対象領域との相補性は、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、１００％である。 The complementarity between the probe and the target region in which the probe hybridizes (the region that aligns with the probe in the specific region) is not particularly limited, and the probe is the target region in the amplified product in the detection step. It is only necessary to be able to hybridize to. The complementarity between the probe and the target region is, for example, 80% or more, 90% or more, 95% or more, and 100%.

前記（＋）鎖特定領域に前記プローブがハイブリダイズするとした場合、前記プローブは、例えば、配列番号１の１５４５番目～１９００番目における連続する１５～３５塩基長の配列が例示できる。また、より好ましくは、例えば、ＤＲ１とＤＲ２との間の領域、具体例として、配列番号１における１５９２番目～１８３６番目または１６０２番目～１８２６番目における連続する前記塩基長の配列が例示できる。具体例としては、前者として、例えば、配列番号６の塩基配列からなるプローブがあげられ、後者として、例えば、配列番号７の塩基配列からなるプローブがあげられ、好ましくは前者である。配列番号７において、ｒは、ａまたはｇである。
配列番号６（1781-1805）：5’-ctgtaggcataaattggtctgttca-3’
配列番号７（1545-1563）：5’-cgtcgcatggaraccaccgtgaacgcc-3’ When the probe hybridizes to the (+) chain specific region, the probe can be exemplified by, for example, a sequence having a continuous 15 to 35 base lengths at positions 1545 to 1900 of SEQ ID NO: 1. Further, more preferably, for example, a region between DR1 and DR2, and as a specific example, a sequence having the continuous base lengths at positions 1592 to 1836 or positions 1602 to 1826 in SEQ ID NO: 1 can be exemplified. As a specific example, as the former, for example, a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6 can be mentioned, and as the latter, for example, a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 can be mentioned, and the former is preferable. In SEQ ID NO: 7, r is a or g.
SEQ ID NO: 6 (1781-1805): 5'-ctgtaggcataaattggtctgttca-3'
SEQ ID NO: 7 (1545-1563): 5'-cgtcgcatggaraccaccgtgaacgcc-3'

前記フォワードプライマー、前記リバースプライマーおよび前記プローブの組み合わせは、特に制限されず、例えば、配列番号２のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーと、配列番号６または７のプローブとの組み合わせ、配列番号３のフォワードプライマーと配列番号５のリバースプライマーと、配列番号６または７のプローブとの組み合わせがあげられ、中でも、配列番号２のフォワードプライマーと配列番号４のリバースプライマーと配列番号６プローブとの組み合わせが好ましい。 The combination of the forward primer, the reverse primer and the probe is not particularly limited, and for example, a combination of the forward primer of SEQ ID NO: 2 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and the probe of SEQ ID NO: 6 or 7, SEQ ID NO: 3 The combination of the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 5 and the probe of SEQ ID NO: 6 or 7 is mentioned, and among them, the combination of the forward primer of SEQ ID NO: 2 and the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and the probe of SEQ ID NO: 6 is mentioned. preferable.

前記プローブは、デジタルＰＣＲの検出工程において、得られた増幅産物と前記プローブとのハイブリダイズを検出するために、例えば、標識化物質で標識化された標識化プローブが好ましい。前記標識化物質は、例えば、ハイブリダイズによる蛍光シグナルの強度の変化が利用できることから、前記ハイブリダイズによって蛍光を発する物質でもよいし、前記ハイブリダイズによって蛍光が消失する物質でもよい。また、前記標識化物質は、例えば、蛍光物質であるレポーターと、前記レポーターの蛍光を消光するクエンチャーとの組み合わせでもよい。本発明において、前記プローブにおける前記標識化物質の種類および標識化箇所は、特に制限されない。前記蛍光物質としては、例えば、SYBR（商標）Green、ＦＡＭ等の色素があげられる。前記蛍光物質による標識箇所の具体例としては、例えば、前記プローブの５’末端、またはその近傍（例えば、５’末端から２塩基目、３塩基目等）、前記プローブの３’末端、またはその近傍（例えば、３’末端から２塩基目、３塩基目等）があげられる。前記レポーターとクエンチャーとの組み合わせの場合、例えば、前記プローブの５’末端またはその近傍に前記レポーターを結合し、前記プローブの３’末端またはその近傍に前記クエンチャーを結合することが好ましい。前記レポーターと前記クエンチャーとの組み合わせは、例えば、ＦＡＭとＴＡＭＳｐとの組み合わせ等があげられる。前記プローブは、例えば、二つのクエンチャーを有してもよく、その場合、前述のようなクエンチャーを末端側に付加し、さらに配列内部に、ＺＥＮ等のクエンチャーを付加してもよい。 The probe is preferably a labeled probe labeled with a labeling substance, for example, in order to detect hybridization between the obtained amplification product and the probe in the detection step of digital PCR. The labeled substance may be, for example, a substance that emits fluorescence by the hybridization or a substance that eliminates the fluorescence by the hybridization because the change in the intensity of the fluorescence signal due to the hybridization can be used. Further, the labeling substance may be, for example, a combination of a reporter which is a fluorescent substance and a citric acid which quenches the fluorescence of the reporter. In the present invention, the type and labeling location of the labeled substance in the probe are not particularly limited. Examples of the fluorescent substance include dyes such as SYBR ™ Green and FAM. Specific examples of the labeled portion with the fluorescent substance include, for example, the 5'end of the probe or its vicinity (for example, the 2nd base to the 3rd base from the 5'end, the 3rd base, etc.), the 3'end of the probe, or the same thereof. The neighborhood (for example, the second base from the 3'end, the third base, etc.) can be mentioned. In the case of a combination of the reporter and the quencher, for example, it is preferable to bind the reporter to the 5'end of the probe or its vicinity and to bind the quencher to the 3'end of the probe or its vicinity. Examples of the combination of the reporter and the citrate include a combination of FAM and TAMSp. The probe may have, for example, two quenchers, in which case a quencher as described above may be added to the terminal side, and a quencher such as ZEN may be added to the inside of the sequence.

（４）検出用試薬
本発明のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法において、プライマーおよびプローブの種類は、前述のように、特に制限されないが、中でも、以下の本発明のＨＢＶｃｃｃＤＮＡ検出用試薬によれば、より精度よくＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出を行うことができ好ましい。 (4) Reagent for Detection In the method for detecting HBV-derived ccDNA of the present invention, the types of primers and probes are not particularly limited as described above, but among them, the following reagent for detecting HBVccDNA of the present invention is used. It is preferable because HBVcc cDNA can be detected with high accuracy.

本発明の検出用試薬は、前記プローブとして、配列番号６の塩基配列からなるプローブを含むことが好ましい。前記プローブは、例えば、前述のように標識化プローブが好ましい。 The detection reagent of the present invention preferably contains, as the probe, a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6. As the probe, for example, a labeled probe as described above is preferable.

そして、本発明の検出用試薬は、前記プローブに対して、さらに、配列番号２の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとを含むことが好ましい。 The detection reagent of the present invention preferably further contains a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 with respect to the probe.

以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and the like, but the present invention is not limited thereto.

（実施例１）
以下の試薬１および試薬２を準備した。
試薬１
フォワードプライマー１：配列番号２
リバースプライマー１：配列番号４
プローブ１：配列番号６
5’- FAM/CT GTA GGC A/ZEN/T AAA TTG GTC TGT TCA /TAMSp -3’
試薬２
フォワードプライマー２：配列番号３
リバースプライマー２：配列番号５
プローブ２：配列番号７（タカラバイオ社製）
5’- FAM/CG TCG CAT GGA RAC CAC CGT GAA CGC C/TAMSp -3’
配列番号７において、Rは、AまたはGであり、本実施例においては、R＝AのプローブとR＝Gのプローブとの混在物を使用した。 (Example 1)
The following reagents 1 and 2 were prepared.
Reagent 1
Forward primer 1: SEQ ID NO: 2
Reverse primer 1: SEQ ID NO: 4
Probe 1: SEQ ID NO: 6
5'- FAM / CT GTA GGC A / ZEN / T AAA TTG GTC TGT TCA / TAMSp -3'
Reagent 2
Forward primer 2: SEQ ID NO: 3
Reverse primer 2: SEQ ID NO: 5
Probe 2: SEQ ID NO: 7 (manufactured by Takara Bio Inc.)
5'-FAM / CG TCG CAT GGA RAC CAC CGT GAA CGC C / TAMSp -3'
In SEQ ID NO: 7, R is A or G, and in this example, a mixture of a probe of R = A and a probe of R = G was used.

ヒト肝細胞として、Hep38.7-tet細胞を使用した。Hep38.7-tet細胞を、テトラサイクリン添加（０．３μｇ／ｍｌ）ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）を用い、３７℃で２４時間培養し、その後、テトラサイクリン未添加のＤ－ＭＥＭに置換し、７２時間培養後、細胞を回収した。なお、前記Hep38.7-tet細胞は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのコピー数が１コピー／１細胞であり、ＲＮａｓｅＰ遺伝子のコピー数が２コピー／１細胞であることが知られている（久留主ら、数理解析研究所録、２０１７年、2043巻、95-101頁、発行所：京都大学数理解析研究所）。 Hep38.7-tet cells were used as human hepatocytes. Hep38.7-tet cells were cultured in Dulbecco-modified Eagle's medium (D-MEM) supplemented with tetracycline (0.3 μg / ml) at 37 ° C. for 24 hours, and then replaced with D-MEM supplemented with tetracycline. After culturing for 72 hours, cells were collected. It is known that the Hep38.7-tet cells have 1 copy / 1 copy of HBVcc cDNA and 2 copies / 1 cell of RNaseP gene (Kurume et al., Mathematical analysis). Laboratory Record, 2017, 2043, pp. 95-101, Publisher: Research Institute for Mathematical Sciences, Kyoto University).

実施例は、以下のように行った。まず、回収した細胞から、ＤＮＡ抽出試薬（商品名SMITEST EX-R&D、MBLライフサイエンス社)を用いて、ＤＮＡを抽出し、得られた抽出液３０μＬをＤＮＡサンプルとした。前記ＤＮＡサンプルを外来のＤＮａｓｅで処理することなく、下記組成の反応液を調製し、ウェル20,000個のプレートに前記反応液を分配し、デジタルＰＣＲに供した。前記反応液において、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブは、前記試薬１および前記試薬２をそれぞれ使用した。デジタルＰＣＲは、市販の機器（商品名QuantStudio（商標） 3D デジタル PCR システム、Applied Biolad System社）を使用し、操作条件は、その使用説明書に従った。そして、前記デジタルＰＣＲにより検出した蛍光シグナルの結果から、前記使用説明書に基づいて、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの量（コピー／μＬ）、ＲＮａｓｅＰの量（コピー／μＬ）、およびＨＢＶｃｃｃＤＮＡの量（コピー／細胞）を算出した。 The examples were carried out as follows. First, DNA was extracted from the collected cells using a DNA extraction reagent (trade name: SMITEST EX-R & D, MBL Life Science Co., Ltd.), and 30 μL of the obtained extract was used as a DNA sample. A reaction solution having the following composition was prepared without treating the DNA sample with an external DNase, and the reaction solution was distributed to plates with 20,000 wells and subjected to digital PCR. In the reaction solution, the reagent 1 and the reagent 2 were used as the forward primer, the reverse primer and the probe, respectively. For digital PCR, a commercially available device (trade name: QuantStudio (trademark) 3D digital PCR system, Applied Biolad System) was used, and the operating conditions were in accordance with the instruction manual. Then, from the results of the fluorescent signal detected by the digital PCR, the amount of HBVcc cDNA (copy / μL), the amount of RNaseP (copy / μL), and the amount of HBVcc cDNA (copy / cell) are determined based on the instruction manual. Calculated.

（反応液組成）
Digital PCR Master Mix 7.5μL
フォワードプライマー 1.35μL
リバースプライマー 1.35μL
プローブ 0.75μL
ＤＮＡサンプル 1.5μL
蒸留水 2.55μL
合計 15μL (Reaction solution composition)
Digital PCR Master Mix 7.5 μL
Forward primer 1.35 μL
Reverse primer 1.35 μL
Probe 0.75 μL
DNA sample 1.5 μL
Distilled water 2.55 μL
15 μL in total

一方、比較例は、以下のように行った。まず、回収した細胞から、ＤＮＡ抽出試薬（商品名SMITEST EX-R&D、MBLライフサイエンス社)を用いて、ＤＮＡを抽出した。得られた抽出液３０μＬに、市販のＤＮａｓｅ（商品名Plasmid-Safe（商標）ATP-Dependent DNase：エアブラウンライフサイエンス社）を添加し、ＤＮＡａｓｅ処理を行った。ＤＮＡａｓｅ処理の条件は、前記抽出液１－３０μＬあたりＤＮａｓｅ １０ユニットの添加、３７℃で３０分のインキュベートとした。そして、ＤＮＡ処理後の抽出液について、再度、前記ＤＮＡ抽出試薬を用いてＤＮＡ抽出処理を行った。得られた抽出液をＤＮＡサンプルとしたした以外は、前記実施例１と同様にしてデジタルＰＣＲを行った。そして、前記デジタルＰＣＲにより検出した蛍光シグナルの結果から、検量線を用いて、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの量（コピー／μＬ）、ＲＮａｓｅＰの量（コピー／μＬ）、およびＨＢＶｃｃｃＤＮＡの量（コピー／細胞）を算出した。前記検量線は、ｃｃｃＤＮＡと類似した構造の人口ＤＮＡ（プラスミド）のコピー数の希釈系を調製し、同様の条件でデジタルＰＣＲを行い、作成した。 On the other hand, the comparative example was performed as follows. First, DNA was extracted from the collected cells using a DNA extraction reagent (trade name: SMITEST EX-R & D, MBL Life Science Co., Ltd.). Commercially available DNase (trade name: Plasmamid-Safe (trademark) ATP-Dependent DNase: Air Brown Life Science Co., Ltd.) was added to 30 μL of the obtained extract to perform DNAase treatment. The conditions for the DNAase treatment were the addition of 10 units of DNase per 1-30 μL of the extract and the incubation at 37 ° C. for 30 minutes. Then, the extract after the DNA treatment was subjected to the DNA extraction treatment again using the DNA extraction reagent. Digital PCR was performed in the same manner as in Example 1 except that the obtained extract was used as a DNA sample. Then, from the results of the fluorescent signal detected by the digital PCR, the amount of HBVcc cDNA (copy / μL), the amount of RNaseP (copy / μL), and the amount of HBVcc cDNA (copy / cell) were calculated using a calibration curve. .. The calibration curve was prepared by preparing a diluted system of the number of copies of artificial DNA (plasmid) having a structure similar to that of cccDNA, and performing digital PCR under the same conditions.

これらの結果を表１に示す。表１には、反応液１μＬあたりのＨＢＶｃｃｃＤＮＡのコピー数、ＲＮａｓｅＰのコピー数、および１細胞あたりのＨＢＶｃｃｃＤＮＡのコピー数を示す。表１に示すように、反応液１μＬあたりにおいて、ＤＮａｓｅ処理を行った比較例は、ＤＮａｓｅ処理を行っていない実施例と比較して、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡもＲＮａｓｅもコピー数が格段に低下した。 These results are shown in Table 1. Table 1 shows the number of copies of HBVcc cDNA per 1 μL of the reaction solution, the number of copies of RNase P, and the number of copies of HBVcc cDNA per cell. As shown in Table 1, in the comparative example in which the DNase treatment was performed per 1 μL of the reaction solution, the number of copies of both HBVcc cDNA and RNase was significantly reduced as compared with the example in which the DNase treatment was not performed.

前述のように、Hep38.7-tet細胞は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのコピー数が１コピー／細胞であることが知られている。このため、デジタルＰＣＲにより得られた結果が、１コピー／細胞に近いほど、精度よくＨＢＶｃｃｃＤＮＡを測定できていると評価できる。表１に示すように、試薬１を使用した場合も、試薬２を使用した場合も、ＤＮａｓｅ処理を行っていない実施例は、ＤＮａｓｅ処理を行った比較例と比べて、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの細胞あたりのコピー数が１に近いことから、ＤＮａｓｅ処理を行わないことによって、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出精度を向上できることが確認できた。さらに、ＤＮａｓｅ処理を行っていない実施例について、試薬１と試薬２とを比較すると、試薬１を使用した場合、１．０３コピー／１細胞であり、試薬２を使用した１．１６コピー／１細胞よりも、さらにコピー数１に近くなった。この結果から、試薬１を使用することによって、より一層、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの検出精度を向上できることがわかった。 As mentioned above, Hep38.7-tet cells are known to have one copy / cell of HBVcc cDNA. Therefore, it can be evaluated that the closer the result obtained by digital PCR is to 1 copy / cell, the more accurately the HBVcc cDNA can be measured. As shown in Table 1, both when reagent 1 was used and when reagent 2 was used, the examples without DNase treatment had a copy of HBVcc cDNA per cell as compared with the comparative example with DNase treatment. Since the number is close to 1, it was confirmed that the detection accuracy of HBVcc cDNA can be improved by not performing DNase treatment. Further, when the reagent 1 and the reagent 2 are compared with each other in the example not subjected to the DNase treatment, it is 1.03 copy / 1 cell when the reagent 1 is used, and 1.16 copy / 1 using the reagent 2. The number of copies was closer to 1 than that of cells. From this result, it was found that the detection accuracy of HBVcc cDNA can be further improved by using the reagent 1.

以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。 Although the present invention has been described above with reference to the embodiments and examples, the present invention is not limited to the above embodiments. Various modifications that can be understood by those skilled in the art can be made to the structure and details of the present invention within the scope of the present invention.

本発明によれば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを精度良く検出できるため、例えば、ＨＢＶ感染の評価、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを除去する治療剤の評価等に有効に利用できる。 According to the present invention, since HBVcc cDNA can be detected with high accuracy, it can be effectively used, for example, for evaluation of HBV infection, evaluation of a therapeutic agent for removing HBVcc cDNA, and the like.

Claims (7)

ＤＮＡ含有試料を微小区画に分配する工程と、
前記微小区画に分配した前記ＤＮＡ含有試料について、ＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡに対するプライマーを用いた増幅、および得られた増幅産物とＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡに対するプローブとのハイブリダイズを検出する検出工程とを含み、
前記分配するＤＮＡ含有試料が、ＤＮＡ分解酵素で処理されていない試料であることを特徴とするデジタルＰＣＲによるＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法。 The process of distributing the DNA-containing sample to the minute compartments,
The DNA-containing sample distributed in the micro-compartment includes amplification using a primer for HBV-derived ccDNA and a detection step for detecting hybridization between the obtained amplification product and a probe for HBV-derived ccDNA.
A method for detecting HBV-derived ccDNA by digital PCR, wherein the DNA-containing sample to be distributed is a sample that has not been treated with a DNA degrading enzyme. 前記ＤＮＡ分解酵素が、ＡＴＰ依存型ＤＮａｓｅである、請求項１に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法。 The method for detecting HBV-derived ccDNA according to claim 1, wherein the DNA degrading enzyme is ATP-dependent DNase. 前記ＤＮＡ含有試料が、肝臓細胞から抽出したＤＮＡ試料である、請求項１または２に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法。 The method for detecting HBV-derived ccDNA according to claim 1 or 2, wherein the DNA-containing sample is a DNA sample extracted from liver cells. 前記プライマーが、配列番号２の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとのセットである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法。 The detection of HBV-derived ccDNA according to any one of claims 1 to 3, wherein the primer is a set of a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4. Method. 前記プローブが、配列番号６の塩基配列からなるプローブである、請求項１から４のいずれか一項に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出方法。 The method for detecting HBV-derived ccDNA according to any one of claims 1 to 4, wherein the probe is a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6. 配列番号６の塩基配列からなるプローブを含むことを特徴とするＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出用試薬。 A reagent for detecting HBV-derived ccDNA, which comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6. さらに、配列番号２の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとを含む、請求項６に記載のＨＢＶ由来ｃｃｃＤＮＡの検出用試薬 The reagent for detecting HBV-derived ccDNA according to claim 6, further comprising a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4.