JP2022076808A - Production method of dendritic cell vaccine - Google Patents

Abstract

To provide a production method of a dendritic cell vaccine which improves intake of an antigen into dendritic cells.SOLUTION: The production method of a dendritic cell vaccine comprises mixing dendritic cells, a polymer compound having in a side chain a group represented by the general formula (1) in the figure, and an antigen. (In the formula, X1 represents a residue obtained by removing a terminal amino group and a terminal carboxyl group from a cell-penetrating peptide; and X2 represents a hydroxy group, an amino group, a C1-4 alkoxyl group, or a benzyloxy group.)SELECTED DRAWING: None

Description

本開示は、樹状細胞ワクチンの製造方法等に関する。 The present disclosure relates to a method for producing a dendritic cell vaccine and the like.

がんの治療方法としては、手術療法、放射線療法、薬物療法が三大療法とされており、薬物療法には、抗がん剤などを用いる化学療法、ホルモン剤などを用いるホルモン療法（内分泌療法）、分子標的薬などを用いる分子標的療法などの種類がある。 Surgical therapy, radiation therapy, and drug therapy are considered to be the three major therapies for cancer treatment. For drug therapy, chemotherapy using anticancer drugs and hormone therapy using hormones (endocrine therapy) ), There are types such as molecular target therapy using molecular target drugs.

近年、新たながんの治療方法として免疫療法が注目されている（特許文献１）。免疫療法の中でも、がん細胞を特異的に認識する樹状細胞を用いる樹状細胞ワクチン療法は、副作用が少ないことから、第４のがん治療方法として期待されている。 In recent years, immunotherapy has been attracting attention as a new treatment method for cancer (Patent Document 1). Among immunotherapies, dendritic cell vaccine therapy using dendritic cells that specifically recognize cancer cells is expected as a fourth cancer treatment method because it has few side effects.

特開２０１８－０８３８４９号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2018-083849

がん細胞を特異的に認識する樹状細胞（樹状細胞ワクチン）を作製する際には、がん抗原を樹状細胞に取り込ませる必要があるところ、当該がん抗原の樹状細胞への透過性（取り込み）が低い点が、樹状細胞ワクチン療法の課題の１つとされている。本開示は、樹状細胞ワクチンの製造において、抗原の樹状細胞への取り込みを向上させることを課題とする。 When producing dendritic cells (dendritic cell vaccine) that specifically recognize cancer cells, it is necessary to incorporate the cancer antigen into the dendritic cells. Low permeability (uptake) is one of the challenges of dendritic cell vaccine therapy. It is an object of the present disclosure to improve the uptake of an antigen into dendritic cells in the production of a dendritic cell vaccine.

本発明者らは、膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物を用いることによって、樹状細胞への抗原の取り込みが向上することを見出し、さらに改良を重ねた。 The present inventors have found that the uptake of an antigen into dendritic cells is improved by using a polymer compound having a membrane-permeable peptide in the side chain, and further improvements have been made.

本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合することを含む、樹状細胞ワクチンの製造方法。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
項２．
前記膜透過性ペプチドが、７～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及びＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、項１に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項３．
前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子である、項１又は２に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項４．
前記抗原が、がん抗原であり、前記樹状細胞ワクチンが、がんワクチンである、項１～３のいずれかに記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。
項５．
樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を含む、樹状細胞ワクチン。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。）
項６．
下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含有する、樹状細胞ワクチン製造補助剤。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。） The present disclosure includes, for example, the subjects described in the following sections.
Item 1.
A method for producing a dendritic cell vaccine, which comprises mixing a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, and an antigen.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.)
Item 2.
The membrane-permeable peptide includes a peptide having an arginine oligomer in which 7 to 30 arginines are peptide-bound, a peptide having an amino acid sequence of GRKKRRQRRRPQ, a peptide having an amino acid sequence of TRQARRRRRRWRRQR, a peptide having an amino acid sequence of RRRRNRRRRRRR. Peptide with sequence, peptide with amino acid sequence KLTRAQRRAARKNKRNTR, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK, peptide with amino acid sequence KMTRAQRRAAARRNRWTAR, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK Item 2. The method for producing a dendritic cell vaccine according to Item 1, which is at least one membrane-permeable peptide selected from the group consisting of a peptide having a peptide, a peptide having an amino acid sequence of GWTLNSAGYLLGKINLKALAALKIL, and a peptide having an amino acid sequence of AGYLLGKINLKALAALKIL.
Item 3.
Item 2. The method for producing a dendritic cell vaccine according to Item 1 or 2, wherein the stem polymer of the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain is a vinyl-based hydrophilic polymer.
Item 4.
Item 6. The method for producing a dendritic cell vaccine according to any one of Items 1 to 3, wherein the antigen is a cancer antigen and the dendritic cell vaccine is a cancer vaccine.
Item 5.
A dendritic cell vaccine comprising a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, and an antigen.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.)
Item 6.
A dendritic cell vaccine production aid containing a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in the side chain.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.)

抗原の樹状細胞への取り込みが向上する樹状細胞ワクチンの製造方法が提供される。 Provided is a method for producing a dendritic cell vaccine that improves the uptake of an antigen into dendritic cells.

樹状細胞による抗原取り込み試験の結果を示す。The results of the antigen uptake test by dendritic cells are shown. 樹状細胞ワクチンの投与による腫瘍体積への影響を比較した結果を示す。The results of comparing the effects of administration of the dendritic cell vaccine on the tumor volume are shown. 樹状細胞ワクチンの投与によるＩＦＮ－γ陽性細胞数への影響を比較した結果を示す。The results of comparing the effects of administration of the dendritic cell vaccine on the number of IFN-γ positive cells are shown.

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
本開示は、樹状細胞、後述する一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合することを含む、樹状細胞ワクチンの製造方法を包含する。本明細書において、当該樹状細胞ワクチンの製造方法を、「本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法」と表記することがある。また、本明細書において、当該樹状細胞ワクチンの製造方法により製造される樹状細胞ワクチンを、「本開示の樹状細胞ワクチン」と表記することがある。 Hereinafter, each embodiment included in the present disclosure will be described in more detail.
The present disclosure includes a method for producing a dendritic cell vaccine, which comprises mixing a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the general formula (1) described later in a side chain, and an antigen. In the present specification, the method for producing the dendritic cell vaccine may be referred to as "the method for producing the dendritic cell vaccine of the present disclosure". Further, in the present specification, the dendritic cell vaccine produced by the method for producing the dendritic cell vaccine may be referred to as "the dendritic cell vaccine of the present disclosure".

本開示に用いられる樹状細胞は、特に限定されず、投与対象等に応じて適宜選択することができる。例えば、本開示に用いられる樹状細胞としては、哺乳動物由来の樹状細胞であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト；ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等の非ヒト哺乳動物などが例示される。また、本開示に用いられる樹状細胞は、例えば、本開示の樹状細胞ワクチンを投与される対象から得た単球由来の樹状細胞であってもよく、商業的に入手可能なものであってもよい。 The dendritic cells used in the present disclosure are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the administration target and the like. For example, the dendritic cells used in the present disclosure are preferably mammalian-derived dendritic cells. Examples of mammals include humans; non-human mammals such as rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep and monkeys. Further, the dendritic cell used in the present disclosure may be, for example, a monocyte-derived dendritic cell obtained from a subject to which the dendritic cell vaccine of the present disclosure is administered, and is commercially available. There may be.

本開示に用いられる高分子化合物は、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する。 The polymer compound used in the present disclosure has a group represented by the following general formula (1) in the side chain.

一般式（１）中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示す。 In the general formula (1), X ¹ represents a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide.

膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の少なくとも１つは塩基性アミノ酸であることが好ましい。また、塩基性アミノ酸は、Ｌ体又はＤ体のいずれであってもよい。 At least one of the amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue is preferably a basic amino acid. Further, the basic amino acid may be either L-form or D-form.

塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、オルニチン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン等が挙げられ、中でも、グアニジノ基含有アミノ酸が好ましく、アルギニンが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成する全アミノ酸に対する塩基性アミノ酸の割合は、モル基準で、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸のうち、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸は、中性アミノ酸であることが好ましい。なお、本明細書中、アミノ酸と記載する場合、特に断らない限り、α－アミノ酸を意味する。 Examples of the basic amino acid include arginine, ornithine, lysine, hydroxylysine, histidine and the like. Among them, guanidino group-containing amino acids are preferable, and arginine is more preferable. The ratio of the basic amino acid to all the amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue is preferably 50% or more, more preferably 70% or more on a molar basis. Among the amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue, amino acids other than the basic amino acids are preferably neutral amino acids. In the present specification, the term amino acid means α-amino acid unless otherwise specified.

膜透過性ペプチド残基を構成するアミノ酸の数は、例えば、５～４０個程度とすることができる。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９個であってもよい。より具体的には、例えば、６～３９個であってもよい。 The number of amino acids constituting the membrane-permeable peptide residue can be, for example, about 5 to 40. The upper or lower limit of the range is, for example, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39. More specifically, for example, the number may be 6 to 39.

膜透過性ペプチドとしては、例えば、７～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ：配列番号１）、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ：配列番号２）、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＦＨＶ Ｃｏａｔ：配列番号３）、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ：配列番号４）、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＣＣＭＶ Ｇａｇ：配列番号５）等の親水性の塩基性ペプチド；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、アンテナペディア：配列番号６）、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＢＭＷ Ｇａｇ：配列番号７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ペネトラチン：配列番号８）、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、Ｐ２２Ｎ：配列番号９）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＶＰ２２：配列番号１０）等の両親媒性の塩基性ペプチド；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、トランスポータン：配列番号１１）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、ＴＰ－１０：配列番号１２）等の疎水性の塩基性ペプチド等が挙げられる。膜透過性ペプチドは、上述したアルギニンオリゴマー又は配列番号１～１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
中でも、膜透過性ペプチドとしては、親水性の塩基性ペプチドが好ましく、アルギニンオリゴマーを有するペプチドがより好ましく、アルギニンオリゴマーからなるペプチドがさらにより好ましい。アルギニンオリゴマーにおけるアルギニンの繰り返し数は、７～２０が好ましく、７～１５がより好ましく、７～１０がさらに好ましい。 Examples of the membrane-permeable peptide include a peptide having an arginine oligomer in which 7 to 30 arginines are peptide-bound, a peptide having an amino acid sequence of GRKKRRQRRRPPPQ (for example, HIV-1 Tat: SEQ ID NO: 1), and an amino acid sequence of TRQUARRNRRRWRRQR. Peptide having (eg, HIV-1 Rev: SEQ ID NO: 2), peptide having an amino acid sequence of RRRRNRTRRNRRRVR (eg, FHV Coat: SEQ ID NO: 3), peptide having an amino acid sequence of TRRQRRRRARNRN (eg, HTLV-II Rex: SEQ ID NO: 4), Hydrophilic basic peptides such as peptides having an amino acid sequence of KLTRAQRRAARKNKRNTR (eg, CCMV Gag: SEQ ID NO: 5); peptides having an amino acid sequence of RQIKIWFQNRRMKWKK (eg, Antennapedia: SEQ ID NO: 6), amino acids of KMTRAQRRAAARRNRWTA. Peptide having a sequence (for example, BMW Gag: SEQ ID NO: 7), peptide having an amino acid sequence of RQIKIWFQNRRMKWKK (for example, Penetratin: SEQ ID NO: 8), peptide having an amino acid sequence of NAKTRRHERRRKLAIER (eg, P22N: SEQ ID NO: 9), DAATATRGRASSARPT Peptide having an amino acid sequence (eg, VP22: SEQ ID NO: 10) and other amphoteric basic peptides; peptide having an amino acid sequence of GWTLNSAGYLLGKINLKALAALKIL (eg, transportan: SEQ ID NO: 11), peptide having an amino acid sequence of AGYLLGKINLKALAALKIL. (For example, TP-10: SEQ ID NO: 12) and the like are hydrophobic basic peptides and the like. The membrane-permeable peptide may be the above-mentioned arginine oligomer or a peptide consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12.
Among them, as the membrane-permeable peptide, a hydrophilic basic peptide is preferable, a peptide having an arginine oligomer is more preferable, and a peptide composed of an arginine oligomer is even more preferable. The number of repetitions of arginine in the arginine oligomer is preferably 7 to 20, more preferably 7 to 15, and even more preferably 7 to 10.

一般式（１）中、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。
炭素数１～４のアルコキシル基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、１－メチルプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基等が挙げられる。Ｘ^２としては、水酸基、アミノ基、ｔ－ブトキシ基、ベンジルオキシ基が好ましく、水酸基、アミノ基が更に好ましく、アミノ基が最も好ましい。
一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物中、一般式（１）で表される基が複数存在する場合、それぞれの一般式（１）で表される基の、Ｘ^１及びＸ^２は同一であってもよく、異なっていてもよい。 In the general formula (1), X ² represents a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group.
Examples of the alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, an isobutoxy group, a 1-methylpropoxy group, a t-butoxy group and the like. As X ² , a hydroxyl group, an amino group, a t-butoxy group and a benzyloxy group are preferable, a hydroxyl group and an amino group are more preferable, and an amino group is most preferable.
When a plurality of groups represented by the general formula (1) are present in the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, the group represented by the general formula (1) is used. X ¹ and X ² may be the same or different.

本明細書において、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の主鎖部分を幹高分子という。 In the present specification, the main chain portion of the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain is referred to as a stem polymer.

幹高分子は、特に限定されないが、親水性高分子であることが好ましい。ここで、親水性高分子とは、水溶性高分子、または水中で膨潤する高分子を意味する。本明細書において、水溶性高分子とは、常圧下で２５℃の水に０．１質量％以上の量で均一に溶解する高分子をいう。 The stem polymer is not particularly limited, but is preferably a hydrophilic polymer. Here, the hydrophilic polymer means a water-soluble polymer or a polymer that swells in water. As used herein, the water-soluble polymer refers to a polymer that is uniformly dissolved in water at 25 ° C. in an amount of 0.1% by mass or more under normal pressure.

親水性高分子としては、例えば、グアーガム、アガロース、マンナン、グルコマンナン、ポリデキストロース、リグニン、キチン、キトサン、カラギーナン、プルラン、コンドロイチン硫酸、セルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、カチオンデンプン、デキストリンの多糖類又は多糖類の変性物；アルブミン、カゼイン、ゼラチン、ポリグルタミン酸、ポリリジン等の水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチド；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（アクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリＮ－ビニルアセトアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（２－アミノエチル（メタ）アクリレート）、（メタ）アクリル酸／アクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物、（メタ）アクリル酸／マレイン酸共重合物、（メタ）アクリル酸／フマル酸共重合物、エチレン／マレイン酸共重合物、イソブチレン／マレイン酸共重合物、スチレン／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／マレイン酸共重合物、アルキルビニルエーテル／フマル酸共重合物等のビニル系親水性高分子；水溶性ポリウレタン等が挙げられる。なお、本明細書において（メタ）アクリル酸とはアクリル酸および／またはメタクリル酸を意味する。 Examples of the hydrophilic polymer include guar gum, agarose, mannan, glucomannan, polydextrose, lignin, chitin, chitosan, carrageenan, purulan, chondroitin sulfate, cellulose, hemicellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and starch. , Cationic starch, polysaccharides of dextrin or modifications of polysaccharides; water-soluble proteins or water-soluble polypeptides such as albumin, casein, gelatin, polyglutamic acid, polylysine; poly (meth) acrylic acid, poly (hydroxyethyl acrylate). , Poly (meth) acrylamide, poly N-vinylacetamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, poly (2-aminoethyl (meth) acrylate), (meth) acrylic acid / acrylamide copolymer, (meth) acrylic acid / N- Isopropylacrylamide copolymer, (meth) acrylic acid / N-vinylacetamide copolymer, (meth) acrylic acid / maleic acid copolymer, (meth) acrylic acid / fumaric acid copolymer, ethylene / maleic acid copolymer Vinyl-based hydrophilic polymers such as isobutylene / maleic acid copolymer, styrene / maleic acid copolymer, alkyl vinyl ether / maleic acid copolymer, alkyl vinyl ether / fumaric acid copolymer; water-soluble polyurethane and the like. Be done. In addition, in this specification, (meth) acrylic acid means acrylic acid and / or methacrylic acid.

幹高分子への膜透過性ペプチド基のグラフト化が容易になることから、幹高分子としては、カルボキシル基を有する高分子が好ましく、カルボキシル基を有する親水性高分子がより好ましく、カルボキシル基を有するモノマーとカルボキシル基を有しないモノマーとの共重合物が更に好ましく、（メタ）アクリル酸／Ｎ－ビニルアセトアミド共重合物が最も好ましい。 Since the membrane-permeable peptide group can be easily grafted onto the stem polymer, the polymer having a carboxyl group is preferable, the hydrophilic polymer having a carboxyl group is more preferable, and the carboxyl group is used as the stem polymer. A copolymer of a monomer having and a monomer having no carboxyl group is more preferable, and a (meth) acrylic acid / N-vinylacetamide copolymer is most preferable.

幹高分子を構成するモノマー単位の数に対するカルボキシル基を有するモノマー単位の数の割合は、例えば、５～８０％程度が好ましく、１０～６０％程度がより好ましい。例えば、２０～４０％程度であってもよい。 The ratio of the number of monomer units having a carboxyl group to the number of monomer units constituting the stem polymer is preferably, for example, about 5 to 80%, more preferably about 10 to 60%. For example, it may be about 20 to 40%.

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物における膜透過性ペプチド残基の数は、幹高分子を構成するモノマー単位（多糖類又は多糖類の変性物の場合は単糖単位、水溶性タンパク質又は水溶性ポリペプチドの場合はアミノ酸単位）の数に対して、０．００１～０．９程度であることが好ましく、０．００５～０．８程度であることが更に好ましく、０．０１～０．７程度であることが最も好ましい。例えば、０．０５～０．５程度であってもよい。 The number of membrane-permeable peptide residues in a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in a side chain is a single monomer unit (in the case of a polysaccharide or a modified product of a polysaccharide) constituting a stem polymer. It is preferably about 0.001 to 0.9, more preferably about 0.005 to 0.8, with respect to the number of sugar units, water-soluble proteins or amino acid units in the case of water-soluble polypeptides). It is preferably about 0.01 to 0.7, and most preferably about 0.01 to 0.7. For example, it may be about 0.05 to 0.5.

幹高分子の重量平均分子量は、例えば、１０ｋＤａ～１００００ｋＤａが好ましく、３０ｋＤａ～５０００ｋＤａが更に好ましく、１００ｋＤａ～３０００ｋＤａが最も好ましい。なお、本明細書において重量平均分子量とは、水系溶媒を用いてＧＰＣ分析を行った場合の重量平均分子量であって、幹高分子が多糖類若しくは多糖類の変性物、又は水溶性タンパク質の場合には、プルラン換算の重量平均分子量、幹高分子がビニル系親水性高分子の場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）換算の重量平均分子量をいう。 The weight average molecular weight of the stem polymer is, for example, preferably 10 kDa to 10000 kDa, more preferably 30 kDa to 5000 kDa, and most preferably 100 kDa to 3000 kDa. In the present specification, the weight average molecular weight is the weight average molecular weight when GPC analysis is performed using an aqueous solvent, and the stem polymer is a polysaccharide, a modified product of the polysaccharide, or a water-soluble protein. Means the weight average molecular weight in terms of pullulan, and when the stem polymer is a vinyl-based hydrophilic polymer, it means the weight average molecular weight in terms of polyethylene glycol (PEG) or polyethylene oxide (PEO).

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の製造方法は特に限定されず、当業者に広く知られている各種の方法を適用できる。例えば、一般式（１）で表される基を有する重合性モノマーを重合して製造してもよく、幹高分子に一般式（１）で表される基を導入して製造してもよい。例えば、幹高分子のカルボキシル基に、膜透過性ペプチドのアミノ基をペプチド反応させることにより得ることができる。カルボキシル基とアミノ基との反応は、公知の方法を用いればよく、例えば、カルボキル基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミドによりスクシイミドエステル化した後、アミノ基を反応させる方法等が挙げられる。 The method for producing a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in a side chain is not particularly limited, and various methods widely known to those skilled in the art can be applied. For example, it may be produced by polymerizing a polymerizable monomer having a group represented by the general formula (1), or it may be produced by introducing a group represented by the general formula (1) into a stem polymer. .. For example, it can be obtained by subjecting the carboxyl group of the stem polymer to the amino group of the membrane-permeable peptide. As the reaction between the carboxyl group and the amino group, a known method may be used, and examples thereof include a method in which the carboxyl group is succiimide esterified with N-hydroxysuccinimide and then the amino group is reacted.

本開示に用いられる抗原は、例えば、がん抗原であることが好ましい。がん抗原としては、がん細胞特異的である限り特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。また、本開示に用いられる抗原としては、例えば、がん細胞又は組織の溶解液等を用いることもできる。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
がん抗原は、例えば、本開示の樹状細胞ワクチンを投与される対象由来であってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。 The antigen used in the present disclosure is preferably, for example, a cancer antigen. The cancer antigen is not particularly limited as long as it is specific to cancer cells, and examples thereof include proteins, peptides, DNA, RNA and the like. Further, as the antigen used in the present disclosure, for example, a lysate of cancer cells or tissues can be used. These can be used alone or in combination of two or more.
The cancer antigen may be, for example, derived from a subject to which the dendritic cell vaccine of the present disclosure is administered, or may be artificially synthesized.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する方法は、樹状細胞に抗原が取り込まれる限り特に限定されず、例えば、水性媒体中で、樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する方法などが挙げられる。 The method for mixing the dendritic cell, the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and the antigen is not particularly limited as long as the antigen is taken up by the dendritic cell, and is, for example, in an aqueous medium. Examples thereof include dendritic cells, a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in a side chain, and a method of mixing an antigen.

水性媒体としては、例えば、細胞培養に一般的に用いられる培地；樹状細胞培養液；蒸留水；生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の等張液等が挙げられる。 Examples of the aqueous medium include a medium generally used for cell culture; dendritic cell culture solution; distilled water; isotonic solution such as physiological saline and glucose aqueous solution.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における樹状細胞の濃度は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、１．０×１０^４～２．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度とすることができる。１．０×１０^５～５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であってもよい。 In the step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and an antigen, the concentration of dendritic cells in the mixed solution is not particularly limited and should be appropriately set. Can be done. For example, it can be about 1.0 × 10 ⁴ to 2.0 × 10 ⁷ cells / ml. It may be about 1.0 × 10 ⁵ to 5 × 10 ⁶ cells / ml.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ程度とすることができる。５μｇ／ｍ１～７５μｇ／ｍｌ程度であってもよい。 In the step of mixing a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and an antigen, a high molecular weight compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain in the mixed solution. The concentration of the molecular compound can be, for example, about 0.1 μg / ml to 1 mg / ml. It may be about 5 μg / m1 to 75 μg / ml.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程において、混合液における抗原の濃度は、抗原の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、０．５μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ程度とすることができる。５μｇ／ｍ～１００μｇ／ｍｌ程度であってもよい。
例えば、細胞の溶解液を抗原として用いる場合には、樹状細胞と細胞溶解液の調製に用いる細胞との細胞数の比率は、例えば、１：０．５～１：５程度とすることができる。 In the step of mixing dendritic cells, a polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and an antigen, the concentration of the antigen in the mixed solution may be appropriately set according to the type of the antigen. can. For example, it can be about 0.5 μg / ml to 10 mg / ml. It may be about 5 μg / m to 100 μg / ml.
For example, when a cell lysate is used as an antigen, the ratio of the number of cells to the dendritic cells and the cells used to prepare the cell lysate may be, for example, about 1: 0.5 to 1: 5. can.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する温度は、樹状細胞が生存し得る限り、特に限定されず、例えば、３０～４０℃程度とすることができる。例えば、３４～３８℃程度であってもよい。 The temperature at which the dendritic cell, the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and the antigen are mixed is not particularly limited as long as the dendritic cell can survive, and is, for example, 30 to 40. It can be about ° C. For example, it may be about 34 to 38 ° C.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する時間は、樹状細胞に抗原が取り込まれる限り特に限定されず、例えば、１５分～２４時間程度とすることができる。例えば、３０分～３時間程度であってもよい。 The time for mixing the dendritic cell, the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and the antigen is not particularly limited as long as the antigen is taken up by the dendritic cell, and is, for example, from 15 minutes. It can be about 24 hours. For example, it may be about 30 minutes to 3 hours.

樹状細胞、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合する工程は、例えば、振盪、攪拌等を行ってもよい。振盪、攪拌方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The step of mixing the dendritic cell, the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain, and the antigen may be, for example, shaking, stirring or the like. As the shaking and stirring methods, methods known in the art can be used, and any conditions can be adopted.

本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法は、さらに樹状細胞を洗浄する工程を含んでいてもよい。洗浄方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The method for producing a dendritic cell vaccine of the present disclosure may further include a step of washing the dendritic cells. As the cleaning method, a method known in the art can be used, and any condition can be adopted.

本開示の樹状細胞ワクチンの製造方法は、さらに樹状細胞を濃縮する工程を含んでいてもよい。濃縮方法は、当該技術分野において公知の方法を用いることができ、任意の条件を採用することができる。 The method for producing a dendritic cell vaccine of the present disclosure may further include a step of concentrating dendritic cells. As the concentration method, a method known in the art can be used, and any condition can be adopted.

本開示の樹状細胞ワクチンは、がんワクチンとして好適に用いることができる。このため、本開示の樹状細胞ワクチンは、がんの治療に好適に用いることができる。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure can be suitably used as a cancer vaccine. Therefore, the dendritic cell vaccine of the present disclosure can be suitably used for the treatment of cancer.

本開示の樹状細胞ワクチンにおける樹状細胞の含有量は、特に限定されず、適宜設定することができる。 The content of dendritic cells in the dendritic cell vaccine of the present disclosure is not particularly limited and can be appropriately set.

本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物は、含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。 In the dendritic cell vaccine of the present disclosure, the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain may or may not be contained.

本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、抗原は、樹状細胞に取り込まれていることが好ましい。なお本開示の樹状細胞ワクチンにおいて、抗原は、樹状細胞外に存在していてもよい。 In the dendritic cell vaccine of the present disclosure, it is preferable that the antigen is taken up by dendritic cells. In the dendritic cell vaccine of the present disclosure, the antigen may be present outside the dendritic cell.

本開示の樹状細胞ワクチンは、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される各種担体（例えば、溶剤、分散剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）等が例示される。また、本開示の樹状細胞ワクチンは、アジュバントを含んでいてもよい。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 The dendritic cell vaccines of the present disclosure may further contain other components. Other components include various pharmaceutically acceptable carriers (eg, solvents, dispersants, tonicity agents, chelating agents, stabilizers, pH regulators, preservatives, preservatives, antioxidants, dissolutions. Auxiliary agents, thickening agents, etc.) are exemplified. The dendritic cell vaccine of the present disclosure may also contain an adjuvant. These can be used alone or in combination of two or more.

本開示の樹状細胞ワクチンの製剤形態は、特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、ゼリー剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、軟膏剤、パップ剤、貼付剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤等の非経口投与剤等を挙げられる。中でも、注射剤が好ましい。 The pharmaceutical form of the dendritic cell vaccine of the present disclosure is not particularly limited, and for example, oral administration agents such as tablets, pills, capsules, powders, granules, liquids, syrups and jellies; injections and instillations. , Ointments, paps, patches, nasal drops, inhalants, suppositories and other parenteral administrations. Of these, injections are preferred.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与方法としては、例えば、経口投与、及び非経口（例えば静脈、動脈、筋肉、皮下、腹腔、直腸、経皮、局所など）投与により、投与することができる。中でも、皮下投与が好ましい。 The dendritic cell vaccine of the present disclosure can be administered, for example, by oral administration and parenteral administration (for example, intravenous, arterial, muscle, subcutaneous, abdominal cavity, rectum, transdermal, topical, etc.). Of these, subcutaneous administration is preferable.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与対象としては、例えば、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、ヒト；ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等の非ヒト哺乳動物などが例示される。 Examples of the administration target of the dendritic cell vaccine of the present disclosure include mammals. Examples of mammals include humans; non-human mammals such as rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep and monkeys.

本開示の樹状細胞ワクチンの投与（摂取）量は、特に限定されず、投与する対象の年齢、性別、症状の程度、投与方法等により決定される。 The administration (intake) amount of the dendritic cell vaccine of the present disclosure is not particularly limited, and is determined by the age, gender, degree of symptoms, administration method, etc. of the subject to be administered.

本開示は、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含有する、樹状細胞ワクチン製造補助剤をも包含する。本明細書において、当該樹状細胞ワクチン製造補助剤を、「本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤」と表記することがある。

The present disclosure also includes a dendritic cell vaccine production aid containing a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in the side chain. In the present specification, the dendritic cell vaccine production aid may be referred to as "the dendritic cell vaccine production aid of the present disclosure".

一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物については、上記記載を援用することができる。 The above description can be incorporated for the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤における、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の含有量は、特に限定されず、適宜設定することができる。 The content of the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain in the dendritic cell vaccine production auxiliary agent of the present disclosure is not particularly limited and can be appropriately set.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤は、一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物に加えて、さらに他の成分を含むことができる。当該他の成分としては、薬学的に許容される各種担体（例えば、溶剤、分散剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、保存剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）等が例示される。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 The dendritic cell vaccine production auxiliary agent of the present disclosure may contain other components in addition to the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain. Other components include various pharmaceutically acceptable carriers (eg, solvents, dispersants, tonicity agents, chelating agents, stabilizers, pH regulators, preservatives, preservatives, antioxidants, dissolutions. Auxiliary agents, thickening agents, etc.) are exemplified. These can be used alone or in combination of two or more.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤の形態は、特に限定されず、例えば、液体状（例えば、溶液状、懸濁液状等）、ペースト状、又は固体状（例えば、粉末状、等）等であってもよい。 The form of the dendritic cell vaccine production aid of the present disclosure is not particularly limited, and is, for example, liquid (for example, solution, suspension, etc.), paste, solid (for example, powder, etc.) and the like. May be.

本開示の樹状細胞ワクチン製造補助剤によれば、樹状細胞による抗原の取り込みを促進することができる。 According to the dendritic cell vaccine production aid of the present disclosure, it is possible to promote the uptake of antigen by dendritic cells.

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of ” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。 In addition, in this specification, "includes" also includes "consisting of" and "consisting of" (The term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of."). In addition, the present disclosure includes all combinations of the constituent elements described herein.

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。 In addition, the various characteristics (property, structure, function, etc.) described for each embodiment of the present disclosure described above may be combined in any way in specifying the subject matter included in the present disclosure. That is, the present disclosure includes all subjects consisting of any combination of each of the combinable properties described herein.

本開示の内容を以下の実験例等を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。 The contents of the present disclosure will be specifically described with reference to the following experimental examples and the like. However, this disclosure is not limited to these. In the following, the experiments are carried out under atmospheric pressure and normal temperature conditions, unless otherwise specified. Also, unless otherwise specified, "%" means "mass%".

実験例１：DC2.4による抗原取り込み試験
細胞株と用いた培地
C57BL/6マウス由来樹状細胞株Dendritic Cell 2.4(DC2.4)はUniversity of Assachusetts Medical schoolのKenneth l.Rockより提供された。DC2.4はFetal Bovine Serum (FBS)(SIGMA Life Science)10%、Non-Essential Amino Asids solution（ナカライテスク）1%、Sodium Pyruvate Solution（ナカライテスク）1%、Penicilin Streptomycin（ナカライテスク）1%、2-MercaptoEthanol（FUJIFILM）0.004%を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地で培養した。ただし、DC2.4への抗原導入時にはFBSのみ含まず他の試薬を加えたRPMI培地を使用した(これをFBS(-)RPMI培地とする)。 Experimental Example 1: Antigen uptake test using DC2.4
Medium used with cell line
The C57BL / 6 mouse-derived dendritic cell line Dendritic Cell 2.4 (DC2.4) was provided by Kenneth l. Rock of the University of Assachusetts Medical School. DC2.4 is Fetal Bovine Serum (FBS) (SIGMA Life Science) 10%, Non-Essential Amino Asids solution (Nacalai Tesque) 1%, Sodium Pyruvate Solution (Nacalai Tesque) 1%, Penicillin Streptomycin (Nacalai Tesque) 1%, Incubated in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium containing 0.004% 2-MercaptoEthanol (FUJIFILM). However, when introducing the antigen into DC2.4, an RPMI medium containing only FBS and other reagents was used (this is referred to as FBS (-) RPMI medium).

実験手順
1.0×10⁵ cellのDC2.4を24ウェルプレートに播種し、RPMI培地で1日培養した。培養液の上清を除去し、FBS（-）RPMI培地を加えた。抗原としてOvalbumin-Fluorescein conjugate(OVA)(Merck)を用いた。OVA 10μg/ml（図１中、OVAと示す。）、OVA 10μg/mlとKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(Wako) 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋KLHと示す。）、OVA 10μg/mlと膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋HAと示す。）、OVA 10μg/mlと膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8 50μg/mlの混合物（図１中、OVA＋VPと示す。）を、DC2.4を培養しているウェルプレートにtriplicate（各群n=3）で添加した。なお、HA-G4R8とVP-R8は摂南大学の佐久間信至先生より提供された。構造式をそれぞれ以下に示す。なお、膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8の主鎖のヒアルロン酸の重量平均分子量は27 kDaであり、膜透過ペプチド部分の分子量とその固定化率から算出した、膜透過ペプチド固定化高分子HA-G4R8の重量平均分子量は114 kDaであった。また、膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8の幹高分子（PNVA-co-AA：アクリル酸／N-ビニルアセトアミド共重合体）の重量平均分子量は、350 kDaであり、膜透過ペプチドとして用いたD-オクタアルギニンの分子量とその固定化率から算出した、膜透過ペプチド固定化高分子VP-R8の重量平均分子量は1100 kDa（計算値）であった。 Experimental procedure
DC2.4 of 1.0 × 10 ⁵ cells was seeded on a 24-well plate and cultured in RPMI medium for 1 day. The supernatant of the culture medium was removed, and FBS (-) RPMI medium was added. Ovalbumin-Fluorescein conjugate (OVA) (Merck) was used as the antigen. OVA 10 μg / ml (indicated as OVA in FIG. 1), a mixture of OVA 10 μg / ml and Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (Wako) 50 μg / ml (indicated as OVA + KLH in FIG. 1), OVA 10 μg / ml Mixture of membrane-permeable peptide-immobilized polymer HA-G4R8 50 μg / ml (indicated as OVA + HA in FIG. 1), mixture of OVA 10 μg / ml and membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 50 μg / ml (in FIG. 1) , OVA + VP) was added to the well plate culturing DC2.4 in a triplicate (n = 3 in each group). HA-G4R8 and VP-R8 were provided by Dr. Shinji Sakuma of Setsunan University. The structural formulas are shown below. The weight average molecular weight of hyaluronic acid in the main chain of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer HA-G4R8 is 27 kDa, and the membrane-permeable peptide-immobilized polymer calculated from the molecular weight of the membrane-permeable peptide portion and its immobilization rate. The weight average molecular weight of HA-G4R8 was 114 kDa. The weight average molecular weight of the stem polymer (PNVA-co-AA: acrylic acid / N-vinylacetamide copolymer) of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 is 350 kDa, and is used as a membrane-permeable peptide. The weight average molecular weight of the membrane-permeable peptide-immobilized polymer VP-R8 calculated from the molecular weight of D-octaarginine and its immobilization rate was 1100 kDa (calculated value).

ウェルプレートを37℃、1時間インキュベートした。上清を除去し、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。Accutase（商標）（ナカライテスク）を添加し、37℃、5分間インキュベートした。ピペッティングし細胞塊をほぐして単一にし、15 mlチューブにうつして、4℃、2000 rpm、5分で遠心した。D-PBSで2回洗浄した後300μlのD-PBSに懸濁し、Guava（登録商標）easyCyte（商標）Flow Cytometers(Luminex Corporation)によりMean Fluorescence Intensity（MFI）を測定した。結果を図１に示す。 Well plates were incubated at 37 ° C for 1 hour. The supernatant was removed and washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). Accutase ™ (Nacalai Tesque) was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. The cell mass was pipetted to loosen it into a single piece, transferred to a 15 ml tube, and centrifuged at 4 ° C., 2000 rpm, 5 minutes. After washing twice with D-PBS, the cells were suspended in 300 μl of D-PBS, and Mean Fluorescence Intensity (MFI) was measured by Guava® easyCyte® Flow Cytometers (Luminex Corporation). The results are shown in FIG.

図１に示すとおり、OVAと膜輸送性高分子ポリマーVP-R8の混合物を添加した場合に、DC2.4による抗原（OVA）取り込みが有意に増加していることが確認された。 As shown in FIG. 1, it was confirmed that the antigen (OVA) uptake by DC2.4 was significantly increased when the mixture of OVA and the membrane transport polymer VP-R8 was added.

実験例２：DC2.4ワクチンin vivo実験
用いた動物と細胞株
実験に用いたメスのC57BL/6マウスはチャールズリバーより購入した。また、DC2.4は実験例１と同様の方法により培養を行った。
C57BL/6Nマウス由来の悪性リンパ腫細胞株であるEL4細胞を使用し、FBS 10%を含むRPMI培地を用いて培養した。 Experimental example 2: DC2.4 vaccine in vivo experiment
The animals used and the female C57BL / 6 mice used in the cell line experiment were purchased from Charles River. In addition, DC2.4 was cultured by the same method as in Experimental Example 1.
EL4 cells, a malignant lymphoma cell line derived from C57BL / 6N mice, were used and cultured in RPMI medium containing 10% FBS.

腫瘍細胞溶解液（ライセ―ト）の準備
シャーレに培養したEL4細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。0.25w/v％トリプシン-1mmol/l EDTA・4Na溶液（Wako）を添加し、37℃、5分インキュベートした。シャーレからはがした細胞をD-PBSで2回洗浄後、2×10⁷ cells/mLでD-PBSに懸濁した。液体窒素に細胞液を3分間浸したのちに42℃で解凍した。これを5回繰り返した。4℃、10000 rpm、10分遠心した後、上清を回収した。回収した上清を0.22μmのMillex-GV Filter Unit(Merck)で濾過し、その液をライセ―トとして回収した。 Preparation of tumor cell lysate (lysate) EL4 cells cultured in a petri dish were washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). A 0.25 w / v% trypsin-1 mmol / l EDTA · 4Na solution (Wako) was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. The cells removed from the petri dish were washed twice with D-PBS and then suspended in D-PBS at 2 × 10 ⁷ cells / mL. The cell fluid was soaked in liquid nitrogen for 3 minutes and then thawed at 42 ° C. This was repeated 5 times. After centrifugation at 4 ° C. and 10000 rpm for 10 minutes, the supernatant was collected. The collected supernatant was filtered through a 0.22 μm Millex-GV Filter Unit (Merck), and the solution was collected as a lysate.

マウスへの腫瘍投与
培養したEL4細胞の上清を除去し、D-PBSで1回洗浄後、トリプシンを添加後インキュベートした。細胞数をカウントし、細胞液が1.4×10⁵ cells/70μlになるよう調整した。70μlずつ1.5 mlチューブに分注し、同量のCorning（登録商標）Matrigel（登録商標）(Corning)を加えた。マウスにセボフルラン（Wako）を用いて麻酔をかけ、細胞液をピペットでやさしく十分に混和した後、右側背中部に1.4×10⁵ cells/100μlで皮下投与した。 Tumor administration to mice The supernatant of cultured EL4 cells was removed, washed once with D-PBS, added with trypsin, and then incubated. The number of cells was counted and the cell fluid was adjusted to 1.4 × 10 ⁵ cells / 70 μl. 70 μl each was dispensed into 1.5 ml tubes and the same amount of Corning® Matrigel® (Corning) was added. Mice were anesthetized with sevoflurane (Wako), the cell fluid was gently and thoroughly mixed with a pipette, and then subcutaneously administered at 1.4 × 10 ⁵ cells / 100 μl to the right back.

DC2.4ワクチンの調製と投与
培養したDC2.4細胞の上清を除去し、FBS(-)RPMI培地を3 ml加えた。DC2.4細胞にライセ－ト（図２中、DC2.4+EL4Lysateと示す。）、ライセ―トとKeyhole Limpet Hemocyanin(KLH)(Wako)50μg/mlの混合物（図２中、DC2.4+EL4Lysate+KLHと示す。）、ライセ－トとVP-R8 12.5μg/mlの混合物（図２中、DC2.4+EL4Lysate+VPと示す。）を添加した。ライセ－トはDC2.4(1.0×10⁶ cells/mouse)の3倍の細胞数から抽出した。添加後、振盪させながら1h、37℃インキュベートした。上清を除去し、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline（D-PBS）で2回洗浄した。Accutase（商標）（ナカライテスク）を添加し、37℃、5分間インキュベートした。ピペッティングし細胞塊をほぐして単一にし、15 mlチューブにうつして、4℃、2000 rpm、5分で遠心し、D-PBSで2回洗浄した。マウス1匹あたり1.0×10⁶ cells in 100μl D-PBS投与できるようD-PBSに懸濁しDC2.4ワクチンを調製した。 Preparation and administration of DC2.4 vaccine The supernatant of cultured DC2.4 cells was removed, and 3 ml of FBS (-) RPMI medium was added. DC2.4 cells with lysate (indicated as DC2.4 + EL4Lysate in Fig. 2), a mixture of lysate and Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) (Wako) 50 μg / ml (in Fig. 2, DC2.4 + EL4Lysate + KLH), a mixture of lysate and VP-R8 12.5 μg / ml (indicated as DC2.4 + EL4Lysate + VP in FIG. 2) were added. The lysate was extracted from 3 times the number of cells of DC2.4 (1.0 × 10 ⁶ cells / mouse). After the addition, the mixture was incubated at 37 ° C for 1 h with shaking. The supernatant was removed and washed twice with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS). Accutase ™ (Nacalai Tesque) was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. The cell mass was pipetted to loosen it into a single piece, transferred to a 15 ml tube, centrifuged at 4 ° C., 2000 rpm for 5 minutes, and washed twice with D-PBS. A DC2.4 vaccine was prepared by suspending it in D-PBS so that 1.0 × 10 ⁶ cells in 100 μl D-PBS could be administered per mouse.

腫瘍を投与した日をday0として、day7、10、13に、マウスの鼠径リンパ節周辺に調製した各DC2.4ワクチンの皮下投与を行った。なお、DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLHに加えて、PBSのみ（図２中、PBSと示す。）、およびライセート、KLHまたはVPのいずれも添加せずに培養調整したDC2.4細胞（図２中、DC2.4と示す。）についても同様にマウスの鼠径リンパ節周辺に皮下投与を行った。 The day when the tumor was administered was set to day 0, and on days 7, 10 and 13, subcutaneous administration of each DC2.4 vaccine prepared around the inguinal lymph node of the mouse was performed. In addition to DC2.4 + EL4Lysate, DC2.4 + EL4Lysate + VP, DC2.4 + EL4Lysate + KLH, PBS only (referred to as PBS in FIG. 2), and either lysate, KLH or VP were added. DC2.4 cells (indicated as DC2.4 in FIG. 2) that had been cultured and adjusted without culture were also subcutaneously administered around the inguinal lymph nodes of mice.

腫瘍径測定を行い、平均腫瘍体積の算定を行った。腫瘍の体積は（腫瘍体積）＝（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）²/2で算定を行った。結果を図２に示す。 Tumor diameter was measured and average tumor volume was calculated. The tumor volume was calculated by (tumor volume) = (tumor major axis) x (tumor minor axis) ^2/2 . The results are shown in FIG.

図２に示す通り、DC2.4細胞にライセ―トとVP-R8の混合物を添加して調製した懸濁液（DC2.4ワクチン）をマウスに投与すると、腫瘍体積の増加が抑制することが確認された。 As shown in FIG. 2, when a suspension (DC2.4 vaccine) prepared by adding a mixture of lysate and VP-R8 to DC2.4 cells is administered to mice, the increase in tumor volume can be suppressed. confirmed.

実験例３：治療したマウスから摘出した脾臓細胞を用いたICCS実験
用いた動物と細胞株
実験例２と同様の動物、及び細胞株を同様に用いた。 Experimental Example 3: ICCS experiment using spleen cells removed from treated mice
Animals used and cell lines Animals similar to Experimental Example 2 and cell lines were used in the same manner.

腫瘍細胞溶解液（ライセ―ト）の準備
実験例２と同様の方法により、ライセートを調製した。 Preparation of Tumor Cell Lysate (Lysate) Lysate was prepared by the same method as in Experimental Example 2.

DC2.4ワクチンの調製と投与
実験例２と同様の方法により、D-PBSに懸濁したDC2.4ワクチン（DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLH）を調製し、マウスの鼠径リンパ節周辺に計3回皮下投与を行った（最初に投与を行った日をday0とし、day0、3、6に投与を行った）。なお、DC2.4+EL4Lysate、DC2.4+EL4Lysate+VP、DC2.4+EL4Lysate+KLHに加えて、PBSのみ（図３中、PBSと示す。）、およびライセート、KLHまたはVPのいずれも添加せずに培養調整したDC2.4細胞（図３中、DC2.4と示す。）についても同様にマウスの鼠径リンパ節周辺に皮下投与を行った。 Preparation and administration of DC2.4 vaccine DC2.4 vaccine suspended in D-PBS (DC2.4 + EL4Lysate, DC2.4 + EL4Lysate + VP, DC2.4 + EL4Lysate + KLH) by the same method as in Experimental Example 2. ) Was prepared and subcutaneously administered three times in total around the inguinal lymph node of the mouse (the day of the first administration was set to day 0, and the administration was performed on days 0, 3, and 6). In addition to DC2.4 + EL4Lysate, DC2.4 + EL4Lysate + VP, DC2.4 + EL4Lysate + KLH, PBS only (referred to as PBS in FIG. 3), and either lysate, KLH or VP were added. DC2.4 cells (indicated as DC2.4 in FIG. 3) that had been cultured and adjusted without culture were also subcutaneously administered around the inguinal lymph nodes of mice.

脾臓回収
最後に投与を行ってから2週間後（day20）にマウスを安楽死させ、脾臓を回収し、セルスクレイパー(日本ジェネティクス)と滅菌ピンセット（アズワン）を使って、脾臓をすりつぶした。セルストレイナー（コーニング）で脾臓細胞を濾過した。4℃、2000 rpm、5分で遠心後、上清を除去した。Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma Aldrich) を1 ml入れて室温で2分インキュベートした。RPMI培地を5 ml加え混和し、4℃、2000 rpm、5分で遠心した。上清を吸い、D-PBSで2回洗浄し、RPMI培地1 mlで懸濁した。96ウェルプレートに細胞液100μlを加え、培養しておいたEL4 2.0×10⁵ cells/サンプルをMitomycin C 50μg/mlで処理したものを100μl添加し、抗原刺激を行った。 Spleen recovery Two weeks after the last administration (day 20), mice were euthanized, the spleen was recovered, and the spleen was ground using cell scraper (Nippon Genetics) and sterile tweezers (As One). Spleen cells were filtered through a cell strainer (Corning). After centrifugation at 4 ° C. and 2000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed. 1 ml of Red Blood Cell Lysis Buffer (Sigma Aldrich) was added and incubated at room temperature for 2 minutes. 5 ml of RPMI medium was added, mixed, and centrifuged at 4 ° C., 2000 rpm, and 5 minutes. The supernatant was aspirated, washed twice with D-PBS and suspended in 1 ml of RPMI medium. 100 μl of cell solution was added to a 96-well plate, and 100 μl of cultured EL4 2.0 × 10 ⁵ cells / sample treated with Mitomycin C 50 μg / ml was added for antigen stimulation.

ICCS実験
抗原刺激を行った脾臓細胞にBD Golgi Stop（商標）(BDs Biosciences)を添加後12時間培養し、ウェルプレートを遠心（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。100μlのstaining buffer（1%FBS、0.09%アジ化ナトリウムin PBS）で1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。1μg CD16/32抗体（Bio Legend）in 100μl staining bufferを添加し氷上で15分間静置した。100μlのstaining bufferで1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。NC（ネガティブコントロール）用の脾臓細胞として抗体反応を行わないサンプルを用意した。FITC-anti-mouse CD4 (BD Biosciences) 抗体、APC-anti-mouse CD8 (BD Biosciences) 抗体、PerCP-anti-mouse CD3 (BD Biosciences) 抗体in Staining Bufferを100μl添加し遮光下、氷上30分静置した。100μlのstaining bufferで1回洗浄（4℃、2500 rpm、5 min）し、上清除去した。細胞を100μl Fixation/Permeabilization solution (BD Biosciences) で遮光下、氷上20分静置した。1×BD Perm/Wash Buffer (BD Biosciences) で2回洗浄した（4℃、3500 rpm、5 min）。細胞をPE-anti mouse IFN-γ抗体（BD Biosciences）[0.5μg in 100μl Perm/Wash Buffer(終濃度5μg/ml)]で遮光下、氷上30分静置した。1×BD Perm/Wash Bufferで2回洗浄（4℃、3500 rpm、5 min）した。細胞を300μl staining bufferに懸濁し、Guava（登録商標）easyCyte（商標）Flow Cytometers(Luminex Corporation)によりMean Fluorescence Intensity（MFI）を測定した。結果を図３に示す。 ICCS experiment The spleen cells stimulated with antigen were cultured for 12 hours after adding BD Golgi Stop ™ (BDs Biosciences), and the well plate was centrifuged (4 ° C, 2500 rpm, 5 min) and the supernatant was removed. The supernatant was removed by washing once with 100 μl of retaining buffer (1% FBS, 0.09% sodium azide in PBS) (4 ° C., 2500 rpm, 5 min). 1 μg CD16 / 32 antibody (Bio Legend) in 100 μl staining buffer was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 15 minutes. The supernatant was removed by washing once with 100 μl of retaining buffer (4 ° C., 2500 rpm, 5 min). Samples not subjected to antibody reaction were prepared as spleen cells for NC (negative control). Add 100 μl of FITC-anti-mouse CD4 (BD Biosciences) antibody, APC-anti-mouse CD8 (BD Biosciences) antibody, PerCP-anti-mouse CD3 (BD Biosciences) antibody in Staining Buffer and leave it on ice for 30 minutes under shading. bottom. The supernatant was removed by washing once with 100 μl of retaining buffer (4 ° C., 2500 rpm, 5 min). The cells were allowed to stand on ice for 20 minutes under shading with 100 μl Fixation / Permeabilization solution (BD Biosciences). Washed twice with 1 × BD Perm / Wash Buffer (BD Biosciences) (4 ° C, 3500 rpm, 5 min). The cells were allowed to stand on ice for 30 minutes under shading with PE-anti mouse IFN-γ antibody (BD Biosciences) [0.5 μg in 100 μl Perm / Wash Buffer (final concentration 5 μg / ml)]. Washed twice with 1 × BD Perm / Wash Buffer (4 ° C, 3500 rpm, 5 min). Cells were suspended in a 300 μl staining buffer and Mean Fluorescence Intensity (MFI) was measured by Guava® easyCyte® Flow Cytometers (Luminex Corporation). The results are shown in FIG.

図３に示すとおり、DC2.4細胞にライセ―トとVP-R8の混合物を添加して培養調製したDC2.4ワクチンをマウスに投与すると、抗原タンパク（EL4細胞）の刺激に反応してIFN-γ陽性のCD4およびCD8細胞数が増加する傾向が確認された。これは当該ワクチンが抗原特異的な細胞性免疫を誘導することができることを示唆する。 As shown in FIG. 3, when the DC2.4 vaccine prepared by adding a mixture of lysate and VP-R8 to DC2.4 cells was administered to mice, IFN responded to the stimulation of the antigen protein (EL4 cells). -It was confirmed that the number of γ-positive CD4 and CD8 cells tended to increase. This suggests that the vaccine can induce antigen-specific cell-mediated immunity.

Claims (6)

樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を混合することを含む、樹状細胞ワクチンの製造方法。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。） A method for producing a dendritic cell vaccine, which comprises mixing a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, and an antigen.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.) 前記膜透過性ペプチドが、７～３０個のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマーを有するペプチド、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＬＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＫＮＫＲＮＴＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＮＡＫＴＲＲＨＥＲＲＲＫＬＡＩＥＲなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＤＤＰＶＤなるアミノ酸配列を有するペプチド、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチド、及びＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の膜透過性ペプチドである、請求項１に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。 The membrane-permeable peptide includes a peptide having an arginine oligomer in which 7 to 30 arginines are peptide-bound, a peptide having an amino acid sequence of GRKKRRQRRRPQ, a peptide having an amino acid sequence of TRQARRRRRRWRRQR, a peptide having an amino acid sequence of RRRRNRRRRRRR. Peptide with sequence, peptide with amino acid sequence KLTRAQRRAARKNKRNTR, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK, peptide with amino acid sequence KMTRAQRRAAARRNRWTAR, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK, peptide with amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK The method for producing a dendritic cell vaccine according to claim 1, which is at least one membrane-permeable peptide selected from the group consisting of a peptide having a peptide, a peptide having an amino acid sequence of GWTLNSAGYLLGKINLKALAALKIL, and a peptide having an amino acid sequence of AGYLLGKINLKALAALKIL. .. 前記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物の幹高分子が、ビニル系親水性高分子である、請求項１又は２に記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。 The method for producing a dendritic cell vaccine according to claim 1 or 2, wherein the stem polymer of the polymer compound having a group represented by the general formula (1) in the side chain is a vinyl-based hydrophilic polymer. 前記抗原が、がん抗原であり、前記樹状細胞ワクチンが、がんワクチンである、請求項１～３のいずれかに記載の樹状細胞ワクチンの製造方法。 The method for producing a dendritic cell vaccine according to any one of claims 1 to 3, wherein the antigen is a cancer antigen and the dendritic cell vaccine is a cancer vaccine. 樹状細胞、下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物、及び抗原を含む、樹状細胞ワクチン。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。） A dendritic cell vaccine comprising a dendritic cell, a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in a side chain, and an antigen.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.) 下記一般式（１）で表される基を側鎖に有する高分子化合物を含有する、樹状細胞ワクチン製造補助剤。

（式中、Ｘ^１は、膜透過性ペプチドから末端アミノ基および末端カルボキシル基を除いた残基を示し、Ｘ^２は、水酸基、アミノ基、炭素数１～４のアルコキシル基又はベンジルオキシ基を示す。） A dendritic cell vaccine production aid containing a polymer compound having a group represented by the following general formula (1) in the side chain.

(In the formula, X ¹ indicates a residue obtained by removing the terminal amino group and the terminal carboxyl group from the membrane-permeable peptide, and X ² indicates a hydroxyl group, an amino group, an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms or a benzyloxy group. show.)

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