JP2022075480A - Method for culturing lactic acid bacteria and medium for lactic acid bacteria - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、乳酸菌の培養方法及び乳酸菌用培地に関する。 The present invention relates to a method for culturing lactic acid bacteria and a medium for lactic acid bacteria.
乳酸菌は代謝によりグルコースなどの糖類から乳酸を産生する微生物の総称であり、醤油、味噌、漬け物、乳製品などに含まれている。乳酸菌は、生菌体及び死菌体を問わずに、摂取されることによって摂取体に様々な生理的効果を与えることが知られている。例えば、乳酸菌の死菌体は、腸内を刺激し、免疫細胞を増殖させ、結果として肌の状態を改善し得ることが知られている。 Lactic acid bacteria are a general term for microorganisms that produce lactic acid from sugars such as glucose by metabolism, and are contained in soy sauce, miso, pickles, dairy products, and the like. Lactic acid bacteria are known to give various physiological effects to the ingested body by ingesting them, regardless of whether they are live or dead cells. For example, it is known that dead lactic acid bacteria can stimulate the intestine, proliferate immune cells, and improve the condition of the skin as a result.
このような乳酸菌の生理的効果を期待する場合、大量の乳酸菌を摂取することが望まれる。しかし、乳酸菌の大量培養は、乳酸菌が産生する乳酸などによって培養液中のｐＨが下がり、困難という問題がある。このような問題を解消して、乳酸菌を大量に培養するために、乳酸菌、培養方式、培養条件、培地などについて種々検討されている。 When expecting such a physiological effect of lactic acid bacteria, it is desirable to ingest a large amount of lactic acid bacteria. However, mass culture of lactic acid bacteria has a problem that it is difficult because the pH in the culture solution is lowered by lactic acid produced by lactic acid bacteria. In order to solve such a problem and cultivate a large amount of lactic acid bacteria, various studies have been conducted on lactic acid bacteria, a culture method, culture conditions, a medium and the like.
このうち、培地を改変して乳酸菌の大量培養を試みる方法として、特許文献１には、グルコースの代わりに、スクロース、ラクトース、マルトース又はガラクトースを炭素源として用いる乳酸菌の培養方法が記載されている。
Among these, as a method for attempting mass culture of lactic acid bacteria by modifying the medium,
しがしながら、特許文献１に記載の方法は、乳酸菌による乳酸の産生を抑制することが可能であるものの、乳酸菌の増殖促進効果は限定的であり、十分ではない。
However, although the method described in
また、乳酸菌の大量培養に使用し得る培地については、これまでにほとんど知られていない。 Moreover, little is known about the medium that can be used for mass culture of lactic acid bacteria.
そこで、本発明は、乳酸菌を大量培養するために使用可能な乳酸菌用培地を用いた乳酸菌の培養方法及び該乳酸菌用培地を提供することを、本発明が解決しようとする課題とする。 Therefore, it is an object of the present invention to provide a method for culturing lactic acid bacteria using a medium for lactic acid bacteria that can be used for mass culturing lactic acid bacteria and a medium for the lactic acid bacteria.
本発明者は、上記の課題を解決しようとして、グルコースに代えて、乳酸菌を大量に培養し得るような炭素源について鋭意検討した。その結果、グルコースの代替物として利用できる、有用な物質は見当たらなかった。しかし、驚くべきことに、種々検討した物質のうち、グルコン酸をグルコースの共炭素源とすることにより、グルコースを炭素源とする培地と比較して、乳酸菌を高濃度で培養し得ることを見出した。本発明者は、このような知見に基づいて、遂に、本発明の課題を解決し得るものとして、乳酸菌を、グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する乳酸菌用培地を用いて、培養する工程を含む、乳酸菌の培養方法を創作することに成功した。本発明は、これらの知見及び成功例に基づき完成された発明である。 In an attempt to solve the above problems, the present inventor has diligently studied a carbon source capable of culturing a large amount of lactic acid bacteria instead of glucose. As a result, no useful substance could be found that could be used as an alternative to glucose. However, surprisingly, among the various studied substances, it was found that by using gluconic acid as a co-carbon source of glucose, lactic acid bacteria can be cultured at a higher concentration than a medium using glucose as a carbon source. rice field. Based on such findings, the present inventor can finally solve the problem of the present invention by culturing lactic acid bacteria using a medium for lactic acid bacteria containing gluconic acid and glucose as carbon sources. Succeeded in creating a method for culturing lactic acid bacteria, including. The present invention is an invention completed based on these findings and successful examples.
したがって、本発明の一態様によれば、以下の方法及び培地が提供される。
［１］乳酸菌を、グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する乳酸菌用培地を用いて、培養する工程を含む、乳酸菌の培養方法。
［２］前記グルコン酸と前記グルコースとの割合が質量比で３：１～１：３である、［１］に記載の方法。
［３］前記乳酸菌がラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）乳酸菌、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）乳酸菌、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌及びペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）乳酸菌からなる群から選択される少なくとも１種の乳酸菌である、［１］～［２］のいずれか１項に記載の方法。
［４］グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する乳酸菌用培地。
［５］前記グルコン酸と前記グルコースとの割合が質量比で３：１～１：３である、［４］に記載の培地。
Therefore, according to one aspect of the invention, the following methods and media are provided.
[1] A method for culturing lactic acid bacteria, which comprises a step of culturing lactic acid bacteria using a medium for lactic acid bacteria containing gluconic acid and glucose as carbon sources.
[2] The method according to [1], wherein the ratio of the gluconic acid to the glucose is 3: 1 to 1: 3 in mass ratio.
[3] The lactic acid bacteria are Lactococcus lactic acid bacteria, Lactococcus lactic acid bacteria, Enterococcus lactic acid bacteria, Lactococcus lactic acid bacteria, and Pediococcus lactic acid bacteria. The method according to any one of [1] to [2], which is at least one selected lactic acid bacterium.
[4] A medium for lactic acid bacteria containing gluconic acid and glucose as carbon sources.
[5] The medium according to [4], wherein the ratio of the gluconic acid to the glucose is 3: 1 to 1: 3 in mass ratio.
本発明の一態様の方法及び培地によれば、乳酸菌高濃度で培養することができる。これにより、本発明の一態様の方法及び培地は、工業的規模での乳酸菌の大量生産、更には乳酸菌を高濃度で高含有する飲食品の生産に利用することが期待される。 According to the method and medium of one aspect of the present invention, lactic acid bacteria can be cultured at a high concentration. Therefore, it is expected that the method and medium of one aspect of the present invention will be used for mass production of lactic acid bacteria on an industrial scale, and further for production of foods and drinks containing a high concentration of lactic acid bacteria.
以下、本発明の一態様である方法及び培地の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。 Hereinafter, the details of the method and the medium which are one aspect of the present invention will be described, but the technical scope of the present invention is not limited to the matters of this item, and the present invention is as long as the object is achieved. It can take various aspects.
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている理論や推測は、本発明者らのこれまでの知見や経験によってなされたものであることから、本発明の技術的範囲はこのような理論や推測のみによって拘泥されるものではない。 Unless otherwise specified, each term herein is used in the sense commonly used by one of ordinary skill in the art and should not be construed as having an unreasonably limited meaning. Further, since the theories and speculations made in the present specification are based on the knowledge and experience of the present inventors, the technical scope of the present invention is limited only by such theories and speculations. It is not something that will be done.
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。本明細書では、別段の定めがない限り、含有量の単位は「質量％（ｗｔ％）」を意味する。
数値範囲の「～」は、本明細書において、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
"Content" is synonymous with concentration and means the ratio of the amount of component to the total amount of composition. However, the total content of the components does not exceed 100%. In the present specification, unless otherwise specified, the unit of content means "mass% (wt%)".
In the present specification, "-" in the numerical range is a range including the numerical values before and after the numerical range. For example, "0% by mass to 100% by mass" is 0% by mass or more and 100% by mass or less. It means a certain range.
［本発明の一態様の培地］
本発明の一態様の培地は、グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する乳酸菌用培地である。本発明の一態様の培地は、乳酸菌の培養のために用いられる。本発明の一態様の培地に含まれる炭素源は、乳酸菌が資化して菌体増殖に利用される有機化合物を意味し、酵母エキス及び肉エキスなどの生物由来エキスは含まれない。
[Medium of one aspect of the present invention]
The medium of one aspect of the present invention is a medium for lactic acid bacteria containing gluconic acid and glucose as carbon sources. The medium of one aspect of the present invention is used for culturing lactic acid bacteria. The carbon source contained in the medium of one aspect of the present invention means an organic compound assimilated by lactic acid bacteria and used for cell growth, and does not contain biological extracts such as yeast extract and meat extract.
炭素源濃度を質量比で同一とした場合、グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する培地が、グルコースのみを炭素源とする培地よりも、乳酸菌の増殖をより促進する理由については定かではない。しかしながら、一部の乳酸菌にはグルコン酸を取り込むチャンネル（ＡＢＣトランスポーターやＰＴＳ）などがあり、リン酸化され解糖系の下流にある６－ホスホグルコネートとして取り込まれることも知られている（マルガリータ・アンドレエフスカヤら著、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１６）１７：５３９）。また、キシロースとグルコースの併用系ではカタボライトリプレッションの濃度が変わり、効率よく乳酸生成が行われているという文献も存在する（キムジェハンら著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９），１５５，１３５１－１３５９、キョンホンチョンら著、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６），２６（７），１１８２－１１８９）。そして、後述する実施例に記載があるとおり、グルコースとグルコン酸ナトリウムとを炭素源として含有する培地を用いて培養した場合は、グルコースのみを炭素源として含む培地で培養した場合よりも、乳酸菌がより増殖し、更に培養液中のｐＨ低下が抑制されるという結果を得た。この結果に基づけば、グルコン酸とグルコースとを炭素源として含有する培地は、グルコースのみを炭素源として含む培地よりも、乳酸菌による乳酸その他の有機酸の生産を抑えて、菌体増殖をより促進し得ると推測できる。 When the carbon source concentrations are the same in terms of mass ratio, it is not clear why a medium containing gluconic acid and glucose as a carbon source promotes the growth of lactic acid bacteria more than a medium containing only glucose as a carbon source. .. However, some lactic acid bacteria have channels (ABC transporters and PTSs) that take up gluconic acid, and it is also known that they are phosphorylated and taken up as 6-phosphogluconate downstream of glycolysis (Margarita). -Andreevskaya et al., BMC Genomics (2016) 17: 539). In addition, there is a document that the concentration of catabolite suppression changes in the combined system of xylose and glucose, and lactic acid production is efficiently performed (Kimjehan et al., Microbiology (2009), 155,1351-1359, Kyunghongcheon). Et al., J. Microbiol. Biotechnol. (2016), 26 (7), 1182-1189). Then, as described in Examples described later, when culturing using a medium containing glucose and sodium gluconate as a carbon source, lactic acid bacteria are produced more than when culturing in a medium containing only glucose as a carbon source. It was obtained that the cells proliferated more and the decrease in pH in the culture medium was suppressed. Based on this result, a medium containing gluconic acid and glucose as a carbon source suppresses the production of lactic acid and other organic acids by lactic acid bacteria and promotes cell growth more than a medium containing only glucose as a carbon source. I can guess that it is possible.
本発明の一態様の培地は、グルコースのみを炭素源として、その他の成分が同じである培地に比べて、乳酸菌の増殖を促進する作用（乳酸菌増殖促進作用）及び／又は培養液中のｐＨの下降を抑制する作用（ｐＨ下降抑制作用）を有する。 The medium of one aspect of the present invention has an action of promoting the growth of lactic acid bacteria (lactic acid bacterium growth promoting action) and / or a pH in the culture medium as compared with a medium containing only glucose as a carbon source and having the same other components. It has an action of suppressing a decrease (effect of suppressing a decrease in pH).
グルコースは、通常知られているとおりの、Ｃ６Ｈ１２Ｏ６の分子式で示される単糖であり、好ましくはＤ－グルコースである。 Glucose is a monosaccharide represented by the molecular formula of C 6 H 12 O 6 as is generally known, and is preferably D-glucose.
グルコン酸は、通常知られているとおりの、グルコースの１位の炭素が酸化してカルボキシル基となった構造を示すカルボン酸であり、好ましくはＤ－グルコン酸である。 Gluconic acid is a carboxylic acid having a structure in which the carbon at the 1-position of glucose is oxidized to form a carboxyl group, as is generally known, and is preferably D-gluconic acid.
グルコン酸として、グルコン酸塩及びグルコン酸の環化化合物であるグルコノラクトンを用いてもよい。グルコン酸塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などが挙げられる。グルコン酸、グルコン酸塩及びグルコノラクトンは、本発明の一態様の培地を溶解してｐＨを中性付近に調整した液体培地中では、いずれも共通してグルコン酸イオンの形態をなし得る。グルコン酸は、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。 As the gluconic acid, gluconate and gluconolactone, which is a cyclization compound of gluconic acid, may be used. Examples of the gluconate include sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt. Gluconic acid, gluconate and gluconolactone can all form the form of gluconate ion in common in a liquid medium in which the medium of one aspect of the present invention is dissolved and the pH is adjusted to near neutral. Gluconic acid can be used alone or in combination of two or more of these.
グルコース及びグルコン酸は、市販されているものでもよく、公知の方法に従って製造したものでもよい。 Glucose and gluconic acid may be commercially available or may be produced according to a known method.
炭素源であるグルコースとグルコン酸との割合は、培地が乳酸菌増殖促進作用及び／又はｐＨ下降抑制作用を示し得る限り特に限定されないが、これらの乾燥質量比（グルコース：グルコン酸）が３：１～１：３であることが好ましく、２：１～１：３であることがより好ましい。グルコン酸を添加した場合に、グルコースによるｐＨ下降が抑制されることを鑑みれば、上記乾燥質量比は、１：１～１：３であることが更に好ましい。 The ratio of glucose as a carbon source to gluconic acid is not particularly limited as long as the medium can exhibit a lactic acid bacterium growth promoting action and / or a pH lowering suppressing action, but the dry mass ratio (glucose: gluconic acid) thereof is 3: 1. It is preferably ~ 1: 3, and more preferably 2: 1 to 1: 3. Considering that the pH decrease due to glucose is suppressed when gluconic acid is added, the dry mass ratio is more preferably 1: 1 to 1: 3.
培地中のグルコース及びグルコン酸の合計の含有量は、所望の菌体量の乳酸菌が得られる限り特に限定されないが、例えば、使用した基礎培地で用いられている量又はそれよりも多い量であることが好ましく、液体状の培地中で２質量％以上がより好ましく、４質量％以上が更に好ましく、６質量％以上がなお更に好ましい。培地中のグルコース及びグルコン酸の合計の含有量の上限は特に限定されないが、グルコースの含有量が多いと菌体増殖が妨げられ得ることから、典型的には５０質量％程度である。 The total content of glucose and gluconic acid in the medium is not particularly limited as long as a desired cell amount of lactic acid bacteria can be obtained, but is, for example, an amount used in the basal medium used or a larger amount. It is preferable, 2% by mass or more is more preferable, 4% by mass or more is further preferable, and 6% by mass or more is further preferable in a liquid medium. The upper limit of the total content of glucose and gluconic acid in the medium is not particularly limited, but it is typically about 50% by mass because a large amount of glucose may hinder the growth of cells.
グルコース及びグルコン酸の含有量は、グルコース及びグルコン酸の質量比及びこれらの合計量が上記した関係にある限り、適宜設定することができる。例えば、液体状の培地中でグルコースの含有量は０．５質量％～２０質量％が好ましく、１．０質量％～１０質量％がより好ましく、１．５質量％～５質量％が更に好ましく；グルコン酸の含有量は０．５質量％～２０質量％が好ましく、１．０質量％～１０質量％がより好ましく、１．５質量％～５質量％が更に好ましい。 The content of glucose and gluconic acid can be appropriately set as long as the mass ratio of glucose and gluconic acid and the total amount thereof have the above-mentioned relationship. For example, the content of glucose in the liquid medium is preferably 0.5% by mass to 20% by mass, more preferably 1.0% by mass to 10% by mass, still more preferably 1.5% by mass to 5% by mass. The content of gluconic acid is preferably 0.5% by mass to 20% by mass, more preferably 1.0% by mass to 10% by mass, still more preferably 1.5% by mass to 5% by mass.
本発明の一態様の培地は、グルコースとグルコン酸とを炭素源として含有する限り、乳酸菌の種類などに応じて任意のその他の成分を含有する。その他の成分は特に限定されず、例えば、基礎培地に含まれる成分などが挙げられ、具体的にはペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、酢酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄及びオレイン酸エステルなどの脂肪酸などの公知の乳酸菌用培地に含まれる成分などが挙げられる。ただし、その他の成分として、本発明の課題を妨げない限り、グルコース及びグルコン酸以外の炭素源となり得るものを使用してもよいが、炭素源はグルコース及びグルコン酸のみからなることが好ましい。基礎培地は、公知の乳酸菌用培地であり、例えば、ＧＹＰ培地、食品グレード培地、ＭＲＳ培地、ＢＣＰ培地、Ｍ１７培地、ＴＹＧ培地などが挙げられる。 The medium of one aspect of the present invention contains any other component depending on the type of lactic acid bacteria and the like as long as it contains glucose and gluconic acid as carbon sources. Other components are not particularly limited, and examples thereof include components contained in the basal medium, and specific examples thereof include peptone, yeast extract, casein, meat extract, sodium acetate, sodium glutamate, sodium chloride, magnesium sulfate, and manganese sulfate. , Ingredients contained in known media for lactic acid bacteria such as fatty acids such as iron sulfate and oleic acid ester. However, as other components, those which can be carbon sources other than glucose and gluconic acid may be used as long as the problems of the present invention are not impaired, but the carbon source is preferably composed only of glucose and gluconic acid. The basal medium is a known medium for lactic acid bacteria, and examples thereof include GYP medium, food grade medium, MRS medium, BCP medium, M17 medium, and TYG medium.
本発明の一態様の培地の調製方法は特に限定されず、例えば、グルコースとグルコン酸と任意のその他の成分とを、常温下又は加温下で、撹拌するなどして混合する方法などが挙げられる。調製後の乳酸菌培地は、オートクレーブ処理、ろ過滅菌処理などの公知の滅菌処理に供して滅菌することが好ましい。 The method for preparing the medium according to one aspect of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method of mixing glucose, gluconic acid, and any other component by stirring at room temperature or heating. Be done. It is preferable that the prepared lactic acid bacterium medium is sterilized by subjecting it to a known sterilization treatment such as an autoclave treatment or a filtration sterilization treatment.
本発明の一態様の培地が有する乳酸菌増殖促進作用は、同一の乳酸菌を用いて、同一の条件により、４８時間培養して、炭素源含有量が乾燥質量比で同一のグルコースのみを炭素源として含有する培地と比較して、乳酸菌の濃度が高くなる作用をいう。また、本発明の一態様の培地が有するｐＨ下降抑制作用は、同一の乳酸菌を用いて、同一の条件により、４８時間培養して、炭素源含有量が乾燥質量比で同一であるグルコースのみを炭素源とする培地と比較して、培養液中のｐＨの値が高くなる作用をいう。 The lactic acid bacterium growth promoting action possessed by the medium of one aspect of the present invention is that the same lactic acid bacterium is cultured under the same conditions for 48 hours, and only glucose having the same carbon source content in dry mass ratio is used as the carbon source. It refers to the action of increasing the concentration of lactic acid bacteria compared to the contained medium. Further, the pH lowering inhibitory effect of the medium of one aspect of the present invention is that only glucose having the same carbon source content in dry mass ratio is cultured for 48 hours under the same conditions using the same lactic acid bacteria. It refers to the action of increasing the pH value in the culture solution as compared with the medium used as a carbon source.
本発明の一態様の培地は、その形態について特に限定されず、例えば、固体状、粉末状、顆粒状、液体状などの形態をとり得るが、溶解性及び保存性が優れていることから、粉末状であることが好ましい。本発明の一態様の培地は、粉末状である場合、乳酸菌の培養に際して水などに溶解して用いられる。 The medium of one aspect of the present invention is not particularly limited in its form, and may take, for example, a solid form, a powder form, a granular form, a liquid form, etc., but is excellent in solubility and storage stability. It is preferably in the form of powder. When the medium of one aspect of the present invention is in the form of powder, it is used by dissolving it in water or the like when culturing lactic acid bacteria.
［本発明の一態様の方法］
本発明の一態様の方法は、乳酸菌を、本発明の一態様の培地を用いて、培養する工程を少なくとも含む。
[Method of one aspect of the present invention]
The method of one aspect of the present invention comprises at least the step of culturing lactic acid bacteria using the medium of one aspect of the present invention.
乳酸菌は、乳酸発酵し得る微生物であれば特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の乳酸菌などが挙げられる。より具体的にはＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｖｅｃｋｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｉｖａｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｏｅｎｏｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓなどが挙げられる。乳酸菌は、上記したものの１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 The lactic acid bacterium is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of lactic acid fermentation, and is, for example, Lactobacillus , Leuconostoc , Enterococcus , Lactococcus and Pediococcus. ( Pediococcus ) lactic acid bacteria and the like can be mentioned.より具体的にはＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ 、 Ｌａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｕｒｖｅｃｋｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｉｖａｔｉｃｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ 、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ 、 Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｉｕｍ 、 Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ 、 Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｏｅｎｏｓ 、 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ 、 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ 、 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ 、 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ 、 Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ 、 Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓなどが挙げられる。 As the lactic acid bacterium, one of the above-mentioned ones may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
乳酸菌の培養は、本発明の一態様の培地を用いて、乳酸菌にとって適した培養条件にて実施する。例えば、本発明の一態様の培地又は公知の乳酸菌用培地を用いて前培養した乳酸菌を、本発明の一態様の培地に加えて、乳酸菌にとって適したｐＨ、温度、通気、時間などの条件にて、静置培養、回分培養、流加培養、連続培養などの公知の培養方式により培養する。 Culturing of lactic acid bacteria is carried out using the medium of one aspect of the present invention under culture conditions suitable for lactic acid bacteria. For example, a lactic acid bacterium pre-cultured using the medium of one aspect of the present invention or a known medium for lactic acid bacteria is added to the medium of one aspect of the present invention under conditions such as pH, temperature, aeration, and time suitable for the lactic acid bacterium. Then, the cells are cultured by a known culture method such as static culture, batch culture, culture medium culture, and continuous culture.
乳酸菌の培養の具体例としては、乳酸菌を本発明の一態様の培地 １０ｍＬ～１００ｍＬに植菌して３０℃～３７℃で一晩培養して前培養し、次いで前培養して得られた乳酸菌を本発明の一態様の培地に添加したものを、３０℃～３７℃にて、２４時間～５日間、静置培養又は撹拌培養することなどを挙げることができる。 As a specific example of culturing lactic acid bacteria, lactic acid bacteria are inoculated into 10 mL to 100 mL of the medium of one aspect of the present invention, cultured overnight at 30 ° C. to 37 ° C., precultured, and then precultured. Is added to the medium of one aspect of the present invention and is statically cultured or stirred and cultured at 30 ° C. to 37 ° C. for 24 hours to 5 days.
培養後の培養液は、そのまま乳酸菌含有物としても用いてもよいし、培養液から乳酸菌を回収してもよい。乳酸菌の回収は、公知の方法を採用すればよく、特に限定されないが、例えば、沈降濃縮、遠心分離、ろ過などの公知の菌体分離手段などを挙げることができる。回収した乳酸菌は、凍結乾燥、風乾などの公知の乾燥手段で乾燥してもよく、乾燥粉末の状態にまで乾燥することが好ましい。また、乳酸菌は生菌体であっても、死菌体であってもよい。乳酸菌の死菌体は、培養液又は回収した乳酸菌を加熱することなどにより、得られ得る。 The culture broth after culturing may be used as it is as a lactic acid bacterium-containing substance, or lactic acid bacteria may be recovered from the culture broth. The recovery of lactic acid bacteria may be performed by a known method and is not particularly limited, and examples thereof include known cell separation means such as sedimentation concentration, centrifugation, and filtration. The recovered lactic acid bacteria may be dried by known drying means such as freeze-drying and air-drying, and it is preferable to dry them into a dry powder state. Further, the lactic acid bacterium may be a live bacterium or a dead bacterium. Killed lactic acid bacteria can be obtained by heating the culture solution or the recovered lactic acid bacteria.
乳酸菌の増殖を確認する方法は特に限定されず、公知の微生物増殖の確認方法を採用すればよいが、例えば、培養液中の菌体数、培養液の濁度、ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）、酸度及びこれらの組み合わせを指標とする方法などが挙げられる。乳酸菌の増殖は、培養液中にて連続的に確認してもよいし、培養液の一部をサンプリングすることにより断続的に確認してもよい。サンプリングの回数は特に限定されず、１回でもよく、複数回でもよい。 The method for confirming the growth of lactic acid bacteria is not particularly limited, and a known method for confirming the growth of microorganisms may be adopted. For example, the number of cells in the culture solution, the turbidity of the culture solution, the pH, and the dissolved oxygen concentration (DO). ), Acidity and a method using a combination thereof as an index. The growth of lactic acid bacteria may be confirmed continuously in the culture broth, or may be confirmed intermittently by sampling a part of the culture broth. The number of samplings is not particularly limited, and may be one time or a plurality of times.
乳酸菌の増殖の確認方法の具体例として、培養開始前よりも、培養液中の菌体数、濁度又は酸度が高い場合、又は培養液中のｐＨ又はＤＯが低い場合は、乳酸菌は増殖しているといえる。培養液中の菌体数は、ＭＲＳ寒天培地、ＢＣＰ寒天培地などの乳酸菌用寒天培地を用いて、段階希釈液を混釈して培養することなどにより測定できる。 As a specific example of the method for confirming the growth of lactic acid bacteria, when the number of cells, turbidity or acidity in the culture solution is higher than before the start of culture, or when the pH or DO in the culture solution is lower, the lactic acid bacteria grow. It can be said that it is. The number of cells in the culture medium can be measured by using an agar medium for lactic acid bacteria such as MRS agar medium and BCP agar medium, and culturing the serially diluted solution in a mixed manner.
本発明の一態様の培養方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。 In the culture method of one aspect of the present invention, various steps and operations can be added to the pre-stage or the post-stage or the process of the above-mentioned steps as long as the problems of the present invention can be solved.
本発明の一態様の方法は、効率的に乳酸菌を増殖させることができる方法である。培養して増殖した乳酸菌の利用方法は特に限定されないが、例えば、乳酸菌を含有する素材、食品、食品素材、食品などの添加物として利用方法などが挙げられる。 The method of one aspect of the present invention is a method capable of efficiently growing lactic acid bacteria. The method of using the lactic acid bacterium that has been cultured and propagated is not particularly limited, and examples thereof include a method of using the lactic acid bacterium-containing material, food, food material, and an additive for food.
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples, and the present invention can take various aspects as long as the problems of the present invention can be solved. ..
［１．培地の調製及び培養方法］ [1. Medium preparation and culture method]
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（ＮＢＲＣ １０７１４７Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＮＢＲＣ １５８９１Ｔ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（ＮＢＲＣ １５８９３Ｔ）及びＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｉｕｍ（ＮＢＲＣ １１３２４３Ｔ）を用いた。 Lactobacillus brevis (NBRC 107147 T ), Lactobacillus plantarum (NBRC 15891 T ), Lactobacillus sakei (NBRC 15893 T ) and Leuconostoc s.
培地にはＧＹＰ培地（標準的なグルコース含有量 １質量％）及び食品グレード培地（標準的なグルコース含有量 ４質量％）を改変した培地を用いた。すなわち、表１及び表２の組成になるように、培地１～３２を調製した。表中の成分の含有量は「質量％」を示す。なお、表１及び表２に記載の培地について、ＧＹＰ培地を改変した培地は炭素源の含有量が標準炭素源含有量の２倍量及び４倍量になるようにし、食品グレード培地を改変した培地は炭素源の含有量が標準炭素源含有量の１／２倍量及び２倍量になるようにした。グルコース及びグルコン酸ナトリウムは、５％、１０％、２０％及び３０％水溶液を用いて添加した。スターターは、乳酸菌をＭＲＳ培地を用いて一晩培養した前培養液を用いた。
As the medium, a modified medium of GYP medium (
スターター以外の各成分を表２及び表３に記載の割合で混合し、培地を調製した。調製した培地をオートクレーブ滅菌処理に供した。滅菌後に冷却した培地に、スターターを無菌的に接種した。 Each component other than the starter was mixed at the ratios shown in Tables 2 and 3 to prepare a medium. The prepared medium was subjected to autoclave sterilization. The starter was aseptically inoculated into the medium cooled after sterilization.
スターターを接種した培地を、３０℃にて、４８時間、静置培養した。４８時間後、培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）及びｐＨを測定した。 The medium inoculated with the starter was statically cultured at 30 ° C. for 48 hours. After 48 hours, the turbidity (OD 660 nm ) and pH of the culture solution were measured.
［２．培養結果］
乳酸菌としてＬ．ｂｒｅｖｉｓ及びＬ．ｃｉｔｒｉｕｍを用いて、ＧＹＰ培地を改変した培地１～１６により培養して、得られた培養液のＯＤ６６０ｎｍ及びｐＨを測定した結果を、それぞれ図１及び図２に示す。図中の横軸は培地中のグルコースとグルコン酸ナトリウムとの割合（グルコース：グルコン酸ナトリウム）を示しており、Ｎはグルコース及びグルコン酸ナトリウムを含まない培地である。図中の丸（●）マーカーは培地中の炭素源合計量が１％の培地、三角（▲）マーカーは培地中の炭素源合計量が２％の培地及びを四角（■）マーカーは培地中の炭素源合計量が４％の培地を示めす。これらの図が示すとおり、グルコースのみを炭素源として含有する培地を用いて培養するよりも、グルコース及びグルコン酸ナトリウムを乾燥質量比３：１～１：３で含有する培地を用いて培養することにより、乳酸菌の増殖が促進し、ｐＨの下降が抑制される傾向を示すという結果が得られた。
[2. Culture results]
As a lactic acid bacterium, L. brevis and L. The results of measuring the OD 660 nm and pH of the obtained culture medium by culturing the GYP medium with the modified
ＧＹＰ培地を改変した培地１～１６に代えて、食品グレード培地を改変した培地１７～３２を用いて、上記と同様に培養した結果をそれぞれ図３及び図４に示す。図中の横軸は図１及び２と同様であり、図中の丸（●）マーカーは培地中の炭素源合計量が２％の培地、三角（▲）マーカーは培地中の炭素源合計量が４％の培地及びを四角（■）マーカーは培地中の炭素源合計量が６％の培地を示めす。これらの図から、培地組成を代えた場合であっても、グルコース及びグルコン酸ナトリウムを乾燥質量比３：１～１：３で含有する培地を用いて培養することにより、乳酸菌の増殖が促進し、ｐＨの下降が抑制される傾向を示すという結果が得られた。
The results of culturing in the same manner as above using media 17 to 32 modified from food grade medium instead of
乳酸菌としてＬ．ｂｒｅｖｉｓと同属異種であるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＬ．ｓａｋｅｉを用いて、ＧＹＰ培地を改変した培地１～１６により培養した結果を、それぞれ図５及び図６に示す。図中の横軸及び図中のマーカーは図１及び２と同様である。これらの図から、微生物種に依らずに、グルコース及びグルコン酸ナトリウムを乾燥質量比３：１～１：３で含有する培地を用いて培養することにより、乳酸菌の増殖が促進し、ｐＨの下降が抑制される傾向を示すという結果が得られた。
As a lactic acid bacterium, L. L. is a different species of the same genus as brevis. Plantarum and L. The results of culturing the GYP medium in the modified
以上の結果より、グルコース及びグルコン酸ナトリウムを乾燥質量比３：１～１：３で含有する培地を用いて培養することにより、乳酸菌の増殖を促進し、ｐＨの下降を抑制することができることがわかった。 From the above results, it is possible to promote the growth of lactic acid bacteria and suppress the decrease in pH by culturing using a medium containing glucose and sodium gluconate at a dry mass ratio of 3: 1 to 1: 3. have understood.
本発明の一態様の乳酸菌の培養方法は、効率的に乳酸菌を増殖させることができる方法であることから、食品産業において乳酸菌を含有する素材、食品、食品素材、食品組成物などの添加物として好適に利用することができる。 Since the method for culturing lactic acid bacteria according to one aspect of the present invention is a method capable of efficiently growing lactic acid bacteria, it can be used as an additive for materials containing lactic acid bacteria, foods, food materials, food compositions, etc. in the food industry. It can be suitably used.
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