JP2022060035A - Intestinal anti-aging composition - Google Patents

Abstract

To provide a composition that activates an immune function in the intestinal tract and contributes to anti-aging by acting on T cells in the intestinal tract.SOLUTION: Provided are a composition for promoting an increase in number of T cells in the intestinal tract or a composition for activating T cells in the intestinal tract. The composition comprises at least one active ingredient selected from the group consisting of cells, cell components, and cultures of Lactococcus lactis subsp. cremoris and processed materials thereof.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、腸管機能の老化を抑制及び回復する成分を含む腸管の抗老化用組成物に関する。 The present invention relates to an intestinal anti-aging composition comprising a component that suppresses and restores aging of intestinal function.

呼吸や飲食物の摂取を通じて、ウイルス、細菌、カビ、原虫、寄生虫などの病原体、花粉、ハウスダストなど物質が体内に侵入する危険がある。体内に侵入した異物を排除するシステムとして、腸管免疫がある。 There is a risk that pathogens such as viruses, bacteria, molds, protozoans and parasites, pollen and house dust will invade the body through breathing and ingestion of food and drink. Intestinal immunity is a system that eliminates foreign substances that have entered the body.

腸管免疫が正常に機能することにより、腸内に取り込まれた異物を排除又は分解し、無毒化する。一方、加齢に伴って腸管内のＴ細胞が減少することなどにより、腸管免疫の機能低下が生じることが報告されている。例えば、高齢マウスの腸管粘膜においては、ＣＤ４^＋ＬＡＰ^＋Ｔ細胞の分化能の低下、ＴＣＲαβ^＋ＣＤ８αα^＋細胞の減少などが生じることが報告されている（非特許文献１）。これらの結果として腸管免疫の機能が低下する。 The normal functioning of intestinal immunity eliminates or decomposes foreign substances taken into the intestine and detoxifies them. On the other hand, it has been reported that the function of intestinal immunity deteriorates due to a decrease in T cells in the intestinal tract with aging. For example, in the intestinal mucosa of aged mice, it has been reported that CD4 ⁺ LAP ⁺ T cell differentiation ability is reduced, TCRαβ ⁺ CD8αα ⁺ cell is reduced, and the like (Non-Patent Document 1). As a result of these, the function of intestinal immunity is reduced.

乳酸菌の一部には、樹状細胞又は脾臓細胞に作用して、サイトカイン産生を促進するものがある。例えば、特許文献１には、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスＣ６０株が、骨髄由来の樹状細胞及び脾臓細胞からインターロイキンＩＬ－１０の産生を促進することが記載されている。 Some lactic acid bacteria act on dendritic cells or spleen cells to promote cytokine production. For example, Patent Document 1 describes that Lactococcus lactis subspecies Cremoris C60 strain promotes the production of interleukin IL-10 from bone marrow-derived dendritic cells and spleen cells.

特開２００３－０８８３６２号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-088362

A.F. Santiogo et al., Immunobiology, 216, 2011, pp.1085-1093A.F. Santiogo et al., Immunobiology, 216, 2011, pp.1085-1093 Yuiko Ishimoto et al., Immunology, 2004, 113, pp.371-377Yuiko Ishimoto et al., Immunology, 2004, 113, pp.371-377

しかし、特許文献１には、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスＣ６０株が腸管内Ｔ細胞に影響を及ぼすことについての記載は無い。また、これまでに、腸管内Ｔ細胞に作用を及ぼす乳酸菌はほとんど知られていない。 However, Patent Document 1 does not describe that Lactococcus lactis subspecies Cremoris C60 strain affects T cells in the intestinal tract. To date, little is known about lactic acid bacteria that act on T cells in the intestinal tract.

そこで、本発明は、腸管内Ｔ細胞へ作用することを通じて、腸管内の免疫機能を賦活し、アンチエイジングの一助となる組成物を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a composition that activates an immune function in the intestinal tract and contributes to anti-aging by acting on T cells in the intestinal tract.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、種々の物質及び微生物について、腸管内Ｔ細胞への影響を試行錯誤した結果、驚くべきことに、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスＣ６０株は、腸管組織内の特定の組織において、特定のＴ細胞に作用して、細胞増殖を促進し、活性化することを見出した。そして、このような知見を基に、本発明者らは遂に、本発明の課題を解決し得るものとして、腸管内Ｔ細胞の増加促進用組成物、腸管内Ｔ細胞の活性化用組成物。腸管内免疫賦活用組成物、抗老化用組成物などを創作することに成功した。本発明は、本発明者らによって初めて見出された知見及び成功例に基づいて完成されたものである。 As a result of diligent studies to solve the above problems and trial and error of the effects of various substances and microorganisms on T cells in the intestinal tract, the present inventors surprisingly found the Lactococcus lactis subspecies Cremoris C60 strain. Found that they act on specific T cells to promote and activate cell proliferation in specific tissues within the intestinal tissue. Based on such findings, the present inventors have finally determined that the problem of the present invention can be solved by a composition for promoting the increase of intestinal T cells and a composition for activating intestinal T cells. We have succeeded in creating an intestinal immunostimulatory composition, an anti-aging composition, and the like. The present invention has been completed based on the findings and successful examples first discovered by the present inventors.

従って、本発明によれば、以下の各態様の組成物及び方法が提供される。
［１］ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管内Ｔ細胞の増加促進用組成物又は腸管内Ｔ細胞の活性化用組成物。
［２］前記腸管内Ｔ細胞は、粘膜固有層におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞である、［１］に記載の組成物。
［３］前記腸管内Ｔ細胞は、パイエル板におけるＣＤ４^＋細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞である、［１］に記載の組成物。
［４］ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管内免疫賦活用組成物。
［５］ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管の抗老化用組成物。
［６］前記ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスは、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスＣ６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ－０８５５９）である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の組成物。
［７］ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分又は該有効成分を含む組成物を、生物個体に適用することを含む、生物個体の腸管内Ｔ細胞の増加を促進する方法、腸管内Ｔ細胞を活性化する方法、腸管内免疫を賦活する方法又は抗老化方法。 Therefore, according to the present invention, the compositions and methods of each of the following aspects are provided.
[1] Lactococcus lactis subspecies cremoris ( Lactococcus lactis subsp. Cremoris ) cells, bacterial cell components and cultures, and intestinal T cells containing at least one active ingredient selected from the group consisting of processed products thereof. A composition for promoting the increase of Lactococcus or a composition for activating T cells in the intestinal tract.
[2] The intestinal T cells are at least one T cell selected from the group consisting of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells in the lamina propria. 1] The composition according to.
[3] The composition according to [1], wherein the intestinal T cells are at least one T cell selected from the group consisting of CD4 ⁺ cells and IFN-γ-producing cells in Peyer's patches.
[4] Intestinal immunostimulation containing at least one active ingredient selected from the group consisting of cells, bacterial cell components and cultures of Lactococcus lactis subspecies cremoris and processed products thereof . Composition for.
[5] Anti-aging of the intestinal tract, which comprises cells, bacterial cell components and cultures of Lactococcus lactis subspecies cremoris and at least one active ingredient selected from the group consisting of processed products thereof. Composition for.
[6] The composition according to any one of [1] to [5], wherein the Lactococcus lactis subspecies cremoris is a Lactococcus lactis subspecies cremoris C60 strain (FERM BP-08559).
[7] Lactococcus lactis subspecies cremoris (Lactococcus lactis subsp. Cremoris) cells, bacterial cell components and cultures, and at least one active ingredient selected from the group consisting of processed products thereof, or a composition containing the active ingredients. A method for promoting the increase of intestinal T cells in an individual organism, a method for activating intestinal T cells, a method for activating intestinal immunity, or a method for anti-aging, which comprises applying a substance to an individual organism.

本発明によれば、腸管内Ｔ細胞の増加促進用及び腸管内Ｔ細胞の活性化作用を通じて、腸管内の免疫を賦活化し、及び／又は腸管の抗老化を誘導することが期待される。 According to the present invention, it is expected to activate immunity in the intestinal tract and / or induce anti-aging of the intestinal tract through the action of promoting the increase of T cells in the intestinal tract and activating the T cells in the intestinal tract.

図１はＷＴマウスとＩＬ－１８ＫＯマウスの実験スキーム図である。マウスには標準飼料を２週間摂取させた後、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料又は対照飼料に変更し、さらに２週間摂取させ、その後、マウスを分析に用いた。FIG. 1 is an experimental scheme diagram of WT mouse and IL-18KO mouse. Mice were fed a standard diet for 2 weeks, then changed to an HK-C60-containing feed or a control feed, fed for an additional 2 weeks, and then the mice were used for analysis. 図２は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから採取したＬＰ中のＴ細胞集団をフローサイトメトリーで測定した結果を示す図である。上段図はＣＤ４５^＋でゲーティングして、ＣＤ３^＋Ｔ細胞を対象としてフローサイトメトリーで解析した結果であり、下段図は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合と細胞数の結果である。データは、３つの独立した実験において、各群あたり６～８サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭ（標本平均の標準誤差）として示した。FIG. 2 is a diagram showing the results of flow cytometry measurement of T cell populations in LPs collected from mice of test groups 1 to 4, as described in Examples described later. The upper figure is the result of gating with CD45 ⁺ and analyzing CD3 ⁺ T cells by flow cytometry, and the lower figure is the result of the ratio of CD3 ⁺ T cells and the number of cells. Data are shown as representative or mean ± SEM (standard error of sample mean) for 6-8 samples per group in 3 independent experiments. 図３は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから採取したＬＰ中のＴ細胞集団をフローサイトメトリーで測定した結果を示す図である。上段図は、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋でゲーティングしてＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を対象として解析した結果であり、下段図は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合と細胞数の結果である。データは、３つの独立した実験において、各群あたり６～８サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 3 is a diagram showing the results of flow cytometry measurement of T cell populations in LPs collected from mice of test groups 1 to 4, as described in Examples described later. The upper figure shows the results of gating with CD45 ⁺ CD3 ⁺ and analyzing both CD4 ⁺ T cells and CD8 ⁺ T cells, and the lower figure shows the ratio and cells of CD4 ⁺ T cells and CD8 ⁺ T cells. It is the result of numbers. Data are shown as representative or mean ± SEM of 6-8 samples per group in 3 independent experiments. 図４は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから採取したＬＰ細胞中のエフェクターＣＤ４^＋Ｔ細胞集団をフローサイトメトリーで分析した結果である。上段図はＬＰ中のＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋でゲーティングしてＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＩＦＮ－γ産生性細胞）集団を対象とした代表的な画像であり、下段図は、総ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生性細胞の割合（左図）と細胞数（右図）の結果である。データは、３つの独立した実験において、６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 4 shows the results of flow cytometric analysis of the effector CD4 ⁺ T cell population in LP cells collected from mice of test groups 1 to 4, as described in Examples described later. The upper figure is a representative image of a population of IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ T cells (IFN-γ-producing cells) gating with CD45 ⁺ CD3 ⁺ in LP, and the lower figure is a total CD4 ⁺ . It is the result of the ratio of IFN-γ-producing cells in T cells (left figure) and the number of cells (right figure). Data are shown as representative or mean ± SEM of 6 samples in 3 independent experiments. 図５は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから採取したＰＰ細胞中のエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞集団をフローサイトメトリーで分析した結果である。上段図はＰＰ中のＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋でゲーティングしてＩＦＮ－γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＦＮ－γ産生性細胞）集団を対象とした代表的な画像であり、下段図は、総ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ産生性細胞の割合（左図）と細胞数（右図）の結果である。データは、３つの独立した実験において、６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 5 shows the results of flow cytometric analysis of the effector CD4 + T cell population in PP cells collected from mice of test groups 1 to 4, as described in Examples described later. The upper figure is a representative image of a population of IFN-γ + CD4 + T cells (IFN-γ-producing cells) gating with CD45 ⁺ CD3 ⁺ in PP, and the lower figure is an IFN in total CD4 ⁺ T cells. -Results of the proportion of γ-producing cells (left figure) and the number of cells (right figure). Data are shown as representative or mean ± SEM of 6 samples in 3 independent experiments. 図６は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＰＰ細胞のＴ細胞におけるＴＣＲ刺激のＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＩＦＮ－γ産生性細胞）集団についての結果である。ＰＰ細胞は試験群１～４のマウスから採取した。採取した細胞は抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で３７℃で４８時間インキュベーションして刺激した。インキュベーションの最後の５時間は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激した。左図はフローサイトメトリーの代表的な画像であり、右図は、ＩＦＮ－γ産生性細胞集団の割合の結果である。データは、３つの独立した実験において、６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 6 is a result of TCR-stimulated IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ T cell (IFN-γ-producing cell) population in T cells of PP cells as described in Examples described later. PP cells were collected from mice in test groups 1-4. The collected cells were stimulated by incubation with anti-CD3 monoclonal antibody and anti-CD28 monoclonal antibody at 37 ° C. for 48 hours. The last 5 hours of incubation were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . The figure on the left is a representative image of flow cytometry, and the figure on the right is the result of the proportion of IFN-γ-producing cell population. Data are shown as representative or mean ± SEM of 6 samples in 3 independent experiments. 図７は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＰＰ細胞のＴ細胞におけるＴＣＲ刺激のＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖についての結果である。ＰＰ細胞は試験群１～４のマウスから採取した。採取した細胞は抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で３７℃で４８時間インキュベーションして刺激した。インキュベーションの最後の５時間は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激した。左図は細胞増殖の代表的な画像であり、右図は、分化した細胞の割合の結果である。データは、３つの独立した実験において、６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 7 shows the results of TCR-stimulated CD4 ⁺ T cell proliferation in T cells of PP cells, as described in Examples below. PP cells were collected from mice in test groups 1-4. The collected cells were stimulated by incubation with anti-CD3 monoclonal antibody and anti-CD28 monoclonal antibody at 37 ° C. for 48 hours. The last 5 hours of incubation were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . The figure on the left is a representative image of cell proliferation, and the figure on the right is the result of the proportion of differentiated cells. Data are shown as representative or mean ± SEM of 6 samples in 3 independent experiments. 図８は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＰＰ細胞をＨＫ－Ｃ６０によって処理した結果である。ＰＰ細胞は試験群１～４のマウスから採取した。採取した細胞は抗ＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体で３７℃で４８時間インキュベーションして刺激した。インキュベーションの最後の５時間は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激した。左図は、フローサイトメトリーの代表的な図であり、右図は、ＩＦＮ－γ産生性細胞の割合の結果である。データは、３つの独立した実験において、６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 8 shows the results of treating PP cells with HK-C60 as described in Examples described later. PP cells were collected from mice in test groups 1-4. The collected cells were stimulated by incubation with anti-CD3 monoclonal antibody and anti-CD28 monoclonal antibody at 37 ° C. for 48 hours. The last 5 hours of incubation were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . The figure on the left is a representative figure of flow cytometry, and the figure on the right is the result of the proportion of IFN-γ-producing cells. Data are shown as representative or mean ± SEM of 6 samples in 3 independent experiments. 図９は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＨＫ－Ｃ６０処理したＢＭＤＣにおける細胞内サイトカインを測定した結果及び細胞活性化の結果である。上段図は細胞内サイトカインを測定した結果である。ＢＭＤＣをＨＫ－Ｃ６０又は対照ビヒクルで、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下、３７℃で６時間処理し、サイトカイン発現をＣＤ１１ｃ^＋でゲーティングしてフローサイトメトリーで解析した。ＭＦＩは解析結果から算出した。下段図は、細胞活性化の結果である。ＢＭＤＣをＨＫ－Ｃ６０又は対照ビヒクルで３７℃で２４時間処理し、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅの発現をＣＤ１１ｃ^＋でゲーティングしてフローサイトメトリーで解析した。ＭＦＩは解析結果から算出した。データは、３つの独立した実験において、３～６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 9 shows the results of measuring intracellular cytokines and cell activation in HK-C60-treated BMDCs, as described in Examples described later. The upper figure shows the results of measuring intracellular cytokines. BMDCs were treated with HK-C60 or control vehicle in the presence of GolgiStop ^TM at 37 ° C. for 6 hours, cytokine expression was gated with CD11c ⁺ and analyzed by flow cytometry. MFI was calculated from the analysis results. The lower figure is the result of cell activation. BMDCs were treated with HK-C60 or control vehicle at 37 ° C. for 24 hours and expression of CD80, CD86 and IA / IE was gated with CD11c ⁺ and analyzed by flow cytometry. MFI was calculated from the analysis results. Data are shown as representative or mean ± SEM of 3-6 samples in 3 independent experiments. 図１０は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＢＭＤＣにおける抗原取込みを評価した結果である。ＢＭＤＣをＯＶＡ－Ａｌｅｘａ４８８と共に、ＨＫ－Ｃ６０処理による インキュベートした。左図がフローサイトメトリーによるＯＶＡ－Ａｌｅｘａ４８８取り込みの代表的な図であり、右図は、ＯＶＡ－Ａｌｅｘａ４８８のシグナルからＭＦＩを算出した結果である。データは、３つの独立した実験において、３～６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 10 shows the results of evaluation of antigen uptake in BMDC as described in Examples described later. BMDCs were incubated with OVA-Alexa488 by HK-C60 treatment. The figure on the left is a typical diagram of OVA-Alexa488 uptake by flow cytometry, and the figure on the right is the result of calculating MFI from the signal of OVA-Alexa488. Data are shown as representative or mean ± SEM of 3-6 samples in 3 independent experiments. 図１１は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示を評価した結果である。ＯＶＡ_{３２３－３３９}ペプチド存在下で、ＢＭＤＣをＤＯ１１．１０ＣＤ４^＋Ｔ細胞と（１：５の割合）共培養し、ＨＫ－Ｃ６０処理又は参照ビヒクル処理した。培養後、ＩＦＮ－γ産生性細胞集団をＣＤ３^＋でゲーティングしてＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＩＦＮ－γ産生性細胞）集団を対象としてフローサイトメトリーで分析した。左図はフローサイトメトリーの代表的な画像であり、右図はＩＦＮ－γ産生性細胞の割合を算出した結果である。データは、３つの独立した実験において、３～６サンプルの代表値又は平均値±ＳＥＭとして示した。FIG. 11 shows the results of evaluation of antigen presentation to CD4 + T cells as described in Examples described later. In the presence of the OVA _323-339 peptide, BMDCs were co-cultured with DO11.10CD4 ⁺ T cells (1: 5 ratio) and treated with HK-C60 or reference vehicle. After culturing, the IFN-γ-producing cell population was gated with CD3 ⁺ and analyzed by flow cytometry for the IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ T cell (IFN-γ-producing cell) population. The left figure is a typical image of flow cytometry, and the right figure is the result of calculating the ratio of IFN-γ-producing cells. Data are shown as representative or mean ± SEM of 3-6 samples in 3 independent experiments. 図１２は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＩＬ－１８ＫＯマウスにおけるＣＤ４５^＋細胞集団の減少を示す図である。試験群１～４のマウスの小腸からＬＰ細胞を単離した。単離したＬＰ細胞をフローサイトメトリーで分析し、ＣＤ４５^＋細胞を検出した。円で囲ったエリアはリンパ球集団を示す。FIG. 12 is a diagram showing a decrease in the CD45 ⁺ cell population in IL-18KO mice, as described in Examples below. LP cells were isolated from the small intestine of mice in test groups 1-4. The isolated LP cells were analyzed by flow cytometry to detect CD45 ⁺ cells. The circled area indicates the lymphocyte population. 図１３は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＬＰにおけるＣＤ３^＋Ｔ細胞の年齢的な減少を示した図である。試験群１及び３並びに試験群５及び６マウスの小腸からＬＰ細胞を採取した。ＣＤ４５^＋ゲーティングしてＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析した。データは、３回の独立した解析における４匹（若齢：８～１２週）又は６匹（高齢：１０～１２ヶ月）の平均±ＳＥＭとして示した。FIG. 13 is a diagram showing the age-related decrease of CD3 ⁺ T cells in LP as described in Examples described later. LP cells were collected from the small intestine of test groups 1 and 3 and test groups 5 and 6 mice. The proportion of CD45 ⁺ gating and CD3 ⁺ T cells was analyzed by flow cytometry. Data are shown as mean ± SEM of 4 (young: 8-12 weeks) or 6 (old: 10-12 months) in 3 independent analyzes. 図１４は、各組織及び臓器のＴ細胞の特性を評価した結果である。末梢血、脾臓、ＰＰ及びＬＰを、対照飼料又はＨＫ－Ｃ６０含有飼料を摂取したＷＴマウス及びＩＬ－１８ＫＯマウスの両方から得た。各組織から細胞を調製した後、フローサイトメトリーによりＴ細胞を分析した。末梢血、脾臓及びＰＰにおけるＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合と細胞数並びに、ＬＰにおけるＦｏｘｐ３^＋ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の割合と細胞数の結果を示す。データは、３つの独立した実験における３～８サンプルの平均±ＳＥＭとして示した。FIG. 14 shows the results of evaluating the characteristics of T cells in each tissue and organ. Peripheral blood, spleen, PP and LP were obtained from both WT and IL-18KO mice fed a control diet or an HK-C60-containing diet. After preparing cells from each tissue, T cells were analyzed by flow cytometry. The results of the proportion and cell number of CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells in peripheral blood, spleen and PP, and the proportion and cell number of Foxp3 ⁺ CD4 ⁺ T cells in LP are shown. Data are shown as mean ± SEM of 3-8 samples in 3 independent experiments. 図１５は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから採取したＰＰ細胞の数を測定した結果である。試験群１～４のマウスの小腸からＰＰ細胞を採取し、採取したＰＰ細胞の数を計数した。データは、３つの独立した分析において８サンプルの平均±ＳＥＭとして示した。FIG. 15 is a result of measuring the number of PP cells collected from the mice of the test groups 1 to 4 as described in Examples described later. PP cells were collected from the small intestine of mice of test groups 1 to 4, and the number of collected PP cells was counted. Data are shown as mean ± SEM of 8 samples in 3 independent analyses. 図１６は、後述する実施例に記載があるとおりの、試験群１～４のマウスから単離したＰＰ細胞の数を測定した結果である。試験群１～４のマウスの小腸からＬＰを採取し、採取したＬＰ細胞について、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋でゲーティングしてＣＤ１０３^＋Ｔ細胞集団を対象としてフローサイトメトリーで分析した。ＭＦＩは解析結果から算出した。左図はフローサイトメトリーの代表的な画像であり、右図はＣＤ１０３^＋のＭＦＩ及びのＣＤ１０３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞割合を算出した結果である。データは、３つの独立した分析において３サンプルの平均±ＳＥＭとして示した。FIG. 16 is a result of measuring the number of PP cells isolated from the mice of the test groups 1 to 4 as described in Examples described later. LPs were collected from the small intestine of mice in test groups 1 to 4, and the collected LP cells were gated with CD3 ⁺ CD4 ⁺ and analyzed by flow cytometry for the CD103 ⁺ T cell population. MFI was calculated from the analysis results. The left figure is a typical image of flow cytometry, and the right figure is the result of calculating the ratio of CD103 ⁺ MFI and CD103 ⁺ CD4 ⁺ T cells. Data are shown as mean ± SEM of 3 samples in 3 independent analyses.

以下、本発明の一態様である腸管内Ｔ細胞の増加促進用組成物、腸管内Ｔ細胞の活性化用組成物、腸管内免疫賦活用組成物及び腸管の抗老化用組成物（以下、これらを総称して「腸管用組成物」ともいう。）について詳細に説明するが、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。 Hereinafter, a composition for promoting the increase of intestinal T cells, a composition for activating intestinal T cells, an intestinal immunostimulatory composition, and an intestinal anti-aging composition according to one aspect of the present invention (hereinafter, these). Will be generically referred to as “composition for intestinal tract”), but the present invention may take various embodiments as long as the object is achieved.

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている推測及び理論は、本発明者らのこれまでの知見及び経験によってなされたものであることから、本発明はこのような推測及び理論のみによって拘泥されるものではない。 Unless otherwise specified, each term herein is used in the sense commonly used by one of ordinary skill in the art and should not be construed as having an unreasonably limited meaning. Moreover, since the guesses and theories made in the present specification are based on the knowledge and experience of the present inventors, the present invention is not bound by such guesses and theories alone. not.

「ＩＦＮ－γ産生性Ｔ細胞」は、ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^－Ｔ細胞であるＴｈ１細胞（ＩＦＮ－γ産生性）、Ｔｒ１細胞（ＩＦＮ－γ産生性かつＩＬ－１０産生性）又はその両方を意味する。なお、「ＩＦＮ」はインターフェロンの略語であり、「ＩＬ」はインターロイキンの略語である。なお、Ｔｈ１細胞及びＴｒ１細胞の詳細については、Ｈｕｂｅｒらの文献（Samuel Huber et al., Immunity 2011 Apr 22;34(4):554-65）を参照することができる。
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の成分が組み合わさってなる物である。
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含む」は、含まれるものとして明示されている要素以外の要素を付加できることを意味する（「少なくとも含む」と同義である）が、「からなる」及び「から本質的になる」を包含する。すなわち、「含む」は、明示されている要素及び任意の１種若しくは２種以上の要素を含み、明示されている要素からなり、又は明示されている要素から本質的になることを意味し得る。要素としては、成分、工程、条件、パラメーター等の制限事項等が挙げられる。 "IFN-γ-producing T cells" are IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ Foxp3 ^- T cells, Th1 cells (IFN-γ-producing), Tr1 cells (IFN-γ-producing and IL-10-producing), or the like thereof. Means both. In addition, "IFN" is an abbreviation for interferon, and "IL" is an abbreviation for interleukin. For details of Th1 cells and Tr1 cells, refer to the literature of Huber et al. (Samuel Huber et al., Immunity 2011 Apr 22; 34 (4): 554-65).
The "composition" is not particularly limited as having a commonly used meaning, but is, for example, a combination of two or more kinds of components.
The term "and / or" means any one, or any combination or all combinations of two or more of the listed related items.
"Including" means that elements other than those specified as being included can be added (synonymous with "at least including"), but includes "consisting of" and "essentially consisting of". .. That is, "contains" can mean that it includes an explicit element and any one or more elements, and consists of, or essentially consists of, the explicit elements. .. Examples of the element include restrictions such as components, processes, conditions, and parameters.

「腸管内Ｔ細胞」は、粘膜固有層、パイエル板といった腸管組織に存在するＴ細胞をいう。
「腸管内Ｔ細胞の増加促進用」は、腸管内Ｔ細胞の増殖を促進する作用、腸管内Ｔ細胞への分化を誘導する作用及び腸管内Ｔ細胞の減少を抑制及び緩和する作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用をいう。「腸管内Ｔ細胞の増殖」は、腸管内Ｔ細胞の数が増えること、及び／又は腸管内細胞における腸管内Ｔ細胞の割合が増えることをいう。
「腸管内Ｔ細胞の活性化作用」は、粘膜固有層、パイエル板といった腸管組織においてＩＦN－γの量が多くなる作用をいう。
「腸管内免疫賦活作用」は、腸管における現在及び将来の免疫系を活性化することにより、種々の疾患及び異常を正常な状態になるように促進する作用並びに種々の疾患及び異常を抑制及び緩和する作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の作用をいう。
「腸管の抗老化作用」は、粘膜固有層、パイエル板といった腸管組織における加齢に伴う変化を抑制又は緩和する作用をいう。 "T cells in the intestinal tract" refer to T cells present in the intestinal tissue such as lamina propria and Peyer's patch.
"For promoting the increase of intestinal T cells" is a group consisting of an action of promoting the proliferation of intestinal T cells, an action of inducing differentiation into intestinal T cells, and an action of suppressing and alleviating the decrease of intestinal T cells. Refers to at least one action selected from. "Proliferation of intestinal T cells" means an increase in the number of intestinal T cells and / or an increase in the proportion of intestinal T cells in the intestinal cells.
"Activating action of T cells in the intestinal tract" refers to an action of increasing the amount of IFN-γ in the intestinal tissue such as lamina propria and Peyer's patch.
"Intra-intestinal immune activating action" is an action that promotes various diseases and abnormalities to a normal state by activating the current and future immune systems in the intestinal tract, and suppresses and alleviates various diseases and abnormalities. It refers to at least one action selected from the group consisting of such actions.
"Anti-aging action of the intestinal tract" refers to an action of suppressing or alleviating changes with age in intestinal tissues such as lamina propria and Peyer's patches.

本明細書では、本発明の一態様の腸管用組成物が有する、腸管内Ｔ細胞の増加促進用、腸管内Ｔ細胞の活性化作用、腸管内免疫賦活作用、腸管の抗老化作用並びにこれらのうちの２種の作用、３種の作用及び４種の作用を総称して、「腸管内有効作用」ともいう。本発明の一態様の腸管用組成物が有する腸管内有効作用は、後述する実施例に記載があるとおりに、ＩＬ－１８ＫＯマウスを用いて、本発明の一態様の腸管用組成物を適用しない場合と比べて、粘膜固有層におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及び／又はＩＦＮ－γ産生性細胞の増殖が促進すること、パイエル板におけるＩＦＮ－γ産生性細胞及び／又はＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖が促進すること、腸管内のＩＦＮ－γの量が増加することを評価することにより確認することができる。 In the present specification, the intestinal composition of one aspect of the present invention has an intestinal T cell increase promoting action, an intestinal T cell activating action, an intestinal immunostimulatory action, an intestinal anti-aging action, and these. Two of these actions, three actions and four actions are collectively referred to as "effective action in the intestinal tract". The intestinal effective action of the intestinal composition of one aspect of the present invention is that the IL-18KO mouse is used and the intestinal composition of one aspect of the present invention is not applied, as described in Examples described later. Promotion of proliferation of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and / or IFN-γ-producing cells in Peyer's patches, IFN-γ-producing cells and / or It can be confirmed by evaluating that the proliferation of CD4 ⁺ T cells is promoted and that the amount of IFN-γ in the intestinal tract is increased.

本発明の一態様の腸管用組成物は、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含むことにより、腸管内有効作用を発揮する。 The composition for the intestinal tract of one aspect of the present invention is at least one selected from the group consisting of cells, bacterial cell components and cultures of Lactococcus lactis subspecies cremoris , and treatments thereof. By containing the active ingredient, it exerts an effective effect in the intestinal tract.

後述する実施例に記載のとおり、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスは、粘膜固有層及びパイエル板におけるＴ細胞の増殖促進作用及びＴ細胞を通常の量及び割合に回復する作用並びにパイエル板細胞に対してＴ細胞刺激感受性を高める作用を有することを見出した。また、これまでの技術常識として、腸管内Ｔ細胞は腸管内の免疫系において重要な役割を担うこと、加齢とともに腸管内Ｔ細胞の数、割合及び／又は活性が低下することが知られている。したがって、本発明の一態様の腸管用組成物は、腸管内Ｔ細胞の増加促進用及び腸管内Ｔ細胞の活性化作用を有し、さらにこれらの作用を通じて腸管内免疫賦活作用及び腸管の抗老化作用を発揮し得る。 As described in Examples below, Lactococcus lactis subspecies Cremoris has an action to promote T cell proliferation in the lamina propria and Peyer's patches, an action to restore T cells to normal amounts and proportions, and an action against Peyer's patches. It has been found that it has an effect of increasing the sensitivity to T cell stimulation. In addition, it is known that intestinal T cells play an important role in the intestinal immune system, and that the number, proportion, and / or activity of intestinal T cells decreases with aging. There is. Therefore, the intestinal composition of one aspect of the present invention has an action for promoting the increase of intestinal T cells and an action for activating intestinal T cells, and further, through these actions, an intestinal immunostimulatory action and an intestinal anti-aging action. Can exert its effect.

本発明の一態様の腸管用組成物が作用を及ぼす腸管内Ｔ細胞は特に限定されないが、腸管組織の中でも腸管内の免疫系に寄与する粘膜固有層及びパイエル板に存在するＴ細胞であることが好ましい。具体的には、粘膜固有層におけるＴ細胞としては、粘膜固有層におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞であることが好ましく、ＩＦＮ－γ産生性細胞であることがより好ましい。また、パイエル板におけるＴ細胞としては、パイエル板におけるＣＤ４^＋細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞であることが好ましく、ＩＦＮ－γ産生性細胞であることがより好ましい。 The intestinal T cells on which the composition for intestinal tract of one aspect of the present invention acts are not particularly limited, but are T cells present in the lamina propria and Peyer's patch that contribute to the immune system in the intestinal tract among the intestinal tissues. Is preferable. Specifically, the T cells in the mucosal intrinsic layer are at least one T cell selected from the group consisting of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells in the mucosal intrinsic layer. , And more preferably IFN-γ-producing cells. The T cells in the Peyer's patch are preferably at least one T cell selected from the group consisting of CD4 ⁺ cells and IFN-γ-producing cells in the Peyer's patch, and are IFN-γ-producing cells. Is more preferable.

本発明の一態様の腸管用組成物は、腸管内有効作用を有することにより、抗ウイルス効果、抗アレルギー効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗腫瘍効果及び抗癌効果などの抗疾患効果を奏することが期待されるものであることから、抗ウイルス剤、抗感染症剤、抗アレルギー剤、抗Ｂ型肝炎剤、抗Ｃ型肝炎剤、抗腫瘍剤及び抗癌剤という態様をとり得る。本発明の一態様の腸管用組成物が奏する抗疾患効果は、例えば、生物個体における現在若しくは将来の疾患の状態又は疾患に罹患しているとされる状態になることを抑制、緩和又は改善することをいう。 The composition for intestinal tract of one aspect of the present invention has an antiviral effect, an antiallergic effect, an anti-infectious disease effect, an anti-hepatitis B effect, an anti-hepatitis C effect, an antitumor effect and an antitumor effect by having an intestinal effective effect. Since it is expected to exert anti-disease effects such as anti-cancer effect, anti-viral agent, anti-infectious disease agent, anti-allergic agent, anti-hepatitis B agent, anti-hepatitis C agent, anti-tumor agent and It can take the form of an anticancer agent. The anti-disease effect exerted by the intestinal composition of one aspect of the present invention suppresses, alleviates or improves, for example, the current or future state of the disease or the state allegedly suffering from the disease in an individual organism. Say that.

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）は、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスに分類される乳酸菌であればよい。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスを入手する方法は特に限定されないが、例えば、市販又は寄託されているものを利用する方法、天然又は醤油諸味、漬物、市販の乳酸菌飲料などの乳酸菌含有物から分離して利用する方法などが挙げられる。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの寄託されているものとしては、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス Ｃ６０株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－０８５５９）などがある。Ｃ６０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）から入手することができる。 Lactococcus lactis subspecies cremoris ( Lactococcus lactis subspecies cremoris ) may be any lactic acid bacterium classified into Lactococcus lactis subspecies cremoris. The method for obtaining Lactococcus lactis subspecies cremoris is not particularly limited, but for example, a method using commercially available or deposited products, and separating from lactic acid bacteria-containing substances such as natural or soy sauce moromi mash, pickles, and commercially available lactic acid bacteria beverages. The method of using it can be mentioned. Lactococcus lactis subspecies Cremoris deposits include Lactococcus lactis subspecies Cremoris C60 strain (deposit number: FERM BP-08559). The C60 strain can be obtained from the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba 292-0818).

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスは、いずれか１種の株を単独で、又は２種以上の株を組み合わせて使用できる。 Lactococcus lactis subspecies Cremoris can be used alone or in combination of two or more strains.

本発明の一態様の腸管用組成物における有効成分は、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスそれ自体、すなわち、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体に加えて、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体成分及びラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの培養物であり得る。また、本発明の一態様の腸管用組成物における有効成分は、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体、菌体成分及び／又は培養物を処理したものであってもよい。 The active ingredient in the intestinal composition of one embodiment of the present invention is Lactococcus lactis subspecies cremoris itself, that is, Lactococcus lactis subspecies cremoris cell component and Lactococcus lactis subspecies cremoris cell component. Lactococcus lactis subspecies can be a culture of Cremoris. In addition, the active ingredient in the intestinal composition of one aspect of the present invention may be a treated cell, cell component and / or culture of Lactococcus lactis subspecies Cremoris.

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体は、例えば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの培養物を遠心分離などの通常知られている固液分離手段を用いて培地を除去することにより得られる菌体が挙げられる。菌体成分は、例えば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体内に存在する、又は菌体外に分泌する精製又は非精製の成分などが挙げられる。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの培養物は、例えば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスを培養して得た培養液そのものなどが挙げられる。 Lactococcus lactis subspecies Cremoris cells can be obtained by removing the medium from a culture of Lactococcus lactis subspecies Cremoris using a commonly known solid-liquid separation method such as centrifugation. Can be mentioned. Examples of the bacterial cell component include purified or unpurified components existing in the cell of Lactococcus lactis subspecies Cremoris or secreted outside the cell. Examples of the culture of Lactococcus lactis subspecies cremoris include the culture solution itself obtained by culturing Lactococcus lactis subspecies cremoris.

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体、菌体成分及び培養物は、それらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体、菌体成分及び培養物を入手する方法は特に限定されないが、例えば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体を入手する方法としては、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスをＭＲＳ培地に植菌し、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの増殖に適した温度、好ましくは約３７℃にて、数時間～数十時間、好ましくは１８時間～３０時間培養することにより、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの培養物を得て、次いで遠心分離などの通常の菌体回収手段を用いて菌体を回収する方法などが挙げられる。ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体成分は、例えば、細胞外の成分については菌体回収後の培養物（培養液）から入手することができ、細胞内の成分については回収した菌体をホモジナイズすることなどにより菌体を破砕することにより入手することができる。 Lactococcus lactis subspecies Cremoris cells, bacterial cell components and cultures can be used alone or in combination of two or more. The method for obtaining the cells, bacterial cell components and cultures of Lactococcus lactis subspecies is not particularly limited. For example, as a method for obtaining the cells of Lactococcus lactis subspecies Cremoris, Lactococcus lactis subspecies Cremoris Lactococcus is inoculated into an MRS medium and cultured at a temperature suitable for growth of Lactococcus lactis subspecies Cremoris, preferably at about 37 ° C. for several hours to several tens of hours, preferably 18 hours to 30 hours. Examples include a method of obtaining a culture of Lactococcus subspecies Cremoris and then recovering the cells by using a usual cell recovery means such as centrifugation. Lactococcus lactis subspecies Cremoris cell components can be obtained, for example, from the culture (culture medium) after cell recovery for extracellular components, and homogenize the recovered cells for intracellular components. It can be obtained by crushing the cells by crushing the cells.

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体、菌体成分及び培養物の処理物としては、例えば、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの菌体、菌体成分又は培養物の高温処理物及び／又は高圧処理物などが挙げられ、安定した腸管内有効作用を得るという観点から、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの殺菌処理物であることが好ましく、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスの加熱殺菌処理物であることがより好ましく、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスのオートクレーブ加熱殺菌処理物であることがさらに好ましい。加熱殺菌処理の条件は、通常の微生物の加熱殺菌処理の条件であれば特に限定されないが、例えば、オートクレーブを用いて、９０℃～１３０℃、好ましくは約９５℃にて、数分間～数十分間、好ましくは約１０分間の条件などが挙げられる。 Examples of the treated product of Lactococcus lactis subspecies cremoris cell, bacterial cell component and culture include, for example, a high temperature treated product and / or a high-pressure treated product of Lactococcus lactis subspecies cremoris cell, bacterial cell component or culture. From the viewpoint of obtaining a stable intestinal effective action, it is preferable that it is a sterilized product of Lactococcus lactis subspecies Cremoris, and more preferably it is a heat sterilized product of Lactococcus lactis subspecies Cremoris. , Lactococcus lactis subspecies Cremoris autoclave heat sterilized product is more preferred. The conditions of the heat sterilization treatment are not particularly limited as long as they are the conditions of the heat sterilization treatment of ordinary microorganisms. The conditions for a minute, preferably about 10 minutes, and the like can be mentioned.

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスは食経験があり、安全性が確認されていることから、本発明の一態様の腸管用組成物は、実用性が高く、そのままで、又は加工することにより、経口的又は非経口的な形態で種々の用途に適用可能である。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内などへ投与することによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。 Since Lactococcus lactis subspecies Cremoris has been eaten and its safety has been confirmed, the intestinal composition according to one aspect of the present invention is highly practical and can be taken orally as it is or by processing. Alternatively, it can be applied to various uses in a parenteral form. Parenteral applications include, but are not limited to, injections and injections by intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, etc .; transdermal; inhalation through mucosa such as the nose and pharynx. ..

本発明の一態様の腸管用組成物を適用する生物個体は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。生物個体は、健常な個体であってもよいが、腸管免疫の改善又は予防が望まれる個体であることが好ましく、高齢の個体であることがより好ましく、ヒトの年齢に換算して４０歳以上の個体であることがさらに好ましく、それ以上の年齢の個体であることがなおさらに好ましい。 The individual organism to which the composition for the intestinal tract of one aspect of the present invention is applied is not particularly limited, and examples thereof include animals, especially mammals, and examples of mammals include humans, dogs, cats, cows, horses, pigs, and sheep. Of these, humans are preferred. The biological individual may be a healthy individual, but is preferably an individual for which improvement or prevention of intestinal immunity is desired, more preferably an elderly individual, and is 40 years or older in terms of human age. It is even more preferable to be an individual of, and even more preferably an individual of an older age.

本発明の一態様の腸管用組成物は、腸管内有効作用を有する限り、用途に応じて、その他の成分を含む。このように、本発明の一態様の腸管用組成物は、有効成分に加えて、本発明の目的を達成し得る限り、種々のその他の成分を含み得る。その他の成分の含有量は、本発明の課題解決を妨げない限り、当業者により適宜設定し得る。 The composition for an intestinal tract according to one aspect of the present invention contains other components depending on the intended use, as long as it has an effective effect in the intestinal tract. As described above, the composition for intestinal tract of one aspect of the present invention may contain various other components in addition to the active ingredient as long as the object of the present invention can be achieved. The contents of other components may be appropriately set by those skilled in the art as long as they do not interfere with solving the problems of the present invention.

その他の成分は特に限定されないが、例えば、本発明の一態様の腸管用組成物を飲食品用組成物として用いる場合は、食品及び調味料に使用される成分などが挙げられ、具体的には、固形成分としては、食塩、糖類（砂糖、ぶどう糖、果糖、水飴、異性化液糖など）、穀類成分（パン粉、小麦粉、オートミールなど）、香辛料（生姜、唐辛子、こしょう、バジル、オレガノ、ジンジャー、ミックススパイスなど）、増粘剤（カラギーナンなどの増粘多糖類、でん粉、加工でん粉、ガム類など）、食肉加工成分（チキンパウダー、ミートパウダー、フィッシュパウダーなど）、化学調味料（グルタミン酸ナトリウム、グリシン、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウムなど）、フレーバー、味噌、カレー粉などが挙げられ；液体成分としては、水、アルコール、甘味成分（みりん、液糖、水飴など）、酸味成分（食酢、りんご、ゆず、レモンといった香酸柑橘など）、油脂成分（ごま油、オリーブオイル、サラダ油、大豆油、ラー油、バター、牛脂、ラードなど）、酒類成分（ワイン、清酒など）、果汁（りんご果汁など）などが挙げられる。この場合、その他の成分は、魚介類エキス、海藻エキス、肉エキス、野菜エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物などのエキス；魚節類、海藻類、キノコ類などを、熱水、エタノールなどの溶媒で抽出して得られるダシ汁；野菜類、香辛野菜類、キノコ類、果実類、肉類、魚介類、海藻類などの食材であってもよい。 Other components are not particularly limited, but for example, when the intestinal composition of one aspect of the present invention is used as a composition for food and drink, components used for foods and seasonings and the like can be mentioned, and specific examples thereof. , Solid ingredients include salt, sugar (sugar, grape sugar, fructose, high fructose corn syrup, high fructose corn syrup, etc.), grain ingredients (bread flour, wheat flour, oatmeal, etc.), spices (ginger, chili pepper, pepper, basil, oregano, ginger, etc.) Mix spices, etc.), thickeners (thickening polysaccharides such as carrageenan, starch, processed starch, gums, etc.), meat processing ingredients (chicken powder, meat powder, fish powder, etc.), chemical seasonings (sodium glutamate, glycine) , Sodium inosinate, sodium guanylate, etc.), flavors, miso, curry powder, etc .; liquid components include water, alcohol, sweet components (mirin, liquid sugar, water candy, etc.), sour components (vinegar, apples, etc.) Spicy citrus such as yuzu and lemon), oil and fat components (sesame oil, olive oil, salad oil, soybean oil, chili oil, butter, beef fat, lard, etc.), liquor components (wine, sake, etc.), fruit juice (apple juice, etc.) Can be mentioned. In this case, other components include fish and shellfish extract, seaweed extract, meat extract, vegetable extract, yeast extract, protein hydrolyzate and other extracts; fish and shellfish, seaweed, mushrooms, etc., in hot water, ethanol, etc. Dashi juice obtained by extraction with a solvent; may be ingredients such as vegetables, spicy vegetables, mushrooms, fruits, meats, fish and shellfish, and seaweeds.

また、その他の成分は、例えば、本発明の一態様の腸管用組成物を化粧品用組成物又は医薬品用組成物として用いる場合は、通常の化粧品及び医薬品に使用される成分などが挙げられ、具体的には水などの基剤、油性成分、保湿剤、清涼剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、増粘剤、美白剤、乳化剤、ビタミン類、その他各種薬効成分、粉体、香料、色材、賦形剤、結合剤、滑沢剤などが挙げられる。 In addition, examples of other components include components used in ordinary cosmetics and pharmaceuticals when the intestinal composition according to one aspect of the present invention is used as a cosmetic composition or a pharmaceutical composition. Bases such as water, oily ingredients, moisturizers, refreshing agents, preservatives, chelating agents, pH regulators, antioxidants, UV absorbers, UV scatterers, thickeners, whitening agents, emulsifiers, vitamins Kind, various other medicinal ingredients, powders, fragrances, coloring materials, excipients, binders, lubricants, etc.

本発明の一態様の腸管用組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態をとり得る。 The composition for the intestinal tract according to one aspect of the present invention is not particularly limited as long as it is in a commonly used form, and for example, solid, liquid, gel, suspension, cream, sheet, stick, powder, etc. It can take various forms such as granules, granules, tablets, rods, plates, blocks, pastes, capsules, and caplets.

本発明の一態様の腸管用組成物は、例えば、経口用組成物である場合に、有効成分を、食道及び胃を経由して小腸へ送達し得るものとして、腸溶性組成物とすることが好ましい。腸溶性組成物は、胃酸では溶けずに小腸において溶解する形態の組成物であれば特に限定されず、例えば、耐酸性マイクロカプセルやリポソームの形態の組成物などが挙げられる。 The intestinal composition of one aspect of the present invention may be an enteric composition such that, for example, when it is an oral composition, the active ingredient can be delivered to the small intestine via the esophagus and stomach. preferable. The enteric composition is not particularly limited as long as it is a composition in the form of not dissolving in gastric acid but dissolving in the small intestine, and examples thereof include acid-resistant microcapsules and compositions in the form of liposomes.

有効成分の含有量は、腸管内Ｔ細胞の増加促進作用又は腸管内Ｔ細胞の活性作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、組成物の全体量に対して、１．０×１０^４ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは１．０×１０^５ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^１０ＣＦＵ／ｇ、より好ましくは１．０×１０^６ＣＦＵ／ｇ～１．０×１０^９ＣＦＵ／ｇであり；又は０．０１質量％～９９．９質量％、好ましくは０．１質量％～９９質量％、より好ましくは１質量％～９０質量％である。 The content of the active ingredient is not particularly limited as long as it has an effect of promoting the increase of T cells in the intestinal tract or an activating effect of T cells in the intestinal tract, but is, for example, 1.0 × with respect to the total amount of the composition. 10 ⁴ CFU / g to 1.0 × 10 ¹² CFU / g, preferably 1.0 × 10 ⁵ CFU / g to 1.0 × 10 ¹⁰ CFU / g, more preferably 1.0 × 10 ⁶ CFU / g. ~ 1.0 × 10 ⁹ CFU / g; or 0.01% by weight to 99.9% by weight, preferably 0.1% by weight to 99% by weight, more preferably 1% by weight to 90% by weight. ..

本発明の一態様の腸管用組成物の１回の使用量、１日の使用量、使用期間、使用間隔などの用法及び用量は特に限定されず、使用態様、適用する生物個体の状態などに応じて適宜設定され得る。 The usage and dosage of the intestinal composition according to one aspect of the present invention, such as the amount of one-time use, the amount of daily use, the period of use, the interval of use, etc. It can be set as appropriate according to the situation.

１回の使用量は、例えば、有効成分の使用量が好ましくは０．１ｍｇ～１０，０００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～１，０００ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ～５００ｍｇになるような量である。１日の使用量は、生物個体の症状及び体格に合わせて適宜設定すればよいが、例えば、１００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日～１０ｇ／体重６０ｋｇ／日であることが好ましい。 The amount used once is, for example, such that the amount of the active ingredient used is preferably 0.1 mg to 10,000 mg, more preferably 1 mg to 1,000 mg, and even more preferably 10 mg to 500 mg. The daily usage amount may be appropriately set according to the symptom and physique of the individual organism, and is preferably 100 mg / body weight 60 kg / day to 10 g / body weight 60 kg / day, for example.

使用間隔は、例えば、１日に１回、２回、３回又は数回を、一定期間、すなわち２日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは２週間以上、さらに好ましくは１ヶ月以上、なおさらに好ましくは６ヶ月又は１年以上にわたって継続的に適用することなどが挙げられる。本発明の一態様の腸管用組成物の適用は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に適用する限り、本発明の一態様の腸管用組成物を毎日適用しなくてもよい。 The interval of use is, for example, once, twice, three times or several times a day for a certain period, that is, two days or more, preferably one week or more, more preferably two weeks or more, still more preferably one month or more. Even more preferably, continuous application for 6 months or 1 year or more can be mentioned. The application of the intestinal composition of one aspect of the present invention is preferably carried out daily, but the intestinal composition of one aspect of the present invention may not be applied daily as long as it is continuously applied during the period.

本発明の一態様の腸管用組成物は、それ自体単独で、又は飲食品、化粧品、医薬品などに添加して使用することができる。本発明の具体的な態様は、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品；乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品；化粧品；医薬品；医薬部外品；動物飼料；及びこれらの製品を製造するための原料などである。 The intestinal composition according to one aspect of the present invention can be used alone or in addition to foods and drinks, cosmetics, pharmaceuticals and the like. Specific embodiments of the present invention include foods and drinks for specified health use, foods and drinks with functional claims, foods and drinks with nutritional functions, foods and drinks with health functions, foods and drinks for special purposes, foods and drinks for nutritional supplements, foods and drinks for health supplements, supplements, and beauty foods and drinks. So-called healthy foods and drinks such as products; foods and drinks for specific persons such as foods and drinks for infants, pregnant women and foods for the elderly; cosmetics; pharmaceuticals; non-medicinal products; animal feeds; and these products are manufactured. It is a raw material for.

本発明の一態様の腸管用組成物は、容器に詰めて密封した容器詰組成物とすることができる。容器は特に限定されないが、例えば、アルミなどの金属、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、１層又は積層（ラミネート）のフィルム、ガラスなどを素材とするパウチ、小袋、ボトル、缶、瓶などの包装容器が挙げられる。本発明の一態様の組成物は、経時的な変質を避けるために、容器に詰めて密封した後に、加圧及び／又は加熱などにより殺菌処理したものであることが好ましい。容器詰組成物は、製造して得られた腸管用組成物を、分注、充填及び／又は個装して、それ自体で独立して、流通におかれて市販され得るものであることが好ましい。 The composition for the intestinal tract according to one aspect of the present invention can be a packaged composition packed in a container and sealed. The container is not particularly limited, but for example, a packaging container such as a pouch, a pouch, a bottle, a can, or a bottle made of a metal such as aluminum, a plastic such as PET or PTP, a one-layer or laminated (laminated) film, or glass. Can be mentioned. In order to avoid deterioration over time, the composition of one aspect of the present invention is preferably packed in a container, sealed, and then sterilized by pressurization and / or heating. The packaged composition may be a composition for the intestinal tract obtained by dispensing, filling and / or individually packaging, and can be independently distributed and marketed by itself. preferable.

本発明の一態様の腸管用組成物の製造方法は特に限定されないが、例えば、有効成分とその他の成分とを混合すること、及び得られた混合物を所望の形態に成形することを含む方法などが挙げられる。 The method for producing the composition for intestinal tract according to one aspect of the present invention is not particularly limited, and for example, a method including mixing an active ingredient with other ingredients and molding the obtained mixture into a desired form and the like. Can be mentioned.

本発明の別の一態様は、有効成分又は該有効成分を含む組成物を、生物個体に適用することを含む、生物個体の腸管内Ｔ細胞の増加を促進する方法、腸管内Ｔ細胞を活性化する方法、腸管内免疫を賦活する方法及び腸管内の抗老化方法である。 Another aspect of the present invention is a method for promoting the increase of intestinal T cells in an individual organism, comprising applying the active ingredient or a composition containing the active ingredient to an individual organism, activating intestinal T cells. It is a method of activating, a method of activating intestinal immunity, and a method of anti-aging in the intestinal tract.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples, and the present invention can take various aspects as long as the problems of the present invention can be solved. ..

１．方法及び材料
（１－１）ＨＫ－Ｃ６０
ラクトコッカス・ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｃ６０株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－０８５５９；以下、「Ｃ６０株」ともよぶ。）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に保存されているものを使用した。Ｃ６０株を、ＭＲＳ培地（「ＢＤ Ｄｉｆｃｏ^ＴＭ」、米国、ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、３７℃で２４時間培養して、培養物を得た。微生物コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）は全ての培養物で算出された。次いで培養物を９５℃にて１０分間、オートクレーブにて加熱殺菌処理を行うことにより、培養殺菌処理液を調製した。得られた培養殺菌処理液を、１０，０００ｇ、５分間の遠心分離処理に供して菌体を回収した。次いで、回収した菌体を、生理食塩水を用いた洗浄処理に供したものを、Ｃ６０株の死菌体（ＨＫ－Ｃ６０）とした。 1. 1. Method and material (1-1) HK-C60
Lactococcus lactis subspecies cremoris C60 strain (deposit number: FERM BP- 08559 ; hereinafter also referred to as "C60 strain") is a patented microorganism deposit center of the Independent Administrative Institution Product Evaluation Technology Infrastructure Organization. NPMD) (Room 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) was used. The C60 strain was cultured at 37 ° C. for 24 hours using MRS medium (“BD Difco ^TM ”, manufactured by BD Bioscience, USA) to obtain a culture. Microbial colony forming units (CFU / mL) were calculated for all cultures. Next, the culture was heat-sterilized at 95 ° C. for 10 minutes in an autoclave to prepare a culture sterilization solution. The obtained culture sterilization solution was subjected to centrifugation at 10,000 g for 5 minutes, and the cells were collected. Next, the recovered cells subjected to a washing treatment using physiological saline were designated as dead cells of the C60 strain (HK-C60).

（１－２）マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス（以下、「ＷＴ」ともよぶ。）は、日本クレア社から購入した。インターロキン－１８ノックアウト（以下、「ＩＬ－１８ＫＯ」ともよぶ。）マウスは、兵庫医科大学より入手した。すべてのマウスは１２時間の明暗サイクルで飼育し、飼料及び水は自由摂取で行った。各実験では性別を一致させた成体マウス（１０週齢～１２週齢の若齢群及び３０週齢～４０週齢の老齢群）を使用した。 (1-2) Mouse BALB / c mouse (hereinafter, also referred to as "WT") was purchased from Claire Japan. Interlokin-18 knockout (hereinafter, also referred to as "IL-18KO") mice were obtained from Hyogo College of Medicine. All mice were bred with a 12-hour light-dark cycle, and feed and water were fed freely. In each experiment, sex-matched adult mice (young group of 10 to 12 weeks old and old group of 30 to 40 weeks old) were used.

図１に示す実験スキームにあるとおり、腸内免疫環境における乳酸菌の影響を評価するために、老齢群のマウスに標準飼料（「ＡＩＮ－９３」、オリエンタル酵母社製）を２週間摂取させて馴化した後、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料又は対照飼料をペレット給餌で与えた。ＨＣ－Ｃ６０含有飼料は、標準飼料１ｇあたりＨＫ－Ｃ６０が４×１０^８ＣＦＵになるように添加して作製した。対照飼料は標準飼料をそのまま用いた。全てのマウスの実験は、国立研究開発法人産業技術総合研究所の動物福祉委員会で審査され、承認された。 As shown in the experimental scheme shown in FIG. 1, in order to evaluate the effect of lactic acid bacteria on the intestinal immune environment, aged mice were ingested with a standard diet (“AIN-93”, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) for 2 weeks to acclimatize. After that, the HK-C60-containing feed or the control feed was fed by pellet feeding. The HC-C60-containing feed was prepared by adding HK-C60 to 4 × ¹⁰⁸ CFU per 1 g of the standard feed. As the control feed, the standard feed was used as it was. All mouse experiments were reviewed and approved by the Animal Welfare Committee of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.

以下の試験で使用したマウスを、表１に示すとおりに試験群１～６に分けた。 The mice used in the following tests were divided into test groups 1 to 6 as shown in Table 1.

（１－３）試薬及び抗体
ホルボール１２－ミリスタート１３－アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン及びオボアルブミン（ＯＶＡ）をシグマリッチ社から購入した。コラゲナーゼ－Ｄ、コラゲナーゼタイプＩ、ＤＮエース及びＡｌｅｘａ ４８８修飾ＯＶＡを、サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを含むＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍキットをＢＤバイオサイエンス社から購入した。組換えマウスインターロイキン－２（ｒｍＩＬ－２）をペプロテック社から購入した。組換えマウス顆粒球マクロファージ－コロニー刺激因子（ｒｍＧＭ－ＣＳＦ）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｎ４１８）、抗ＣＤ８０抗体（１６－１０Ａ１）、抗ＣＤ８６抗体（ＧＬ－１）、抗ＭＨＣ－ＩＩ抗体（Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ；Ｍ５／１１４．５）、抗ＣＤ４５抗体（３０－Ｆ１１）、抗ＣＤ３ε抗体（１７Ａ２）、抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８α抗体（５３－６．７）、抗インターフェロンγ抗体（ＩＦＮ－γ）（ＸＭＧ１．２）、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２）、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ^ＴＭ精製抗ＣＤ３抗体（１７Ａ２）及びＵｌｔｒａ－ＬＥＡＦ^ＴＭ精製抗ＣＤ２８抗体（３７．５１）を、バイオレジェンド社から購入した。各抗体のアイソタイプマッチコントロールを、抗体を購入した会社から購入した。 (1-3) Reagents and Antibodies Phorbol 12-millistart 13-acetate (PMA), ionomycin and ovalbumin (OVA) were purchased from Sigmarich. Collagenase-D, collagenase type I, DN Ace and Alexa 488 modified OVA were purchased from Thermo Fisher Scientific. A Cytofix / Cytoperm kit containing GolgiStop was purchased from BD Biosciences. Recombinant mouse interleukin-2 (rmIL-2) was purchased from Peprotech. Recombinant mouse granulocyte macrophage-colony stimulator (rmGM-CSF), anti-CD11c antibody (N418), anti-CD80 antibody (16-10A1), anti-CD86 antibody (GL-1), anti-MHC-II antibody (IA) / IE; M5 / 114.5), anti-CD45 antibody (30-F11), anti-CD3ε antibody (17A2), anti-CD4 antibody (GK1.5), anti-CD8α antibody (53-6.7), anti-interferon γ antibody (IFN-γ) (XMG1.2), anti-CD16 / CD32 antibody (2.4G2), Ultra-LEAF ^TM purified anti-CD3 antibody (17A2) and Ultra-LEAF ^TM purified anti-CD28 antibody (37.51). , Purchased from Bio-Legend. Isotype match controls for each antibody were purchased from the company that purchased the antibody.

（１－４）マウスのプライマリー細胞の単離及び血中白血球の調製
＜１－４－１ ＬＰ細胞＞
粘膜固有層（Ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ：ＬＰ）細胞は、Ｊａｎｇらの文献（Myoung Ho Jang et al., J Immunol January 15, 2006, 176 (2) 803-810）に記載されている手法に従い、軽微な修正を加えて単離した。すなわち、マウスから小腸を摘出し、ＰＢＳで洗浄した後、ハサミで開腸し、ＰＢＳでよく洗浄した。洗浄した腸を５ｍｍ～１０ｍｍに断片化した腸片を、３７℃で３０分間、洗浄緩衝液（１０％ ＦＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシン及び２ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含むＰＢＳ）中で撹拌しながらインキュベートした。 (1-4) Isolation of mouse primary cells and preparation of blood leukocytes <1-4-1 LP cells>
Lamina propria (LP) cells were slightly modified according to the procedure described in Jang et al. (Myoung Ho Jang et al., J Immunol January 15, 2006, 176 (2) 803-810). Was added and isolated. That is, the small intestine was removed from the mouse, washed with PBS, opened with scissors, and washed well with PBS. Fragmented intestinal pieces from washed intestine to 5 mm to 10 mm with wash buffer (10% FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 100 U / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin and 2 mM sodium pyruvate) at 37 ° C. for 30 minutes. Incubated with stirring in PBS) containing.

インキュベーション後の腸片を、ＰＢＳで数回洗浄し、次いで消化緩衝液（１０％ ＦＢＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ及び５０ｕｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩを含むＲＰＭＩ１６４０培地）中で、さらに可能な限り小さく断片化して腸細断片（１ｍｍ～２ｍｍ）を得た。腸細断片を含む細胞消化緩衝液を撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートする消化処理に供した。消化処理後の溶液をメッシュサイズが７０μｍの細胞ストレーナーでろ過した。未消化の組織片を細胞ストレーナー上で機械的に粉砕した。このようにして、腸細断片から細胞を得た。 Intestinal pieces after incubation are washed several times with PBS and then RPMI1640 medium containing digestive buffer (10% FBS, 20 mM HEPES, 100 U / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin, 1 mg / mL collagenase D and 50 ug / mL DNase I). ), Further fragmented as small as possible to obtain an intestinal fine fragment (1 mm to 2 mm). The cell digestion buffer containing the intestinal fine fragments was subjected to a digestion process incubating at 37 ° C. for 30 minutes with stirring. The digested solution was filtered through a cell strainer with a mesh size of 70 μm. Undigested tissue pieces were mechanically ground on a cell strainer. In this way, cells were obtained from the intestinal fragment.

得られた細胞を、細胞培養培地（１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０ μＭ ２－ＭＥ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）で洗浄した後、メッシュサイズが４０μｍの細胞ストレーナーでろ過した。細胞を、３００ｇで５分間遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞をＬＰ細胞として使用した。 The resulting cells were washed with cell culture medium (RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 50 μM 2-ME, 10 mM HEPES, 100 U / mL penicillin and 100 mg / mL streptomycin) and then meshed to size. The cells were filtered with a 40 μm cell strainer. The cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes and precipitated. Precipitated cells were used as LP cells.

＜１－４－２ ＰＰ細胞＞
パイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ；ＰＰ）細胞は、以下の方法で単離した。すなわち、摘出したパイエル板を洗浄緩衝液（１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシン、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ）中で３７℃にて２０分間撹拌しながらインキュベートした。次いで、インキュベート後のＰＰをメッシュサイズが７０μｍの細胞ストレーナーにてデカンテーションして回収し、細胞培養培地を用いて短時間洗浄した。 <1-4-2 PP cells>
Peyer's patches (PP) cells were isolated by the following method. That is, the removed Peyer's patches were incubated in wash buffer (PBS containing 10% FBS, 100 U / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin, 20 mM EDTA and 1 mM DTT) at 37 ° C. for 20 minutes with stirring. The incubated PP was then decanted and recovered in a cell strainer with a mesh size of 70 μm and washed briefly with cell culture medium.

洗浄後のＰＰを消化緩衝液（１０％ ＦＢＳ及びコラゲナーゼタイプ－Ｉを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に移し、３７℃にて３０分間撹拌しながらインキュベートする消化処理に供した。消化処理後のＰＰを、メッシュサイズが７０μｍの細胞ストレーナー上で機械的に粉砕して細胞を得て、次いで得られた細胞を細胞培養培地で洗浄した。洗浄後の細胞を再びメッシュサイズが４０μｍの細胞ストレーナーでろ過し、次いで得られたろ液を３００ｇにて５分間遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞をＰＰ細胞として使用した。 The washed PP was transferred to digestion buffer (RPMI1640 medium containing 10% FBS and collagenase type-I) and subjected to a digestion process incubating at 37 ° C. for 30 minutes with stirring. The digested PP was mechanically ground on a cell strainer having a mesh size of 70 μm to obtain cells, and then the obtained cells were washed with a cell culture medium. The washed cells were again filtered through a cell strainer having a mesh size of 40 μm, and then the obtained filtrate was centrifuged at 300 g for 5 minutes to precipitate. Precipitated cells were used as PP cells.

＜１－４－３ 脾臓細胞＞
脾臓細胞は、Ｓａｉｔｏらの文献（Suguru Saito et al., Eur. J. Immunol. 2015. 45: 1512-1523）に記載されている手法に従って、脾臓から調製した。すなわち、摘出した脾臓を、細胞培養培地（１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μＭ ２－ＭＥ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ＭＬ ペニシリン及び１００ＭＧ／ＭＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて、メッシュサイズが７０μｍの細胞ストレーナー上で機械的に破砕して細胞を得た。得られた細胞を、細胞培養液で洗浄した後、３００ｇにて５分間遠心分離して沈殿させた。得られた細胞ペレットを、１×ＲＢＣ溶解緩衝液で１０分間室温にて処理し、次いで細胞培養培地で２回洗浄した。洗浄した細胞を、３００ｇにて５分間遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞を脾臓細胞として使用した。 <1-4-3 Spleen cells>
Spleen cells were prepared from the spleen according to the procedure described in Saito et al. (Suguru Saito et al., Eur. J. Immunol. 2015. 45: 1512-1523). That is, the excised spleen was used in a cell culture medium (RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 50 μM 2-ME, 10 mM HEPES, 100 U / ML penicillin and 100 MG / ML streptomycin) and had a mesh size of 70 μm. Cells were obtained by mechanically disrupting them on a cell trainer. The obtained cells were washed with a cell culture medium and then centrifuged at 300 g for 5 minutes to precipitate. The resulting cell pellet was treated with 1 × RBC lysis buffer for 10 minutes at room temperature and then washed twice with cell culture medium. The washed cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes and precipitated. Precipitated cells were used as spleen cells.

＜１－４－４ 骨髄細胞＞
骨髄細胞は、Ｋａｗａｓｈｉｍａらの文献（Kawashima T et al., Immunity. 2013 Jun 27;38(6): 1187-97）に記載されている手法に従い、脛骨及び大腿骨から得た。すなわち、細胞培養培地を含む１０ｍｌの２７Ｇシリンジで脛骨及び大腿骨から細胞を洗い出し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液をメッシュサイズが７０μｍの細胞ストレーナーでろ過し、細胞培養液で１回洗浄した。洗浄した細胞を、１×ＲＢＣ溶解緩衝液で１０分間室温で処理し、次いで細胞培養液で２回洗浄した。洗浄後の細胞を、３００ｇにて５分間遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞を骨髄細胞として使用した。 <1-4-4 Bone marrow cells>
Bone marrow cells were obtained from the tibia and femur according to the procedure described in Kawashima et al., Immunity. 2013 Jun 27; 38 (6): 1187-97). That is, cells were washed out from the tibia and femur with a 10 ml 27 G syringe containing a cell culture medium to obtain a cell suspension. The obtained cell suspension was filtered through a cell strainer having a mesh size of 70 μm, and washed once with a cell culture medium. The washed cells were treated with 1 × RBC lysis buffer for 10 minutes at room temperature and then washed twice with cell culture medium. The washed cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes and precipitated. The precipitated cells were used as bone marrow cells.

＜１－４－５ 末梢血細胞＞
末梢血細胞は、以下の方法で単離した。１００μｌの全血を１ｍｌの溶血試薬（ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ， ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて室温１０分で溶血させ、９ｍｌの細胞培養培地（１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μＭ ２－ＭＥ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ＭＬ ペニシリン及び１００ＭＧ／ＭＬ ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて洗浄し、洗浄後の細胞を、３００ｇにて５分間遠心分離して沈殿させた。沈殿した細胞を末梢血細胞として使用した。 <1-4-5 peripheral blood cells>
Peripheral blood cells were isolated by the following method. 100 μl of whole blood was hemolyzed at room temperature for 10 minutes using 1 ml of hemolytic reagent (RBC lysis buffer, ebioscience), and 9 ml of cell culture medium (10% fetal bovine serum (FBS), 50 μM 2-ME, 10 mM HEPES, 100 U). Washed with RPMI1640 medium containing / ML penicillin and 100 MG / ML streptomycin), and the washed cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes and precipitated. Precipitated cells were used as peripheral blood cells.

（１－５）フローサイトメトリー
細胞表面マーカー及び細胞内サイトカインについてフローサイトメーター「ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｉ」（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、試薬及び抗体の欄に記載の蛍光色素修飾モノクローナル抗体を用いて分析した。 (1-5) Flow Cytometry For Cell Surface Markers and Intracellular Cytometry Using a flow cytometer "FACS Maria I" (manufactured by BD Bioscience), using the fluorescent dye-modified monoclonal antibody described in the column of reagents and antibodies. And analyzed.

細胞を、ＦｃＲブロッカー（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体）を用いて４℃にて１０分間インキュベートした。細胞表面マーカーの染色は、細胞を、抗体を含むＰＢＳ／２％ＦＢＳ溶液中で、４℃にて３０分間インキュベートすることにより行った。細胞内染色は、細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、次いでＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭを含むＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ Ｋｉｔ（ＢＤ バイオサイエンス社）を用いて、製造業者が提供する操作マニュアルに従い下記のとおりに処理した。なお、以下の試験項目において他の記載がない限り、細胞を、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて３７℃にて５時間刺激した。 Cells were incubated with FcR blockers (anti-CD16 / CD32 antibody) at 4 ° C. for 10 minutes. Staining of cell surface markers was performed by incubating the cells in a PBS / 2% FBS solution containing the antibody at 4 ° C. for 30 minutes. The intracellular staining was performed with an antibody against the cell surface marker, and then treated as follows using a Cytofix / CytoPerm Kit (BD Bioscience) containing GolgiStop ^TM according to the operation manual provided by the manufacturer. Unless otherwise stated in the following test items, cells were stimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) at 37 ° C. for 5 hours in the presence of GolgiStop ^TM .

すなわち、細胞表面マーカーを染色した細胞を、４℃にて２０分間、固定化及び透過処理に供した。処理後の細胞を、細胞内サイトカインを染色するための抗体を用いて４℃にて３０分間インキュベートして染色した。各分析において、死細胞は、前方散乱、側方散乱及び７－ＡＡＤ核染色により除外した。すべてのデータは、「ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ」（ＢＤバイオサイエンス社製）又は「ＦｌｏｗＪｏ」（ツリースター社製）を用いて分析した。 That is, the cells stained with the cell surface marker were subjected to immobilization and permeation treatment at 4 ° C. for 20 minutes. The treated cells were incubated and stained at 4 ° C. for 30 minutes with an antibody for staining intracellular cytokines. In each analysis, dead cells were excluded by forward scatter, side scatter and 7-AAD nuclear staining. All data were analyzed using "BD FACS Diva" (BD Bioscience) or "FlowJo" (Treestar).

（１－６）ＨＫ－Ｃ６０摂取マウスから単離したＰＰ細胞におけるＴ細胞刺激
試験群１～４のマウスから単離したＰＰ細胞（５．０×１０^６細胞／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（２μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬを用いて、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）でプレコートした９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。一部の細胞を、ウェルに播種する前にＣＦＳＥを用いて事前に染色した。プレートを３７℃にて４８時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）によるＭＴＴアッセイ又はフローサイトメトリーにより、各ウェルにおけるＴ細胞の増殖を分析した。ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を分析するために、インキュベーションの最後の５時間は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激した。インキュベーション後の細胞をフローサイトメトリーで分析した。 (1-6) T cell stimulation in PP cells isolated from HK-C60-fed mice PP cells (5.0 × ¹⁰⁶ cells / mL) isolated from mice of test groups 1 to 4 and anti-CD28 monoclonal antibody (1-6) Using 0.1 mL of cell culture medium containing 2 μg / mL), seeded into each well of a 96-well plate precoated with anti-CD3 monoclonal antibody (10 μg / mL). Some cells were pre-stained with CFSE prior to seeding the wells. After incubating the plates at 37 ° C. for 48 hours, T cell proliferation in each well was analyzed by MTT assay or flow cytometry with Cell Counting Kit-8 (CCK-8). To analyze cytokine production in CD4 ⁺ T cells, the last 5 hours of incubation were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . The cells after incubation were analyzed by flow cytometry.

（１－７）ＨＫ－Ｃ６０非摂取マウスから単離したＰＰ細胞におけるＴ細胞刺激
試験群１及び３（対照飼料給餌）のマウスから単離したＰＰ細胞（５．０×１０^６細胞／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（２μｇ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬを用いて、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）でプレコートした９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。各ウェルに、ＨＫ－Ｃ６０（５．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬ又はＨＫ－Ｃ６０を含まない細胞培養培地 ０．１ｍＬ（対照ビヒクル）を加えた。プレートを、３７℃にて４８時間インキュベートした後、インキュベーションの最後の５時間は、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）で再刺激した。インキュベーション後の細胞をフローサイトメトリーで分析した。 (1-7) T cell stimulation in PP cells isolated from HK-C60 non-ingestioned PP cells (5.0 × ¹⁰⁶ cells / mL) isolated from mice of test groups 1 and 3 (control feed). And 0.1 mL of cell culture medium containing the anti-CD28 monoclonal antibody (2 μg / mL) was inoculated into each well of a 96-well plate precoated with the anti-CD3 monoclonal antibody (10 μg / mL). To each well, 0.1 mL of cell culture medium containing HK-C60 (5.0 × ¹⁰⁷ CFU / mL) or 0.1 mL of cell culture medium containing no HK-C60 (control vehicle) was added. After incubating the plates at 37 ° C. for 48 hours, the last 5 hours of incubation were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . The cells after incubation were analyzed by flow cytometry.

（１－８）骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の調製
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）は、これまでに知られている文献に記載されているプロトコルに変更を加えて調製した。試験群１及び３のマウスから単離した骨髄細胞（３．０×１０^５細胞／ｍＬ）を含むＤＣ培地（２０ｎｇ／ｍＬ ｒｍＧＭ－ＣＳＦを添加した細胞培養培地） ４ｍＬを、６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃にてインキュベートした。培養後３日目及び６日目に、培養液の半量を新鮮なＤＣ培地に交換した。培養後８日目に細胞を採取し、ＣＤ１１ｃ^＋陽性集団を「ＣＤ１１ｃ Ｍｉｃｒｏ Ｂｅａｄｓ Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ」（ミルテナイ・バイオテック社製）を用いて濃縮した。濃縮して得られた細胞について、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ１１ｃ^＋、ＣＤ８０^ｌｏｗ、ＣＤ８６^ｌｏｗ及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ^ｌｏｗが９０％以上のものをＢＭＤＣとして使用した。 (1-8) Preparation of Bone Marrow-Derived Dendritic Cell (BMDC) Bone marrow-derived dendritic cell (BMDC) was prepared by modifying the protocol described in the literature known so far. ⁴ mL of DC medium (cell culture medium supplemented with 20 ng / mL rmGM-CSF) containing bone marrow cells (3.0 × 105 cells / mL) isolated from mice of test groups 1 and 3 was added to each of the 6-well plates. The wells were seeded and incubated at 37 ° C. On the 3rd and 6th days after culturing, half of the culture broth was replaced with fresh DC medium. Cells were harvested 8 days after culture and the CD11c ⁺ positive population was concentrated using "CD11c MicroBeads Ultra Pure" (manufactured by Miltenai Biotech). The cells obtained by concentration were analyzed by flow cytometry. CD11c ⁺ , CD80 ^low , CD86 ^low and IA / I-E ^low of 90% or more were used as BMDCs.

（１－９）ＢＭＤＣ刺激アッセイ
細胞内サイトカインの検出のために、ＢＭＤＣ（１．０×１０^６細胞／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．９ｍＬを、１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。各ウェルに、ＨＫ－Ｃ６０（１．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬ又はＨＫ－Ｃ６０を含まない細胞培養培地 ０．１ｍＬ（対照ビヒクル）を加えた。細胞を、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭ存在下で、３７℃にて６時間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリーで分析した。 (1-9) BMDC Stimulation Assay For detection of intracellular cytokines, 0.9 mL of cell culture medium containing BMDC (1.0 × ¹⁰⁶ cells / mL) was seeded in each well of a 12-well plate. To each well, 0.1 mL of cell culture medium containing HK-C60 (1.0 × ¹⁰⁷ CFU / mL) or 0.1 mL of cell culture medium containing no HK-C60 (control vehicle) was added. Cells were incubated at 37 ° C. for 6 hours in the presence of GolgiStop ^TM . Cells were analyzed by flow cytometry.

ＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定のために、ＢＭＤＣ（１．０×１０^６細胞／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。各ウェルに、ＨＫ－Ｃ６０（５．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬ又はＨＫ－Ｃ６０を含まない細胞培養培地 ０．１ｍＬ（対照ビヒクル）を加えた。細胞を、３７℃にて２４時間インキュベートすることにより、ＨＫ－Ｃ６０を用いて刺激した。培養した培地を回収し、使用するまで－８０℃で保存した。 For cytokine measurement by ELISA, 0.1 mL of cell culture medium containing BMDC (1.0 × ¹⁰⁶ cells / mL) was seeded in each well of a 96-well plate. To each well, 0.1 mL of cell culture medium containing HK-C60 (5.0 × ¹⁰⁷ CFU / mL) or 0.1 mL of cell culture medium containing no HK-C60 (control vehicle) was added. Cells were stimulated with HK-C60 by incubating at 37 ° C. for 24 hours. Cultured medium was collected and stored at −80 ° C. until use.

（１－１０）抗原取込みアッセイ
ＢＭＤＣ（１．０×１０^６細胞／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．９ｍＬを、１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＯＶＡ－Ａｌｅｘａ４８８（１μｇ／ｍＬ）を抗原として培養液中に加えた。各ウェルに、ＨＫ－Ｃ６０（１．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬ又はＨＫ－Ｃ６０を含まない細胞培養培地 ０．１ｍＬ（対照ビヒクル）を加えた。細胞を、３７℃にて１８時間～２０時間インキュベートし、次いで細胞のＯＶＡの取込みについて、フローサイトメトリーを用いて分析した。 (1-10) Antigen uptake assay 0.9 mL of cell culture medium containing BMDC (1.0 × ¹⁰⁶ cells / mL) was seeded in each well of a 12-well plate. OVA-Alexa488 (1 μg / mL) was added to the culture medium as an antigen. To each well, 0.1 mL of cell culture medium containing HK-C60 (1.0 × ¹⁰⁷ CFU / mL) or 0.1 mL of cell culture medium containing no HK-C60 (control vehicle) was added. The cells were incubated at 37 ° C. for 18-20 hours and then the OVA uptake of the cells was analyzed using flow cytometry.

（１－１１）抗原提示アッセイ
ＢＭＤＣ（２．０×１０^４細胞／ｍＬ）及びＤＯ１１．１０ＣＤ４^＋Ｔ細胞（１．０×１０^５細胞／ｍＬ）を含む、ｒｍＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍＬ）添加した細胞培地 ０．１ｍＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＯＶＡ_{３２３－３３９}ペプチド（１００μｇ／ｍＬ）を培地に添加した。各ウェルに、ＨＫ－Ｃ６０（１．０×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）を含む細胞培養培地 ０．１ｍＬ又はＨＫ－Ｃ６０を含まない細胞培養培地 ０．１ｍＬ（対照ビヒクル）を加えた。プレートを、３７℃にて７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の５時間時に、細胞をＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭの存在下でＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激した。細胞をフローサイトメトリーで分析した。細胞増殖はＭＴＴアッセイによって測定した。 (1-11) Antigen presentation assay Addition of rmIL-2 (10 ng / mL) containing BMDC (2.0 × 10 ⁴ cells / mL) and DO11.10CD4 ⁺ T cells (1.0 × 10 ⁵ cells / mL). 0.1 mL of the cell medium was seeded in each well of a 96-well plate. OVA _323-339 peptide (100 μg / mL) was added to the medium. To each well, 0.1 mL of cell culture medium containing HK-C60 (1.0 × ¹⁰⁶ CFU / mL) or 0.1 mL of cell culture medium containing no HK-C60 (control vehicle) was added. The plates were incubated at 37 ° C. for 72 hours. During the last 5 hours of incubation, cells were restimulated with PMA (500 ng / mL) and ionomycin (1 μg / mL) in the presence of GolgiStop ^TM . Cells were analyzed by flow cytometry. Cell proliferation was measured by MTT assay.

（１－１２）ＥＬＩＳＡ
刺激したＢＭＤＣから産生されるサイトカインを、キット「Ｄｕｏ ｓｅｔ ＥＬＩＳＡ」（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を用いて、サイトカインごとに測定した。測定方法はすべて製品マニュアルに従って行った。 (1-12) ELISA
Cytokines produced from stimulated BMDCs were measured for each cytokine using the kit "Duo set ELISA" (manufactured by R & D Systems). All measurement methods were performed according to the product manual.

（１－１３）統計処理
有意差の分析にはスチューデントのｔ検定を用いた。「＊」はｐ＜０．０５を表し、「＊＊」はｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１を表し、それぞれ得られた値を有意とした。 (1-13) Statistical processing Student's t-test was used for the analysis of significant differences. “*” Represents p <0.05, “**” represents p <0.01, and “***” represents p <0.001, and the obtained values were regarded as significant.

２．試験結果
（２－１）ＨＫ－Ｃ６０摂取による粘膜固有層（ＬＰ）におけるＴ細胞増殖促進作用の評価
ＩＬ－１８ＫＯマウスのＬＰにおけるＴ細胞の数及び割合を測定することにより、ＨＫ－Ｃ６０摂取によるＴ細胞増殖促進作用を評価した。 2. 2. Test results (2-1) Evaluation of T cell proliferation promoting effect on lamina propria (LP) by ingestion of HK-C60 By ingestion of HK-C60 by measuring the number and proportion of T cells in LP of IL-18KO mice. The T cell proliferation promoting effect was evaluated.

試験群１～４のマウスから採取したＬＰ中のＴ細胞集団をフローサイトメトリーで測定した結果を図２及び図３に示す。図２はＣＤ３^＋Ｔ細胞の結果を示し、図３はＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の結果をそれぞれ示す。ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の数及び割合はフローサイトメトリー測定の解析結果から算出したものである。 The results of flow cytometric measurement of the T cell population in LP collected from the mice of test groups 1 to 4 are shown in FIGS. 2 and 3. FIG. 2 shows the results of CD3 ⁺ T cells, and FIG. 3 shows the results of CD4 ⁺ T cells and CD8 ⁺ T cells, respectively. The numbers and proportions of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells and CD8 ⁺ T cells were calculated from the analysis results of flow cytometry measurement.

図２及び図３が示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、対照飼料を給餌した場合と比べて、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料を給餌することにより、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞といったいずれのＴ細胞においても、数及び割合が有意に増加した。一方、ＷＴマウスでは、両方の飼料において大きな差異は見られなかった。 As shown in FIGS. 2 and 3, from the results of IL-18KO mice, by feeding the HK-C60-containing feed, CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ T cells and CD8 ⁺ were compared with the case of feeding the control feed. In any T cell, such as T cells, the number and proportion increased significantly. On the other hand, in WT mice, no significant difference was observed in both feeds.

以上の結果より、ＨＫ－Ｃ６０は、ＬＰにおけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞といったＴ細胞の増殖促進作用を有し、さらにＬＰにおける減少した該Ｔ細胞を通常の量及び割合に回復する作用を有することが確認された。 From the above results, HK-C60 has a proliferative effect on T cells such as CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells and CD8 ⁺ T cells in LP, and further reduces the amount and proportion of the T cells in LP. It was confirmed that it has a recovery effect.

（２－２）ＨＫ－Ｃ６０摂取による粘膜固有層（ＬＰ）及びパイエル板（ＰＰ）におけるＩＦＮ－γ産生性細胞増殖促進作用の評価
ＩＬ－１８ＫＯマウスのＬＰ及びＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合を測定することにより、ＨＫ－Ｃ６０摂取によるＩＦＮ－γ産生性細胞増殖促進作用を評価した。 (2-2) Evaluation of IFN-γ-producing cell proliferation promoting effect on mucosal proprioception layer (LP) and Pier plate (PP) by ingestion of HK-C60 IL-18KO mice LP and PP of IFN-γ-producing cells The IFN-γ-producing cell proliferation promoting effect of HK-C60 ingestion was evaluated by measuring the number and proportion.

試験群１～４のマウスから採取したＬＰ中のＩＦＮ－γ産生性細胞集団をフローサイトメトリーで測定した結果を図４に示し、ＰＰ中のＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＩＦＮ－γ産生性細胞）集団をフローサイトメトリーで測定した結果を図５に示す。 The results of flow cytometric measurement of the IFN-γ-producing cell population in LP collected from the mice of test groups 1 to 4 are shown in FIG. 4, and IFN-γ ⁺ CD4 ⁺ T cells (IFN-γ production) in PP are shown. The results of flow cytometric measurement of the (sex cell) population are shown in FIG.

図４に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、対照飼料を給餌した場合と比べて、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料を給餌することにより、ＬＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合が有意に増加した。一方、ＷＴマウスでは、両方の飼料において大きな差異は見られなかった。 As shown in FIG. 4, from the results of IL-18KO mice, the number and proportion of IFN-γ-producing cells in LP were significantly increased by feeding the HK-C60-containing feed as compared with the case of feeding the control feed. Increased. On the other hand, in WT mice, no significant difference was observed in both feeds.

これらの結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＬＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の増殖促進作用を有し、さらにＬＰにおける減少したＩＦＮ－γ産生性細胞を通常の量及び割合に回復する作用を有することが確認された。 From these results, HK-C60 has an action of promoting the proliferation of IFN-γ-producing cells in LP, and further has an action of recovering the decreased IFN-γ-producing cells in LP to a normal amount and ratio. Was confirmed.

また、図５に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、対照飼料を給餌した場合と比べて、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料を給餌することにより、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合が有意に増加した。したがって、ＨＫ－Ｃ６０は、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の増殖促進作用を有することが確認された。 In addition, as shown in FIG. 5, from the results of IL-18KO mice, the number and proportion of IFN-γ-producing cells in PP were increased by feeding the HK-C60-containing feed as compared with the case of feeding the control feed. Significantly increased. Therefore, it was confirmed that HK-C60 has an effect of promoting the proliferation of IFN-γ-producing cells in PP.

（２－３）ＨＫ－Ｃ６０摂取マウスから単離したパイエル板（ＰＰ）細胞についてＴ細胞刺激をした場合のＨＫ－Ｃ６０摂取によるＴ細胞活性化作用の評価
試験群１～４のマウスから単離したＰＰ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激下で培養することによる、ＨＫ－Ｃ６０摂取によるＴ細胞活性化作用を評価した。図６はＩＦＮ－γ産生性細胞の割合を測定した結果を示し、図７はＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合を測定した結果を示す。ただし、図７において、試験に供する前のプレートに播種する前の細胞をＣＦＳＥで予め染色した。 (2-3) Evaluation of T cell activation effect by ingestion of HK-C60 when T cell stimulation was applied to Pierre plate (PP) cells isolated from mice ingested HK-C60 Isolated from mice in test groups 1 to 4. The T cell activation effect by ingestion of HK-C60 by culturing the obtained PP cells under T cell receptor (TCR) stimulation with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody was evaluated. FIG. 6 shows the result of measuring the ratio of IFN-γ-producing cells, and FIG. 7 shows the result of measuring the ratio of CD4 ⁺ T cells. However, in FIG. 7, the cells before seeding on the plate before being subjected to the test were pre-stained with CFSE.

ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、対照飼料を給餌した場合と比べて、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料を給餌することにより、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合が有意に増加した。一方、ＷＴマウスでは、両方の飼料において大きな差異は見られなかった。 From the results of IL-18KO mice, the number and proportion of IFN-γ-producing cells in PP were significantly increased by feeding the HK-C60-containing feed as compared with the case of feeding the control feed. On the other hand, in WT mice, no significant difference was observed in both feeds.

これらの結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の増殖促進作用を有し、さらにＰＰにおける減少したＴ細胞を通常の量及び割合に回復する作用を有することが確認された。 From these results, it was confirmed that HK-C60 has an action of promoting the proliferation of IFN-γ-producing cells in PP, and further has an action of recovering decreased T cells in PP to a normal amount and ratio. ..

また、図７に示すとおり、ＨＫ－Ｃ６０含有飼料を給餌したマウスから単離したＰＰ細胞を、ＴＣＲを介して刺激することにより、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の割合が格段に増加した。これにより、ＨＣ－Ｃ６０が、ＰＰ細胞に対して、Ｔ細胞刺激に対する感受性を高める作用を有すること、及び／又はＰＰにおけるＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を促進する作用を有することがわかった。 In addition, as shown in FIG. 7, by stimulating PP cells isolated from mice fed the HK-C60-containing feed via TCR, the proportion of CD4 ⁺ T cells was significantly increased. From this, it was found that HC-C60 has an action of increasing the sensitivity to T cell stimulation to PP cells and / or an action of promoting the proliferation of CD4 ⁺ T cells in PP.

（２－４）ＨＫ－Ｃ６０非摂取マウスから単離したパイエル板（ＰＰ）細胞についてＴ細胞刺激をした場合のＨＫ－Ｃ６０処理によるＴ細胞活性化作用の評価
試験群１及び３（対照飼料給餌）のマウスから単離したＰＰ細胞を、ＨＣ－Ｃ６０の存在下又は非存在下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激下で培養することにより、ＨＫ－Ｃ６０処理によるＴ細胞活性化作用を評価した。図８はＩＦＮ－γ産生性細胞の割合を測定した結果を示す。 (2-4) Evaluation of T cell activation effect by HK-C60 treatment when T cell stimulation was performed on Pier plate (PP) cells isolated from HK-C60 non-ingestion mice Test groups 1 and 3 (control feed feeding) ) HK-C60 treatment by culturing PP cells isolated from mice in the presence or absence of HC-C60 under T cell receptor (TCR) stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. T cell activation effect was evaluated. FIG. 8 shows the results of measuring the proportion of IFN-γ-producing cells.

図８に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、ＨＫ－Ｃ６０処理により、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合が有意に増加した。一方、ＷＴマウスでも、ＨＣ－Ｃ６０処理により、若干の増加が見られた。 As shown in FIG. 8, from the results of IL-18KO mice, HK-C60 treatment significantly increased the number and proportion of IFN-γ-producing cells in PP. On the other hand, even in WT mice, a slight increase was observed by the HC-C60 treatment.

これらの結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＰＰにおけるＩＦＮ－γ産生性細胞の増殖促進作用を有することが確認された。 From these results, it was confirmed that HK-C60 has an effect of promoting the proliferation of IFN-γ-producing cells in PP.

（２－５）ＨＫ－Ｃ６０非摂取マウスから単離した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＨＫ－Ｃ６０処理によるサイトカイン産生促進作用の評価
試験群１及び３（対照飼料給餌）のマウスから単離したＢＭＤＣを、ＨＫ－Ｃ６０の存在下又は非存在下で培養して刺激することにより、ＨＫ－Ｃ６０処理によるサイトカイン産生促進作用を評価した。図９は、サイトカインであるＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを産生する細胞を測定した結果、並びに抗原提示に係る補助シグナル分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子であるＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅを発現する細胞を測定した結果を示す。 (2-5) Evaluation of Cytokine Production Promoting Effect of Bone Marrow-Derived Dendritic Cells (BMDC) Isolated from HK-C60 Non-Ingested Mice by HK-C60 Treatment Isolated from Test Group 1 and 3 (Control Feed Feeding) Mice By culturing and stimulating the BMDC in the presence or absence of HK-C60, the cytokine production promoting effect of HK-C60 treatment was evaluated. FIG. 9 shows the results of measuring cells producing the cytokines IL-12, IL-6 and TNF-α, as well as the auxiliary signal molecule for antigen presentation and the MHC class II molecules CD80, CD86 and I-A /. The results of measuring the cells expressing IE are shown.

図９に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスの結果から、ＨＫ－Ｃ６０処理により、ＢＭＤＣにより炎症性サイトカインであるＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを産生する細胞が有意に増加し、さらに抗原提示に係る細胞表面発現タンパク質であるＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩ－Ａ／Ｉ－Ｅを発現する細胞が有意に増加した。一方、ＷＴマウスでは、ＨＫ－Ｃ６０処理により、サイトカインが増加したが、細胞表面発現タンパク質は減少した。 As shown in FIG. 9, from the results of IL-18KO mice, HK-C60 treatment significantly increased the number of cells producing the inflammatory cytokines IL-12, IL-6 and TNF-α by BMDC, and further increased the antigen. The number of cells expressing the cell surface expressed proteins CD80, CD86 and IA / IE according to the presentation was significantly increased. On the other hand, in WT mice, treatment with HK-C60 increased cytokines but decreased cell surface expression proteins.

これらの結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＢＭＤＣに対して、少なくともＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αといったサイトカインの産生促進作用を有することがわかった。 From these results, it was found that HK-C60 has an action of promoting the production of cytokines such as IL-12, IL-6 and TNF-α on BMDC.

（２－６）ＨＫ－Ｃ６０非摂取マウスから単離した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＨＫ－Ｃ６０処理による抗原取込み促進作用の評価
試験群１及び３（対照飼料給餌）のマウスから単離したＢＭＤＣを、ＨＫ－Ｃ６０の存在下又は非存在下で、抗原を含む培地を用いて培養することにより、ＨＫ－Ｃ６０処理による抗原取込み促進作用を評価した。図１０は、抗原取込み量を測定した結果を示す。 (2-6) Evaluation of antigen uptake promoting effect of bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) isolated from HK-C60 non-ingestion mice by HK-C60 treatment Isolated from mice of test groups 1 and 3 (control feed feeding) By culturing the resulting BMDC in the presence or absence of HK-C60 using a medium containing an antigen, the antigen uptake promoting effect of the HK-C60 treatment was evaluated. FIG. 10 shows the results of measuring the amount of antigen uptake.

図１０に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウス及びＷＴマウスの両方の結果から、ＨＫ－Ｃ６０処理により、ＢＭＤＣによる抗原の取込み能が増加した。 As shown in FIG. 10, from the results of both IL-18KO mice and WT mice, the HK-C60 treatment increased the antigen uptake ability by BMDC.

この結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＢＭＤＣに対して、抗原取込み促進作用を有することがわかった。 From this result, it was found that HK-C60 has an antigen uptake promoting action on BMDC.

（２－７）ＨＫ－Ｃ６０非摂取マウスから単離した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＨＫ－Ｃ６０処理による抗原提示促進作用の評価
試験群１及び３（対照飼料給餌）のマウスから単離したＢＭＤＣを、ＨＫ－Ｃ６０の存在下又は非存在下で、ＤＯ１１．１０ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び抗原を含む培地を用いて培養することにより、ＨＫ－Ｃ６０処理による抗原提示促進作用を評価した。図１１は、ＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合を測定した結果を示す。 (2-7) Evaluation of antigen presentation promoting effect of bone marrow-derived dendritic cells (BMDC) isolated from HK-C60 non-ingestion mice by HK-C60 treatment Isolated from mice of test groups 1 and 3 (control feed feeding) The resulting BMDC was cultured in the presence or absence of HK-C60 using a medium containing DO11.10CD4 ⁺ T cells and an antigen to evaluate the antigen presentation promoting effect of HK-C60 treatment. FIG. 11 shows the results of measuring the number and proportion of IFN-γ-producing cells.

図１１に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウス及びＷＴマウスの両方の結果から、ＨＫ－Ｃ６０処理により、ＢＭＤＣによる抗原提示により、ＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合が増加した。 As shown in FIG. 11, from the results of both IL-18KO mice and WT mice, HK-C60 treatment increased the number and proportion of IFN-γ-producing cells by antigen presentation by BMDC.

この結果から、ＨＫ－Ｃ６０は、ＢＭＤＣに対して、抗原提示促進作用を有することがわかった。 From this result, it was found that HK-C60 has an antigen presentation promoting action on BMDC.

（２－８）補助的な各種評価
試験群１～４のマウスから採取したＬＰ中のＣＤ４５^＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーで測定した結果を図１２に示す。図１２が示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスは、対照飼料ではＣＤ４５^＋Ｔ細胞の数が少なかったが、ＨＫ－Ｃ６０を給餌することによりＣＤ４５^＋Ｔ細胞が増加することが確認された。 (2-8) Various auxiliary evaluations The results of flow cytometric measurement of CD45 ⁺ T cells in LP collected from mice of test groups 1 to 4 are shown in FIG. As shown in FIG. 12, IL-18KO mice had a small number of CD45 ⁺ T cells in the control diet, but it was confirmed that feeding HK-C60 increased the number of CD45 ⁺ T cells.

試験群１及び３並びに試験群５及び６のマウスから単離したＬＰ細胞の割合を測定した結果を図１３に示す。図１３が示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスは、老齢化することによりＣＤ３^＋Ｔ細胞の割合が減少することが確認された。 The results of measuring the proportion of LP cells isolated from the mice of the test groups 1 and 3 and the test groups 5 and 6 are shown in FIG. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the proportion of CD3 ⁺ T cells in IL-18KO mice decreased with aging.

試験群１～４のマウスについての粘膜固有層、パイエル板、脾臓及び末梢血のＴ細胞の数及び割合を測定した結果を図１４に示す。図１４が示すとおり、固定粘膜層（ＬＰ）においては、ＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の数及び割合は増えたものの、ＦＯＸＰ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞については増えなかった。パイエル板（ＰＰ）においては、ＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合は増えたのと同様にＣＤ４^＋Ｔ細胞は増えたが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞はそのような傾向が認められなかった。また、末梢血及び脾臓においては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞の数及び割合について、ほとんど変化が認められなかった。 The results of measuring the number and proportion of T cells in the lamina propria, Peyer's patch, spleen and peripheral blood of the mice of the test groups 1 to 4 are shown in FIG. As shown in FIG. 14, in the fixed mucosal layer (LP), the number and proportion of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells increased, but not for FOXP3 ⁺ CD4 ⁺ T cells. In Peyer's patches (PP), CD4 ⁺ T cells increased as well as the number and proportion of IFN-γ-producing cells increased, but CD8 ⁺ T cells did not show such a tendency. In addition, in peripheral blood and spleen, almost no change was observed in the number and proportion of CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells.

試験群１～４のマウスから単離したパイエル板（ＰＰ）細胞の数を測定した結果を図１５に示す。図１５に示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスについて、ＨＫ－Ｃ６０摂取の有無によってＰＰ細胞の数は変化しなかった。 The results of measuring the number of Peyer's patch (PP) cells isolated from the mice of the test groups 1 to 4 are shown in FIG. As shown in FIG. 15, in IL-18KO mice, the number of PP cells did not change depending on the presence or absence of ingestion of HK-C60.

試験群１～４のマウスから単離したＬＰ細胞について、ＣＤ１０３の発現を測定した。ＣＤ１０３は、Ｔ細胞において、粘膜Ｔ細胞又は活性型Ｔ細胞又は接着因子のマーカーである。結果を図１６に示す。図１６が示すとおり、ＩＬ－１８ＫＯマウスは、ＨＫ－Ｃ６０を給餌することによりＣＤ１０３^＋ＣＤ４５^＋Ｔ細胞が増加することが確認された。 The expression of CD103 was measured in LP cells isolated from the mice of test groups 1 to 4. CD103 is a marker for mucosal T cells or active T cells or adhesion factors in T cells. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 16, it was confirmed that IL-18KO mice increased CD103 ⁺ CD45 ⁺ T cells by feeding HK-C60.

３．ＨＫ－Ｃ６０が有する作用
以上の結果より、ＨＫ－Ｃ６０は以下の作用を有することが確認された：粘膜固有層におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞といったＴ細胞の増殖促進作用；粘膜固有層における減少したＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞といったＴ細胞を通常の量及び割合に回復する作用；パイエル板におけるＩＦＮ－γ産生性細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖促進作用；パイエル板における減少したＩＦＮ－γ産生性細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を通常の量及び割合に回復する作用；パイエル板細胞に対してＴ細胞刺激感受性を高める作用；ＢＭＤＣにおけるＩＬ－１２、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αといったサイトカインの産生促進作用；ＢＭＤＣにおける抗原取込み促進作用及び抗原提示促進作用。 3. 3. Actions of HK-C60 From the above results, it was confirmed that HK-C60 has the following actions: CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells in the mucosal intrinsic layer. T cell proliferation promoting action; action to restore T cells such as reduced CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells in the mucosal intrinsic layer to normal amounts and proportions; Proliferation-promoting action of IFN-γ-producing cells and CD4 ⁺ T cells in; recovery of decreased IFN-γ-producing cells and CD4 ⁺ T cells in the Pier plate to normal amounts and proportions; Action to enhance T cell stimulation sensitivity; Action to promote production of cytokines such as IL-12, IL-6 and TNF-α in BMDC; Action to promote antigen uptake and action to promote antigen presentation in BMDC.

Claims (6)

ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管内Ｔ細胞の増加促進用組成物又は腸管内Ｔ細胞の活性化用組成物。 Lactococcus lactis subspecies cremoris ( Lactococcus lactis subsp. Cremoris ) cells, bacterial cell components and cultures, and at least one active ingredient selected from the group consisting of treatments thereof, which promotes the growth of T cells in the intestinal tract. Composition or composition for activating T cells in the intestinal tract. 前記腸管内Ｔ細胞は、粘膜固有層におけるＣＤ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。 The T cell in the intestinal tract is at least one T cell selected from the group consisting of CD3 ⁺ T cells, CD4 ⁺ cells, CD8 ⁺ T cells and IFN-γ-producing cells in the lamina propria, according to claim 1. The composition described. 前記腸管内Ｔ細胞は、パイエル板におけるＣＤ４^＋細胞及びＩＦＮ－γ産生性細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種のＴ細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the intestinal T cells are at least one T cell selected from the group consisting of CD4 ⁺ cells and IFN-γ-producing cells in Peyer's patches. ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管内免疫賦活用組成物。 An intestinal immunostimulatory composition comprising cells, bacterial cell components and cultures of Lactococcus lactis subspecies cremoris and at least one active ingredient selected from the group consisting of treatments thereof. .. ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含む、腸管の抗老化用組成物。 Lactococcus lactis subspecies cremoris ( Lactococcus lactis subsp. Cremoris ) cell, bacterial cell component and culture, and at least one active ingredient selected from the group consisting of treatments thereof, an anti-aging composition of the intestinal tract. .. 前記ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスは、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ クレモリスＣ６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ－０８５５９）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

The composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the Lactococcus lactis subspecies cremoris is a Lactococcus lactis subspecies cremoris C60 strain (FERM BP-08559).

Images