JP2022059418A - 重合体、検査薬、アナライト濃度測定法、及び、アナライト濃度測定装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、結合パートナーを導入することで良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供する。また、該重合体を含む検査薬、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供する。【解決手段】凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する重合体。【選択図】なし
Description
本発明は、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、結合パートナーを導入することで良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体に関する。また、本発明は、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置に関する。
蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法(蛍光法)は、簡便かつ高感度な測定が可能であり、イムノプレートリーダ等の分析装置を使用して自動化が可能なことから、臨床検査をはじめ多くの分野で利用されている。蛍光法は、高効率、簡便さ等の点で極めて優れている。
しかしながら、蛍光法では、測定対象物質に起因しない、いわゆるバックグラウンド蛍光を生じることがある。バックグラウンド蛍光は、試料中の測定対象物質以外の内在性物質が自家蛍光を有するために生じる場合、試料中のタンパク質等に非特異的に付着した蛍光色素から生じる場合、測定対象物質が注入されている容器(プレート等)から生じる場合等がある。いずれの場合も、感度、特異性に影響を与えるため、蛍光法に共通した問題点であり、バックグラウンド蛍光の影響を抑制して測定する方法が要求されていた。
特許文献1には、凝集誘起発光特性を有する蛍光性糖鎖プローブを用いる方法が開示されている。また、特許文献2には、臨界ミセル濃度以上のミセル構造を形成する物質とAIE効果を惹起する化合物を混合した組成物に試料物質を混合する検出方法が開示されている。更に、特許文献3には、シロールデンドリマーを含む検出試薬を用いる検出方法が開示されている。
しかしながら、これらの方法では、バックグラウンド蛍光を充分に抑制できないという問題がある。
更に、これらの方法では、測定対象物質であるアナライトが糖鎖と相互作用するもの、ウイルスや微生物に限定されるという問題がある。
しかしながら、これらの方法では、バックグラウンド蛍光を充分に抑制できないという問題がある。
更に、これらの方法では、測定対象物質であるアナライトが糖鎖と相互作用するもの、ウイルスや微生物に限定されるという問題がある。
特許文献4には、コア粒子と、コア粒子上に設けられた、アナライトと結合する結合パートナーと、結合パートナーにアナライトが結合すると凝集蛍光する凝集蛍光材料とを備える凝集蛍光材料含有粒子が開示されている。また、特許文献5には、合成高分子と凝集発光性材料とを含み、アナライトと結合する結合パートナーを表面に有する凝集発光性材料含有粒子が開示されている。このような凝集蛍光材料含有粒子を用いれば、バックグラウンド蛍光を抑制しながら、ある程度良好な検出感度でアナライトの測定を行うことが可能である。
一方、従来の凝集発光性材料を用いた診断薬は、高分子(重合体やグラフト鎖)に結合パートナーを結合させる際に縮合剤が必要である。しかしながら、高分子上に存在する凝集発光性分子(AIE分子)にカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基等の反応性官能基がある場合、縮合剤によってAIE分子と結合パートナーが直接結合し、AIE分子の分子運動が束縛されることでバックグラウンド蛍光が生じ、検出感度が悪くなるという問題がある。このため、バックグラウンド蛍光を抑制する効果、及び、アナライトの検出感度に更に優れる測定方法が求められている。
また、原子力発電において、ウランやプルトニウムの核***反応が生じた際に、放射性同位体であるセシウム137(137Cs)やセシウム134(134Cs)等が生成する場合がある。
従来、放射性物質の測定には、ゲルマニウム半導体検出器や、NaI(TI)シンチレーションスペクトロメータ等が必要であったが、装置が高額な上、操作も煩雑で測定に労力が掛かっていた。そのため、低コストかつ簡易に放射性物質を測定できる方法が求められている。
従来、放射性物質の測定には、ゲルマニウム半導体検出器や、NaI(TI)シンチレーションスペクトロメータ等が必要であったが、装置が高額な上、操作も煩雑で測定に労力が掛かっていた。そのため、低コストかつ簡易に放射性物質を測定できる方法が求められている。
本発明は、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、結合パートナーを導入することで良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することを目的とする。また、本発明は、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することを目的とする。
本発明は、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する重合体である。
以下に本発明を詳述する。
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する重合体を用いることを検討した。その結果、該重合体に結合パートナーを導入して得られる重合体では、凝集誘起発光性基と結合パートナーとが直接結合することにより生じるバックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の重合体に結合パートナーを導入して得られる重合体は、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合の散乱光のような問題をほとんど生じさせないため、バックグラウンド蛍光を抑制する効果に優れるものとなる。また、反応に関与できる部分が空間的に大きい重合体の絡み合いに伴って凝集誘起発光性基が近接して蛍光を発するものであるため、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合よりも高い検出感度を示すことができる。更に、凝集誘起発光性基と結合パートナーとが直接結合することを抑制できるため、より高い検出感度を示すことができる。
本発明の重合体に結合パートナーを導入して得られる重合体は、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合の散乱光のような問題をほとんど生じさせないため、バックグラウンド蛍光を抑制する効果に優れるものとなる。また、反応に関与できる部分が空間的に大きい重合体の絡み合いに伴って凝集誘起発光性基が近接して蛍光を発するものであるため、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合よりも高い検出感度を示すことができる。更に、凝集誘起発光性基と結合パートナーとが直接結合することを抑制できるため、より高い検出感度を示すことができる。
本発明の重合体は、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する。
なお、本明細書において「凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する」とは、上記凝集誘起発光性基、及び、上記結合パートナーと自発的に結合する官能基が重合体骨格上に化学結合している場合のみならず、これらを有する化合物が重合体骨格と物理的に接している場合も含む。好ましくは化学結合している場合である。
なお、本明細書において「凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有する」とは、上記凝集誘起発光性基、及び、上記結合パートナーと自発的に結合する官能基が重合体骨格上に化学結合している場合のみならず、これらを有する化合物が重合体骨格と物理的に接している場合も含む。好ましくは化学結合している場合である。
上記アナライトに結合可能な結合パートナーとは、アナライトとの親和性を有し、アナライトと特異的に相互作用する物質を意味する。上記相互作用は共有結合であってもよく、非共有結合的な相互作用であってもよい。上記非共有結合的な相互作用としては、疎水性相互作用、静電的相互作用、ファンデルワールス力、水素結合、配位結合、イオン結合等が挙げられる。
上記アナライトは特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテン等、理論的に測定法により測定可能な分子が挙げられる。具体的には例えば、CRP(C反応性タンパク質)、Lp(a)(リポプロテイン(a))、MMP3(マトリクスメタロプロテイナーゼ3)、抗CCP(環状シトルリン化ペプチド)抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗原抗体、RPR、IV型コラーゲン、PSA、AFP、CEA、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)、NT-proBNP、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンC、RF(リウマチ因子)、CA-RF、KL-6、PIVKA-II、FDP、Dダイマー、SF(可溶性フィブリン)、TAT(トロンビン-アンチトロンビンIII複合体)、PIC、PAI、XIII因子、ペプシノーゲンI、ペプシノーゲンII、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリン等が挙げられる。
また、上記アナライトとしては、放射性物質が挙げられる。
上記放射性物質としては、例えば、コバルト60(60Co)、ストロンチウム90(90Sr)、放射性ジルコニウム、テクネチウム99(99Tc)、ルテニウム106(106Ru)、放射性ヨウ素、放射性セシウム、放射性トリウム、放射性ウラン、放射性プルトニウム、放射性アメリシウム、放射性キュリウム等が挙げられる。
上記放射性ジルコニウムとしては、例えば、ジルコニウム93(93Zr)、ジルコニウム95(95Zr)等が挙げられる。
上記放射性ヨウ素としては、例えば、ヨウ素129(129I)、ヨウ素131(131I)等が挙げられる。
上記放射性セシウムとしては、例えば、セシウム137(137Cs)やセシウム134(134Cs)等が挙げられる。
上記放射性トリウムとしては、例えば、トリウム230(230Th)等が挙げられる。
上記放射性ウランとしては、例えば、ウラン235(235U)やウラン238(238U)等が挙げられる。
上記放射性プルトニウムとしては、例えば、プルトニウム240(240Pu)等が挙げられる。
上記放射性アメリシウムとしては、例えば、アメリシウム242(242Am)等が挙げられる。
上記放射性キュリウムとしては、例えば、キュリウム244(244Cm)等が挙げられる。
上記放射性物質としては、例えば、コバルト60(60Co)、ストロンチウム90(90Sr)、放射性ジルコニウム、テクネチウム99(99Tc)、ルテニウム106(106Ru)、放射性ヨウ素、放射性セシウム、放射性トリウム、放射性ウラン、放射性プルトニウム、放射性アメリシウム、放射性キュリウム等が挙げられる。
上記放射性ジルコニウムとしては、例えば、ジルコニウム93(93Zr)、ジルコニウム95(95Zr)等が挙げられる。
上記放射性ヨウ素としては、例えば、ヨウ素129(129I)、ヨウ素131(131I)等が挙げられる。
上記放射性セシウムとしては、例えば、セシウム137(137Cs)やセシウム134(134Cs)等が挙げられる。
上記放射性トリウムとしては、例えば、トリウム230(230Th)等が挙げられる。
上記放射性ウランとしては、例えば、ウラン235(235U)やウラン238(238U)等が挙げられる。
上記放射性プルトニウムとしては、例えば、プルトニウム240(240Pu)等が挙げられる。
上記放射性アメリシウムとしては、例えば、アメリシウム242(242Am)等が挙げられる。
上記放射性キュリウムとしては、例えば、キュリウム244(244Cm)等が挙げられる。
上記結合パートナーは上記アナライトの種類に応じて適宜選ばれ、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ハプテン等が挙げられる。
また、上記アナライトが上記放射性物質である場合、上記結合パートナーは、直鎖状ポリエーテル類、環状エーテル類、カリックスアレーン類、大環状複素環化合物類、シクロデキストリン類、テトラフェニルホウ酸類、及び、これらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物であることが好ましく、下記式(1)で表される化合物であることがより好ましい。
特に、本発明の重合体は結合パートナーを導入することにより臨床検査薬に好適に用いることができるようになることから、上記結合パートナーは、抗体又は抗原であることが好ましい。
上記アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基とは、結合パートナー上に存在する官能基との接触により生じる化学反応によって共有結合を形成できる官能基を意味する。
本発明の重合体は、上記アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有することで、結合パートナー上の官能基及び上記重合体上の官能基のみで反応が進行するため、縮合剤を添加することなく、結合パートナーを導入することができる。このため、凝集誘起発光性基と結合パートナーとが直接結合することにより生じるバックグラウンド蛍光を抑制することができる。
本発明の重合体は、上記アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有することで、結合パートナー上の官能基及び上記重合体上の官能基のみで反応が進行するため、縮合剤を添加することなく、結合パートナーを導入することができる。このため、凝集誘起発光性基と結合パートナーとが直接結合することにより生じるバックグラウンド蛍光を抑制することができる。
上記アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基としては、例えば、酸無水物、活性エステル基、酸ハロゲン化物基、トシル基、エポキシ基等が挙げられる。
上記酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、酢酸・安息香酸無水物、酢酸・プロピオン酸無水物等のカルボン酸無水物が挙げられる。
上記活性エステル基としては、スクシンイミジルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、4-ニトロフェニルオキシカルボニル基等が挙げられる。
上記酸ハロゲン化物基としては、例えば、カルボン酸フッ化物基、カルボン酸塩化物基、カルボン酸臭化物基、カルボン酸ヨウ化物基等が挙げられる。
上記酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、酢酸・安息香酸無水物、酢酸・プロピオン酸無水物等のカルボン酸無水物が挙げられる。
上記活性エステル基としては、スクシンイミジルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、4-ニトロフェニルオキシカルボニル基等が挙げられる。
上記酸ハロゲン化物基としては、例えば、カルボン酸フッ化物基、カルボン酸塩化物基、カルボン酸臭化物基、カルボン酸ヨウ化物基等が挙げられる。
上記重合体骨格は、鎖状又は網状であることが好ましく、重合体同士が絡み合いやすく、かつ、より高い検出感度を示すことができることから、鎖状であることがより好ましい。
上記重合体骨格の由来となる重合性単量体としては、例えば、エチレン性不飽和基を有する重合性単量体等が挙げられる。
上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体としては、例えば、カルボキシル基含有単官能モノマー、水酸基含有単官能モノマー、水酸基含有多官能モノマー、アミノ基含有単官能モノマー、アミノ基含有多官能モノマー、アミド基含有単官能モノマー、アミド基含有多官能モノマー、スルホン酸基含有単官能モノマー等が挙げられる。
上記カルボキシル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、β-カルボキシエチル(メタ)アクリレート、2-(メタ)アクリロイロキシエチルコハク酸等が挙げられる。
上記水酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシプロピル、4-ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基含有多官能モノマーとしては、例えば、グリセリンジ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有単官能モノマーとしては、例えば、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有多官能モノマーとしては、例えば、PEG-NH2、PEG-NHS等が挙げられる。
上記アミド基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド、N-メチロール(メタ)アクリルアミド、イソプロピル(メタ)アクリルアミド、富士フイルム社製のスルホベタインモノマーFAM-101等が挙げられる。
上記アミド基含有多官能モノマーとしては、例えば、N,N’-メチレンビス(メタ)アクリルアミド、富士フイルム社製の多官能アクリルアミドモノマーFAM-401、301、201、402等が挙げられる。
上記スルホン酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、2-(メタ)アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、2-(メタ)アクリロイロキシエチルアシッドホスフェート、p-スチレンスルホン酸塩等が挙げられる。
これらは単独で用いられてもよいし、2種以上が組み合わせて用いられてもよい。
また、本発明の重合体における架橋体構造は、上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体として挙げた多官能モノマーを共重合することで得られる他、カルボキシル基や水酸基を用いた分子内架橋(脱水縮合)によっても得ることができる。
なかでも、(メタ)アクリル酸、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリルアミド、N-メチロール(メタ)アクリルアミド、N,N’-メチレンビス(メタ)アクリルアミドが好ましい。
本明細書において上記「(メタ)アクリル」は、アクリル又はメタクリルを意味し、上記「(メタ)アクリレート」は、アクリレート又はメタクリレートを意味する。
上記重合体骨格の由来となる重合性単量体としては、例えば、エチレン性不飽和基を有する重合性単量体等が挙げられる。
上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体としては、例えば、カルボキシル基含有単官能モノマー、水酸基含有単官能モノマー、水酸基含有多官能モノマー、アミノ基含有単官能モノマー、アミノ基含有多官能モノマー、アミド基含有単官能モノマー、アミド基含有多官能モノマー、スルホン酸基含有単官能モノマー等が挙げられる。
上記カルボキシル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸、β-カルボキシエチル(メタ)アクリレート、2-(メタ)アクリロイロキシエチルコハク酸等が挙げられる。
上記水酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシプロピル、4-ヒドロキシブチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基含有多官能モノマーとしては、例えば、グリセリンジ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有単官能モノマーとしては、例えば、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有多官能モノマーとしては、例えば、PEG-NH2、PEG-NHS等が挙げられる。
上記アミド基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリルアミド、N-メチロール(メタ)アクリルアミド、イソプロピル(メタ)アクリルアミド、富士フイルム社製のスルホベタインモノマーFAM-101等が挙げられる。
上記アミド基含有多官能モノマーとしては、例えば、N,N’-メチレンビス(メタ)アクリルアミド、富士フイルム社製の多官能アクリルアミドモノマーFAM-401、301、201、402等が挙げられる。
上記スルホン酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、2-(メタ)アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、2-(メタ)アクリロイロキシエチルアシッドホスフェート、p-スチレンスルホン酸塩等が挙げられる。
これらは単独で用いられてもよいし、2種以上が組み合わせて用いられてもよい。
また、本発明の重合体における架橋体構造は、上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体として挙げた多官能モノマーを共重合することで得られる他、カルボキシル基や水酸基を用いた分子内架橋(脱水縮合)によっても得ることができる。
なかでも、(メタ)アクリル酸、(メタ)アクリル酸2-ヒドロキシエチル、(メタ)アクリルアミド、N-メチロール(メタ)アクリルアミド、N,N’-メチレンビス(メタ)アクリルアミドが好ましい。
本明細書において上記「(メタ)アクリル」は、アクリル又はメタクリルを意味し、上記「(メタ)アクリレート」は、アクリレート又はメタクリレートを意味する。
上記重合体骨格上に上記結合パートナーと自発的に結合する官能基を導入するための重合性単量体としては、例えば、不飽和酸無水物、活性エステル基含有単官能モノマー、酸ハロゲン化物基含有単官能モノマー、トシル基含有単官能モノマー、エポキシ基含有単官能モノマー等が挙げられる。
上記不飽和酸無水物としては、例えば、マレイン酸無水物、イタコン酸無水物、2-Propenoic acid,tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl ester、2-Propenoic acid,(tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl)methyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,(tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl)methyl ester等のエチレン性不飽和カルボン酸無水物が挙げられる。
上記活性エステル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸N-スクシンイミジル、(メタ)アクリル酸ペンタフルオロフェニル、(メタ)アクリル酸4-ニトロフェニル等が挙げられる。
上記酸ハロゲン化物基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸クロリド等が挙げられる。
上記トシル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸トシル、2-Propenoic acid,2-[[(4-Methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,2-[[(4-Methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl ester等が挙げられる。
上記エポキシ基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸グリシジル等が挙げられる。
上記官能基を導入するための重合体単量体の使用割合の好ましい下限は1重量%、より好ましい下限は5重量%、好ましい上限は100重量%、より好ましい上限は90重量%である。
上記不飽和酸無水物としては、例えば、マレイン酸無水物、イタコン酸無水物、2-Propenoic acid,tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl ester、2-Propenoic acid,(tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl)methyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,(tetrahydro-2,5-dioxo-3-furanyl)methyl ester等のエチレン性不飽和カルボン酸無水物が挙げられる。
上記活性エステル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸N-スクシンイミジル、(メタ)アクリル酸ペンタフルオロフェニル、(メタ)アクリル酸4-ニトロフェニル等が挙げられる。
上記酸ハロゲン化物基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸クロリド等が挙げられる。
上記トシル基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸トシル、2-Propenoic acid,2-[[(4-Methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl ester、2-Propenoic acid,2-Methyl,2-[[(4-Methylphenyl)sulfonyl]oxy]ethyl ester等が挙げられる。
上記エポキシ基含有単官能モノマーとしては、例えば、(メタ)アクリル酸グリシジル等が挙げられる。
上記官能基を導入するための重合体単量体の使用割合の好ましい下限は1重量%、より好ましい下限は5重量%、好ましい上限は100重量%、より好ましい上限は90重量%である。
また、必要に応じてスチレン、(メタ)アクリル酸メチル等の他の単量体を共重合してもよい。上記他の単量体を共重合する場合の該他の単量体の使用割合の好ましい上限は50重量%、より好ましい上限は30重量%、更に好ましい上限は10重量%である。
上記重合体骨格は、親水性基を含むことが好ましい。上記重合体骨格が親水性基を含むものであることにより、結合パートナーを導入して得られる重合体が水への溶解性に優れるものとなり、バックグラウンド蛍光の低減、及び、アナライトと結合パートナーとの衝突頻度が増加することによる重合体の凝集が起こりやすくなって上記凝集誘起発光性基による蛍光強度がより高いものとなる。
上記重合体骨格が親水性基を含む場合の該親水性基としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、及び、スルホン酸基からなる群より選択される少なくとも1種の基が好ましく、水酸基、カルボキシル基、及び、アミノ基からなる群より選択される少なくとも1種の基がより好ましい。
上記凝集誘起発光性基とは、当該基の分子運動が抑制されていない状態では非発光性であるが、当該基部分の凝集、空間的制約、及び、周囲分子との相互作用等により当該基の分子運動が大幅に抑制され、無放射失活経路が阻害されることで蛍光を発する基である。
上記凝集誘起発光性基は、親水性基を含むものであることが好ましい。上記凝集誘起発光性基が親水性基を含むものであることにより、結合パートナーを導入して得られる重合体が水への溶解性に優れるものとなり、バックグラウンド蛍光の低減、及び、アナライトと結合パートナーとの衝突頻度が増加することによる重合体の凝集が起こりやすくなって上記凝集誘起発光性基による蛍光強度がより高いものとなる。
上記凝集誘起発光性基が親水性基を含む場合の該親水性基としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、及び、スルホン酸基からなる群より選択される少なくとも1種の基が好ましく、水酸基、カルボキシル基、及び、アミノ基からなる群より選択される少なくとも1種の基がより好ましい。
上記凝集誘起発光性基は、具体的には、下記式(2)で表される基又は下記式(3)で表される基であることが好ましい。
式(2)中、Eは、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、R1及びR2は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数1~6の飽和若しくは不飽和炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホン基、スルホン酸ナトリウム基、スルホプロピル基、又は、ニトロ基を示す。R3~R6のいずれか1つは結合手であり、R3~R6のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。
式(3)中、R7~R10のいずれか1つは結合手であり、R7~R10のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数1~6の飽和若しくは不飽和炭化水素基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホン基、スルホン酸ナトリウム基、スルホプロピルエーテル基、又は、ニトロ基を示す。
上記凝集誘起発光性基は、凝集誘起発光性化合物を重合体骨格の由来となる重合性単量体と反応させることによって上記重合体骨格上に導入することができる。
上記凝集誘起発光性化合物は、上記重合体骨格上に共重合されていてもよく、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、エポキシ基等の官能基を介して化学結合されていてもよい。
また、上記凝集誘起発光性基は、上記凝集誘起発光性化合物が重合体骨格と物理的に接している状態とすることによっても、上記重合体骨格上に導入することができる。
上記凝集誘起発光性化合物は、上記重合体骨格上に共重合されていてもよく、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、エポキシ基等の官能基を介して化学結合されていてもよい。
また、上記凝集誘起発光性基は、上記凝集誘起発光性化合物が重合体骨格と物理的に接している状態とすることによっても、上記重合体骨格上に導入することができる。
本発明の重合体における上記凝集誘起発光性基の含有量は、好ましい下限が0.01モル%、より好ましい下限が0.2モル%、好ましい上限が10モル%、より好ましい上限が7モル%である。
上記凝集誘起発光性基の含有量とは、上記重合体を構成する構成単位全体に占める上記凝集誘起発光性基を有する構成単位の割合を意味する。
上記凝集誘起発光性基の含有量は、例えば、NMRにより測定することができる。
上記凝集誘起発光性基の含有量とは、上記重合体を構成する構成単位全体に占める上記凝集誘起発光性基を有する構成単位の割合を意味する。
上記凝集誘起発光性基の含有量は、例えば、NMRにより測定することができる。
上記凝集誘起発光性化合物としては、例えば、テトラフェニルエチレン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、ケトイミンホウ素錯体誘導体、ジイミンホウ素錯体誘導体、アミノマレイミド誘導体、アミノベンゾピロキサンテン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体等が挙げられる。なかでも、入手容易性等の観点から、テトラフェニルエチレン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体が好ましく、テトラフェニルエチレン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体がより好ましい。特に好ましくは、テトラフェニルエチレン誘導体である。
上記テトラフェニルエチレン誘導体としては、フェニル基上に官能基が置換していてもよいテトラフェニルエチレンが挙げられる。上記テトラフェニルエチレン誘導体は、アルキレンオキサイドによって変性されたものであってもよい。具体的には例えば、テトラフェニルエチレン、ポリエチレングリコール変性テトラフェニルエチレン、4-(1,2,2-トリフェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート、4-(1,2,2-トリフェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート、p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート及びその塩、1-(4-ブロモフェニル)-1,2,2-トリフェニルエチレン、テトラキス(4-ヒドロキシフェニル)エチレン、1,2-Bis[4-(azidomethyl)phenyl]-1,2-diphenylethene、1,2-Bis[4-(bromomethyl)phenyl]-1,2-diphenylethene、1,2-Bis(4-methoxyphenyl)-1,2-diphenylethene、4,4’-Bis(1,2,2-triphenylvinyl)-1,1’-biphenyl、[(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]diboronic acid、4,4’-(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)dibenzoic acid、2,2’-[[(1,2-Diphenyl-1,2-ethenediyl]di-4,1-phenylene]bis[4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane]、1-{4-[1,2-Diphenyl-2-(p-tolyl)vinyl]phenyl}-1H-pyrrole-2,5-dione、1-Ethynyl-4-(1,2,2-triphenylethenyl)benzene、Sodium 3,3’-{[(1,2-diphenylethene-1,2-diyl)bis(4,1-phenylene)]bis(oxy)}bis(propane-1-sulfonate)、4-(1,2,2-Triphenylethenyl)benzaldehyde、B-[4-(1,2,2-Triphenylethenyl)phenyl]boronic acid等が挙げられる。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が1つのものとしては、4-((4-ヒドロキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が2つのものとしては、4-(ビス(4-ヒドロキシフェニル)フェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、2つの4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-ヒドロキシフェニル)ビニル)フェニル(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が1つのものとしては、4-((4-ヒドロキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が2つのものとしては、4-(ビス(4-ヒドロキシフェニル)フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、2つの4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-ヒドロキシフェニル)ビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が1つのものとしては、4-((4-カルボキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が2つのものとしては、4-(ビス(4-カルボキシフェニル)フェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、2つの4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-カルボキシフェニル)ビニル)フェニル(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が1つのものとしては、4-((4-カルボキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が2つのものとしては、4-(ビス(4-カルボキシフェニル)フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、2つの4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-カルボキシフェニル)ビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレートが挙げられる。
なかでも、テトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート及びその塩、テトラキス(4-ヒドロキシフェニル)エチレン、4,4’-(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)dibenzoic acid、4,4’-(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)diphenolが好ましい。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が1つのものとしては、4-((4-ヒドロキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が2つのものとしては、4-(ビス(4-ヒドロキシフェニル)フェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、2つの4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-ヒドロキシフェニル)ビニル)フェニル(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が1つのものとしては、4-((4-ヒドロキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が2つのものとしては、4-(ビス(4-ヒドロキシフェニル)フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、2つの4-ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうち水酸基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-ヒドロキシフェニル)ビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が1つのものとしては、4-((4-カルボキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が2つのものとしては、4-(ビス(4-カルボキシフェニル)フェニルビニル)フェニル(メタ)アクリレート(なお、2つの4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-カルボキシフェニル)ビニル)フェニル(メタ)アクリレートが挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が1つのものとしては、4-((4-カルボキシフェニル)ジフェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が2つのものとしては、4-(ビス(4-カルボキシフェニル)フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレート(なお、2つの4-カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上4位のいずれにあってもよい)が挙げられる。
上記ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレートのうちカルボキシル基が3つのものとしては、4-(1,2,2-トリス(4-カルボキシフェニル)ビニル)フェニルトリエチレングリコール(メタ)アクリレートが挙げられる。
なかでも、テトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-ヒドロキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコール変性p-カルボキシテトラフェニルエチレン(メタ)アクリレート及びその塩、テトラキス(4-ヒドロキシフェニル)エチレン、4,4’-(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)dibenzoic acid、4,4’-(1,2-Diphenylethene-1,2-diyl)diphenolが好ましい。
上記テトラフェニルシロール誘導体又は上記ヘキサフェニルシロール誘導体としては、例えば、フェニル基上に1~5個の官能基が置換していてもよい1,1,2,3,4,5-ヘキサフェニルシロール、フェニル基上に1~5個の官能基が置換していてもよい2,3,4,5-テトラフェニル-1,1-ジメチルシロール、フェニル基上に1~5個の官能基が置換していてもよい2,3,4,5-テトラフェニル-1,1-ジアリルシロール、フェニル基上に1~5個の官能基が置換していてもよい1-メチル-1,2,3,4,5-ペンタフェニルシロール等が挙げられる。
上記ヘキサフェニルベンゼン誘導体としては、例えば、4つ以上のフェニル基又はフェニル基誘導体により置換されたベンゼン誘導体等が挙げられる。具体的には例えば、ヘキサフェニルシロール、ヘキサフェニルベンゼン等が挙げられる。
上記トリフェニルアミン誘導体としては、例えば、4-(ジ-p-トリアミノ)ベンズアルデヒド等が挙げられる。
特に、上記凝集誘起発光性化合物は、下記式(4)で表される化合物又は下記式(5)で表される化合物であることが好ましい。
式(4)中、Eは、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示す。R11及びR12は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数1~6の飽和若しくは不飽和炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホン基、スルホン酸ナトリウム基、スルホプロピルエーテル基、又は、ニトロ基を示す。R13~R16は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。
式(5)中、R17~R20は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数1~6の飽和若しくは不飽和炭化水素基、アクリロイル基、ポリアルキレンオキサイド基、カルボキシル基、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、スルホン基、スルホン酸ナトリウム基、スルホプロピルエーテル基、又は、ニトロ基を示す。
本発明の重合体は、糖鎖が検体中の物質に想定外に相互作用する場合があることから、糖鎖を有さないことが好ましい。
本発明の重合体は、親水性であることが好ましい。具体的には、本発明の重合体は、溶解性パラメーターが12~25(cal/cc)1/2である液体に溶解、即ち、溶媒和し均一に分散するものであることが好ましい。上記溶解性パラメーターが12~25(cal/cc)1/2である液体に上記重合体が溶解することにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
本発明の重合体は、オリゴマーであってもよいし、ポリマーであってもよい。
また、本発明の重合体は、数平均重合度が20以上7万以下、及び、数平均分子量が2000以上500万以下の少なくともいずれかを満たすことが好ましい。上記数平均重合度及び上記数平均分子量の少なくともいずれかが上記範囲であることにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
上記数平均重合度のより好ましい下限は125、より好ましい上限は14000である。
上記数平均分子量のより好ましい下限は1万、より好ましい上限は100万である。
なお、本明細書において、上記数平均重合度及び上記数平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)で溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる値である。GPCによってポリスチレン換算による上記数平均重合度及び上記数平均分子量を測定する際のカラムとしては、例えば、Shodex LF-804(昭和電工社製)等が挙げられる。
また、本発明の重合体は、数平均重合度が20以上7万以下、及び、数平均分子量が2000以上500万以下の少なくともいずれかを満たすことが好ましい。上記数平均重合度及び上記数平均分子量の少なくともいずれかが上記範囲であることにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
上記数平均重合度のより好ましい下限は125、より好ましい上限は14000である。
上記数平均分子量のより好ましい下限は1万、より好ましい上限は100万である。
なお、本明細書において、上記数平均重合度及び上記数平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)で溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる値である。GPCによってポリスチレン換算による上記数平均重合度及び上記数平均分子量を測定する際のカラムとしては、例えば、Shodex LF-804(昭和電工社製)等が挙げられる。
本発明の重合体を製造する方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。
即ち、まず、溶媒中に、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を導入するための重合性単量体を含む重合性単量体と、凝集誘起発光性化合物と、重合開始剤とを溶解させる。次いで、得られた溶液を加熱しながら撹拌することで、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有する重合体を得ることができる。
また、溶媒中に、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を骨格上に有する重合体と、凝集誘起発光性化合物とを溶解させる。次いで、得られた溶液を加熱しながら又は室温下で撹拌することで、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有する重合体を得ることができる。
即ち、まず、溶媒中に、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を導入するための重合性単量体を含む重合性単量体と、凝集誘起発光性化合物と、重合開始剤とを溶解させる。次いで、得られた溶液を加熱しながら撹拌することで、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有する重合体を得ることができる。
また、溶媒中に、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を骨格上に有する重合体と、凝集誘起発光性化合物とを溶解させる。次いで、得られた溶液を加熱しながら又は室温下で撹拌することで、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有する重合体を得ることができる。
上記溶媒としては、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、水等が挙げられる。
上記重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等の油溶性開始剤、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の水溶性開始剤等が挙げられる。
上記アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を骨格上に有する重合体としては、例えば、ビニルエーテル-無水マレイン酸交互共重合体、ポリグリシジル(メタ)アクリレート、ポリ(メタ)アクリル酸N-スクシンイミジル等が挙げられる。
更に、本発明の重合体の水分散液に、アナライトの種類に応じた結合パートナーを有する化合物を加えて反応させることにより、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーを重合体骨格上に有する重合体を得ることができる。
凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーを重合体骨格上に有する重合体もまた本発明の1つである。
凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーを重合体骨格上に有する重合体もまた本発明の1つである。
別の態様の本発明の重合体は、凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーを重合体骨格上に有する。
上記凝集誘起発光性基、アナライト、アナライトに結合可能な結合パートナーとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
上記凝集誘起発光性基、アナライト、アナライトに結合可能な結合パートナーとしては、上述したものと同様のものが挙げられる。
上記別の態様の本発明の重合体は、上記結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有するものであってもよい。
また、上記別の態様の本発明の重合体は、上記結合パートナーを重合体骨格上のみに有するものであることが好ましい。
また、上記別の態様の本発明の重合体は、上記結合パートナーを重合体骨格上のみに有するものであることが好ましい。
別の態様の本発明の重合体は、糖鎖が検体中の物質に想定外に相互作用する場合があることから、糖鎖を有さないことが好ましい。
別の態様の本発明の重合体は、親水性であることが好ましい。具体的には、本発明の重合体は、溶解性パラメーターが12~25(cal/cc)1/2である液体に溶解、即ち、溶媒和し均一に分散するものであることが好ましい。上記溶解性パラメーターが12~25(cal/cc)1/2である液体に上記重合体が溶解することにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
別の態様の本発明の重合体は、オリゴマーであってもよいし、ポリマーであってもよい。
また、別の態様の本発明の重合体は、数平均重合度が20以上7万以下、及び、数平均分子量が2000以上500万以下の少なくともいずれかを満たすことが好ましい。上記数平均重合度及び上記数平均分子量の少なくともいずれかが上記範囲であることにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
上記数平均重合度のより好ましい下限は125、より好ましい上限は14000である。
上記数平均分子量のより好ましい下限は1万、より好ましい上限は100万である。
なお、本明細書において、上記数平均重合度及び上記数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で溶媒として150mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて測定を行い、キャリブレーション標準(オブアルブミン、ミオグロビン、アプロチニン、ニューロテンシン、アンギオテンシンII)の測定結果から求められる値である。SECによる上記数平均分子量を測定する際のカラムとしては、例えば、AdvanceBio SEC(Agilent Technologies社製)等が挙げられる。
また、別の態様の本発明の重合体は、数平均重合度が20以上7万以下、及び、数平均分子量が2000以上500万以下の少なくともいずれかを満たすことが好ましい。上記数平均重合度及び上記数平均分子量の少なくともいずれかが上記範囲であることにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
上記数平均重合度のより好ましい下限は125、より好ましい上限は14000である。
上記数平均分子量のより好ましい下限は1万、より好ましい上限は100万である。
なお、本明細書において、上記数平均重合度及び上記数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で溶媒として150mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて測定を行い、キャリブレーション標準(オブアルブミン、ミオグロビン、アプロチニン、ニューロテンシン、アンギオテンシンII)の測定結果から求められる値である。SECによる上記数平均分子量を測定する際のカラムとしては、例えば、AdvanceBio SEC(Agilent Technologies社製)等が挙げられる。
別の態様の本発明の重合体は、検査薬に好適に用いられる。別の態様の本発明の重合体を含む検査薬もまた、本発明の1つである。
本発明の検査薬は、臨床検査薬として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、イムノクロマトグラフ法等の生物学的反応を利用した種々の方法に好適に用いることができる。
また、本発明の検査薬は、放射性物質の測定にも好適に用いられる。本発明の検査薬を用いれば、低コストかつ簡易に放射性物質を測定することができる。
また、本発明の検査薬は、放射性物質の測定にも好適に用いられる。本発明の検査薬を用いれば、低コストかつ簡易に放射性物質を測定することができる。
アナライトを含有する試料溶液と、別の態様の本発明の重合体を含有する溶液とを混合して混合液を調製する工程と、上記混合液中の上記別の態様の本発明の重合体から発生する蛍光強度を測定する工程と、アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と上記別の態様の本発明の重合体から発生する蛍光強度とを対比して、上記別の態様の本発明の重合体から発生する蛍光強度と上記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程とを有するアナライト濃度測定法もまた、本発明の1つである。
上記混合液中の上記別の態様の本発明の重合体から発生する蛍光強度を測定する工程では、混合液に励起光を照射する工程、及び、混合液が発する蛍光や燐光等の発光強度の変化量を測定する工程を行うことが好ましい。
本発明のアナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置もまた、本発明の1つである。
本発明のアナライト濃度測定装置としては、迅速かつ簡便に測定を行うことができる自動分析装置の利用が適しており、蛍光や燐光等の発光強度を測定できる自動分析装置が好ましい。
本発明のアナライト濃度測定装置としては、迅速かつ簡便に測定を行うことができる自動分析装置の利用が適しており、蛍光や燐光等の発光強度を測定できる自動分析装置が好ましい。
上記混合液に励起光を照射する工程に用いられる光源は特に限定されない。
また、上記混合液に励起光を照射する工程で照射される光の波長としては、紫外光領域の波長が適しており、特に10nm~400nmの波長が好適である。
上述した自動分析装置においては、アナライトを含む試料溶液と、別の態様の本発明の重合体を含有する溶液との混合直後から、最大1000秒までの任意の2時点における蛍光強度の変化量を測定できる。特に、混合直後から300秒以内の2時点の蛍光強度の変化量を測定することにより、1試料あたりの総測定時間を10分以内とすることができ、市販されている各種自動分析装置の最大検体処理速度の利益を享受することができる。
また、上記混合液に励起光を照射する工程で照射される光の波長としては、紫外光領域の波長が適しており、特に10nm~400nmの波長が好適である。
上述した自動分析装置においては、アナライトを含む試料溶液と、別の態様の本発明の重合体を含有する溶液との混合直後から、最大1000秒までの任意の2時点における蛍光強度の変化量を測定できる。特に、混合直後から300秒以内の2時点の蛍光強度の変化量を測定することにより、1試料あたりの総測定時間を10分以内とすることができ、市販されている各種自動分析装置の最大検体処理速度の利益を享受することができる。
上記混合液に励起光を照射する工程における光の照射角度としては、15度~35度が好ましい。上記照射角度をこの範囲とすることにより、蛍光を検知するための受光部において透過光の影響を強く受けず、また、蛍光を受光する能力に関しても有利となる。上記照射角度は、20度~30度がより好ましい。
上記蛍光強度の変化量は、2時点間の差や比、単位時間あたりの換算値等、適用可能な算出法であれば特に制限はない。
上記別の態様の本発明の重合体から発生する蛍光強度と上記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程では、既知濃度のアナライト含有試料を用いて作成した、蛍光強度の検量線を用いることが好ましい。ダイナミックレンジが広い蛍光強度の測定では、より広い濃度範囲で検量線を作成することが好ましい。
なお、本発明のアナライト濃度測定法においては、低濃度のアナライト測定値の正確性や再現性が良好であることが高感度の指標となる。
また、上記「ダイナミックレンジ」とは、測定可能な最大のアナライト量までの範囲を意味する。本発明のアナライト濃度測定法のダイナミックレンジは、アナライト濃度に比例した光量変化が検出できる範囲となる。
なお、本発明のアナライト濃度測定法においては、低濃度のアナライト測定値の正確性や再現性が良好であることが高感度の指標となる。
また、上記「ダイナミックレンジ」とは、測定可能な最大のアナライト量までの範囲を意味する。本発明のアナライト濃度測定法のダイナミックレンジは、アナライト濃度に比例した光量変化が検出できる範囲となる。
本発明によれば、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、結合パートナーを導入することで良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することができる。また、本発明によれば、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することができる。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
(実施例1)
(重合体の作製)
ビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互共重合体(ガントレッツAN-119、Ashland社製)100重量部と、4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール3重量部とアセトン500重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、25℃で2時間反応させ、凝集誘起発光性基を導入した重合体Aを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Aは、鎖状のビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、酸無水物基である無水コハク酸基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は1モル%であった。
また、得られた重合体Aについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められた数平均分子量は101,000であった。
(重合体の作製)
ビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互共重合体(ガントレッツAN-119、Ashland社製)100重量部と、4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコール3重量部とアセトン500重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、25℃で2時間反応させ、凝集誘起発光性基を導入した重合体Aを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Aは、鎖状のビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、酸無水物基である無水コハク酸基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は1モル%であった。
また、得られた重合体Aについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められた数平均分子量は101,000であった。
(実施例2)
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコールを15重量部用いた以外は実施例1と同様にして重合体Bを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Bは、鎖状のビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、酸無水物基である無水コハク酸基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Bについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は106,000であった。
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコールを15重量部用いた以外は実施例1と同様にして重合体Bを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Bは、鎖状のビニルメチルエーテル-無水マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、酸無水物基である無水コハク酸基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Bについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は106,000であった。
(実施例3)
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコールアクリレート5重量部と、アクリル酸N-スクシンイミジル95重量部と、アゾビスイソブチロニトリル2重量部と、N,N’-ジメチルホルムアミド100重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、加熱を開始して60℃で18時間反応させ、凝集発光性基を導入した重合体Cを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Cは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、活性エステル基であるスクシンイミジルオキシカルボニル基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Cについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は98,000であった。
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルトリエチレングリコールアクリレート5重量部と、アクリル酸N-スクシンイミジル95重量部と、アゾビスイソブチロニトリル2重量部と、N,N’-ジメチルホルムアミド100重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、加熱を開始して60℃で18時間反応させ、凝集発光性基を導入した重合体Cを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Cは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、活性エステル基であるスクシンイミジルオキシカルボニル基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Cについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は98,000であった。
(実施例4)
(重合体の作製)
アクリル酸N-スクシンイミジルに代えて、アクリル酸ペンタフルオロフェニルを用いた以外は実施例4と同様にして重合体Dを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Dは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、活性エステル基であるペンタフルオロフェノキシカルボニル基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Dについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は102,000であった。
(重合体の作製)
アクリル酸N-スクシンイミジルに代えて、アクリル酸ペンタフルオロフェニルを用いた以外は実施例4と同様にして重合体Dを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Dは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基として、活性エステル基であるペンタフルオロフェノキシカルボニル基を有することを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Dについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は102,000であった。
(比較例1)
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルアクリレート5重量部と、アクリル酸95重量部と、アゾビスイソブチロニトリル5重量部と、N,N’-ジメチルホルムアミド100重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、加熱を開始して60℃で18時間反応させ、凝集誘起発光性基を導入した重合体Eを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Eは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有しないことを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Eについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は100,000であった。
(重合体の作製)
4-(1,2-ビス(4-カルボキシフェニル)2-フェニルビニル)フェニルアクリレート5重量部と、アクリル酸95重量部と、アゾビスイソブチロニトリル5重量部と、N,N’-ジメチルホルムアミド100重量部とをナスフラスコに投入し、均一に攪拌した。その後、加熱を開始して60℃で18時間反応させ、凝集誘起発光性基を導入した重合体Eを得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体Eは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(3)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)を有する重合体であることを確認した。また、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を有しないことを確認した。上記凝集誘起発光性基の含有量は5モル%であった。
また、得られた重合体Eについて、GPCで溶媒としてテトラヒドロフランを用いて測定を行い、ポリスチレン換算により求められる数平均分子量は100,000であった。
(比較例2)
特開2016-158587の記載に従って、下記式(6)で表されるデンドリマーを作製した。
特開2016-158587の記載に従って、下記式(6)で表されるデンドリマーを作製した。
(比較例3)
水100重量部に、スチレン3.6重量部、及び、重合開始剤としてV-50(富士フイルム和光純薬社製)0.136重量部を混合した。得られた混合液を60℃で4時間撹拌した後、2-クロロプロピオニルオキシエチルメタクリレート0.375重量部を添加して更に60℃で6時間撹拌した。得られた溶液をろ過した後、遠心分離により精製し、コア粒子を得た。
得られたコア粒子を含有割合が1.0重量%となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液30重量部に、金属錯体として塩化銅(I)/トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミンの存在下で、メタクリル酸0.517重量部、及び、還元剤としてアスコルビン酸21.1重量部を添加し、30℃で2時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、コア粒子の表面に有機グラフト鎖を付与した。
得られた粒子1.0重量部をエチレングリコール中に分散させ、4-(1,2,2-トリフェニルビニル)フェノール0.578重量部、及び、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド0.28重量部を加え、室温で6時間撹拌した。得られた分散液を遠心分離により精製し、有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した。
得られた有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した粒子を含有割合が0.5重量%となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液10重量部にKL-6抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)20重量部を加え、室温で24時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、凝集発光性材料を表面に有する凝集発光性材料含有粒子を得た。凝集発光性材料の含有量は11重量%であった。
水100重量部に、スチレン3.6重量部、及び、重合開始剤としてV-50(富士フイルム和光純薬社製)0.136重量部を混合した。得られた混合液を60℃で4時間撹拌した後、2-クロロプロピオニルオキシエチルメタクリレート0.375重量部を添加して更に60℃で6時間撹拌した。得られた溶液をろ過した後、遠心分離により精製し、コア粒子を得た。
得られたコア粒子を含有割合が1.0重量%となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液30重量部に、金属錯体として塩化銅(I)/トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミンの存在下で、メタクリル酸0.517重量部、及び、還元剤としてアスコルビン酸21.1重量部を添加し、30℃で2時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、コア粒子の表面に有機グラフト鎖を付与した。
得られた粒子1.0重量部をエチレングリコール中に分散させ、4-(1,2,2-トリフェニルビニル)フェノール0.578重量部、及び、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド0.28重量部を加え、室温で6時間撹拌した。得られた分散液を遠心分離により精製し、有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した。
得られた有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した粒子を含有割合が0.5重量%となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液10重量部にKL-6抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)20重量部を加え、室温で24時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、凝集発光性材料を表面に有する凝集発光性材料含有粒子を得た。凝集発光性材料の含有量は11重量%であった。
(比較例4)
種粒子として平均粒子径0.15μmのポリスチレン粒子を用意した。凝集誘起発光性化合物としてテトラフェニルエチレン0.5重量部と、酢酸エチル5重量部と、スチレンスルホン酸ナトリウム0.1重量部と、イオン交換水10重量部とを混合し、乳化液を調製した。上記種粒子1重量部の分散液に上記乳化液を加え、室温にて24時間撹拌して、テトラフェニルエチレンと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
得られた膨潤粒子液滴の分散液を65℃で24時間撹拌することで酢酸エチルを乾燥させ、凝集発光性材料含有粒子を得た。凝集発光性材料の含有量は33重量%であった。
種粒子として平均粒子径0.15μmのポリスチレン粒子を用意した。凝集誘起発光性化合物としてテトラフェニルエチレン0.5重量部と、酢酸エチル5重量部と、スチレンスルホン酸ナトリウム0.1重量部と、イオン交換水10重量部とを混合し、乳化液を調製した。上記種粒子1重量部の分散液に上記乳化液を加え、室温にて24時間撹拌して、テトラフェニルエチレンと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
得られた膨潤粒子液滴の分散液を65℃で24時間撹拌することで酢酸エチルを乾燥させ、凝集発光性材料含有粒子を得た。凝集発光性材料の含有量は33重量%であった。
(比較例5)
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とKL-6抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)とを用いて、SDS濃度が1.0×10-2mol/LのPBS溶液(以下、「SDS溶液」ともいう)を調製した。また、2,3,4,5-テトラフェニル-1,1-ジメチルシロール(TPS)とメタノールとを用いて、TPS濃度が1.0×10-3mol/Lのメタノール溶液(以下、「TPS溶液」ともいう)を調製した。
SDS溶液10mLにTPS溶液0.1mLを添加し、1時間撹拌した後、冷暗所で一晩静置することにより、凝集発光性材料内包ミセルを得た。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)とKL-6抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)とを用いて、SDS濃度が1.0×10-2mol/LのPBS溶液(以下、「SDS溶液」ともいう)を調製した。また、2,3,4,5-テトラフェニル-1,1-ジメチルシロール(TPS)とメタノールとを用いて、TPS濃度が1.0×10-3mol/Lのメタノール溶液(以下、「TPS溶液」ともいう)を調製した。
SDS溶液10mLにTPS溶液0.1mLを添加し、1時間撹拌した後、冷暗所で一晩静置することにより、凝集発光性材料内包ミセルを得た。
<評価>
実施例及び比較例で得られた各水溶液について以下の評価を行った。結果を表1に示した。
実施例及び比較例で得られた各水溶液について以下の評価を行った。結果を表1に示した。
(結合パートナーの導入)
実施例1で得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体を水に分散させた分散液に、シアル化糖鎖抗原KL-6(以下、単に「KL-6」ともいう)抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)2重量部を加えた。次いで、25℃で24時間攪拌することにより、重合体A’を得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体A’は、鎖状のビニルメチルエーテル-マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(2)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)、結合パートナーとしてKL-6抗体を有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体’について、SECで溶媒として150mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均分子量は表1のようであった。
実施例1で得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体を水に分散させた分散液に、シアル化糖鎖抗原KL-6(以下、単に「KL-6」ともいう)抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)2重量部を加えた。次いで、25℃で24時間攪拌することにより、重合体A’を得た。
1H-NMR及びFT-IR測定により、得られた重合体A’は、鎖状のビニルメチルエーテル-マレイン酸交互重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式(2)で表される基(R7は結合手、R8及びR9はカルボキシル基、R10は水素原子)、結合パートナーとしてKL-6抗体を有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体’について、SECで溶媒として150mMリン酸緩衝液(pH7.0)を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均分子量は表1のようであった。
また、実施例2~4で得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体についても、同様にして重合体B’~D’を得た。
更に、比較例1で得られた重合体Eを水に分散させた分散液に、KL-6抗体を含むPBS溶液(KL-6抗体濃度0.75mg/mL)2重量部及び塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド1重量部を加えた。次いで、25℃で24時間攪拌することにより、重合体E’を得た。
(PBS溶液の作製)
得られた重合体A’~E’を表1に示した濃度で含有するPBS溶液を作製した。
また、比較例2で得られたデンドリマー、比較例3及び4で得られた凝集発光性材料含有粒子、比較例5で得られた凝集発光性材料内包ミセルを表1に示した濃度で含有するPBS溶液を作製した。
得られた重合体A’~E’を表1に示した濃度で含有するPBS溶液を作製した。
また、比較例2で得られたデンドリマー、比較例3及び4で得られた凝集発光性材料含有粒子、比較例5で得られた凝集発光性材料内包ミセルを表1に示した濃度で含有するPBS溶液を作製した。
(蛍光強度)
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中にアナライトとしてKL-6抗原を添加して撹拌し、表1に示す濃度でアナライトを含む試料溶液を調製した。得られたアナライトを含む試料溶液1重量部と、各PBS溶液10重量部とを混合して混合液を得た。得られた混合液をウェイブローターで15分間振とうさせた。
アナライトを含まない試料溶液1重量部と、得られた各PBS溶液10重量部とを混合して得られる混合液の蛍光強度を抗原抗体反応前の蛍光強度、振とう後の混合液の蛍光強度を抗原抗体反応後の蛍光強度として、F-2700(日立ハイテクサイエンス社製)を用いて、それぞれの蛍光強度を測定した。また、抗原抗体反応前後の蛍光強度比(抗原抗体反応後の蛍光強度/抗原抗体反応前の蛍光強度)を算出した。アナライト濃度が0.8mg/mLの試料溶液を用いた場合については、蛍光強度比が100以上を「〇〇」、30以上100未満を「〇」、10以上30未満を「△」、10未満を「×」として評価した。また、アナライト濃度が0.000008mg/mLの試料溶液を用いた場合については、蛍光強度比が1.05より大きいものを「〇」、1より大きく1.05以下のものを「△」、1以下のものを「×」として評価した。
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中にアナライトとしてKL-6抗原を添加して撹拌し、表1に示す濃度でアナライトを含む試料溶液を調製した。得られたアナライトを含む試料溶液1重量部と、各PBS溶液10重量部とを混合して混合液を得た。得られた混合液をウェイブローターで15分間振とうさせた。
アナライトを含まない試料溶液1重量部と、得られた各PBS溶液10重量部とを混合して得られる混合液の蛍光強度を抗原抗体反応前の蛍光強度、振とう後の混合液の蛍光強度を抗原抗体反応後の蛍光強度として、F-2700(日立ハイテクサイエンス社製)を用いて、それぞれの蛍光強度を測定した。また、抗原抗体反応前後の蛍光強度比(抗原抗体反応後の蛍光強度/抗原抗体反応前の蛍光強度)を算出した。アナライト濃度が0.8mg/mLの試料溶液を用いた場合については、蛍光強度比が100以上を「〇〇」、30以上100未満を「〇」、10以上30未満を「△」、10未満を「×」として評価した。また、アナライト濃度が0.000008mg/mLの試料溶液を用いた場合については、蛍光強度比が1.05より大きいものを「〇」、1より大きく1.05以下のものを「△」、1以下のものを「×」として評価した。
本発明によれば、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、結合パートナーを導入することで良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することができる。また、本発明によれば、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することができる。
Claims (10)
- 凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーと自発的に結合する官能基を重合体骨格上に有することを特徴とする重合体。
- 凝集誘起発光性基、及び、アナライトに結合可能な結合パートナーを重合体骨格上に有することを特徴とする重合体。
- 重合体骨格は、鎖状である請求項1又は2記載の重合体。
- 数平均重合度が20以上7万以下、及び、数平均分子量が2000以上500万以下の少なくともいずれかを満たす請求項1、2又は3記載の重合体。
- 糖鎖を有さない請求項1、2、3又は4記載の重合体。
- 結合パートナーは、抗体又は抗原である請求項1、2、3、4又は5記載の重合体。
- 凝集誘起発光性基は、下記式(2)で表される基又は下記式(3)で表される基である請求項1、2、3、4、5又は6記載の重合体。
- 請求項2、3、4、5、6又は7記載の重合体を含む検査薬。
- アナライトを含有する試料溶液と、請求項2、3、4、5、6又は7記載の重合体を含有する溶液とを混合して混合液を調製する工程と、
前記混合液中の前記重合体から発生する蛍光強度を測定する工程と、
アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と前記重合体から発生する蛍光強度とを対比して、前記重合体から発生する蛍光強度と前記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程と
を有するアナライト濃度測定法。 - 請求項9記載のアナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置。
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