JP2022059100A - Method of screening for sodium action regulating substances - Google Patents

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Ikumi Shiraishi
史恵 本河
Fumie HONKAWA
裕 石渡
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千織 伊地知
Chiori Ijichi
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Abstract

To provide a method of screening for sodium action regulating substances.SOLUTION: Screening for sodium action regulating substances is accomplished by using a combination of αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ナトリウムの作用を調節する物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a substance that regulates the action of sodium.

現代人の食塩摂取量は目標塩分摂取量と比較すると格段に多い。過剰な食塩摂取は高血圧や循環器病に直結することから、減塩が望まれている。現在、減塩のためにはKCl等の塩味代替物質が使用されている。しかし、KClは塩味以外に苦味やえぐ味等を有するため、その使用量に上限がある。そのため、NaClの塩味を増強する物質等の、減塩に有効な物質が求められている。 The salt intake of modern humans is much higher than the target salt intake. Excessive salt intake is directly linked to hypertension and cardiovascular disease, so salt reduction is desired. Currently, salt substitute substances such as KCl are used for salt reduction. However, since KCl has a bitter taste and a harsh taste in addition to the salty taste, there is an upper limit to the amount of KCl used. Therefore, there is a demand for substances that are effective in reducing salt, such as substances that enhance the saltiness of NaCl.

上皮性ナトリウムチャネル（epithelial sodium channel；ENaC）は、塩味受容体として知られている（非特許文献１）。ENaCは、３種のサブユニットαENaC、βENaC、γENaCのヘテロ多量体として機能する。ENaCは、アミロライド（amiloride）によってチャネルとしての機能を阻害される。ヒトやマウスにおいては、アミロライドによる塩味受容の阻害は限局的であることから、ENaCを介する塩味受容機構とそれ以外の塩味受容機構が存在すると考えられている（非特許文献２）。ENaC以外の塩味受容体の候補としては、例えば、TRPV1t、TRPML3、Kv3.2、TMC6が見出されている。 Epithelial sodium channel (ENaC) is known as a salty taste receptor (Non-Patent Document 1). ENaC functions as a heteromultimer of the three subunits αENaC, βENaC and γENaC. ENaC is inhibited from functioning as a channel by amiloride. Since the inhibition of salt taste reception by amiloride is localized in humans and mice, it is considered that there is an ENaC-mediated salt taste reception mechanism and other salt taste reception mechanisms (Non-Patent Document 2). As candidates for salty taste receptors other than ENaC, for example, TRPV1t, TRPML3, Kv3.2, and TMC6 have been found.

酸感受性イオンチャネル（acid-sensing ion channel；ASIC）は、酸味受容体として機能することが示唆されている。ASICは、例えば、ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4、ASIC5等のASICサブユニットのホモ多量体またはヘテロ多量体として機能し得る。ASIC1サブユニットとしては、例えば、ASIC1a、ASIC1b、ASIC1cが知られている。また、ASICサブユニットは、例えば、ENaCサブユニットと複合体（すなわちヘテロ多量体）を形成して機能し得る。例えば、αENaC/ASIC1a（αENaCとASIC1aの組み合わせ）が、非選択的カチオンチャネルとして機能することが報告されている（非特許文献３）。 It has been suggested that acid-sensing ion channels (ASICs) function as acid taste receptors. The ASIC can function, for example, as a homo-multimer or a hetero-multimer of ASIC subunits such as ASIC1, ASIC2, ASIC3, ASIC4, ASIC5. As the ASIC1 subunit, for example, ASIC1a, ASIC1b, and ASIC1c are known. Also, the ASIC subunit can function, for example, by forming a complex (ie, a heteromultimer) with the ENaC subunit. For example, it has been reported that αENaC / ASIC1a (a combination of αENaC and ASIC1a) functions as a non-selective cation channel (Non-Patent Document 3).

Chandrashekar J. et al., The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 2010 Mar 11;464(7286):297-301.Chandrashekar J. et al., The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 2010 Mar 11; 464 (7286): 297-301. Roper SD, The taste of table salt. Eur J Physiol. 2015 Mar;467(3):457-63.Roper SD, The taste of table salt. Eur J Physiol. 2015 Mar; 467 (3): 457-63. Trac PT. et al., Alveolar nonselective channels are ASIC1a/α-ENaC channels and contribute to AFC. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017 Jun 1;312(6):L797-L811.Trac PT. et al., Alveolar nonselective channels are ASIC1a / α-ENaC channels and contribute to AFC. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017 Jun 1; 312 (6): L797-L811.

本発明は、ナトリウムの作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for screening a substance that regulates the action of sodium.

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、イオンチャネルサブユニットの特定の組み合わせであるαγENaC/ASIC1cがナトリウムに強く応答することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventor has found that αγENaC / ASIC1c, which is a specific combination of ion channel subunits, strongly responds to sodium, and has completed the present invention.

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
目的物質をスクリーニングする方法であって、
下記工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる工程；
（Ｂ）ナトリウムに対する前記αγENaC/ASIC1cの応答を測定する工程；および
（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程；
を含み、
前記応答が前記試験物質により調節されている場合に、該試験物質を目的物質として同定し、
前記目的物質が、ナトリウムの作用を調節する物質であり、
前記αγENaC/ASIC1cが、αENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質の組み合わせである、方法。
［２］
前記応答が、ナトリウムによる前記αγENaC/ASIC1cの活性化である、前記方法。
［３］
前記αγENaC/ASIC1cが、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、または人工脂質二重膜に担持された形態で使用される、前記方法。
［４］
前記αγENaC/ASIC1cが、細胞に担持された形態で使用される、前記方法。
［５］
前記細胞が、動物細胞である、前記方法。
［６］
前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）により実施される、前記方法：
（Ｂ１）前記工程（Ａ）を実施した際の前記αγENaC/ASIC1cの活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程。［７］
前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）により実施される、前記方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記αγENaC/ASIC1cの活性化の程度Ｄ２との差に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程。
［８］
前記対照条件が、下記条件（Ｃ２－１）または（Ｃ２－２）である、前記方法：
（Ｃ２－１）前記試験物質の非存在下で前記αγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件；
（Ｃ２－２）前記試験物質の存在下で前記αγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件であって、該試験物質の濃度が前記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。
［９］
さらに、前記活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含む、前記方法。
［１０］
前記目的物質が、ナトリウムの作用を促進または阻害する物質であり、
前記応答が前記試験物質により促進されている場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を促進する物質として同定し、
前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を阻害する物質として同定する、前記方法。
［１１］
前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも高い場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を促進する物質として同定する、前記方法。
［１２］
前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を阻害する物質として同定する、前記方法。
［１３］
前記ナトリウムの作用を促進する物質が塩味増強物質であり、前記ナトリウムの作用を阻害する物質が塩味低減物質である、前記方法。
［１４］
前記工程（Ａ）において、塩化ナトリウムがナトリウムとして用いられる、前記方法。［１５］
前記応答が、膜電流、膜電位、またはイオン濃度を指標として測定され、該イオン濃度が、細胞内のイオン濃度、人工脂質二重膜小胞内のイオン濃度、または細胞膜もしくは人工脂質二重膜により区分された内部空間内のイオン濃度である、前記方法。
［１６］
前記イオン濃度が、ナトリウムイオン濃度、カルシウムイオン濃度、または塩化物イオン濃度である、前記方法。
［１７］
前記αENaCタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のαENaCタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のαENaCタンパク質のキメラタンパク質。
［１８］
前記αENaCタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質。
［１９］
前記γENaCタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のγENaCタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のγENaCタンパク質のキメラタンパク質。
［２０］
前記γENaCタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質。
［２１］
前記ASIC1cタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（Ａ）哺乳類のASIC1cタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のASIC1cタンパク質のキメラタンパク質。
［２２］
前記ASIC1cタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびγENaCタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびγENaCタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質。
［２３］
さらに、同定された目的物質の塩味調節機能を評価する工程を含む、前記方法。
［２４］
前記評価が、官能評価によって実施される、前記方法。
［２５］
αENaCタンパク質をコードする遺伝子、γENaCタンパク質をコードする遺伝子、およびASIC1cタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞。
［２６］
動物細胞である、前記細胞。 That is, the present invention can be exemplified as follows.
[1]
It is a method of screening for the target substance.
The following steps (A) to (C):
(A) Step of contacting αγENaC / ASIC1c with sodium in the presence of a test substance;
(B) The step of measuring the response of the αγENaC / ASIC1c to sodium; and (C) the step of identifying the test substance as the target substance based on the response;
Including
When the response is regulated by the test substance, the test substance is identified as the target substance, and the test substance is identified.
The target substance is a substance that regulates the action of sodium.
The method, wherein the αγENaC / ASIC1c is a combination of the αENaC protein, the γENaC protein, and the ASIC1c protein.
[2]
The method, wherein the response is activation of the αγENaC / ASIC1c by sodium.
[3]
The method according to the method, wherein the αγENaC / ASIC1c is used in a form supported on a cell, a cell membrane, an artificial lipid bilayer vesicle, or an artificial lipid bilayer membrane.
[4]
The method, wherein the αγENaC / ASIC1c is used in a cell-supported form.
[5]
The method, wherein the cell is an animal cell.
[6]
The method: The method: The steps (B) and (C) are carried out by the following steps (B1) and (C1), respectively.
(B1) A step of measuring the degree of activation D1 of the αγENaC / ASIC1c when the step (A) is carried out;
(C1) A step of identifying the test substance as a target substance based on the degree of activation D1. [7]
The method: The method: The step (C1) is carried out by the following step (C2).
(C2) A step of identifying the test substance as a target substance based on the difference between the degree of activation D1 and the degree of activation of αγENaC / ASIC1c D2 under control conditions.
[8]
The control condition is the following condition (C2-1) or (C2-2), the method:
(C2-1) Conditions for contacting the αγENaC / ASIC1c with sodium in the absence of the test substance;
(C2-2) A condition in which the αγENaC / ASIC1c is brought into contact with sodium in the presence of the test substance, and the concentration of the test substance is lower than the concentration of the test substance in the step (A). ..
[9]
The method further comprises the step of measuring the degree of activation D2.
[10]
The target substance is a substance that promotes or inhibits the action of sodium.
When the response is facilitated by the test substance, the test substance is identified as a substance that promotes the action of sodium.
The method of identifying the test substance as a substance that inhibits the action of sodium when the response is inhibited by the test substance.
[11]
The method for identifying the test substance as a substance that promotes the action of sodium when the degree of activation D1 is higher than the degree of activation D2.
[12]
The method for identifying the test substance as a substance that inhibits the action of sodium when the degree of activation D1 is lower than the degree of activation D2.
[13]
The above-mentioned method, wherein the substance that promotes the action of sodium is a salty taste enhancing substance, and the substance that inhibits the action of sodium is a salty taste reducing substance.
[14]
The method in which sodium chloride is used as sodium in the step (A). [15]
The response is measured using membrane current, membrane potential, or ion concentration as an index, and the ion concentration is intracellular ion concentration, artificial lipid bilayer membrane vesicle ion concentration, or cell membrane or artificial lipid bilayer membrane. The method described above, which is the ion concentration in the internal space classified by.
[16]
The method, wherein the ion concentration is a sodium ion concentration, a calcium ion concentration, or a chloride ion concentration.
[17]
The method: The method: The αENaC protein is the protein according to (A) or (B) below.
(A) Mammalian αENaC protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian αENaC proteins.
[18]
The method: The method: The αENaC protein is the protein according to (a), (b), or (c) below.
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with the γENaC protein and the ASIC1c protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having responsiveness to sodium in combination with the γENaC protein and the ASIC1c protein.
[19]
The method: The method: The γENaC protein is the protein according to (A) or (B) below.
(A) Mammalian γENaC protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian γENaC proteins.
[20]
The method: The method: The γENaC protein is the protein according to (a), (b), or (c) below.
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with the αENaC protein and the ASIC1c protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having responsiveness to sodium in combination with the αENaC protein and the ASIC1c protein.
[21]
The method: The method: The ASIC1c protein is the protein according to (A) or (B) below.
(A) Mammalian ASIC1c protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian ASIC1c proteins.
[22]
The method: The method: The ASIC1c protein is the protein according to (a), (b), or (c) below.
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with αENaC protein and γENaC protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having responsiveness to sodium in combination with αENaC protein and γENaC protein.
[23]
The method further comprises the step of evaluating the salty taste regulating function of the identified target substance.
[24]
The method, wherein the evaluation is performed by a sensory evaluation.
[25]
A cell into which a gene encoding the αENaC protein, a gene encoding the γENaC protein, and a gene encoding the ASIC1c protein have been introduced.
[26]
The cell, which is an animal cell.

本発明によれば、ナトリウムの作用を調節する物質を効率的にスクリーニングすることができる。 According to the present invention, substances that regulate the action of sodium can be efficiently screened.

膜電流を指標として測定した、ENaCサブユニットおよび／またはASIC1cを発現する細胞のナトリウムに対する応答を示す図。データは、平均値±SDとして示す（Water：n=24, αENaC and αγENaC：n=5, ASIC1c：n=4, αENaC/ASIC1c：n=17, αγENaC/ASIC1c：n=9, αγENaC/ASIC1c+Ami：n=8）。*：p<0.05, ****：p<0.0001, Tukey’s test.The figure which shows the response to sodium of the cell expressing ENaC subunit and / or ASIC1c measured by the membrane current as an index. Data are shown as mean ± SD (Water: n = 24, αENaC and αγENaC: n = 5, ASIC1c: n = 4, αENaC / ASIC1c: n = 17, αγENaC / ASIC1c: n = 9, αγENaC / ASIC1c + Ami: n = 8). *: p <0.05, ****: p <0.0001, Tukey ’s test. 膜電流を指標として測定した、ENaCサブユニットを発現する細胞のナトリウムに対する応答を示す図。データは、平均値±SDとして示す（Water：n=10, αβENaC：n=5, αβγENaC and αβγENaC+Ami：n=6）。The figure which showed the response to sodium of the cell expressing ENaC subunit measured by the membrane current as an index. The data are shown as mean ± SD (Water: n = 10, αβENaC: n = 5, αβγENaC and αβγENaC + Ami: n = 6). 膜電流を指標として測定した、αβγENaCまたはαγENaC/ASIC1cを発現する細胞のカリウムに対する応答を示す図。データは、平均値±SDとして示す（n=5）。The figure which showed the response to potassium of the cell which expresses αβγENaC or αγENaC / ASIC1c measured by the membrane current as an index. The data are shown as mean ± SD (n = 5). 細胞内カルシウム濃度を指標として測定した、αβγENaCまたはαγENaC/ASIC1cを発現する細胞のナトリウムに対する応答を示す図。データは、2 wellの平均値として示す。The figure which showed the response to sodium of the cell expressing αβγENaC or αγENaC / ASIC1c measured by the intracellular calcium concentration as an index. The data are shown as an average of 2 wells.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明の方法は、イオンチャネルサブユニットの特定の組み合わせであるαγENaC/ASIC1cを利用したナトリウムの作用を調節する物質のスクリーニング方法である。ナトリウムの作用を調節する物質を「目的物質」ともいう。本発明の方法においては、αγENaC/ASIC1cを利用して、目的物質を同定する（すなわち試験物質が目的物質であるかを同定する）ことができる。本発明の方法においては、具体的には、試験物質の存在下でのナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答に基づいて、目的物質を同定する（すなわち当該試験物質が目的物質であるかを同定する）ことができる。本発明の方法においては、より具体的には、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答が試験物質により調節されるかに基づいて、目的物質を同定する（すなわち当該試験物質が目的物質であるかを同定する）ことができる。すなわち、本発明の方法は、具体的には、（Ａ）試験物質の存在下でαγ
ENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる工程；（Ｂ）ナトリウムに対する前記αγENaC/ASIC1cの応答を測定する工程；及び、（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程、を含み、前記応答が前記試験物質により調節されている場合に、該試験物質を目的物質として同定する、目的物質のスクリーニング方法であってよい。 The method of the present invention is a method for screening a substance that regulates the action of sodium using αγENaC / ASIC1c, which is a specific combination of ion channel subunits. A substance that regulates the action of sodium is also called a "target substance". In the method of the present invention, αγENaC / ASIC1c can be used to identify the target substance (that is, identify whether the test substance is the target substance). Specifically, in the method of the present invention, the target substance is identified (that is, whether or not the test substance is the target substance) based on the response of αγENaC / ASIC1c to sodium in the presence of the test substance. be able to. In the method of the present invention, more specifically, the target substance is identified based on whether the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is regulated by the test substance (that is, whether the test substance is the target substance). can do. That is, the method of the present invention specifically, (A) αγ in the presence of the test substance.
It comprises a step of contacting ENaC / ASIC1c with sodium; (B) a step of measuring the response of the αγENaC / ASIC1c to sodium; and (C) a step of identifying the test substance as a target substance based on the response. It may be a method for screening a target substance, which identifies the test substance as the target substance when the response is regulated by the test substance.

＜１＞目的物質
「目的物質」とは、ナトリウムの作用を調節する物質をいう。すなわち、目的物質は、ナトリウムの作用を調節する機能を有する。ナトリウムの作用の調節としては、ナトリウムの作用の促進やナトリウムの作用の阻害が挙げられる。すなわち、目的物質としては、ナトリウムの作用を促進する物質やナトリウムの作用を阻害する物質が挙げられる。 <1> Target substance The "target substance" means a substance that regulates the action of sodium. That is, the target substance has a function of regulating the action of sodium. Regulation of the action of sodium includes promotion of the action of sodium and inhibition of the action of sodium. That is, examples of the target substance include substances that promote the action of sodium and substances that inhibit the action of sodium.

ナトリウムは、例えば、ナトリウムに対する応答性を有するタンパク質に対して作用する。すなわち、ナトリウムの作用の調節としては、そのようなタンパク質に対するナトリウムの作用の調節が挙げられる。また、言い換えると、ナトリウムの作用の調節としては、ナトリウムに対するそのようなタンパク質の応答の調節が挙げられる。そのようなタンパク質としては、塩味の受容体が挙げられる。すなわち、ナトリウムの作用は、例えば、塩味として感知され得る。よって、ナトリウムの作用の調節により、塩味を調節することができると期待される。すなわち、目的物質としては、塩味を調節する物質が挙げられる。塩味を調節する物質を、「塩味調節物質」ともいう。すなわち、目的物質は、塩味を調節する機能を有していてよい。同機能を「塩味調節機能」ともいう。「塩味の調節」とは、ナトリウムにより惹起される塩味の調節を意味してよく、特に、塩化ナトリウムの塩味の調節を意味してよい。例えば、ナトリウムの作用の促進により、塩味を増強することができると期待される。また、例えば、ナトリウムの作用の阻害により、塩味を低減することができると期待される。すなわち、塩味の調節としては、塩味の増強や塩味の低減が挙げられる。すなわち、目的物質（具体的には塩味調節物質）としては、塩味を増強する物質や塩味を低減する物質が挙げられる。また、ナトリウムの作用を促進する物質としては、塩味を増強する物質が挙げられる。また、ナトリウムの作用を阻害する物質としては、塩味を低減する物質が挙げられる。塩味を増強する物質および塩味を低減する物質を、それぞれ、「塩味増強物質」および「塩味低減物質」ともいう。塩味調節物質は、それ自体が塩味を呈してもよく、呈さなくてもよい。 Sodium acts, for example, on proteins that are responsive to sodium. That is, the regulation of the action of sodium includes the regulation of the action of sodium on such proteins. Also, in other words, the regulation of the action of sodium includes the regulation of the response of such proteins to sodium. Examples of such proteins include salty receptors. That is, the action of sodium can be perceived as, for example, a salty taste. Therefore, it is expected that the salty taste can be adjusted by adjusting the action of sodium. That is, examples of the target substance include substances that regulate the salty taste. A substance that regulates saltiness is also referred to as a "salt taste regulating substance". That is, the target substance may have a function of adjusting the salty taste. This function is also called "salt taste adjustment function". "Regulation of saltiness" may mean regulation of saltiness evoked by sodium, and in particular may mean regulation of saltiness of sodium chloride. For example, it is expected that the salty taste can be enhanced by promoting the action of sodium. Further, for example, it is expected that the salty taste can be reduced by inhibiting the action of sodium. That is, the adjustment of the salty taste includes the enhancement of the salty taste and the reduction of the salty taste. That is, examples of the target substance (specifically, the salty taste adjusting substance) include a substance that enhances the salty taste and a substance that reduces the salty taste. In addition, examples of the substance that promotes the action of sodium include a substance that enhances the salty taste. Examples of the substance that inhibits the action of sodium include a substance that reduces saltiness. The substance that enhances saltiness and the substance that reduces saltiness are also referred to as "salt taste enhancer substance" and "salt taste reducing substance", respectively. The saltiness adjusting substance may or may not exhibit saltiness by itself.

目的物質は、単一の成分からなるもの（すなわち純物質）であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせからなるもの（すなわち混合物）であってもよい。「混合物」を「組成物」ともいう。目的物質が混合物である場合、当該混合物がナトリウムの作用を調節する機能等の上述したような機能を有する限り、当該混合物を構成する各成分は、単独で、ナトリウムの作用を調節する機能等の上述したような機能を有していてもよく、有していなくてもよい。 The target substance may be composed of a single component (that is, a pure substance) or a combination of two or more components (that is, a mixture). The "mixture" is also referred to as a "composition". When the target substance is a mixture, as long as the mixture has the above-mentioned functions such as the function of regulating the action of sodium, each component constituting the mixture alone has the function of regulating the action of sodium and the like. It may or may not have the above-mentioned functions.

＜２＞試験物質
「試験物質」とは、目的物質の候補として本発明の方法に用いられる物質をいう。試験物質は、特に制限されない。試験物質は、単一の成分からなるもの（すなわち純物質）であってもよく、２種またはそれ以上の成分の組み合わせからなるもの（すなわち混合物）であってもよい。試験物質が混合物である場合、当該混合物を構成する成分の種類数や構成比率は、特に制限されない。試験物質は、公知物質であってもよく、新規物質であってもよい。試験物質は、天然物であってもよく、人工物であってもよい。試験物質は、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリーであってもよい。試験物質としては、例えば、アルコール、ケトン、アルデヒド、エーテル、エステル、炭化水素、糖、有機酸、核酸、アミノ酸、ペプチド、脂質、その他の有機または無機の各種成分が挙げられる。また、試験物質としては、特に、既存の食品添加物が挙げられる。「既存の食品添加物」とは、食品添加物としての使用が認められている物質をいう
。試験物質としては、１種の試験物質を用いてもよく、２種またはそれ以上の試験物質を組み合わせて用いてもよい。２種またはそれ以上の成分をまとめてαγENaC/ASIC1cに接触させて本発明の方法を実施することにより、それらの成分の組み合わせが全体として目的物質であるかを同定することができる。「２種またはそれ以上の成分をまとめてαγENaC/ASIC1cに接触させる」場合としては、混合物である試験物質をαγENaC/ASIC1cに接触させる場合や、２種またはそれ以上の試験物質をまとめてαγENaC/ASIC1cに接触させる場合が挙げられる。 <2> Test substance “Test substance” refers to a substance used in the method of the present invention as a candidate for a target substance. The test substance is not particularly limited. The test substance may be a single component (ie, a pure substance) or a combination of two or more components (ie, a mixture). When the test substance is a mixture, the number of types and composition ratios of the components constituting the mixture are not particularly limited. The test substance may be a known substance or a novel substance. The test substance may be a natural product or an artificial product. The test substance may be, for example, a compound library prepared using combinatorial chemistry techniques. Examples of the test substance include alcohols, ketones, aldehydes, ethers, esters, hydrocarbons, sugars, organic acids, nucleic acids, amino acids, peptides, lipids, and various other organic or inorganic components. In addition, examples of the test substance include existing food additives. "Existing food additive" means a substance approved for use as a food additive. As the test substance, one kind of test substance may be used, or two or more kinds of test substances may be used in combination. By carrying out the method of the present invention by bringing two or more components together into contact with αγENaC / ASIC1c, it is possible to identify whether the combination of these components is the target substance as a whole. In the case of "contacting two or more kinds of components together with αγENaC / ASIC1c", the case where the test substance as a mixture is brought into contact with αγENaC / ASIC1c, or the case where two or more kinds of test substances are brought into contact with αγENaC / There is a case where it is brought into contact with ASIC1c.

試験物質は、例えば、既存の食品添加物等の、上記例示したような物質を含むように選択されてよい。すなわち、試験物質としては、例えば、１種の既存の食品添加物を用いてもよく、２種またはそれ以上の食品添加物を組み合わせて用いてもよく、１種またはそれ以上の食品添加物と１種またはそれ以上の他の成分とを組み合わせて用いてもよい。 The test material may be selected to include, for example, existing food additives and other materials as exemplified above. That is, as the test substance, for example, one kind of existing food additive may be used, or two or more kinds of food additives may be used in combination, and one kind or more food additives may be used. It may be used in combination with one or more other ingredients.

また、試験物質は、例えば、既知の目的物質以外の物質を含むように選択されてよい。「既知の目的物質」とは、ナトリウムの作用を調節する機能等の上述したような機能を有することが既知である物質をいう。すなわち、本発明の方法からは、試験物質が既知の目的物質からなる場合が除かれてもよい。また、本発明の方法からは、試験物質が既知の目的物質を含む場合が除かれてもよい。 Further, the test substance may be selected to contain, for example, a substance other than the known target substance. The "known target substance" refers to a substance known to have the above-mentioned functions such as a function of regulating the action of sodium. That is, the method of the present invention may exclude the case where the test substance is a known target substance. Further, the method of the present invention may exclude the case where the test substance contains a known target substance.

＜３＞αγENaC/ASIC1c
「αγENaC/ASIC1c」とは、αENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質の組み合わせをいう。 <3> αγENaC / ASIC1c
"ΑγENaC / ASIC1c" refers to a combination of αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein.

「αENaCタンパク質」とは、上皮性ナトリウムチャネル（epithelial sodium channel；ENaC）のαサブユニットをいう。αENaCタンパク質を単に「αENaC」ともいう。αENaCタンパク質をコードする遺伝子を「αENaC遺伝子」ともいう。αENaCタンパク質としては、１種のαENaCタンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のαENaCタンパク質を組み合わせて用いてもよい。 "ΑENaC protein" refers to the α-subunit of epithelial sodium channel (ENaC). The αENaC protein is also simply referred to as "αENaC". The gene encoding the αENaC protein is also called the "αENaC gene". As the αENaC protein, one type of αENaC protein may be used, or two or more types of αENaC protein may be used in combination.

「γENaCタンパク質」とは、上皮性ナトリウムチャネル（epithelial sodium channel；ENaC）のγサブユニットをいう。γENaCタンパク質を単に「γENaC」ともいう。γENaCタンパク質をコードする遺伝子を「γENaC遺伝子」ともいう。γENaCタンパク質としては、１種のγENaCタンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のγENaCタンパク質を組み合わせて用いてもよい。 The "γENaC protein" refers to the γ subunit of the epithelial sodium channel (ENaC). The γENaC protein is also simply referred to as "γENaC". The gene encoding the γENaC protein is also referred to as the "γENaC gene". As the γENaC protein, one kind of γENaC protein may be used, or two or more kinds of γENaC proteins may be used in combination.

「ASIC1cタンパク質」とは、酸感受性イオンチャネル（acid-sensing ion channel；ASIC）の1cサブユニットをいう。ASIC1cタンパク質を単に「ASIC1c」ともいう。ASIC1cタンパク質をコードする遺伝子を「ASIC1c遺伝子」ともいう。ASIC1cタンパク質としては、１種のASIC1cタンパク質を用いてもよく、２種またはそれ以上のASIC1cタンパク質を組み合わせて用いてもよい。 "ASIC1c protein" refers to the 1c subunit of an acid-sensing ion channel (ASIC). The ASIC1c protein is also simply referred to as "ASIC1c". The gene encoding the ASIC1c protein is also called the "ASIC1c gene". As the ASIC1c protein, one kind of ASIC1c protein may be used, or two or more kinds of ASIC1c proteins may be used in combination.

αENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質を、それぞれ、「イオンチャネルサブユニット」または「サブユニット」ともいう。αENaC遺伝子、γENaC遺伝子、およびASIC1c遺伝子を、それぞれ、「イオンチャネルサブユニット遺伝子」または「サブユニット遺伝子」ともいう。 The αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein are also referred to as “ion channel subunits” or “subunits”, respectively. The αENaC gene, γENaC gene, and ASIC1c gene are also referred to as “ion channel subunit gene” or “subunit gene”, respectively.

αγENaC/ASIC1cは、ナトリウムに対する応答性を有する。すなわち、３つのサブユニット（すなわちαENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質）の組み合わせは、ナトリウムに対する応答性を有する。言い換えると、各サブユニットは、他のサブユニットとの組み合わせで、ナトリウムに対する応答性を有する。各サブユニットは
、単独で、ナトリウムに対する応答性を有していてもよく、いなくてもよい。αγENaC/ASIC1cは、各サブユニットと比較して、ナトリウムに対する高い応答性を有していてよい。また、αγENaC/ASIC1cは、３つのサブユニットから選択される２つのサブユニットの組み合わせと比較して、ナトリウムに対する高い応答性を有していてよい。「ナトリウムに対する応答性を有する」とは、ナトリウムにより活性化されることを意味してよく、特に、塩化ナトリウムにより活性化されることを意味してよい。また、「ナトリウムに対する応答性を有する」とは、ナトリウムの存在下でナトリウムチャネルとして機能することを意味してよく、特に、塩化ナトリウムの存在下でナトリウムチャネルとして機能することを意味してよい。 αγENaC / ASIC1c is responsive to sodium. That is, the combination of the three subunits (ie, αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein) is responsive to sodium. In other words, each subunit is responsive to sodium in combination with other subunits. Each subunit may or may not be responsive to sodium alone. αγENaC / ASIC1c may have a high responsiveness to sodium as compared to each subunit. In addition, αγENaC / ASIC1c may have a high responsiveness to sodium as compared with the combination of two subunits selected from the three subunits. "Having a responsiveness to sodium" may mean activated by sodium, and in particular may mean activated by sodium chloride. Further, "having responsiveness to sodium" may mean functioning as a sodium channel in the presence of sodium, and in particular, may mean functioning as a sodium channel in the presence of sodium chloride.

また、αγENaC/ASIC1cは、例えば、アミロライドの存在下でナトリウムに対する応答性を有していてよい。具体的には、例えば、100 μMアミロライドの存在下でのαγENaC/ASIC1cのナトリウムに対する応答性は、アミロライドの非存在下でのαγENaC/ASIC1cのナトリウムに対する応答性の、８０％以上、９０％以上、または９５％以上であってもよい。 Also, αγENaC / ASIC1c may have responsiveness to sodium, for example, in the presence of amiloride. Specifically, for example, the responsiveness of αγENaC / ASIC1c to sodium in the presence of 100 μM amiloride is 80% or more, 90% or more of the responsiveness of αγENaC / ASIC1c to sodium in the absence of amiloride. Alternatively, it may be 95% or more.

ナトリウムに対する応答性については、本発明の方法におけるナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答の測定についての記載を準用できる。 Regarding the responsiveness to sodium, the description regarding the measurement of the response of αγENaC / ASIC1c to sodium in the method of the present invention can be applied mutatis mutandis.

サブユニット遺伝子およびサブユニットとしては、各種生物のサブユニット遺伝子およびサブユニットが挙げられる。生物としては、例えば、哺乳類等の動物が挙げられる。哺乳類等の動物として、具体的には、例えば、表１～３に示すものが挙げられる。哺乳類等の動物としては、特に、ヒトが挙げられる。各種生物のサブユニット遺伝子の塩基配列およびサブユニットのアミノ酸配列は、例えば、NCBIやEnsembl等の公開データベースから取得できる。ヒトのαENaC遺伝子（mRNA）の塩基配列およびαENaCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および２に示す。ヒトのγENaC遺伝子（mRNA）の塩基配列およびγENaCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および６に示す。ヒトのASIC1c遺伝子（mRNA）の塩基配列およびASIC1cタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７および８に示す。サブユニットの一例を表１～３に示す。表中、「Identity」は、ClustalWを用いて算出したヒトのサブユニットのアミノ酸配列（配列番号２、６、または８）に対する各生物のサブユニットのアミノ酸配列の同一性を示す。 Subunit genes and subunits include subunit genes and subunits of various organisms. Examples of organisms include animals such as mammals. Specific examples of the animals such as mammals include those shown in Tables 1 to 3. Examples of animals such as mammals include humans. Nucleotide sequences of subunit genes of various organisms and amino acid sequences of subunits can be obtained from public databases such as NCBI and Ensembl, for example. The nucleotide sequence of the human αENaC gene (mRNA) and the amino acid sequence of the αENaC protein are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. The nucleotide sequence of the human γENaC gene (mRNA) and the amino acid sequence of the γENaC protein are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively. The nucleotide sequence of the human ASIC1c gene (mRNA) and the amino acid sequence of the ASIC1c protein are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively. Examples of subunits are shown in Tables 1 to 3. In the table, "Identity" indicates the identity of the amino acid sequence of each organism's subunit to the amino acid sequence of the human subunit (SEQ ID NO: 2, 6, or 8) calculated using Clustal W.

Figure 2022059100000001
Figure 2022059100000001

Figure 2022059100000002
Figure 2022059100000002

Figure 2022059100000003
Figure 2022059100000003

すなわち、サブユニット遺伝子は、例えば、上記例示したサブユニットのアミノ酸配列
をコードする塩基配列（例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、サブユニットは、例えば、上記例示したサブユニットのアミノ酸配列（例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。 That is, the subunit gene is, for example, a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of the above-exemplified subunit (for example, a base sequence encoding the amino acid sequence registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3). It may be there. Further, the subunit may be, for example, a protein having the amino acid sequence of the above-exemplified subunit (for example, the amino acid sequence registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3). The expression "having a (amino acid or base) sequence" means "including the (amino acid or base) sequence" and includes the case of "consisting of the (amino acid or base) sequence" unless otherwise specified. do.

また、サブユニットとしては、キメラサブユニットも挙げられる。キメラサブユニットとしては、キメラαENaCタンパク質、キメラγENaCタンパク質、キメラASIC1cタンパク質が挙げられる。なお、キメラサブユニットの説明で言及される「サブユニット」とは、キメラαENaCタンパク質の場合にはαENaCタンパク質を、キメラγENaCタンパク質の場合にはγENaCタンパク質を、キメラASIC1cタンパク質の場合にはASIC1cタンパク質を指す。「キメラサブユニット」とは、サブユニットのキメラタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上のサブユニットのキメラタンパク質）をいう。また、言い換えると、「キメラサブユニット」とは、サブユニットのキメラ配列を有するタンパク質（すなわち、２種またはそれ以上のサブユニットのキメラ配列を有するタンパク質）をいう。「サブユニットのキメラ配列」とは、サブユニットのアミノ酸配列のキメラ配列（すなわち、２種またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸配列のキメラ配列）をいう。「サブユニットのキメラ配列」とは、具体的には、サブユニットのアミノ酸配列であって、その部分配列が、１種またはそれ以上の他のサブユニットのアミノ酸配列の部分配列で置換されたアミノ酸配列をいう。キメラサブユニットの構築におけるアミノ酸配列の置換は、サブユニットのアミノ酸配列中の対応する部位間で実施することができる。「サブユニットのアミノ酸配列中の対応する部位」とは、それらサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントにおいて対応する位置に配列される部位をいう。キメラサブユニットとしては、例えば、上記例示したサブユニットのキメラタンパク質（具体的には、上記例示したサブユニットから選択される２種またはそれ以上のサブユニットのキメラタンパク質）が挙げられる。キメラサブユニットとして、具体的には、例えば、哺乳類のキメラサブユニット（具体的には、哺乳類のサブユニットから選択される２種またはそれ以上のサブユニットのキメラタンパク質）が挙げられる。すなわち、サブユニットは、例えば、上記例示したサブユニットのアミノ酸配列のキメラ配列（具体的には、上記例示したサブユニットのアミノ酸配列から選択される２種またはそれ以上のアミノ酸配列のキメラ配列）を有するタンパク質であってもよい。キメラサブユニットとしては、ナトリウムに対する応答性を有するものを選択することができる。 Further, as the subunit, a chimeric subunit can also be mentioned. Examples of the chimeric subunit include a chimeric αENaC protein, a chimeric γENaC protein, and a chimeric ASIC1c protein. The "subunit" referred to in the description of the chimeric subunit is αENaC protein in the case of chimeric αENaC protein, γENaC protein in the case of chimeric γENaC protein, and ASIC1c protein in the case of chimeric ASIC1c protein. Point to. "Chimera subunit" refers to a subunit chimeric protein (ie, a chimeric protein of two or more subunits). In other words, the "chimeric subunit" refers to a protein having a chimeric sequence of subunits (that is, a protein having a chimeric sequence of two or more subunits). The "chimeric sequence of a subunit" refers to a chimeric sequence of an amino acid sequence of a subunit (that is, a chimeric sequence of an amino acid sequence of two or more subunits). A "subunit chimeric sequence" is specifically an amino acid sequence of a subunit, the partial sequence of which is substituted with a partial sequence of the amino acid sequence of one or more other subunits. Refers to an array. Substitution of amino acid sequences in the construction of chimeric subunits can be performed between corresponding sites in the amino acid sequence of the subunit. The "corresponding site in the amino acid sequence of a subunit" means a site arranged at a corresponding position in the alignment of the amino acid sequences of those subunits. Examples of the chimeric subunit include a chimeric protein of the above-exemplified subunit (specifically, a chimeric protein of two or more subunits selected from the above-exemplified subunits). Specific examples of the chimeric subunit include a mammalian chimeric subunit (specifically, a chimeric protein of two or more subunits selected from the mammalian subunits). That is, the subsystem is, for example, a chimeric sequence of the amino acid sequence of the above-exemplified subunit (specifically, a chimeric sequence of two or more amino acid sequences selected from the amino acid sequence of the above-exemplified subunit). It may be a protein having. As the chimeric subunit, one having responsiveness to sodium can be selected.

キメラサブユニットを構成するサブユニットの種類数は、特に制限されない。キメラサブユニットを構成するサブユニットの種類数は、２種であってもよく、３種またはそれ以上であってもよい。 The number of types of subunits constituting the chimera subunit is not particularly limited. The number of types of subunits constituting the chimera subunit may be two, three or more.

キメラサブユニットにおける各サブユニットの構成比率は特に制限されない。各サブユニットの構成比率は、キメラサブユニットを構成するサブユニットの構成比率の合計が１００％を超えない範囲で適宜設定することができる。各サブユニットの構成比率は、例えば、１％以上、３％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上であってもよく、９９％以下、９７％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または１％以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。「各サブユニットの構成比率」とは、キメラサブユニットを構成するアミノ酸残基の総数に対する各サブユニットに由来するアミノ酸残基の個数の比率をいう。なお、キメラサブユニットを構成するアミノ酸残基が当該キメラサブユニットを
構成するサブユニットの保存配列に該当する場合、当該アミノ酸残基はそれらサブユニットのいずれに由来するとみなしてもよい。 The composition ratio of each subunit in the chimeric subunit is not particularly limited. The composition ratio of each subunit can be appropriately set within a range in which the total composition ratio of the subunits constituting the chimera subunit does not exceed 100%. The composition ratio of each subunit is, for example, 1% or more, 3% or more, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more, 99% or less, 97% or less, 95% or less, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, It may be 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, 3% or less, or 1% or less, and may be a consistent combination thereof. The "constituent ratio of each subunit" means the ratio of the number of amino acid residues derived from each subunit to the total number of amino acid residues constituting the chimeric subunit. When the amino acid residue constituting the chimera subunit corresponds to the conserved sequence of the subunit constituting the chimera subunit, the amino acid residue may be considered to be derived from any of those subunits.

キメラサブユニットにおける各サブユニットに由来する部位の分布態様は特に制限されない。キメラサブユニットにおいて、各サブユニットに由来する部位は、１ヶ所に固まって存在していてもよく、２ヶ所またはそれ以上に分散して存在していてもよい。例えば、或るサブユニット（サブユニットＡ）の内部のアミノ酸配列を別のサブユニット（サブユニットＢ）のアミノ酸配列で置換してキメラサブユニットをデザインした場合、サブユニットＡのアミノ酸配列は当該キメラサブユニットのＮ末側とＣ末側に分散して残存する。 The distribution mode of the site derived from each subunit in the chimeric subunit is not particularly limited. In the chimeric subunit, the sites derived from each subunit may be present in a single place, or may be dispersed in two or more places. For example, when a chimeric subunit is designed by substituting the amino acid sequence inside one subunit (subunit A) with the amino acid sequence of another subunit (subunit B), the amino acid sequence of subunit A is the chimera. It remains dispersed on the N-terminal side and the C-terminal side of the subunit.

同様に、サブユニット遺伝子としては、キメラサブユニット遺伝子が挙げられる。キメラサブユニットについての記載は、キメラサブユニット遺伝子にも準用できる。 Similarly, the subunit gene includes a chimeric subunit gene. The description of the chimeric subunit can also be applied mutatis mutandis to the chimeric subunit gene.

サブユニット遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したサブユニット遺伝子、例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列を有する遺伝子、のバリアントであってもよい。同様に、サブユニットは、元の機能が維持されている限り、上記例示したサブユニット、例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列を有するタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「αENaC遺伝子」、「γENaC遺伝子」、および「ASIC1c遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したαENaC遺伝子、γENaC遺伝子、およびASIC1c遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「αENaCタンパク質」、「γENaCタンパク質」、および「ASIC1cタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したαENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したサブユニット遺伝子やサブユニットのホモログや人為的な改変体が挙げられる。 As long as the original function is maintained, the subunit gene may be a subunit gene exemplified above, for example, a base sequence encoding an amino acid sequence registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3 or a chimeric sequence thereof. It may be a variant of the gene. Similarly, subunits are of the subunits exemplified above, eg, proteins having amino acid sequences registered in NCBI Accession No. in Tables 1-3 or chimeric sequences thereof, as long as the original function is maintained. It may be a variant. A variant in which such an original function is maintained may be referred to as a "conservative variant". The terms "αENaC gene", "γENaC gene", and "ASIC1c gene" are intended to include conservative variants thereof in addition to the αENaC gene, γENaC gene, and ASIC1c gene exemplified above, respectively. Similarly, the terms "αENaC protein", "γENaC protein", and "ASIC1c protein" include, respectively, the αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein exemplified above, as well as their conservative variants. do. Conservative variants include, for example, the subunit genes exemplified above, subunit homologs, and artificial variants.

また、由来する生物種で特定されるサブユニット遺伝子は、当該生物種において見出されるサブユニット遺伝子そのものに限られず、当該生物種において見出されるサブユニット遺伝子の塩基配列を有する遺伝子およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、由来する生物種で特定されるサブユニットは、当該生物種において見出されるサブユニットそのものに限られず、当該生物種において見出されるサブユニットのアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。それら保存的バリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。例えば、「哺乳類のサブユニット」という用語は、哺乳類において見出されるサブユニットのアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。また、例えば、「哺乳類のキメラサブユニット」という用語は、哺乳類において見出されるサブユニットのアミノ酸配列のキメラ配列を有するタンパク質およびそれらの保存的バリアントを包含するものとする。言い換えると、「哺乳類のキメラサブユニット」を構成するサブユニットは、哺乳類において見出されるサブユニットそのものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。 In addition, the subunit gene specified by the species of origin is not limited to the subunit gene itself found in the species, but the gene having the subunit gene base sequence found in the species and their conservative variants. Shall be included. Similarly, the subunits identified in the species of origin are not limited to the subunits found in the species itself, but include proteins with amino acid sequences of the subunits found in the species and their conservative variants. It shall be. These conservative variants may or may not be found in the species. For example, the term "mammalian subunit" is intended to include proteins having an amino acid sequence of subunits found in mammals and conservative variants thereof. Also, for example, the term "mammalian chimeric subunit" is intended to include proteins having a chimeric sequence of amino acid sequences of subunits found in mammals and conservative variants thereof. In other words, the subunits that make up the "mammalian chimeric subunit" are not limited to the subunits found in mammals themselves, but may be conservative variants thereof.

「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、各サブユニット遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが他のサブユニットとの組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質（サブユニット）をコードすることをいう。また、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」
とは、タンパク質（サブユニット）のバリアントが他のサブユニットとの組み合わせでナトリウムに対する応答性を有することをいう。 "The original function is maintained" means that the variant of the gene or protein has a function (activity or property) corresponding to the function (activity or property) of the original gene or protein. By "maintaining the original function" of a gene is meant that the variant of the gene encodes a protein that retains its original function. That is, "maintaining the original function" for each subunit gene means that the variant of the gene encodes a protein (subunit) that is responsive to sodium in combination with other subunits. .. Also, "the original function is maintained" for each subunit.
It means that a variant of a protein (subunit) has a responsiveness to sodium in combination with other subunits.

サブユニットの組み合わせがナトリウムに対する応答性を有することは、例えば、当該組み合わせをナトリウムと接触させた際の当該組み合わせの応答を測定することにより、確認できる。 The responsiveness of the subunit combination to sodium can be confirmed, for example, by measuring the response of the combination when the combination is brought into contact with sodium.

以下、保存的バリアントについて例示する。 Hereinafter, the conservative variant will be illustrated.

サブユニット遺伝子のホモログまたはサブユニットのホモログは、例えば、上記例示したサブユニット遺伝子の塩基配列または上記例示したサブユニットのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、サブユニット遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知のサブユニット遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。 The subunit gene homolog or subunit homolog can be easily obtained from a public database by, for example, a BLAST search or a FASTA search using the above-exemplified subunit gene base sequence or the above-exemplified subunit amino acid sequence as a query sequence. can do. Further, the subunit gene homolog can be obtained, for example, by PCR using chromosomes of various organisms as templates and oligonucleotides prepared based on the base sequences of these known subunit genes as primers.

サブユニット遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列またはそれらのキメラ配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。 The subunit gene has one or several positions in the above amino acid sequence (for example, the amino acid sequence registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3 or a chimeric sequence thereof) as long as the original function is maintained. One or several amino acids in the gene may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence substituted, deleted, inserted, and / or added. For example, the encoded protein may have its N-terminus and / or C-terminus extended or shortened. The above-mentioned "1 or several" varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30. It preferably means 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。 Substitutions, deletions, insertions, and / or additions of one or several amino acids described above are conservative mutations that maintain normal protein function. A typical conservative mutation is a conservative substitution. Conservative substitutions are polar amino acids between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In some cases, between Gln and Asn, between Lys, Arg and His if it is a basic amino acid, and between Asp and Glu if it is an acidic amino acid, if it is an amino acid with a hydroxyl group. Is a mutation that replaces each other between Ser and Thr. Substitutions that are considered conservative substitutions include, specifically, Ala to Ser or Thr substitutions, Arg to Gln, His or Lys substitutions, Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp substitutions. Asp to Asn, Glu or Gln replacement, Cys to Ser or Ala replacement, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg replacement, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, Ile to Leu, Met, Val or Phe, Leu to Ile, Met, Val or Phe, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, Met to Ile, Leu, Val or Phe, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitutions include Thr to Ser or Ala, Trp to Phe or Tyr, Tyr to His, Phe or Trp, and Val to Met, Ile or Leu. In addition, the above-mentioned amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions are naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the organism from which the gene is derived. Also includes those caused by.

また、サブユニット遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性（identity）を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。 Further, as long as the original function is maintained, the subunit gene is, for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% with respect to the entire amino acid sequence. As described above, it may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having 97% or more, more preferably 99% or more of identity.

また、サブユニット遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列をコードする塩基配列またはそれらのキメラ配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。 In addition, the subunit gene is derived from the above-mentioned base sequence (for example, a base sequence encoding an amino acid sequence registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3 or a chimeric sequence thereof) as long as the original function is maintained. It may be a probe that can be prepared, such as a complementary sequence to all or part of the above base sequence, and a gene that hybridizes under stringent conditions, such as DNA. The "stringent condition" refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, DNAs having high identity, for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, particularly preferably 99. 60 ° C, 1 × SSC, 0.1% SDS, which is a condition in which DNAs having an identity of% or more hybridize with each other and DNAs having a lower identity do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions. Conditions of washing once, preferably 2-3 times, preferably at a salt concentration and temperature corresponding to 60 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS. be able to.

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。 As described above, the probe used for the hybridization may be a part of the complementary sequence of the gene. Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing the above-mentioned gene as a template. For example, as a probe, a DNA fragment having a length of about 300 bp can be used. When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as the probe, the conditions for washing the hybridization include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.

また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、サブユニット遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、サブユニット遺伝子は、例えば、遺伝コードの縮重による上記例示したサブユニット遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、サブユニット遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。 Further, since the codon degeneracy differs depending on the host, the subunit gene may be a subunit gene in which any codon is replaced with an equivalent codon. That is, the subunit gene may be, for example, a variant of the above-exemplified subunit gene due to the reduction of the genetic code. For example, the subunit gene may be modified to have the optimum codon depending on the codon usage frequency of the host used.

なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、DNAに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「サブユニット遺伝子」とは、サブユニットをコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。サブユニット遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。サブユニット遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。サブユニット遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。サブユニット遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。サブユニット遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。サブユニット遺伝子がRNAを含む場合、上記例示した塩基配列等のDNAに関する記載は、RNAに合わせて適宜読み替えてよい。サブユニット遺伝子は、イントロンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。サブユニット遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。 In the present invention, the term "gene" is not limited to DNA as long as it encodes a protein of interest, and may include any polynucleotide. That is, the "subunit gene" may mean any polynucleotide encoding a subunit. The subunit gene may be DNA, RNA, or a combination thereof. The subunit gene may be single-stranded or double-stranded. The subunit gene may be single-stranded DNA or single-stranded RNA. The subunit gene may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid strand consisting of a DNA strand and an RNA strand. The subunit gene may contain both DNA and RNA residues in a single polynucleotide strand. When the subunit gene contains RNA, the description regarding DNA such as the above-exemplified base sequence may be appropriately read according to the RNA. The subunit gene may or may not contain an intron. The mode of the subunit gene can be appropriately selected according to various conditions such as the mode of use thereof.

なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。 The "identity" between amino acid sequences is calculated by blastp using the default Scoring Parameters (Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence = 11, Extension = 1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment). It means the identity between amino acid sequences. In addition, "identity" between base sequences means the identity between base sequences calculated by blastn using the default Scoring Parameters (Match / Mismatch Scores = 1, -2; Gap Costs = Linear). do.

また、サブユニットは、サブユニットの保存配列（すなわち、２種またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。なお、保存配列の説明で言及される「サブユニット」とは、αENaCタンパク質が有する保存配列の
場合にはαENaCタンパク質を、γENaCタンパク質が有する保存配列の場合にはγENaCタンパク質を、ASIC1cタンパク質が有する保存配列の場合にはASIC1cタンパク質を指す。サブユニットは、例えば、上記例示したサブユニットの保存配列（具体的には、上記例示したサブユニットから選択される２種またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。サブユニットは、具体的には、例えば、哺乳類のキメラサブユニットの保存配列（具体的には、哺乳類のサブユニットから選択される２種またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸配列の保存配列）の一部または全部を有していてもよい。また、サブユニットは、例えば、表１～３のNCBI Accession No.で登録されているアミノ酸配列（αENaCタンパク質について計３４個、γENaCタンパク質について計３５個、ASIC1cタンパク質について計３５個）のアラインメントにおいて、１０個以上、２０個以上、または３０個以上のアミノ酸配列において保存されているアミノ酸配列の一部または全部を有していてもよい。保存配列は対象のアミノ酸配列のアラインメントにより決定できる。保存配列の一部または全部としては、保存配列の１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上、または１００％の領域が挙げられる。 In addition, the subunit may have a part or all of the conserved sequence of the subunit (that is, the conserved sequence of the amino acid sequence of two or more subunits). The "subunit" referred to in the description of the conserved sequence is the conserved αENaC protein in the case of the conserved sequence possessed by the αENaC protein, the γENaC protein in the case of the conserved sequence possessed by the γENaC protein, and the conservative possessed by the ASIC1c protein. In the case of a sequence, it refers to the ASIC1c protein. The subunit may be, for example, a part or all of the conserved sequence of the above-exemplified subunit (specifically, the conserved sequence of the amino acid sequence of two or more subunits selected from the above-exemplified subunits). You may have. The subunit is specifically, for example, one of the conserved sequences of the mammalian chimeric subunit (specifically, the conserved sequence of the amino acid sequences of two or more subunits selected from the subunits of mammals). It may have a part or all. In addition, the subunits are, for example, in the alignment of the amino acid sequences registered in NCBI Accession No. in Tables 1 to 3 (34 in total for αENaC protein, 35 in total for γENaC protein, 35 in total for ASIC1c protein). It may have some or all of the amino acid sequences conserved in 10 or more, 20 or more, or 30 or more amino acid sequences. The conserved sequence can be determined by the alignment of the amino acid sequence of interest. Part or all of the conserved sequence includes regions of 10% or more, 30% or more, 50% or more, 70% or more, 90% or more, or 100% of the conserved sequence.

また、サブユニットは、上述したようなサブユニットのアミノ酸配列に加えて、その他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。すなわち、サブユニットは、上述したようなサブユニットのアミノ酸配列とその他のアミノ酸配列との融合タンパク質であってもよい。その他のアミノ酸配列は、サブユニットがナトリウムに対する応答性を損なわない限り、特に制限されない。その他のアミノ酸配列としては、例えば、HisタグやV5エピトープタグ等のタグ配列が挙げられる。その他のアミノ酸配列は、例えば、サブユニットのＮ末端、若しくはＣ末端、又はその両方に連結されていてよい。 Further, the subunit may contain other amino acid sequences in addition to the amino acid sequence of the subunit as described above. That is, the subunit may be a fusion protein of the amino acid sequence of the subunit as described above and another amino acid sequence. Other amino acid sequences are not particularly limited as long as the subunit does not impair the responsiveness to sodium. Examples of other amino acid sequences include tag sequences such as His tag and V5 epitope tag. Other amino acid sequences may be linked, for example, to the N-terminus, C-terminus, or both of the subunits.

サブユニットは、目的物質のスクリーニングに利用可能な任意の形態で使用することができる。すなわち、具体的には、サブユニットは、αγENaC/ASIC1cが試験物質と接触でき、且つαγENaC/ASIC1cがナトリウムに対する応答性を有する限り、任意の形態で使用することができる。サブユニットの使用形態は、本発明の方法の実施態様等の諸条件に応じて適宜設定できる。 The subunit can be used in any form that can be used for screening for the substance of interest. That is, specifically, the subunit can be used in any form as long as αγENaC / ASIC1c can be contacted with the test substance and αγENaC / ASIC1c is responsive to sodium. The usage pattern of the subunit can be appropriately set according to various conditions such as the embodiment of the method of the present invention.

サブユニットは、例えば、精製物や粗精製物等の所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。サブユニットは、具体的には、例えば、構造物に担持された形態で使用されてもよい。構造物としては、例えば、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、人工脂質二重膜が挙げられる。構造物としては、特に、細胞が挙げられる。言い換えると、サブユニットは、例えば、サブユニットを有する細胞、サブユニットを有する細胞膜、サブユニットを有する人工脂質二重膜小胞、またはサブユニットを有する人工脂質二重膜等のサブユニットを有する（担持する）構造物の形態で使用することができる。これらサブユニットを有する構造物も、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。また、サブユニットは、器具の一部を構成していてもよい。すなわち、サブユニットは、例えば、サブユニットを備える器具の形態で使用することもできる。サブユニットを備える器具としては、例えば、サブユニットが固定化された器具や、サブユニットを有する構造物（脂質二重膜等）を備える器具が挙げられる。脂質二重膜を備える器具としては、例えば、脂質二重膜を配列したチップ（WO2005/000558；Watanabe R. et al., Arrayed lipid bilayer
chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat Commun. 2014 Jul 24;5:4519.；Kamiya K. et al., Preparation of artificial cell membrane and single ion channel measurement, Electrochemistry, 83, 1096-1100 (2015)）や、液滴接触法により調製された脂質二重膜を備えるイオンチャネル測定デバイス（Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single
Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995 (2013)）が挙げられる。これらの形態のサブユニットは、いずれも、本発明の方法で使用されるサブユニットの範囲に含まれ
る。 The subunit may be used, for example, in a form isolated to a desired degree, such as a purified product or a crude product, or may be used in a form contained in a material. Specifically, the subunit may be used, for example, in a form supported on a structure. Examples of the structure include cells, cell membranes, artificial lipid bilayer vesicles, and artificial lipid bilayer membranes. Structures include, in particular, cells. In other words, the subunit has subunits such as, for example, a cell having a subunit, a cell membrane having a subunit, an artificial lipid bilayer vesicle having a subunit, or an artificial lipid bilayer membrane having a subunit ( It can be used in the form of a structure (to carry). The structure having these subunits may also be used, for example, in a form isolated to a desired degree, or may be used in a form contained in the material. Further, the subunit may form a part of the instrument. That is, the subunit can also be used, for example, in the form of an instrument comprising the subunit. Examples of the device including the subunit include a device in which the subunit is immobilized and a device having a structure having the subunit (such as a lipid bilayer membrane). As an instrument equipped with a lipid bilayer, for example, a chip in which a lipid bilayer is arranged (WO2005 / 000558; Watanabe R. et al., Arrayed lipid bilayer)
chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nat Commun. 2014 Jul 24; 5: 4519 .; Kamiya K. et al., Preparation of artificial cell membrane and single ion channel measurement, Electrochemistry, 83, 1096-1100 (2015) )) And an ion channel measurement device (Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single) equipped with a lipid bilayer membrane prepared by the droplet contact method.
Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995 (2013)). All of these forms of subunits fall within the scope of subunits used in the methods of the invention.

サブユニットは、例えば、サブユニット遺伝子を発現させることにより製造できる。サブユニット遺伝子の発現は、例えば、細胞を用いて実施してもよいし、無細胞タンパク質合成系を用いて実施してもよい。細胞を用いたサブユニット遺伝子の発現については、後述するサブユニットを有する細胞の説明を参照できる。発現したサブユニットは、適宜、上述したような形態で取得し、本発明の方法に利用できる。 The subunit can be produced, for example, by expressing the subunit gene. Expression of the subunit gene may be carried out using, for example, cells or a cell-free protein synthesis system. For the expression of subunit genes using cells, the description of cells having subunits can be referred to later. The expressed subunit can be appropriately obtained in the form as described above and used in the method of the present invention.

サブユニットを有する細胞を「本発明の細胞」ともいう。サブユニットは、例えば、細胞膜に局在して機能し得る。よって、本発明の細胞は、サブユニットを、例えば、細胞膜に有していてよい。 A cell having a subunit is also referred to as a "cell of the present invention". The subunits can function, for example, localized to the cell membrane. Therefore, the cells of the present invention may have subunits, for example, on the cell membrane.

サブユニットは、サブユニット遺伝子から発現する。よって、本発明の細胞は、サブユニット遺伝子を有する。本発明の細胞は、具体的には、サブユニット遺伝子を発現可能に有する。なお、本発明の細胞は、サブユニットを発現するまでサブユニット遺伝子を有していれば足りる。すなわち、本発明の細胞は、サブユニットの発現後には、サブユニット遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。また、本発明の細胞は、言い換えると、サブユニット遺伝子を発現した細胞であり、また、サブユニットを発現した細胞である。なお、「サブユニット遺伝子の発現」と「サブユニットの発現」とは同義に用いられ得る。 The subunits are expressed from the subunit gene. Therefore, the cell of the present invention has a subunit gene. Specifically, the cell of the present invention has a subunit gene capable of expressing it. It is sufficient that the cell of the present invention has the subunit gene until it expresses the subunit. That is, the cell of the present invention may or may not have the subunit gene after the subunit is expressed. Further, the cell of the present invention is, in other words, a cell expressing a subunit gene and a cell expressing a subunit. In addition, "expression of subunit gene" and "expression of subunit" can be used synonymously.

本発明の細胞は、各サブユニット遺伝子について、１コピーのサブユニット遺伝子を有していてもよく、２コピーまたはそれ以上のサブユニット遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、各サブユニット遺伝子について、１種のサブユニット遺伝子を有していてもよく、２種またはそれ以上のサブユニット遺伝子を有していてもよい。また、本発明の細胞は、各サブユニットについて、１種のサブユニットを有していてもよく、２種またはそれ以上のサブユニットを有していてもよい。 The cells of the present invention may have one copy of the subunit gene for each subunit gene, or may have two copies or more of the subunit gene. Further, the cell of the present invention may have one subunit gene for each subunit gene, or may have two or more subunit genes. In addition, the cells of the present invention may have one subunit for each subunit, or may have two or more subunits.

本発明の細胞は、本来的にサブユニット遺伝子を有するものであってもよく、サブユニット遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。 The cell of the present invention may originally have a subunit gene or may be modified to have a subunit gene.

本来的にサブユニット遺伝子を有する細胞としては、上記のようなサブユニット遺伝子が由来する生物の細胞、例えば、ヒト等の哺乳類の味細胞、が挙げられる。本来的にサブユニット遺伝子を有する細胞は、例えば、当該細胞を含む生物体や組織から取得することができる。 Examples of cells that originally have a subunit gene include cells of an organism from which the above-mentioned subunit gene is derived, for example, taste cells of mammals such as humans. A cell that originally has a subunit gene can be obtained, for example, from an organism or tissue containing the cell.

サブユニット遺伝子を有するように改変された細胞としては、サブユニット遺伝子が導入された細胞が挙げられる。本発明の細胞は、例えば、αENaC遺伝子、γENaC遺伝子、およびASIC1c遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子が導入された細胞であってよい。本発明の細胞は、例えば、αENaC遺伝子、γENaC遺伝子、およびASIC1c遺伝子が導入された細胞であってもよい。 Examples of the cell modified to have the subunit gene include a cell into which the subunit gene has been introduced. The cell of the present invention may be, for example, a cell into which one or more genes selected from the αENaC gene, the γENaC gene, and the ASIC1c gene have been introduced. The cell of the present invention may be, for example, a cell into which the αENaC gene, the γENaC gene, and the ASIC1c gene have been introduced.

なお、本発明の細胞およびそれを取得するために用いられる細胞（例えば、サブユニット遺伝子が導入される又は導入された細胞）を総称して「宿主細胞」ともいう。 In addition, the cell of the present invention and the cell used for obtaining the cell (for example, the cell into which the subunit gene is introduced or introduced) are also collectively referred to as "host cell".

宿主細胞は、機能するサブユニットを発現でき、以て目的物質のスクリーニングに利用可能なものであれば特に制限されない。宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞等の真核細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、動物細胞が挙げられる。動物としては、例えば、哺乳類、鳥類、両生類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類とし
ては、例えば、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。霊長類としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリが挙げられる。両生類としては、例えば、アフリカツメガエルが挙げられる。また、宿主細胞が由来する組織または細胞は特に制限されない。宿主細胞が由来する組織または細胞としては、例えば、卵巣、腎臓、副腎、舌上皮、嗅上皮、松果体、甲状腺、メラノサイトが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO）が挙げられる。CHOとして、具体的には、例えば、CHO-DG44やCHO-K1が挙げられる。ヒトの細胞としては、例えば、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（HEK）が挙げられる。HEKとして、具体的には、例えば、HEK293やHEK293Tが挙げられる。サルの細胞としては、例えば、アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株（COS）が挙げられる。COSとして、具体的には、例えば、COS-1が挙げられる。アフリカツメガエルの細胞としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21、SF+等のSpodoptera frugiperda由来細胞や、High-Five等のTrichoplusia ni由来細胞が挙げられる。宿主細胞は、個々の独立した細胞（例えば遊離の細胞）であってもよいし、組織等の集合体を形成していてもよい。 The host cell is not particularly limited as long as it can express a functional subunit and can be used for screening a target substance. Host cells include, for example, bacterial cells, fungal cells, plant cells, insect cells, and animal cells. Preferred host cells include eukaryotic cells such as fungal cells, plant cells, insect cells, and animal cells. More preferred host cells include animal cells. Animals include, for example, mammals, birds and amphibians. Mammals include, for example, rodents and primates. Examples of rodents include Chinese hamsters, hamsters, mice, rats, and guinea pigs. Primates include, for example, humans, monkeys and chimpanzees. Examples of birds include chickens. Amphibians include, for example, Xenopus laevis. Further, the tissue or cell from which the host cell is derived is not particularly limited. Tissues or cells from which host cells are derived include, for example, ovaries, kidneys, adrenal glands, tongue epithelium, olfactory epithelium, pineal gland, thyroid gland, and melanocytes. Examples of Chinese hamster cells include Chinese hamster ovary-derived cell lines (CHO). Specific examples of the CHO include CHO-DG44 and CHO-K1. Examples of human cells include human fetal kidney cell-derived cell lines (HEK). Specific examples of HEK include HEK293 and HEK293T. Examples of monkey cells include African green monkey renal cell-derived cell lines (COS). Specific examples of COS include COS-1. Examples of Xenopus cells include Xenopus oocytes. Examples of insect cells include Spodoptera frugiperda-derived cells such as Sf9, Sf21, and SF +, and Trichoplusia ni-derived cells such as High-Five. The host cell may be an individual independent cell (for example, a free cell) or may form an aggregate such as a tissue.

サブユニット遺伝子は、サブユニット遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、サブユニット遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。 The subunit gene can be obtained by cloning from an organism having the subunit gene. Nucleic acids such as genomic DNA and cDNA containing the same gene can be used for cloning. The subunit gene can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).

取得したサブユニット遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、サブユニット遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR
technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、サブユニット遺伝子のバリアントを化学合成によって直接取得してもよい。 The obtained subunit gene can be used as it is or after being appropriately modified. That is, the variant can be obtained by modifying the subunit gene. Genetic modification can be performed by a known method. For example, a site-specific mutation method can be used to introduce a desired mutation into a target site of DNA. That is, for example, site-specific mutagenesis can modify the coding region of a gene such that the encoded protein contains amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and / or additions at specific sites. .. As a site-specific mutation method, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR)
technology, Erlich, HA Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, TA et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternatively, the subunit gene variant may be obtained directly by chemical synthesis.

サブユニット遺伝子を宿主細胞に導入する形態は特に制限されない。サブユニット遺伝子は、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。具体的には、例えば、サブユニット遺伝子をDNA等の転写を要する形態で導入する場合、宿主細胞において、サブユニット遺伝子は、当該宿主細胞で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主細胞において、サブユニット遺伝子は、染色体外に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。２つまたはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。 The form of introducing the subunit gene into the host cell is not particularly limited. The subunit gene may be retained in the host cell so that it can be expressed. Specifically, for example, when a subunit gene is introduced in a form requiring transcription such as DNA, the subunit gene is retained in a host cell so as to be expressible under the control of a promoter functioning in the host cell. Just do it. In the host cell, the subunit gene may be present extrachromosomally or may have been introduced onto the chromosome. When introducing two or more genes, each gene need only be retained in the host cell so that it can be expressed.

サブユニット遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主細胞において機能するものであれば特に制限されない。「宿主細胞において機能するプロモーター」とは、宿主細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主細胞由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、サブユニット遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、サブユニット遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。例えば、動物細胞において機能するプロモーターとしては、SV40プロモーター、EF1aプロモーター、RSVプロモーター、CMVプロモーター、SR
alphaプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。 The promoter for expressing the subunit gene is not particularly limited as long as it functions in the host cell. "Promoter functioning in a host cell" means a promoter having promoter activity in a host cell. The promoter may be a promoter derived from a host cell or a promoter derived from a foreign substance. The promoter may be a promoter unique to the subunit gene or a promoter of another gene. The promoter may be a stronger promoter than the unique promoter of the subunit gene. For example, promoters that function in animal cells include the SV40 promoter, EF1a promoter, RSV promoter, CMV promoter, and SR.
The alpha promoter is mentioned. Further, as the promoter, a highly active form of a conventional promoter may be obtained and used by using various reporter genes. Methods for assessing promoter strength and examples of potent promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).

サブユニット遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。サブユニット遺伝子を含むベクターを、「サブユニット遺伝子の発現ベクター」ともいう。サブユニット遺伝子の発現ベクターは、例えば、サブユニット遺伝子を含むDNA断片をベクターと連結することにより、構築することができる。サブユニット遺伝子の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、同遺伝子を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、薬剤耐性遺伝子などのマーカーを備えていてもよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーター等の発現調節配列を備えていてもよい。ベクターは、宿主細胞の種類やサブユニット遺伝子の導入形態等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞への遺伝子導入に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNAシリーズベクター（pcDNA3.1等；Thermo Fisher Scientific）、pBApo-CMVシリーズベクター（タカラバイオ）、pCI-neo（Promega）が挙げられる。なお、ベクターの種類や構成によっては、ベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るし、宿主細胞の染色体外で自律複製し得るし、あるいは宿主細胞の染色体外に一時的に保持され得る。例えば、SV40複製起点等のウイルスの複製起点を有するベクターは、動物細胞の染色体外で自律複製し得る。具体的には、例えば、pcDNAシリーズベクターはSV40複製起点を有しており、SV40のラージＴ抗原を発現する宿主細胞（COS-1やHEK293T等）において染色体外で自律複製し得る。 The subunit gene can be introduced into a host cell using, for example, a vector containing the gene. A vector containing a subunit gene is also referred to as a "subunit gene expression vector". The subunit gene expression vector can be constructed, for example, by ligating a DNA fragment containing the subunit gene with the vector. By introducing the subunit gene expression vector into the host cell, the gene can be introduced into the host cell. The vector may comprise a marker such as a drug resistance gene. In addition, the vector may include an expression regulatory sequence such as a promoter for expressing the inserted gene. The vector can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cell and the form of introduction of the subunit gene. For example, examples of vectors that can be used for gene transfer into animal cells include plasmid vectors and viral vectors. Examples of the virus vector include a retrovirus vector and an adenovirus vector. Examples of the plasmid vector include a pcDNA series vector (pcDNA3.1 and the like; Thermo Fisher Scientific), a pBApo-CMV series vector (Takara Bio), and pCI-neo (Promega). Depending on the type and composition of the vector, the vector can be integrated into the chromosome of the host cell, can autonomously replicate outside the chromosome of the host cell, or can be temporarily retained outside the chromosome of the host cell. For example, a vector having a viral origin of replication, such as the SV40 origin of replication, can autonomously replicate extrachromosomally in animal cells. Specifically, for example, the pcDNA series vector has an SV40 origin of replication and can autonomously replicate extrachromosomally in host cells expressing the SV40 large T antigen (COS-1, HEK293T, etc.).

また、サブユニット遺伝子は、例えば、同遺伝子を含む核酸断片を宿主細胞に導入することによっても、宿主細胞に導入することができる。サブユニット遺伝子を含む核酸断片を、「サブユニット遺伝子断片」ともいう。そのような断片としては、直鎖状DNAや直鎖状RNAが挙げられる。直鎖状RNAとしては、例えば、mRNAやcRNAが挙げられる。 The subunit gene can also be introduced into a host cell, for example, by introducing a nucleic acid fragment containing the gene into the host cell. A nucleic acid fragment containing a subunit gene is also referred to as a "subunit gene fragment". Examples of such fragments include linear DNA and linear RNA. Examples of linear RNA include mRNA and cRNA.

ベクターや核酸断片等の核酸を宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞等の宿主細胞にベクターや核酸断片等の核酸を導入する方法としては、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合は、同ベクター（ウイルス）を宿主細胞に感染させることにより、宿主細胞に同ベクターを導入することができる。 The method for introducing nucleic acid such as a vector or a nucleic acid fragment into a host cell can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cell. For example, examples of a method for introducing a nucleic acid such as a vector or a nucleic acid fragment into a host cell such as an animal cell include a DEAE dextran method, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, and a microinjection method. When the vector is a viral vector, the vector can be introduced into the host cell by infecting the host cell with the vector (virus).

また、本来的にサブユニット遺伝子を有する細胞を、サブユニット遺伝子の発現が増大するよう改変して用いてもよい。「遺伝子の発現が増大する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変細胞と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変細胞」とは、標的の遺伝子の発現が増大するように改変されていない対照細胞を意味する。非改変細胞としては、野生型の細胞や改変元の細胞が挙げられる。サブユニット遺伝子の発現を増大させる手法としては、サブユニット遺伝子のコピー数を増加させることやサブユニット遺伝子の転写効率や翻訳効率を向上させることが挙げられる。サブユニット遺伝子のコピー数の増加は、サブユニット遺伝子を宿主細胞に導入することにより達成できる。サブユニット遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入されるサブユニット遺伝子は、宿主細胞由来であってもよく、異種由来であってもよい。サブユニット遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、プロモーター等の遺伝子の発現調節配列の改変により達成できる。例えば、サブユニット遺伝子の転写効率の向上は、サブユニット遺伝子のプロ
モーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。 In addition, cells that originally have the subunit gene may be modified and used so that the expression of the subunit gene is increased. "Increased gene expression" means that the per-cell expression level of the gene is increased as compared to unmodified cells. The term "unmodified cell" as used herein means a control cell that has not been modified to increase the expression of the target gene. Examples of the unmodified cell include wild-type cells and cells from which the modification originated. Methods for increasing the expression of the subunit gene include increasing the number of copies of the subunit gene and improving the transcription efficiency and translation efficiency of the subunit gene. An increase in the number of copies of the subunit gene can be achieved by introducing the subunit gene into a host cell. The subunit gene can be introduced as described above. The subunit gene to be introduced may be derived from a host cell or a heterologous gene. Improvements in transcription efficiency and translation efficiency of subunit genes can be achieved by modifying the expression regulatory sequences of genes such as promoters. For example, an improvement in transcription efficiency of a subunit gene can be achieved by replacing the promoter of the subunit gene with a stronger promoter.

本発明の細胞は、目的物質のスクリーニングに利用できる限り、その他の任意の性質を有していてよい。そのような性質としては、例えば、ナトリウムに対するサブユニットの応答を測定するために有用な性質が挙げられる。 The cells of the present invention may have any other properties as long as they can be used for screening of the target substance. Such properties include, for example, properties useful for measuring the response of subunits to sodium.

本発明の細胞は、例えば、サブユニット以外の呈味受容体（「他の呈味受容体」ともいう）を有していてもよく、有していなくてもよい。本発明の細胞は、他の呈味受容体を有さないのが好ましい場合があり得る。他の呈味受容体を有さない細胞としては、他の呈味受容体をコードする遺伝子を有さない細胞や、他の呈味受容体をコードする遺伝子を有するが同遺伝子を発現していない細胞が挙げられる。本発明の細胞は、例えば、本来的に他の呈味受容体を有さないものであってもよく、他の呈味受容体を有さないように改変されたものであってもよい。他の呈味受容体を有さないように細胞を改変することは、例えば、他の呈味受容体をコードする遺伝子をノックアウトすることにより達成できる。 The cells of the present invention may or may not have, for example, taste receptors other than subunits (also referred to as "other taste receptors"). It may be preferable that the cells of the present invention do not have other taste receptors. Cells that do not have other taste receptors include cells that do not have a gene that encodes another taste receptor, or cells that have a gene that encodes another taste receptor but express the same gene. There are no cells. The cells of the present invention may be, for example, those which originally do not have other taste receptors, or those which have been modified so as not to have other taste receptors. Modifying cells to have no other taste receptors can be achieved, for example, by knocking out genes encoding other taste receptors.

また、本発明の細胞は、例えば、αγENaC/ASIC1cの活性化に直接的または間接的に応答するタンパク質を有していてもよい。言い換えると、本発明の細胞は、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を有していてよい。そのようなタンパク質としては、カルシウムチャネルや塩素チャネルが挙げられる。カルシウムチャネルとして、具体的には、電位依存性カルシウムチャネルが挙げられる。塩素チャネルとして、具体的には、カルシウム依存性塩素チャネルが挙げられる。 In addition, the cells of the present invention may have, for example, a protein that responds directly or indirectly to the activation of αγENaC / ASIC1c. In other words, the cells of the invention may have a gene encoding such a protein. Such proteins include calcium channels and chlorine channels. Specific examples of calcium channels include voltage-gated calcium channels. Specific examples of chlorine channels include calcium-dependent chlorine channels.

また、本発明の細胞は、例えば、測定するパラメーターに応じた構成要素を有していてよい。そのような構成要素としては、カルシウム指示薬や膜電位感受性色素等のプローブが挙げられる。カルシウム指示薬等のプローブを遺伝子から発現する場合、本発明の細胞は、当該プローブをコードする遺伝子を有していてよい。 In addition, the cells of the present invention may have, for example, components depending on the parameters to be measured. Such components include probes such as calcium indicators and voltage-sensitive dyes. When a probe such as a calcium indicator is expressed from a gene, the cell of the present invention may have a gene encoding the probe.

本発明の細胞は、本来的に上記例示したような性質を有するものであってもよく、上記例示したような性質を有するように改変されたものであってもよい。細胞の改変については、サブユニット遺伝子の導入等のサブユニット遺伝子に関する細胞の改変の記載を準用できる。上記例示したような遺伝子は、宿主細胞由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。また、上記例示したような遺伝子は、サブユニット遺伝子と、同一の由来であってもよく、そうでなくてもよい。２つまたはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。それらの遺伝子は、例えば、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、それらの遺伝子は、例えば、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。上記例示したような遺伝子およびそれにコードされるタンパク質は、それぞれ、例えば、公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、上記例示したような遺伝子およびそれにコードされるタンパク質は、それぞれ、例えば、公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、サブユニット遺伝子およびサブユニットの保存的バリアントに関する記載を準用できる。 The cell of the present invention may be originally one having the above-exemplified property, or may be modified to have the above-exemplified property. For cell modification, the description of cell modification relating to subunit gene such as introduction of subunit gene can be applied mutatis mutandis. The gene as exemplified above may be a gene derived from a host cell or a gene derived from a heterologous species. Further, the gene as exemplified above may or may not have the same origin as the subunit gene. When introducing two or more genes, each gene need only be retained in the host cell so that it can be expressed. For example, all of these genes may be carried on a single expression vector, or all of them may be carried on a chromosome. In addition, these genes may be separately retained on a plurality of expression vectors, for example, or may be separately retained on a single or a plurality of expression vectors and on a chromosome. The gene as exemplified above and the protein encoded by the gene may have, for example, a known gene and protein base sequence and amino acid sequence, respectively. In addition, the gene as exemplified above and the protein encoded by the gene may be, for example, a known gene and a conservative variant of the protein, respectively. For conservative variants of genes and proteins, the description of subunit genes and conservative variants of subunits can be applied mutatis mutandis.

サブユニット遺伝子を有する細胞は、そのまま、あるいは適宜サブユニット遺伝子を発現させて、サブユニットを有する細胞（本発明の細胞）として使用することができる。すなわち、サブユニット遺伝子を有する細胞が既にサブユニット遺伝子を発現している場合、当該細胞は、そのまま、サブユニットを有する細胞（本発明の細胞）として使用してもよい。また、サブユニット遺伝子を有する細胞にサブユニット遺伝子を発現させることにより、サブユニットを有する細胞（本発明の細胞）が得られる。例えば、サブユニット遺
伝子を有する細胞を培養することにより、サブユニット遺伝子を発現させることができ、以てサブユニットを有する細胞（本発明の細胞）が得られる。具体的には、例えば、サブユニット遺伝子の導入（例えばトランスフェクション）後、宿主細胞の培養を継続し、サブユニット遺伝子を発現させることができる。培地組成や培養条件は、サブユニット遺伝子を有する細胞を維持する（例えば増殖させる）ことができ、サブユニット遺伝子が発現する限り、特に制限されない。培養の際に、サブユニット遺伝子を有する細胞は、増殖してもよく、しなくてもよい。培地組成や培養条件は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜設定することができる。培養は、例えば、動物細胞等の細胞の培養に利用される通常の培地および通常の条件をそのまま、あるいは適宜改変して用いて実施することができる。例えば、動物細胞の培養に利用できる培地として、具体的には、Opti-MEM培地（Thermo
Fisher Scientific）、DMEM培地、RPMI 1640培地、CD293培地が挙げられる。培養は、例えば、３６℃～３８℃で、５％ＣＯ２等のＣＯ２含有雰囲気下で静置培養により行うことができる。また、必要に応じて、選択薬剤や発現誘導剤を用いることができる。 A cell having a subunit gene can be used as a cell having a subunit (cell of the present invention) as it is or by expressing the subunit gene as appropriate. That is, when a cell having a subunit gene has already expressed the subunit gene, the cell may be used as it is as a cell having a subunit (cell of the present invention). Further, by expressing the subunit gene in a cell having the subunit gene, a cell having the subunit (cell of the present invention) can be obtained. For example, by culturing a cell having a subunit gene, the subunit gene can be expressed, whereby a cell having a subunit (cell of the present invention) can be obtained. Specifically, for example, after the introduction of the subunit gene (for example, transfection), the culture of the host cell can be continued to express the subunit gene. The medium composition and culture conditions are not particularly limited as long as the cells having the subunit gene can be maintained (for example, proliferated) and the subunit gene is expressed. During culture, cells carrying the subunit gene may or may not proliferate. The medium composition and culture conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of host cell. The culture can be carried out, for example, by using a normal medium used for culturing cells such as animal cells and normal conditions as they are or by appropriately modifying them. For example, as a medium that can be used for culturing animal cells, specifically, Opti-MEM medium (Thermo).
Fisher Scientific), DMEM medium, RPMI 1640 medium, CD293 medium and the like. The culture can be carried out by static culture, for example, at 36 ° C. to 38 ° C. under a CO 2 containing atmosphere such as 5% CO 2 . Further, if necessary, a selective agent or an expression inducer can be used.

サブユニットが発現したことは、他のサブユニットと組み合わせた際のナトリウムに対する応答を測定することにより確認できる。また、サブユニットが発現したことは、サブユニット遺伝子から転写されるmRNAの量を測定することや、抗体を用いてウェスタンブロットによりサブユニットを検出することでも確認できる。 The expression of the subunit can be confirmed by measuring the response to sodium when combined with other subunits. The expression of the subunit can also be confirmed by measuring the amount of mRNA transcribed from the subunit gene or by detecting the subunit by Western blotting using an antibody.

本発明の細胞は、例えば、そのまま（培養物に含まれたまま）、あるいは培地から回収して、本発明の方法に使用することができる。また、培養物やそれから回収した細胞は、例えば、適宜、洗浄、濃縮、希釈、固定化等の処理をしてから、本発明の方法に使用してもよい。このように、本発明の細胞は、例えば、所望の程度に単離された形態で使用されてもよく、素材に含有された形態で使用されてもよい。サブユニットを有する他の構造物についても同様である。 The cells of the present invention can be used, for example, as they are (as they are contained in the culture) or recovered from the medium and used in the method of the present invention. In addition, the culture and the cells recovered from the culture may be appropriately washed, concentrated, diluted, immobilized, etc., and then used in the method of the present invention. As described above, the cells of the present invention may be used, for example, in a form isolated to a desired degree, or may be used in a form contained in a material. The same applies to other structures having subunits.

サブユニットを有する細胞膜は、例えば、本発明の細胞から調製することができる。サブユニットを有する細胞膜は、具体的には、例えば、本発明の細胞を破砕した際の膜画分として得られる。 The cell membrane having subunits can be prepared, for example, from the cells of the present invention. Specifically, the cell membrane having a subunit is obtained, for example, as a membrane fraction when the cells of the present invention are disrupted.

また、サブユニットを利用してサブユニットを有する人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜を製造することができる。例えば、予め調製された人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜にサブユニットを組み込むことで、サブユニットを有する人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜を調製することができる。また、例えば、サブユニットを原料として人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜にサブユニットを調製することで、サブユニットを有する人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜を調製することができる。サブユニットを有する人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜の調製には、サブユニットを有する膜画分等の適切な形態のサブユニットを用いることができる。人工脂質二重膜小胞や人工脂質二重膜は、例えば、公知の手段により製造できる。例えば、人工脂質二重膜の製造法としては、Montal-Mueller法や、液滴接触法（Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995 (2013)）が挙げられる。例えば、US2018-0095071には、ナトリウムチャネルTMC6を発現させた細胞から得た粗精製膜画分を用いて人工脂質二重膜を調製したことが開示されている。人工脂質二重膜小胞は、サブユニットを、例えば、その膜に有していてよい。脂質二重膜小胞としては、リポソームが挙げられる。 Further, the subunit can be used to produce an artificial lipid bilayer vesicle or an artificial lipid bilayer membrane having the subunit. For example, by incorporating a subunit into a pre-prepared artificial lipid bilayer vesicle or artificial lipid bilayer membrane, an artificial lipid bilayer vesicle or artificial lipid bilayer membrane having the subunit can be prepared. .. Further, for example, by preparing a subunit into an artificial lipid bilayer vesicle or an artificial lipid bilayer using the subunit as a raw material, an artificial lipid bilayer vesicle or an artificial lipid bilayer having the subunit can be prepared. can do. For the preparation of artificial lipid bilayer vesicles having subunits and artificial lipid bilayer vesicles, subunits having an appropriate form such as a membrane fraction having subunits can be used. Artificial lipid bilayer vesicles and artificial lipid bilayer vesicles can be produced, for example, by known means. For example, as a method for producing an artificial lipid bilayer membrane, the Montal-Mueller method and the droplet contact method (Kawano R. et al., Automated Parallel Recordings of Topologically Identified Single Ion Channels, Scientific Reports, 3, No. 1995 ( 2013)). For example, US2018-0095071 discloses the preparation of artificial lipid bilayers using crudely purified membrane fractions obtained from cells expressing the sodium channel TMC6. Artificial lipid bilayer vesicles may have subunits, for example, in their membrane. Lipid bilayer vesicles include liposomes.

細胞膜や人工脂質二重膜等の膜は、例えば、当該膜により区分された空間が生じるように使用することができる。そのような膜は、例えば、２つのウェル等の２つの空間を区分するように使用することができる。すなわち、そのような膜は、例えば、２つのウェル等の２つの空間を備える反応系であって、当該２つの空間が当該膜によって互いに区分され
ている反応系を提供するように使用することができる。そのような２つの空間は、その境界の少なくとも一部がそのような膜により区分されていればよい。そのような反応系は、例えば、上述したような装置として提供されてよい。例えば、US2018-0095071には、ナトリウムチャネルTMC6を有する人工脂質二重膜で区分された２つのウェルを備えたイオンチャネル測定デバイスが開示されている。 Membranes such as cell membranes and artificial lipid bilayer membranes can be used, for example, so as to create a space partitioned by the membrane. Such membranes can be used to separate two spaces, such as two wells. That is, such a membrane can be used to provide a reaction system comprising, for example, two spaces, such as two wells, wherein the two spaces are separated from each other by the membrane. can. The two such spaces need only be separated by such a membrane at least part of their boundary. Such a reaction system may be provided, for example, as an apparatus as described above. For example, US2018-0095071 discloses an ion channel measurement device with two wells separated by an artificial lipid bilayer membrane with sodium channel TMC6.

本発明の方法においては、３つのサブユニット（すなわちαENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質）の組み合わせが利用される。３つのサブユニットは、まとめて製造されてもよく、そうでなくてもよい。３つのサブユニットがまとめて製造される場合、それらサブユニットはそのまま本発明の方法に使用することができる。また、３つのサブユニットがまとめて製造されない場合、それらサブユニットは製造後に適宜組み合わせて本発明の方法に使用することができる。３つのサブユニットは、具体的には、それらサブユニットが共同で機能できるよう、それらサブユニットが共存した状態で本発明の方法に使用すればよい。例えば、３つのサブユニットを構造物に担持した形態で使用する場合、それらサブユニットを単一の構造物に担持した形態で使用することができる。３つのサブユニットは、例えば、単一の細胞に担持した形態で使用することができる。そのような細胞は、例えば、３つのサブユニットを宿主細胞で共発現することにより得られる。３つのサブユニットは、例えば、複合体（すなわちヘテロ多量体）を形成して機能してもよい。３つのサブユニットは、具体的には、例えば、それらサブユニット全てを含む複合体（すなわちヘテロ多量体）を形成して機能してもよい。 In the method of the present invention, a combination of three subunits (ie, αENaC protein, γENaC protein, and ASIC1c protein) is utilized. The three subunits may or may not be manufactured together. When the three subunits are manufactured together, the subunits can be used as they are in the method of the present invention. Further, when the three subunits are not manufactured together, the subunits can be appropriately combined after manufacture and used in the method of the present invention. Specifically, the three subunits may be used in the method of the present invention in a state where the subunits coexist so that the subunits can function jointly. For example, when three subunits are used in a form supported on a structure, those subunits can be used in a form supported on a single structure. The three subunits can be used, for example, in a single cell-supported form. Such cells are obtained, for example, by co-expressing the three subunits in a host cell. The three subunits may function, for example, by forming a complex (ie, a heteromultimer). Specifically, the three subunits may function, for example, by forming a complex (that is, a heteromultimer) containing all of these subunits.

＜４＞本発明の方法
本発明の方法は、in vitroで実施することができる。 <4> Method of the present invention The method of the present invention can be carried out in vitro.

まず、試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させることができる。言い換えると、ナトリウムの存在下でαγENaC/ASIC1cと試験物質を接触させることができる。また、言い換えると、αγENaC/ASIC1cとナトリウムおよび試験物質を接触させることができる。すなわち、「試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる」、「ナトリウムの存在下でαγENaC/ASIC1cと試験物質を接触させる」、および「αγENaC/ASIC1cとナトリウムおよび試験物質を接触させる」という表現は、互いに同義で用いることができる。以下、ナトリウムおよび試験物質を総称して、単に、「物質」ともいう。 First, αγENaC / ASIC1c can be brought into contact with sodium in the presence of the test substance. In other words, αγENaC / ASIC1c can be contacted with the test substance in the presence of sodium. In other words, αγENaC / ASIC1c can be brought into contact with sodium and the test substance. That is, "contact αγENaC / ASIC1c with sodium in the presence of the test substance", "contact αγENaC / ASIC1c with the test substance in the presence of sodium", and "contact sodium and the test substance with αγENaC / ASIC1c". Can be used synonymously with each other. Hereinafter, sodium and the test substance are collectively referred to simply as "substance".

αγENaC/ASIC1cと両物質との接触が実施される系を「反応系」ともいう。αγENaC/ASIC1cと両物質との接触は、適当な液体中で実施することができる。αγENaC/ASIC1cと両物質との接触が実施される液体を「反応液」ともいう。すなわち、例えば、適当な反応液中でαγENaC/ASIC1cと両物質とを共存させることにより、αγENaC/ASIC1cと両物質とを接触させることができる。具体的には、例えば、αγENaC/ASIC1c（例えばαγENaC/ASIC1cを有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および両物質を適当な液体媒体中に溶解、懸濁、分散等して共存させることにより、αγENaC/ASIC1cと両物質とを接触させることができる。液体媒体としては、水や水性緩衝液等の水性媒体が挙げられる。なお、両物質等の２種またはそれ以上の成分をまとめてαγENaC/ASIC1cに接触させる場合、それらの成分とαγENaC/ASIC1cとの接触は、同時に開始してもよく、そうでなくてもよい。すなわち、例えば、或る成分とαγENaC/ASIC1cとの接触を開始した後、別の成分をさらに反応系に添加してもよい。具体的には、例えば、試験物質とαγENaC/ASIC1cとの接触を開始した後でナトリウムをさらに反応系に添加してもよく、ナトリウムとαγENaC/ASIC1cとの接触を開始した後で試験物質をさらに反応系に添加してもよい。通常は、試験物質とナトリウムとを予め混合してからαγENaC/ASIC1cに接触させればよい。反応条件（αγENaC/ASIC1cと両物質との接触を実施する条件）は、目的物質のスクリーニングが可能である限り、特に制限されない。反応条件は、αγENaC/ASIC1cの使用形態、試験物
質の種類、αγENaC/ASIC1cの応答の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、タンパク質とリガンド間の相互作用等の物質間の相互作用を測定する際の公知の反応条件をそのまま、あるいは適宜改変して利用してもよい。試験物質の濃度は、例えば、0.01 nM～500 mM、10 nM～100 mM、または1μM～10 mMであってもよい。ナトリウムの濃度は、例えば、5 mM～500 mM、20 mM～300 mM、または50 mM～200 mMであってもよい。αγENaC/ASIC1cの濃度は、例えば、1 pg/mL～10 mg/mLであってもよい。また、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いる場合、αγENaC/ASIC1cを有する細胞の濃度は、例えば、10 cell/mL～10,000,000 cell/mLであってもよい。αγENaC/ASIC1cと両物質との接触は、適当な時点で終了してもよいし、しなくてもよい。αγENaC/ASIC1cと両物質との接触は、通常、少なくともナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答の測定時まで継続されていてよい。αγENaC/ASIC1cと両物質との接触の継続時間は、例えば、０．１秒以上、０．５秒以上、１秒以上、５秒以上、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、４０秒以上、５０秒以上、１分以上、２分以上、３分以上、５分以上、１０分以上、３０分以上、１時間以上、または２時間以上であってもよく、２４時間以下、１２時間以下、６時間以下、２時間以下、または１時間以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。反応系は、目的物質のスクリーニングが可能である限り、αγENaC/ASIC1c（例えばαγENaC/ASIC1cを有する細胞等の上記例示したような形態のもの）および両物質に加えて、その他の成分を含有していてよい。その他の成分は、αγENaC/ASIC1cの使用形態、試験物質の種類、αγENaC/ASIC1cの応答の測定手法等の諸条件に応じて適宜設定できる。その他の成分としては、カルシウム塩等の塩類、グルコース等の炭素源、その他の培地成分、ｐＨ緩衝剤が挙げられる。 The system in which the contact between αγENaC / ASIC1c and both substances is carried out is also called a “reaction system”. Contact between αγENaC / ASIC1c and both substances can be carried out in a suitable liquid. The liquid in which αγENaC / ASIC1c is brought into contact with both substances is also called a “reaction liquid”. That is, for example, by allowing αγENaC / ASIC1c and both substances to coexist in an appropriate reaction solution, αγENaC / ASIC1c and both substances can be brought into contact with each other. Specifically, for example, αγENaC / ASIC1c (for example, a cell having αγENaC / ASIC1c in the above-exemplified form) and both substances are dissolved, suspended, dispersed, etc. in an appropriate liquid medium to coexist. As a result, αγENaC / ASIC1c can be brought into contact with both substances. Examples of the liquid medium include an aqueous medium such as water and an aqueous buffer solution. When two or more components such as both substances are brought into contact with αγENaC / ASIC1c together, the contact between those components and αγENaC / ASIC1c may or may not be started at the same time. That is, for example, after starting contact between one component and αγENaC / ASIC1c, another component may be further added to the reaction system. Specifically, for example, sodium may be further added to the reaction system after the contact between the test substance and αγENaC / ASIC1c is started, and the test substance is further added after the contact between sodium and αγENaC / ASIC1c is started. It may be added to the reaction system. Usually, the test substance and sodium may be mixed in advance and then contacted with αγENaC / ASIC1c. The reaction conditions (conditions for carrying out contact between αγENaC / ASIC1c and both substances) are not particularly limited as long as the target substance can be screened. The reaction conditions can be appropriately set according to various conditions such as the usage pattern of αγENaC / ASIC1c, the type of test substance, and the measurement method of the response of αγENaC / ASIC1c. As the reaction conditions, for example, known reaction conditions for measuring an interaction between substances such as an interaction between a protein and a ligand may be used as they are, or may be appropriately modified and used. The concentration of the test substance may be, for example, 0.01 nM to 500 mM, 10 nM to 100 mM, or 1 μM to 10 mM. The concentration of sodium may be, for example, 5 mM to 500 mM, 20 mM to 300 mM, or 50 mM to 200 mM. The concentration of αγENaC / ASIC1c may be, for example, 1 pg / mL to 10 mg / mL. When cells having αγENaC / ASIC1c are used, the concentration of the cells having αγENaC / ASIC1c may be, for example, 10 cells / mL to 10,000,000 cells / mL. Contact between αγENaC / ASIC1c and both substances may or may not be terminated at an appropriate time. Contact between αγENaC / ASIC1c and both substances may usually continue at least until the measurement of the response of αγENaC / ASIC1c to sodium. The duration of contact between αγENaC / ASIC1c and both substances is, for example, 0.1 seconds or longer, 0.5 seconds or longer, 1 second or longer, 5 seconds or longer, 10 seconds or longer, 20 seconds or longer, 30 seconds or longer, 40 seconds. It may be 50 seconds or more, 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, 30 minutes or more, 1 hour or more, or 2 hours or more, 24 hours or less, 12 hours or more. Hereinafter, it may be 6 hours or less, 2 hours or less, or 1 hour or less, and may be a consistent combination thereof. The reaction system contains αγENaC / ASIC1c (for example, cells having αγENaC / ASIC1c and the like as exemplified above) and both substances as long as the target substance can be screened, and other components. It's okay. Other components can be appropriately set according to various conditions such as the usage pattern of αγENaC / ASIC1c, the type of test substance, and the measurement method of the response of αγENaC / ASIC1c. Examples of other components include salts such as calcium salts, carbon sources such as glucose, other medium components, and pH buffers.

ナトリウムは、目的物質のスクリーニングに利用可能な任意の形態で使用することができる。すなわち、具体的には、ナトリウムは、αγENaC/ASIC1cの応答を惹起できる任意の形態で使用することができる。ナトリウムは、例えば、反応系でナトリウムイオンを与える（生じる）物質の形態で反応系に提供され使用されてよい。そのような物質を「ナトリウムイオン源」ともいう。言い換えると、ナトリウムとしては、ナトリウムイオン源を使用することができる。ナトリウムイオン源としては、ナトリウム塩が挙げられる。ナトリウム塩としては、塩化ナトリウムが挙げられる。すなわち、一態様において、「ナトリウムの存在下」とは、ナトリウムイオン源（塩化ナトリウム等）の存在下を意味してよい。また、一態様において、「αγENaC/ASIC1cとナトリウムの接触」とは、αγENaC/ASIC1cとナトリウムイオン源（塩化ナトリウム等）の接触を意味してよい。また、一態様において、「ナトリウムに対する応答」とは、ナトリウムイオン源（塩化ナトリウム等）に対する応答を意味してよい。 Sodium can be used in any form available for screening for the substance of interest. That is, specifically, sodium can be used in any form capable of eliciting a response of αγENaC / ASIC1c. Sodium may be provided and used in the reaction system, for example, in the form of a substance that gives (produces) sodium ions in the reaction system. Such substances are also referred to as "sodium ion sources". In other words, as sodium, a sodium ion source can be used. Examples of the sodium ion source include sodium salts. Examples of the sodium salt include sodium chloride. That is, in one embodiment, "in the presence of sodium" may mean the presence of a sodium ion source (sodium chloride or the like). Further, in one embodiment, "contact between αγENaC / ASIC1c and sodium" may mean contact between αγENaC / ASIC1c and a sodium ion source (sodium chloride or the like). Further, in one embodiment, the "response to sodium" may mean a response to a sodium ion source (sodium chloride or the like).

ナトリウムは、通常、イオン化して反応系に存在していてよい。すなわち、「ナトリウムの存在下」とは、ナトリウムイオンの存在下を意味してよい。また、「αγENaC/ASIC1cとナトリウムの接触」とは、αγENaC/ASIC1cとナトリウムイオンの接触を意味してよい。また、「ナトリウムに対する応答」とは、ナトリウムイオンに対する応答を意味してよい。塩化ナトリウム等のナトリウムイオン源についても同様である。すなわち、例えば、「塩化ナトリウムの存在下」とは、塩化物イオンとナトリウムイオンの存在下を意味してよい。また、例えば、「αγENaC/ASIC1cと塩化ナトリウムの接触」とは、塩化物イオンの存在下でのαγENaC/ASIC1cとナトリウムイオンの接触を意味してよい。また、例えば、「塩化ナトリウムに対する応答」とは、塩化物イオンの存在下でのナトリウムイオンに対する応答を意味してよい。 Sodium may normally be ionized and present in the reaction system. That is, "in the presence of sodium" may mean the presence of sodium ions. Further, "contact between αγENaC / ASIC1c and sodium" may mean contact between αγENaC / ASIC1c and sodium ion. Further, the "response to sodium" may mean a response to sodium ions. The same applies to sodium ion sources such as sodium chloride. That is, for example, "in the presence of sodium chloride" may mean the presence of chloride ions and sodium ions. Further, for example, "contact between αγENaC / ASIC1c and sodium chloride" may mean contact between αγENaC / ASIC1c and sodium ion in the presence of chloride ion. Further, for example, "response to sodium chloride" may mean a response to sodium ion in the presence of chloride ion.

次いで、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定することができる。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答は、後述するように、試験物質による応答調節を評価するための指標となる。よって、「ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定する」とは、具体的には、試験物質による応答調節を測定することを意味してもよい。「
試験物質による応答調節」とは、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答が試験物質により調節されることをいう。応答調節としては、応答促進や応答阻害が挙げられる。 The response of αγENaC / ASIC1c to sodium can then be measured. The response of αγENaC / ASIC1c to sodium is an index for evaluating the response regulation by the test substance, as will be described later. Therefore, "measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium" may specifically mean measuring the response regulation by the test substance. "
"Regulation of response by test substance" means that the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is regulated by the test substance. Response regulation includes response promotion and response inhibition.

ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、試験物質が目的物質であった場合に測定可能な程度に当該試験物質による応答調節が生じている時点であれば特に制限されない。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、具体的には、αγENaC/ASIC1cと両物質との接触が開始した時点から、試験物質による応答調節が消失する時点までの適当な時点であってよい。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、例えば、試験物質による応答調節が最大となる時点であってもよい。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、通常、αγENaC/ASIC1cと両物質との接触中であってよい。また、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、例えば、αγENaC/ASIC1cと両物質との接触が開始した時点の０．１秒後以降、０．５秒後以降、１秒後以降、５秒後以降、１０秒後以降、２０秒後以降、３０秒後以降、４０秒後以降、５０秒後以降、１分後以降、２分後以降、３分後以降、５分後以降、１０分後以降、３０分後以降、１時間後以降、または２時間後以降であってもよく、２４時間後まで、１２時間後まで、６時間後まで、２時間後まで、１時間後まで、３０分後まで、１０分後まで、５分後まで、３分後まで、２分後まで、または１分後までであってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するタイミングは、具体的には、例えば、αγENaC/ASIC1cと両物質との接触が開始した時点の１秒後以降１０分後までであってもよい。 The timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is not particularly limited as long as the response is adjusted by the test substance to the extent that it can be measured when the test substance is the target substance. Specifically, the timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is an appropriate time from the time when the contact between αγENaC / ASIC1c and both substances starts to the time when the response regulation by the test substance disappears. good. The timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium may be, for example, the time when the response regulation by the test substance is maximized. The timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium may normally be during contact between αγENaC / ASIC1c and both substances. The timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is, for example, 0.1 seconds or later, 0.5 seconds or later, and 1 second or later when the contact between αγENaC / ASIC1c and both substances starts. After 5 seconds, after 10 seconds, after 20 seconds, after 30 seconds, after 40 seconds, after 50 seconds, after 1 minute, after 2 minutes, after 3 minutes, after 5 minutes, It may be after 10 minutes, after 30 minutes, after 1 hour, or after 2 hours, up to 24 hours, up to 12 hours, up to 6 hours, up to 2 hours, up to 1 hour. , 30 minutes, 10 minutes, 5 minutes, 3 minutes, 2 minutes, or 1 minute, or a consistent combination thereof. Specifically, the timing for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium may be, for example, from 1 second to 10 minutes after the start of contact between αγENaC / ASIC1c and both substances.

次いで、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答に基づいて、試験物質が目的物質であるかを同定することができる。すなわち、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答に基づいて、試験物質を目的物質として同定することができる。 Then, based on the response of αγENaC / ASIC1c to sodium, it is possible to identify whether the test substance is the target substance. That is, the test substance can be identified as the target substance based on the response of αγENaC / ASIC1c to sodium.

具体的には、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答に基づいて試験物質による応答調節を評価することができ、さらに、試験物質による応答調節に基づいて試験物質を目的物質として同定することができる。より具体的には、試験物質による応答調節が認められた場合に、すなわち、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答が試験物質により調節されている場合に、当該試験物質を目的物質として同定することができる。例えば、試験物質による応答促進が認められた場合に、すなわち、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答が試験物質により促進されている場合に、当該試験物質をナトリウムの作用を促進する物質（塩味増強物質等）として同定することができる。また、例えば、試験物質による応答阻害が認められた場合に、すなわち、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答が試験物質により阻害されている場合に、当該試験物質をナトリウムの作用を阻害する物質（塩味低減物質等）として同定することができる。 Specifically, the response regulation by the test substance can be evaluated based on the response of αγENaC / ASIC1c to sodium, and the test substance can be identified as the target substance based on the response regulation by the test substance. More specifically, when the response of the test substance is regulated, that is, when the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is regulated by the test substance, the test substance can be identified as the target substance. .. For example, when the response promotion by the test substance is recognized, that is, when the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is promoted by the test substance, the substance that promotes the action of sodium on the test substance (salt taste enhancer, etc.) ) Can be identified. Further, for example, when the response inhibition by the test substance is observed, that is, when the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is inhibited by the test substance, the substance that inhibits the action of sodium on the test substance (reduction of saltiness). It can be identified as a substance, etc.).

ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答としては、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化が挙げられる。すなわち、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答は、例えば、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化を指標として測定することができる。すなわち、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化が試験物質により調節されている場合に、当該試験物質を目的物質として同定することができる。ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化が試験物質により調節されることを、「試験物質による活性化調節」ともいう。活性化調節としては、活性化促進や活性化阻害が挙げられる。例えば、試験物質による活性化促進が認められた場合に、すなわち、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化が試験物質により促進されている場合に、当該試験物質をナトリウムの作用を促進する物質（塩味増強物質等）として同定することができる。また、例えば、試験物質による活性化阻害が認められた場合に、すなわち、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化が試験物質により阻害されている場合に、当該試験物質をナトリウムの作用を阻害す
る物質（塩味低減物質等）として同定することができる。試験物質による活性化促進を「試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化」ともいう。試験物質による活性化阻害を「試験物質によるαγENaC/ASIC1cの不活性化」ともいう。 Responses of αγENaC / ASIC1c to sodium include activation of αγENaC / ASIC1c by sodium. That is, the response of αγENaC / ASIC1c to sodium can be measured, for example, by using the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium as an index. That is, when the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium is regulated by the test substance, the test substance can be identified as the target substance. The regulation of αγENaC / ASIC1c activation by sodium by the test substance is also referred to as “regulation of activation by the test substance”. Examples of activation regulation include activation promotion and activation inhibition. For example, when the test substance promotes activation, that is, when the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium is promoted by the test substance, the test substance is used as a substance that promotes the action of sodium (enhancement of saltiness). It can be identified as a substance, etc.). Further, for example, when the activation inhibition by the test substance is observed, that is, when the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium is inhibited by the test substance, the substance that inhibits the action of sodium on the test substance ( It can be identified as a salt-reducing substance, etc.). Promotion of activation by the test substance is also referred to as "activation of αγENaC / ASIC1c by the test substance". Inhibition of activation by the test substance is also referred to as "inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance".

試験物質による活性化調節は、前記工程（Ａ）を実施した際の（すなわち試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件における）αγENaC/ASIC1cの活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）を指標として決定することができる。すなわち、上記工程（Ｂ）は、例えば、（Ｂ１）活性化の程度Ｄ１を測定する工程であってよい。また、上記工程（Ｃ）は、例えば、（Ｃ１）活性化の程度Ｄ１に基づいて試験物質が目的物質であるかを同定する工程であってよい。 The regulation of activation by the test substance is the degree of activation (degree of activation) of αγENaC / ASIC1c when the step (A) is carried out (that is, under the condition that αγENaC / ASIC1c and sodium are brought into contact with each other in the presence of the test substance). It can be determined using D1) as an index. That is, the step (B) may be, for example, a step of measuring the degree D1 of (B1) activation. Further, the step (C) may be, for example, a step of identifying whether the test substance is the target substance based on (C1) the degree of activation D1.

試験物質による活性化調節は、具体的には、前記工程（Ａ）を実施した際の（すなわち試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件における）αγENaC/ASIC1cの活性化の程度（活性化の程度Ｄ１）と対照条件におけるαγENaC/ASIC1cの活性化の程度（活性化の程度Ｄ２）とを比較することにより決定できる。すなわち、上記工程（Ｃ１）は、例えば、（Ｃ２）活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２との差に基づいて試験物質が目的物質であるかを同定する工程であってもよい。 The regulation of activation by the test substance is specifically the degree of activation of αγENaC / ASIC1c when the step (A) is carried out (that is, under the condition that αγENaC / ASIC1c and sodium are brought into contact with each other in the presence of the test substance). It can be determined by comparing (degree of activation D1) with the degree of activation of αγENaC / ASIC1c under control conditions (degree of activation D2). That is, the step (C1) may be, for example, a step of identifying whether the test substance is the target substance based on the difference between the degree of activation D1 and the degree of activation D2 (C2).

「対照条件」とは、下記条件（Ｃ２－１）または（Ｃ２－２）をいう：
（Ｃ２－１）試験物質の非存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件；
（Ｃ２－２）試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件であって、該試験物質の濃度が上記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。 "Control condition" means the following condition (C2-1) or (C2-2):
(C2-1) Conditions for contacting αγENaC / ASIC1c with sodium in the absence of the test substance;
(C2-2) The condition that αγENaC / ASIC1c is brought into contact with sodium in the presence of the test substance, and the concentration of the test substance is lower than the concentration of the test substance in the above step (A).

言い換えると、試験物質による活性化調節は、例えば、ナトリウムの存在下での試験物質の有無または濃度差によるαγENaC/ASIC1cの活性化の程度の差を指標として決定できる。 In other words, the regulation of activation by the test substance can be determined, for example, by using the difference in the degree of activation of αγENaC / ASIC1c due to the presence or absence of the test substance in the presence of sodium or the difference in concentration as an index.

上記条件（Ｃ２－１）としては、αγENaC/ASIC1cと試験物質を接触させる前の条件であって、αγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件が挙げられる。上記条件（Ｃ２－１）としては、αγENaC/ASIC1cとナトリウムおよび試験物質を接触させた後の条件であって、試験物質が実質的に（例えば完全に）反応系から除去され、且つ試験物質による応答調節が実質的に（例えば完全に）消失している条件も挙げられる。上記条件（Ｃ２－２）における試験物質の濃度は、活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２とで測定可能な程度に差が認められる濃度であれば特に制限されない。上記条件（Ｃ２－２）における試験物質の濃度は、例えば、上記工程（Ａ）における試験物質の濃度の、９０％以下、７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の濃度であってよい。対照条件は、試験物質の有無または濃度以外は、試験物質による応答調節を評価することができる限り、特に制限されない。対照条件は、試験物質の有無または濃度以外は、例えば、上記工程（Ａ）の条件と同一であってよい。 Examples of the above condition (C2-1) include conditions before contacting αγENaC / ASIC1c with the test substance, and conditions for contacting αγENaC / ASIC1c with sodium. The above condition (C2-1) is a condition after contacting αγENaC / ASIC1c with sodium and the test substance, in which the test substance is substantially (for example, completely) removed from the reaction system and depends on the test substance. There are also conditions in which response regulation has virtually (eg, completely) disappeared. The concentration of the test substance under the above condition (C2-2) is not particularly limited as long as there is a measurable difference between the degree of activation D1 and the degree of activation D2. The concentration of the test substance under the above condition (C2-2) is, for example, 90% or less, 70% or less, 50% or less, 30% or less, 20% or less, 10% of the concentration of the test substance in the step (A). Below, the concentration may be 5% or less, or 1% or less. The control conditions are not particularly limited as long as the response regulation by the test substance can be evaluated except for the presence or concentration of the test substance. The control conditions may be the same as those in the above step (A), for example, except for the presence or absence or concentration of the test substance.

本発明の方法は、活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含んでいてもよい。活性化の程度Ｄ１と活性化の程度Ｄ２は、単一の反応系において時間差で測定されてもよいし、それぞれ別個の反応系において同時にあるいは時間差で測定されてもよい。活性化の程度Ｄ２は、活性化の程度Ｄ１よりも先に測定されてもよく、後に測定されてもよい。例えば、活性化の程度Ｄ２を測定した後、反応系に試験物質を添加して活性化の程度Ｄ１を測定してもよい。 The method of the present invention may include a step of measuring the degree of activation D2. The degree of activation D1 and the degree of activation D2 may be measured in a single reaction system with a time lag, or may be measured simultaneously or with a time lag in separate reaction systems. The degree of activation D2 may be measured before or after the degree of activation D1. For example, after measuring the degree of activation D2, a test substance may be added to the reaction system to measure the degree of activation D1.

活性化の程度Ｄ１とＤ２に差がある場合に、試験物質による活性化調節が認められたと判断できる。 When there is a difference in the degree of activation between D1 and D2, it can be determined that activation regulation by the test substance was observed.

例えば、活性化の程度Ｄ１が高い場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化が認められたと判断できる。具体的には、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高い場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化が認められたと判断できる。例えば、活性化の程度Ｄ２に対する活性化の程度Ｄ１の比率が１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、２００％以上、２５０％以上、または３００％以上である場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化が認められたと判断してもよい。 For example, when the degree of activation D1 is high, it can be determined that activation of αγENaC / ASIC1c by the test substance was observed. Specifically, when the degree of activation D1 is higher than the degree of activation D2, it can be determined that activation of αγENaC / ASIC1c by the test substance was observed. For example, the ratio of the degree of activation D1 to the degree of activation D2 is 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% or more, 170% or more, 180% or more, 190% or more, 200%. If it is 250% or more, or 300% or more, it may be determined that activation of αγENaC / ASIC1c by the test substance is recognized.

また、例えば、活性化の程度Ｄ１が低い場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの不活性化が認められたと判断できる。具体的には、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの不活性化が認められたと判断できる。例えば、活性化の程度Ｄ２に対する活性化の程度Ｄ１の比率が８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満である場合に、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの不活性化が認められたと判断してもよい。 Further, for example, when the degree of activation D1 is low, it can be determined that the inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance was observed. Specifically, when the degree of activation D1 is lower than the degree of activation D2, it can be determined that the inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance was observed. For example, the ratio of the degree of activation D1 to the degree of activation D2 is less than 80%, less than 70%, less than 60%, less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, or less than 10%. In this case, it may be determined that the inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance was observed.

試験物質による活性化調節を決定する場合についての上記の記載は、他の指標に基づいて試験物質による応答調節を決定する場合にも準用できる。 The above description regarding the case of determining the activation regulation by the test substance can also be applied mutatis mutandis to the case of determining the response regulation by the test substance based on other indicators.

ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定する手法は特に制限されない。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定する手法は、αγENaC/ASIC1cの使用形態や測定する応答の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答は、例えば、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化を測定できる適当な手法により測定することができる。 The method for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is not particularly limited. The method for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium can be appropriately selected according to various conditions such as the usage pattern of αγENaC / ASIC1c and the type of response to be measured. The response of αγENaC / ASIC1c to sodium can be measured, for example, by any suitable technique capable of measuring the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium.

「αγENaC/ASIC1cの活性化」とは、同タンパク質がイオンチャネルとして機能することを意味してよく、特に、同タンパク質がナトリウムチャネルとして機能することを意味してよい。よって、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化は、例えば、ナトリウムイオンの輸送またはそれに伴う現象を測定することにより、測定することができる。ナトリウムイオンの輸送またはそれに伴う現象を測定するための指標としては、イオン流入、膜電流、膜電位、イオン濃度が挙げられる。すなわち、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化は、例えば、これらのパラメーターの１種またはそれ以上を指標として測定することができる。また、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答は、試験物質による応答調節を評価するための指標となる。すなわち、言い換えると、試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化は、例えば、これらのパラメーターの１種またはそれ以上を指標として測定することができる。ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化または試験物質によるαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化は、例えば、膜電流、膜電位、またはイオン濃度を指標として測定されてよい。イオン流入としては、膜により区分された空間内へのイオン流入が挙げられ、特に、細胞内へのイオン流入、人工脂質二重膜小胞内へのイオン流入、細胞膜や人工脂質二重膜等の膜により区分された空間内へのイオン流入が挙げられる。膜電流としては、細胞の膜電流、人工脂質二重膜小胞の膜電流、細胞膜の膜電流、人工脂質二重膜の膜電流が挙げられる。膜電位としては、細胞の膜電位、人工脂質二重膜小胞の膜電位、細胞膜の膜電位、人工脂質二重膜の膜電位が挙げられる。イオン濃度としては、膜により区分された空間内のイオン濃度が挙げられ、特に、細胞内のイオン濃度、人工脂質二重膜小胞内のイオン濃度、細胞膜や人工脂質二重膜等の膜により区分された空間内のイオン濃度が挙げられる。膜により区分された空間としては、後述するような、膜により区分された内部空間が挙げられる。イオン流入またはイオン濃度について言及されるイオンとしては、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオンが挙げられる。 "Activation of αγENaC / ASIC1c" may mean that the protein functions as an ion channel, and in particular, it may mean that the protein functions as a sodium channel. Therefore, the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium can be measured, for example, by measuring the transport of sodium ions or the accompanying phenomenon. Indicators for measuring sodium ion transport or associated phenomena include ion influx, membrane current, membrane potential, and ion concentration. That is, the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium can be measured, for example, using one or more of these parameters as an index. In addition, the response of αγENaC / ASIC1c to sodium is an index for evaluating the response regulation by the test substance. That is, in other words, the activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance can be measured, for example, using one or more of these parameters as an index. The activation of αγENaC / ASIC1c by sodium or the activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c by the test substance may be measured, for example, by using a membrane current, a membrane potential, or an ion concentration as an index. Examples of the ion inflow include ion inflow into the space divided by the membrane, and in particular, ion inflow into the cell, ion inflow into the artificial lipid bilayer vesicle, cell membrane, artificial lipid bilayer membrane, etc. Ion inflow into the space separated by the membrane of the vesicle can be mentioned. Examples of the membrane current include the membrane current of cells, the membrane current of artificial lipid double membrane vesicles, the membrane current of cell membranes, and the membrane current of artificial lipid double membranes. Examples of the membrane potential include the membrane potential of cells, the membrane potential of artificial lipid double membrane vesicles, the membrane potential of cell membranes, and the membrane potential of artificial lipid double membranes. Examples of the ion concentration include the ion concentration in the space divided by the membrane, and in particular, the ion concentration in the cell, the ion concentration in the artificial lipid bilayer vesicle, and the membrane such as the cell membrane or the artificial lipid bilayer membrane. The ion concentration in the partitioned space can be mentioned. Examples of the space partitioned by the membrane include an internal space partitioned by the membrane, which will be described later. Ions referred to as ion influx or ion concentration include sodium ions, calcium ions, chloride ions.

以下、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いる場合を参照してαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化を測定する手法について例示する。 Hereinafter, a method for measuring the activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c will be illustrated with reference to the case of using cells having αγENaC / ASIC1c.

すなわち、細胞内へのイオン流入（すなわち、細胞外から細胞内へのイオンの流れ）が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、αγENaC/ASIC1cが活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞の膜電位が対照条件と比較して増大（脱分極）または減少（過分極）した場合に、それぞれ、αγENaC/ASIC1cが活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞の内向きの膜電流が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、αγENaC/ASIC1cが活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。また、細胞内のイオン濃度が対照条件と比較して増大または減少した場合に、それぞれ、αγENaC/ASIC1cが活性化または不活性化された（すなわち、活性化の程度Ｄ１が活性化の程度Ｄ２よりも高いまたは低い）と判断できる。なお、αγENaC/ASIC1cは、直接的または間接的に上記例示したようなパラメーターに影響してよい。例えば、一態様においては、αγENaC/ASIC1cを通してナトリウムイオンが細胞内に流入することにより細胞の膜電位が脱分極し、脱分極によりカルシウムチャネルを通してのカルシウムイオンの細胞内への流入が誘導されてもよい。また、例えば、一態様においては、カルシウムチャネルを通してカルシウムイオンが細胞内へ流入することにより細胞内カルシウムイオン濃度が増大し、以て塩素チャネルを通しての塩化物イオンの細胞内への流入が誘導されてもよい。 That is, αγENaC / ASIC1c was activated or inactivated when the intracellular ion influx (that is, the flow of ions from the extracellular to the intracellular) was increased or decreased as compared with the control condition. (That is, the degree of activation D1 is higher or lower than the degree of activation D2). Also, when the cell membrane potential increased (depolarized) or decreased (hyperpolarized) compared to the control condition, αγENaC / ASIC1c was activated or inactivated (ie, degree of activation D1), respectively. Is higher or lower than the degree of activation D2). Also, when the inward membrane current of the cell increased or decreased compared to the control condition, αγENaC / ASIC1c was activated or inactivated (ie, the degree of activation D1 was the degree of activation, respectively). It can be determined that it is higher or lower than D2). In addition, when the intracellular ion concentration increased or decreased as compared with the control condition, αγENaC / ASIC1c was activated or inactivated (that is, the degree of activation D1 was higher than the degree of activation D2, respectively). Can be judged to be high or low). It should be noted that αγENaC / ASIC1c may directly or indirectly affect the parameters as exemplified above. For example, in one embodiment, even if sodium ions flow into the cell through αγENaC / ASIC1c, the membrane potential of the cell is depolarized, and depolarization induces the influx of calcium ions through the calcium channel into the cell. good. Further, for example, in one embodiment, the calcium ion flows into the cell through the calcium channel to increase the intracellular calcium ion concentration, thereby inducing the influx of chloride ion into the cell through the chlorine channel. May be good.

これらのパラメーターを測定する手法は特に制限されない。これらのパラメーターは、例えば、公知の手法により測定することができる。例えば、細胞の膜電位、細胞の膜電流、細胞内のイオン濃度は、いずれも、細胞内へのイオン流入（特に細胞へのナトリウムイオン流入の指標）の指標でもあり得る。よって、細胞内へのイオン流入（特に細胞へのナトリウムイオン流入）は、例えば、該細胞の膜電位、該細胞の膜電流、または該細胞内のイオン濃度を測定することにより、測定することができる。膜電位を測定する手法としては、パッチクランプ法や膜電位感受性色素を用いた方法が挙げられる。膜電位感受性色素としては、例えば、FLIPR membrane potential (FMP) dye（Molecular Devices）が挙げられる。膜電流を測定する手法としては、パッチクランプ法や電位固定法が挙げられる。細胞内ナトリウム濃度を測定する手法としては、CoroNa Green Sodium Indicator（Thermo Fisher Scientific社）等のナトリウム指示薬を用いた方法が挙げられる。細胞内のカルシウム濃度を測定する手法としては、カルシウムイメージングが挙げられる。カルシウムイメージングにおいては、カルシウム指示薬を利用して、細胞内のカルシウム濃度を測定することができる。カルシウム指示薬としては、カルシウム感受性蛍光色素やカルシウム感受性蛍光タンパク質が挙げられる。カルシウム感受性蛍光色素としては、例えば、Fura 2、Fluo 4が挙げられる。また、カルシウム感受性蛍光タンパク質としては、例えば、Cameleon、TN-XL、GCaMP、G-GECOが挙げられる。Cameleonとして、具体的には、例えば、Yellow Cameleon 2.60（YC2.60）（PNAS vol.101:10554-10559 (2004)）が挙げられる。カルシウムイメージングにおけるシグナル（例えば蛍光）の検出は、蛍光検出器等のシグナルの種類に応じた検出器を用いて実施することができる。蛍光検出器としては、例えば、FV1200（オリンパス社製）等の共焦点レーザー顕微鏡やFDSS7000（浜松ホトニクス社製）等のハイスループットスクリーニングシステムが挙げられる。FDSS7000は、96穴や384穴プレート等のマルチウェルプレートの測定に対応しており、複数の試験物質をまとめて試験できる。 The method for measuring these parameters is not particularly limited. These parameters can be measured, for example, by known methods. For example, the membrane potential of a cell, the membrane current of a cell, and the ion concentration in a cell can all be indicators of the influx of ions into the cell (particularly, an index of the influx of sodium ions into the cell). Therefore, the influx of ions into the cell (particularly the influx of sodium ion into the cell) can be measured, for example, by measuring the membrane potential of the cell, the membrane current of the cell, or the ion concentration in the cell. can. Examples of the method for measuring the membrane potential include a patch clamp method and a method using a voltage-sensitive dye. Examples of the voltage-sensitive dye include FLIPR membrane potential (FMP) dye (Molecular Devices). Examples of the method for measuring the membrane current include the patch clamp method and the voltage fixation method. Examples of the method for measuring the intracellular sodium concentration include a method using a sodium indicator such as CoroNa Green Sodium Indicator (Thermo Fisher Scientific). Calcium imaging can be mentioned as a method for measuring the intracellular calcium concentration. In calcium imaging, a calcium indicator can be used to measure the intracellular calcium concentration. Calcium indicators include calcium-sensitive fluorescent dyes and calcium-sensitive fluorescent proteins. Examples of the calcium-sensitive fluorescent dye include Fura 2 and Fluo 4. Examples of the calcium-sensitive fluorescent protein include Cameleon, TN-XL, GCaMP, and G-GECO. Specific examples of Cameleon include Yellow Cameleon 2.60 (YC2.60) (PNAS vol.101: 10554-10559 (2004)). The detection of a signal (for example, fluorescence) in calcium imaging can be carried out by using a detector according to the type of signal such as a fluorescence detector. Examples of the fluorescence detector include a confocal laser scanning microscope such as FV1200 (manufactured by Olympus) and a high throughput screening system such as FDSS7000 (manufactured by Hamamatsu Photonics). The FDSS7000 supports the measurement of multi-well plates such as 96-well and 384-well plates, and can test multiple test substances at once.

αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いたαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化の測定についての記載は、その他の態様でαγENaC/ASIC1cを用いる場合にも準用できる。その
他の態様でαγENaC/ASIC1cを用いる場合としては、αγENaC/ASIC1cを有する、人工脂質二重膜小胞、細胞膜、または人工脂質二重膜を用いる場合が挙げられる。その他の態様でαγENaC/ASIC1cを用いる場合としては、特に、αγENaC/ASIC1cが内部空間を有する形態で使用される場合が挙げられる。 The description of the measurement of activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c using cells having αγENaC / ASIC1c can also be applied mutatis mutandis when αγENaC / ASIC1c is used in other embodiments. Examples of the case where αγENaC / ASIC1c is used in other embodiments include the case of using an artificial lipid bilayer vesicle, a cell membrane, or an artificial lipid bilayer membrane having αγENaC / ASIC1c. Examples of the case where αγENaC / ASIC1c is used in other embodiments include a case where αγENaC / ASIC1c is used in a form having an internal space.

すなわち、例えば、αγENaC/ASIC1cを有する人工脂質二重膜小胞を用いて、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いる場合と同様の手法によりαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化を測定することができる。そのような場合、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いたαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化の測定についての記載における「細胞」は、「人工脂質二重膜小胞」と読み替えることができる。 That is, for example, the activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c can be measured by using an artificial lipid bilayer vesicle having αγENaC / ASIC1c in the same manner as in the case of using cells having αγENaC / ASIC1c. .. In such cases, "cell" in the description of the measurement of activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c using cells having αγENaC / ASIC1c can be read as "artificial lipid bilayer vesicle".

また、例えば、αγENaC/ASIC1cを有する細胞膜や人工脂質二重膜等の膜を当該膜により区分された空間が生じるように用いて、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いる場合と同様の手法によりαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化を測定することができる。具体的には、例えば、そのような膜が２つの空間を区分するように使用される場合、すなわち、そのような膜が、２つの空間を備える反応系であって、当該２つの空間が当該膜によって互いに区分されている反応系を提供するように使用される場合、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いる場合と同様の手法によりαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化を測定することができる。そのような場合、膜により区分された空間を細胞の内部（「内部空間」ともいう）とみなすことがでる。具体的には、それら２つの空間の内、一方を細胞の内部（「内部空間」ともいう）とみなすことができ、他方を細胞の外部（「外部空間」ともいう）とみなすことができる。それらの空間の内、ナトリウムおよび試験物質を含有する方を外部空間とみなすことができる。そのような場合、αγENaC/ASIC1cを有する細胞を用いたαγENaC/ASIC1cの活性化または不活性化の測定についての記載における「細胞内へのイオン流入」、「細胞の膜電位」、「細胞の膜電流」、「細胞内のイオン濃度」は、それぞれ、「内部空間内へのイオン流入」、「膜の膜電位」、「膜の膜電流」、「内部空間内のイオン濃度」と読み替えることができる。例えば、US2018-0095071には、ナトリウムチャネルTMC6を有する人工脂質二重膜で区分された２つのウェルを備えたイオンチャネル測定デバイスを利用してナトリウムイオンの輸送により生じる膜電流を測定したことが開示されている。 Further, for example, by using a membrane such as a cell membrane having αγENaC / ASIC1c or an artificial lipid bilayer membrane so as to create a space partitioned by the membrane, αγENaC / by the same method as when using cells having αγENaC / ASIC1c. The activation or inactivation of ASIC1c can be measured. Specifically, for example, when such a membrane is used to separate two spaces, i.e., such a membrane is a reaction system comprising two spaces, the two spaces being said. When used to provide reaction systems separated from each other by membranes, activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c can be measured in the same manner as with cells with αγENaC / ASIC1c. In such a case, the space divided by the membrane can be regarded as the inside of the cell (also referred to as "internal space"). Specifically, one of these two spaces can be regarded as the inside of the cell (also referred to as "internal space"), and the other can be regarded as the outside of the cell (also referred to as "external space"). Of those spaces, the one containing sodium and the test substance can be regarded as an external space. In such cases, "ion influx into cells", "cell membrane potential", "cell membrane" in the description of measuring activation or inactivation of αγENaC / ASIC1c using cells having αγENaC / ASIC1c. "Current" and "intracellular ion concentration" can be read as "ion inflow into the internal space", "membrane potential", "membrane current", and "ion concentration in the internal space", respectively. can. For example, US2018-0095071 disclosed that an ion channel measuring device with two wells separated by an artificial lipid bilayer with sodium channel TMC6 was used to measure the membrane current generated by the transport of sodium ions. Has been done.

いずれの場合も、αγENaC/ASIC1cの使用態様に応じて、測定可能なパラメーターを選択することができる。 In either case, measurable parameters can be selected according to the usage mode of αγENaC / ASIC1c.

なお、「或るパラメーターを測定し、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定するための指標として利用する」とは、当該応答を測定できる限り、具体的には、当該応答に基づいて試験物質による応答調節を評価できる（すなわち、試験物質による応答調節が認められるかを判定できる）限り、当該パラメーターを反映するデータを取得して利用することで足り、当該パラメーターの値自体を取得することは必要としない。すなわち、或るパラメーターを反映するデータを取得した場合、当該データから当該パラメーターの値自体を算出することは必要としない。具体的には、例えば、カルシウムイメージングにより細胞内のカルシウム濃度を測定し、ナトリウムによるαγENaC/ASIC1cの活性化を測定するための指標として利用する場合、当該活性化を測定できる限り、具体的には、当該活性化に基づいて試験物質による活性化調節を評価できる（すなわち、試験物質による活性化調節が認められるかを判定できる）限り、細胞内のカルシウム濃度を反映するデータ（例えば、カルシウム指示薬のシグナル強度やシグナル強度比率）を取得して利用することで足り、当該データから細胞内のカルシウム濃度自体を算出することは必要としない。 In addition, "measure a certain parameter and use it as an index for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium" means that as long as the response can be measured, specifically, it depends on the test substance based on the response. As long as the response regulation can be evaluated (that is, it can be determined whether the response regulation by the test substance is recognized), it is sufficient to acquire and use the data reflecting the parameter, and it is necessary to acquire the value of the parameter itself. Do not. That is, when data reflecting a certain parameter is acquired, it is not necessary to calculate the value of the parameter itself from the data. Specifically, for example, when the intracellular calcium concentration is measured by calcium imaging and used as an index for measuring the activation of αγENaC / ASIC1c by sodium, as long as the activation can be measured, specifically. As long as the activation regulation by the test substance can be evaluated based on the activation (that is, it can be determined whether the activation regulation by the test substance is observed), the data reflecting the intracellular calcium concentration (for example, the calcium indicator) It is sufficient to acquire and use the signal intensity or signal intensity ratio), and it is not necessary to calculate the intracellular calcium concentration itself from the data.

また、「ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定する」とは、当該応答を反
映するデータであって、試験物質による応答調節を評価するために利用できるものを取得することで足りる。同様に、試験物質による応答調節を評価するための指標として利用される「ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答」とは、当該応答を反映するデータであって、試験物質による応答調節を評価するために利用できるものであれば足りる。そのようなデータとしては、例えば、ナトリウムに対するαγENaC/ASIC1cの応答を測定する手法を実施することにより得られたデータ（例えば、上記例示したようなパラメーターやそれを反映するデータ）を、そのまま、あるいは適宜加工して、用いることができる。 In addition, "measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium" means that it is sufficient to obtain data that reflects the response and that can be used to evaluate the response regulation by the test substance. Similarly, the "response of αγENaC / ASIC1c to sodium" used as an index for evaluating the response regulation by the test substance is the data reflecting the response, and is used to evaluate the response regulation by the test substance. Anything that can be used is sufficient. As such data, for example, the data obtained by implementing a method for measuring the response of αγENaC / ASIC1c to sodium (for example, the parameters as exemplified above and the data reflecting the parameters) can be used as they are or as such data. It can be appropriately processed and used.

このようにして目的物質を同定することができる。本発明の方法は、さらに、同定された目的物質（特に塩味調節物質）の塩味調節機能を評価する工程を含んでいてもよい。すなわち、同定された目的物質の塩味調節機能を評価することにより、当該目的物質が実際に塩味を調節（例えば増強または低減）するかを確認することができる。同定された目的物質の塩味調節機能を評価する手法は特に制限されない。同定された目的物質の塩味調節機能は、例えば、物質の塩味等の呈味を評価する公知の手法により評価することができる。そのような手法としては、官能評価（官能試験による評価）が挙げられる。同定された目的物質の塩味調節機能は、具体的には、例えば、目的物質の共存下での塩化ナトリウムの塩味と、目的物質の非共存下での塩化ナトリウムの塩味とを比較することにより、評価することができる。 In this way, the target substance can be identified. The method of the present invention may further include a step of evaluating the saltiness adjusting function of the identified target substance (particularly the saltiness adjusting substance). That is, by evaluating the salt taste adjusting function of the identified target substance, it is possible to confirm whether the target substance actually regulates (for example, enhances or reduces) the salt taste. The method for evaluating the saltiness-regulating function of the identified target substance is not particularly limited. The salty taste adjusting function of the identified target substance can be evaluated by a known method for evaluating the taste such as salty taste of the substance, for example. Examples of such a method include sensory evaluation (evaluation by a sensory test). The salty taste regulating function of the identified target substance is specifically, for example, by comparing the salty taste of sodium chloride in the coexistence of the target substance with the salty taste of sodium chloride in the non-coexistence of the target substance. Can be evaluated.

従来の塩味調節剤の開発過程では、官能試験等によって膨大な数の物質またはそれらの組み合わせの塩味調節機能を１つ１つ確認して塩味調節物質を選択していかなければならなかったため、塩味調節剤の開発までに多くの時間とコストが必要であった。しかし、本発明の方法によれば、αγENaC/ASIC1cを利用することにより、塩味調節物質を効率的にスクリーニングすることができる。よって、本発明の方法によれば、塩味調節剤の開発の効率を大きく向上させることができる。 In the process of developing a conventional salt taste adjusting agent, it is necessary to confirm the salt taste adjusting function of a huge number of substances or combinations thereof one by one by a sensory test or the like and select a salt taste adjusting substance. It took a lot of time and cost to develop the regulator. However, according to the method of the present invention, by using αγENaC / ASIC1c, a salty taste adjusting substance can be efficiently screened. Therefore, according to the method of the present invention, the efficiency of developing a salty taste adjusting agent can be greatly improved.

スクリーニングされた目的物質の用途は、特に制限されない。目的物質（特に塩味調節物質）は、例えば、塩化ナトリウムを含有する対象物（例えば飲食品）に配合して使用することができる。目的物質（特に塩味調節物質）の配合により、塩化ナトリウムを含有する対象物における塩味を調節（例えば増強または低減）することができる。また、目的物質は、例えば、新たな目的物質の開発のための原料として使用することもできる。 The use of the screened target substance is not particularly limited. The target substance (particularly a salty taste adjusting substance) can be used, for example, by blending it with an object containing sodium chloride (for example, food or drink). By blending the target substance (particularly the salt taste adjusting substance), the salt taste in the object containing sodium chloride can be adjusted (for example, enhanced or reduced). Further, the target substance can also be used as a raw material for developing a new target substance, for example.

以下、非限定的な実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.

実施例１：電気生理学的手法を用いた評価
（１）発現プラスミド構築
ヒトのαENaC遺伝子、βENaC遺伝子、及びγENaC遺伝子のORFクローンをClontech社より、ヒトのASIC1c遺伝子のORFクローンをPromega社より購入した。各遺伝子のmRNAのNCBI
Accession No.は、αENaC：NM_001038、βENaC：NM_000336、γENaC：NM_001039、ASIC1c：NM_001256830である。ORFクローンを鋳型として、PCR法により各ORFを含むDNA断片を増幅した。増幅したDNA断片をIn-Fusionクローニングシステム（#639648、Clontech社）により哺乳細胞発現用ベクターであるpcDNA3.1(+)（#V790-20、Invitrogen）のマルチクローニングサイト（HindIII、XbaI）に挿入し、各遺伝子の発現プラスミドを得た。 Example 1: Evaluation using an electrophysiological method (1) Construction of expression vector ORF clones of human αENaC gene, βENaC gene, and γENaC gene were purchased from Clontech, and ORF clones of human ASIC1c gene were purchased from Promega. .. NCBI of mRNA of each gene
The Accession No. is αENaC: NM_001038, βENaC: NM_000336, γENaC: NM_001039, ASIC1c: NM_001256830. Using the ORF clone as a template, the DNA fragment containing each ORF was amplified by the PCR method. The amplified DNA fragment is inserted into the multicloning site (HindIII, XbaI) of pcDNA3.1 (+) (# V790-20, Invitrogen), which is a vector for expressing mammalian cells, by the In-Fusion cloning system (# 639648, Clontech). Then, an expression plasmid for each gene was obtained.

（２）cRNA合成
発現プラスミドを制限酵素XbaIにより切断し、直鎖状DNAを得た。得られたDNAをproteinase K処理（50℃ 30分）に供して制限酵素及びRNaseを不活化させ、次いでフェノール/クロロホルム抽出法により精製した。精製したDNAを鋳型として、MEGAscript T7 Kit（#AM1334、life technologies社）によりcRNAの合成を行った（GTP量は1/5量、Ribo m7G Cap
Analog（Promega社）をfinal 40 mMで添加）。得られたcRNAをフェノール/クロロホルム抽出法により精製した後、イソプロパノール沈殿法により沈殿物として回収した。cRNAを70%エタノールで洗浄し風乾した。cRNAを水に溶解し、70℃、2分間のヒートショックを与え、cRNA溶液を調製した。Bioanalyzer（2100、Agilent社）及びNanodropを用いてcRNAの品質の確認と定量を行った。 (2) cRNA synthesis The expression plasmid was cleaved with the restriction enzyme XbaI to obtain linear DNA. The obtained DNA was subjected to proteinase K treatment (50 ° C. for 30 minutes) to inactivate restriction enzymes and RNase, and then purified by a phenol / chloroform extraction method. Using the purified DNA as a template, cRNA was synthesized by MEGAscript T7 Kit (# AM1334, life technologies) (GTP amount is 1/5 amount, Ribo m7G Cap).
Analog (Promega) added at final 40 mM). The obtained cRNA was purified by a phenol / chloroform extraction method and then recovered as a precipitate by an isopropanol precipitation method. The cRNA was washed with 70% ethanol and air dried. The cRNA was dissolved in water and heat-shocked at 70 ° C. for 2 minutes to prepare a cRNA solution. The quality of cRNA was confirmed and quantified using Bioanalyzer (2100, Agilent) and Nanodrop.

（３）cRNAのマイクロインジェクション
調製したcRNA溶液はマイクロキャピラリーを用い23.3 nLずつアフリカツメガエルから単離した卵母細胞にインジェクションした（αENaC：3.1 ng、βENaC：3.1 ng、γENaC：3.1 ng、ASIC1c：34.6 ng）。インジェクションしたcRNA溶液は以下の通りである：αENaC単独、ASIC1c単独、αβENaC（αENaCとβENaCの組み合わせ）、αγENaC（αENaCとγENaCの組み合わせ）、αβγENaC（αENaCとβENaCとγENaCの組み合わせ）、αENaC/ASIC1c（αENaCとASIC1cの組み合わせ）、およびαγENaC/ASIC1c（αENaCとγENaCとASIC1cの組み合わせ）。また、MOCKとして、cRNA溶液に代えて水をインジェクションした。卵母細胞を培養用バッファーND96溶液（96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, pH7.4, 1％抗生物質, 2％ピルビン酸ナトリウム）に移して、18℃で一晩から3日程度インキュベートし、十分に遺伝子を発現させた。 (3) Microinjection of cRNA The prepared cRNA solution was injected into oocytes isolated from Xenopus laevis by 23.3 nL each using a microcapillary (αENaC: 3.1 ng, βENaC: 3.1 ng, γENaC: 3.1 ng, ASIC1c: 34.6). ng). The injected cRNA solutions are as follows: αENaC alone, ASIC1c alone, αβENaC (combination of αENaC and βENaC), αγENaC (combination of αENaC and γENaC), αβγENaC (combination of αENaC and βENaC and γENaC), αENaC / ASIC1c. αENaC and ASIC1c combination), and αγENaC / ASIC1c (αENaC and γENaC and ASIC1c combination). In addition, as MOCK, water was injected instead of the cRNA solution. Transfer the egg mother cells to a culture buffer ND96 solution (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES, 1.8 mM CaCl 2 , pH 7.4, 1% antibiotics, 2% sodium pyruvate). Incubate at 18 ° C for about 1 night to 3 days to fully express the gene.

（４）二電極膜電位固定法による膜電流の測定
ガラスピペット内に3 M 塩化カリウム水溶液を充填し、電流測定および電位測定各ヘッドステージにセットして、ガラス電極とした。電極の抵抗値を測定し、電流電極の抵抗値が0.2～0.8 MΩ、電位電極の抵抗値が2 MΩ以下であることを確認し、必要に応じて電流値補正を行った。測定用バッファーの流速が約2 mL/minになるようにフローコントロールピンチバルブにて調節した。チャンバーには測定に使う卵母細胞を置き、ガラス電極の先端を細胞膜へなるべく直角になるよう卵に刺し、静止電位を確認した。ソフトウェアで設定した電位（-80 ｍV）をA/D-D/Aコンバーター（Digidata 1440A、Axon CNS）およびアンプ（Gene clamp 500B、Axon）を介して卵母細胞に与え、イオン電流（膜電流）の経時変化を記録した（使用ソフトウェアClampex 10.2.09、Axon）。解析にはClampfit ソフトウェア（v10.2.09、Axon）を用いた。測定用バッファーとしては、まず、Naを含むND96（96
mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, pH7.3）を用い、次いで、Naを含まないNMDG96（96 mM NMDG, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2,, pH7.3）に切り替えた。ND96で得られた膜電流の測定値と、NMDG96で得られた膜電流の測定値との差を、Naによる膜電流の変化とみなした。NMDG96で得られた膜電流の測定値としては、NMDG96に切り替えてから1～3分後の安定した値を用いた。また、αγENaC/ASIC1c発現細胞およびαβγENaC発現細胞について、100 μM Amiloride存在下で、同様の手順でNaによる膜電流の変化を測定した（「αγENaC/ASIC1c＋Ami」および「αβγENaC＋Ami」）。Naによる膜電流の変化をNa応答の指標とした。 (4) Measurement of membrane current by two-electrode membrane voltage fixation method A glass pipette was filled with a 3 M potassium chloride aqueous solution and set on each head stage for current measurement and potential measurement to form a glass electrode. The resistance value of the electrode was measured, and it was confirmed that the resistance value of the current electrode was 0.2 to 0.8 MΩ and the resistance value of the potential electrode was 2 MΩ or less, and the current value was corrected as necessary. The flow control pinch valve was used to adjust the flow rate of the measurement buffer to about 2 mL / min. Oocytes used for measurement were placed in the chamber, and the tip of the glass electrode was stabbed into the egg so as to be as perpendicular to the cell membrane as possible, and the resting potential was confirmed. A potential (-80 mV) set by software is applied to the oocyte via an A / DD / A converter (Digidata 1440A, Axon CNS) and an amplifier (Gene clamp 500B, Axon), and the ionic current (membrane current) changes over time. Recorded changes (software used Clampex 10.2.09, Axon). Clampfit software (v10.2.09, Axon) was used for the analysis. As a measurement buffer, first, ND96 (96) containing Na
mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES, 1.8 mM CaCl 2 , pH 7.3), followed by Na-free NMDG96 (96 mM NMDG, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 5). It was switched to mM HEPES, 1.8 mM CaCl 2 , pH 7.3). The difference between the measured value of the membrane current obtained by ND96 and the measured value of the membrane current obtained by NMDG96 was regarded as the change in the membrane current due to Na. As the measured value of the membrane current obtained by NMDG96, a stable value 1 to 3 minutes after switching to NMDG96 was used. In addition, for αγENaC / ASIC1c-expressing cells and αβγENaC-expressing cells, changes in membrane current due to Na were measured in the presence of 100 μM Amiloride (“αγENaC / ASIC1c + Ami” and “αβγENaC + Ami”). The change in film current due to Na was used as an index of Na response.

（５）結果
結果を図１～２に示す。αγENaC/ASIC1c発現細胞は、αENaC発現細胞、ASIC1c発現細胞、αγENaC発現細胞と比較して、顕著に高いNa応答を示した（図１）。また、ENaC阻害剤であるAmilorideは、αγENaC/ASIC1c発現細胞のNa応答には影響しなかった（図１）。一方、AmilorideはαβγENaC発現細胞のNa応答を80％程度抑制した（図２）。このことから、αγENaC/ASIC1cはαβγENaCと異なる性質を有するNaチャネルであると考えられた。すなわち、αγENaC/ASIC1cがαβγENaCと異なる塩味受容体として機能している可能性が示唆された。 (5) Results The results are shown in FIGS. 1 and 2. The αγENaC / ASIC1c-expressing cells showed a significantly higher Na response than the αENaC-expressing cells, ASIC1c-expressing cells, and αγENaC-expressing cells (Fig. 1). In addition, the ENaC inhibitor Amiloride did not affect the Na response of αγENaC / ASIC1c-expressing cells (Fig. 1). On the other hand, Amiloride suppressed the Na response of αβγENaC-expressing cells by about 80% (Fig. 2). From this, it was considered that αγENaC / ASIC1c is a Na channel having different properties from αβγENaC. That is, it was suggested that αγENaC / ASIC1c may function as a salty taste receptor different from αβγENaC.

（６）Na選択性の評価
ENaCサブユニット及びASIC1サブユニットを含むチャネルとしては、αENaC/ASIC1aが知られている（Trac PT. et al., Alveolar nonselective channels are ASIC1a/α-ENaC c
hannels and contribute to AFC. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017 Jun 1;312(6):L797-L811.）。αENaC/ASIC1aは非選択的カチオンチャネルであり、ナトリウム（Na）とカリウム（K）間で選択性に差はない。そこで、αγENaC/ASIC1cのイオン選択性について検討する目的で、αγENaC/ASIC1cのKに対する応答を測定した。測定は、測定用バッファーのNaClをKClに替えたこと以外は、上記（４）と同様の手順で実施した。 (6) Evaluation of Na selectivity
As a channel containing the ENaC subunit and the ASIC1 subunit, αENaC / ASIC1a is known (Trac PT. Et al., Alveolar nonselective channels are ASIC1a / α-ENaC c.
hannels and contribute to AFC. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2017 Jun 1; 312 (6): L797-L811.). αENaC / ASIC1a is a non-selective cation channel and there is no difference in selectivity between sodium (Na) and potassium (K). Therefore, the response of αγENaC / ASIC1c to K was measured for the purpose of examining the ion selectivity of αγENaC / ASIC1c. The measurement was carried out in the same procedure as in (4) above, except that NaCl in the measurement buffer was replaced with KCl.

結果を図３に示す。αβγENaC発現細胞はK応答を示した。なお、αβγENaC発現細胞のK応答はAmilorideで抑制されなかった（Data not shown）。一方、αγENaC/ASIC1c発現細胞のK応答は、MOCKとほぼ同等であった。このことから、αγENaC/ASIC1cはNaに対して選択性を有すると考えられた。よって、αγENaC/ASIC1cを利用することにより、K等のNa以外のカチオンに影響されることなく、Naの作用を調節する物質を効率的にスクリーニングできると期待される。 The results are shown in FIG. αβγENaC expressing cells showed a K response. The K response of αβγENaC-expressing cells was not suppressed by Amiloride (Data not shown). On the other hand, the K response of αγENaC / ASIC1c expressing cells was almost the same as that of MOCK. From this, it was considered that αγENaC / ASIC1c had selectivity for Na. Therefore, by using αγENaC / ASIC1c, it is expected that substances that regulate the action of Na can be efficiently screened without being affected by cations other than Na such as K.

実施例２：ヒト培養細胞を用いた評価
（１）リポフェクションによる遺伝子導入
HEK293T細胞を100mm2シャーレの成長培地（G418不含）に1.5×106 cells/10 mL培地で播種し、CO2インキュベータ（5 % CO2、37 ℃）で16～24時間培養した。培地を養生培地（DMEM/HamF-12／5%FBS）に交換し、Fugene6（Promega）を用いて実施例１（１）で得た発現プラスミドを培養細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした発現プラスミドは以下の通りである：αβγENaC（αENaCとβENaCとγENaCの組み合わせ）およびαγENaC/ASIC1c（αENaCとγENaCとASIC1cの組み合わせ）。また、MOCKとして、発現プラスミドに代えて空ベクターpcDNA3.1を培養細胞にトランスフェクションした。DNAとトランスフェクション試薬はDNA：Fugene6 = 1 μg：4 μLの割合で定法に従って調製した。トランスフェクション後の細胞をCO2インキュベーターで4～6時間培養した後、細胞を回収して7×104 cells/100 μL/wellでFDSS用アッセイプレート（FALCON Biocoat Black clear-bottom 96well plate (PDL coat) #356692）に播種し、16～24時間培養した。FDSS用アッセイプレートの培地としては75mM Na-DMEM培地を用いた。 Example 2: Evaluation using cultured human cells (1) Gene transfer by lipofection
HEK293T cells were seeded in 100 mm 2 petri dish growth medium (without G418) in 1.5 × 10 6 cells / 10 mL medium and cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 37 ° C.) for 16 to 24 hours. The medium was replaced with a curing medium (DMEM / HamF-12 / 5% FBS), and the expression plasmid obtained in Example 1 (1) was transfected into cultured cells using Fugene6 (Promega). The transfected expression plasmids are: αβγENaC (a combination of αENaC and βENaC and γENaC) and αγENaC / ASIC1c (a combination of αENaC and γENaC and ASIC1c). In addition, as MOCK, an empty vector pcDNA3.1 was transfected into cultured cells instead of the expression plasmid. DNA and transfection reagents were prepared according to the standard at a ratio of DNA: Fugene6 = 1 μg: 4 μL. After culturing the transfected cells in a CO 2 incubator for 4-6 hours, the cells are harvested and FDSS assay plate (FALCON Biocoat Black clear-bottom 96well plate (PDL coat)) at 7 × 10 4 cells / 100 μL / well. ) # 356692) and cultured for 16 to 24 hours. 75 mM Na-DMEM medium was used as the medium for the assay plate for FDSS.

（２）FDSS/μCELLによる膜電位測定
培養後のFDSS用アッセイプレートは、培地を除去した後、Na-free Ringer Solution（mM:150 NMDG-Cl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucose, 10 HEPES （pH7.3））で1回洗浄し、FLIPR membrane potential (FMP) dyeにて染色した。FMP dyeは定法に従ってNa-free Ringer Solutionで希釈して調製し、200μL/wellで添加し45分間37℃ CO2インキュベーターにて静置した。Na刺激液（NaClをNa-free Ringer Solutionで希釈して調製）はサンプルプレート（COSTAR 96well pp plate #3363）に終濃度の5倍になるように調製し、FDSS/μCELL（浜松ホトニクス社）にて50 μL/wellでアッセイプレートに添加した。Na刺激液添加後120秒間、535/565nmの蛍光の経時変化を測定した。Na刺激液添加10秒後から120秒後までの蛍光値変化を算出し、F/F0とした。F/F0はNa刺激による膜電位の変化を反映しており、F/F0をNa応答の指標とした。 (2) Membrane potential measurement by FDSS / μCELL After removing the medium from the assay plate for FDSS after culturing, Na-free Ringer Solution (mM: 150 NMDG-Cl, 5 KCl, 1 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 10) It was washed once with glucose, 10 HEPES (pH 7.3)) and stained with FLIPR membrane potential (FMP) dye. FMP dye was prepared by diluting with Na-free Ringer Solution according to a conventional method, added at 200 μL / well, and allowed to stand in a 37 ° C CO 2 incubator for 45 minutes. Na stimulant (prepared by diluting NaCl with Na-free Ringer Solution) was prepared on a sample plate (COSTAR 96well pp plate # 3363) so that the final concentration was 5 times, and was applied to FDSS / μCELL (Hamamatsu Photonics). Was added to the assay plate at 50 μL / well. The change over time of fluorescence at 535/565 nm was measured for 120 seconds after the addition of the Na stimulant. The change in fluorescence value from 10 seconds to 120 seconds after the addition of Na stimulant was calculated and set as F / F0. F / F0 reflects the change in membrane potential due to Na stimulation, and F / F0 was used as an index of Na response.

（３）結果
結果を図４に示す。MOCKと比較し、αγENaC/ASIC1c発現細胞は高いNa応答を示した。すなわち、αγENaC/ASIC1cはNaチャネルであると考えられた。 (3) Results The results are shown in FIG. Compared with MOCK, αγENaC / ASIC1c expressing cells showed a high Na response. That is, αγENaC / ASIC1c was considered to be a Na channel.

＜配列表の説明＞
配列番号：
１：ヒトのαENaC遺伝子（mRNA）の塩基配列
２：ヒトのαENaCタンパク質のアミノ酸配列
３：ヒトのβENaC遺伝子（mRNA）の塩基配列
４：ヒトのβENaCタンパク質のアミノ酸配列
５：ヒトのγENaC遺伝子（mRNA）の塩基配列
６：ヒトのγENaCタンパク質のアミノ酸配列
７：ヒトのASIC1c遺伝子（mRNA）の塩基配列
８：ヒトのASIC1cタンパク質のアミノ酸配列 <Explanation of sequence table>
SEQ ID NO:
1: Nucleotide sequence of human αENaC gene (mRNA) 2: Nucleotide sequence of human αENaC protein 3: Nucleotide sequence of human βENaC gene (mRNA) 4: Nucleotide sequence of human βENaC protein 5: Human γENaC gene (mRNA) ) Base sequence 6: Human γENaC protein amino acid sequence 7: Human ASIC1c gene (mRNA) base sequence 8: Human ASIC1c protein amino acid sequence

Claims (26)

目的物質をスクリーニングする方法であって、
下記工程（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）試験物質の存在下でαγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる工程；
（Ｂ）ナトリウムに対する前記αγENaC/ASIC1cの応答を測定する工程；および
（Ｃ）前記応答に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程；
を含み、
前記応答が前記試験物質により調節されている場合に、該試験物質を目的物質として同定し、
前記目的物質が、ナトリウムの作用を調節する物質であり、
前記αγENaC/ASIC1cが、αENaCタンパク質、γENaCタンパク質、およびASIC1cタンパク質の組み合わせである、方法。 It is a method of screening for the target substance.
The following steps (A) to (C):
(A) Step of contacting αγENaC / ASIC1c with sodium in the presence of the test substance;
(B) The step of measuring the response of the αγENaC / ASIC1c to sodium; and (C) the step of identifying the test substance as the target substance based on the response;
Including
When the response is regulated by the test substance, the test substance is identified as the target substance, and the test substance is identified.
The target substance is a substance that regulates the action of sodium.
The method, wherein the αγENaC / ASIC1c is a combination of the αENaC protein, the γENaC protein, and the ASIC1c protein. 前記応答が、ナトリウムによる前記αγENaC/ASIC1cの活性化である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the response is activation of the αγENaC / ASIC1c by sodium. 前記αγENaC/ASIC1cが、細胞、細胞膜、人工脂質二重膜小胞、または人工脂質二重膜に担持された形態で使用される、請求項１または２に記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the αγENaC / ASIC1c is used in a form of being supported on a cell, a cell membrane, an artificial lipid bilayer vesicle, or an artificial lipid bilayer membrane. 前記αγENaC/ASIC1cが、細胞に担持された形態で使用される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the αγENaC / ASIC1c is used in a cell-supported form. 前記細胞が、動物細胞である、請求項３または４に記載の方法。 The method according to claim 3 or 4, wherein the cell is an animal cell. 前記工程（Ｂ）および（Ｃ）が、それぞれ、下記工程（Ｂ１）および（Ｃ１）により実施される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法：
（Ｂ１）前記工程（Ａ）を実施した際の前記αγENaC/ASIC1cの活性化の程度Ｄ１を測定する工程；
（Ｃ１）前記活性化の程度Ｄ１に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程。 The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the steps (B) and (C) are carried out by the following steps (B1) and (C1), respectively:
(B1) A step of measuring the degree of activation D1 of the αγENaC / ASIC1c when the step (A) is carried out;
(C1) A step of identifying the test substance as a target substance based on the degree of activation D1. 前記工程（Ｃ１）が、下記工程（Ｃ２）により実施される、請求項６に記載の方法：
（Ｃ２）前記活性化の程度Ｄ１と対照条件における前記αγENaC/ASIC1cの活性化の程度Ｄ２との差に基づいて前記試験物質を目的物質として同定する工程。 The method according to claim 6, wherein the step (C1) is carried out by the following step (C2):
(C2) A step of identifying the test substance as a target substance based on the difference between the degree of activation D1 and the degree of activation of αγENaC / ASIC1c D2 under control conditions. 前記対照条件が、下記条件（Ｃ２－１）または（Ｃ２－２）である、請求項７に記載の方法：
（Ｃ２－１）前記試験物質の非存在下で前記αγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件；
（Ｃ２－２）前記試験物質の存在下で前記αγENaC/ASIC1cとナトリウムを接触させる条件であって、該試験物質の濃度が前記工程（Ａ）における該試験物質の濃度よりも低い濃度である条件。 The method according to claim 7, wherein the control condition is the following condition (C2-1) or (C2-2).
(C2-1) Conditions for contacting the αγENaC / ASIC1c with sodium in the absence of the test substance;
(C2-2) A condition in which the αγENaC / ASIC1c is brought into contact with sodium in the presence of the test substance, and the concentration of the test substance is lower than the concentration of the test substance in the step (A). .. さらに、前記活性化の程度Ｄ２を測定する工程を含む、請求項７または８に記載の方法。 The method of claim 7 or 8, further comprising the step of measuring the degree of activation D2. 前記目的物質が、ナトリウムの作用を促進または阻害する物質であり、
前記応答が前記試験物質により促進されている場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を促進する物質として同定し、
前記応答が前記試験物質により阻害されている場合に、前記試験物質をナトリウムの作
用を阻害する物質として同定する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。 The target substance is a substance that promotes or inhibits the action of sodium.
When the response is facilitated by the test substance, the test substance is identified as a substance that promotes the action of sodium.
The method according to any one of claims 1 to 9, wherein when the response is inhibited by the test substance, the test substance is identified as a substance that inhibits the action of sodium. 前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも高い場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を促進する物質として同定する、請求項１０に記載の方法。 10. The method of claim 10, wherein when the degree of activation D1 is higher than the degree of activation D2, the test substance is identified as a substance that promotes the action of sodium. 前記活性化の程度Ｄ１が前記活性化の程度Ｄ２よりも低い場合に、前記試験物質をナトリウムの作用を阻害する物質として同定する、請求項１０に記載の方法。 10. The method of claim 10, wherein the test substance is identified as a substance that inhibits the action of sodium when the degree of activation D1 is lower than the degree of activation D2. 前記ナトリウムの作用を促進する物質が塩味増強物質であり、前記ナトリウムの作用を阻害する物質が塩味低減物質である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 10 to 12, wherein the substance that promotes the action of sodium is a salty taste enhancing substance, and the substance that inhibits the action of sodium is a salty taste reducing substance. 前記工程（Ａ）において、塩化ナトリウムがナトリウムとして用いられる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 13, wherein sodium chloride is used as sodium in the step (A). 前記応答が、膜電流、膜電位、またはイオン濃度を指標として測定され、該イオン濃度が、細胞内のイオン濃度、人工脂質二重膜小胞内のイオン濃度、または細胞膜もしくは人工脂質二重膜により区分された内部空間内のイオン濃度である、請求項３～１４のいずれか１項に記載の方法。 The response is measured using membrane current, membrane potential, or ion concentration as an index, and the ion concentration is intracellular ion concentration, artificial lipid bilayer membrane vesicle ion concentration, or cell membrane or artificial lipid bilayer membrane. The method according to any one of claims 3 to 14, which is the ion concentration in the internal space classified by. 前記イオン濃度が、ナトリウムイオン濃度、カルシウムイオン濃度、または塩化物イオン濃度である、請求項１５に記載の方法。 15. The method of claim 15, wherein the ion concentration is a sodium ion concentration, a calcium ion concentration, or a chloride ion concentration. 前記αENaCタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のαENaCタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のαENaCタンパク質のキメラタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 16, wherein the αENaC protein is the protein according to (A) or (B) below.
(A) Mammalian αENaC protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian αENaC proteins. 前記αENaCタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 17, wherein the αENaC protein is the protein according to (a), (b), or (c) below.
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with the γENaC protein and the ASIC1c protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having responsiveness to sodium in combination with the γENaC protein and the ASIC1c protein. 前記γENaCタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のγENaCタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のγENaCタンパク質のキメラタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 18, wherein the γENaC protein is the protein according to the following (A) or (B):
(A) Mammalian γENaC protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian γENaC proteins. 前記γENaCタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびASIC1cタンパク質との組み合わせでナトリウムに
対する応答性を有するタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 19, wherein the γENaC protein is the protein according to the following (a), (b), or (c):
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with the αENaC protein and the ASIC1c protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having responsiveness to sodium in combination with the αENaC protein and the ASIC1c protein. 前記ASIC1cタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）哺乳類のASIC1cタンパク質；
（Ｂ）２種またはそれ以上の哺乳類のASIC1cタンパク質のキメラタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the ASIC1c protein is the protein according to (A) or (B) below.
(A) Mammalian ASIC1c protein;
(B) A chimeric protein of two or more mammalian ASIC1c proteins. 前記ASIC1cタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびγENaCタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号８に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、αENaCタンパク質およびγENaCタンパク質との組み合わせでナトリウムに対する応答性を有するタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 21, wherein the ASIC1c protein is the protein according to (a), (b), or (c) below.
(A) A protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 contains an amino acid sequence containing substitutions, deletions, insertions, and / or additions of 1 to 10 amino acid residues, and in combination with αENaC protein and γENaC protein. Proteins that are responsive to sodium;
(C) A protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having responsiveness to sodium in combination with αENaC protein and γENaC protein. さらに、同定された目的物質の塩味調節機能を評価する工程を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 22, further comprising a step of evaluating the salty taste adjusting function of the identified target substance. 前記評価が、官能評価によって実施される、請求項２３に記載の方法。 23. The method of claim 23, wherein the evaluation is performed by sensory evaluation. αENaCタンパク質をコードする遺伝子、γENaCタンパク質をコードする遺伝子、およびASIC1cタンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞。 A cell into which a gene encoding the αENaC protein, a gene encoding the γENaC protein, and a gene encoding the ASIC1c protein have been introduced. 動物細胞である、請求項２５に記載の細胞。 25. The cell of claim 25, which is an animal cell.
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