JP2022052023A - Methods for producing extracellular vesicles - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞外小胞の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing extracellular vesicles.
従来、薬理効果の増強および副作用の軽減などの観点から、体内での薬物の分布を、空間的、時間的および量的に制御する技術についての検討が行われている。前記技術はドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれており、近年では、例えば、がん細胞などの目的の細胞に対して目的の薬剤を効率よく作用させるべく、細胞レベルでのＤＤＳ技術の向上が望まれている。 Conventionally, from the viewpoint of enhancing pharmacological effects and reducing side effects, techniques for controlling the distribution of drugs in the body spatially, temporally and quantitatively have been studied. The above-mentioned technology is called a drug delivery system (DDS), and in recent years, improvements in DDS technology at the cellular level have been made in order to efficiently act the target drug on the target cells such as cancer cells. It is desired.
このような細胞レベルでのＤＤＳに関する技術として、たとえば、特許文献１に記載の技術が知られている。特許文献１には、抗腫瘍活性を有する化合物等の外来物質を対象細胞（例えばがん細胞）内に導入するためのエクソソームであって、前記外来物質等を内包するエクソソームが提案されている。 As a technique relating to DDS at the cellular level, for example, the technique described in Patent Document 1 is known. Patent Document 1 proposes an exosome for introducing a foreign substance such as a compound having antitumor activity into a target cell (for example, a cancer cell), and which contains the foreign substance or the like.
上記特許文献１には、外来物質等をエクソソームに内包させる方法として、エレクトロポーション法（電気穿孔法）が記載されている。前記エレクトロポーション法では、外来物質等を含む懸濁液に所定の電気パルスを負荷してエクソソームに微小な穴をあけることにより、外来物質等が導入されるため、エクソソームが破壊されることがある。また、前記方法では、エクソソーム内への外来物質等の導入率が低い（外来物質等の内包量が少ない）という問題もあり、改善が求められている。 The above-mentioned Patent Document 1 describes an electroporation method (electroporation method) as a method for encapsulating a foreign substance or the like in an exosome. In the electroporation method, a suspension containing a foreign substance or the like is loaded with a predetermined electric pulse to make a minute hole in the exosome, so that the foreign substance or the like is introduced and the exosome may be destroyed. .. In addition, the above method has a problem that the introduction rate of foreign substances and the like into exosomes is low (the amount of foreign substances contained is small), and improvement is required.
本発明の課題は、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for producing extracellular vesicles capable of improving the encapsulation amount of a nucleic acid drug.
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、核酸医薬を内包する細胞外小胞の製造方法であって、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含み、工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬である細胞外小胞の製造方法である。 The present inventors have arrived at the present invention as a result of diligent studies to solve the above problems. That is, the present invention is a method for producing extracellular vesicles containing a nucleic acid drug, which comprises the step 1 of culturing the source cells of the extracellular vesicles in the presence of the nucleic acid drug, and the nucleic acid drug used in step 1 is This is a method for producing extracellular vesicles, which are nucleic acid drugs having a sense strand having a modified 3'end and a 5'end, respectively, and an antisense strand.
本発明によれば、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a method for producing extracellular vesicles capable of improving the encapsulation amount of a nucleic acid drug.
本発明の細胞外小胞の製造方法は、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含む。工程１は核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程である。以下の説明において、「配列（１）」とは、本明細書中または配列表における「配列番号（１）」を意味し、配列（１）以外の配列についても同様である。 The method for producing extracellular vesicles of the present invention includes step 1 of culturing the source cells of extracellular vesicles in the presence of a nucleic acid drug. Step 1 is a step of culturing the source cells of extracellular vesicles in the presence of a nucleic acid drug. In the following description, the "sequence (1)" means "SEQ ID NO: (1)" in the present specification or in the sequence listing, and the same applies to sequences other than the sequence (1).
核酸医薬は遺伝子発現を介さずに直接生体に作用する。また、核酸医薬は標的物質に対し、高い特異性を有する医薬である。核酸医薬としては、ｓｉＲＮＡ、二本鎖ヘテロ核酸などがあげられる。工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する。 Nucleic acid drugs act directly on living organisms without mediated gene expression. Nucleic acid drugs are drugs that have high specificity for target substances. Examples of nucleic acid drugs include siRNA and double-stranded heteronucleic acid. The nucleic acid drug used in step 1 has a sense strand in which the 3'end and the 5'end are modified, respectively, and an antisense strand.
工程１で用いる核酸医薬としては、３’末端が核酸アプタマーまたはポリエチレングリコール鎖により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬、および５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物または核酸アプタマーにより修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬が好ましく、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、かつ、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬がより好ましい。３’末端が核酸アプタマーにより修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬は、細胞外小胞内へ導入されやすいので、細胞外小胞における核酸医薬内包量を多くすることができる。５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているセンス鎖を有する核酸医薬は、分解酵素による分解を抑制するため安定性に優れ、対象となる細胞での滞留時間を長くすることができる。 The nucleic acid drug used in step 1 is a nucleic acid drug having a sense chain modified with a nucleic acid aptamer or a polyethylene glycol chain at the 3'end, and a compound or a nucleic acid aptamer having a polyethylene glycol chain at the 5'end. Nucleic acid drugs having a sense chain are preferable, and nucleic acid drugs having a sense chain whose 3'end is modified with a nucleic acid aptamer and whose 5'end is modified with a compound having a polyethylene glycol chain are more preferable. A nucleic acid drug having a sense strand whose 3'end is modified with a nucleic acid aptamer can be easily introduced into extracellular vesicles, so that the amount of nucleic acid drug included in the extracellular vesicles can be increased. Nucleic acid drugs having a sense strand modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end have excellent stability because they suppress degradation by degrading enzymes, and can prolong the residence time in the target cells. ..
センス鎖の３’末端を修飾しうる核酸アプタマーとしては、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸、ならびに、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。核酸アプタマーは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子のことをいい、天然由来のものであってもよいし、公知の方法（後述のＳＥＬＥＸ法など）により製造したものであってもよい。 Nucleic acid aptamers capable of modifying the 3'end of the sense strand include, for example, single-stranded nucleic acids such as single-stranded RNA and single-stranded DNA, and double-stranded nucleic acids such as double-stranded RNA and double-stranded DNA. Can be given. The nucleic acid aptamer refers to a nucleic acid molecule that can specifically bind to a specific target substance, and may be of natural origin or may be produced by a known method (such as the SELEX method described later). May be good.
核酸アプタマーは３’末端と５’末端のいずれか一方またはそれらの両方が修飾されていてもよい。末端が修飾されているものによれば、核酸の安定性を改善することができる。核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性は、核酸アプタマー立体構造によりもたらされるので、その立体構造が維持される限り、核酸アプタマーの末端に他の塩基配列や修飾物質が付加されていても、核酸アプタマーの標的物質に対する結合親和性を維持することができる。末端修飾の例としてはビオチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、蛍光物質、発光物質、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ぺプチド、アミノ酸、脂質などが挙げられる。上記修飾は、スペーサー配列を介して核酸アプタマーに対して結合されていてもよい。スペーサー配列は任意の長さとしうるが、好ましくは０～２０塩基としうる。 Nucleic acid aptamers may be modified with either or both of the 3'and 5'ends. If the terminal is modified, the stability of the nucleic acid can be improved. Since the binding affinity of a nucleic acid aptamer for a target substance is provided by the nucleic acid aptamer three-dimensional structure, as long as the three-dimensional structure is maintained, the nucleic acid aptamer may have other base sequences or modifying substances added to the ends of the nucleic acid aptamer. Can maintain its binding affinity for the target substance. Examples of terminal modifications include biotin, polyethylene glycol (PEG), fluorescent substances, luminescent substances, carboxyfluorescein (FAM), peptides, amino acids, lipids and the like. The modification may be attached to the nucleic acid aptamer via a spacer sequence. The spacer sequence can be of any length, but preferably 0 to 20 bases.
核酸アプタマーは、例えばＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得してもよい（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ． ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５０５－５１０，１９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ランダム配列を含む核酸ライブラリーから、標的分子と結合する核酸を選択し増幅するサイクルを複数回、例えば５～２０回繰り返すことによって、標的分子と高い親和性で結合する核酸のみを選別する方法である。ＳＥＬＥＸ法により取得した核酸アプタマーは、その塩基配列を決定した後、従来公知の種々の合成法によって調製することができる。例えば、核酸アプタマーは化学合成法によって調製することができる。 Nucleic acid aptamers may be obtained, for example, by the SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXpotential evolution) method (Tuerk, C. and Gold, L., Science, Vol. 249, pp. 905). In the SELEX method, only nucleic acids that bind to the target molecule with high affinity are selected and amplified multiple times, for example, 5 to 20 times by selecting a nucleic acid that binds to the target molecule from a nucleic acid library containing a random sequence. It is a method of sorting. The nucleic acid aptamer obtained by the SELEX method can be prepared by various conventionally known synthetic methods after determining its base sequence. For example, nucleic acid aptamers can be prepared by chemical synthesis.
センス鎖の５’末端を修飾しうるポリエチレングリコール鎖を有する化合物としては、ポリエチレングリコール、直鎖型または分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルなどが挙げられる。ポリエチレングリコール鎖を有する化合物としては、油化産業株式会社製のポリエチレングリコール修飾剤［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）シリーズ］を用いてもよい。５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖は、例えば、５’末端にアミノ基を有する核酸（センス鎖となる核酸）と、ポリエチレングリコール鎖を有する化合物とを反応させることにより得ることができる。 Compounds having a polyethylene glycol chain capable of modifying the 5'end of the sense strand include polyethylene glycol, N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of linear or branched polyethylene glycol, and the like. As the compound having a polyethylene glycol chain, a polyethylene glycol modifier [SUNBRIGHT (registered trademark) series] manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd. may be used. The sense strand modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end is obtained, for example, by reacting a nucleic acid having an amino group at the 5'end (nucleic acid serving as a sense strand) with a compound having a polyethylene glycol chain. Obtainable.
核酸医薬が有するアンチセンス鎖は、５’末端および／または３’末端が修飾されているものであってもよい。核酸医薬のアンチセンス鎖の５’末端および３’末端は、それぞれ、センス鎖の３’末端および５’末端と対向する位置に配されており、アンチセンス鎖の塩基配列はセンス鎖の塩基配列と相補的である。 The antisense strand possessed by the nucleic acid drug may be modified at the 5'end and / or the 3'end. The 5'end and 3'end of the antisense strand of the nucleic acid drug are arranged at positions facing the 3'end and 5'end of the sense strand, respectively, and the base sequence of the antisense strand is the base sequence of the sense strand. Is complementary to.
本発明で用いうる核酸医薬の具体例について説明する。核酸医薬としては、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（３）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（４）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（５）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（６）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（７）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（８）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（９）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１０）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１３）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１４）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾され、配列（１５）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（１６）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、ならびに、５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、配列（２１）の塩基配列を有するセンス鎖および配列（２２）の塩基配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸医薬、があげられる。 Specific examples of the nucleic acid drug that can be used in the present invention will be described. As a nucleic acid drug, the 5'end is modified with a compound having a polyethylene glycol chain, the 3'end is modified with a nucleic acid aptamer, and the sense chain having the base sequence of the sequence (1) and the base sequence of the sequence (2) are obtained. A nucleic acid drug having an antisense chain, modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end, modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end, and a sense chain having the base sequence of sequence (3) and the base of sequence (4). A nucleic acid drug having an antisense chain having a sequence, a sense chain and a sequence (6) having a base sequence of sequence (5), modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end and modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end. ), A nucleic acid drug having an antisense chain having the base sequence of (7), and a sense chain having the base sequence of sequence (7), which is modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end and modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end. A nucleic acid drug having an antisense chain having the base sequence of sequence (8), modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end, modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end, and having the base sequence of sequence (9). A nucleic acid drug having an antisense chain having a sense chain and a base sequence of sequence (10), modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end, and modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end, and the base of sequence (11). A nucleic acid drug having a sense chain having a sequence and an antisense chain having the base sequence of sequence (12), modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end, and modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end, and the sequence (13). ) And a nucleic acid drug having an antisense chain having the base sequence of sequence (14), modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 5'end, and modified with a nucleic acid aptamer at the 3'end. A nucleic acid drug having a sense chain having the base sequence of sequence (15) and an antisense chain having the base sequence of sequence (16), and a 5'end modified with a nucleic acid aptamer and a 3'end having a polyethylene glycol chain. Examples thereof include a sense chain modified with a compound and having the base sequence of the sequence (21) and a nucleic acid drug having an antisense chain having the base sequence of the sequence (22).
細胞外小胞の供給源細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト由来間葉系幹細胞、ヒト以外の動物（具体的には哺乳動物）由来の初代培養細胞、継代細胞、および細胞株（セルライン）などの各種培養細胞、ならびに生体内に存在する種々の細胞（例えば上皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、免疫系細胞、造血系細胞など）などがあげられる。 Source cells for extracellular vesicles are not particularly limited, but are, for example, human-derived mesenchymal stem cells, primary cultured cells derived from non-human animals (specifically, mammals), passaged cells, and cell lines ( Examples include various cultured cells (cell line) and various cells existing in the living body (for example, epithelial cells, fibroblasts, muscle cells, immune system cells, hematopoietic cells, etc.).
工程１において、核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する際には、核酸医薬とともに、トランスフェクション試薬を用いることが好ましい。トランスフェクション試薬を用いると、核酸医薬が前記供給源細胞内に導入されやすくなる。トランスフェクション試薬は、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選ばれるものを用いることができる。トランスフェクション試薬としては、Ｔｈｅｒｍｏ社製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）シリーズを用いてもよい。 In step 1, when culturing the source cells of extracellular vesicles in the presence of the nucleic acid drug, it is preferable to use a transfection reagent together with the nucleic acid drug. The use of transfection reagents facilitates the introduction of nucleic acid drugs into the source cells. As the transfection reagent, one selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate can be used. As the transfection reagent, Lipofectamine (registered trademark) series manufactured by Thermo may be used.
細胞外小胞の供給源細胞の培養条件（温度、環境及び時間など）は、特に限定されず、前記供給源細胞の種類、核酸医薬の種類などを考慮して選択することができる。例えば前記供給源細胞がヒト由来間葉系幹細胞で、核酸医薬がルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである場合、培養温度は３５℃～３９℃が好ましく、ＣＯ２条件下で行うことが好ましい。培養時間は細胞の性質を考慮し、適宜設定することができる。 The culture conditions (temperature, environment, time, etc.) of the source cell of the extracellular vesicle are not particularly limited, and can be selected in consideration of the type of the source cell, the type of nucleic acid drug, and the like. For example, when the source cell is a human-derived mesenchymal stem cell and the nucleic acid drug is siRNA that suppresses the expression of luciferase, the culture temperature is preferably 35 ° C. to 39 ° C., preferably under CO 2 conditions. The culture time can be appropriately set in consideration of the properties of the cells.
本発明の細胞外小胞の製造方法は、工程１を行った後に得られる培養液から細胞外小胞を精製および／または分離する工程（工程２）を含んでいてもよい。培養液から細胞外小胞を精製または分離する方法としては、例えば遠心分離法などの方法があげられる。 The method for producing extracellular vesicles of the present invention may include a step (step 2) of purifying and / or separating extracellular vesicles from the culture medium obtained after performing step 1. Examples of the method for purifying or separating extracellular vesicles from the culture medium include a method such as centrifugation.
本発明の製造方法で得られる細胞外小胞は、好ましくは直径が１０ｎｍ以上、より好ましくは２０ｎｍ以上であり、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下である。細胞外小胞の直径が下限値以上であることにより、核酸医薬の内包量を増やすことができ、細胞外小胞の直系が上限値以下であることにより、核酸医薬を内包する細胞外小胞が前記供給源細胞から外部に分泌されやすくなる。また、細胞外小胞を標的細胞に対して投与した際に、エンドサイトーシスによる標的細胞への細胞外小胞の取り込みがされやすくなる。細胞外小胞の直径の測定は、例えばナノ粒子マルチアナライザー（ｑＮａｎｏ）を使用することにより行うことができる。細胞外小胞の直径とは、平均粒径をいう。 The extracellular vesicles obtained by the production method of the present invention preferably have a diameter of 10 nm or more, more preferably 20 nm or more, preferably 200 nm or less, and more preferably 150 nm or less. When the diameter of the extracellular vesicle is at least the lower limit, the amount of nucleic acid drug contained can be increased, and when the direct line of the extracellular vesicle is below the upper limit, the extracellular vesicle containing the nucleic acid drug can be increased. Is more likely to be secreted from the source cells to the outside. In addition, when extracellular vesicles are administered to target cells, the uptake of extracellular vesicles into target cells by endocytosis is facilitated. The diameter of the extracellular vesicle can be measured, for example, by using a nanoparticle multianalyzer (qNano). The diameter of extracellular vesicles means the average particle size.
細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。本発明において細胞外小胞としては、エクソソームが好ましい。 Examples of extracellular vesicles include exosomes, microvesicles, apoptotic vesicles, ectosomes, microparticles, secretory microvesicles and the like. Exosomes are preferred as extracellular vesicles in the present invention.
本発明によれば、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養することにより、細胞外小胞の内部に含まれる核酸医薬量（核酸医薬の内包量）を向上させることが可能である。このような効果が得られるメカニズムは、以下のように推測されるが、本発明の効果が得られるメカニズムは、下記に限定されない。 According to the present invention, extracellular vesicle source cells are cultured in the presence of a nucleic acid drug having a sense strand having a modified 3'end and a 5'end, respectively, and an antisense strand. It is possible to improve the amount of nucleic acid drug contained inside the vesicle (the amount of nucleic acid drug included). The mechanism for obtaining such an effect is presumed as follows, but the mechanism for obtaining the effect of the present invention is not limited to the following.
３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養すると、前記供給源細胞の細胞膜から前記供給源細胞の内部へと核酸医薬が導入される。前記供給現細胞内に導入された核酸医薬はエンドソーム内へと輸送される。核酸医薬が輸送された初期エンドソームでは内部のｐＨが低下し、核酸医薬はプロトン化されて当該エンドソーム内の浸透圧を上げ、これにより、核酸医薬のエンドソーマルエスケープが起こる。エンドソーマルエスケープした核酸医薬は前記供給源細胞の細胞膜内層と、初期エンドソームから移行した後期エンドソームの外層に結合する。後期エンドソームでは、当該エンドソームが内側にくびれることにより複数の腔内膜小胞が形成される。この腔内小胞内には核酸医薬が導入され、これにより核酸医薬を内包した細胞外小胞が形成される。このようにして形成された核酸医薬を内包した細胞外小胞は、前記供給源細胞の細胞膜と融合し、当該供給源細胞の外へと放出される。
本発明では、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬を用いることで、核酸医薬が前記供給源細胞の細胞膜内層及び後期エンドソームの外層に結合しやすくなり、その結果、細胞内小胞の内部に含まれる核酸医薬量を向上させることが可能となると考えられる。また、本発明では、核酸医薬を導入する際に、細胞外小胞の細胞膜にエレクトロポレーション法等によって微小な穴をあける必要はないので、細胞外小胞の破壊は生じにくい。その結果、核酸医薬を内包した細胞外小胞の粒子数を増やすことができ、さらに、細胞外小胞内への核酸医薬の導入量を増やすことができると考えられる。
When the source cells of extracellular vesicles are cultured in the presence of a nucleic acid drug having a sense strand having a modified 3'end and a 5'end, and an antisense strand, the source cells are cultivated from the cell membrane of the source cell. Nucleic acid drugs are introduced into the cells. The nucleic acid drug introduced into the supply current cell is transported into the endosome. In the early endosomes to which the nucleic acid drug is transported, the internal pH is lowered, and the nucleic acid drug is protonated to increase the osmotic pressure in the endosome, which causes endosomal escape of the nucleic acid drug. The endosomeally escaped nucleic acid drug binds to the inner layer of the cell membrane of the source cell and the outer layer of the late endosome that has migrated from the early endosome. In late endosomes, the endosomes are constricted inward to form multiple endometrial vesicles. A nucleic acid drug is introduced into the intracellular vesicle, whereby an extracellular vesicle containing the nucleic acid drug is formed. The extracellular vesicles containing the nucleic acid drug thus formed fuse with the cell membrane of the source cell and are released to the outside of the source cell.
In the present invention, by using a nucleic acid drug having a sense strand having a modified 3'end and a 5'end, respectively, and an antisense strand, the nucleic acid drug binds to the inner layer of the cell membrane of the source cell and the outer layer of the late endosome. As a result, it is considered possible to improve the amount of nucleic acid drug contained inside the intracellular vesicles. Further, in the present invention, when introducing a nucleic acid drug, it is not necessary to make a minute hole in the cell membrane of the extracellular vesicle by an electroporation method or the like, so that the destruction of the extracellular vesicle is unlikely to occur. As a result, it is considered that the number of particles of the extracellular vesicles containing the nucleic acid drug can be increased, and further, the amount of the nucleic acid drug introduced into the extracellular vesicles can be increased.
本発明の製造方法によれば、核酸医薬の内包量を向上させることができ、その結果、本発明の製造方法により得られる細胞外小胞を用いることにより核酸医薬を効率よく作用させることができる。よって、例えば、核酸医薬として標的遺伝子の発現抑制効果を有する核酸医薬を用いた場合には、標的遺伝子の発現抑制効果の高い核酸医薬内包細胞外小胞を容易に製造することができる。
本発明の製造方法により得られる細胞外小胞は、目的の細胞に対して目的の薬剤（核酸医薬）を作用させる薬剤送達システムに好適に用いることができるので、核酸医薬の実用化において、極めて有用である。
According to the production method of the present invention, the encapsulation amount of the nucleic acid drug can be improved, and as a result, the nucleic acid drug can be efficiently acted by using the extracellular vesicles obtained by the production method of the present invention. .. Therefore, for example, when a nucleic acid drug having an effect of suppressing the expression of a target gene is used as a nucleic acid drug, extracellular vesicles encapsulating the nucleic acid drug having a high effect of suppressing the expression of the target gene can be easily produced.
Since the extracellular vesicles obtained by the production method of the present invention can be suitably used for a drug delivery system in which a target drug (nucleic acid drug) acts on a target cell, it is extremely practical in practical use of a nucleic acid drug. It is useful.
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。核酸の塩基配列（配列）は５’末端から３’末端方向に左から右へ記載した。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto. Hereinafter, unless otherwise specified,% indicates weight% and parts indicate parts by weight. The base sequence (sequence) of the nucleic acid is described from left to right in the direction from the 5'end to the 3'end.
＜製造例１：核酸医薬（Ａ－１）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１）の塩基配列を有する核酸１および配列（２）の塩基配列を有する核酸２を委託合成した。
核酸１をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸２と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１）を得た。核酸医薬（Ａ－１）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
<Production Example 1: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-1)>
Nucleic acid 1 having the base sequence of the sequence (1) containing the amino group at the 5'end and the nucleic acid aptamer at the 3'end and nucleic acid 2 having the base sequence of the sequence (2) are outsourced by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Synthesized.
Nucleic acid 1 is dissolved in a phosphate buffer (pH 7.5), and an equal amount of N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of linear polyethylene glycol (Sunbright ME-200AS manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) is added. The cross-linking reaction was carried out at room temperature for 4 hours. The solution after the reaction is purified by ethanol precipitation and mixed with nucleic acid 2, so that the 5'end is modified with a compound having a polyethylene glycol chain, and the 3'end is modified with a nucleic acid aptamer. A nucleic acid drug (A-1) having the above was obtained. Nucleic acid drug (A-1) is a siRNA that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (1): sense strand]
5'-cuuackgucugacattaaaaaga-3'
[SEQ ID NO: (2): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguaagttataaga-3'
＜製造例２：核酸医薬（Ａ－２）の合成＞
製造例１において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－２）を得た。核酸医薬（Ａ－２）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
<Production Example 2: Nucleic Acid Drug (A-2) Synthesis>
In Production Example 1, instead of the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of 2 equal amounts of linear polyethylene glycol, the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of 2 equal amounts of branched polyethylene glycol (oil). The same operation as in Production Example 1 was performed except that Sunbright GL2-200GS2) manufactured by Kasangyo Co., Ltd. was used, and the 5'end was modified with a compound having a polyethylene glycol chain, and the 3'end was modified with a nucleic acid aptamer. A nucleic acid drug (A-2) having a sense strand and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-2) is a siRNA that inhibits the expression of luciferase.
＜製造例３：核酸医薬（Ａ－３）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（３）の塩基配列を有する核酸３および配列（４）の塩基配列を有する核酸４を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－３）を得た。核酸医薬（Ａ－３）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（４）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
<Production Example 3: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-3)>
Nucleic acid 3 having the base sequence of the sequence (3) containing an amino group at the 5'end and a nucleic acid aptamer at the 3'end and nucleic acid 4 having the base sequence of the sequence (4) are outsourced by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 3 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 4 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol strand was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-3) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-3) is a siRNA that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (3): sense strand]
5'-cuuacgcugaguacucugattccccccccctccgtccccgtggacactataattgcta-3'
[SEQ ID NO: (4): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguaagttccaccccaccctccgtccccgtgacactataattgcta-3'
＜製造例４：核酸医薬（Ａ－４）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（５）の塩基配列を有する核酸５および配列（６）の塩基配列を有する核酸６を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－４）を得た。核酸医薬（Ａ－４）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａｇａｃ－３’
［配列番号（６）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａｇａｃ－３’
<Production Example 4: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-4)>
Nucleic acid 5 having the base sequence of the sequence (5) containing the amino group at the 5'end and the nucleic acid aptamer at the 3'end and nucleic acid 6 having the base sequence of the sequence (6) are outsourced by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 5 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 6 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol strand was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-4) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-4) is a siRNA that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (5): sense strand]
5'-cuucgcuugacuacucgattaagac-3'
[SEQ ID NO: (6): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguaagttataagac-3'
＜製造例５：核酸医薬（Ａ－５）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（７）の塩基配列を有する核酸７および配列（８）の塩基配列を有する核酸８を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－５）を得た。核酸医薬（Ａ－５）はルシフェラーゼの発現を阻害するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
<Production Example 5: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-5)>
Nucleic acid 7 having the base sequence of the sequence (7) containing the amino group at the 5'end and the nucleic acid aptamer at the 3'end and nucleic acid 8 having the base sequence of the sequence (8) are outsourced by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 7 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 8 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol chain was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-5) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-5) is a siRNA that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (7): sense strand]
5'-cuuacgcugaguacucgaattgggaggggcattccgtgtgtctccagaatttctccga-3'
[SEQ ID NO: (8): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguaagttggggggaggccgattcggtgtgtccctccagaattttccga-3'
＜製造例６：核酸医薬（Ａ－６）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（９）の塩基配列を有する核酸９（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１０）の塩基配列を有する核酸１０（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
核酸９をリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＭＥ－２００ＡＳ）を加えて室温で４時間架橋反応した。反応後の溶液をエタノール沈殿により精製し、核酸１０と混合することで、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－６）を得た。核酸医薬（Ａ－６）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａａｇａ－３’
［配列番号（１０）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａａｇａ－３’
<Production Example 6: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-6)>
Nucleic acid 9 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (9) containing an amino group at the 5'end and a nucleic acid aptamer at the 3'end and having the base sequence of the sequence (10) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Nucleic acid 10 (luciferase DNA) was commissioned and synthesized.
Nucleic acid 9 is dissolved in a phosphate buffer (pH 7.5), and an equal amount of N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of linear polyethylene glycol (Sunbright ME-200AS manufactured by Yuka Sangyo Co., Ltd.) is added. The cross-linking reaction was carried out at room temperature for 4 hours. The solution after the reaction is purified by ethanol precipitation and mixed with nucleic acid 10, so that the 5'end is modified with a compound having a polyethylene glycol chain, and the 3'end is modified with a nucleic acid aptamer. A nucleic acid drug (A-6) having the above was obtained. Nucleic acid drug (A-6) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (9): sense strand]
5'-cuuacgcugaguacucugaaaaaaga-3'
[SEQ ID NO: (10): antisense strand]
5'-tcgaagtactcagcatagaaaaga-3'
＜製造例７：核酸医薬（Ａ－７）の合成＞
製造例６において、２等量の直鎖型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体に代えて、２等量の分岐型のポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル体（油化産業社製サンブライトＧＬ２－２００ＧＳ２）を用いたこと以外は、製造例６と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－７）を得た。核酸医薬（Ａ－７）はルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
<Production Example 7: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-7)>
In Production Example 6, instead of the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of 2 equal amounts of linear polyethylene glycol, the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester of 2 equal amounts of branched polyethylene glycol (oil). The same operation as in Production Example 6 was performed except that Sunbright GL2-200GS2) manufactured by Kasangyo Co., Ltd. was used, and the 5'end was modified with a compound having a polyethylene glycol chain, and the 3'end was modified with a nucleic acid aptamer. A nucleic acid drug (A-7) having a sense strand and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-7) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
＜製造例８：核酸医薬（Ａ－８）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１１）の塩基配列を有する核酸１１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１２）の塩基配列を有する核酸１２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－８）を得た。核酸医薬（Ａ－８）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１１）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
［配列番号（１２）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｃａｃｃｃｃａｃｃｔｃｇｃｔｃｃｃｇｔｇａｃａｃｔａａｔｇｃｔａ－３’
<Production Example 8: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-8)>
Nucleic acid 11 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (11) containing an amino group at the 5'end and a nucleic acid aptamer at the 3'end and having the base sequence of the sequence (12) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Nucleic acid 12 (luciferase DNA) was commissioned and synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 11 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 12 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol strand was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-8) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-8) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (11): sense strand]
5'-cuuackgucugacucccccaccctccgtccgtggacactataattgcta-3'
[SEQ ID NO: (12): antisense strand]
5'-tcgaagtactcagccgtagccccccccctccgtccccgtgacactaatgcta-3'
＜製造例９：核酸医薬（Ａ－９）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１３）の塩基配列を有する核酸１３（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１４）の塩基配列を有する核酸１４（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１３を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１４を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－９）を得た。核酸医薬（Ａ－９）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１３）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａａａａｇａｃ－３’
［配列番号（１４）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇａａａｇａｃ－３’
<Production Example 9: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-9)>
Nucleic acid 13 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (13) containing an amino group at the 5'end and a nucleic acid aptamer at the 3'end and having the base sequence of the sequence (14) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Nucleic acid 14 (luciferase DNA) was commissioned and synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 13 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 14 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol strand was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-9) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-9) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (13): sense strand]
5'-cuuackgucugaaagaac-3'
[SEQ ID NO: (14): antisense strand]
5'-tcgaagtactcagcgtagagaac-3'
＜製造例１０：核酸医薬（Ａ－１０）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含み、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１５）の塩基配列を有する核酸１５（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（１６）の塩基配列を有する核酸１６（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１５を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１６を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾され、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１０）を得た。核酸医薬（Ａ－１０）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（１５）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
［配列番号（１６）：アンチセンス鎖］
５’－ｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇｇｇｇｇａｇｇｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｔｇｔｃｃｔｃｃａｇａａｇａｔａｔｔｔｃｃｇａ－３’
<Production Example 10: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-10)>
Nucleic acid 15 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (15) containing an amino group at the 5'end and a nucleic acid aptamer at the 3'end and having the base sequence of the sequence (16) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Nucleic acid 16 (luciferase DNA) was commissioned and synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 15 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 16 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol strand was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-10) having a sense strand modified by a compound having a nucleic acid aptamer at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-10) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (15): sense strand]
5'-cuuacgcugaguacucugagggagggccgattcggtgtgtctccagaatttctccga-3'
[SEQ ID NO: (16): antisense strand]
5'-tcgaagtactcagccgtaggggggaggccgattcggtgtgtctccagaatttctccga-3'
＜製造例１１：比較の核酸医薬（Ａ－１１）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（５’末端および３’末端のいずれも修飾なし）及び配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１７と、核酸１８とを混合することで、５’末端および３’末端が修飾されていないセンス鎖とアンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１１）を得た。核酸医薬（Ａ－１１）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１７）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔ－３’
［配列番号（１８）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔ－３’
<Production Example 11: Synthesis of Comparative Nucleic Acid Drug (A-11)>
Nucleic acid 17 (neither 5'end nor 3'end modified) having the base sequence of sequence (17) and nucleic acid 18 (luciferase RNA) having the base sequence of sequence (18) were obtained by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Consigned synthesis.
Nucleic acid 17 and nucleic acid 18 were mixed to obtain a nucleic acid drug (A-11) having an unmodified sense strand and antisense strand at the 5'end and 3'end. Nucleic acid drug (A-11) is a siRNA that suppresses the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (17): sense strand]
5'-cuuackgucugacuucgatt-3'
[SEQ ID NO: (18): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguagtt-3'
＜製造例１２：比較の核酸医薬（Ａ－１２）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端にアミノ基を含む配列（１７）の塩基配列を有する核酸１７（３’末端の修飾なし）および配列（１８）の塩基配列を有する核酸１８（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸１７を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸１８を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１２）を得た。核酸医薬（Ａ－１２）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
<Production Example 12: Synthesis of Comparative Nucleic Acid Drug (A-12)>
Nucleic acid 17 (without modification at the 3'end) having the base sequence of the sequence (17) containing an amino group at the 5'end and nucleic acid 18 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (18) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. ) Was commissioned and synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 17 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 18 was used instead of nucleic acid 2, and a polyethylene glycol chain was formed at the 5'end. A nucleic acid drug (A-12) having a sense strand modified with a compound having an antisense strand and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-12) is a siRNA that suppresses the expression of luciferase.
＜製造例１３：比較の核酸医薬（Ａ－１３）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、３’末端に核酸アプタマーを含む配列（１９）の塩基配列を有する核酸１９（５’末端の修飾なし）および配列（２０）の塩基配列を有する核酸２０（ルシフェラーゼＲＮＡ）を委託合成した。
核酸１９と、核酸２０とを混合することで、３’末端が核酸アプタマーにより修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１３）を得た。核酸医薬（Ａ－１３）はルシフェラーゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡである。
［配列番号（１９）：センス鎖］
５’－ｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａｔｔａａａａｇａ－３’
［配列番号（２０）：アンチセンス鎖］
５’－ｕｃｇａａｇｕａｃｕｃａｇｃｇｕａａｇｔｔａａａａｇａ－３’
<Production Example 13: Synthesis of Comparative Nucleic Acid Drug (A-13)>
Nucleic acid 19 (without modification at the 5'end) having the base sequence of the sequence (19) containing the nucleic acid aptamer at the 3'end and nucleic acid 20 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (20) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. ) Was commissioned and synthesized.
By mixing nucleic acid 19 and nucleic acid 20, a nucleic acid drug (A-13) having a sense strand having a 3'end modified with a nucleic acid aptamer and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-13) is a siRNA that suppresses the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (19): sense strand]
5'-cuuackgucugacattaaaaaga-3'
[SEQ ID NO: (20): antisense strand]
5'-ucgaaguacucaggucguaagttataaga-3'
＜製造例１４：核酸医薬（Ａ－１４）の合成＞
Ｔｈｅｒｍｏ社のカスタム核酸合成により、５’末端に核酸アプタマーを含み、３’末端にアミノ基を含む配列（２１）の塩基配列を有する核酸２１（ルシフェラーゼＲＮＡ）及び配列（２２）の塩基配列を有する核酸２２（ルシフェラーゼＤＮＡ）を委託合成した。
製造例１において、核酸１に代えて、核酸２１を用いたこと、ならびに、核酸２に代えて核酸２２を用いたこと以外は製造例１と同じ操作を行い、５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖とを有する核酸医薬（Ａ－１４）を得た。核酸医薬（Ａ－１４）は、ルシフェラーゼの発現を阻害するヘテロ二本鎖核酸である。
［配列番号（２１）：センス鎖］
５’－ａａａｇａｃｃｕｕａｃｇｃｕｇａｇｕａｃｕｕｃｇａ－３’
［配列番号（２２）：アンチセンス鎖］
５’－ａａａｇａｃｔｃｇａａｇｔａｃｔｃａｇｃｇｔａａｇ－３’
<Production Example 14: Synthesis of Nucleic Acid Drug (A-14)>
Nucleic acid 21 (luciferase RNA) having the base sequence of the sequence (21) containing a nucleic acid aptamer at the 5'end and an amino group at the 3'end and having the base sequence of the sequence (22) by the custom nucleic acid synthesis of Thermo. Nucleic acid 22 (luciferase DNA) was commissioned and synthesized.
In Production Example 1, the same operation as in Production Example 1 was performed except that nucleic acid 21 was used instead of nucleic acid 1 and nucleic acid 22 was used instead of nucleic acid 2, and the 5'end was modified with a nucleic acid aptamer. Then, a nucleic acid drug (A-14) having a sense strand modified with a compound having a polyethylene glycol chain at the 3'end and an antisense strand was obtained. Nucleic acid drug (A-14) is a heteroduplex nucleic acid that inhibits the expression of luciferase.
[SEQ ID NO: (21): sense strand]
5'-aagaaccuacgcugaguacucga-3'
[SEQ ID NO: (22): antisense strand]
5'-aaagactcgaagtactccgtag-3'
＜実施例１～１１及び比較例１～３：細胞外小胞の製造及び評価＞
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍの培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、製造例１～１４で合成した核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下（ａ）～（ｄ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収することにより核酸医薬を内包した細胞外小胞（ＥＶ）を得た。
<Examples 1 to 11 and Comparative Examples 1 to 3: Production and evaluation of extracellular vesicles>
(1) Production of extracellular vesicles 5 μg of the nucleic acid drug synthesized in Production Examples 1 to 14 was transferred to a human-derived mesenchymal stem cell (hMSC) cultured in a culture plate of 1 × 10 6 cells / 10 cm with a transfection reagent (Thermo). It was introduced using Lipofectamine 2000) manufactured by the same company, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 conditions for 24 hours. After 24 hours, the supernatant was collected from the culture solution with a pipette, centrifuged according to the following procedures (a) to (d), and extracellular vesicles were purified and collected.
(A) The supernatant collected from the culture solution was centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was collected.
(B) The supernatant obtained in (a) was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was collected.
(C) The supernatant obtained in (b) was centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes, and the precipitate was collected.
(D) The precipitate obtained in (c) is suspended in 10 mL of phosphate buffered saline (PBS), centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes, and the precipitate is collected to contain a nucleic acid drug. Extracellular vesicles (EV) were obtained.
（２）細胞外小胞の粒子数の評価
（１）（ｄ）で得られた沈殿（核酸医薬を内包したＥＶ）に０．５ｍＬのＰＢＳを加えて懸濁させ、ＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。比較例４のＥＶサンプル液の１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を１．００としたときの、各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数の比を算出した。結果を表１に示す。
(2) Evaluation of the number of particles of extracellular vesicles (1) 0.5 mL of PBS was added to the precipitate (EV containing a nucleic acid drug) obtained in (d) and suspended to prepare an EV sample solution. .. The number of EV particles per 1 mL of the EV sample solution was measured using a nanoparticle multi-analyzer qNano. The ratio of the number of EV particles per 1 mL of the EV sample solution of each example was calculated when the number of EV particles per 1 mL of the EV sample solution of Comparative Example 4 was 1.00. The results are shown in Table 1.
（３）細胞外小胞に内包された核酸医薬量の評価
リシスバッファーを用いて、（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。比較例４のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量に対する各例のＥＶサンプル液１ｍＬあたりの核酸医薬量の比を算出した。結果を表１に示す。
(3) Evaluation of the amount of nucleic acid encapsulated in extracellular vesicles Nucleic acid contained in EV was extracted from the EV sample solution prepared in (2) using a lysis buffer, and the nucleic acid encapsulated in EV by a quantitative PCR method. The dosage was measured. The ratio of the nucleic acid pharmaceutical amount per 1 mL of the EV sample solution of each example to the nucleic acid pharmaceutical amount per 1 mL of the EV sample solution of Comparative Example 4 was calculated. The results are shown in Table 1.
＜比較例４：エレクトロポーション法による細胞外小胞の製造及び評価＞
（１）細胞外小胞の製造
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の（ａ）～（ｅ）の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製し回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、細胞外小胞（ＥＶ）として、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。このＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標） ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いて、エレクトロポレーション法により遺伝子導入を行い、核酸医薬を内包した細胞外小胞を製造した。
<Comparative Example 4: Production and evaluation of extracellular vesicles by electroporation method>
(1) Production of extracellular vesicles Human-derived mesenchymal stem cells (hMSC) cultured in 1 × 10 6 cells / 10 cm culture plates were cultured for 24 hours under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. After 24 hours, the supernatant was collected from the culture solution with a pipette, centrifuged according to the following procedures (a) to (e), and extracellular vesicles were purified and collected.
(A) The supernatant collected from the culture solution was centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was collected.
(B) The supernatant obtained in (a) was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was collected.
(C) The supernatant obtained in (b) was centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes, and the precipitate was collected.
(D) The precipitate obtained in (c) was suspended in 10 mL of PBS and centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes to recover the precipitate.
(E) The precipitate obtained in (d) was suspended as extracellular vesicles (EV) in 10 μL PBS to obtain an EV suspension. Nucleic acid drug (A-1) was added to this EV suspension in an amount of 5 μg, and a gene was introduced by electroporation using ExoFectin (registered trademark) sRNA-into-Exosome Kit (manufactured by 101 Bio). An extracellular vesicle containing was produced.
（２）細胞外小胞の粒子数の測定
（１）（ｅ）で得られた溶液にＰＢＳを添加して０．５ｍＬの懸濁液とすることでＥＶサンプル液を調製した。当該ＥＶサンプル液１ｍＬあたりのＥＶの粒子数を、ナノ粒子マルチアナライザーｑＮａｎｏを用いて測定した。
(2) Measurement of the number of particles of extracellular vesicles (1) An EV sample solution was prepared by adding PBS to the solution obtained in (e) to make a 0.5 mL suspension. The number of EV particles per 1 mL of the EV sample solution was measured using a nanoparticle multi-analyzer qNano.
（３）細胞外小胞に内包された核酸医薬量の測定
リシスバッファーを用いて（２）で調製したＥＶサンプル液からＥＶ内の核酸を抽出し、定量ＰＣＲ法によりＥＶに内包された核酸医薬量を測定した。
(3) Measurement of the amount of nucleic acid drug contained in extracellular vesicles Nucleic acid drug in EV is extracted from the EV sample solution prepared in (2) using a lysis buffer, and the nucleic acid drug encapsulated in EV by a quantitative PCR method. The amount was measured.
表１および２のＰＥＧ修飾の欄には、核酸医薬のセンス鎖の５’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物で修飾されているものについては「＋」、前記センス鎖の５’末端が修飾されていないものは「－」と記載した。表１および２の核酸アプタマー修飾の欄には、核酸医薬のセンス鎖の３’末端が核酸アプタマーで修飾されているものについては「＋」、前記センス鎖の３’末端が修飾されていないものは「－」と記載した。核酸医薬（Ａ－１４）については、センス鎖の５’末端が核酸アプタマーにより修飾され、３’末端がポリエチレングリコール鎖を有する化合物により修飾されているが、核酸アプタマー修飾の欄及びＰＥＧ修飾の欄に、それぞれ「＋」と記載した。 In the PEG modification column of Tables 1 and 2, "+" is given to those in which the 5'end of the sense strand of the nucleic acid drug is modified with a compound having a polyethylene glycol chain, and the 5'end of the sense strand is modified. Those that are not listed are described as "-". In the columns of nucleic acid aptamer modification in Tables 1 and 2, "+" is given to those in which the 3'end of the sense strand of the nucleic acid drug is modified with nucleic acid aptamer, and those in which the 3'end of the sense strand is not modified. Is described as "-". For nucleic acid drugs (A-14), the 5'end of the sense strand is modified with a nucleic acid aptamer and the 3'end is modified with a compound having a polyethylene glycol chain, but the nucleic acid aptamer modification column and the PEG modification column. , Each described as "+".
＜実施例１２～２２及び比較例６～８：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果の評価＞
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）に、核酸医薬５μｇをトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。核酸医薬としては製造例１～１４で製造した核酸医薬（Ａ－１）～（Ａ－１４）であって表２に示す種類のものを用いた。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液から回収した上清を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳにて懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、０．２ｍＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶサンプルとした。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に、（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの各例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
<Examples 12 to 22 and Comparative Examples 6 to 8: Evaluation of luciferase activity inhibitory effect of extracellular vesicles>
(1) Purification of extracellular vesicles 5 μg of nucleic acid drug was introduced into human-derived mesenchymal stem cells (hMSC) cultured in a 1 × 10 6 cell / 10 cm culture plate using a transfection reagent (Lipofectamine 2000 manufactured by Thermo). , 37 ° C., 5% CO 2 conditions for 24 hours. As the nucleic acid medicine, the nucleic acid medicines (A-1) to (A-14) produced in Production Examples 1 to 14 and the types shown in Table 2 were used. After 24 hours, the supernatant was collected from the culture solution with a pipette, centrifuged according to the following procedure, and extracellular vesicles were purified and collected.
(A) The supernatant collected from the culture solution was centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was collected.
(B) The supernatant obtained in (a) was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was collected.
(C) The supernatant obtained in (b) was centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes, and the precipitate was collected.
(D) The precipitate obtained in (c) was suspended in 10 mL of PBS and centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes to recover the precipitate.
(E) The precipitate obtained in (d) was suspended in 0.2 mL of PBS to prepare an EV sample.
(2) Evaluation of luciferase activity inhibitory effect 0.1 mL of the EV sample obtained in (1) was added to Hela cells expressing luciferase cultured on a 24-well culture plate at a cell concentration of 1 × 10 5 cells / well. It was added and cultured for 16 hours. 100 μL of a luciferin reagent prepared in PBS at a concentration of 150 μg / mL was added to the cultured Hela cells, and the intracellular luciferase activity was measured using an in vivo imaging system IVIS Lumina (manufactured by Xenogen). The ratio of the luciferase activity of each example was calculated when the luciferase activity of Comparative Example 5 (control example: see below) was 1.00. The results are shown in Table 2.
＜比較例５：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果を評価するためのコントロール例＞
核酸医薬を用いなかったこと以外は実施例１１と同様の操作を行い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
<Comparative Example 5: Control example for evaluating the effect of suppressing the luciferase activity of extracellular vesicles>
The same operation as in Example 11 was carried out except that the nucleic acid drug was not used, and the luciferase activity was measured.
＜比較例９：細胞外小胞のルシフェラーゼ活性抑制効果の評価（エレクトロポレーション法）＞
（１）細胞外小胞の精製
１×１０６個／１０ｃｍ培養プレートで培養したヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。２４時間経過後、培養液から上清をピペットで回収し、以下の手順に従って遠心分離を行い、細胞外小胞を精製回収した。
（ａ）前記培養液を、２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｂ）（ａ）で得られた上清を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（ｃ）（ｂ）で得られた上清を、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｄ）（ｃ）で得られた沈殿を、１０ｍＬのＰＢＳで懸濁し、１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
（ｅ）（ｄ）で得られた沈殿を、ＥＶとして、１０μＬのＰＢＳにより懸濁しＥＶ懸濁液を得た。得られたＥＶ懸濁液に核酸医薬（Ａ－１）を５μｇ加え、ＥｘｏＦｅｃｔｉｎ（登録商標）ｓＲＮＡ－ｉｎｔｏ－Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（１０１ Ｂｉｏ社製）を用いてエレクトロポレーション法により遺伝子の導入を行った。得られた溶液にＰＢＳを添加して懸濁し０．２ｍＬのＥＶサンプルを得た。
（２）ルシフェラーゼ活性抑制効果の評価
１×１０５個／ウェルの細胞濃度にて２４ウェル培養プレート上で培養したルシフェラーゼを発現するＨｅｌａ細胞に（１）で得られたＥＶサンプルを０．１ｍＬ添加して１６時間培養した。培養後のＨｅｌａ細胞に１５０μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳで調製したルシフェリン試薬を１００μＬ添加し、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）を使用して、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。比較例５（コントロール例：下記参照）のルシフェラーゼ活性を１．００としたときの本例のルシフェラーゼ活性の比を算出した。結果を表２に示す。
<Comparative Example 9: Evaluation of luciferase activity inhibitory effect of extracellular vesicles (electroporation method)>
(1) Purification of extracellular vesicles Human-derived mesenchymal stem cells (hMSC) cultured in 1 × 10 6 cells / 10 cm culture plates were cultured at 37 ° C. for 24 hours under 5% CO 2 conditions. After 24 hours, the supernatant was collected from the culture solution with a pipette, centrifuged according to the following procedure, and extracellular vesicles were purified and collected.
(A) The culture solution was centrifuged at 2,000 × g for 15 minutes, and the supernatant was collected.
(B) The supernatant obtained in (a) was centrifuged at 10,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was collected.
(C) The supernatant obtained in (b) was centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes, and the precipitate was collected.
(D) The precipitate obtained in (c) was suspended in 10 mL of PBS and centrifuged at 100,000 × g for 60 minutes to recover the precipitate.
(E) The precipitate obtained in (d) was suspended in 10 μL of PBS as EV to obtain an EV suspension. 5 μg of nucleic acid drug (A-1) was added to the obtained EV suspension, and the gene was introduced by the electroporation method using ExoFectin (registered trademark) sRNA-into-Exosome Kit (manufactured by 101 Bio). .. PBS was added to the obtained solution and suspended to obtain a 0.2 mL EV sample.
(2) Evaluation of luciferase activity inhibitory effect 0.1 mL of the EV sample obtained in (1) was added to Hela cells expressing luciferase cultured on a 24-well culture plate at a cell concentration of 1 × 10 5 cells / well. And cultured for 16 hours. 100 μL of a luciferin reagent prepared in PBS at a concentration of 150 μg / mL was added to the cultured Hela cells, and the intracellular luciferase activity was measured using an in vivo imaging system IVIS Lumina (manufactured by Xenogen). The ratio of the luciferase activity of this example was calculated when the luciferase activity of Comparative Example 5 (control example: see below) was 1.00. The results are shown in Table 2.
表１に示すように、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬の存在下に細胞外小胞を製造した実施例１～１１では、比較例１～３と比較して、ＥＶ内への核酸医薬の導入量（内包量）が顕著に高いことが分かる。また、実施例１～１１では、比較例４の方法と比較して、回収できるＥＶの粒子数が顕著に多いことが分かる。
さらに、表２に示すように、実施例１２～２２の方法で標的遺伝子の活性抑制を行うと、比較例５～８の方法と比較して、標的遺伝子の活性抑制効果が顕著に高いことが分かる。また、実施例１２～２２の方法では、比較例９の方法（エレクトロポレーション法により作製したＥＶを用いる方法）よりも、標的遺伝子の発現抑制効果が顕著に高いことが分かる。
これらの結果から、本発明によれば、核酸医薬の内包量を向上させることが可能な細胞外小胞の製造方法を提供でき、かつ、標的遺伝子の発現抑制効果の高い核酸医薬内包細胞外小胞を容易に製造できることがわかる。
As shown in Table 1, in Examples 1 to 11 in which extracellular vesicles were produced in the presence of a nucleic acid drug having a sense strand having a modified 3'end and a 5'end, respectively, and an antisense strand. It can be seen that the amount of the nucleic acid drug introduced into the EV (encapsulation amount) is significantly higher than that of Comparative Examples 1 to 3. Further, it can be seen that in Examples 1 to 11, the number of EV particles that can be recovered is significantly larger than that in the method of Comparative Example 4.
Furthermore, as shown in Table 2, when the activity of the target gene is suppressed by the methods of Examples 12 to 22, the effect of suppressing the activity of the target gene is significantly higher than that of the methods of Comparative Examples 5 to 8. I understand. Further, it can be seen that the methods of Examples 12 to 22 have a significantly higher effect of suppressing the expression of the target gene than the method of Comparative Example 9 (method using EV produced by the electroporation method).
From these results, according to the present invention, it is possible to provide a method for producing extracellular vesicles capable of improving the encapsulation amount of a nucleic acid drug, and the nucleic acid drug encapsulating extracellular vesicle having a high effect of suppressing the expression of a target gene can be provided. It can be seen that vesicles can be easily produced.
Claims (5)
核酸医薬の存在下、細胞外小胞の供給源細胞を培養する工程１を含み、
工程１で用いる核酸医薬は、３’末端及び５’末端がそれぞれ修飾されたセンス鎖と、アンチセンス鎖と、を有する核酸医薬である細胞外小胞の製造方法。 A method for producing extracellular vesicles containing nucleic acid drugs.
Including step 1 of culturing the source cells of extracellular vesicles in the presence of a nucleic acid drug.
The nucleic acid drug used in step 1 is a method for producing extracellular vesicles, which is a nucleic acid drug having a sense strand and an antisense strand in which the 3'end and the 5'end are modified, respectively.
The method for producing an extracellular vesicle according to any one of claims 1 to 4, wherein the extracellular vesicle is an exosome.
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| CN117706088A (en) * | 2024-02-05 | 2024-03-15 | 首都医科大学附属北京康复医院 | Method for detecting methicillin staphylococcus aureus |
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| CN117706088A (en) * | 2024-02-05 | 2024-03-15 | 首都医科大学附属北京康复医院 | Method for detecting methicillin staphylococcus aureus |
| CN117706088B (en) * | 2024-02-05 | 2024-05-03 | 首都医科大学附属北京康复医院 | Method for detecting methicillin staphylococcus aureus |
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