JP2022031784A - Bcma-targeted chimeric antigen receptor, and preparation method and use thereof - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a BCMA-targeted chimeric antigen receptor, and a preparation method and use thereof.

SOLUTION: The present invention provides a BCMA-targeted chimeric antigen receptor which comprises a BCMA-targeted scFv, a hinge region, a transmembrane region, and an intracellular signal domain. The present invention provides a nucleic acid molecule for encoding the chimeric antigen receptor and a corresponding expression vector, as well as CAR-T cells and use thereof. The chimeric antigen receptor targets BCMA-positive cells, and thus can be used for treating diseases such as BCMA-positive B-cell lymphoma, multiple myeloma and plasma cell leukemia.

SELECTED DRAWING: None

COPYRIGHT: (C)2022,JPO&INPIT

Description

本発明は、生物医薬の分野に関し、より具体的に、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受
容体およびその製造方法と使用に関する。 The present invention relates to the field of biopharmaceuticals, and more specifically to BCMA-targeted chimeric antigen receptors and methods and uses thereof.

ＢＣＭＡはＢ細胞成熟抗原で、ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳＦ１７とも呼ばれ、腫瘍壊
死因子受容体スーパーファミリーのメンバーで、そのリガンドはＢ細胞活性化因子（ＢＡ
ＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。
ＢＣＭＡとＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの結合はＮＦ－ｋＢを活性化させ、抗アポトーシ
スＢｃｌ－２のメンバー、たとえばＢｃｌ－ｘＬまたはＢｃｌ－２およびＭｃｌ－１の上
方調節を誘導する。ＢＣＭＡとそのリガンドの相互作用は様々な面から体液免疫、Ｂ細胞
の生長、分化を調節することによって人体内環境の安定した平衡を維持する。 BCMA is a B cell maturation antigen, also called CD269 or TNFRSF17, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, whose ligand is B cell activating factor (BA).
FF) and growth-inducing ligand (APRIL).
Binding of BCMA to BAFF and APRIL activates NF-kB and induces upregulation of anti-apoptotic Bcl-2 members such as Bcl-xL or Bcl-2 and Mcl-1. The interaction between BCMA and its ligands maintains a stable equilibrium of the human environment by regulating humoral immunity, B cell growth, and differentiation from various aspects.

ＢＣＭＡの発現はＢ細胞系に限られ、形質芽球では、形質細胞および一部の成熟Ｂ細胞
で発現され、末梢Ｂ細胞の分化時に増加するが、一方、大半のＢ細胞、たとえばナイーブ
Ｂ細胞、メモリーＢ細胞や胚中心Ｂ細胞およびほかの器官では発現されない。ＢＣＭＡの
発現は骨髄における長寿で、定着した形質細胞に重要であることが報告された。そのため
、ＢＣＭＡ欠陥マウスでは、骨髄における形質細胞は減少するが、脾臓における形質細胞
レベルは影響されない。成熟Ｂ細胞はＢＣＭＡノックアウトマウスにおいて正常に形質細
胞に分化する。ＢＣＭＡノックアウトマウスは見かけはすべて正常で、健康そうで、しか
もＢ細胞の数が正常であるが、形質細胞は長期間生存することができない。 BCMA expression is confined to B cell lines, and in plasmablasts it is expressed in plasma cells and some mature B cells and increases during peripheral B cell differentiation, while most B cells, such as naive B cells, , Not expressed in memory B cells, germinal center B cells and other organs. BCMA expression has been reported to be important for established plasma cells for longevity in the bone marrow. Therefore, in BCMA-deficient mice, plasma cells in the bone marrow are reduced, but plasma cell levels in the spleen are not affected. Mature B cells normally differentiate into plasma cells in BCMA knockout mice. BCMA knockout mice are all normal in appearance, appear healthy, and have a normal number of B cells, but plasma cells cannot survive for long periods of time.

ＢＣＭＡは悪性形質細胞でも高度発現され、たとえば多発性骨髄腫や形質細胞性白血病
、ホジキンリンパ腫の患者のＨＲＳ細胞でもＢＣＭＡが検出された。米国では、血液系の
悪性腫瘍は悪性腫瘍全体の約１０％を占め、骨髄腫は悪性血液腫瘍全体の１５％を占める
。文献では、ＢＣＭＡの発現は多発性骨髄腫の疾患進展に関連することが報告された。Ｂ
ＣＭＡ遺伝子は骨髄腫の検体では高度発現されるが、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性
白血病、急性Ｔリンパ性白血病では発現レベルが低い。ＢＣＭＡリガンドであるＢＡＦＦ
およびＡＰＲＩＬを過剰発現するネズミモデルにおいて、Ｂ細胞リンパ腫が顕著に増殖す
る。ＢＣＭＡと結合するリガンドはＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫の増殖と生存を調節
することができることが証明された。ＢＣＭＡとＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの結合は悪性
形質細胞を生存させることができるため、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞を消耗させ、ＢＣ
ＭＡリガンドと受容体の間の相互作用を破壊することは、多発性骨髄腫またはほかのＢＣ
ＭＡ陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫に対する治療効果を改善することができる。 BCMA is also highly expressed in malignant plasma cells, and BCMA was also detected in HRS cells of patients with multiple myeloma, plasma cell leukemia, and Hodgkin lymphoma, for example. In the United States, malignant tumors of the blood system make up about 10% of all malignant tumors, and myeloma accounts for 15% of all malignant hematological tumors. The literature reports that expression of BCMA is associated with disease progression in multiple myeloma. B
The CMA gene is highly expressed in myeloma specimens, but is less expressed in chronic lymphocytic leukemia, acute lymphocytic leukemia, and acute T lymphocytic leukemia. BAFF, a BCMA ligand
And in a murine model that overexpresses APRIL, B-cell lymphoma proliferates significantly. It has been demonstrated that a ligand that binds to BCMA can regulate the growth and survival of multiple myeloma expressing BCMA. Since the binding of BCMA to BAFF and APRIL can survive malignant plasma cells, it depletes tumor cells expressing BCMA and BC.
Disrupting the interaction between MA ligands and receptors can lead to multiple myeloma or other BCs.
The therapeutic effect on MA-positive B-cell malignant lymphoma can be improved.

多発性骨髄腫は、形質細胞腫またはケーラー病とも呼ばれ、難治性のＢ細胞系の悪性腫
瘍で、特徴は形質細胞の異常増殖で、形質細胞は白血球の種類の一つで、抗体を生成する
役割を担う。米国国立癌研究所によって２０１７年に発表されたデータでは、骨髄腫は腫
瘍症例全体の１．８％を占め、致死率が２．１％であることが示されている。２０１０年
－２０１４年の統計結果では、毎年の発症率が約１０万分の６．６で、死亡率が約５０％
であることが示されている。多発性骨髄腫は、中高年疾患に属し、欧米では発症年齢の中
央値は６８歳で、男性は女性よりも多く、我が国の統計では、発症年齢のピークは５５－
６５歳で、男女比は２．３５：１で、我が国では、多発性骨髄腫の確実な流行病学の調査
資料がまだないが、一般的に、発症率が周辺の東南アジアと日本に近く、約１０万分の１
であると推測されている。多発性骨髄腫の従来の治療手段は、化学治療および造血幹細胞
移植を含むが、これらの方法は再発率が高い。ボルテゾミブ（ＰＳ－３４１）は初めての
プロテアソーム阻害剤で、２００３年にＦＤＡによって単独または既存薬物との併用で再
発性・難治性の多発性骨髄腫の治療への使用が許可され、結果は喜ばしいものであった。
当該薬物は２００５年に中国でも市販され、現在、サリドマイド、デキサメタゾンなどと
ともに多発性骨髄腫の治療によく使用される選択の一つになっている。多発性骨髄腫の治
療方法は、通常、併用のものであるが、同時に複数の薬物を使用すると、費用が高価で、
副作用が累積するという、よくない結果もある。臨床では、多発性骨髄腫を治療する新規
な方法の開発がまだ切望されている。 Multiple myeloma, also called plasmacytoma or Koehler's disease, is a refractory B-cell malignancies characterized by overgrowth of plasma cells, which are a type of white blood cell that produce antibodies. Take on the role of Data published in 2017 by the National Cancer Institute show that myeloma accounts for 1.8% of all tumor cases and has a case fatality rate of 2.1%. According to the 2010-2014 statistics, the annual incidence rate is about 6.6 / 100,000 and the mortality rate is about 50%.
It is shown to be. Multiple myeloma belongs to middle-aged and elderly diseases. In Europe and the United States, the median age of onset is 68 years, and males are more common than females. According to Japanese statistics, the peak age of onset is 55-
At the age of 65, the male-female ratio is 2.35: 1, and although there is no reliable epidemiological survey material for multiple myeloma in Japan, the incidence is generally close to that of neighboring Southeast Asia and Japan. About 1 / 100,000
It is speculated that. Traditional treatments for multiple myeloma include chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation, but these methods have a high recurrence rate. Bortezomib (PS-341) is the first proteasome inhibitor and was approved by the FDA in 2003 for the treatment of relapsed and refractory multiple myeloma alone or in combination with existing drugs, and the results are pleasing. Met.
The drug was marketed in China in 2005 and is now one of the most commonly used choices for the treatment of multiple myeloma along with thalidomide, dexamethasone and the like. Treatment of multiple myeloma is usually a combination, but the use of multiple drugs at the same time is expensive and expensive.
There are also bad consequences of cumulative side effects. In clinical practice, the development of new methods for treating multiple myeloma is still eagerly awaited.

最近、免疫療法、特に養子Ｔ細胞療法は、血液系の悪性腫瘍を治療する臨床試験におい
て強い治療効果および明るい将来性が示されている。Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ
）を発現するように遺伝子修飾されてもよく、抗原認識部分およびＴ細胞活性化領域を含
む。ＣＡＲはモノクローナル抗体の抗原結合の性質を利用してＴ細胞の特異性と反応性を
リダイレクトしてＭＨＣに拘束されずにターゲッティングすることができる。このような
非ＭＨＣ拘束性抗原認識によって、ＣＡＲを発現するＴ細胞は抗原を加工せずに抗原を認
識するため、腫瘍の逃避の主な機序の一つが避けられる。そのほか、ＣＡＲは内因性ＴＣ
Ｒのα鎖、β鎖と二量体になることがない。 Recently, immunotherapy, especially adoptive T cell therapy, has shown strong therapeutic effects and bright future in clinical trials for treating malignant tumors of the blood system. T cells are chimeric antigen receptors (CAR)
) May be genetically modified to include an antigen recognition moiety and a T cell activation region. CAR can utilize the antigen-binding properties of monoclonal antibodies to redirect the specificity and reactivity of T cells for targeting without being bound by MHC. By such non-MHC-restricted antigen recognition, CAR-expressing T cells recognize the antigen without processing the antigen, thus avoiding one of the main mechanisms of tumor escape. In addition, CAR is an endogenous TC
It does not become a dimer with the α chain and β chain of R.

現在、海外では既に２つのＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（ＣＡＲ
－Ｔ）の製品が市販され、児童と若年の患者の急性リンパ性白血病の治療および成人の再
発性または難治性の大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫の第二選択以上の治療に使用される。しか
しながら、ＣＤ１９は多発性骨髄腫の悪性形質細胞において発現されることが少ない。本
分野では、多発性骨髄腫を治療する、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ－Ｔ製品の開発が切望
されている。 Currently, overseas, chimeric antigen receptor T cell therapy (CAR) already targets two CD19s.
-T) products are commercially available and are used in the treatment of acute lymphocytic leukemia in children and young patients and in the second and higher choices for relapsed or refractory large B-cell lymphoma in adults. However, CD19 is rarely expressed in malignant plasma cells of multiple myeloma. In this field, the development of CAR-T products targeting BCMA for treating multiple myeloma is eagerly desired.

発明の概要
本発明の目的は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用を
提供することにある。
具体的に、本発明の目的は、ＢＣＭＡ抗原を標的とするキメラ抗原受容体の配列、およ
びその修飾Ｔ細胞（ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ）の製造方法と活性同定を提供することにある。 Outline of the Invention An object of the present invention is to provide a chimeric antigen receptor targeting BCMA and a method for producing the same and its use.
Specifically, an object of the present invention is to provide a sequence of a chimeric antigen receptor targeting a BCMA antigen, and a method for producing and identifying the activity of modified T cells (CART-BCMA) thereof.

本発明は、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫を治療するためのキメラ抗原受容体の構造
を提供する。
本発明の第一の側面では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（配列）であって、前記キメラ
抗原受容体の抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標的とする細胞外領域の抗体一本鎖可変領域
の配列であるものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗原結合ドメインはＢＣＭＡ配列の２４～４１番
目のアミノ酸残基を標的とする抗体一本鎖可変領域の配列である。
もう一つの好適な例において、前記のＢＣＭＡ配列のＮＣＢＩ登録番号はＡＹ６８４９
７５．１である。 The present invention provides the structure of a chimeric antigen receptor for treating BCMA-positive B-cell lymphoma.
In the first aspect of the present invention, it is a chimeric antigen receptor (CAR) (sequence), and the antigen binding domain of the chimeric antigen receptor is a sequence of an antibody single-stranded variable region in an extracellular region targeting BCMA. Provide what is.
In another preferred example, the antigen-binding domain is a sequence of antibody single-stranded variable regions targeting amino acid residues 24-41 of the BCMA sequence.
In another preferred example, the NCBI registration number for the BCMA sequence is AY6849.
75.1.

もう一つの好適な例において、前記の抗原結合ドメインの構造は、下記式Ｉで表され
る。
Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ （Ｉ）
（ただし、Ｖ_Ｈは抗体の重鎖可変領域で、Ｖ_Ｌは抗体の軽鎖可変領域で、「－」は連結
ペプチドまたはペプチド結合である。
かつ、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号１で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号２で
示され、
あるいは、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号３で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号
４で示され、
あるいは、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号５で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号
６で示される。） In another preferred example, the structure of the antigen binding domain is represented by Formula I below.
_VL - _VH (I)
(However, _VE is the heavy chain variable region of the antibody, _VL is the light chain variable region of the antibody, and "-" is a linked peptide or peptide bond.
Moreover, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 2.
Alternatively, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 4.
Alternatively, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 6. )

もう一つの好適な例において、前記の連結ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１０ま
たは配列番号１１で示される。
もう一つの好適な例において、前記の抗体一本鎖可変領域はヒト化の抗体一本鎖可変領
域、ネズミ由来の抗体一本鎖可変領域、ヒトとネズミのキメラの抗体一本鎖可変領域であ
る。
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗原受容体の構造は、下記式ＩＩで表される
。
Ｓ－Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩ）
（ただし、
Ｓは任意のシグナルペプチド（すなわちsignal peptide）である。
Ｈはヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
Ｖ_ＨとＶ_Ｌはそれぞれ上記の通りである。） In another preferred example, the amino acid sequence of the linked peptide is set forth by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11.
In another preferred example, the antibody single-stranded variable region described above is a humanized antibody single-stranded variable region, a murine-derived antibody single-stranded variable region, or a human-rat chimeric antibody single-stranded variable region. be.
In another preferred example, the structure of the chimeric antigen receptor is represented by Formula II below.
S-V _L -V _H -H-TM-C-CD3ζ (II)
(However,
S is any signal peptide (ie, signal peptide).
H is a hinge region.
TM is a transmembrane domain.
C is a co-stimulation signal molecule.
CD3ζ is an intracellular signal transduction sequence derived from CD3ζ.
V _H and V _L are as described above, respectively. )

もう一つの好適な例において、前記のＳは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４
、ＣＤ１３７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のシグナル
ペプチドである。
もう一つの好適な例において、前記のＳは、ＣＤ８由来のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、Ｓのアミノ酸配列は、配列番号９で示される。 In another preferred example, the S is CD8, CD28, GM-CSF, CD4.
, CD137, or a signal peptide of a protein selected from the group consisting of combinations thereof.
In another preferred example, the S is a CD8-derived signal peptide.
In another preferred example, the amino acid sequence of S is set forth in SEQ ID NO: 9.

もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはこ
れらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８由来のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、Ｈのアミノ酸配列は、配列番号１２で示される。 In another preferred example, said H is the hinge region of a protein selected from the group consisting of CD8, CD28, CD137, or a combination thereof.
In another preferred example, the H is a hinge region derived from CD8.
In another preferred example, the amino acid sequence of H is set forth in SEQ ID NO: 12.

もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４
、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ
８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの組み合わせから
なる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインである。
もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ８由来の膜貫通ドメインである。
もう一つの好適な例において、ＴＭの配列は、配列番号１３で示される。 In another preferred example, the TM is CD28, CD3ε, CD45, CD4.
, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD
A transmembrane domain of a protein selected from the group consisting of 80, CD86, CD134, CD137, CD154, or a combination thereof.
In another preferred example, the TM is a CD8-derived transmembrane domain.
In another preferred example, the sequence of TM is set forth in SEQ ID NO: 13.

もう一つの好適な例において、前記のＣは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、Ｃ
Ｄ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ
１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯ
Ｓ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、またはこれらの組み合わせからな
る群から選ばれるタンパク質の共刺激シグナル分子である。
もう一つの好適な例において、前記のＣは、４－１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子であ
る。
もう一つの好適な例において、Ｃのアミノ酸配列は、配列番号１４で示される。
もう一つの好適な例において、ＣＤ３ζのアミノ酸配列は、配列番号１５で示される。 In another preferred example, the C is OX40, CD2, CD7, CD27, C.
D28, CD30, CD40, CD70, CD134, 4-1BB (CD137), PD
1, Dap10, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a / CD18), ICO
It is a protein co-stimulation signal molecule selected from the group consisting of S (CD278), NKG2D, GITR, TLR2, or a combination thereof.
In another preferred example, C is a co-stimulation signal molecule derived from 4-1BB.
In another preferred example, the amino acid sequence of C is set forth in SEQ ID NO: 14.
In another preferred example, the amino acid sequence of CD3ζ is set forth by SEQ ID NO: 15.

本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を
コードする核酸分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は単離されたものである。
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供
する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レン
チウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾ
ン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。 A second aspect of the invention provides a nucleic acid molecule encoding the chimeric antigen receptor (CAR) described in the first aspect of the invention.
In another preferred example, the nucleic acid molecule is isolated.
A third aspect of the invention provides a vector comprising the nucleic acid molecule described in the second aspect of the invention.
In another preferred example, the vector is selected from the group consisting of DNA, RNA, plasmids, lentiviral vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors, transposons, or combinations thereof.
In another preferred example, the vector is a lentiviral vector.

本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含有するか、あるい
は染色体に外来の本発明の第二の側面に記載の核酸分子が組み込まれたか、あるいは本発
明の第一の側面に記載のＣＡＲを発現する宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記細胞は単離された細胞で、および／または前記細胞
は遺伝子改変された細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞は哺乳動物の細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞はＴ細胞である。 In the fourth aspect of the invention, the vector according to the third aspect of the present invention is contained, or the chromosomal nucleic acid molecule described in the second aspect of the present invention is incorporated into the chromosome, or the present invention. Provided are host cells expressing the CAR described in the first aspect of the invention.
In another preferred example, the cell is an isolated cell and / or the cell is a genetically modified cell.
In another preferred example, the cell is a mammalian cell.
In another preferred example, the cell is a T cell.

本発明の第五の側面では、ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法であって、前記のＣＡＲ－Ｔ
細胞は本発明の第一の側面に記載のＣＡＲを発現し、
本発明の第二の側面に記載の核酸分子または本発明の第三の側面に記載のベクターをＴ
細胞内に形質導入することによって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程、
を含む方法を提供する。 A fifth aspect of the present invention is a method for producing CAR-T cells, which is the above-mentioned CAR-T.
The cells express the CAR described in the first aspect of the invention and
The nucleic acid molecule described in the second aspect of the present invention or the vector described in the third aspect of the present invention is T.
The step of obtaining the CAR-T cells by transducing them into cells,
Provide methods including.

本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第
二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四
の側面に記載の細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する薬物
組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記製剤は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記製剤の剤形は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記製剤で、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度が１×１０^３～
１×１０^８細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０^４～１×１０^７細胞／ｍＬである。 In the sixth aspect of the invention, the chimeric antigen receptor described in the first aspect of the invention, the nucleic acid molecule described in the second aspect of the invention, the vector described in the third aspect of the invention, or. Provided is a drug composition containing the cells according to the fourth aspect of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.
In another preferred example, the formulation is a liquid formulation.
In another preferred example, the dosage form of the formulation is an injection.
In another suitable example, in the above-mentioned preparation, the concentration of the CAR-T cells is 1 × 10 ³ ～.
It is 1 × 10 ⁸ cells / mL, preferably 1 × 10 ⁴ to 1 × 10 ⁷ cells / mL.

本発明の第七の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第
二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四
の側面に記載の細胞の使用であって、癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物ま
たは製剤の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み
合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発
性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、び
まん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはこれらの組み合わせからなる群
から選ばれる。 In the seventh aspect of the invention, the chimeric antigen receptor described in the first aspect of the invention, the nucleic acid molecule described in the second aspect of the invention, the vector described in the third aspect of the invention, or. The use of cells according to a fourth aspect of the invention, provided for use in the manufacture of a drug or formulation that prevents and / or treats cancer or tumor.
In another preferred example, the tumor is selected from the group consisting of hematological tumors, solid tumors, or combinations thereof.
In another preferred example, the hematological malignancies are acute myelocytic leukemia (AML), multiple myeloma (MM), chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute lymphocytic leukemia (ALL), diffuse large cells. It is selected from the group consisting of type B cell lymphoma (DLBCL) or a combination thereof.

もう一つの好適な例において、前記の固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血
病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵
巣癌、リンパ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳膠細
胞腫、子宮内膜癌、またはからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍は、ＢＣＭＡ陽性腫瘍、好ましくはＢＣＭＡ
陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、または形質細胞性白血病である。 In another preferred example, the solid tumors are gastric cancer, gastric cancer peritoneal metastasis, liver cancer, leukemia, kidney tumor, lung cancer, small bowel cancer, bone cancer, prostate cancer, conjunctival cancer, breast cancer, colon cancer, cervix. It is selected from the group consisting of cancer, ovarian cancer, lymphoma, nasopharyngeal cancer, adrenal tumor, bladder tumor, non-small cell lung cancer (NSCLC), gliocytoma, endometrial cancer, or.
In another preferred example, the tumor is a BCMA positive tumor, preferably BCMA.
Positive B-cell lymphoma, multiple myeloma, or plasmacytotic leukemia.

本発明の第八の側面では、本発明の第四の側面に記載の細胞を製造するためのキットで
あって、容器と、容器内にある本発明の第二の側面に記載の核酸分子、または本発明の第
三の側面に記載のベクターを含むキットを提供する。
本発明の第九の側面では、本発明の第四の側面に記載の細胞、または本発明の第六の側
面に記載の製剤の使用であって、癌または腫瘍の予防および／または治療における使用を
提供する。 In the eighth aspect of the present invention, a kit for producing the cells according to the fourth aspect of the present invention, the container and the nucleic acid molecule according to the second aspect of the present invention in the container. Alternatively, a kit containing the vector according to the third aspect of the present invention is provided.
A ninth aspect of the invention is the use of the cell according to the fourth aspect of the invention, or the formulation according to the sixth aspect of the invention, for use in the prevention and / or treatment of cancer or tumor. I will provide a.

本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に適量の本
発明の第四の側面に記載の細胞、および／または本発明の第六の側面に記載の製剤を施用
する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記疾患は癌または腫瘍である。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば
実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技
術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。 A tenth aspect of the invention is a method of treating a disease, wherein an appropriate amount of the cells according to the fourth aspect of the present invention and / or the sixth aspect of the present invention is described for a subject in need of treatment. Provided is a method including a step of applying the preparation of the above.
In another preferred example, the disease is cancer or tumor.
Of course, within the scope of the present invention, it is understood that the above-mentioned technical features of the present invention and the specifically described technical features below (for example, Examples) can be combined with each other to form a new or suitable technical plan. Will be done. Since the number of papers is limited, I will not explain it here one by one.

図１は、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ比較例のクリーニング結果の図を示す。図１Ａは、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞への形質導入効率の検出を示す。組み換えヒトＢＣＭＡタンパク質Ｆｃ断片染色法によって、６日目まで培養したＣＡＲ－ＢＣＭＡｓ細胞におけるＣＡＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを同定した。順に１０日目まで培養したＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０^５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２－ＢＣＭＡ－Ｂ９腫瘍細胞系、天然のＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞系ＭＭ．１ＳおよびＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ－５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養した後、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベル（図１Ｂ）および培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベル（図１Ｃ）を検出した。FIG. 1 shows a diagram of cleaning results of a comparative example of CART-BCMAs. FIG. 1A shows the detection of transduction efficiency of chimeric antigen receptors targeting BCMA into genetically modified T cells. Recombinant human BCMA protein Fc fragment staining was used to identify the expression level of the protein encoded by the CAR gene on the membrane surface of T cells in CAR-BCMAs cells cultured up to day 6. 1 × 10 ⁵ CART-BCMAs cells cultured up to the 10th day were taken in order, and BCMA-positive K562-BCMA-B9 tumor cell line and tumor cell line expressing natural BCMA were taken. Expression of CD137 on the membrane surface of T cells after culturing in 200 μl GT-551 medium for 18 hours in 1: 1 ratio with 1S and RPMI8226, as well as BCMA-negative K562 tumor cell lines or without tumor cells. Levels (FIG. 1B) and IFNγ secretion levels in culture supernatant (FIG. 1C) were detected. 図２は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造概略図である。ＣＡＲの構造は、リーダー配列、抗原認識配列、連結領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域およびＣＤ３ζシグナル伝達領域を含む。FIG. 2 is a schematic structural diagram of a chimeric antigen receptor targeting BCMA. The structure of the CAR includes a leader sequence, an antigen recognition sequence, a linking region, a transmembrane domain, a co-stimulator signal region and a CD3ζ signaling region. 図３は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞への形質導入効率の検出を示す。組み換えヒトＢＣＭＡタンパク質Ｆｃ断片染色法によって、７日目（図３Ａ）、２１日目（図３Ｂ）および２９日目（図３Ｃ）まで培養したＣＡＲ－ＢＣＭＡｓ細胞におけるＣＡＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを同定した。FIG. 3 shows the detection of transduction efficiency of chimeric antigen receptors targeting BCMA into genetically modified T cells. T of the protein encoded by the CAR gene in CAR-BCMAs cells cultured until day 7 (FIG. 3A), day 21 (FIG. 3B) and day 29 (FIG. 3C) by recombinant human BCMA protein Fc fragment staining. The expression level on the membrane surface of the cell was identified.

図４は、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベル（図４Ａ）および培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベル（図４Ｂ）を示す。具体的に、順に７日目まで培養したＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０^５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２－ＢＣＭＡ－Ｅ７腫瘍細胞系、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ－５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養した後、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベルおよび培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベルを検出した。FIG. 4 shows the expression level of CD137 on the membrane surface of T cells (FIG. 4A) and the secretion level of IFNγ in the culture supernatant (FIG. 4B). Specifically, 1 × 10 ⁵ CART-BCMAs cells cultured up to the 7th day were taken in order, and BCMA-positive K562-BCMA-E7 tumor cell line and BCMA-negative K562 tumor cell line, respectively, or tumor cells were obtained. After culturing in 200 μl of GT-551 medium for 18 hours at a ratio of 1: 1 without addition, the expression level of CD137 on the membrane surface of T cells and the secretion level of IFNγ in the culture supernatant were detected. 図５は、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓによる腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導のレベルの検出を示す。具体的に、それぞれＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性（ＮＨ９２９－ＢＣＭＡ）の腫瘍細胞系を１×１０^４個取り、１００μｌのＧＴ－５５１培地において図面に示される比率で相応するＴ細胞とそれぞれ４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色した後、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。この図では、ＰＩ陽性細胞の相応する共培養サンプルにおける統計分析結果が示された。FIG. 5 shows the detection of the level of induction of end-stage apoptosis of tumor cells by CART-BCMAs. Specifically, 1 × 10 ⁴ CFSE-labeled BCMA-negative (NH929) or BCMA-positive (NH929-BCMA) tumor cell lines are taken and corresponding in 100 μl of GT-551 medium at the proportions shown in the drawings. After co-culturing with T cells for 4 hours each, the cells were stained with 100 μl of 25% PI dye for 15 minutes, and then the ratio of PI-positive cells to CFSE-positive cells was analyzed by a flow cytometer. This figure shows the results of statistical analysis of corresponding co-cultured samples of PI-positive cells.

図６は、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓによる腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導のレベルの検出を示す。図６Ａは、分析されたＣＡＲＴ陽性細胞の比率を示すが、ここで、ＮＴおよびＢＣＭＡ－ＭＯ６は６０％で計算された。それぞれＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性（ＮＨ９２９－ＢＣＭＡ、ＭＭ．１Ｓ）の腫瘍細胞系を１×１０^４個取り、１００μｌのＧＴ－５５１培地において図面に示される比率で相応するＴ細胞とそれぞれ４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色した後、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。図６Ｂは、ＰＩ陽性細胞の相応する共培養サンプルにおける統計分析結果を示す。FIG. 6 shows the detection of the level of induction of end-stage apoptosis of tumor cells by CART-BCMAs. FIG. 6A shows the proportion of CART-positive cells analyzed, where NT and BCMA-MO6 were calculated at 60%. Take 1 × 10 ⁴ CFSE-labeled BCMA-negative (NH929) or BCMA-positive (NH929-BCMA, MM.1S) tumor cell lines, respectively, in 100 μl GT-551 medium at the proportions shown in the drawings. After co-culturing with T cells for 4 hours each, the cells were stained with 100 μl of 25% PI dye for 15 minutes, and then the ratio of PI-positive cells to CFSE-positive cells was analyzed by a flow cytometer. FIG. 6B shows the statistical analysis results in a corresponding co-cultured sample of PI-positive cells. 図７は、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓの骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ－８２２６のＢ－ＮＤＧマウス体内における増殖に対する阻害作用を示す。対数増殖期にあるＲＰＭＩ－８２２６細胞を収集し、マウスの右側背部に４．０×１０^６個の腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍体積が１２０ｍｍ^３程度に達した時点で、動物を腫瘍体積によってランダムに４群に分けた後、それぞれ尾静脈から溶媒対照、７．５×１０^６個のＮＴ（Ｔ細胞のみ）および７．５×１０^６個のＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を注射した。図７Ａは、尾静脈からＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１およびＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－２０を単回で注射することによって、有効にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ－８２２６細胞の生長を抑制することができたことを示す。図７Ｂは、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１およびＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－２０は顕著にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ－８２２６細胞の腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができたことを示す。FIG. 7 shows the inhibitory effect of CART-BCMAs on the proliferation of myeloma cell line RPMI-8226 in B-NDG mice. RPMI-8226 cells in the logarithmic growth phase were collected, and 4.0 × 10 ⁶ tumor cells were subcutaneously injected into the right back of the mouse, and when the tumor volume reached about 120 mm3 ^, the animals were treated by the tumor volume. After being randomly divided into 4 groups, 7.5 × 10 ⁶ NT (T cells only) and 7.5 × 10 ⁶ CART-BCMAs cells were injected from the tail vein, respectively, as a solvent control. FIG. 7A shows that a single injection of CART-BCMA-1 and CART-BCMA-20 from the tail vein was able to effectively suppress the growth of human myeloma RPMI-8226 cells. FIG. 7B shows that CART-BCMA-1 and CART-BCMA-20 were able to significantly prolong the survival time of tumor-carrying mice with human myeloma RPMI-8226 cells.

具体的な実施形態
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めてＢＣ
ＭＡ抗原を標的とするキメラ抗原受容体を得た。具体的に、本発明では、ＢＣＭＡ－１、
ＢＣＭＡ－２０、ＢＣＭＡ－ＣＡ８、ＢＣＭＡ－ＭＯ６の４つのモノクローナル抗体配列
に基づいて構築されたＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造を獲得し、そしてこ
れらのキメラ抗原受容体の初代Ｔ細胞における発現レベル、体外活性化能力および腫瘍細
胞殺傷力などの面における分析と同定を完成させた。研究では、本発明のキメラ抗原受容
体は、ＢＣＭＡ陽性細胞を標的とし、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、
形質細胞性白血病またはほかの疾患の治療に使用することができることが明らかになった
。 Specific Embodiment The present inventors have conducted extensive and in-depth research and conducted a large amount of screening, and for the first time, BC
A chimeric antigen receptor targeting the MA antigen was obtained. Specifically, in the present invention, BCMA-1,
Acquired BCMA-targeting chimeric antigen receptor structures constructed on the basis of four monoclonal antibody sequences, BCMA-20, BCMA-CA8, BCMA-MO6, and these chimeric antigen receptors in primary T cells. Completed analysis and identification in terms of expression levels, in vitro activation capacity and tumor cell killing power. In the study, the chimeric antigen receptors of the invention targeted BCMA-positive cells, BCMA-positive B-cell lymphoma, multiple myeloma,
It has been shown that it can be used to treat plasmacytoid leukemia or other diseases.

具体的に、本発明では、異なるＣＡＲ構造とウイルス感染後の細胞膜表面における発現
時間および発現強度の関連性を同定し、さらに異なるＣＡＲ構造のタンパク質発現の難易
度の違いを同定したが、この発見はＣＡＲ構造によって同様の感染条件においてＣＡＲタ
ンパク質の膜表面における発現レベルおよびＣＡＲＴの体内活性の持続性が変わることを
示唆する。大量のスクリーニングによって、本発明の構造のＣＡＲを得たが、結果から、
本発明におけるＣＡＲ構造によってコードされるタンパク質がいずれも十分な発現と膜局
在化ができることが示された。
本発明において、ＢＣＭＡ抗原を標的とするＣＡＲ構造で修飾されたＴ細胞の製造プロ
セスを改良し、主に１％ヒト血清アルブミンを添加したＧＴ－５５１無血清培地で体外で
リンパ球を培養した。 Specifically, in the present invention, the relationship between the different CAR structures and the expression time and the expression intensity on the cell membrane surface after virus infection was identified, and further, the difference in the difficulty of protein expression of different CAR structures was identified. Suggests that the CAR structure alters the expression level of CAR protein on the membrane surface and the persistence of CART activity in the body under similar infection conditions. A large amount of screening gave CAR of the structure of the present invention, but from the results,
It was shown that all the proteins encoded by the CAR structure in the present invention are capable of sufficient expression and membrane localization.
In the present invention, the process for producing T cells modified with a CAR structure targeting BCMA antigen was improved, and lymphocytes were cultured in vitro in GT-551 serum-free medium supplemented mainly with 1% human serum albumin.

用語
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるよ
うに、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有す
る。出願全体において、ほかの定義が記述されている。
用語「約」とは当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内
にある値または組成で、それによって部分的にどのように値または組成を計量または測定
するかというのが決まる。
用語「投与」とは当業者に既知の様々な方法および送達システムの任意の一つによって
本発明の製品を物理的に被験者に導入することで、静脈内、筋肉内、皮下、腹膜内、脊髄
またはほかの胃腸外の投与経路、たとえば注射または輸注によるものを含む。 Terms To make this disclosure easier to understand, we first define some terms. As used herein, all of the following terms have the following meanings, unless expressly specified herein. Other definitions are given throughout the application.
The term "about" is a value or composition within an acceptable error range of a particular value or composition determined by one of ordinary skill in the art, thereby partially measuring or measuring the value or composition. Is decided.
The term "administration" means intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, spinal cord by physically introducing the product of the invention into a subject by any one of various methods and delivery systems known to those of skill in the art. Or other extragastrointestinal routes of administration, such as by injection or infusion.

用語「抗体」（Ａｂ）はグロブリンを含むが、これに限定されず、特異的に抗原に結合
し、かつジスルフィド結合を介して互いに連結した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２
本の軽（Ｌ）鎖あるいはその抗原結合部分を含む。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書で
ＶＨと略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメインＣＨ１
、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略する）およ
び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬを含む。ＶＨとＶＬ領
域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分してもよく、これらは
フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域に散在している。各ＶＨとＶＬ
は３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ
１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ。重鎖と軽鎖の可変領域は
抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。 The term "antibody" (Ab) includes, but is not limited to, at least two heavy (H) chains and 2 that specifically bind to the antigen and are linked to each other via a disulfide bond.
Includes a light (L) chain of a book or an antigen binding portion thereof. Each H chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is the three constant domains CH1.
, CH2 and CH3. Each light chain comprises a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one constant domain CL. The VH and VL regions may be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), which are interspersed in more conservative regions called framework regions (FRs). Each VH and VL
Contains 3 CDRs and 4 FRs, FR1 from the amino terminus to the carboxy terminus, CDR
1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 are arranged in this order. The variable regions of the heavy and light chains contain binding domains that interact with the antigen.

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細
胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメイン
とも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含
む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む。共刺激分子
は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子で、抗原受容体またはその
リガンドではない。 Chimeric antigen receptor (CAR)
The chimeric antigen receptor (CAR) of the present invention includes an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain. The extracellular domain comprises a target-specific binding element (also referred to as an antigen binding domain). The intracellular domain contains the co-stimulation signaling region and the ζ chain portion. The co-stimulation signaling region contains a portion of the intracellular domain of the co-stimulation molecule. A co-stimulator is a cell surface molecule required for an effective response of lymphocytes to an antigen, not an antigen receptor or its ligand.

ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫
通ドメインの間に、リンカーを導入してもよい。本明細書で用いられるように、用語「リ
ンカー」とは、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ド
メインに連結させる作用を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドをいう。リン
カーは、０～３００個のアミノ酸、好ましくは２～１００個のアミノ酸、最も好ましくは
３～５０個のアミノ酸を含んでもよい。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明によって提供されるＣＡＲの細胞外ド
メインはＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のＣＡＲがＴ細胞におい
て発現される場合、抗原結合の特異性に基づいて抗原を認識することができる。それが関
連抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響し、腫瘍細胞が成長せず、死亡するように、または
ほかの形で影響され、そして患者の腫瘍負荷が軽減または解消する。抗原結合ドメインは
、共刺激分子およびζ鎖から由来する一つまたは複数の細胞内ドメインと融合することが
好ましい。好ましくは、抗原結合ドメインは４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＣ
Ｄ３ζシグナルドメインと組み合わせた細胞内ドメインと融合している。 A linker may be introduced between the extracellular domain and transmembrane domain of CAR, or between the intracellular domain and transmembrane domain of CAR. As used herein, the term "linker" usually refers to any oligopeptide or polypeptide that acts to link the transmembrane domain to the extracellular or intracellular domain of the polypeptide chain. The linker may contain 0 to 300 amino acids, preferably 2 to 100 amino acids, most preferably 3 to 50 amino acids.
In one preferred embodiment of the invention, the extracellular domain of CAR provided by the invention comprises an antigen binding domain that targets BCMA. When the CAR of the present invention is expressed in T cells, the antigen can be recognized based on the specificity of antigen binding. When it binds to the associated antigen, it affects the tumor cells, causing them to not grow, die, or otherwise be affected, and reduce or eliminate the patient's tumor burden. The antigen binding domain is preferably fused with one or more intracellular domains derived from the co-stimulator molecule and the ζ chain. Preferably, the antigen binding domain is the 4-1BB signaling domain, and C.
It is fused with the intracellular domain combined with the D3ζ signal domain.

本明細書で用いられるように、「抗原結合ドメイン」、「一本鎖抗体断片」とはいずれ
も抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、または単一の
Ｆｖ断片である。Ｆｖ抗体は抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域
がなく、かつすべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一般的に、Ｆｖ抗体
はさらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、かつ抗原結合に必要な
構造を形成することができる。抗原結合ドメインは、通常、ｓｃＦｖ（single-chain var
iable fragment、一本鎖可変断片）である。ｓｃＦｖの大きさは、通常、完全の抗体の１
／６である。一本鎖抗体は一本のヌクレオチド鎖によってコードされる一本のアミノ酸鎖
配列が好ましい。本発明の好適な形態として、前記ｓｃＦｖは特異的にＢＣＭＡ細胞外領
域を認識する抗体、特に特異的にＢＣＭＡ配列の２４－４１番目のアミノ酸残基を認識す
る抗体を含み、好ましくは一本鎖抗体である。 As used herein, an "antigen-binding domain" or "single-chain antibody fragment" is a Fab fragment, Fab'fragment, F (ab') ₂ fragment, or a single fragment having antigen-binding activity. It is an Fv fragment. The Fv antibody is the smallest antibody fragment containing a heavy chain variable region and a light chain variable region of an antibody, but without a constant region and having all antigen binding sites. In general, Fv antibodies further include a polypeptide linker between the VH and VL domains and can form the structures required for antigen binding. The antigen-binding domain is usually scFv (single-chain var).
iable fragment, single-stranded variable fragment). The magnitude of scFv is usually one of the complete antibodies.
/ 6. The single-chain antibody preferably has a single amino acid chain sequence encoded by a single nucleotide chain. As a preferred embodiment of the invention, the scFv comprises an antibody that specifically recognizes the extracellular space of BCMA, particularly an antibody that specifically recognizes the 24-41th amino acid residue of the BCMA sequence, preferably single chain. It is an antibody.

ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、ＣＡＲはＣＡＲの細胞外ドメイ
ンに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天
然のＣＡＲにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例に
おいて、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このよう
なドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避け
ることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。
本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよび
ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。 For the hinge region and transmembrane domain (transmembrane domain), the CAR may be designed to include a transmembrane domain fused to the extracellular domain of CAR. In one embodiment, a transmembrane domain associated with one of the domains in natural CAR is used. In some examples, the receptor by selecting a transmembrane domain or modifying it with an amino acid substitution to prevent such a domain from binding to a transmembrane domain of a similar or different surface membrane protein. Minimize interaction with other members of the complex.
The intracellular domain in CAR of the present invention includes the signal transduction domain of 4-1BB and the signal transduction domain of CD3ζ.

好ましくは、本発明のＣＡＲの構造は、シグナルペプチド、抗原認識配列（抗原結合ド
メイン）、連結領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域およびＣＤ３ζシグナル伝達
領域（ζ鎖部分）を含み、連結順は以下の通りである。
［ＣＤ８ Ｓ］－［ＶＬ－リンカー－ＶＨ］－［ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ］－［４－１ＢＢ
］－［ＣＤ３ζ］
具体的に、本発明で使用される配列は以下の通りである。
（１）シグナルペプチドである、ＣＤ８由来のシグナルペプチド配列：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ （配列番号９）
（２）ＢＣＭＡ－１抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＰＳＬＡＭＳＬＧＫＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨＷ
ＹＱＱＫＰＧＱＰＰＴＬＬＩＱＬＡＳＮＶＱＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩ
ＤＰＶＥＥＤＤＶＡＶＹＹＣＬＱＳＲＴＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ （配列番号７）
（３）ＢＣＭＡ－１抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＩＮＷＶＫＲ
ＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＥＴＲＥＰＡＹＡＹＤＦＲＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡ
ＹＬＱＩＮＮＬＫＹＥＤＴＡＴＹＦＣＡＬＤＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ （
配列番号８）
ここで、ＢＣＭＡ－１は、既に発表されたＣａｒ－Ｔ配列に含まれる抗体配列で、本願
において対照として使用される。 Preferably, the structure of the CAR of the present invention comprises a signal peptide, an antigen recognition sequence (antigen binding domain), a linking region, a transmembrane domain, a co-stimulator signal region and a CD3ζ signal transduction region (ζ chain portion), in order of linkage. Is as follows.
[ CD8 S ]-[VL-Linker-VH]-[Hinge-CD8TM]-[4-1BB]
]-[CD3ζ]
Specifically, the sequences used in the present invention are as follows.
(1) CD8-derived signal peptide sequence, which is a signal peptide:
MALPVTALLLPLALLHAARP (SEQ ID NO: 9)
(2) Single-stranded light chain variable region (VL) sequence derived from BCMA-1 antibody:
DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHW
YQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTI
DPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGTKLEIK (SEQ ID NO: 7)
(3) Single-stranded heavy chain variable region (VH) sequence derived from BCMA-1 antibody:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKR
APGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTA
YLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS (
SEQ ID NO: 8)
Here, BCMA-1 is an antibody sequence contained in the previously announced Car-T sequence and is used as a control in the present application.

（４）ＢＣＭＡ－２０抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫ
ＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹＹＴＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱ
ＰＥＤＦＡＴＹＹＣＭＧＱＴＩＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （配列番号１）
（５）ＢＣＭＡ－２０抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＦＤＭＡＷＶＲＱ
ＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＳＩＴＴＧＡＤＨＡＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬ
ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＹＹＤＧＹＨＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ
ＳＳ （配列番号２）
（６）ＢＣＭＡ－ＣＡ８抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＬＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＴＴＴＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫ
ＰＤＧＴＶＥＬＶＩＹＹＴＳＮＬＨＧＧＧＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＧＹＬＥ
ＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＧＧＳＫＬＥＩＫＲ （配列番号３）
（７）ＢＣＭＡ－ＣＡ８抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＫＱ
ＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡ
ＹＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶ
ＳＳ （配列番号４） (4) Single-stranded light chain variable region (VL) sequence derived from BCMA-20 antibody:
DIQMTQSLSLSVSVGDRVTTCRASQGISNYLNWYQQK
PGKAPKPLIYYTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTSSLQ
PEDFATYCMGQTISYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 1)
(5) Single-stranded heavy chain variable region (VH) sequence derived from BCMA-20 antibody:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFDMWVRQ
APGKGLVWVSSITTGADHAIYADSVKGRFTISRDNAKNTL
YLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGYYDGYHLFDYWGQGTLVTV
SS (SEQ ID NO: 2)
(6) Single-stranded light chain variable region (VL) sequence derived from BCMA-CA8 antibody:
DIQLTQTTSSLSASSLSLGDRVTISCSATTSNYLNWYQQK
PDGTVELVIYYTSNLHGGGGPSRFSGSGSGTDYSLTYLE
PEDVATYYCQQYRKLPWTFGGGSKLEIKR (SEQ ID NO: 3)
(7) Single-stranded heavy chain variable region (VH) sequence derived from BCMA-CA8 antibody:
EVQLQQSGAVLARPGASVKMSCKGSGYTFTNYWMHWVKQ
RPGQGLEWIGATYRGHSDTYYNQKFKGKAKLTAVTSSTA
YMELSLTNEDSAVYYCTRGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTV
SS (SEQ ID NO: 4)

（８）ＢＣＭＡ－ＭＯ６抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫ
ＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱ
ＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ （配列番号５）
（９）ＢＣＭＡ－ＭＯ６抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱ
ＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡ
ＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶ
ＳＳ （配列番号６）
（１０）ＢＣＭＡ－１の一本鎖可変領域の重鎖と軽鎖の間の連結配列：
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ （配列番号１０）
（１１）ＢＣＭＡ－２０、ＢＣＭＡ－ＣＡ８、ＢＣＭＡ－ＭＯ６の一本鎖可変領域の重
鎖と軽鎖の間の連結配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ （配列番号１１） (8) Single-stranded light chain variable region (VL) sequence derived from BCMA-MO6 antibody:
DIQMTQSLSLSVSVGDRVTTCSASSQDISNYLNWYQQK
PGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFSSLQ
PEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 5)
(9) Single-stranded heavy chain variable region (VH) sequence derived from BCMA-MO6 antibody:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQ
APGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTTA
YMELSSLRSEDITAVYYCARCAIYDGYDVLDNWGQGTLVTV
SS (SEQ ID NO: 6)
(10) Linkage sequence between heavy chain and light chain of single chain variable region of BCMA-1:
GSTSGSGGKPGSGESTKG (SEQ ID NO: 10)
(11) Linkage sequence between heavy chain and light chain of single chain variable region of BCMA-20, BCMA-CA8, BCMA-MO6:
GGGGSGGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 11)

（１２）ヒンジ領域および連結領域の配列：
ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰ
ＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ （配列番号１２）
（１３）膜貫通領域であるＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）抗原の膜貫通配列：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ （配列番号１３）
（１４）共刺激因子シグナル領域である４－１ＢＢ由来の細胞内シグナル伝達モチーフ
の配列：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧ
ＣＥＬ （配列番号１４）
（１５）ＣＤ３ζシグナル伝達領域であるＴＣＲ複合体におけるＣＤ３ζの免疫受容体
チロシン活性化モチーフ（immunorecceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡ
Ｍ）の配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲ
ＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧ
ＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ （配列番号
１５） (12) Arrangement of hinge region and connecting region:
FVPVLPAKPTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRP
AAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 12)
(13) Transmembrane sequence of CD8 (CD8TM) antigen, which is a transmembrane region:
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 13)
(14) Sequence of intracellular signal transduction motif derived from 4-1BB, which is a co-stimulator signal region:
KRGRKKLLYIFKQPMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG
CEL (SEQ ID NO: 14)
(15) CD3ζ immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITA) in the TCR complex, which is a CD3ζ signal transduction region.
Array of M):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR
GRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMEAYSEIGMKG
ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 15)

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ－Ｔ細胞」、「ＣＡＲ－Ｔ」、「ＣＡＲＴ
」、「本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞」とはいずれも本発明の第二の側面に記載のＣＡＲ－Ｔ細
胞である。
本発明は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造の構築、ＢＣＭＡを標的とす
るキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法およびその活性同定に関する。 Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells)
As used herein, the terms "CAR-T cells", "CAR-T", "CART".
, And "CAR-T cells of the present invention" are both CAR-T cells according to the second aspect of the present invention.
The present invention relates to the construction of a structure of a chimeric antigen receptor targeting BCMA, a method for producing a genetically modified T cell of a chimeric antigen receptor targeting BCMA, and identification of its activity.

ベクター
所期の分子をコードする核酸配列は本分野で既知の組み換え方法、たとえば遺伝子を発
現する細胞においてライブラリーをスクリーニングすること、既知の当該遺伝子を含むベ
クターから当該ベクターを得ること、あるいは標準の技術で当該遺伝子を含む細胞および
組織から直接単離することによって得ることができる。必要により、興味のある遺伝子は
合成によって生産することもできる。
また、本発明は本発明の発現カセットが挿入されたベクターを提供する。レトロウイル
ス、たとえばレンチウイルス由来のベクターは、導入された遺伝子の長期間で、安定した
組み込みおよびその子細胞における増殖を可能にするため、長期間の遺伝子の移動を実現
させる適切な道具である。レンチウイルスは、増殖しない細胞、たとえば肝細胞に導入す
ることができるため、発癌性レトロウイルス、たとえばマウス白血病ウイルスのベクター
を超える利点を持つ。また、低免疫原性という利点もある。 Nucleic acid sequences encoding the desired molecules are recombinant methods known in the art, such as screening the library in cells expressing the gene, obtaining the vector from a known vector containing the gene, or standard. It can be obtained by technique by directly isolating from cells and tissues containing the gene. If desired, the gene of interest can also be produced synthetically.
The present invention also provides a vector into which the expression cassette of the present invention is inserted. Vectors derived from retroviruses, such as lentiviruses, are suitable tools for long-term gene migration, as they allow for long-term stable integration of the introduced gene and proliferation in its offspring. Lentiviruses have advantages over vectors of carcinogenic retroviruses such as murine leukemia virus because they can be introduced into non-proliferating cells such as hepatocytes. It also has the advantage of low immunogenicity.

簡単に要約すると、通常、本発明の発現カセットまたは核酸配列を操作可能にプロモー
ターに連結し、そしてそれを発現ベクターに組み込む。当該ベクターは、真核細胞の複製
および組み込みに適する。典型的なクローニングベクターは、所期の核酸配列の発現を調
節するのに使用できる転写と翻訳のターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む
。
本発明の発現構築体は標準の遺伝子送達プロトコールによって、核酸免疫および遺伝子
療法に使用することもできる。遺伝子送達の方法は、本分野では既知である。たとえば、
米国特許番号５，３９９，３４６、５，５８０，８５９、５，５８９，４６６を参照し、
ここで引用によって全文を取り込む。もう一つの実施形態において、本発明は、遺伝子療
法ベクターを提供する。 Briefly summarized, the expression cassette or nucleic acid sequence of the invention is usually operably linked to a promoter and incorporated into an expression vector. The vector is suitable for eukaryotic cell replication and integration. Typical cloning vectors include transcriptional and translational terminators, initiation sequences and promoters that can be used to regulate the expression of the desired nucleic acid sequence.
The expression constructs of the invention can also be used for nucleic acid immunity and gene therapy by means of standard gene delivery protocols. Methods of gene delivery are known in the art. for example,
See U.S. Pat. No. 5,399,346,5,580,859,5,589,466.
Here, the full text is taken in by quoting. In another embodiment, the invention provides a gene therapy vector.

当該核酸は様々な種類のベクターにクローニンすることができる。たとえば、当該核酸
がクローニングできるベクターは、プラスミド、ファージ、ファージ誘導体、動物ウイル
スやコスミドを含むが、これらに限定されない。特定の興味のあるベクターは、発現ベク
ター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態によって細胞に提供することができる
。ウイルスベクターの技術は本分野公知のもので、そしてたとえばSambrookら（2001, Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）
およびほかのウイルス学と分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして使
用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス
ウイルスやレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。通常、適切なベクターは少
なくとも１種類の有機体において作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵
素切断部位および１つまたは複数の選択できるマーカーを含む（たとえば、ＷＯ０１／９
６５８４、ＷＯ０１／２９０５８および米国特許番号６，３２６，１９３）。 The nucleic acid can be cloninized into various types of vectors. For example, vectors in which the nucleic acid can be cloned include, but are not limited to, plasmids, phages, phage derivatives, animal viruses and cosmids. Certain vectors of interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors and sequencing vectors.
In addition, expression vectors can be provided to cells in the form of viral vectors. Viral vector techniques are well known in the art, and for example Sambrook et al. (2001, Mo).
lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)
And other virology and molecular biology manuals. Viruses that can be used as vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses and lentiviruses. Suitable vectors usually include replication origins, promoter sequences, convenient restriction enzyme cleavage sites and one or more selectable markers that act on at least one organism (eg, WO01 / 9).
6584, WO 01/29058 and US Pat. No. 6,326,193).

すでに多くのウイルスに基づいたシステムが開発され、哺乳動物細胞への遺伝子の導入
に使用されている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプ
ラットホームを提供する。本分野で既知の技術によって選択された遺伝子をベクターに挿
入してレトロウイルス顆粒にパッケージングすることができる。当該組み換えウイルスは
、さらに分離されて体内または体外の対象細胞に送達される。多くのレトロウイルスシス
テムは本分野では既知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用
される。多くのアデノウイルスベクターは本分野では既知である。一部の実施形態におい
て、レンチウイルスベクターが使用される。 Many virus-based systems have already been developed and used to introduce genes into mammalian cells. For example, retroviruses provide a convenient platform for gene delivery systems. Genes selected by techniques known in the art can be inserted into vectors and packaged in retrovirus granules. The recombinant virus is further isolated and delivered to target cells in or out of the body. Many retroviral systems are known in the art. In some embodiments, adenoviral vectors are used. Many adenoviral vectors are known in the art. In some embodiments, lentiviral vectors are used.

付加のプロモーターエレメント、たとえばエンハンサーは転写が開始する頻度を調節す
ることができる。通常、これらは開始点の上流の３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、
最近、多くのプロモーターは開始点の下流の機能エレメントも含むことが明らかになった
。プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが別のエレメントに対して逆さまに
なったか、移動した場合、プロモーターの機能が維持できるように、可動性のものが多い
。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔
は、活性が低下することなく、５０ｂｐまで増加することができる。プロモーターによっ
て、単一のエレメントは共同にまたは独立に作用し、転写を開始させる。 Additional promoter elements, such as enhancers, can regulate the frequency with which transcription begins. Normally, they are located in the region 30-110 bp upstream of the starting point,
Recently, it has been revealed that many promoters also contain functional elements downstream of the starting point. The spacing between promoter elements is often mobile so that if an element is turned upside down or moved with respect to another element, the promoter's function can be maintained. In the thymidine kinase (tk) promoter, the spacing between promoter elements can be increased up to 50 bp without diminished activity. By the promoter, a single element acts jointly or independently to initiate transcription.

適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配
列である。当該プロモーター配列は操作可能にそれに連結した任意のポリヌクレオチド配
列を高レベルで発現させることができる強力な構成型プロモーター配列である。適切なプ
ロモーターのもう一例は、伸長因子１α（ＥＦ－１α）である。しかし、ほかの構成型プ
ロモーター配列を使用してもよく、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター
、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復（Ｌ
ＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エ
プスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス
プロモーター、およびヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されず、ヒト遺伝
子プロモーターは、たとえばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモ
ーターやクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さら
に、本発明は構成型プロモーターの使用に限定されない。誘導型プロモーターも本発明の
一部として考えられる。誘導型プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、それによっ
て、そのような発現が必要な場合、操作可能に誘導型プロモーターに連結したポリヌクレ
オチド配列の発現を開始させ、あるいは発現が必要ではない場合、発現を終止させること
ができる。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイ
ドプロモーター、プロゲステロンプロモーターやテトラサイクリンプロモーターを含むが
、これらに限定されない。 An example of a suitable promoter is the pre-early cytomegalovirus (CMV) promoter sequence. The promoter sequence is a potent constitutive promoter sequence capable of operably expressing any polynucleotide sequence linked to it at high levels. Another example of a suitable promoter is elongation factor 1α (EF-1α). However, other constitutive promoter sequences may be used, including the Simian virus 40 (SV40) early promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV), and human immunodeficiency virus (HIV) long-chain terminal repeats (L).
TR) promoters, MoMuLV promoters, trileukemia virus promoters, Epstein-Barr virus pre-early promoters, Raus sarcoma virus promoters, and human gene promoters, including, but not limited to, human gene promoters include, for example. Examples include, but are not limited to, the actin promoter, the myosin promoter, the hem promoter and the creatin kinase promoter. Moreover, the invention is not limited to the use of constitutive promoters. Inducible promoters are also considered as part of the present invention. The use of an inducible promoter provides a molecular switch, thereby initiating expression of a polynucleotide sequence operably linked to an inducible promoter if such expression is required, or if expression is not required. Expression can be terminated. Examples of inducible promoters include, but are not limited to, metallothionein promoters, glucocorticoid promoters, progesterone promoters and tetracycline promoters.

ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入された発現ベク
ターは選択できるマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のうちの任意の一方または両方
を含むようにすることによって、ウイルスベクターで形質導入または感染された細胞群か
ら発現細胞を同定および選択することもできる。また、選択できるマーカーは単独のＤＮ
Ａ断片に載せて共形質移入のプロセスに使用することができる。選択できるマーカー遺伝
子およびレポーター遺伝子の両者の隣接する領域には、いずれも適切な調節配列を有する
ことによって、宿主細胞において発現できるようにしてもよい。有用な選択できるマーカ
ーは、たとえば抗生物質耐性遺伝子、たとえばｎｅｏなどを含む。 To assess the expression of a CAR polypeptide or part thereof, the expression vector introduced into the cell is transduced with a viral vector by including any one or both of a selectable marker gene or reporter gene. Alternatively, expressing cells can be identified and selected from the infected cell population. In addition, the marker that can be selected is a single DN
It can be placed on the A fragment and used in the process of co-transfection. Adjacent regions of both the selectable marker gene and the reporter gene may have appropriate regulatory sequences so that they can be expressed in the host cell. Useful selectable markers include, for example, antibiotic resistance genes, such as neo.

レポーター遺伝子は形質導入された可能性のある細胞の同定および調節配列の機能性の
評価に使用される。通常、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織に存在
しないか、レシピエントの有機体または組織によって発現され、そしてその発現が容易に
検出できる性質、たとえば酵素活性によって明確に示すことができるポリペプチドをコー
ドする遺伝子である。ＤＮＡがすでにレシピエントの細胞に導入されると、レポーター遺
伝子の発現は適切な時間で測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β
－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、分泌型アルカリホスフ
ァターゼや緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む（たとえば、Ui-Teiら，2000FE
BS Letters479:79-82）。適切な発現系は公知で、かつ既知の技術によって製造するか、
市販品として入手することができる。通常、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す
、少なくとも５つのフランキング領域を有する構築体はプロモーターと同定される。この
ようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、かつ試薬のプロモーターを調節
して転写を活性化させる能力の評価に使用することができる。 Reporter genes are used to identify cells that may have been transduced and to assess the functionality of regulatory sequences. Normally, a reporter gene is a poly that is not present in the recipient's organism or tissue, or is expressed by the recipient's organism or tissue, and its expression can be clearly demonstrated by a detectable property, such as enzymatic activity. It is a gene encoding a peptide. Once the DNA has already been introduced into the recipient's cells, the expression of the reporter gene is measured at the appropriate time. Suitable reporter genes are luciferase, β
-Contains genes encoding galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, secretory alkaline phosphatase and green fluorescent protein (eg, Ui-Tei et al., 2000FE).
BS Letters 479: 79-82). Suitable expression systems are known and manufactured by known techniques,
It can be obtained as a commercial product. Usually, constructs with at least 5 flanking regions showing the highest levels of expression of the reporter gene are identified as promoters. Such promoter regions are linked to the reporter gene and can be used to assess the ability of the reagent to regulate the promoter and activate transcription.

遺伝子を細胞に導入する方法および細胞において遺伝子を発現させる方法は、本分野で
は既知である。発現ベクターの内容において、ベクターは本分野における任意の方法によ
って宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母や昆虫の細胞に容易に導入することがで
きる。たとえば、発現ベクターは物理、化学または生物学の手段によって宿主細胞に導入
することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフ
ェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む
。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を生産する方法は本分野では公知である。
たとえば、Sambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, New York）を参照する。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好
適な方法は、リン酸カルシウム形質導入である。 Methods of introducing a gene into a cell and expressing the gene in the cell are known in the art. In the content of the expression vector, the vector can be readily introduced into host cells such as mammalian, bacterial, yeast and insect cells by any method in the art. For example, expression vectors can be introduced into host cells by physical, chemical or biological means.
Physical methods for introducing polynucleotides into host cells include calcium phosphate precipitation, lipofection, particle collisions, microinjection, electroporation and the like. Methods of producing cells containing vectors and / or foreign nucleic acids are known in the art.
For example, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring)
Harbor Laboratory, New York). A preferred method for introducing a polynucleotide into a host cell is calcium phosphate transduction.

興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮ
Ａベクターを使用する方法を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、
すでに最も幅広く使用される、遺伝子を哺乳動物、たとえばヒト細胞に挿入する方法にな
っている。ほかのウイルスベクターはレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペス
ウイルスＩ、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどからのものでもよい。例えば、米
国特許番号５，３５０，６７４および５，５８５，３６２を参照する。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、コロイド分散系、たとえば大分
子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混
合ミセル、やリポソームを含む脂質に基づいた系を含む。体外および体内の送達担体（de
livery vehicle）として使用される例示的なコロイド系はリポソーム（たとえば、人工膜
小胞）である。 Biological methods for introducing polynucleotides of interest into host cells include DNA and RN.
Includes a method using an A vector. Viral vectors, especially retroviral vectors,
It has already become the most widely used method of inserting genes into mammals, such as human cells. Other viral vectors may be from lentivirus, poxvirus, simple herpesvirus I, adenovirus, adeno-associated virus and the like. See, for example, US Pat. Nos. 5,350,674 and 5,585,362.
Chemical means of introducing polynucleotides into host cells were based on colloidal dispersions, such as large molecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipids including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, and liposomes. Including system. In-vitro and in-vivo delivery carriers (de
An exemplary colloidal system used as a livery vehicle) is a liposome (eg, an artificial membrane vesicle).

非ウイルス送達系を使用する場合、例示的な送達担体はリポソームである。脂質製剤を
使用し、核酸を宿主細胞に導入することが考えられる（体外、エクスビボ（ex vivo）ま
たは体内）。また、当該核酸は脂質と関連してもよい。脂質と関連した核酸は、リポソー
ムの水性の内部に封入し、リポソームの脂質二重層に散在し、リポソームとオリゴヌクレ
オチドの両者に連結する連結分子を介してリポソームに接着し、リポソームに取り込まれ
、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と配合し、懸
濁液として脂質に含まれ、ミセルに含まれるか、ミセルと複合体化し、あるいはほかの形
態で脂質と結合することができる。組成物と関連する脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発
現ベクターは溶液における具体的な構造のいずれにも限定されない。たとえば、二重層の
構造において、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。簡単に溶液に
分散し、大きさや形状が異なる集合体を形成してもよい。脂質は脂肪物質で、天然の脂質
でも合成の脂質でもよい。たとえば、脂質は細胞質で自然に発生する脂肪小滴、ならびに
長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、たとえば脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミ
ノアルコール類やアルデヒド類のような化合物を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターであ
る。 When using a non-viral delivery system, the exemplary delivery carrier is a liposome. It is conceivable to use a lipid preparation to introduce nucleic acid into a host cell (in vitro, ex vivo or in vivo). The nucleic acid may also be associated with lipids. Lipid-related nucleic acids are encapsulated inside the aqueous solution of the liposome, scattered in the lipid bilayer of the liposome, adhered to the liposome via a linking molecule that links to both the liposome and the oligonucleotide, incorporated into the liposome, and incorporated into the liposome. Complexes with lipids, disperses in lipid-containing solutions, mixes with lipids, blends with lipids, is contained in lipids as a suspension, is contained in micelles, is complexed with micelles, or in other forms lipids. Can be combined with. The lipid, lipid / DNA or lipid / expression vector associated with the composition is not limited to any of the specific structures in solution. For example, in a double layer structure, it may exist as a micelle or in a "collapsed" structure. It may be easily dispersed in a solution to form aggregates of different sizes and shapes. Lipids are fatty substances and may be natural or synthetic lipids. For example, lipids include naturally occurring lipid droplets in the cytoplasm, as well as long-chain aliphatic hydrocarbons and derivatives thereof, such as compounds such as fatty acids, alcohols, amines, aminoalcohols and aldehydes.
In one preferred embodiment of the invention, the vector is a lentiviral vector.

製剤
本発明は、本発明の第一の側面に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体、
希釈剤または賦形剤とを含有する製剤を提供する。一つの実施形態において、前記製剤は
液体製剤である。好ましくは、前記製剤は注射剤である。好ましくは、前記製剤で、前記
ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度が１×１０^３～１×１０^８細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０^４
～１×１０^７細胞／ｍＬである。
一つの実施形態において、前記製剤は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝
食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニ
トール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キ
レート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニ
ウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の製剤は、静脈内で施用するように調製す
ることが好ましい。 Pharmaceuticals The present invention comprises the CAR-T cells according to the first aspect of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
A pharmaceutical product containing a diluent or an excipient is provided. In one embodiment, the formulation is a liquid formulation. Preferably, the formulation is an injection. Preferably, in the above-mentioned preparation, the concentration of the CAR-T cells is 1 × 10 ³ to 1 × 10 ⁸ cells / mL, more preferably 1 × 10 ⁴ .
~ 1 × 10 ⁷ cells / mL.
In one embodiment, the formulation comprises buffers such as neutral buffered saline, sulfate buffered saline and other carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose and dextran, mannitol, proteins, polypeptides or amino acids such as glycine. , Antioxidants, chelating agents such as EDTA and glutathione, adjuvants (eg aluminum hydroxide), and preservatives may be included. The pharmaceutical product of the present invention is preferably prepared for intravenous application.

治療的使用
本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質
導入された細胞（たとえば、Ｔ細胞）で行われる治療的使用を含む。形質導入された細胞
は、腫瘍細胞のマーカーであるＢＣＭＡを標的とし、協同してＴ細胞を活性化させ、Ｔ細
胞の免疫応答を引き起こすことによって、その腫瘍細胞に対する殺傷効率を顕著に向上さ
せることができる。
そのため、本発明は、哺乳動物の標的細胞群または組織に対するＴ細胞による免疫応答
を刺激する方法であって、哺乳動物に本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を施用する工程を含む方法
も提供する。 Therapeutic Use The present invention includes therapeutic use in cells transduced with a lentiviral vector (LV) encoding the expression cassette of the invention (eg, T cells). The transduced cells target BCMA, a marker of tumor cells, and cooperate to activate T cells and elicit an immune response of the T cells, thereby significantly improving the killing efficiency of the tumor cells. Can be done.
Therefore, the present invention also provides a method of stimulating an immune response by T cells to a target cell group or tissue of a mammal, which comprises a step of applying the CAR-T cells of the present invention to a mammal.

一つの実施形態において、本発明は、患者の自己Ｔ細胞（または異系ドナー）を分離し
、活性化させて遺伝子改変し、ＣＡＲ－Ｔ細胞が生成した後、同患者の体内に注入する細
胞療法を含む。このような方法では、移植片対宿主病に罹る確率は極めて低く、抗原はＴ
細胞によってＭＨＣに拘束されずに認識される。また、一つのＣＡＲ－Ｔで当該抗原を発
現するすべての癌を治療することができる。抗体療法と異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で
複製可能で、持続的に腫瘍を抑える長期間の持久性が生じる。
一つの実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は安定した体内におけるＴ細胞の増
殖を経て延長した時間で持続することができる。また、ＣＡＲによる免疫応答は養子免疫
療法の工程の一部でもよく、ここで、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞はＣＡＲにおける高原結合ドメイ
ンに特異的な免疫応答を誘導する。たとえば、抗ＢＣＭＡのＣＡＲ－Ｔ細胞はＢＣＭＡを
発現する細胞に抵抗する特異的な免疫応答を引き起こす。 In one embodiment, the invention isolates a patient's autologous T cells (or allogeneic donors), activates and genetically modifies them to generate CAR-T cells, which are then injected into the patient's body. Including therapy. With such a method, the probability of getting graft-versus-host disease is extremely low, and the antigen is T.
Recognized by cells without being constrained by MHC. In addition, one CAR-T can treat all cancers expressing the antigen. Unlike antibody therapy, CAR-T cells are replicable in the body, resulting in long-term endurance that permanently suppresses tumors.
In one embodiment, the CAR-T cells of the invention can be sustained for an extended period of time through stable T cell proliferation in the body. The CAR immune response may also be part of the adoptive immunotherapy process, where CAR-modified T cells induce a plateau-binding domain-specific immune response in CAR. For example, anti-BCMA CAR-T cells elicit a specific immune response that resists BCMA-expressing cells.

本明細書で公開されたデータは、具体的に抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ヒンジおよび膜貫通
領域、および４－１ＢＢとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクター
を公開したが、本発明は構築体の各構成部分の任意の数の変化を含むと解釈されるべきで
ある。
治療可能な癌は、血管新生がしていない腫瘍または血管新生が基本的にしていない腫瘍
、および血管新生がした腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（たとえば血液腫瘍、たとえば白
血病やリンパ腫）または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで治療する癌の種類は
、癌、胚細胞腫瘍や肉腫、および一部の白血病やリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性
腫瘍、および悪性腫瘍、たとえば肉腫、癌やメラノーマを含むが、これらに限定されない
。成人腫瘍／癌および児童腫瘍／癌も含む。 The data published herein specifically publish a lentiviral vector containing an anti-BCMA scFv, a hinge and transmembrane domain, and a 4-1BB and CD3ζ signaling domain, whereas the present invention reveals each configuration of the construct. It should be construed to include any number of changes in the portion.
Treatable cancers include non-angiogenic or non-angiogenic tumors, and tumors with angiogenesis. The cancer may include a non-solid tumor (eg, a hematological tumor, such as leukemia or lymphoma) or a solid tumor. The types of cancer treated with CAR of the present invention include cancer, embryonic cell tumors and sarcoma, and some leukemia and lymphatic malignancies, benign and malignant tumors, and malignant tumors such as sarcoma, cancer and melanoma. , Not limited to these. Also includes adult tumors / cancers and childhood tumors / cancers.

血液癌は血液または骨髄の癌である。血液（または血液原性）癌の例は、白血病を含み
、それに急性白血病（たとえば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白
血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球型、単核球性や赤白血病）、慢性白血病（
たとえば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髓性白血病や慢性リンパ性白血病）、
真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫（無痛および重症の場
合）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形
成症候群、有毛細胞白血病や脊髄形成異常が含まれる。
固形腫瘍は、通常、嚢腫や液体領域の組織の腫瘤を含まない。固形腫瘍は良性でも悪性
でもよい。異なる種類の固形腫瘍はこれらを形成する細胞の種類によって命名される（た
とえば肉腫、癌やリンパ腫）。固形腫瘍は、たとえば肉腫および癌の例は、線維肉腫、粘
液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、卵巣癌を含む。 Blood cancer is cancer of the blood or bone marrow. Examples of blood (or hematogenous) cancers include leukemia, which includes acute leukemia (eg, acute lymphocytic leukemia, acute myelocytic leukemia, acute myeloid leukemia and myeloblastic, promyelomonocytes, myelomonocytes). Type, mononuclear and red leukemia), chronic leukemia (
For example, chronic myelogenous (granulocytic) leukemia, chronic osteogenic leukemia and chronic lymphocytic leukemia),
True erythrocytosis, lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma (painless and severe), multiple myeloma, Waldenström macroglobulinemia, H chain disease, myelodysplastic syndrome, hairy cell leukemia And spinal cord dysplasia.
Solid tumors usually do not include cysts or masses of tissue in the fluid area. Solid tumors can be benign or malignant. Different types of solid tumors are named by the type of cells that form them (eg, sarcoma, cancer or lymphoma). Solid tumors include, for example, sarcomas and cancer examples include fibrosarcoma, mucocele, liposarcoma, mesopharia, lymphocytic malignancies, pancreatic cancer, ovarian cancer.

本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は哺乳動物に対する体外免疫および／または体内療法のワク
チンとしても有用である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
体外免疫について、ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、
および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも一つが細胞を哺乳動物に施用
する前に体外で行われる。
体外プロトコールは本分野では公知で、そして後記でより完全に検討される。簡単に言
えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離して本明細書で公開されるＣＡＲを発
現するベクターで遺伝子修飾を行う（すなわち、体外形質転換または形質導入）。ＣＡＲ
修飾細胞は哺乳動物のレシピエントに施用し、治療の有益な効果を提供することができる
。哺乳動物のレシピエントはヒトでもよく、そしてＣＡＲ修飾細胞はレシピエント自身の
細胞でもよい。必要により、細胞はレシピエントに対して同種異系、同系（syngeneic）
または異種でもよい。
体外免疫について細胞に基づいたワクチン以外、本発明は、体内免疫によって患者にお
ける抗原に対する免疫応答を引き起こす組成物および方法も提供する。 The CAR-modified T cells of the present invention are also useful as vaccines for in vitro immunization and / or in-vivo therapy against mammals. Preferably, the mammal is a human.
For in vitro immunity, i) cell proliferation, ii) introduction of CAR-encoding nucleic acids into cells,
And / or iii) At least one of the cryopreservation of cells is performed in vitro prior to application of the cells to mammals.
In vitro protocols are known in the art and will be considered more thoroughly later. Briefly, cells are isolated from mammals (preferably humans) and genetically modified with a CAR-expressing vector exposed herein (ie, in vitro transformation or transduction). CAR
Modified cells can be applied to mammalian recipients to provide beneficial therapeutic effects. The mammalian recipient may be human, and the CAR-modified cells may be the recipient's own cells. If necessary, the cells are allogeneic and syngeneic to the recipient.
Or it may be different.
In addition to cell-based vaccines for in vitro immunity, the invention also provides compositions and methods that elicit an immune response against an antigen in a patient by in vitro immunity.

本発明は、腫瘍を治療する方法であって、それが必要な対象に治療有効量の本発明のＣ
ＡＲ修飾Ｔ細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は単独で、または薬物組成物として希釈剤および／またはほ
かの成分、たとえばＩＬ－２、ＩＬ－１７やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて
施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、本明細書に記載の標的細
胞群を含み、一つまたは複数の薬学または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形
剤と合わせてもよい。このような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩
衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マン
ニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、
キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミ
ニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内で施用するように調
製することが好ましい。 The present invention is a method of treating a tumor, and a therapeutically effective amount of C of the present invention is applied to a subject in need thereof.
Provided is a method including a step of applying AR-modified T cells.
The CAR-modified T cells of the invention can be applied alone or as a drug composition in conjunction with diluents and / or other components such as IL-2, IL-17 and other cytokines or cell populations. Briefly, the drug compositions of the invention include the target cell populations described herein, even when combined with one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers, diluents or excipients. good. Such compositions include buffers such as neutral buffered saline, sulfate buffered saline and other carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose and dextran, mannitol, proteins, polypeptides or amino acids such as glycine, antioxidants. Agent,
It may contain a chelating agent such as EDTA or glutathione, an adjuvant (eg aluminum hydroxide), and a preservative. The compositions of the present invention are preferably prepared for intravenous application.

本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用す
ることができる。施用の数量および頻度は、患者の病床、および患者の疾患の種類と重篤
度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。
「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記
載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍
の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる
。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０^４～１０^９個細胞／ｋｇ体重
の投与量、好ましくは１０^５～１０^６個細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内におけ
るすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で
数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばRosenbergら，NewEn
g.J. of Med. 319:1676,1988）によって施用することができる。具体的な患者対する最適
な投与量および治療プランは、患者の疾患の所見をモニタリングしてそれに基づいて調整
して治療することができ、医学分野の技術者によって容易に決めることができる。 The drug composition of the present invention can be applied in a form suitable for a disease requiring treatment (or prevention). The quantity and frequency of application will depend on factors such as the patient's bed and the type and severity of the patient's disease, but the appropriate dose will be determined by clinical trials.
When described as "immunologically effective amount", "anti-tumor effective amount", "tumor-suppressing effective amount" or "therapeutic amount", the exact amount of the composition of the present invention to be applied is the patient (subject). Determined by the doctor, taking into account the age, weight, size of the tumor, degree of infection or metastasis, and individual differences in the disease. Generally, the T cell-containing drug compositions described herein have a dose of ^{104 to 109 cells / kg body weight, preferably a dose of 105 to 10 6 cells / kg} body weight (range of these). Can be applied with (including all integer values within). The T cell composition may be applied several times at these doses. Cells are known for injection techniques in immunotherapy (eg Rosenberg et al., NewEn).
It can be applied by gJ of Med. 319: 1676, 1988). The optimal dosage and treatment plan for a specific patient can be monitored, adjusted and treated based on the patient's findings of the disease, and can be easily determined by a technician in the medical field.

対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便
利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、
脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つ
の実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用
される。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物はｉ．ｖ．注射によって
施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入
してもよい。 Application of the composition to the subject may be by any convenient means, including spraying, injection, oral, infusion, implantation or transplantation. The compositions described herein are subcutaneous, intradermal, intratumoral, intranodes, and
It may be administered to the patient by intraspinal, intramuscular, intravenous (iv) injection or intraperitoneal. In one embodiment, the T cell compositions of the invention are applied to a patient by intradermal or subcutaneous injection. In another embodiment, the T cell composition of the present invention is i. v. It is preferably applied by injection. The composition of T cells may be injected directly into the tumor, lymph node or site of infection.

本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかの
Ｔ細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増殖した細胞を使用し、任
意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施
用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン－２、ア
ザシチジン（ＡＲＡ－Ｃとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはＭＳ患
者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療ま
たはＰＭＬ患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態
において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリン
Ａ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやＦＫ５０６、抗
体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明
の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（
ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患
者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末
梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増殖した
免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前また
は外科手術後に施用される。 In some embodiments of the invention, any quantity of cells activated and proliferated by the methods described herein or by proliferating other T cells known in the art to therapeutic levels is used. When applied to a patient in combination with related treatments (eg, prior, simultaneous or subsequent), said treatments such as antiviral therapy, Sidphovir and Interleukin-2, azacitidine (known as ARA-C). It includes, but is not limited to, treatment with reagents, or treatment with natalizumab for MS patients, efarizumab treatment for psoriasis patients, or other treatments for PML patients. In a further embodiment, the T cells of the invention can be used in combination with chemotherapeutic, radiation, immunosuppressive agents such as cyclosporine A, azathioprine, methotrexate, mycophenolate mofetil and FK506, antibodies or other immunotherapeutic agents. In a further embodiment, the cell compositions of the invention are bone marrow transplants, chemotherapeutic agents such as fludarabine, external photoradiation therapy (
XRT), administered to patients in combination with cyclophosphamide (eg, before, at the same time or after). For example, in one embodiment, the subject may be transplanted with peripheral blood stem cells after high dose chemotherapy. In some embodiments, after transplantation, the subject receives an injection of proliferated immune cells of the invention. In another embodiment, the proliferated cells are applied before or after surgery.

患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピ
エントによって変わる。患者へ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって
実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０^６個～１
×１０^１０個の本発明の修飾されたＴ細胞（たとえば、ＣＡＲ－Ｔ－ＢＣＭＡ細胞）を、
たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。 The dosage of more treatment than applied to the patient depends on the exact attributes of the disease to be treated and the recipient to be treated. The proportion of dose applied to the patient can be carried out by practices acceptable in the art. Usually 1 x 10 ⁶ to 1 per treatment or one treatment course
× 10 ¹⁰ modified T cells of the invention (eg, CAR-T-BCMA cells).
It can be applied to a patient, for example, by means of intravenous infusion.

本発明の主な利点は以下の通りである。
（ａ）本発明のキメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合ドメインが特定の抗ＢＣＭＡ ｓ
ｃＦｖで、当該特定の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは特定のヒンジ領域および細胞内ドメインと
結合してなるＣＡＲは非常に強力な腫瘍細胞に対する殺傷能力を示し、しかも細胞毒性が
小さく、副作用が低い。
（ｂ）本発明によって提供されるキメラ抗原受容体はＣＡＲ遺伝子を担持するレンチウ
イルスでＴ細胞を感染させた後、ＣＡＲタンパク質の安定した発現および膜局在化を実現
することができる。
（ｃ）本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は体内で生存時間が長く、かつ抗湯用効果が強く、本
発明で使用されるｓｃＦｖはヒト化抗体またはヒト由来の抗体で、特異的な免疫拒絶反応
が生じる可能性が小さい。 The main advantages of the present invention are as follows.
(A) The chimeric antigen receptor of the present invention has an anti-BCMA s having a specific extracellular antigen-binding domain.
In cFv, the particular anti-BCMA scFv is bound to a particular hinge region and intracellular domain, and CAR exhibits a very strong ability to kill tumor cells, yet has low cytotoxicity and low side effects.
(B) The chimeric antigen receptor provided by the present invention can realize stable expression and membrane localization of CAR protein after infecting T cells with a lentivirus carrying a CAR gene.
(C) The CAR-modified T cells of the present invention have a long survival time in the body and have a strong anti-hot water effect, and the scFv used in the present invention is a humanized antibody or a human-derived antibody, which is a specific immune rejection reaction. Is unlikely to occur.

以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を
説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるも
のである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSa
mbrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コール
ド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）に記載の条件などの通常の条件に、
あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算さ
れた。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to specific examples. It is understood that these examples are used only to illustrate the invention and do not limit the scope of the invention. Experimental methods for which specific conditions are not shown in the following examples are usually, for example, Sa.
Under normal conditions, such as those described in "Molecular Cloning: Laboratory Manual" (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Publishing Co., Ltd., 1989), mbrook et al.
Alternatively, follow the manufacturer's recommended conditions. Unless otherwise noted,% and parts were calculated by weight.

実施例１
レンチウイルス発現ベクターの構築
コードプラスミドの構築は、上海博益生物科技有限公司に全長ＤＮＡの合成およびクロ
ーンを依頼し、実現させた。ｐＷＰＴレンチウイルスベクターをクローニングベクターと
し、クローニング部位はＢａｍＨ ＩおよびＳａｌ Ｉ部位である。具体的な配列は前記
の通りである。 Example 1
Construction of Lentivirus Expression Vector The construction of the code plasmid was realized by requesting Shanghai Hakuei Biotechnology Co., Ltd. to synthesize and clone full-length DNA. The pWPT lentiviral vector is used as the cloning vector, and the cloning sites are BamHI and Sal I sites. The specific arrangement is as described above.

実施例２
ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造
（１）健常者の静脉血を採取し、密度勾配遠心法によって単核球を単離した（ＰＢＭＣ
ｓ）。
（２）０日目に、ＰＢＭＣｓを事前に最終濃度が５μｇ／ｍＬのＣＤ３モノクローナル
抗体（ＯＫＴ３）および最終濃度が１０μｇ／ｍＬのRetronectin（TAKARA社から購入）
でコーティングした細胞培養瓶に接種し、培地は１％ヒト血清アルブミン含有ＧＴ－Ｔ５
５１細胞培地で、培地に最終濃度が１０００Ｕ／ｍＬになるように組み換えヒトインター
ロイキン－２（ＩＬ－２）を添加し、３７℃、飽和湿度、５％ ＣＯ_２のインキュベータ
ーで培養した。 Example 2
Production of CAR-T cells (1) Static blood of healthy subjects was collected and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation (PBMC).
s).
(2) On day 0, PBMCs were previously prepared with a CD3 monoclonal antibody (OKT3) having a final concentration of 5 μg / mL and a Retronectin (purchased from TAKARA) having a final concentration of 10 μg / mL.
Inoculate into cell culture bottles coated with 1% human serum albumin-containing GT-T5 medium.
In 51 cell medium, recombinant human interleukin-2 (IL-2) was added to the medium to a final concentration of 1000 U / mL, and the cells were cultured in an incubator at 37 ° C., saturated humidity and 5% CO ₂ .

（３）１日目に、ゆっくりＰＢＭＣｓを培養する上清液を吸い取って捨て、そして新し
い１％ヒト血清アルブミン含有ＧＴ－Ｔ５５１細胞培地を入れ、培地に最終濃度が１００
０Ｕ／ｍＬになるように組み換えヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を入れ、３７℃
、飽和湿度、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで培養した。
（４）３日目に、新鮮な培養液、濃縮・精製されたＣＡＲ－ＢＣＭＡｓレンチウイルス
液、プロタミン硫酸塩（１２μｇ／ｍｌ）、および最終濃度が１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ－
２を入れた。３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで１２時間感染させた後、培養液
を捨て、新鮮な培地を入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２のインキュベーターで培養を続けた。
（５）６日目から、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を取って相応する活性検出試験を行うこ
とができた。 (3) On the first day, the supernatant for slowly culturing PBMCs is sucked up and discarded, and a new GT-T551 cell medium containing 1% human serum albumin is added, and the final concentration is 100 in the medium.
Add recombinant human interleukin-2 (IL-2) to 0 U / mL and add 37 ° C.
Incubators with saturated humidity, 5% CO ₂ and incubators.
(4) On the third day, fresh culture solution, concentrated and purified CAR-BCMAs lentivirus solution, protamine sulfate (12 μg / ml), and IL- with a final concentration of 1000 U / mL.
I put in 2. After infection in an incubator at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 12 hours, the culture medium was discarded, fresh medium was added, and the culture was continued in the incubator at 37 ° C. and 5% CO ₂ .
(5) From the 6th day, CART-BCMAs cells could be taken and a corresponding activity detection test could be performed.

実施例３
ＣＡＲ遺伝子のＴ細胞ゲノムにおける組み込み率およびそれによってコードされるタン
パク質の膜表面における発現レベルの検出
それぞれ０．５×１０^６の実施例２で７日目（図３Ａ）、２１日目（図３Ｂ）および２
９日目（図３Ｃ）まで培養したＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞のサンプルを取り、組み換えヒ
トＢＣＭＡタンパク質のＦｃ断片で染色した後、フローサイトメーターによってＣＡＲ－
ＢＣＭＡタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを分析した。
結果は図３に示すように、本発明で設計された４つのＣＡＲ構造はいずれもその相応す
る修飾Ｔ細胞で発現され、そして細胞膜表面における局在化が完成した。 Example 3
Detection of the rate of integration of the CAR gene in the T cell genome and the expression level of the protein encoded by it on the membrane surface in Example 2 of 0.5 × ¹⁰⁶ on days 7 (3A) and 21 (3B, respectively). ) And 2
A sample of CART-BCMAs cells cultured up to day 9 (FIG. 3C) was taken, stained with an Fc fragment of recombinant human BCMA protein, and then CAR- by a flow cytometer.
The expression level of BCMA protein on the membrane surface of T cells was analyzed.
As a result, as shown in FIG. 3, all four CAR structures designed in the present invention were expressed in their corresponding modified T cells, and localization on the cell membrane surface was completed.

実施例４
ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓの体外活性化能力の検出
実施例２における７日目まで培養されたＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞で細胞の活性化レベ
ル指標であるタンパク質ＣＤ１３７およびＩＦＮγの検出を行った。順に７日目まで培養
したＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ細胞を１×１０^５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２－Ｂ
ＣＭＡ＋Ｅ７腫瘍細胞系、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍
細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ－５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養し
た後、フローサイトメトリーによってＴ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベルを、
ＥＬＩＳＡ方法によって培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベルを検出した。
結果は図４Ａおよび図４Ｂに示すように、４つのＣＡＲＴ細胞の表面はいずれもＣＤ１
３７の発現が検出され、かついずれも培養上清にＩＦＮγの発現が検出された。中では、
ＣＡＲ－ＢＣＭＡ－２０は最も優れたＣＤ１３７活性化レベルおよびＩＦＮγ放出レベル
を有し、ヒト化ＭＯ６抗体配列に基づいて構築されたＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－ＭＯ６はネズ
ミ由来抗体配列に基づいて構築されたＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－ＣＡ８と比べて弱いＣＤ１３
７活性化レベルを有するが、高いＩＦＮγ放出レベルを有する。 Example 4
Detection of in vitro activation ability of CART-BCMAs In CART-BCMAs cells cultured up to the 7th day in Example 2, proteins CD137 and IFNγ, which are indicators of cell activation level, were detected. 1 × 10 ⁵ CART-BCMA cells cultured up to the 7th day were taken in order, and each was BCMA-positive K562-B.
CMA + E7 tumor cell line and BCMA-negative K562 tumor cell line, or without tumor cells added, cultured in 200 μl GT-551 medium at a ratio of 1: 1 for 18 hours, and then the membrane of T cells by flow cytometry. The expression level of CD137 on the surface,
The level of IFNγ secretion in the culture supernatant was detected by the ELISA method.
The results are shown in FIGS. 4A and 4B, where the surfaces of all four CART cells are all CD1.
The expression of 37 was detected, and the expression of IFNγ was detected in the culture supernatant in each case. Inside
CAR-BCMA-20 has the best CD137 activation and IFNγ release levels, and CART-BCMA-MO6 constructed based on the humanized MO6 antibody sequence is based on the murine-derived antibody sequence CART- CD13 weaker than BCMA-CA8
It has 7 activation levels but high IFNγ release levels.

実施例５
ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞による腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導活性の検出
（１）１：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１の比率（図５に示される比率
）で、それぞれ実施例２における１７日目まで培養されたＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を１
×１０^４個のＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性細胞（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性
の構築された細胞ＮＨ９２９－ＢＣＭＡ過剰発現腫瘍細胞株と混合し、１００μｌのＧＴ
－５５１培地において４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色
し、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析
した。
（２）１：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１の比率（図６Ｂに示される比率
）で、それぞれ実施例２における２２日目まで培養されたＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を１
×１０^４個のＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性細胞（ＮＨ９２９）、ＢＣＭＡ陽性の構
築された細胞ＮＨ９２９－ＢＣＭＡ過剰発現腫瘍細胞株、または天然のＢＣＭＡを発現す
るＭＭ．１Ｓ細胞系と混合し、１００μｌのＧＴ－５５１培地において４ｈ共培養した後
、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色し、フローサイトメーターによってＣＦ
ＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。
結果は図５および図６に示すように、４つのＣＡＲＴ細胞はいずれも好適にＢＣＭＡ陽
性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができた。中では、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－２０
はＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１よりも好適にＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の末期アポトーシスを誘導
し、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－ＭＯ６およびＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－ＣＡ８はＢＣＭＡ陽性腫瘍
細胞の末期アポトーシスを誘導する能力が類似する。 Example 5
Detection of end-stage apoptosis-inducing activity of tumor cells by CART-BCMAs cells (1) 1: 1, 2.5: 1, 5: 1, 10: 1, 20: 1 ratio (ratio shown in FIG. 5) , CART-BCMAs cells cultured up to the 17th day in Example 2, respectively.
× 10 100 μl GT mixed with ⁴ CFSE-labeled BCMA-negative cells (NH929) or BCMA-positive constructed cells NH929-BCMA overexpressing tumor cell lines.
After co-culturing in -551 medium for 4 hours, the cells were stained with 100 μl of 25% PI dye for 15 min, and the ratio of PI-positive cells to CFSE-positive cells was analyzed by a flow cytometer.
(2) CART-BCMAs cells cultured up to day 22 in Example 2 at a ratio of 1: 1, 5: 1, 10: 1, 20: 1, 40: 1 (ratio shown in FIG. 6B), respectively. 1
× 10 ^BCSE -labeled BCMA-negative cells (NH929), BCMA-positive constructed cells NH929-BCMA overexpressing tumor cell lines, or MM expressing native BCMA. It was mixed with a 1S cell line, co-cultured in 100 μl of GT-551 medium for 4 hours, stained with 100 μl of 25% PI dye for 15 min, and CFed by a flow cytometer.
The ratio of PI-positive cells to SE-positive cells was analyzed.
As a result, as shown in FIGS. 5 and 6, all four CART cells were able to suitably induce apoptosis of BCMA-positive tumor cells. Among them, CART-BCMA-20
Better than CART-BCMA-1 to induce end-stage apoptosis of BCMA-positive tumor cells, and CART-BCMA-MO6 and CART-BCMA-CA8 have similar abilities to induce end-stage apoptosis of BCMA-positive tumor cells.

実施例６
ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓのＲＰＭＩ－８２２６骨髄腫異種移植モデルに対する抑制作用
対数増殖期にあるＲＰＭＩ－８２２６細胞を収集し、６－８週のＢ－ＮＤＧマウスの右
側背部に４．０×１０^６個の腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍体積が１２０ｍｍ^３程度に達し
た時点で、動物を腫瘍体積によってランダムに４群に各群の腫瘍体積の違いが平均値の１
０％よりも小さいように分けた後、それぞれ尾静脈から溶媒対照、７．５×１０^６個のＮ
Ｔおよび７．５×１０^６個のＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ細胞を注射した。
結果は図７に示すように、対照群と比べ、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１およびＣＡＲＴ－Ｂ
ＣＭＡ－２０の単回の尾静脈注射は、有効にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ－８２２６細胞の生長を
抑制し（相対腫瘍増殖率％Ｔ／ＣＲＴＶ≦４０％、Ｐ＜０．０５）、かつ顕著にヒト骨髄
腫担持マウスの生存時間を延ばし（対照群で生存期間が２３日で、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡｓ
治療群で生存期間の中央値＞３３日）、中では、ＣＡＲＴ－ＢＣＭＡ－１およびＣＡＲＴ
－ＢＣＭＡ－２０による治療を受けたマウスは、相対腫瘍増殖率および生存期間の中央値
に有意差がなかった。 Example 6
Suppressive effect of CART-BCMAs on RPMI-8226 xenograft model RPMI-8226 cells in logoproliferative phase were collected and 4.0 × 10 ⁶ tumors on the right dorsal side of 6-8 week B-NDG mice. When the cells were subcutaneously inoculated and the tumor volume reached about 120 mm3 ^, the animals were randomly divided into 4 groups according to the tumor volume, and the difference in the tumor volume of each group was 1 of the average value.
After dividing into smaller than 0%, solvent control from the tail vein, 7.5 × 10 ⁶ N
T and 7.5 × 10 ⁶ CART-BCMAs cells were injected.
The results are shown in FIG. 7, as compared with the control group, CART-BCMA-1 and CART-B.
A single tail intravenous injection of CMA-20 effectively suppressed the growth of human myeloma RPMI-8226 cells (relative tumor growth rate% T / CRTV ≤ 40%, P <0.05) and was markedly human. Prolonged survival time of myeloma-carrying mice (23 days survival in control group, CART-BCMAs)
Median survival> 33 days in the treatment group), among which CART-BCMA-1 and CART
Mice treated with BCMA-20 had no significant difference in relative tumor growth and median survival.

比較例
本願のキメラ抗原受容体のスクリーニング過程中において、発明者らは大量の候補配列
をテストしたが、以下、例を挙げて説明する。
スクリーニングされた抗体は、ＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２、ＢＣＭＡ－６９、ＢＣＭ
Ａ－７２、ＢＣＭＡ－２Ａ１、ＢＣＭＡ－１Ｅ１、ＢＣＭＡ－Ｊ２２．９、ＢＣＭＡ－２
０、ＢＣＭＡ－ＣＡ８、ＢＣＭＡ－ＭＯ６である。上記抗体に基づいて構築された、ＢＣ
ＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造である。ここで、ＢＣＭＡ－１およびＢＣＭＡ
－２はすでに発表されたＣａｒ－Ｔ配列で、スクリーニングの陽性対照として、ＣＡＲ－
Ｔ細胞の製造方法は実施例２と同様で、検出方法は実施例３、４と同様である。
結果は図１に示すように、それぞれ２ロットのＣＡＲ－Ｔ細胞の実施結果である。ＢＣ
ＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質でＣａｒ－Ｔの発現を検出したところ、初代Ｔ細胞に高発現が
見られ、図１Ａを参照する。図１Ｂにおいて、ＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２０、ＢＣＭＡ
－１Ｅ１、ＢＣＭＡ－ＣＡ８、ＢＣＭＡ－ＭＯ６、およびＢＣＭＡ－Ｊ２２．９はＢＣＭ
Ａ抗原によって活性化されたことがわかる。図１Ｃでは、活性化されたＢＣＭＡ－１、Ｂ
ＣＭＡ－２０、ＢＣＭＡ－１Ｅ１、ＢＣＭＡ－ＣＡ８、ＢＣＭＡ－ＭＯ６、およびＢＣＭ
Ａ－Ｊ２２．９のＣａｒ－Ｔは比較的に高いＩＦＮ－γを生成したことが示された。これ
らの結果をまとめると、ＢＣＭＡ－１、ＢＣＭＡ－２０、ＣＡ８およびＭＯ６で得られた
ＣＡＲ－Ｔは機能が近いことが示されたため、ＢＣＭＡ－２０、ＣＡ８およびＭＯ６ＣＡ
Ｒ－Ｔをさらに分析し、研究した。 Comparative Example In the process of screening the chimeric antigen receptor of the present application, the inventors tested a large number of candidate sequences, which will be described below with an example.
The screened antibodies were BCMA-1, BCMA-2, BCMA-69, and BCM.
A-72, BCMA-2A1, BCMA-1E1, BCMA-J22.9, BCMA-2
0, BCMA-CA8, BCMA-MO6. BC constructed based on the above antibody
It is the structure of a chimeric antigen receptor that targets MA. Here, BCMA-1 and BCMA
-2 is a previously published Car-T sequence, and CAR- is a positive control for screening.
The method for producing T cells is the same as in Example 2, and the detection method is the same as in Examples 3 and 4.
The results are the results of performing 2 lots of CAR-T cells, respectively, as shown in FIG. BC
When the expression of Car-T was detected in the MA-Fc fusion protein, high expression was observed in the primary T cells, which is referred to in FIG. 1A. In FIG. 1B, BCMA-1, BCMA-20, BCMA.
-1E1, BCMA-CA8, BCMA-MO6, and BCMA-J22.9 are BCM
It can be seen that it was activated by the A antigen. In FIG. 1C, activated BCMA-1, B
CMA-20, BCMA-1E1, BCMA-CA8, BCMA-MO6, and BCM
It was shown that Car-T of A-J22.9 produced relatively high IFN-γ. Summarizing these results, the CAR-Ts obtained with BCMA-1, BCMA-20, CA8 and MO6 were shown to have similar functions, so BCMA-20, CA8 and MO6CA.
RT was further analyzed and studied.

各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考
として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の
変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含
まれることが理解されるはずである。 All documents relating to the present invention are cited as references in this application, just as each document is cited independently. Further, after reading the above contents of the present invention, those skilled in the art may make various variations and modifications to the present invention, but those equivalent forms thereof are included in the claims of the present invention. Should be understood.

Claims (12)

キメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標
的とする細胞外領域の抗体一本鎖可変領域の配列であることを特徴とする、前記キメラ抗
原受容体。 The chimeric antigen receptor, wherein the antigen-binding domain of the chimeric antigen receptor is a sequence of an antibody single-stranded variable region in an extracellular region targeting BCMA. 前記抗原結合ドメインがＢＣＭＡ配列の２４～４１番目のアミノ酸残基を標的とする抗
体一本鎖可変領域の配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。 The chimeric antigen receptor according to claim 1, wherein the antigen-binding domain is a sequence of an antibody single-stranded variable region targeting amino acid residues 24 to 41 of the BCMA sequence. 前記抗原結合ドメインの構造が下記式Ｉで表されることを特徴とする、請求項１に記載
のキメラ抗原受容体。
Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ （Ｉ）
（ただし、Ｖ_Ｈは抗体の重鎖可変領域で、Ｖ_Ｌは抗体の軽鎖可変領域で、「－」は連結
ペプチドまたはペプチド結合である。
かつ、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号１で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号２で
示され、
あるいは、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号３で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号
４で示され、
あるいは、Ｖ_Ｌのアミノ酸配列は配列番号５で示され、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列は配列番号
６で示される。） The chimeric antigen receptor according to claim 1, wherein the structure of the antigen-binding domain is represented by the following formula I.
_VL - _VH (I)
(However, _VE is the heavy chain variable region of the antibody, _VL is the light chain variable region of the antibody, and "-" is a linked peptide or peptide bond.
Moreover, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 2.
Alternatively, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 4.
Alternatively, the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of _VL is shown by SEQ ID NO: 6. ) 前記キメラ抗原受容体の構造は下記式ＩＩで表されることを特徴とする、請求項１に記
載のキメラ抗原受容体。
Ｓ－Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ （ＩＩ）
（ただし、
Ｓは任意のシグナルペプチド（すなわちsignal peptide）である。
Ｈはヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
Ｖ_ＨとＶ_Ｌはそれぞれ上記の通りである。） The chimeric antigen receptor according to claim 1, wherein the structure of the chimeric antigen receptor is represented by the following formula II.
S-V _L -V _H -H-TM-C-CD3ζ (II)
(However,
S is any signal peptide (ie, signal peptide).
H is a hinge region.
TM is a transmembrane domain.
C is a co-stimulation signal molecule.
CD3ζ is an intracellular signal transduction sequence derived from CD3ζ.
V _H and V _L are as described above, respectively. ) 請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードすることを特徴とする核酸分子。 A nucleic acid molecule comprising encoding the chimeric antigen receptor according to claim 1. 請求項５に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。 A vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 5. 請求項６に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項５に記載の核酸分
子が組み込まれているか、あるいは請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現することを
特徴とする宿主細胞。 A host comprising the vector according to claim 6, incorporating a foreign nucleic acid molecule according to claim 5 into a chromosome, or expressing the chimeric antigen receptor according to claim 1. cell. ＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、請求項１に記載のＣ
ＡＲを発現する、
請求項５に記載の核酸分子または請求項６に記載のベクターをＴ細胞内に形質導入する
ことによって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を得る工程、
を含むことを特徴とする、前記方法。 A method for producing CAR-T cells, wherein the CAR-T cells are the C according to claim 1.
Express AR,
A step of obtaining the CAR-T cells by transducing the nucleic acid molecule according to claim 5 or the vector according to claim 6 into T cells.
The above-mentioned method. 請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベ
クター、または請求項７に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦
形剤とを含有することを特徴とする製剤。 The chimeric antigen receptor according to claim 1, the nucleic acid molecule according to claim 5, the vector according to claim 6, or the host cell according to claim 7, and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or the like. A preparation characterized by containing an excipient. 請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベ
クター、または請求項７に記載の宿主細胞の使用であって、癌または腫瘍を予防および／
または治療する薬物または製剤の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。 Use of the chimeric antigen receptor of claim 1, the nucleic acid molecule of claim 5, the vector of claim 6, or the host cell of claim 7 to prevent and / or prevent cancer or tumor.
Or said use, characterized in that it is used in the manufacture of a drug or formulation to be treated. 前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。 The use according to claim 10, wherein the tumor is a BCMA positive tumor. 前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、または形質細胞性白血
病であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。 The use according to claim 10, wherein the tumor is BCMA-positive B-cell lymphoma, multiple myeloma, or plasmacytoid leukemia.

Images