JP2022031644A - フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ｉ及び／又は系統群ｉｉのメンバーの定量方法並びに該メンバーのバイオマーカーとしての使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＩＢＤ及びＩＢＤ表現型の進行及び／又は予後の精密診断、分類、研究のために改善された方法を提供する。【解決手段】被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記ＰＨＧＩ存在量の測定は、ある特定の塩基配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含み、かつ、前記ＰＨＧＩＩ存在量の測定は、別のある特定の塩基配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含む、方法である。【選択図】なし

Description

本発明は概して、腸疾患の診断及び分類並びに個別化医療の分野に関する。本発明はさらに、微生物学及び分子生物学の分野に関し、より具体的には本発明は、腸内細菌叢組成と腸疾患との、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における関連性に関する。具体的には、本発明は、腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（Faecalibacterium
prausnitzii）系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の精密定量のための新規方法に関する。さらに、本発明は、ヒト被験体における疾患活動性のスクリーニング、診断、鑑別診断、測定、及び／又は疾患活動性及び／又は疾患進行の監視を含む、腸疾患を検知する方法であって、上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩメンバーの存在量を測定することを含む、方法に関する。さらに、本発明は、ヒト被験体における腸疾患の治療的処置における薬剤の効力の予測方法であって、上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定することを含む、方法に関する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、一群の突発性慢性炎症性腸状態を表す。その用語が範囲に含める２種の主要な疾患カテゴリーは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、それらは重複した臨床的特徴及び病理的特徴と、別個の臨床的特徴及び病理的特徴との両方を有する（世界胃腸学組織の国際ガイドライン、非特許文献１、及び非特許文献２）。
米国では１６０万人もの人々が、そして欧州では２２０万人もの人々がＩＢＤに罹患している。その発病率は、世界的に増加している。ＩＢＤ治療の進歩にかかわらず、米国におけるＩＢＤ入院及び手術率は、１９９０年以降かなり増加している。ＩＢＤは、米国において最も多く見られる５つの胃腸疾患負担のうちの１つであり、１７億ドルを超える年間総医療費を伴う。先進国において１０００人に１人から２人がＩＢＤに罹患しており、その世界的な比率は、急速な近代化及び西欧諸国の生活様式の採用を原因として増加しているように見える。これらの慢性疾患は、クオリティーオブライフ及び平均余命を脅かすかなりの罹患率及び死亡率をもたらす（非特許文献３）。
ＩＢＤの発病率の増加と、社会経済的発展に結びついた環境的要因との関連は、世界中の様々な地域で絶えず認められるので、先進国の生活様式がヒトの腸の天然の微生物定着パターンを害しているようである。ＩＢＤにおいて、粘膜病変は、一般的に腸内の共生微生物に対する過度の又は調節不全の免疫応答に関連しており、腸内微生物叢分析のための分子的方法を使用した研究は、腸内微生物の生態系のディスバイオシス（dysbiosis：腸
内菌共生バランス失調）（つまり、異常な微生物叢組成）及び複雑性の低下がＣＤ患者又はＵＣ患者における共通の特徴であることを指摘している（非特許文献４）。
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（ルミノコッカス科）は、腸内に見られる最も豊富な３つの細菌種のうちの１つであり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子解析に基づくヒト腸内ミクロビオームの多様性研究によれば、健康な個体における糞便微生物叢の２％～２０％に相当する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。他方で、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイは、粘膜関連微生物群叢中の細菌の６％に相当すると報告されている（非特許文献１１）が、幾つかの研究では、これらの値は、幾らかの個体においてはおよそ２０％～５０％にまで増加し得ることが指摘されている（非特許文献１２、非特許文献１３）。
近年、Ｆ．プラウスニッツイへの関心は、抗炎症性化合物の形成（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８）及び腸管バリア機能の増強（非特許文献１９、非特許文献２０）によるその腸の健康促進における潜在的に重要な役割を考慮して（非特許文献１４、非特許文献１５）高まっている。
多くの研究は、Ｆ．プラウスニッツイの保有率及び存在量が、様々な腸障害において低下することを実証しており（非特許文献２１）、特にＦ．プラウスニッツイの数量の減少は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において最も幅広く報告されている。この種の総数が少ないことは、成人のＣＤ患者の糞便関連群叢及び粘膜関連群叢の両方で観察されている（非特許文献１５、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。
ＵＣ患者においては、この障害でたびたび観察されているフィルミクテス門の細菌の減少にもかかわらず（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）、群叢の変動が報告されている（非特許文献１１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献２６、非特許文献３２、非特許文献３３）。１２７人のＵＣ被験体に行われた最近の研究は、Ｆ．プラウスニッツイの減少が、ＵＣのディスバイオシスにも関わっていることを指摘している（非特許文献２６）。
興味深いことに、別種の過敏性腸症候群（ＩＢＳ）のような機能性腸障害においてもフィーカリバクテリウム関連細菌のより少ない総数が観察されており（非特許文献３４）、それはまたＩＢＤ患者と幾つかの特徴で共通しており（非特許文献３５、非特許文献３６）、そして結腸直腸癌（ＣＲＣ）のようなより重症な腸障害においてもそうである（非特許文献３７）。総合すれば、これらの知見は、Ｆ．プラウスニッツイの数の変化が、幾つかの病理的障害下に起こることを示唆している。
フィーカリバクテリウム属内の多様性に着目した研究は比較的少なかった。最近の系統樹解析により、主に２種の異なるＦ．プラウスニッツイ系統群が、健康な被験体の糞便試料に見られることが分かった（非特許文献１８）。より具体的には、非特許文献１８は、Ｆ．プラウスニッツイ分離株とクロストリジウム属クラスターＩＶのその他のメンバーとの系統関係を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて解析し、Ｆ．プラウスニッツイ種内で初めて２種の系統群を定義した（図１）。これらのＦ．プラウスニッツイ系統群は、培養された分離株Ｍ２１／２、ＡＴＣＣ ２７７６６及びＡＴＣＣ ２７７６８（ＰＨＧＩに属する）並びにＡ２－１６５及びＬ２－６（ＰＨＧＩＩに属する）について以前に報告された５つの配列を含んでいた。
さらに、非特許文献３０には、Ｆ．プラウスニッツイ種に属する細菌ＤＮＡ配列の単独のエンドポイントＰＣＲにおける増幅方法が記載されている。増幅のために使用されたプライマー（Ｆｐ．ＩＤ．Ｆ２及びＦｐ．ＩＤ．Ｒ２）は、Ｆ．プラウスニッツイＡ２－１６５株及びＭ２１／２株のヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子配列及びブチリル－ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子配列のそれぞれに対して設計され、ＰＣＲ産物の収量は、２種の異なるサブグループ、すなわちＡ２－１６５サブグループ及びＭ２１／２サブグループに属するものと分類された（表１を参照）。したがって、Ｆ．プラウスニッツイのメンバーの増幅のために使用されたプライマーは、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とせず、２種の菌株の配列だけを基礎としていた。さらに、それぞれのサブグループに属するメンバーは、ＰＣＲ産物のサイズによって区別されたが、Ａ２－１６５サブグループ及びＭ２１／２サブグループのそれぞれに特異的なプライマー又はプローブは非特許文献３０には開示されなかった。
近頃では、ＩＢＤの診断には、包括的身体検査及び患者の病歴の再検討が必要とされる
。血液検査、検便、内視鏡検査、生検、及び画像診断を含む様々な試験は、他の原因を除外し、診断を確定する助けになる（世界胃腸学組織の国際ガイドライン、非特許文献１）。
精密ＩＢＤ診断は、根拠に基づいた正しい処置を提供するために非常に重要である。それというのも、処置の応答及び合併症は、ＵＣ患者とＣＤ患者とで大きく異なるからである（非特許文献３８）。臨床医の見地からすれば、これらの疾患の精密診断及び分類は、患者カウンセリング、疾患予後の評価、疾患進行及び疾患回帰の監視に関して、特に各々の疾患サブタイプにとって最も適切な処置の選択に関して潜在的な利点があるはずである。さらに、ＣＤ及びＵＣの両方についての疾患進行の問題は、遺伝子型と表現型とを関連付ける研究において重要である。それというのも疾患の挙動及び重症度は、時間に伴い確実に変化するからである（非特許文献３９）。
Inflammatory bowel disease: a global perspective, June 2009 Silverberg et al., Can J Gastroenterol. 2005, 19 Suppl A:5-36 M'Koma A. E., World J Gastrointest Surg 2014; 6(11), 208-219 Manichanh et al., Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 9, 599-608 Arumugam et al. Nature. 2011;473: 174-180 Eckburg et al. Science. 2005;308: 1635-1638 Hold et al. Appl Environ Microbiol. 2003;69:4320-4324 Schwiertz et al. J Pediatr. 2010; 157:240-244 Suau et al. Systematic and Applied Microbiology. 2001;24: 139-145 Walker et al. ISME J. 2011:220-230 Swidsinski et al. World J Gastroenterol. 2005; 11: 1131-1140 Nava GM, Stappenbeck TS. Gut Microbes. 2011;2: 99-104 Baumgart et al. ISME J. 2007; 1:403-418 Louis et al. FEMS Microbiol Lett. 2009;294: 1-8 Sokol et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 16731-16736 Barcenilla et al. Appl Environ Microbiol. 2000;66: 1654-1661 Duncan et al. Int J Syst Evol Microbiol 2002;52:2141-2146 Lopez-Siles et al. Appl Environ Microbiol. 2012;78:420-428 Carlsson et al. Scand J Gastroenterol. 2013;48: 1136-1144 Wrzosek et al. BMC Biol. 2013;11:61 Miquel et al. Curr Opin Microbiol. 2013;16:255-261 Lopez-Siles et al. International Journal of Medical Microbiology. 2014;304:464-475 Sokol et al. Inflamm Bowel Dis. 2009; 15: 1183-1189 Swidsinski et al. Inflamm Bowel Dis. 2008; 14: 147-161 Willing et al. Inflamm Bowel Dis. 2009; 15:653-660 Machiels et al. Gut. 2013 Frank et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104: 13780-13785 Nagalingam NA, Lynch SV. Inflamm Bowel Dis. 2012;18:968-984 Hansen et al. Am J Gastroenterol. 2012; 107: 1913-1922 Jia et al. FEMS Microbiol Lett. 2010;310:138-144 Kabeerdoss et al. BMC Gastroenterol. 2013;13:20 McLaughlin et al. Therap Adv Gastroenterol. 2010;3:335-348 Vermeiren et al. FEMS Microbiol Ecol. 2012;79:685-696 Rajilic-Stojanovic et al. Gastroenterology. 2011; 141: 1792-1801 Ghoshal et al. Int J Inflam. 2012;2012: 151085 Spiller RC. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2004;18:641-661 Balamurugan et al. J Gastroenterol Hepatol. 2008;23: 1298-1303 Farmer et al. Am J Gastroenterol 2000; 95: 3184-3188 Satsangi et al., Gut 2006; 55, 749-753
過去２０年の間にＩＢＤに関連した分子的マーカー及び血清学的マーカーの発見においてなされた大幅な進歩にかかわらず、ＩＢＤ及びＩＢＤ表現型の進行及び／又は予後の精密診断、分類、研究のために改善された方法がいまだ求められている。
本発明者らは、腸試料におけるＦ．プラウスニッツイ種の系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又は系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の精密定量のための新規方法を開発した。特に、両者のＦ．プラウスニッツイ系統群を同時に定量するために、本発明者らによって特異性を保ちつつ広範なカバレッジを有するように設計及び最適化された、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関するユニークな種特異的プライマー対、並びにＦ．プラウスニッツイ系統群のメンバーの各々を標的とする２種の加水分解プローブを使用することを含む、マルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が開発された。腸疾患に罹患している（例えばＩＢＤ、クローン病、又は潰瘍性大腸炎に罹患している）患者の腸内微生物叢組成には、個体間の変動があり、Ｆ．プラウスニッツイ株の幾つかは、所与の個体の腸内細菌群叢には見られないことがある。したがって、本発明のプライマー及びプローブの広範なカバレッジは、Ｆ．プラウスニッツイ系統群のより精密な定量をもたらす。
種特異的プライマー及び系統群特異的プローブの設計のために、Ｆ．プラウスニッツイ由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３３個の配列を、ＧｅｎＢａｎｋから回収し、アライメントさせた（表１４を参照、ここではこれらの配列（太字）に、＊、１及び２のそれぞれの印を付けた）。Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及び各々の系統群について作成されたコンセンサス配列から、プライマー及び加水分解プローブの両方を手動で設計し、最適化した。したがって、Ｆ．プラウスニッツイＡ２－１６５株及びＭ２１／２株のみのヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子配列及びブチリル－ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子配列に基づいてプライマーが設計された非特許文献３０とは異なって、本発明のＦ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関する種特異的プライマーの設計は、３３個の既知のＦ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列のアライメントに基づくものであった。
さらに、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びＦ．プラウスニッ
ツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）に特異的なプローブが初めて記載された。ＰＨＧＩプローブの設計のために、５個の既知のＦ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が出発点として使用され、ＰＨＧＩＩプローブの場合は、１３個の既知のＦ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が使用された（以下の表３及び表５をそれぞれ参照）。既知の配列の系統群分類は、非特許文献１８に従って行った。
作成された種特異的プライマー及び系統群特異的プローブを、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子についての広範なカバレッジ及び特異性を保証するためにｉｎ ｓｉｌｉｃｏ試験及びｉｎ ｖｉｖｏ試験に供試した（包含性／排他性試験）。ＰＨＧＩプローブ（配列番号３）は、本発明者らにより、１０００個を上回る１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、すなわち表３及び表４に列挙される１１９６個の配列と特異的にハイブリダイズすることが示された。したがって、本明細書で使用されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）のメンバーという用語は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子がＰＨＧＩプローブ（配列番号３）と特異的にハイブリダイズするそれらの細菌株を含む。同様に、ＰＨＧＩＩプローブ（配列番号４）は、本発明者らにより、２０００個を上回る１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列、すなわち表５及び表６に列挙される２２４４個の配列と特異的にハイブリダイズすることが示された。したがって、本明細書で使用されるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）のメンバーという用語は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子がＰＨＧＩＩプローブ（配列番号４）と特異的にハイブリダイズするそれらの細菌株を含む。
ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩのメンバーの定量のための新たに開発された方法を使用して、本発明者らは、Ｆ．プラウスニッツイの不均衡が群叢全体に含まれるのか、それともその不均衡が特定の系統群に特異的に影響するのかを確かめるために、健康な被験体と幾つかの腸障害に罹患している患者とでの粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ系統群及び糞便関連Ｆ．プラウスニッツイ系統群の変動を調べた。
さらに、スクリーニング診断、鑑別診断（例えば、ＩＢＤ表現型の鑑別診断）、疾患活動性の測定及び疾患活動性又は疾患進行の監視を含む、腸疾患の検知のためのバイオマーカーとしての、Ｆ．プラウスニッツイ系統群単独、その組み合わせ、又は他のバイオマーカーとの組み合わせ（例えば、Ｆ．プラウスニッツイ及びＥ．ｃｏｌｉ）の定量の有用性を調べた。さらに、腸疾患、特にクローン病及び潰瘍性大腸炎における治療的処置の効果を予測するためのバイオマーカーとしてのその有用性を調べた。
したがって、本発明は、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩのメンバーの定量のための新規方法、並びに該メンバーの、腸疾患、特にクローン病及び／又は潰瘍性大腸炎の新たなバイオマーカーとしての使用を提供する。
したがって、本発明の具体的な知見により、以下の態様が提供される。
本発明の第１の態様は、被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ＰＨＧＩ存在量の測定は、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含み、かつ、
ＰＨＧＩＩ存在量の測定は、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含む、方法に関する。
第２の態様において、本発明は、ヒト被験体における腸疾患の検知、及び／又はヒト被
験体における腸疾患の治療的処置における薬剤の効力の予測のための有用な情報を取得する方法であって、
ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を、本発明の方法に従って測定することを含む、方法に関する。
第３の態様において、本発明は、ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、第１の態様に記載の方法に従って測定する工程と、
ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる、方法に関する。
更なる一態様において、本発明は、ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせの、腸疾患の検知のための、及び／又は腸疾患の処置における薬剤の効力を予測するためのバイオマーカーとしての使用に関する。
本発明はさらに、
ａ． フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定するための、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬と、
ｂ． フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するための、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬と、
ｃ． 任意に、上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料からＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための説明書と、
を含むキットを提供する。
本発明の更なる一態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される核酸配列、又はその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列に関する。
本発明の一層の更なる一態様は、ヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせと、判別されるべきＩＢＤ表現型の参照試料中の相応の値とを比較して被験体が罹患しているＩＢＤ表現型を決定する工程と、
を含み、ここで、被験体試料が上記ＩＢＤ表現型の１つと有意に類似した値を表していることが、その被験体が上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となり、
上記ＩＢＤ表現型は、少なくとも以下のパラメータ：
－ 疾患部位、
－ ＩＢＤ型、及び、
－ 診断時の年齢、
のうちの２つ、好ましくは３つの組み合わせによって定義され、
任意に、上記ＩＢＤ表現型の定義のために追加のバイオマーカーの使用を含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、結腸病変を伴うＩＢＤに罹患しているヒト被験体においてＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせと、参照試料中の相応の値とを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、Ｃ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
また、本発明の別の態様は、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤに罹患しているヒト被験体においてＩＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせと、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤと診断されると思われる上記被験体からの参照試料中の相応の値とを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、ＩＣ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
本発明の更なる一態様は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予後判定方法であって、ＩＢＤ表現型を、本発明の上記態様のいずれかの鑑別診断方法により測定し、測定されたＩＢＤ表現型に応じて予後を確立することを含む、方法に関する。
本発明のもう１つの更なる態様は、ヒト被験体の腸試料において測定されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）の存在量、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせの、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用に関する。
本発明のもう１つの一層の更なる態様は、上記態様のいずれかの方法による炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのキットであって、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定するための試薬と、
－ 上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料から上記標的微生物の存在量レベルを測定するための説明書と、
を含む、キットに関する。
Ｆ．プラウスニッツイ（黒色）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（灰色）及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（白色）の保有率のグラフ表示である。被験体を、疾患（左）及びＩＢＤ部位（右）によって類別した。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール被験体、ＣＲＣ、結腸直腸癌、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＵＣ、潰瘍性大腸炎、ＣＤ、クローン病、Ｅ１、直腸炎、Ｅ２、左側大腸炎、Ｅ３、全大腸炎、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、Ｉ－ＣＤ、回腸クローン病、及びＩＢＤ、炎症性腸疾患。棒内の数字は、保有率の計算のために分析された患者（生検材料）の数を指す。統計学は、それぞれのパネルについて別々に計算した。それぞれのパネル内の同質のサブグループ（Ｐ＞０．０５）は棒の上に同じ符号で示され、その一方で、統計学的に異なる保有率を有する患者の群（Ｐ＜０．０５）は、どの上付文字も共通しない。 疾患によって類別された患者の群（Ａ）及びＩＢＤサブタイプによって類別された患者の群（Ｂ）のそれぞれにおける、Ｆ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの保有率のグラフ表示である。Ａ）及びＢ）の両方において、腸に沿った保有率（内側の円から外側の円に向かって、回腸、結腸、そして直腸）の値が表されており、さらに全ての試料をまとめた相応の保有率（外側の円）も表されている。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール被験体、ＣＲＣ、結腸直腸癌、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＵＣ、潰瘍性大腸炎、ＣＤ、クローン病、Ｅ１、潰瘍性直腸炎、Ｅ２、潰瘍性左側大腸炎、Ｅ３、潰瘍性全大腸炎、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、及びＩ－ＣＤ、回腸クローン病。扇形内の数字は、分析された生検材料の数を指す。＊不確定部位の試料は、ＩＢＳ患者の平均分析に含めた。 受信者動作特性解析（ＲＯＣ曲線）により得られた曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される、粘膜関連のＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量を、種々の腸障害とＩＢＤサブタイプ（部位による）とを判別するためのバイオマーカーとして使用するための適性についてのヒートマップとしてのグラフ表示である。試験は、ＡＵＣが０．６から０．７５までの場合（淡灰色）に適切な識別因子であるとみなされ、ＡＵＣが０．７５から０．９までの場合（暗灰色）に高い識別性を有するとみなされ、かつＡＵＣが０．９から１までの場合（黒色）に優れた識別因子であるとみなされる。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール、ＩＢＤ、炎症性腸疾患、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＵＣ、潰瘍性大腸炎、ＣＤ、クローン病、ＣＲＣ、結腸直腸癌、Ｉ－ＣＤ、回腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、Ｅ１、潰瘍性直腸炎、Ｅ２、遠位潰瘍性大腸炎、及びＥ３、広汎性潰瘍性大腸炎又は潰瘍性全大腸炎。 上記群比較に関する粘膜関連のＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）の存在量についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図であり、ここではＰＨＧＩが、腸疾患又は疾患サブタイプの存在と不存在との最良の識別因子であることを示している。Ａ）Ｈ対ＩＢＳ＋ＩＢＤ＋ＣＲＣ、Ｂ）Ｈ対ＩＢＤ、Ｃ）Ｈ対ＣＤ、及びＤ）Ｈ対Ｉ－ＣＤ。Ｙ軸には感度が表され、Ｘ軸には１－特異度が表される。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール、ＩＢＤ、炎症性腸疾患、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＣＤ、クローン病、ＣＲＣ、結腸直腸癌、及びＩ－ＣＤ、回腸クローン病。 臨床的に関心が持たれる鑑別診断のために選択された群比較に関する粘膜関連のＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）の存在量についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。Ａ）ＵＣ－Ｅ３対Ｃ－ＣＤ、Ｂ）Ｉ－ＣＤ対ＩＣ－ＣＤ、及びＣ）ＩＣ－ＣＤ対Ｃ－ＣＤ。Ｙ軸には感度が表され、Ｘ軸には１－特異度が表される。以下の略語を使用した：Ｉ－ＣＤ、回腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、及びＥ３、広汎性潰瘍性大腸炎又は潰瘍性全大腸炎。 受信者動作特性解析（ＲＯＣ曲線）によって得られた曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される、糞便におけるＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量を、種々のＩＢＤ診断とＩＢＤサブタイプ（部位による）とを判別するためのバイオマーカーとして使用するための適性についてのヒートマップとしてのグラフ表示である。試験は、ＡＵＣが０．６から０．７５までの場合（淡灰色）に適切な識別因子であるとみなされ、ＡＵＣが０．７５から０．９までの場合（暗灰色）に高い識別性を有するとみなされ、かつＡＵＣが０．９から１までの場合（黒色）に優れた識別因子であるとみなされる。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール、ＩＢＤ、炎症性腸疾患、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＵＣ、潰瘍性大腸炎、ＣＤ、クローン病、ＣＲＣ、結腸直腸癌、Ｉ－ＣＤ、回腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、Ｅ１、潰瘍性直腸炎、Ｅ２、遠位潰瘍性大腸炎、及びＥ３、広汎性潰瘍性大腸炎又は潰瘍性全大腸炎。 ＩＢＤ疾患及び疾患サブタイプの選択された群比較に関する糞便におけるＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）の存在量についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。Ａ）．Ｈ対ＩＢＤ、Ｃ）Ｈ対ＣＤ、及びＤ）Ｈ対Ｉ－ＣＤ。Ｙ軸には感度が表され、Ｘ軸には１－特異度が表される。以下の略語を使用した：Ｈ、コントロール、ＩＢＤ、炎症性腸疾患、ＩＢＳ、過敏性腸症候群、ＣＤ、クローン病、ＣＲＣ、結腸直腸癌、及びＩ－ＣＤ、回腸クローン病。 臨床的に関心が持たれる鑑別診断のために選択された群比較に関する糞便におけるＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）の存在量についての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。Ａ）ＩＣ－ＣＤ対Ｉ－ＣＤ、Ｂ）．ＩＣ－ＣＤ対Ｃ－ＣＤ、及びＣ）ＵＣ－Ｅ３対Ｃ－ＣＤ。Ｙ軸には感度が表され、Ｘ軸には１－特異度が表される。以下の略語を使用した：Ｉ－ＣＤ、回腸クローン病、ＩＣ－ＣＤ、回腸結腸クローン病、Ｃ－ＣＤ、結腸クローン病、及びＥ３、広汎性潰瘍性大腸炎又は潰瘍性全大腸炎。 健康者（Ｈ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者及びクローン病（ＣＤ）患者における、糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群（ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩ）及びＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量を表すグラフ（Ｃｔで表現される）である。 バイオマーカーの比率による細菌存在量を表すグラフである。 健康者（Ｈ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者及びクローン病（ＣＤ）患者における、糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群（ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩ）及びＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 ＣＤ患者の結腸部位、回腸結腸部位及び回腸部位の試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）の存在量を示す図である。 ＣＤ患者の結腸部位、回腸結腸部位及び回腸部位の試料におけるＦＴ／ＰＨＧＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩＩの存在量の比率を示す図である。 クローン病（ＣＤ）患者の回腸部位における、糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群（ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩ）及びＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 クローン病（ＣＤ）患者の回腸結腸部位における、糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、及び系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 クローン病（ＣＤ）患者の結腸部位における、糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、及び系統群（ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩ）のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 ＵＣ患者を識別する細菌マーカー及び比率のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 クローン病（ＣＤ）患者の結腸部位における細菌マーカー及び比率のＲＯＣ曲線解析を表すグラフである。 種々の範囲のカルプロテクチンの間での、ＣＤ患者及びＵＣ患者における総フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群Ｉ（ＰＨＩ）及び系統群ＩＩ（ＰＨＩＩ）を示す図である。 ２５０μｇ／ｇを上回る又は２５０μｇ／ｇを下回るカルプロテクチンの間での、ＣＤ患者及びＵＣ患者における比率ＦＴ／ＰＨＩ、ＰＨＩ／ＰＨＩＩ、ＰＨＩ／ＥＣ、及びＰＨＩＩ／ＥＣのグラフである。 ２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチン値を有するＣＤ患者におけるＲＯＣ曲線解析のグラフである。 ２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチン値を有するＵＣ患者におけるＲＯＣ曲線解析のグラフである。 レスポンダー及びノンレスポンダーのＣＤ患者及びＵＣ患者における総フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群Ｉ（ＰＨＩ）、系統群ＩＩ（ＰＨＩＩ）及びＥ．ｃｏｌｉの存在量を示す図である。 レスポンダー及びノンレスポンダーとして下位分類されるＣＤ患者及びＵＣ患者における比率ＦＴ／ＥＣ、ＦＴ／ＰＨＩ、ＦＴ／ＰＨＩＩ、ＰＨＩ／ＰＨＩＩ、ＰＨＩ／ＥＣ及びＰＨＩＩ／ＥＣを示す図である。
定義
本明細書で使用される用語「保有率」は、研究対象の集団内で発生する疾患の事例の数の尺度、すなわち、分析される生物学的試料又は個体の全体に対する標的微生物について陽性の生物学的試料又は個体の％を指す。保有率は、このように研究対象の試料又は個体のそれぞれの中の上記標的微生物の定性測定（存在／不存在）から計算される。
本明細書で使用される用語「存在量」は、生物学的試料内の標的微生物の量の尺度を指す。それは、「負荷量」とも呼ばれる。細菌定量は、一般的に分子的方法によって、典型的には上記標的微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピーの数を測定することによって、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はＰＣＲ／パイロシーケンシング法によって行われる。生物学的試料内の標的核酸配列の存在量の定量は、絶対値であっても又は相対値であってもよい。「相対定量」は、一般的に１種以上の内部参照遺伝子、すなわち参照株由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、例えばユニバーサルプライマーを使用した総細菌の測定量に基づいており、標的核酸配列の存在量は、総細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数のパーセンテージとして表現されるか、又はＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数によって正規化される。「絶対定量」は、ＤＮＡ標準との比較によって又はＤＮＡ濃度による正規化によって標的分子の正確な数を示す。
用語「定量レベル」は、濃度（単位容量当たりのＤＮＡ量）、細胞数当たりのＤＮＡ量若しくは遺伝子コピー数、サイクル閾値（Ｃｔ値）又はそれらの任意の数学的別形、例えば遺伝子コピー数のｌｏｇ１０であってもよい。
本明細書で使用される表現「バイオマーカーとしての有用性」とは、分子マーカーがどれほど良好に対象となる標的状態を特定するかを指し、すなわち上記パラメータがどれほど良好に種々の集団群に属する被験体を、例えば疾患群と非疾患群とを又は種々の疾患表現型を識別することを可能にするかを指す。これは、試験の「妥当性」又は「性能」と呼ばれる。
妥当性研究は、標的状態を特定する能力についての提案された（インデックス）試験と
参照標準との合致を扱う（Florkowski M. C., Clin Biochem Rev. 2008, 29 (Suppl 1): S83-S87を参照）。感度、特異度、精度、陽性尤度比、陰性尤度比、陽性予測値及び陰性
予測値は、試験性能を評価するために定義することができる統計値である。頭字語の定義及び更なる詳細を、以下の表１で規定する。
Figure 2022031644000001
本明細書で使用される用語「感度」は、標的状態（参照標準陽性）を有し、かつ陽性の試験結果を示す被験体の割合を指す（ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ））。感度は、その試験が疾患の検知にどれほど良好かを示す。感度（「ｓｅｎｓ」）は、０（０％）＜ｓｅｎｓ＜１（１００％）の範囲内であってもよく、偽陰性の数は、０に等しいか又はほぼ０に等しいことが理想的であり、かつ感度は、１（１００％）に等しいか又はほぼ１（１００％）に等しいことが理想的である。
本明細書で使用される用語「特異度」は、標的状態（参照標準陰性）を有さず、かつ陰性の試験結果を示す被験体の割合を指す（ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ））。特異度は、その試験が正常（陰性）状態を特定するのにどれほど良好かを示す。特異度（「ｓｐｅｃ」）は、０（０％）＜ｓｐｅｃ＜１（１００％）の範囲内であってもよく、偽陽性の数は、０に等しいか又はほぼ０に等しいことが理想的であり、かつ特異度は、１（１００％）に等しいか又はほぼ１（１００％）に等しいことが理想的である。
本明細書で使用される用語「精度」は、集団における真の結果、つまり真陽性又は真陰性のいずれかの割合を指す。精度は、或る状態に対するスクリーニング試験の正確さの度合いの尺度であり、すなわち所与の状態の確定及び除外がどれほど正しいかの指標となる（ＴＮ＋ＴＰ）／（ＴＮ＋ＴＰ＋ＦＮ＋ＦＰ）。精度（「ａｃｃ」）は、０（０％）＜ａｃｃ＜１（１００％）の範囲内であってもよく、偽陽性の数は、０に等しいか又はほぼ０に等しいことが理想的であり、かつ精度は、１（１００％）に等しいか又はほぼ１（１００％）に等しいことが理想的である。
本明細書で使用される用語「受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線」とは、識別閾値を変化させたときの二項分類システムの性能を図解するグラフプロットを指す。その曲線は、様々な閾値を設定したときの真陽性率を、偽陽性率に対してプロットすることによって作成される。真陽性率は、感度としても知られている。偽陽性率は、１－特異度として計算される。このように、ＲＯＣ曲線は、カットオフの範囲にわたる真陽性率対偽陽性率（感度対（１－特異度））をグラフ表示し、臨床的使用のための最適なカットオフを選択するため
の手法である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）として表現される精度は、試験性能を比較するための有用なパラメータを提供する。ＡＵＣが１に向かうと、その試験の感度が高いだけでなく特異度が高いことも示しており、その一方で、ＡＵＣが０．５に向かうと、その試験の感度も特異度もないことを示している。一般に、試験は、ＡＵＣが０．６から０．７５までの場合に適切な識別因子であるとみなされ、ＡＵＣが０．７５から０．９までの場合に高い識別性を有するとみなされ、かつＡＵＣが０．９から１までの場合に優れた識別因子であるとみなされる。更なる詳細については、例えばZweig MH and Campbell G, Clinical Chemistry 1993; 39:561-577又はGreiner et al. Preventive Veterinary Medicine 2000; 45:23-41を参照。
用語「有意」又は「統計学的に有意」は、試験試料とコントロール試料又は参照試料との差異について述べるときに、適切な統計解析を用いて、それらの群が同じである確率が５％未満（例えば、ｐ＜０．０５）である場合の状態に関連している。言い換えると、完全無作為法ベースで同じ結果が得られる確率が、１００回の試みのうち５回未満である。当業者は、適切な統計解析をどのように選択するかを認識しているであろう。一般的に、適切な統計解析は、研究対象となる変数が、例えばコルモゴロフ－スミルノフ検定を使用することにより正規分布を有するかどうかに基づき、かつ例えばルビーン検定で決定される等分散性があるかどうかに基づいて決定される。好ましくは、正規分布及び等分散性がある場合には、ｔ検定又はＡＮＯＶＡ検定のようなパラメトリックモデルが使用され、これらの２つの必要条件のうちの少なくとも１つが達成されない場合には、マン－ホイットニーのＵ検定又はクラスカル－ウォリスの検定のようなノンパラメトリックモデルが一般的に使用される。
本明細書で使用される用語「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）」とは、一群の突発性慢性炎症性腸状態を指す。その用語が範囲に含める２種の主要な疾患カテゴリーは、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であり、それらは重複した臨床的特徴及び病理的特徴と、別個の臨床的特徴及び病理的特徴との両方を有する。ＩＢＤの診断は、包括的身体検査及び患者の病歴の再検討を必要とする。血液検査、検便、内視鏡検査、生検、及び画像診断を含む様々な試験は、他の原因を除外し、診断を確定する助けになる（世界胃腸学組織の国際ガイドライン、非特許文献１、及び非特許文献２）。ＩＢＤの疫学及び遺伝学の理解が高まるにつれ、ＵＣ及びＣＤが、実際にはＩＢＤの幾つかの形態を表すことが臨床医らに明らかになった。このように、本明細書で使用される用語「ＩＢＤ」は、それらの複数の表現型を含む。
本明細書で使用される用語「ＩＢＤ表現型」は、ＣＤ、ＵＣ、非定型大腸炎、無分類型の炎症性腸疾患（ＩＢＤＵ）、回腸嚢炎、顕微鏡的大腸炎、憩室炎のような疾患又は障害を含む（Mowat et al., Gut 2011, 1-37、Geboes et al., J Clin Pathol 2005;58: 1133-1134; Cheifetz A、及びItzkowitz S., J Clin Gastroenterol. 2004 May-Jun;38(5 Suppl 1):S44-50）。ＩＢＤ表現型は、ＩＢＤ疾患又は障害の範囲内のサブタイプを更に含む。ＣＤサブタイプは、例えばモントリオール分類によって規定されるサブタイプであり、その際、ＣＤは、診断時の年齢、部位及び／又は挙動により分類される。ＵＣサブタイプも、モントリオール分類によって規定されるサブタイプであってもよく、その際、ＵＣは、疾患の拡張及び／又は疾患の重症度により分類される（世界胃腸学組織の国際ガイドライン、非特許文献１、及び非特許文献２）。
本明細書で使用される用語「非定型大腸炎（ＩＣ）」とは、結腸切除標本においてＵＣ又はＣＤどちらの特徴も有さない慢性ＩＢＤのそれらの事例を指す（非特許文献２、非特許文献３９）。
本明細書で使用される用語「無分類型の炎症性腸疾患（ＩＢＤＵ）」とは、結腸を冒す
が、小腸の病変を有さない慢性炎症性腸疾患について臨床的根拠及び内視鏡的根拠に基づくエビデンスがあるが、ＣＤ又はＵＣのいずれかを立証するための組織学的又はその他のエビデンスがなく、感染を除外したそれらの事例を指す（非特許文献３９）。
本明細書で使用される用語「診断検査」とは、被験体が疾患の徴候又は症状を示す場合に、その疾患の存在又は不存在を測定する検査を指す。その検査は、疾患又は表現型を示唆又は除外するために使用することができる。その診断という用語は、鑑別診断を含み得る。
本明細書で使用される用語「スクリーニング試験」とは、疾患を有するかもしれない無症候の個体を特定する試験を指し、それは、疾患の早期検知のために使用される。その試験は、疾患又は表現型の存在を推測するために使用することができる。
本明細書でＩＢＤのために使用される用語「進行を監視するための試験」とは、疾患が腸の他の領域にまで拡張したかどうかを調べる試験、例えば疾患が患者においてＩ－ＣＤ（回腸部位でのクローン病）からＩＣ－ＣＤへと進行して、疾患が結腸までも拡張したかどうかを監視する試験を指す。
本明細書で使用される用語「処置の効力」とは、その処置が所望の又は予定されたアウトカムを達成する度合い、例えば薬剤が所望の効果を達成する能力を指す。
用語「処置」は、予防的処置又は治療的処置の両方を含む。本明細書で使用される用語「治療的処置」又は「治療」とは、身体を病的状態又は疾患からその正常な健康状態に戻すことを指す。本明細書で使用される用語「予防的処置」とは、病的状態を防止することを指す。
本明細書で使用される用語「プローブ」は、１０塩基対から２８５塩基対の間の長さの合成により又は生物学的に製造された核酸であって、予め決められた条件下で標的核酸配列へと特異的かつ選択的なハイブリダイゼーションを可能にする特異的なヌクレオチド配列を含み、任意に検知のための部分又はアッセイ性能を向上させる部分を含む、核酸を指す。統計学的には、特異性を獲得し、かつ安定なハイブリダイゼーション産物を形成するためには、最低でも１０個のヌクレオチドが一般的に必要とされ、最大２８５個のヌクレオチドは、一般的に、ミスマッチ配列及び選択的ハイブリダイゼーションを決定するために容易に反応パラメータを調節することができる長さの上限に相当する。プローブは、任意に、或る特定のアッセイ条件下でのその適切又は最適な機能をもたらす或る特定の成分を含んでいてもよい。例えば、プローブは、それらのヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善（例えば、末端封鎖によって）するように、検知リガンド（例えば、フルオレセイン）を有するように、又は固体担体へのそれらの捕捉を容易にするように（例えば、ポリデオキシアデノシン「テール」）修飾されていてもよい。
本明細書で使用される用語「プライマー」とは、ヌクレオチド配列を増幅するための増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）で使用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、特定の標的配列、例えば１つの特定の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列のポリヌクレオチド配列に基づいて設計される。プライマー及びプローブの設計及びバリデーションは、当該技術分野で良く知られている。定量的リアルタイムＰＣＲ法については、例えばRodriguez Aら（Methods Mol Biol., 2015, 1275:31-56）を参照。
本明細書で使用される用語「特異的」とは、或るヌクレオチド配列が、アッセイ条件下で（一般的にストリンジェント条件が使用される）、予め決められた標的配列にハイブリダイズする／該配列を増幅するが、非標的配列には本質的にハイブリダイズしない／該配
列を増幅しないことを意味する。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション」とは、予め決められた反応条件下で、２つの部分的に又は完全に相補的な核酸鎖が、逆平行状態で一緒になって、核酸塩基が互いに対をなすことができる明確な規則に従って特異的かつ安定な水素結合により二本鎖核酸を形成することを可能にする過程を指す。
用語「本質的なハイブリダイゼーション」とは、観察されるハイブリダイゼーションの量が、結果の観察者がポジティブコントロール及びネガティブコントロールにおけるハイブリダイゼーションデータに関して結果を陽性とみなすような量であることを意味する。「バックグラウンドノイズ」とみなされるデータは、本質的なハイブリダイゼーションではない。
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ほぼ０．９モル濃度のＮａＣｌの塩溶液中でほぼ３５℃～６５℃を意味する。ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、存在する変性剤の種類及び濃度、並びにハイブリダイゼーション温度のような反応パラメータによって左右されることもある。一般的によりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件になると、安定なハイブリッドが形成されるべきであるならば、より長いプローブが好ましい。通例、ハイブリダイゼーションが行われる条件のストリンジェンシーは、使用されるべき好ましいプローブの或る特定の特徴を規定するものである。
本明細書で使用される用語「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のそれぞれの、厳密なヌクレオチドとヌクレオチドとの対応関係又はアミノ酸とアミノ酸との対応関係を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することができる。核酸配列又はアミノ酸配列のどちらの２つの配列の「パーセント同一性」も、アライメントされた２つの配列の間の厳密なマッチした数を短い方の配列の長さで割って１００を掛けたものである。配列間のパーセント同一性又は類似性を計算するために適したプログラムは、当該技術分野で良く知られており、例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムが、例えばデフォルトパラメータで使用される（http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST）。
用語「キット」又は「試験キット」は、分析に必要な試薬及び助剤の組み合わせを示す。試験キットは、大抵の場合に幾つかのユニットからなるが、一体型の分析要素も利用可能であり、それも同様に試験キットとみなさねばならない。
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩのメンバーの存在量の測定方法
第１の態様において、本発明は、被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ＰＨＧＩ存在量の測定は、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含み、かつ、
ＰＨＧＩＩ存在量の測定は、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含む、方法に関する。
フィーカリバクテリウムは、Duncanら（非特許文献１７）によって以下の説明：Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｆａｅ．ｃａ．ｌｉ．ｂａｃ．ｔｅ＜＜ｒｉ．ｕｍ、糞便に関係するラテン語の形容詞ｆａｅｃａｌｉｓ、短い棒に関係するギリシャ語の指小辞ｂ
ａｋｔｅｒｉｏｎ、糞便由来の棒に関係する新ラテン語の名詞Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、それというのも、この細菌は、結腸内の糞便中というその推定される生息場所に数多く存在するからである）をもって創設された新たな属である。グラム陰性で、非胞子形成性で、絶対嫌気性である。その非運動性の生物は、酪酸塩、ｄ－乳酸塩及びギ酸塩を産生し、そして酢酸塩を利用する。ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は、４７±５７ｍｏｌ％である（熱変性により測定される）。Cato et al. (1974)によりその特徴が報告された基準株は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＡＴＣＣ ２７７６８Ｔ（ＮＣＩＭＢ
１３８７２Ｔ）である。しかしながら、過去１０年間でこの種に対して行われた最近の研究のほとんどは、Ａ２－１６５株（ＤＳＭ １７６７７）に基づくものであり、それはまた、Duncanら（非特許文献１７）によっても記載されている。
Ｆ．プラウスニッツイの２種の系統群は、以前から記載されている（非特許文献１８）。この研究は、Ｆ．プラウスニッツイ分離株とクロストリジウム属クラスターＩＶのその他のメンバーとの系統関係を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて解析し、Ｆ．プラウスニッツイ種内に初めて２種の系統群を定義しており（図１）、具体的には、その研究は、ルミノコッカス科内に９７％を上回る配列同一性を有する２つの枝を定義している。これらは、分離株Ｍ２１／２、ＡＴＣＣ ２７７６６及びＡＴＣＣ ２７７６８（ＰＨＧＩに属する）並びにＡ２－１６５及びＬ２－６（ＰＨＧＩＩに属する）について以前に報告された５つの配列を含んでいる。
両者のＦ．プラウスニッツイ系統群を同時に定量するために、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関するユニークな種特異的プライマー対、並びに本発明者らによって設計及び最適化されたＦ．プラウスニッツイ系統群の各々を標的とする２種の加水分解プローブを使用することを含むｑＰＣＲアッセイが開発された。本研究で使用されるオリゴヌクレオチドは、表１５に示される（実施例を参照）。Ｆ．プラウスニッツイ系統群の定量のために使用されるプライマー及びプローブは、新たに設計されたが、総Ｆ．プラウスニッツイについてのプライマー及びプローブは、非特許文献２２で以前に開示された。
表１５に列挙されるオリゴヌクレオチドは、本明細書全体にわたって、以下の表２に示される配列番号１～配列番号１６として呼ばれる。
Figure 2022031644000002
設計
Ｆ．プラウスニッツイ及び近縁のルミノコッカス科由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（表１４、実施例を参照）から回収し、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗソフトウェアを使用してアライメントさせることで、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子及びＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のそれぞれのコンセンサス配列を得た。プライマー及び加水分解プローブの両方を、これらのコンセンサス配列から手動で設計し、最適化した。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏバリデーション
カバレッジは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＳＩＬＶＡデータベース（ＳＩＬＶＡプローブマッチ及び評価ツール－ＴｅｓｔＰｒｏｂｅ ３．０、http://www.arb-silva.de/search/testprobe/）中の配列に対してＴｅｓｔＰｒｉｍｅ（商標）を使用して測定した。Ｔｅｓ
ｔＰｒｉｍｅ（商標）は、ＳＩＬＶＡデータベースでｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＰＣＲを実行することによってプライマー対の性能を評価することを可能にする。そのＰＣＲの結果から、ＴｅｓｔＰｒｉｍｅは、ＳＩＬＶＡにより提供される分類の全てにおけるそれぞれの分類群についてカバレッジを計算する。
ＳＩＬＶＡは、種々の研究による分子的方法を通じて回収された全てのフィーカリバクテリウム属の一種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を含むデータベースである。設計されたプライマーが試験され、このデータセット中のフィーカリバクテリウム属の一種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の７４．８５％を標的とするものであった。
したがって、本発明のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の特定の一実施形態においては、上記プライマーは、フィーカリバクテリウム属の一種の既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、好ましくはおよそ７５％の増幅を可能にする。特定の一実施形態においては、フィーカリバクテリウム属の一種の既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、本出願日の時点でＳＩＬＶＡデータベース中に含まれるものである。
ＳＩＬＶＡデータベースは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来の配列のみを含むが、プライマーとマッチし得る細菌種のゲノムのその他の部分が存在して、偽陽性の結果をもたらす場合があるので、プライマー特異性を、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome、NCBI BLAST: a better web interface. Johnson M et al. Nucleic Acids Res. 2008, 1;36(Web Server issue): W5-9）を使用することによって、検索を「細菌 ＮＯＴ
培養不可能（bacteria NOT uncultured）」に制限して更に試験した。得られた結果に
より、フィーカリバクテリウム属の一種についての特異性が確認された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏバリデーション
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで包含性／排他性試験を実施した。Ｆ．プラウスニッツイについて入手可能な９種の分離株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅することが可能であると実証されたプライマー及びプローブは、それぞれの系統群について特異的であった。さらに、同じ試験を標的となる種のものではないＤＮＡを用いて行って（排他性試験）、特異性を裏付けた（表１６、実施例を参照）。
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバーは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が系統群Ｉプローブ（配列番号３）とマッチする細菌配列であり、これは、表３に示されるプローブ設計のために使用される５個の配列及びＳＩＬＶＡデータベースにおいてマッチした１１９１個の配列を含み、それらのアクセッション番号は、表４に示されている（表３に列挙される配列はＳＩＬＶＡデータベースにおいてもマッチすると解釈されるが、ここでは繰り返さなかった）。このように、系統群Ｉのプローブ（配列番号３）は、１１９６個の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の全てと特異的にハイブリダイズすることが示された。
Figure 2022031644000003
Figure 2022031644000004
Figure 2022031644000005
Figure 2022031644000006
Figure 2022031644000007
Figure 2022031644000008
フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバーは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が系統群ＩＩプローブ（配列番号４）とマッチする細菌配列であり、これは、表５に示されるプローブ設計のために使用される１３個の配列及びＳＩＬＶＡデータベースにおいてマッチした２２３１個の配列を含み、それらのアクセッション番号は、表６に示されている（表５に列挙される配列はＳＩＬＶＡデータベースにおいてもマッチすると解釈されるが、ここでは繰り返さなかった）。このように、系統群ＩＩのプローブ（配列番号４）は、２２４４個の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の全てと特異的にハイブリダイズすることが示された。

Figure 2022031644000009
Figure 2022031644000010

Figure 2022031644000011
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Figure 2022031644000014
Figure 2022031644000015
Figure 2022031644000016
Figure 2022031644000017
有用な情報を取得する方法
第２の態様において、本発明は、ヒト被験体における腸疾患の検知、及び／又はヒト被験体における腸疾患の治療的処置における薬剤の効力の予測のための有用な情報を取得する方法であって、
ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を、第１の態様の方法に従って測定することを含み、上記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択されることが好ましい、方法に関する。
特定の一実施形態においては、本発明は、ヒト被験体の腸試料から有用な情報を取得する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定する工程と、
ｂ． 任意に、上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッ
ツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する工程と、
を含む、方法に関する。
もう１つの実施形態は、ヒト被験体の腸試料から有用な情報を取得する方法であって、上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定することを含む、方法に関する。更なる一実施形態は、ヒト被験体の腸試料から有用な情報を取得する方法であって、上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの存在量を測定することを含む、方法に関する。
上記情報は、被験体試料におけるＰＨＧＩの存在量、及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較した場合に、上記ヒト被験体における腸疾患を検知するために有用であるとすることができ、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる。ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の定量の上記使用及びその他の使用は、本明細書に記載される通りである。
腸疾患を検知する方法
第３の態様において、本発明は、ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、第１の態様に記載の方法により測定する工程と、
ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となり、好ましくは、上記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択され、かつ、
上記参照試料は、好ましくは、健康な被験体の試料及び／又は腸疾患の寛解状態にある患者の試料である、方法に関する。
好ましくは、本発明は、ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定する工程と、
ｂ． 任意に、上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する工程と、
ｃ． 被験体試料におけるＰＨＧＩの存在量、任意にＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる、方法に関する。
本明細書で使用される用語「腸疾患を検知する」は、疾患活動性及び／又は疾患進行のスクリーニング、診断、鑑別診断、及び／又は監視を含む。
特定の一実施形態においては、本発明は、ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定する工程と、
ｂ． 被験体試料の存在量レベルを、参照試料における存在量レベルと比較する工程と、を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、腸疾患の指標となる、方法に関する。
もう１つの特定の実施形態においては、本発明は、ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩの存在量を測定する工程と、
ｂ． 上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩＩの存在量を測定する工程と、
ｃ． 被験体試料におけるＰＨＧＩの存在量、ＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる、方法に関する。
本発明の特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量及びＰＨＧＩＩの存在量が測定される。もう１つの特定の実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量及びＰＨＧＩＩの存在量、並びに上記配列の間の数学的組み合わせ又は関係性（例えば、比率、多変量解析等）が測定される。更なる一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量及び／又はＰＨＧＩＩの存在量が測定されるだけでなく、これらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせ又は関係性（例えば、比率、多変量解析等）も測定される。
ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＦＴ及び／又はＥＣの存在量の間の比率は、第１の配列の定量レベルを、第２の配列の定量レベルによって割り算することによって得ることができる。例えば、ＰＨＧＩＩの存在量／ＰＨＧＩの存在量の比率は、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の定量レベルを、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の定量レベルによって割り算することによって得られる。
ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＦＴ及び／又はＥＣの存在量の間の比率は、第１の配列の定量レベルから、第２の配列の定量レベルを引き算することによっても得ることができる。例えば、ＰＨＧＩＩの存在量／ＰＨＧＩの存在量の比率は、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の定量レベルから、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の定量レベルを引き算することによって得られる。
本発明の好ましい比率は、ＰＨＧＩの存在量／ＰＨＧＩＩの存在量（ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ）、ＰＨＧＩの存在量／ＥＣの存在量（ＰＨＧＩ／ＥＣ）、ＰＨＧＩＩの存在量／ＥＣの存在量（ＰＨＧＩＩ／ＥＣ）、ＦＴの存在量／ＰＨＧＩの存在量（ＦＴ／ＰＨＧＩ）、及びＦＴの存在量／ＰＨＧＩＩの存在量（ＦＴ／ＰＨＧＩＩ）並びにその逆の比率である。特に好ましい比率は、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。
好ましくは、定量は、ｑＰＣＲ（以下に記載される）によって行われており、定量レベルは、サイクル閾値（Ｃｔ値）として表現される。より好ましくは、その比率は、引き算によって計算される。
特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量とＰＨＧＩの存在量との比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定され、上記被験体試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率が、参照試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率と比較され、ここで、被験体試料値にお
ける上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる。
当業者は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための幾つかの方法及び装置を認識している。その測定は、一般的に細菌遺伝子の定量によって行われる。用語「定量する」は、試料中の特定の核酸配列の量を測定する能力を指す。
標的核酸配列の量を測定する分子生物学的方法が当該技術分野でよく知られている。これらの方法として、限定されないが、エンドポイントＰＣＲ、競合的ＰＣＲ、逆転写酵素－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ｑＰＣＲ（ＲＴ-ｑ
ＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、ＤＮＡマイクロアレイ、ドットブロット又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ（ＦＩＳＨ）等のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、分岐鎖ＤＮＡ（Nolte, Adv. Clin. Chem., 1998, 33:201-235）及び上記方法の複合バージョン（例えば、Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009;15, 2066-2073を参照されたい）が挙げられる。腸内微生物叢を研究するための分子的アプローチに対するレビューについては、非特許文献４及びWeinstock B.M（Nature 2012, 489,250-256）も参照。マルチプレックスアッセイ
は、複数の分析物、一般に１２個以上の分析物を、アッセイの単独の実行／サイクルにおいて同時に測定するアッセイである。
好ましいプライマー及び／又はプローブは、典型的には、細菌核酸配列の量の増加に対して直接的な線形応答を提供することによって、予測可能に反応する。適切な標準を作製すること及びそれに対して比較することによって、試料中の所与の核酸配列の量を容易に定量することができる。好ましくは、遺伝子定量のための上記分子的方法は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＤＮＡマイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される。
或る１つの特に好ましい定量方法は、個々の細菌配列の直接的な定量のためプローブハイブリダイゼーションと蛍光顕微鏡検査、共焦点レーザー顕微鏡検査、又はフローサイトメトリーとを組み合わせた、ＦＩＳＨである。ＦＩＳＨの方法論のレビューについては、例えばHarmsen et al., Appl Environ Microbiol, 2002;68 2982-2990、Kalliomaki et al., J Allerg Clin Immunol, 2001;107 129-134、Tkachuk et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 1991;8: 67-74、Trask et al., Trends Genet., 1991;7 (5): 149-154、及びWeier et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 2002, 2(2):109-119、並びに米国特許第６，１７
４，６８１号を参照されたい。
別の特に好ましい定量方法は、リアルタイムＰＣＲとしても知られる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）である。種々の機器、例えばApplied Biosystems社製のＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ ＳＤＳ、ＧｅｎｅＡｍｐ ５７００ ＳＤＳ、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ ＨＴ ＳＤＳ、Bio-Rad社製のｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ、Cepheid社製のＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ、Corbett Research社製のＲｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ、Roche Molecular Biochemicals社製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、及びStratagene社製のＭｘ４０００ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを利用することができる。ｑＰＣＲプロセスは、反応の指数関数期の非常に初期段階でＰＣＲ産物の蓄積を測定することで、エンドポイントＰＣＲで生ずるＰＣＲ増幅効率に関係する定量におけるバイアスを減らすことによって、リアルタイムでのＰＣＲ産物の正確な定量を可能にする。リアルタイムＰＣＲは、当該技術分野で良く知られているので、本明細書では詳細に説明しない。ｑＰＣＲのための技術的概要及びプロトコルは、例えば、上述の供給業者、例えばhttp://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html、又はhttp://www.sigmaaldrich.com/life-science/molec
ular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.htmlから入手することがで
きる。ｑＰＣＲ法のレビューについては、Smith CJ and Osborn AM., FEMS Microbiol Ecol., 2009;67(1):6-20及びGiulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401を参照。好ま
しい一実施形態においては、定量法は、マルチプレックスｑＰＣＲである。
幾つかの遺伝子を、細菌定量の目的のために使用することができる。一般的に、特定の標的細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅によって定量される。１６Ｓ ｒＲＮＡは、それぞれの細菌種につき異なっている。細菌種を定義するのは困難であるが、しばしば操作的分類単位（ＯＴＵ）として定義される、少なくとも９７％の同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する生物として解釈される。約１．５キロベースの１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子配列は、細菌の分類群を区別する９個の短い超可変領域を有し、これらの領域の１つ以上の配列は、群集センサス（Weinstock B.M, Nature 2012, 489,250-256
）においてターゲティングされる。
タンパク質をコードする遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子を使用してもよい。Rouxら（FEMS Microbiol Ecol 78 (2011) 617-628）では、プライマーセットが入手可能な
５種のタンパク質マーカー遺伝子（ｒｐｌＢ、ｐｙｒＧ、ｆｕｓＡ、ｌｅｕＳ及びｒｐｏＢ）の、生態学的研究のための分類学的マーカーとしての使用が記載されている。特定の標的細菌定量の目的のためのヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子及びブチリル－ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子の使用も記載されている（非特許文献３０）。
種々の検知化学をｑＰＣＲのために利用可能である。それらの全ては、上述のｑＰＣＲ機器と一緒に使用することができる。用語「検知化学」は、リアルタイムＰＣＲにおいて特定のＰＣＲ産物の増幅を知らせる方法を指し、加水分解プローブ又はＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子ビーコン、スコーピオン、ハイブリダイゼーションプローブ、及びＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉを含み得る。これらは、例えばGiulietti et al., Methods 2001; 25, 386-401において詳細に記載される。
好ましい一実施形態においては、上記プローブは、二重標識オリゴヌクレオチド、例えば加水分解プローブ又は分子ビーコンである。該オリゴヌクレオチドの５’末端は、一般的に、蛍光レポーター分子で標識されているが、３’末端は、クエンチャー分子で標識されている。プローブの配列は、増幅される標的分子における対象となる領域に特異的である。より好ましい一実施形態においては、上記プローブは、配列の長さが５’蛍光体と３’クエンチャーとが蛍光を抑制するのに十分な近さとなるように設計される加水分解プローブである。
ｑＰＣＲプローブで使用する幾つかのレポーター分子及びクエンチャーは、当該技術分野で良く知られている。これらは、例えばhttps://www.eurofinsgenomics.eu/en/dna-rna-oligonucleotides/optimised-application-oligos/qpcr-probes.aspx:から入手可能である。説明の目的で、以下の表７は、網羅的でないが、ｑＰＣＲ分析のための二重標識プローブの一覧を提供する。
Figure 2022031644000018
好ましくは、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる。
特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３と特異的にハイブリダイズするフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を定量することによって行われる。その他の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む若しくはそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を定量することによって行われる。
もう１つの実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４と特異的にハイブリダイズするフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を定量することによって行われる。その他の一実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量は、配列番号４を含む若しくはそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を定量することによって測定される。好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われ、ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。
好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号
１若しくは配列番号２の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド分子、及び／又は配列番号３の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列のオリゴヌクレオチド分子を用いて行われる。好ましくは、配列番号１及び配列番号２の配列のオリゴヌクレオチド分子が使用される。
更なる好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる。
ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量が、配列番号１若しくは配列番号２の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド分子、及び／又は配列番号４の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列のオリゴヌクレオチド分子を用いて行われることが好ましい。好ましくは、配列番号１及び配列番号２の配列のオリゴヌクレオチド分子が使用される。
別の好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる。
好ましくは、本明細書に記載される上記の少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列は、それぞれの配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４のそれぞれ）と少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、１００％の配列同一性を有するヌクレオチド分子が特に好ましい。さらに、少なくとも７５％の同一性を有するこれらのオリゴヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド数を有していてもよく、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４よりも長くても、又はそれより短くてもよい。
特に好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、好ましくは、ｑＰＣＲによって、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、及び配列番号３のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる。更なる好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、好ましくは、ｑＰＣＲによって、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、及び配列番号４のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる。
上記オリゴヌクレオチド配列は、修飾されていてもよい。例えば、プローブは、それらのヌクレアーゼ分解に対する耐性を改善（例えば、末端封鎖によって）するように、検知リガンド（例えば、フルオレセイン）を有するように、又は固体担体へのそれらの捕捉を容易にするように（例えば、ポリデオキシアデノシン「テール」）修飾されていてもよい。
好ましい一実施形態においては、上記ＰＨＧＩ特異的プローブは、配列番号３又はその少なくとも７５％の同一性を有する修飾された配列からなる。好ましくは、該プローブは、上記の二重標識プローブ、より好ましくは加水分解プローブである。より好ましい一実施形態においては、配列番号３は、その５’末端において６ＦＡＭ（６－カルボキシフル
オレセイン）で修飾され、かつその３’末端においてＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１）で修飾されており、それは、６ＦＡＭ－ＴＡＡＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＧＣＡＴＣＧ－ＢＨＱ１として表される。
別の好ましい一実施形態においては、上記ＰＨＧＩＩ特異的プローブは、配列番号４又はその少なくとも７５％の同一性を有する修飾された配列からなる。好ましくは、該プローブは、二重標識プローブ、より好ましくは加水分解プローブである。より好ましい一実施形態においては、配列番号４は、その５’末端においてＪＯＥ（４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシ－５（６）－カルボキシフルオレセイン）で修飾され、かつその３’末端においてＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１）で修飾されており、それは、ＪＯＥ－ＴＡＡＧＣＣＣＡＣＲＧＣＴＣＧＧＣＡＴＣ－ＢＨＱ１として表される。
本発明の方法による腸試料におけるＰＧＨＩ及び／又はＰＧＨＩＩの存在量の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。上記腸試料は、腸生検材料であってもよい。例えば内視鏡検査により腸生検材料を得る幾つかの方法は、当該技術分野で良く知られている。好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、非侵襲的腸試料である。非侵襲的腸試料は、例えば非侵襲的方法、例えば直腸Ｓ状結腸鏡検査により得られる腸生検材料、そしてまた糞便試料であってもよい。より好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。
本発明の方法においては、ＤＮＡを、遺伝子定量の前に腸試料から抽出することが好ましい。試料回収後に、新鮮な試料を処理し、直ちにＤＮＡを抽出することができる。あるいは抽出前にＤＮＡの品質を保つために、凍結又はバッファー若しくはＤＮＡ安定化溶液との混合のような幾つかの処理が一般に知られている。ＤＮＡ抽出の前に、試料はまた、追加的な処理、例えば１回以上の洗浄サイクルに供されてもよい。
特定の一実施形態においては、上記腸試料は、生検試料であり、かつＤＮＡは、上記細菌配列の定量の前に上記試料から抽出される。好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料であり、かつＤＮＡは、上記細菌配列の定量の前に該糞便試料から抽出される。
生物学的試料からの幾つかのＤＮＡ抽出法は、当該技術分野で良く知られており、これらの全ての方法は、細胞の化学的若しくは機械的破壊、界面活性剤を用いた溶解、又はこれらのアプローチの組み合わせに基づくものである（Kennedy A. et al., PLoS One, 2014;9(2):e88982）。生検試料からのＤＮＡは、例えばＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Macherey-Nagel Gmbh& Co. KG社）を使用して抽出され得る。
糞便試料における細菌ＤＮＡの抽出方法は、例えばM Corist et al., Journal of Microbiological Methods, 2002; 50(2):131-139、Whitney D et al., Journal of Molecular
Diagnostics, American Society for Investigative Pathology, 2004;6(4):386-395、
及び国際公開第２００３／０６８７８８号から知られている。好ましい方法は、機械的破壊、例えば高速ビーズ破砕抽出、化学的溶解、及び好ましくはシリカ膜カラム、例えば市販のＤＮＡ抽出キット「ＭｏｂｉｏＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（商標）ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ」（Mo-Bio Laboratories Inc.社）、土壌法のためのＦａｓｔＤＮＡ（商標）ＳＰＩＮ Ｋｉｔ（MP biomedicals社）、及びＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｓｏｉｌ（Macherey-Nagel Gmbh& Co. KG社）に含まれるカラムを使用した最終精
製工程の組み合わせを使用する。糞便試料からのＤＮＡ抽出物中のＰＣＲ阻害物質、例えばビリルビン、胆汁酸塩及び複合炭水化物の存在は、糞便からのＤＮＡ抽出物においてＤＮＡバイオマーカーを測定する場合に直面する難点の１つである（Fleckna et al., Mol
Cell Probes, 2007;21(4):282-7）。好ましいＤＮＡ抽出法は、少量のＰＣＲ阻害物質、
例えば５％未満の、好ましくは２％未満の、より好ましくは１％未満の、更により好ましくは０．５％未満の、例えば０．２５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％未満のＰＣＲ阻害物質を有する糞便抽出物をもたらす方法である。
定量レベルは、絶対値であっても、又は相対値であってもよい。一般的に、存在量レベルが正規化されることが好ましい。正規化は、試料中の種々の測定に対して、例えば試料重量、ヒト細胞定量、全ＤＮＡ定量、総細菌の定量、総Ｆ．プラウスニッツイ定量又はその他のＦ．プラウスニッツイ系統群定量によって行うことができる。これらの方法は、当業者に良く知られている。
特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量レベルの定量はｑＰＣＲによって行われ、定量レベルは正規化される。好ましい一実施形態においては、正規化は、総細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量に対して、例えば１００万の細菌ｒＲＮＡ遺伝子コピー数に対する中央値ｌｏｇ１０の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数として行われる。幾つかのプライマー及びプローブは、総細菌の定量のために記載されており、例えばFuret J-P, et al. FEMS Microbiology Ecology 2009, 68:351-362、Corless et al., J Clin Microbiol. 2000, 38(5):1747-52、Suzuki et al., Appl Environ Microbiol. 2000, 66(11):4605-14、Bach et al., J Microbiol Methods. 2002, 49(3):235-45、Nadkarni et al., Microbiology. 2002, 148(Pt 1):257-66に記載されるものが参照される。
総細菌の定量のために好ましいプライマー及びプローブは、Furet J-P, et al. FEMS Microbiology Ecology. 2009;68:351-362に記載されるものであり、表１５に示されている（実施例を参照）。
本発明の方法は、腸疾患の１つ以上のバイオマーカーを検知及び／又は定量することを更に含むことができ、好ましくはこれらのマーカーは、ＩＢＤ又は特定のＩＢＤ表現型に特異的であり、より好ましくはこれらのマーカーは、ＵＣ又はＣＤに特異的であり、更により好ましくはこれらのマーカーは、ＣＤに特異的である。ＩＢＤバイオマーカー並びにその分類及び診断への影響は、例えば非特許文献２、及び非特許文献３９に記載されている。
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」は、容易に測定可能な身体試料に典型的にみられる物質である、疾患のマーカーを指す。上記身体試料は、例えば血液試料、血漿試料又は糞便試料であってもよい。一般的に、測定された量は、基礎をなす病態生理学、例えば特定のＩＢＤ疾患又は表現型の存在又は不存在に相関し、こうして、その量は疾患進行又は処置の効果を診断及び測定するのに有用となる。バイオマーカーという用語は、遺伝子マーカー及び血清学的マーカーを含む生物物理的測定及び生化学的測定を含む。
例えば、抗サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）抗体（ＡＳＣＡ）、抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）、抗ＯＭＰＣ抗体並びに抗Ｉ２抗体及び抗ＣＢｉｒ１フラジェリン抗体のような血清学的バイオマーカーを使用してもよい。他の著者により、ＡＳＣＡ、ＡＮＣＡ、抗ＯｍｐＣ及び抗Ｉ２の組み合わせがＣＤの下位分類に役立つことがあることが報告され、特にこれらの血清学的マーカーが、手術の必要性を含む、特に複雑かつ過酷な疾患挙動と関連していることが報告された。ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、ＭＤＲ１遺伝子、ＤＬＧ５遺伝子又はＴＬＲ４遺伝子のような遺伝子マーカーを使用してもよい。
微生物叢バイオマーカーを使用してもよい。特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量は、白血球数と組み合わせて使用される。ＣＤ及びＵＣは、Ｆ．プラウスニッツイの存在量と一緒に糞便白血球数を監視することによって鑑別するこ
とができると以前に報告されている（非特許文献２４）。特に好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量は、エシェリキア・コリの存在量と組み合わせて使用される。非特許文献２２では、Ｆ．プラウスニッツイの存在量とエシェリキア・コリの存在量との組み合わせの、補足的な対比指標としての使用が記載された。
特定の一実施形態においては、本発明の方法は、総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の定量を更に含む。ＦＴの存在量の測定は、配列番号５及び配列番号６の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号７の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行うことができる。同様に、ＥＣの存在量の測定は、配列番号１４及び配列番号１５の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号１６の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行うことができる。
好ましくは、本明細書に記載される上記の少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列は、それぞれの配列（例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１４、配列番号１５及び／又は配列番号１６のそれぞれ）と少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、１００％の配列同一性を有するヌクレオチド分子が特に好ましい。
本発明の方法においては、上記参照試料は、個体試料又は参照集団の試料のコレクションであってもよい。参照集団は、一般的に、本発明の方法に示される使用に応じて選択され、例えば診断のためには、上記参照集団は、一般的に健康な被験体又は寛解状態にある患者であることとなるが、一方で疾患の活動性又は進行を測定するためには、該参照集団は、一般的に、同じ患者の以前の時点、例えば診断時又は寛解状態時点であることとなる。
腸疾患という用語は、小腸、結腸及び／又は直腸を冒す疾患を指す。好ましくは、上記腸疾患は、ＣＲＣ、ＩＢＳ及びＩＢＤからなる群から選択される。特定の一実施形態においては、上記腸疾患は、ＣＲＣである。もう１つの特定の実施形態においては、上記腸疾患は、ＩＢＳである。好ましい一実施形態においては、上記腸疾患は、ＩＢＤである。
本発明の方法は、腸疾患のスクリーニング若しくは早期検知のために、腸疾患の診断のために、疾患活動性の測定のために、腸疾患進行及び／又は活動性の監視のために、腸疾患の回帰の監視のために、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するために、及び／又は腸疾患への処置の効力を測定するために使用することができる。
好ましい実施形態においては、本発明の方法は、ＩＢＤのスクリーニング若しくは早期検知のために、ＩＢＤの診断のために、ＩＢＤの進行の監視のために、ＩＢＤの回帰の監視のために、及び／又はＩＢＤの術後再発を監視するために、及び／又はＩＢＤへの処置の効力を測定するために使用される。
ＩＢＤは、患者が疾患の症状を呈する期間（再燃）と、患者が症状を呈さず寛解状態にある他の期間とが交互に起こる。患者が寛解期となった後に症状を呈した場合に、患者は回帰を呈する。疾患の存在を検知する試験は、回帰を検知することも可能にし得る。
ＩＢＤ患者に適用することができる利用可能な処置の１つは、腸内の罹患領域の切除術である。術後再発という表現は、処置が不成功に終わり、一定の期間の後に患者が再びＩＢＤに罹患している状況を指す。疾患の存在を検知する試験は、術後再発を検知すること
も可能にし得る。
より好ましい一実施形態においては、本発明の方法は、腸疾患、好ましくはＩＢＤのスクリーニング及び／又は診断のために使用される。好ましくは、上記参照試料は、健康な被験体の試料及び／又は腸疾患の寛解状態にある被験体の試料である。健康な被験体は、腸疾患に罹患していない被験体、好ましくはＩＢＤに罹患していない被験体、より好ましくはＣＤ又はＵＣに罹患していない被験体として定義される。健康な患者からの上記試料は、例えば様々な理由、例えば直腸出血、ＣＲＣ家族歴又は腹痛のために結腸鏡検査を受けた患者から得ることができる。好ましい一実施形態においては、上記参照試料は、同じ被験体の寛解状態の試料である。
本発明による健康な消化状態の測定のためのバイオマーカーは、実施例１４及び１５に示されている。健康な消化状態の測定のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ／ＥＣ、ＰＨＧＩＩ／ＥＣ、ＦＴ／ＰＨＧＩ、及びＦＴ／ＰＨＧＩＩである。ＰＨＧＩ／ＥＣ、ＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率は、実施例１４における健康な患者からの試料において低下することが示されており、その一方でＦＴ／ＰＨＧＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩＩは、実施例１５におけるＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であることが示された。
当業者は、正しい診断の確立は、より精密な予後を提供し、各々の疾患又は疾患サブタイプのために最も適切な予防的処置又は治療的処置を選択することを可能にするのみならず、特定の処置の効力を予測することさえも可能にするということを認識している。特定の一実施形態においては、本発明の方法は、予後目的のために使用される。もう１つの実施形態においては、本発明の方法は、最も適切な予防的処置又は治療的処置を選択するために使用される。更なる一実施形態においては、本発明の方法は、所定の予防的処置又は治療的処置の効力又は有用性を予測するために使用される。好ましくは、上記処置は、治療的処置である。
本発明によるＩＢＤ、ＣＤ及び／又はＵＣのスクリーニング及び／又は診断のためのバイオマーカーは、実施例１４及び１５に示されている。ＩＢＤのスクリーニング及び／又は診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。ＩＢＤで存在量が減少するのがＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩであり、ＩＢＤで増大するのがＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率である。ＩＢＤは、ＵＣ又はＣＤであってもよい。特定の一実施形態においては、上記ＩＢＤはＵＣである。ＵＣのスクリーニング及び／又は診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。ＵＣで存在量が減少するのがＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩであり、ＵＣで増大するのがＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率であり、好ましくはＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。好ましい一実施形態においては、上記ＩＢＤはＣＤである。ＣＤのスクリーニング及び／又は診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。ＣＤで存在量が減少するのがＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩであり、ＣＤで増大するのがＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣであり、好ましくはＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。
一般的に、ＣＤは、結腸近位疾患、会陰疾患、瘻孔、組織学的肉芽腫、及び粘膜限局疾患と対照的な全層によってＵＣとは区別される。一般的に、ＣＤにおいては、肉芽腫は、患者の５０％までに認められ、瘻孔は２５％に認められる。以下の世界胃腸学組織の国際ガイドライン（非特許文献１）からの表７に、ＵＣ及びＣＤについての最新の診断基準に対する概要が示されている。
Figure 2022031644000019
さらに、ＵＣとＣＤとを鑑別するための特徴は、世界胃腸学組織の国際ガイドライン（非特許文献１）からの以下の表９に示されている。
Figure 2022031644000020
更なる一実施形態においては、腸疾患を検知する本発明の方法は、ＣＤとＵＣとの鑑別診断方法である。本発明によるＣＤとＵＣとの鑑別診断のためのバイオマーカーは、実施例１４及び１５に示されている。ＣＤとＵＣとの鑑別診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析によって特定されたＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、並びにＣＤで増大するＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率である。
サブタイプ分類は、一般的に、国際分類を使用して、例えば１９９１年ローマ、１９９８年ウィーン又は２００５年モントリオールのレポートにおける国際ワーキンググループにより発行された国際分類を使用して行われる。好ましくは、ＩＢＤサブタイプは、モントリオール分類（モントリオール分類についての更なる詳細は以下に示す）に従って決定される。
好ましい一実施形態においては、ＵＣ患者は、結腸直腸炎の範囲によって、以下のサブタイプ：
Ｅ１：潰瘍性直腸炎：直腸に限局された病変、
Ｅ２：遠位大腸炎：脾彎曲部に対して遠位の結腸直腸の部分に限局された病変、及び、
Ｅ３：広汎性潰瘍性大腸炎又は潰瘍性全大腸炎：脾彎曲部に対して近位に拡張する病変、において分類される。
もう１つの好ましい実施形態においては、ＣＤ患者は、疾患部位に応じて以下のサブタイプ：回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）に分類される。
本発明によるＩ－ＣＤ、ＩＣ－ＣＤ及びＣ－ＣＤの検知のためのバイオマーカーは、実施例１６に示されている。Ｉ－ＣＤの検知のための特に好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であると示されたＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、及びＦＴ／ＰＨＧＩＩである。ＩＣ－ＣＤの検知のための好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であると示されたＦＴ／ＰＨＧＩである。好ましくは、上記比率は、上記及び実施例に記載されるように引き算によって計算された。特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量が測定され、かつ被験体試料における上記参照試料に対するＰＨＧＩの存在量レベルの有意な低下が、ＣＤの、好ましくは回腸病変を伴うＣＤ（ＩＣ－ＣＤ又はＩ－ＣＤ）の指標となる。
Ｃ－ＣＤの検知のための特に好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であると示されたＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ、好ましくはＰＨＧＩ及びＰＨＧＩ／ＥＣである。好ましくは、上記比率は、上記及び実施例に記載されるように引き算によって計算された。
もう１つの特定の実施形態においては、ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩの比率が測定され、かつ被験体試料値における上記参照試料に対する有意差が、ＣＤの、好ましくは結腸病変を伴うＣＤ（Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤ）の指標となる。
更なる特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩ存在量及びＰＨＧＩＩ存在量が測定され、かつＰＨＧＩＩの有意な低下がありＰＨＧＩの有意な低下がないことが、Ｉ－ＣＤの指標となる。
本発明の方法はまた、本明細書に記載されるＰＨＧＩ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量及び／又は更なるバイオマーカー検知及び／又は定量の結果と、腸疾患、好ましくはＩＢＤのその他の指標とを組み合わせることを含んでいてもよい。
ＩＢＤの診断は、一般的に、臨床評価及び研究室検査、内視鏡検査、組織学的検査又は画像ベースの検査の組み合わせによって確認される。これらの臨床検査、研究室検査、内視鏡検査、組織学的検査及び画像ベースの検査の結果の単独又は組み合わせは、ＩＢＤの指標となり得る。臨床検査は、一般的に、内視鏡検査、組織病理学試験、並びに超音波、磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法、バリウム透視検査及び／又は同位体標識スキャン（Mowat et al., Gut 2011, 1-37）を含む画像試験である。
研究室検査には、全血算定、尿素及び電解質、肝機能試験、赤血球沈降速度、Ｃ反応性蛋白、フェリチン、トランスフェリン飽和度、ビタミンＢ１２及び葉酸塩が含まれ得る。
好ましくは、上記研究室検査には、糞便検査が含まれる。ＩＢＤ診断のために通常使用される糞便検査は、下痢の細菌性、ウイルス性又は寄生虫性の原因を除外するために通常の検便及び培養であり、とりわけクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）又はサイトメガロウイルス感染を除外するために、潜血又は糞便白血球、カルプロ
テクチン、ラクトフェリン及びα１－アンチトリプシンが確認される。
特定の一実施形態においては、本発明の方法は、糞便のカルプロテクチン試験と組み合わせて使用される。カルプロテクチンは、ＩＢＤを含む感染状態及び炎症状態において著しく高まる血漿及び糞便の両方に見られる豊富な好中球タンパク質である。ＩＢＤにおける腸炎症のバイオマーカーとしての糞便のカルプロテクチンの役割は、以前に記載されている（例えば、Konikoff and Denson, Inflamm Bowel Dis. 2006;12(6):524-34、又はVan
Rheenen et al. BMJ 2010;341:c3369を参照）。
疾患活動性を評価するために使用される指標は幾つか存在し、これらの指標は、例えば、有効な臨床指標：クローン病活動性指標（ＣＤＡＩ）（Best, W.R., et al. Gastroenterology, 1976. 70(3): p. 439-44）、Ｈａｒｖｅｙ－Ｂｒａｄｓｈａｗ指標（Lancet. 1980;315 (8167):514）、Ｍａｙｏ指標（Pineton de Chambrun, G., L. et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010. 7(1): p. 15-29）、肛門周囲疾患活動性指数（ＰＤＡＩ）、瘻孔ドレナージ評価、クオリティーオブライフスコア：炎症性腸疾患質問票（ＩＢＤＱ）、及び内視鏡指標：クローン病の内視鏡的重症度指標（ＣＤＥＩＳ）／クローン病のための単純内視鏡スコア（ＳＥＳ－ＣＤ）、術後再発のためのＲｕｔｇｅｅｒｔｓスコア（Sostegni et al., Aliment Pharmacol Ther. 2003;17 Suppl 2:11-7を参照）であっても
よい。特に、ＵＣに関しては、例えばＴｒｕｅ ｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓの指標（Journal of Crohn's and colitis 2008; 2:1-23）又はＳｕｔｈｅｒｌａｎｄの疾患活動性指標
（Sutherland et al. Gastroenterology 1987;92:1894-8）を参照、そしてＣＤに関して
は、例えばＨａｒｖｅｙ－Ｂｒａｄｓｈａｗの簡略化されたクローン病活動性指標（Lancet. 1980;315 (8167):514）を参照。
更なる一態様においては、本発明は、疾患活動性（すなわち、２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチンレベル）を測定する方法であって、上記態様で規定される工程ａ）及びｂ）を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、活動性の腸疾患の指標となる、方法に関する。
本発明によるＩＢＤ、ＵＣ又はＣＤにおける疾患活動性を検知するためのバイオマーカーは、実施例１８に示されている。ＣＤにおける疾患活動性を検知するための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩＩ／ＥＣである。ＲＯＣ曲線により良好な識別因子であると示されたのがＰＨＧＩであり、活動性のＣＤで存在量が減少するのがＰＨＧＩＩであり、及び増大するのがＰＨＧＩＩ／ＥＣ比である。他方で、ＵＣにおける疾患活動性を検知するための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＦＴ／ＰＨＧＩ、及びＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩである。活動性のＵＣで存在量が減少するのがＰＨＧＩであり、ＲＯＣ曲線により良好な識別因子であると示されたのがＰＨＧＩＩであり、低下するのがＦＴ／ＰＨＧＩ比であり、低下するのがＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ比であり、増大するのがＰＨＧＩ／ＥＣ比である。ＣＤ疾患のためのＰＨＩＩ、及びＵＣ疾患のためのＰＨＩは、疾患活動性（すなわち、２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチンレベル）についての完璧な識別因子であると思われる。
関連する一態様においては、本発明は、ヒト被験体における腸疾患の活動性を監視する方法であって、上記態様で定義される工程ａ）及びｂ）を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、活動性の腸疾患の指標となり、かつ上記参照試料は、好ましくは同じ被験体の以前の試料（例えば、診断時又は寛解状態時点）である、方法に関する。
これらの態様のいずれの場合にも、上記腸疾患は、好ましくは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択され、より好ましくはＩＢＤである。特定の一実施形態においては、ＦＴ存在量及び／又はＥＣ存在量との上記数学的組み合わせは、ＰＨＧＩ存在量／ＥＣ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量／ＥＣ存在量、ＦＴ存在量／ＰＨＧＩ存在量、及びＦＴ存在量／ＰＨＧＩＩ存在量からなる群から選択される比率である。好ましくは、存在量の測定は、ｑＰＣＲによって行われ、サイクル閾値（Ｃｔ）として表現され、上記比率は、１番目のＣｔ値から２番目のＣｔ値を引き算することによって得られる。
本発明による疾患活動性の監視のためのバイオマーカーは、実施例１９に示されている。ＵＣにおける疾患活動性の監視（すなわち、２つの時点の間で高まる炎症活動性の測定
）のための特に好ましいバイオマーカーは、減少するＰＨＧＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩ比である。
現在、ＩＢＤの管理のために幾つかの処置が利用可能である。ほとんどの適切な処置は、一般に、疾患部位、重症度及び活動性に応じて選択されることとなる。現在使用される一般的な薬物療法は、サリチル酸から誘導される抗炎症化学薬品（すなわち、メサラジン及びスルファサラジン）、コルチコステロイド類（すなわち、プレドニゾン、メチルプレドニゾン及びブデゾニド）、抗生物質（すなわち、メトロニダゾール及びシプロフロキサシン）、免疫抑制剤（すなわち、アザチオプリン及びメルカプトプリン）、代謝拮抗物質及び抗葉酸剤のメトトレキサート、並びに、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、エタネルセプト及びゴリムマブからなる、いわゆる「生物学的」薬物である。劇症又は瘻孔を伴うＣＤ患者において、そして上述の投薬のいずれにも反応しない患者（難治性の事例）については、腸切除も指摘される。最近では、難治性疾患を伴うＣＤ患者における満たされない治療ニーズが継続することで、自家造血幹細胞移植を含む革新的な細胞免疫調節医学及び再生医学への関心が高まった。また増えゆく文献は、プロバイオティクス又はプレバイオティクスがディスバイオシスを均衡することによりＩＢＤにおける治療効果を有し得ることを示唆する新しく浮上しつつある構想を支持している。例えば、動物モデルにおける研究は、腸微生物叢の幾つかの種、例えばバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）及びＦ．プラウスニッツイが、大腸炎を抑える分子又は抗炎症効果を有する分子をそれぞれ産生することが可能であることを指摘しており、そのことは、この腸障害における治療薬としての腸微生物叢の将来的な使用に新たな光を投げかけている。好ましい処置は、メサラジン、中程度の免疫抑制剤、例えばアザチオプリン又はメトトレキサート、及び抗ＴＮＦα剤、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、エタネルセプト及びゴリムマブである。
さらに、本発明は、処置の効力を予測する方法を提供する。特定の一実施形態は、ＩＢＤに罹患しているヒト被験体における処置の効力を予測する方法であって、
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、第１の態様の方法により測定することと、ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較することと、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、該処置に対する応答の可能性が増大した指標となる、方法に関する。
関連した一態様においては、本発明は、ＩＢＤに罹患している被験体を処置に対するレスポンダーとして分類するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明の上記態様の工程ａ）及びｂ）を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、該処置に対する高められた応答の可能性の指標となり、かつ高められた応答の可能性を有する被験体が、レスポンダーとして分類される、方法に関する。更なる関連した一態様においては、本発明は、ＩＢＤに罹患している被験体の処置を選択する方法であって、上記態様において記載した処置に対するレスポンダー又はノンレスポンダーとして被験体を分類し、上記処置をレスポンダーのために選択することを含む、方法に関する。
上記処置は、先に列挙されたいずれであってもよい。特定の一実施形態においては、上記処置は、抗ＴＮＦα剤によるものである。好ましくは、上記参照試料は、健康な被験体の試料又は腸疾患の寛解状態にある患者の試料である。その他の好ましい特徴及び実施形
態は、本発明のその他の態様について先に定義された通りである。
本発明によるＴＮＦα処置に対する応答の測定のためのバイオマーカーは、実施例２０に示されている。被験体のＴＮＦα処置のレスポンダー又はノンレスポンダーとしての分類のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩである。実施例２０において、ＰＨＧＩのＣｔが、ＵＣ及びＣＤのノンレスポンダーにおいて高まり（それぞれ２６．８０％及び５３．９４％）、ＰＨＧＩＩのＣｔが、ＵＣのノンレスポンダーにおいて６６．８２％高まることが観察された。
本明細書で使用される用語「レスポンダー」とは、ＩＢＤ（例えば、ＣＤ又はＵＣ）に罹患している被験体であって、生物学的処置の導入後に炎症の低下を示す、すなわち２５０μｇ／ｇ未満のカルプロテクチンレベルの減少を示す、被験体を指す。本明細書で使用される用語「導入」とは、種々の処置投与量が与えられて治療用量に達する時点を指す。
他方で、処置は、手術を基礎とするものであってもよい。好ましくは、該処置は、薬物療法と手術との組み合わせである。ＵＣは、一般的に手術により治癒可能である。しかしながら、切除術は、しばしばＣＤを治癒せず、再発が常である。ＩＢＤにおける外科的介入には、とりわけ以下：
・ ＵＣ：回腸造瘻術を伴う直腸結腸切除術、回腸肛門吻合術を伴う全直腸結腸切除術、・ 劇症大腸炎：選択される外科的処置は、終末型回腸瘻及びハルトマン窩作成を伴う結腸亜全摘術である、
・ ＣＤ：該疾患の疾患合併症の場合には、手術が最も一般的に行われ、それは一般に、将来的に追加の手術が必要とされる場合に腸の長さを保つための保存的切除（例えば、潜在的な狭窄形成術対切除術）からなる、
・ 遠位回腸疾患又は近位結腸疾患を伴う選択された患者：回腸直腸吻合術又は回腸結腸吻合術に対する選択肢、
・ 重症の肛門周囲瘻：迂回回腸造瘻術に対する選択肢、一般に、症候性の腸－腸瘻孔のための切除、
が含まれる。
本発明はさらに、腸疾患を伴う被験体を処置する方法であって、本明細書に記載される腸疾患の検知のための本発明の方法工程を含み、さらにｃ）この被験体に処置を施すことを含む、方法を提供する。好ましくは、上記処置は、抗ＴＮＦα剤である。
本発明はまた、腸疾患を伴う被験体を処置する方法であって、被験体をレスポンダー又はノンレスポンダーとして分類するための本発明の方法工程を含み、さらにｃ）レスポンダーである被験体に処置を施すことを含む、方法を提供する。好ましくは、上記処置は、抗ＴＮＦα剤である。
好ましくは、本発明の方法はさらに、該方法の結果をデータ媒体に記録することを含む。一実施形態においては、上記データ媒体は、紙シートである。好ましい一実施形態では、上記データ媒体は、コンピュータ可読媒体である。本明細書で使用される「コンピュータ可読媒体」は、本発明の方法の判定結果を含み、保存し、通信し、伝搬し、又は輸送し得る任意の装置であってもよい。該媒体は、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、又は半導体のシステム（又は装置若しくはデバイス）、又は伝搬媒体であってもよい。
感度、特異度、及び精度又はそれらの組み合わせは、試験の妥当性又は性能を説明するために一般的に使用されるパラメータである。特に、それらは、その方法がどれほど良好であり、かつ信頼することができるものであるかを定量するために使用される。
本発明の方法は、７０％～９０％、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～１００％、又は９０％～１００％の感度を有することが好ましい。本発明の方法は、少なくとも８５％、例えば約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９９％、又は１００％の感度値を有することがより好ましい。
本発明の方法は、７０％～９０％、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～１００％、又は９０％～１００％の特異度を有することが好ましい。本発明の方法は、少なくとも８５％、例えば約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９９％、又は１００％の特異度値を有することがより好ましい。
好ましい一実施形態においては、本発明の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検知する方法は、少なくとも６０％の、少なくとも６５％の、少なくとも７０％の、少なくとも７５％の、少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９７．５％の、又は好ましくは１００％の感度及び／又は特異度をもって統計学的に有意に、進行を診断し、早期検知し、測定し、回帰を測定し、再発を測定し、及び／又は処置の効力を測定する。
本発明の方法の精度は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、又は好ましくは１００％が好ましい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、７０％～９０％、７５％～９５％、８０％～９５％、８５％～１００％、又は９０％～１００％の精度を有する。本発明の方法は、少なくとも８５％、例えば約８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９９％、又は１００％の精度値を有することが好ましい。
感度、特異度及び精度のパラメータは比率であるため、一致する信頼区間は、当該技術分野で良く知られた比率についての標準的方法を使用することによって計算することができる。比率を中心に２種類の９５％の信頼区間が一般的に定義される。正確な信頼区間が、二項分布を使用することによって定義されることで、正確な推定値に至る。漸近信頼区間は、標本分布を正規近似と仮定して計算される。当業者は、適切な信頼区間をどのように定義するかを認識しているであろう。一方の種類、又はもう一方の種類の信頼区間を選択することは、一般的に、標本比率が正規分布に対して良好な近似であるかどうかに依存することとなる。
精度は、好ましくは、ＲＯＣ曲線下面積によって測定される。「ＲＯＣ曲線」は、感度及び特異度の両方の関係のグラフ表示であり、スクリーニング検査に対する最善の閾値（最適カットポイント）の決定により最適なモデルを決定することを補助する。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、検査の精度を測定する方法を提供する。本発明の方法のＡＵＣの範囲の値は、好ましくは０．６～１、より好ましくは０．７～１であり、より好ましい値は０．７５～１、より好ましくは０．８～１又は０．９～１の範囲である。好ましい実施形態においては、ＡＵＣは、０．７から０．９まで、０．７から０．９５まで、０．７５から０．９まで、０．７５から０．９５まで、０．８から０．９まで、０．８から０．９５まで、０．８５から０．９まで、又は０．８５から０．９５までである。
好ましい一実施形態においては、本発明の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検知する方法は、少なくとも０．６の、少なくとも０．６５の、少なくとも０．７の、少なくとも０．７５の、少なくとも０．８の、少なくとも０．８５の、少なくとも０．９の、少なくとも０．
９５又はそれより高いＡＵＣ値をもって統計学的に有意に、進行を診断し、早期検知し、測定し、回帰を測定し、再発を測定し、及び／又は処置の効力を測定する。
腸疾患の検知のためのバイオマーカーとしてのＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の使用
更なる一態様においては、本発明は、ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせの、腸疾患の検知のための、及び／又は腸疾患の処置における薬剤の効力を予測するためのバイオマーカーとしての使用に関する。
特定の一実施形態においては、本発明は、ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量の、任意にフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量と一緒の（それらの任意の数学的組み合わせを含む）、腸疾患の検知のためのバイオマーカーとしての使用に関する。本発明の方法による腸試料におけるＰＧＨＩ及び／又はＰＧＨＩＩの存在量の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量は、上記ヒト被験体の腸試料におけるＰＨＧＩＩの存在量と組み合わせて（それらの任意の数学的組み合わせを含む）使用され、好ましくは、ＰＨＧＩＩの存在量、及びＰＨＧＩの存在量の比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定される。
上述のように、当業者は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定する幾つかの方法及び装置を認識している。更なる詳細は、先に示されている。
好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる。
また上記のように、幾つかの遺伝子を、細菌定量の目的のために使用することもできる。好ましくは、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる。特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。もう１つの実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって測定される。好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われ、ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定のための好ましいオリゴヌクレオチド、検知化学薬品及び定量方法の好ましい実施形態は、先に示されている。
上記腸試料は、腸生検材料であってもよい。好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、非侵襲的方法、例えば直腸Ｓ状結腸鏡検査により得られる腸生検材料である。別の好ましい実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。試料の処理において好ましい実施形態は、先に示されている。
好ましくは、上記腸疾患は、ＣＲＣ、ＩＢＳ及びＩＢＤからなる群から選択される。好ましい実施形態においては、上記腸疾患は、ＩＢＤであり、好ましくは上記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）であり、より好ましくは上記ＩＢＤは、ＣＤである。上記腸疾患の診断、分類、及び処置における更なる詳細は、先に示されている。
好ましい実施形態においては、腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量は、腸疾患の進行をスクリーニング、診断、監視するための、腸疾患の回帰を監視するための、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するための、及び／又は腸疾患に対する処置の効力を測定するための、好ましくは腸疾患をスクリーニング又は診断するためのバイオマーカーとして使用される。
ヒト被験体の腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の、腸疾患の検知のためのバイオマーカーとしての使用における更なる詳細、及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様で示される通りである。
腸疾患を検知するためのキット
本発明の更なる一態様は、本発明の第３の態様で記載される方法により腸疾患を検知するためのキットであって、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定するための試薬と、
－ 任意に、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するための試薬と、
－ 上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料からＰＨＧＩ及び任意にＰＨＧＩＩの存在量レベルを測定するための説明書と、
を含む、キットに関する。
本発明はさらに、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定するための、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬、及び／又は、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するための、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬と、
－ 任意に、上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料からＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための説明書と、
を含むキットを提供する。
好ましくは、上記腸試料は、糞便試料である。
上記キットは、疾患活動性をスクリーニング、診断、測定するために、活動性及び／又は進行を監視するために、回帰を監視するために、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するために、及び／又は腸疾患に対する処置の効力を測定するために、好ましくは腸疾患をスクリーニング及び／又は診断するために使用することができる。したがって、本発明はさらに、本明細書に記載されるキットの、腸疾患の検知のための、腸疾患の処置における薬剤の効力を予測するための、及び／又はＩＢＤ表現型の鑑別診断のための使用に関する
。
ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための試薬は、本発明の上記態様について先に記載される通りである。
特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される。
別の特定の一実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量を測定するための上記試薬は、－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される。
好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量を測定するための上記試薬及びＰＨＧＩＩの存在量を測定するための上記試薬は、本発明の上記態様について先に定義された特定の実施形態における試薬である。
好ましい一実施形態においては、上記キットは、ＤＮＡ抽出手段、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅を実施するための手段、検知手段、及び／又は生物学的試料を回収及び／又は保持するための１個以上の容器を更に含んでいてもよい。
本発明のキットは、データを正規化するための参照試薬を更に含んでよく、好ましくは、その際、上記試薬は、総細菌の定量のためのプライマー及び／又はプローブである。定量データの正規化についての更なる詳細は、先に示されている。
好ましくは、上記腸疾患は、ＣＲＣ、ＩＢＳ及びＩＢＤからなる群から選択される。好ましい実施形態においては、上記腸疾患は、ＩＢＤであり、好ましくは上記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）であり、より好ましくは上記ＩＢＤは、ＣＤである。上記腸疾患の診断、分類、及び処置における更なる詳細は、先に示されている。
腸疾患の検知のための本発明のキットの更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様について示される通りである。
本発明の核酸配列
本発明の更なる一態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される配列、又はその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する。好ましくは、上記の少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４と少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。さらに、少なくとも７５％の同一性を有するこれらのヌクレオチド配列は、同じオリゴヌクレオチド数を有していてもよく、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４よりも長くても、又はそれより短くてもよい。
特定の一実施形態において、上記核酸分子は、配列番号１又はその少なくとも８０％の同一性を有する配列、配列番号２又はその少なくとも９０％の同一性を有する配列、配列番号３又はその少なくとも８０％の同一性を有する配列、及び配列番号４又はその少なくとも８５％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を有する。
上記核酸分子は、本発明の方法においてプライマー又はプローブとして使用することができ、かつ上記のように修飾されていてもよい。更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様について示される通りである。
腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定方法
この節は、本発明の第１の態様に属する追加の実施形態を示す。特定の一実施形態は、被験体からの腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する方法であって、上記測定は、１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われ、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われ、かつＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、方法に関する。
上述のように、当業者は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための幾つかの方法及び装置を認識している。更なる詳細は、先に示されている。
好ましい実施形態においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法で行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる。
好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１若しくは配列番号２の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド分子、及び／又は配列番号３の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列のオリゴヌクレオチド分子を用いて行われる。好ましくは、配列番号１及び配列番号２の配列のオリゴヌクレオチド分子が使用される。
更なる好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる。
ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量が、配列番号１若しくは配列番号２の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド分子、及び／又は配列番号４の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列のオリゴヌクレオチド分子を用いて行われることが好ましい。好ましくは、配列番号１及び配列番号２の配列のオリゴヌクレオチド分子が使用される。
もう１つの好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号４のオリゴヌクレオチド
配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる。
好ましくは、上記の少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４と少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。さらに、少なくとも７５％の同一性を有するこれらのヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド数を有していてもよく、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び／又は配列番号４よりも長くても、又はそれより短くてもよい。
より具体的には、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、好ましくは、ｑＰＣＲによって、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号３のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる。また、ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、好ましくは、ｑＰＣＲによって、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号４のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる。
上記オリゴヌクレオチド配列は、修飾されていてもよい。好ましい一実施形態においては、上記ＰＨＧＩ特異的プローブは、配列番号３又はその少なくとも７５％の同一性を有する修飾された配列からなる。好ましくは、該プローブは、二重標識プローブ、より好ましくは加水分解プローブである。より好ましい一実施形態においては、配列番号３は、その５’末端において６ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）で修飾され、かつその３’末端においてＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１）で修飾されており、それは、６ＦＡＭ－ＴＡＡＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＧＣＡＴＣＧ－ＢＨＱ１として表される。
別の好ましい一実施形態においては、上記ＰＨＧＩＩ特異的プローブは、配列番号４又はその少なくとも７５％の同一性を有する修飾された配列からなる。好ましくは、該プローブは、二重標識プローブ、より好ましくは加水分解プローブである。より好ましい一実施形態においては、配列番号４は、その５’末端においてＪＯＥ（４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシ－５（６）－カルボキシフルオレセイン）で修飾され、かつその３’末端においてＢＨＱ１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１）で修飾されており、それは、ＪＯＥ－ＴＡＡＧＣＣＣＡＣＲＧＣＴＣＧＧＣＡＴＣ－ＢＨＱ１として表される。
好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量レベルは、上記のように正規化される。好ましくは、正規化は、総細菌の定量に対して行われる。
ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の定量方法、検知化学薬品及びその他の特記事項における更なる詳細は、先に示される通りである。
本発明の方法による腸試料におけるＰＧＨＩ及び／又はＰＧＨＩＩの存在量の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。上記腸試料は、腸生検材料であってもよい。例えば内視鏡検査により腸生検材料を得るための幾つかの方法は、当該技術分野で良く知られている。好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、非侵襲的腸試料である。非侵襲的腸試料は、非侵襲的方法、例えば直腸Ｓ状結腸鏡検査により得られる腸生検材料、そしてまた糞便試料であってもよい。より好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。試料の処理において好ましい実施形態は、先に示されている。好ましい一実施形態においては、ＤＮＡは、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの遺伝子定量の前に腸試料から抽出され
る。
腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定方法における更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様で示される通りである。
ヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法
本発明の更なる一態様は、ヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせと、判別されるべきＩＢＤ表現型の参照試料中の相応の値とを比較して被験体が罹患しているＩＢＤ表現型を決定する工程と、
を含み、ここで、被験体試料が上記ＩＢＤ表現型の１つと有意に類似した値を表していることが、その被験体が上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となり、
上記ＩＢＤ表現型は、少なくとも以下のパラメータ：
－ 疾患部位、
－ ＩＢＤ型、及び、
－ 診断時の年齢、
のうちの２つ、好ましくは３つの組み合わせによって定義され、
任意に、上記ＩＢＤ表現型の定義のために追加のバイオマーカーの使用を含む、方法に関する。
ＩＢＤ疾患又は障害に関して本明細書で使用されるＩＢＤ型というこの用語は、先に列挙されている。好ましくは、上記ＩＢＤ型は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、非定型大腸炎、及び無分類型の炎症性腸疾患（ＩＢＤＵ）からなる群から選択される。
サブタイプは、ＩＢＤ疾患又は障害の範囲内で定義され得る。サブタイプ分類は、一般的に、国際分類を使用して、例えば１９９１年ローマ、１９９８年ウィーン又は２００５年モントリオールのレポートにおける国際ワーキンググループにより発行された国際分類を使用して行われる。好ましくは、ＩＢＤサブタイプは、モントリオール分類に従って決定される。
好ましい一実施形態においては、上記ＩＢＤ表現型は、
ｉ． 以下のパラメータ：
－ 疾患部位、
－ 診断時の年齢、及び、
－ 挙動、
のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＣＤ表現型、
ｉｉ． 以下のパラメータ：
－ 疾患部位又は範囲、及び、
－ 重症度、
のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＵＣ表現型、
からなる群から選択される。
好ましくは、ＣＤサブタイプは、例えばモントリオール分類によって示されるサブタイプであり、その場合、ＣＤは、診断時の年齢、部位及び／又は挙動により分類される。同様に、好ましいＵＣサブタイプは、モントリオール分類によって示されるサブタイプであり、その場合、ＵＣは、疾患の範囲及び／又は疾患の重症度により分類される（世界胃腸学組織の国際ガイドライン、非特許文献１、非特許文献３９、及び非特許文献２）。これらのパラメータにより定義される具体的なサブタイプは、非特許文献３９からの以下の表に規定されている。
Figure 2022031644000021
Figure 2022031644000022
Figure 2022031644000023
更なる好ましい一実施形態においては、上記ＩＢＤ表現型は、疾患部位によって定義され、より好ましくは、これらは、
－ 回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）からなるＣＤ表現型、並びに、
－ 潰瘍性直腸炎（ＵＣ－Ｅ１）、遠位大腸炎（ＵＣ－Ｅ２）、及び広汎性潰瘍性大腸炎又は全大腸炎（ＵＣ－Ｅ３）からなるＵＣ表現型、
からなる群から選択される。
本発明の方法は、以下のＩＢＤサブタイプ：ＵＣ対Ｃ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ２対ＵＣ－Ｅ３、ＵＣ－Ｅ２対Ｃ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ２対ＩＣ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ２対Ｉ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ３対Ｃ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ３対ＩＣ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ３対Ｉ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ対ＩＣ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ対Ｉ－ＣＤ、又はＩ－ＣＤ対ＩＣ－ＣＤの１つ以上の間の、好ましくはＵＣ対Ｃ－ＣＤ、ＵＣ－Ｅ３対Ｃ－ＣＤ、Ｉ－ＣＤ対ＩＣ－ＣＤ、及びＣ－ＣＤ対ＩＣ－ＣＤからなる一覧から選択されるＩＢＤサブタイプの１つ以上の間の鑑別診断のために有用な場合がある。
上記腸試料は、腸生検材料であってもよい。好ましい一実施形態においては、上記腸試料は、非侵襲的方法、例えば直腸Ｓ状結腸鏡検査により得られる腸生検材料である。別の好ましい実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。試料の処理における好ましい実施形態は、先に示されている。
好ましい一実施形態においては、上記ＩＢＤ表現型は、ＵＣ－Ｅ３及びＣ－ＣＤであり、かつ被験体試料値は、ＵＣ－Ｅ３陽性参照試料及び／又はＣ－ＣＤ陽性参照試料と比較され、ここで、ＵＣ－Ｅ３又はＣ－ＣＤと有意に類似した値を表す被験体試料が、該被験体が、上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となる。好ましくは、上記ヒト被験体は、以前に結腸病変を伴うＩＢＤと診断された被験体である。更なる好ましい一実施形態においては、任意に上述のいずれかの組み合わせにおいて、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである。
もう１つの更なる実施形態においては、任意に上記のいずれかの組み合わせにおいて、ＦＴ存在量及び／又はＥＣ存在量との上記数学的組み合わせは、ＰＨＧＩ存在量／ＥＣ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量／ＥＣ存在量、ＦＴ存在量／ＰＨＧＩ存在量、及びＦＴ存在量／ＰＨＧＩＩ存在量からなる群から選択される比率である。好ましくは、存在量の測定は、ｑＰＣＲによって行われ、サイクル閾値（Ｃｔ）として表現され、上記比率は、１番目のＣｔ値から２番目のＣｔ値を引き算することによって得られる。
本発明によるＵＣとＣ－ＣＤとの鑑別診断のためのバイオマーカーは、実施例１７に示されている。ＵＣとＣ－ＣＤとの鑑別診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率である。ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの存在量はＵＣにおいて増大し、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率はＵＣにおいて低下する。ＵＣとＣ－ＣＤとを鑑別診断するためのその他の特に好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であると示されたＦＴ／ＰＨＧＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩＩの比率である。他方では、Ｃ－ＣＤとＵＣとの鑑別診断のための特に好ましいバイオマーカーは、ＲＯＣ曲線解析により良好な識別因子であると示されたＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ、好ましくはＰＨＧＩ及びＰＨＧＩ／ＥＣである。
結腸病変を伴うＩＢＤに罹患しているヒト被験体においてＣ－ＣＤを診断する方法
本発明の更なる一態様は、結腸病変を伴うＩＢＤに罹患しているヒト被験体においてＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料中の相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、Ｃ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
特定の一実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩである。もう１つの特定の実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩである。もう１つの特定の実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである。
上述のように、Ｃ－ＣＤの検知のための特に好ましいバイオマーカーは、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ、好ましくはＰＨＧＩ及びＰＨＧＩ／ＥＣである。好ましくは、上記比率は、上記及び実施例に記載されるように引き算によって計算された。
好ましい一実施形態においては、該実施形態は、結腸病変を伴うＩＢＤに罹患しているヒト被験体においてＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の存在量レベルと参照試料におけるレベルとを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、Ｃ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
好ましくは、上記参照試料は、健康な被験体の試料、及び／又はＩＢＤを伴う寛解状態にある患者の試料、より好ましくは同じ被験体の寛解状態にある試料である。
好ましい実施形態においては、上記ＩＢＤ表現型は、Ｉ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ及びＩＣ－ＣＤからなる群から選択され、かつ被験体試料値は、Ｉ－ＣＤ陽性参照試料、Ｃ－ＣＤ陽性参照試料、及び／又はＩＣ－ＣＤ陽性参照試料と比較され、ここで、Ｉ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤと有意に類似した値を表す被験体試料が、該被験体が上記ＩＢＤ表現型に
罹患していることの指標となる。
好ましい一実施形態においては、本発明の方法は、以前にＩ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の結腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するために使用される。好ましくは、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである。
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明の方法は、以前にＣ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の回腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するために使用される。好ましくは、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである。
Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤに罹患しているヒト被験体においてＩＣ－ＣＤを診断する方法
本発明の更なる一態様は、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤに罹患しているヒト被験体においてＩＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤと診断されると思われる上記被験体からの参照試料中の相応の値と比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、ＩＣ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
特定の一実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩである。もう１つの特定の実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩである。もう１つの特定の実施形態においては、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである。更なる一実施形態においては、上記標的微生物は、ＦＴ及びＰＨＧＩである。上述のように、ＩＣ－ＣＤの測定のための好ましいバイオマーカーは、ＦＴ／ＰＨＧＩである。
好ましい一実施形態においては、該実施形態は、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤに罹患しているヒト被験体においてＩＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料のＰＨＧＩＩ存在量レベルと、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤと診断されると思われる上記被験体からの参照試料におけるレベルとを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、ＩＣ－ＣＤの指標となる、方法に関する。
上述のように、当業者は、標的微生物の存在量を測定するための幾つかの方法及び装置を認識している。更なる詳細は、先に示されている。
好ましい実施形態においては、上記標的微生物の存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる。
また上記のように、幾つかの遺伝子を、細菌定量の目的のために使用することもできる。好ましくは、上記標的微生物の存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって
行われる。
上記標的微生物は、好ましくは、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩからなる群から選択される。好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量は、上記ヒト被験体の腸試料におけるＰＨＧＩＩの存在量と組み合わせて（それらの任意の数学的組み合わせを含む）使用され、好ましくは、ＰＨＧＩＩの存在量とＰＨＧＩの存在量との比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定される。
好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。もう１つの実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって測定される。好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われ、ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定のための好ましいオリゴヌクレオチド、検知化学薬品及び定量方法の好ましい実施形態は、本発明の上記態様において示されている。
総ＦＰに関しては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量は、配列番号７を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる。
好ましい実施形態においては、総ＦＰの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号５若しくは配列番号６の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド分子、及び／又は配列番号７の配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列のオリゴヌクレオチド分子を用いて行われる。好ましくは、配列番号５及び配列番号６の配列のオリゴヌクレオチド分子が使用される。
更なる好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号５若しくは配列番号６のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号７のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる。好ましい一実施形態においては、総ＦＰの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、好ましくは、ｑＰＣＲによって、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号７のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる。
好ましくは、上記の少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列は、配列番号５、配列番号６及び／又は配列番号７と少なくとも８０％の、少なくとも８５％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、より好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。さらに、少なくとも７５％の同一性を有するこれらのオリゴヌクレオチド配列は、同じヌクレオチド数を有していてもよく、配列番号５、配列番号６及び／又は配列番号７よりも長くても、又はそれより短くてもよい。
好ましい一実施形態においては、上記総ＦＰプローブは、配列番号７又はその少なくとも７５％の同一性を有する修飾された配列からなる。好ましくは、該プローブは、二重標識プローブ、より好ましくは加水分解プローブである。より好ましい一実施形態において
は、配列番号７は、その５’末端において６ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）で修飾され、かつその３’末端においてＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）で修飾されており、それは、６ＦＡＭ－ＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧ－ＴＡＭＲＡとして表される。
定量方法の更なる詳細及び好ましい実施形態は、本発明の上記態様において示されている。
好ましい一実施形態においては、上記方法は、腸疾患、好ましくはＩＢＤの１種以上のバイオマーカーを検知及び／又は定量することを更に含む。
更なる好ましい一実施形態においては、上記方法は、標的微生物定量及び／又は上記更なるバイオマーカー検知及び／又は定量の結果と、ＩＢＤの独立した予測因子である臨床的徴候及び／又は症状とを組み合わせることを更に含む。
もう１つの実施形態においては、上記方法は、該方法の結果をデータ媒体に記録することを更に含み、好ましくは、ここで上記データ媒体は、コンピュータ可読媒体である。
本発明の第６の態様～第８の態様のいずれかによるヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法における更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様について示される通りである。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予後判定方法
更なる付加的な一態様においては、本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予後判定方法であって、ＩＢＤ表現型を、本明細書に記載される本発明の鑑別診断方法により測定し、測定されたＩＢＤ表現型に応じて予後を確立することを含む、方法に関する。
総ＦＰ、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量のＩＢＤ表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用
更なる一態様においては、本発明は、ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせの、ＩＢＤ表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用であって、上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量が、本発明の方法により測定される、使用に関する。
特定の一実施形態は、ヒト被験体の腸試料において測定されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）の存在量、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせの、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用に関する。腸試料における総ＦＰ、ＰＧＨＩ及び／又はＰＧＨＩＩの存在量の測定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
ＩＢＤ表現型の更なる詳細及び好ましい実施形態は、先に示されている。好ましい一実施形態においては、上記ＩＢＤ表現型は、
－ 潰瘍性直腸炎（ＵＣ－Ｅ１）、遠位大腸炎（ＵＣ－Ｅ２）、及び広汎性潰瘍性大腸炎又は全大腸炎（ＵＣ－Ｅ３）からなる潰瘍性大腸炎（ＵＣ）表現型、並びに、
－ 回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）からなるクローン病（ＣＤ）表現型、
からなる群から選択される。
好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量、ＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせは、バイオマーカーとして使用される。更なる好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの存在量の数学的組み合わせは、バイオマーカーとして使用され、好ましくは、ＰＨＧＩＩとＰＨＧＩとの存在量の比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）は、バイオマーカーとして使用される。
別の好ましい実施形態においては、上記標的微生物の存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる。
更なる好ましい一実施形態においては、上記標的微生物の存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる。
更にもう１つの好ましい実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。
ヒト被験体の腸試料における総ＦＰ、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用における更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様について示される通りである。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのキット
本発明のもう１つの態様は、第６の態様～第８の態様のいずれかの方法による炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのキットであって、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定するための試薬と、
－ 上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料から上記標的微生物の存在量レベルを測定するための説明書と、
を含む、キットに関する。
好ましい実施形態においては、上記腸試料は、糞便試料である。
もう１つの好ましい実施形態においては、ＰＨＧＩの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される。
更なる好ましい一実施形態においては、ＰＨＧＩＩの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％
の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される。
更にもう１つの好ましい実施形態においては、総ＦＰの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号７のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される。
更に好ましい一実施形態においては、上記キットは、データを正規化するための参照試薬を更に含み、好ましくは、その際、上記試薬は、総細菌の定量のためのプライマー及び／又はプローブである。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのキットにおける更なる詳細及びその他の好ましい実施形態は、本発明の上記態様について示される通りである。
ヒト被験体における腸疾患を検知する方法に関連する項目
１． ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定する工程と、
ｂ． 任意に、上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する工程と、
ｃ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ存在量、任意にＰＨＧＩＩ存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせと、参照試料中の相応の値とを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となる、方法。
２． 以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩの存在量を測定する工程と、
ｂ． 被験体試料の存在量レベルと参照試料におけるレベルとを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、腸疾患の指標となる、項目１に記載の方法。
３． 以下の工程：
ａ． 上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩの存在量を測定する工程と、
ｂ． 上記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩＩの存在量を測定する工程と、
ｃ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせと、参照試料中の相応の値とを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となり、好ましくは、ＰＨＧＩＩの存在量とＰＨＧＩの存在量との比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定され、上記被験体試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率が、参照試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率と比較される、項目１に記載の方法。
４． 上記方法は、腸疾患の進行をスクリーニング、診断、監視するために、腸疾患の回帰を監視するために、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するために、及び／又は腸疾患に対する処置の効力を測定するために、好ましくは腸疾患をスクリーニング及び／又は
診断するために使用される、項目１～３のいずれかに記載の方法。
５． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、項目１～４のいずれかに記載の方法。
６． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる、項目１～５のいずれかに記載の方法。
７． ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、項目１～６のいずれかに記載の方法。
８． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～７のいずれかに記載の方法。
９． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号３のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～８のいずれかに記載の方法。
１０． ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、項目１～９のいずれかに記載の方法。
１１． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目３～１０のいずれかに記載の方法。
１２． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号４のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目３～１１のいずれかに記載の方法。
１３． ＤＮＡは、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの遺伝子定量の前に腸試料から抽出される、項目５～１２のいずれかに記載の方法。
１４． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量レベルは正規化され、好ましくは、正規化は、総細菌の定量に対して行われる、項目１～１３のいずれかに記載の方法。
１５． 上記腸試料は、糞便試料である、項目１～１４のいずれかに記載の方法。
１６． 上記参照試料は、健康な被験体の試料、及び／又は腸疾患を伴う寛解状態にある患者の試料、好ましくは同じ被験体の寛解状態にある試料である、項目１～１５のいずれかに記載の方法。
１７． 上記腸疾患は、ＩＢＤであり、好ましくは上記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）であり、より好ましくは上記ＩＢＤは、ＣＤである、項目１～１６のいずれかに記載の方法。
１８． ＰＨＧＩの存在量が測定され、かつ被験体試料における上記参照試料に対するＰＨＧＩの存在量レベルの有意な低下が、ＣＤの、好ましくは回腸病変を伴うＣＤ（ＩＣ－ＣＤ又はＩ－ＣＤ）の指標となる、項目１～１７のいずれかに記載の方法。
１９． ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩの比率が測定され、かつ被験体試料値における上記参照試料に対する有意な偏差が、ＣＤの、好ましくは結腸病変を伴うＣＤ（Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤ）の指標となる、項目１～１８のいずれかに記載の方法。
２０． 上記方法は、腸疾患、好ましくはＩＢＤの１種以上のバイオマーカーを検知及び／又は定量することを更に含む、項目１～１９のいずれかに記載の方法。
２１． 上記方法は、ＰＨＧＩ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量及び／又は上記更なるバイオマーカー検知及び／又は定量の結果と、腸疾患、好ましくはＩＢＤのその他の指標とを組み合わせることを更に含む、項目１～２０のいずれかに記載の方法。
２２． 上記方法は、該方法の結果をデータ媒体に記録することを更に含み、好ましくは、ここで上記データ媒体は、コンピュータ可読媒体である、項目１～２１のいずれかに記載の方法。
２３． ヒト被験体の腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量の、腸疾患の検知のためのバイオマーカーとしての使用。
２４． 腸疾患の進行をスクリーニング、診断、監視するための、腸疾患の回帰を監視するための、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するための、及び／又は腸疾患に対する処置の効力を測定するための、好ましくは腸疾患をスクリーニング又は診断するための、項目２３に記載の使用。
２５． ＰＨＧＩの存在量は、上記ヒト被験体の腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量と組み合わせて使用され、好ましくは、ＰＨＧＩＩの存在量とＰＨＧＩの存在量との比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定される、項目２３又は２４に記載の使用。
２６． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、項目２３～２５のいずれかに記載の使用。
２７． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる、項目２３～２６のいずれかに記載の使用。
２８． 上記腸試料は、糞便試料である、項目２３～２７のいずれかに記載の使用。
２９． 上記腸疾患は、ＩＢＤであり、好ましくは上記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ
）又はクローン病（ＣＤ）であり、より好ましくは上記ＩＢＤは、ＣＤである、項目２３～２８のいずれかに記載の使用。
３０． 項目１～２２のいずれかに記載の方法により腸疾患を検知するためのキットであって、
・ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定するための試薬と、
・ 任意に、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するための試薬と、
・ 上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料からＰＨＧＩ及び任意にＰＨＧＩＩの存在量レベルを測定するための説明書と、
を含む、キット。
３１． 腸疾患の進行をスクリーニング、診断、監視するための、腸疾患の回帰を監視するための、及び／又は腸疾患の術後再発を監視するための、及び／又は腸疾患に対する処置の効力を測定するための、好ましくは腸疾患をスクリーニング又は診断するための、項目３０に記載のキット。
３２． ＰＨＧＩの存在量を測定するための上記試薬は、
・ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、・ 配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される、項目３０又は３１に記載のキット。
３３． ＰＨＧＩＩの存在量を測定するための上記試薬は、
・ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、・ 配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される、項目３０～３２のいずれかに記載のキット。
３４． データを正規化するための参照試薬を更に含み、好ましくは、その際、上記試薬は、総細菌の定量のためのプライマー及び／又はプローブである、項目３０～３３のいずれかに記載のキット。
３５． 上記腸疾患は、ＩＢＤであり、好ましくは上記ＩＢＤは、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）であり、より好ましくは上記ＩＢＤは、ＣＤである、項目３０～３４のいずれかに記載のキット。
３６． 配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される核酸配列、又はその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列。
３７． 被験体からの腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定する方法であって、上記測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われ、ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われ、かつＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、方法。
３８． １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法で行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、項目３７に記載の方法。
３９． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目３７又は３８に記載の方法。
４０． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号３のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目３７～３９のいずれかに記載の方法。
４１． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目３７～４０のいずれかに記載の方法。
４２． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号４のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目３７～４１のいずれかに記載の方法。
４３． ＤＮＡは、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの遺伝子定量の前に腸試料から抽出される、項目３７～４２のいずれかに記載の方法。
４４． ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量レベルは正規化され、好ましくは、正規化は、総細菌の定量に対して行われる、項目３７～４３のいずれかに記載の方法。
４５． 上記腸試料は、糞便試料である、項目３７～４４のいずれかに記載の方法。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法に関連する項目
１． ヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の上記標的微生物の１つ以上の存在量及び／又はその数学的組み合わせと、判別されるべきＩＢＤ表現型の参照試料中の相応の値とを比較して、被験体が罹患するＩＢＤ表現型を測定する工程と、
を含み、ここで、被験体試料が上記ＩＢＤ表現型の１つと有意に類似した値を表すことが、その被験体が上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となり、上記ＩＢＤ表現型は、少なくとも以下のパラメータ：
－ 疾患部位、
－ ＩＢＤ型、及び、
－ 診断時の年齢、
のうちの２つ、好ましくは３つの組み合わせによって定義され、任意に、上記ＩＢＤ表現型の定義のために追加のバイオマーカーを使用することを含む、方法。
２． 上記ＩＢＤ表現型は、
－ 以下のパラメータ：
・ 疾患部位、
・ 診断時の年齢、及び、
・ 挙動、
のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＣＤ表現型、
－ 以下のパラメータ：
・ 疾患部位又は範囲、及び、
・ 重症度、
のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＵＣ表現型、
からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
３． 上記ＩＢＤ表現型は、
－ 回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）からなるＣＤ表現型、並びに、
－ 潰瘍性直腸炎（ＵＣ－Ｅ１）、遠位大腸炎（ＵＣ－Ｅ２）、及び広汎性潰瘍性大腸炎又は全大腸炎（ＵＣ－Ｅ３）からなるＵＣ表現型、
からなる群から選択される、項目１又は２に記載の方法。
４． 上記標的微生物は、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩからなる群から選択される、項目１～３のいずれかに記載の方法。
５． ＰＨＧＩＩの存在量とＰＨＧＩの存在量との比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）が測定され、上記被験体試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率は、参照試料におけるＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率と比較される、項目１～４のいずれかに記載の方法。
６． 上記ＩＢＤ表現型は、ＵＣ－Ｅ３及びＣ－ＣＤであり、かつ被験体試料値は、ＵＣ－Ｅ３陽性参照試料及び／又はＣ－ＣＤ陽性参照試料と比較され、ここで、ＵＣ－Ｅ３又はＣ－ＣＤと有意に類似した値を表す被験体試料が、該被験体が上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となる、項目１～５のいずれかに記載の方法。
７． 上記ヒト被験体は、以前に結腸病変を伴うＩＢＤと診断された被験体である、項目６に記載の方法。
８． 上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである、項目６又は７に記載の方法。
９． 結腸病変を伴うＩＢＤに罹患しているヒト被験体においてＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料の存在量レベルと参照試料におけるレベルとを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、Ｃ－ＣＤの指標となり、好ましくは、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである、方法。
１０． 上記参照試料は、健康な被験体の試料、及び／又はＩＢＤを伴う寛解状態にある患者の試料、好ましくは同じ被験体の寛解状態にある試料である、項目９に記載の方法。
１１． 上記ＩＢＤ表現型は、Ｉ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ及びＩＣ－ＣＤからなる群から選択され、かつ被験体試料値は、Ｉ－ＣＤ陽性参照試料、Ｃ－ＣＤ陽性参照試料、及び／又はＩＣ－ＣＤ陽性参照試料と比較され、ここで、Ｉ－ＣＤ、Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤと有意に類似した値を表す被験体試料が、該被験体が上記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となる、項目１～５のいずれかに記載の方法。
１２． 以前にＩ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の結腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するための、項目１１に記載の方法。
１３． 上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである、項目１２に記載の方法。
１４． 以前にＣ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の回腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するための、項目１３に記載の方法。
１５． 上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである、項目１４に記載の方法。
１６． Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤに罹患しているヒト被験体においてＩＣ－ＣＤを診断する方法であって、以下の工程：
ｉ． 上記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定する工程と、
ｉｉ． 被験体試料のＰＨＧＩＩ存在量レベルと、Ｉ－ＣＤ又はＣ－ＣＤと診断されると思われる上記被験体からの参照試料におけるレベルとを比較する工程と、
を含み、ここで、被験体試料における存在量レベルの上記参照試料に対する有意な低下が、ＩＣ－ＣＤの指標となり、好ましくは、上記標的微生物は、ＰＨＧＩＩである、方法。
１７． 上記標的微生物の存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、項目１～１６のいずれかに記載の方法。
１８． 上記標的微生物の存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる、項目１～１７のいずれかに記載の方法。
１９． ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号３を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、項目１～１８のいずれかに記載の方法。
２０． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～１９のいずれかに記載の方法。
２１． ＰＨＧＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号３のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～２０のいずれかに記載の方法。
２２． ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号４を含む又はそれからなるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を定量することによって行われる、項目１～２１のいずれかに記載の方法。
２３． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～２２のいずれかに記載の方法。
２４． ＰＨＧＩＩの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号４のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～２３のいずれかに記載の方法。
２５． 総ＦＰの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプライマー、及び／又は配列番号７のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有する配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～２４のいずれかに記載の方法。
２６． 総ＦＰの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の定量は、配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー、並びに配列番号７のオリゴヌクレオチド配列からなるプローブを用いて行われる、項目１～２５のいずれかに記載の方法。
２７． ＤＮＡは、標的微生物の遺伝子定量の前に腸試料から抽出される、項目１～２６のいずれかに記載の方法。
２８． 上記腸試料は、糞便試料である、項目１～２７のいずれかに記載の方法。
２９． 標的の存在量レベルは正規化され、好ましくは、正規化は、総細菌の定量に対して行われる、項目１～２８のいずれかに記載の方法。
３０． 上記方法は、腸疾患、好ましくはＩＢＤの１種以上のバイオマーカーを検知及び／又は定量することを更に含む、項目１～２９のいずれかに記載の方法。
３１． 上記方法は、標的微生物定量及び／又は上記更なるバイオマーカー検知及び／又は定量の結果と、ＩＢＤの独立した予測因子である臨床的徴候及び／又は症状とを組み合わせることを更に含む、項目１～３０のいずれかに記載の方法。
３２． 上記方法は、該方法の結果をデータ媒体に記録することを更に含み、好ましくは、上記データ媒体は、コンピュータ可読媒体である、項目１～３１のいずれかに記載の方法。
３３． 炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予後判定方法であって、ＩＢＤ表現型を、項目１～３２のいずれかに記載の鑑別診断方法により測定し、測定されたＩＢＤ表現型に応じて予後を確立することを含む、方法。
３４． ヒト被験体の腸試料において測定されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）の存在量、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせの、項目１～３のいずれかに規定される炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用。
３５． 上記ＩＢＤ表現型は、
－ 潰瘍性直腸炎（ＵＣ－Ｅ１）、遠位大腸炎（ＵＣ－Ｅ２）、及び広汎性潰瘍性大腸炎又は全大腸炎（ＵＣ－Ｅ３）からなる潰瘍性大腸炎（ＵＣ）表現型、並びに、
－ 回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）からなるクローン病（ＣＤ）表現型、
からなる群から選択される、項目３４に記載の使用。
３６． ＰＨＧＩの存在量、ＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせは、バイオマーカーとして使用される、項目３４又は３５に記載の使用。
３７． ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの存在量の数学的組み合わせは、バイオマーカーとして使用され、好ましくは、ＰＨＧＩＩとＰＨＧＩとの存在量の比率（ＰＨＧＩＩ／ＰＨＧＩ比率）は、バイオマーカーとして使用される、項目３４～３６のいずれかに記載の使用。
３８． 上記標的微生物の存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法による遺伝子定量によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、項目３４～３７のいずれかに記載の使用。
３９． 上記標的微生物の存在量の測定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子定量によって行われる、項目３４～３８のいずれかに記載の使用。
４０． 上記腸試料は、糞便試料である、項目３４～３９のいずれかに記載の使用。
４１． 項目１～３３のいずれかの方法による炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断のためのキットであって、
－ フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイのメンバー（総ＦＰ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）からなる群から選択される標的微生物の存在量を測定するための試薬と、
－ 上記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料から上記標的微生物の存在量レベルを測定するための説明書と、
を含む、キット。
４２． 上記腸試料は、糞便試料である、項目４１に記載のキット。
４３． ＰＨＧＩの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号３のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有す
るオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される、項目４１又は４２に記載のキット。
４４． ＰＨＧＩＩの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号４のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される、項目４１～４３のいずれかに記載のキット。
４５． 総ＦＰの存在量を測定するための上記試薬は、
－ 配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなる１対の核酸プライマー、及び／又は、－ 配列番号７のオリゴヌクレオチド配列若しくはその少なくとも７５％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列からなるプローブ、
からなる群から選択される、項目４１～４４のいずれかに記載のキット。
４６． データを正規化するための参照試薬を更に含み、好ましくは、その際、上記試薬は、総細菌の定量のためのプライマー及び／又はプローブである、項目４１～４５のいずれかに記載のキット。
本明細書中で述べられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は使用に関して実行することができ、その逆もまた同様であることが意図される。本明細書に記載される特定の実施形態は解説として示されるのであって、本発明の限定として示されるものではないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において採用され得る。当業者は、通常の程度の実験を使用して、本明細書に記載される具体的な手順に対する数多くの等価物を認識するか、又は確認することができる。かかる等価物は、本発明の範囲に含まれるとされ、特許請求の範囲によって包含される。
本明細書において言及された全ての出版物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルの指標である。全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が各々具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすことが示されるのと同じ程度に引用することにより本明細書の一部をなす。
語「a」又は「an」の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において、「含む（comprising）」という用語と併せて使用される場合、「１つの（one）」を意味し得るが、「１つ以上の（one or more）」、「少なくとも１つの（at least one）」及び「１つ又
は１つより多い（one or more than one）」の意味とも一致する。特許請求の範囲において、「又は（or）」という用語の使用は、本開示が、単一の選択肢のみ及び「及び／又は（and/or）」を指す定義を裏付けるが、単一の選択肢のみを指すこと又は選択肢が相互に排他的であることが明確に指示されない限り、「及び／又は（and/or）」を意味するために使用される。本出願全体にわたって、「約（about）」という用語は、或る値が、値を
決定するために用いられる装置、方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象の間にある変動を含むことを示すために使用される。
本明細書及び１つ以上の請求項において使用される場合、語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」等の含む（comprising）の任意
の形）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」等の
有する（having）の任意の形）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」
及び「含む（include）」等の含む（including）の任意の形）又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」等の含有する（containing）の任意の形）は、包含的であるか又は非限定的であり、追加の列挙されてい
ない要素又は方法工程を除外しない。本明細書で使用される場合に、「本質的に～からなる（consisting essentially of）」という文言は、請求項の範囲を、特定された材料又
は工程並びに特許請求の範囲に記載される発明の１つ以上の基本特性及び新規特性に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程に限定する。本明細書で使用される場合に、「～からなる（consisting of）」という文言は、例えば、要素又は限定と通常関連する不純物を
除いて、請求項に特記されていない一切の要素、工程又は成分を排除する。
本明細書で使用される用語「又はその組み合わせ（or combinations thereof）」は、
この用語の前に列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はその組み合わせ（A, B, C, or combinations thereof）」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むと解釈され、特定の状況において順序が重要である場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むと解釈される。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等の１つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせが、明示的に含まれる。当業者は、特に文脈から明らかでない限り、任意の組み合わせの中の項目又は用語の数に、一般的に制限はないことを理解している。
本明細書で使用される場合に、限定されるものではないが、「約（about）」、「およ
そ（around）」、「ほぼ（approximately）」のような近似の語は、こうして修飾された
ときに、必ずしも絶対的なものとは限らないか、又は寸分違わぬものとは限らないと理解される状況であって、しかしながらその状況が存在することを示すのを保証するのに当業者に十分に近いと思われる状況を指す。詳細な説明が変動し得る範囲は、どれほど大きな変化が引き起こされ得るかに依存し、当業者は、修飾された特徴を、修飾されていない特徴の必要とされる特徴及び能力を依然として有すると認識している。一般に、先行する言及を受けるが、「約（about）」などの近似の語により修飾される本明細書中の数値は、
示された値から少なくとも±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±６％、±７％、±１０％、±１２％又は１５％だけ変動し得る。
実施例１． 生検試料におけるＦ．プラウスニッツイ系統群の定量の材料及び方法
１． 患者、臨床データ及び試料採取
７０人のＩＢＤ患者（４５人のＣＤ及び２５人のＵＣ）、１０人のＩＢＳ患者、２０人のＣＲＣ患者、及び３１人のＨからなるスペイン人のコホートを登録した（表１３）。
被験体は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、ジローナ）及びSanta Caterina病院
（スペイン、サルト）の胃腸内科によって募集された。被験体は、全ての群について性別マッチングされた。年齢に関しては、ＣＤ患者は、Ｈ群の年齢よりも若かった（Ｐ＜０．００１）が、ＣＲＣ患者は、その他の全ての群よりも有意に年を取っていた（Ｐ≦０．０１９）。ＩＢＤ患者は、標準的な臨床的、病理学的、かつ内視鏡的な基準に従って診断され、モントリオール分類（非特許文献２）に従って類別された。ＩＢＳ患者は、ローマＩＩＩ基準（＜http://www.romecriteria.org/criteria/＞で入手可能）に従って診断され
た。ＣＲＣの診断は、結腸鏡検査法及び生検によって確立され、この疾患の発症の高いリスクと相関したデータが記録された。コントロール群は、直腸出血（Ｎ＝９）、結腸直腸癌家族歴（Ｎ＝１１）及び腹痛（Ｎ＝１１）のような種々の理由のために結腸鏡検査法を受けている被験体からなっていた。全ての患者の臨床関連データが収集された。どの被験体も、結腸鏡検査法の前少なくとも２ヶ月間にわたり抗微生物処置を受けていなかった。
結腸鏡検査法の前に、患者はＣａｓｅｎｇｌｉｃｏｌ（商標）を使用して製造元のガイドラインに従って胃腸管の洗浄を受けた。通常の内視鏡検査の間に、患者１人当たりに３個までの生検試料を、腸管に沿った種々の部位（近位回腸、結腸、及び直腸）から標準的な手法に従って採取した。全ての生検材料は、バッファーを一切含まない滅菌チューブ中に直ちに入れ、内視鏡検査手順全てが完了した後に、かつ分析を行ったら－８０℃で貯蔵した。
この研究は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、ジローナ）及びジローナのInstitut d'Assistencia Sanitaria（スペイン、サルト）の臨床研究倫理委員会によって、それ
ぞれ２００９年２月２４日及び２００９年４月２１日に承認された。被験体からのインフォームドコンセントは、登録前に取得した。
Figure 2022031644000024
２． 試料処置及びＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出の前に、生検材料を、以前に報告されるように（３４）一時的に緩く付着した細菌を破棄するために、２回の穏やかな超音波洗浄サイクルに供した。ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Macherey-Nagel GmbH& Co.社、ドイツ、デューレン）を使用して抽出した。グラム陽性細菌のサポートプロトコル及びＲＮアーゼ処置工程を行った。ゲノムＤＮＡは、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）で溶出させ、使用するまで－８０℃で貯蔵した。ＤＮＡ濃度及び抽出物の純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ
ＮＤ－１００分光光度計（NanoDrop Technologies社、米国）で測定した。
３． プライマー及び加水分解プローブの設計、並びにＦ．プラウスニッツイ系統群についてのｑＰＣＲアッセイの構成
両者のＦ．プラウスニッツイ系統群を同時に定量するために、Ｆ．プラウスニッツイに関するユニークな種特異的プライマー対、並びにＦ．プラウスニッツイ系統群の各々を標的とする２種の加水分解プローブからなるｑＰＣＲアッセイを設計した。
Ｆ．プラウスニッツイ及び近縁のルミノコッカス科由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（表１４）から回収し、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Thompson JD et al.
Nucleic Acids Res. 1994;22:4673-4680）を使用してアライメントさせた。プライマー
及び加水分解プローブの両方とも、それぞれの目的のために特別に構成されたコンセンサス配列（表１４）から、プライマー及びプローブのアレル識別のための設計に関するApplied Biosystems社（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）により準備されたガイドラインに従って手動で設計し、さらに、ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）バージョン３．０（Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）を使用して確認した。またオリゴヌクレオチドを、プライマー二量体構造、ヘアピン、及び考えられる二量体間相互作用を確認するためにＮｅｔＰｒｉｍｅｒ（商標）ソフトウェア（PREMIER Biosoft International社、米国、カリフォルニア州）を使用して
評価した。得られたプライマー及びプローブを、表１５に列挙する。

Figure 2022031644000025
Figure 2022031644000026
Figure 2022031644000027
ｑＰＣＲアッセイのための最良の試薬濃度を決定するために、５０ｎＭから９００ｎＭまでの範囲の種々のプライマー濃度及びプローブ濃度を使用して実験を行った。最大蛍光シグナル及び標的ＤＮＡの１反応当たりに１０６コピーのための最低定量サイクル（Ｃｑ）値が得られる試薬濃度を最適なものとして選択し、したがってその濃度を試料における更なる定量のために使用した（以下のｑＰＣＲアッセイの節に記載される）。
オリゴヌクレオチド特異性は、それぞれリボソームデータベースプロジェクトＩＩ（ＲＤＰ）（Maidak BL, et al., Nucleic Acids Research. 2001;29:173-174）並びにＳｅｑｍａｔｃｈ及びＢＬＡＳＴを通じたＧｅｎＢａｎｋデータベース（Altschul SF, et al. Nucleic Acids Research. 1997;25:3389-3402）に対して確認した。カバレッジは、ＳＩ
ＬＶＡプローブマッチ及び評価ツール－ＴｅｓｔＰｒｏｂｅ ３．０（http://www.arb-silva.de/search/testprobe/で入手可能）を使用して評価した。最後に、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏの包含性／排他性試験を、８９種の細菌株を含めて実施し、そのうち９種がＦ．プラウスニッツイであった（表１６）。
アッセイの線形性、効率及び検知限界を測定した。アッセイの信頼することができる定量範囲を決定するために、Ｆ．プラウスニッツイＳ３Ｌ／３（系統群Ｉ）又はＦ．プラウスニッツイＤＳＭ１７６７７（系統群ＩＩ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のいずれかの単コピーを含む線状化プラスミドの１０回反復１０倍希釈（１反応当たり２×１０８から２までの範囲の標的遺伝子コピー数）を使用した。定量の線形範囲は、複製物の間の０．３４未満のＳＤ値を有するそれらの濃度について考慮した。反応における標的遺伝子の数の対数に対する得られたＣｑをプロットする回帰分析も実施した。ｑＰＣＲアッセイの効率は、式：効率＝［１０（－１／傾き）］－１を使用して計算した。アッセイの検知限界については、Ｆ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１から１００の間の標的コピー数の２倍連続希釈の校正曲線を行った。それぞれの希釈の８つの複製をアッセイした。データは、Ｐｒｏｂｉｔ試験（Ｍｉｎｉｔａｂ（商標）１４統計学ソフトウェア、米国、ペンシルバニア州）によって解析し、そこでは、ポジティブ／ネガティブ増幅事象の比率が、１反応当たりに存在する標的遺伝子の量に対してプロットされた。
４． ｑＰＣＲのための定量標準
Ｆ．プラウスニッツイ株Ｓ３Ｌ／３（系統群Ｉ）及びＦ．プラウスニッツイＤＳＭ１７６７７（系統群ＩＩ）由来の標準的ＤＮＡ鋳型を、以前報告されたＰＣＲ増幅（Lane DJ.
et al., E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.)., John Willy and Sons; 1991、Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al. J Bacteriol. 1991;173:697-703）後に遺
伝子構築物として調製した後に、引き続いて全１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をｐＣＲ（商標）４－ＴＯＰＯ（商標）クローニングプラスミド（Invitrogen社、米国、カリフォルニア州）中に製造元のガイドラインに従って挿入した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）プラスミド（Macherey-Nagel GmbH&Co.社、ドイツ、デューレン）を用いて精製した後に、プラス
ミドをＳｐｅＩ（Ｆ．プラウスニッツイ）で線状化し、Ｑｕｂｉｔ（商標）定量プラットフォーム（Invitrogen社、米国、カールスバッド）を使用して定量した。初期標的濃度は、以前に報告されたように推定した（非特許文献２２）。標準曲線は、線状化されたプラスミドの滴定された懸濁液の１０倍連続希釈から得られ、それは１反応当たり２０コピーから２×１０８コピーまでの範囲であり、全ての反応についてリニアダイナミックレンジの範囲に相当する。Ｆ．プラウスニッツイＤＳＭ１７６７７の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用いて構築された標準曲線を、総細菌及び総フィーカリバクテリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡの遺伝子定量の両方のために使用し、いずれかの系統群から得られた標準曲線を、総Ｆ．プラウスニッツイのプライマー及びプローブの組を使用して相互校正した。
５． ｑＰＣＲアッセイ
以前に報告された１６Ｓ ｒＤＮＡを標的とするプライマー及びプローブを、総Ｆ．プラウスニッツイ（非特許文献２２）、及び総細菌（Furet J-P, et al. FEMS Microbiology Ecology. 2009;68:351-362）の定量のために使用し、そして増幅反応を、以前に記載されるように（非特許文献２２）実施した。Ｆ．プラウスニッツイ系統群の定量のための新規アッセイを、１×ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ（Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）、９００ｎＭのそれぞれのプライマー、３００ｎＭのそれぞれのプローブ、及び５０ｎｇまでのゲノムＤＮＡ鋳型を含有する全容量２０μｌの反応において実施した。この研究で使用した全てのプライマー及びプローブ並びにＰＣＲ条件を、表１５に詳説する。総Ｆ．プラウスニッツイ及び総細菌のプライマー及び加水分解プローブは、Applied Biosystems社（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）から購入し、一方でＦ．プラウスニッツイ系統群のためのプライマー及び加水分解プローブは、Biomers社（ドイツ、ウルム）か
ら取得した。内部増幅コントロール（ＩＡＣ）のＤＮＡは、Bonsai technologies group
社（スペイン、アルコベンダス）によって合成された。
試料は、同じプレート中で二重試験で実行した。データ解析のために、二重試験での定量の平均を使用した。二重試験は、定量サイクル（Ｃｑ）の間の標準偏差が０．３４未満である場合に有効とみなされた（すなわち、１０％未満の量の差が許容された）。既知の数の標的遺伝子との少なくとも５つの反応からなる定量コントロールは、実行間再現性を評価するために実施した。阻害は、総Ｆ．プラウスニッツイ定量に対して、１０３コピーのＩＡＣ鋳型をそれぞれの反応に添加することによって制御した。得られたＣｑが、複製物のいずれかについてＩＡＣ単独を定量する場合に得られるものとの差が０．３４未満である場合に、阻害がないものとみなされた。Ｆ．プラウスニッツイＤＮＡを用いない反応からなる鋳型無しコントロール並びにＤＮＡ鋳型を一切含まない（細菌又はＩＡＣのどちらも）非増幅コントロールを、それぞれの実行にも含めた。ネガティブコントロールは、全ての場合において検知不可能なＣｑ値をもたらした。
全ての定量的ＰＣＲは、７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）を使用して実施した。データを収集し、７５００ ＳＤＳシステムソフトウェアのバージョン１．４（Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）を使用して解析した。全ての定量は、８９．５１±７．０６％の平均ＰＣＲ効率で行われた。
６． データ正規化及び統計解析
定量解析については、ｑＰＣＲ分析の間に検知が得られない場合にＦ．プラウスニッツイ又はその系統群が存在しないとみなされ、それは、Ｆ．プラウスニッツイ又は系統群を検知限界（すなわち、総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ及び系統群ＩＩのそれぞれについて、１反応当たり１０６．６、１．１０及び２．３９の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）未満でしか有さない試料に相当する。ピアソンのカイ２乗検定を使用して、患者の群間の、及びＩＢＤ疾患部位によるＦ．プラウスニッツイ及びその系統群の保有率を比較した。
定量解析に関しては、総Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群のコピー数を、総細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数に対して正規化した。データは、標的微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数及び同じ試料中で検知される１００万の総細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の間の比率のｌｏｇ１０として示される。
ノンパラメトリックのクルスカル－ウォリス検定を使用して、診断、ＣＤ及びＵＣ疾患部位、並びに現在の投薬等の３つ以上のカテゴリーで変量の差を試験した。これらの変量のサブカテゴリーの一対比較は、マン－ホイットニーＵ検定を使用して解析した。また、この試験を使用して、患者のサブグループの範囲内で、活動性（活動性のＣＤ及びＵＣ患
者は、１５０より大きいＣＤＡＩ（Best, W.R., et al. Gastroenterology, 1976. 70(3): p. 439-44）かつ３より大きいＭａｙｏスコア（Pineton de Chambrun, G., L. et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010. 7(1): p. 15-29）のそれぞれの場合）及び腸切
除のような２つのカテゴリーで変量を比較した。
さらに、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析、つまり真陽性率（感度）対偽陽性率（１－特異度）のプロットを適用して、Ｆ．プラウスニッツイ及びそれぞれの系統群を種々の腸障害の間で判別するための有用性を確かめた。識別の精度は、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定した。ＡＵＣが１に向かうと、その試験の感度が高いだけでなく特異度が高いことを示しており、その一方で、ＡＵＣが０．５に向かうと、その試験の感度も特異度もないことを示している。
全ての統計解析は、ＳＰＳＳ １５．０統計学的パッケージ（LEAD Technologies, Inc.社）を使用して実施した。有意水準は、Ｐ値≦０．０５の場合に確立された。
実施例２． Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＩＩのための新規のマルチプレックスｑＰＣＲアッセイの特徴
新規のオリゴヌクレオチドセットを、２種の最近記載されたＦ．プラウスニッツイ系統群を定量するために設計した（表１５）。選択されたオリゴヌクレオチドセットのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析により、プライマーＦｐｒａ １３６Ｆ－Ｆｐｒａ ２３２ＲがＦ．プラウスニッツイに特異的であり、現在入手可能な分離株全てを標的とし、一方で、プローブＰＨＧ１ １８０ＰＲ及びＰＨＧ２ １８０ＰＲは、それぞれ系統群Ｉ及びＩＩと特異的に合致することが示された。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで包含性－排他性試験によって確認された（表１６）。Ｆｐｒａ １３６Ｆ－Ｆｐｒａ ２３２Ｒプライマーセットのカバレッジは、ＳＩＬＶＡデータセットにおける配列の７４．８５％であった。ＰＨＧ１ １８０ＰＲプローブは、フィーカリバクテリウム属の一種の配列の２０．５０％を標的とし、一方で、ＰＨＧ２ １８０ＰＲプローブのカバレッジは、このデータベースにおけるフィーカリバクテリウム属の一種の配列の３８．８０％であった。ＳＩＬＶＡデータセットにおいて利用可能な全てのフィーカリバクテリウム配列のほぼ２５％は、ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏでこれらのどのアッセイによってもターゲティングされない。この不一致は、その他の系統群の存在によるものである可能性があり、及び／又は種々の系統群プローブがそれぞれの系統群内の全てのメンバーを含まないことを理由とし得る。しかしながら、本発明の結果は、依然として本発明の研究において疾患間を比較するために有効である。それというのも、系統群のメンバーの定義について同じ基準が使用されているからであり、すなわちＰＨＧＩが、配列番号３との特異的ハイブリダイゼーションによって定義され、かつＰＨＧＩＩが、配列番号４との特異的ハイブリダイゼーションによって定義されるからである。
両方の反応に関して、確実な定量は、７の対数の線形範囲にわたって、１反応当たり２０の標的遺伝子（Ｒ２＝０．９９８）から始まって、系統群Ｉについて８５．６８±３．２３％の平均効率で、かつ系統群ＩＩについて９０．３１±３．４０％の平均効率で可能であった。検知限界は、系統群Ｉ及び系統群ＩＩのそれぞれについて１．１０の標的遺伝子、及び２．３９の標的遺伝子であった。

Figure 2022031644000028
Figure 2022031644000029
実施例３． 健康者及び疾患者における腸管に沿った粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ並びに系統群Ｉ及びＩＩの保有率
全試料にわたる陽性の測定から計算されたＦ．プラウスニッツイ及び両方の系統群の保有率を、疾患状態によって全ての部位にわたる全てのデータを考慮して分析した（図１）。Ｆ．プラウスニッツイの保有率は、ＣＤ患者においてＨにおけるよりも低かった（図１）。Ｉ－ＣＤを伴うＣＤ患者は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＣ－ＣＤを伴う患者よりも低いＦ．プラウスニッツイ保有率を特徴とする。保有率値は、値が有意により低いＩ－ＣＤ（６８％まで下がる、Ｐ≦０．０４６）を除き、８１％～１００％の範囲であった。
系統群が考慮される限りは、両方とも、ＣＤ患者において、Ｈ群及びＣＲＣ群におけるよりも、特に回腸病変を伴うＣＤ患者において保有率が低い（Ｐ＜０．００１）ことが判明した（図１）。ＣＲＣ患者及びＵＣ患者については、保有率は、相変わらずＨと類似していた。それにもかかわらず、系統群Ｉは、潰瘍性全大腸炎においてより低い値の傾向を示し、それは、統計学的有意性（Ｐ＝０．０５３）に至らなかったが、それは恐らく、処理された試料の数が少なかったからであると思われる。同様にＩＢＳ患者は、Ｈ被験体と比較して低下した系統群Ｉの保有率のみを有していた。
両方の系統群は、Ｈ患者及びＣＲＣ患者のそれぞれからのＦ．プラウスニッツイを含有する試料の８５．４％及び８５．０％に共存した。系統群Ｉは、Ｈ被験体及びＣＲＣ被験体のうちの１０％において排他的であり、一方で、系統群ＩＩは、Ｈ被験体の４．２％において唯一の代表として見出された（図２Ａ）。それに対して、Ｆ．プラウスニッツイを有するＩＢＳ患者の１６％、ＵＣ患者の６％、及びＣＤ患者の２２％は、系統群Ｉも系統群ＩＩも保有せず、それはその他の系統群が存在することを示唆している。保有率の差は、ＩＢＤ疾患部位間で観察された。ＵＣの重症度が低い全ての患者（すなわち、Ｅ１及びＥ２）は、Ｈ被験体に似てＦ．プラウスニッツイ系統群の一方又は両方を有するが、潰瘍性全大腸炎患者の２３．１％には、Ｆ．プラウスニッツイを有するにもかかわらず上記系統群は検知されなかった（図２Ｂ）。同様に、全てのＣＤ患者の２２．２％は、いずれの系統群も示さなかった。ＣＤ患者の範囲内で、Ｃ－ＣＤ患者の４７．１％は、両方のＦ．プラウスニッツイ系統群を有したが、一方で、単独の系統群の存在が、回腸病変を伴うＣＤ患者においてはより頻度が高かった（ＩＣ－ＣＤ患者の４４．４％及びＩ－ＣＤ患者の２８．０％）。注目すべきことに、単独の系統群がＩ－ＣＤにおいて見られた場合にはいつでも、それは常に系統群ＩＩであった。
Ｈ被験体及びＣＲＣ被験体の大多数が、検知可能レベルよりもはるかに高く両方の系統群を保有し、その一方で、ＩＢＳ患者及びＩＢＤ患者、特にＣＤ患者は、系統群の一方の保有率の低下を特徴とする。さらに、系統群Ｉ及びＩＩは、Ｆ．プラウスニッツイを有するＩＢＳ患者の１６％及びＣＤ患者の２２％において検知されなかった。これらの結果は、これらの疾患におけるＦ．プラウスニッツイ群叢内の不均衡を示唆し、少なくとももう１種の系統群の存在を示唆している。
実施例４． 健康者及び疾患者における粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ並びに系統群の存在量
一緒にまとめられた全ての生検材料からのＦ．プラウスニッツイ及びその系統群の存在量を、種々の腸障害を有する患者及びＨ被験体の間で比較した（表１７）。Ｆ．プラウスニッツイは、ＩＢＤ患者及びＣＲＣ患者において、健康な被験体と比較して存在量が少なく（Ｐ＜０．００１）、一方で、ＩＢＳ患者は、Ｈ群と非常に似ていた。以前に報告されたように（非特許文献２２）、ＵＣ患者のなかで、Ｅ１及びＥ３を伴う患者は、Ｈ被験体と類似したＦ．プラウスニッツイ負荷量を表すが、Ｅ２を伴う患者は、ＣＤ患者とＨ被験体との間の存在量を有していた。ＣＤ患者において、回腸病変を伴う患者は、この細菌の最も低い水準を表すが、Ｃ－ＣＤ患者は、ＵＣと類似していた（表１７）。
Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉの負荷量は、分析された全ての腸疾患において、ＩＢＳ
患者を除いて、Ｈ被験体と比較して低下したが、それは恐らく、含まれる患者数が少ないことと、データの分散が高いことが原因であると思われる。この低下は、特にＣＤ患者において顕著であり、そのＣＤ患者は、Ｈ被験体より１０００分の１の低い値を有していた（Ｐ＜０．００１）。疾患部位によりデータを解析した場合に、全てのＣＤ患者は、系統群Ｉの存在量の顕著な低下を、その他のＵＣ疾患部位を有する患者と比べてよりＣＤ患者と似たＥ３を伴うＵＣ患者と同様に示した。それに対して、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量は、ＣＤ患者において、特に回腸病変を伴う患者（Ｉ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤのいずれか）においてのみＨと比較して有意に低下し（Ｐ＜０．００１）（表１７）、それは、これらの患者において、Ｆ．プラウスニッツイの減少が、フィーカリバクテリウム細菌の群叢全体に影響を及ぼすことを示唆している。
Figure 2022031644000030
本発明のデータは、粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ負荷量が、ＣＲＣ患者及びＣＤ患者において、特に回腸病変を伴う患者において顕著に低下することを示している。Ｆ．プラウスニッツイは、ＣＲＣ患者の５％及びＣＤ患者の２０％において該方法の検知限界（１反応当たり１０６．６のＦ．プラウスニッツイの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）を下回った。ＵＣ患者はまた、Ｈ被験体よりも低いＦ．プラウスニッツイ存在量を特徴としていたが、この減少は、ＣＤ患者及びＣＲＣ患者において観察される減少よりも程度は４分の１の小ささであった。最後に、ＩＢＳ患者における存在量は、Ｈ被験体と類似していた。本発明の研究は、成人のＣＤ、ＵＣ及びＣＲＣにおいてＦ．プラウスニッツイの存在量及び／又は保有率がより低いことが判明した以前の報告と一致している。ＩＢＳ患者においてＦ．プラウスニッツイ負荷量に減少は観察されなかったが、この観察は、コホートサイズが小さく、それがまた疾患型によって分類されていなかったことにより偏ったのかもしれない。
一般的には、この定量解析は、系統群Ｉの存在量の減少が異常な腸状態における一般的な特徴である一方で、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの減少は、回腸疾患部位を伴うＣ
Ｄ患者に特異的であると思われることを示した。
実施例５． 粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群の存在量の診断バイオマーカーとしての有用性
２つの患者の群を鑑別するための指標としての総Ｆ．プラウスニッツイ存在量の推定精度を試験するために行われたＲＯＣ曲線解析により、この種の負荷量の低下が、ＣＲＣ患者とＨ患者及びＩＢＳ患者との良好な識別因子であることが確認され、そのＡＵＣ値は０．８より大きく、定められた閾値で８０％の特異度及び７０％より高い感度を有していた（図３）。またＣＤ患者とＨ患者とでも良好な識別が観察されたが、同じ特異度値の場合に、感度は６２％にまで減少した。興味深いことに、系統群Ｉの存在量は、Ｈ被験体とＩＢＤ被験体とを判別するための、総Ｆ．プラウスニッツイ存在量よりも精密な指標であった（図３）。Ｈ被験体とＵＣとを比較した場合に、定められた閾値での７６．６０％より高い感度及び５７．１４％より高い特異度は、潰瘍性全大腸炎（Ｅ１）は除くが、全ての疾患部位に関して達成された。特異度は、Ｅ３患者のみを考慮した場合に７０％まで改善した。さらに、系統群Ｉの存在量は、Ｈ患者とＣＤ患者とを判別するために（９１．４８％の感度、７３．０２％の特異度）、特にＨ患者とＩ－ＣＤを伴う患者とを判別するために（９１．４８％の感度及び８８．００％までの特異度を達し得た）特に正確なバイオマーカーであった。系統群ＩＩの存在量は、Ｈ被験体とＣＤ被験体とを正確に識別し得るが、ＡＵＣ値は、系統群Ｉについて得られた値よりも僅かに低く、そのため系統群ＩがＨ状態のためにより適したバイオマーカーであることが示される。それに対して、系統群ＩＩは、ＩＢＤサブタイプのなかを識別するための有用なバイオマーカーであった。それというのも、潰瘍性全大腸炎患者と、結腸病変を伴うＣＤ患者とを判別するために、最良のＡＵＣ値が得られたからである（系統群ＩＩのＥ３対Ｃ－ＣＤについてのＡＵＣ＝０．８１７）。
図３は、受信者動作特性解析（ＲＯＣ曲線）によって得られた曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される、粘膜関連のＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量の、種々の腸障害とＩＢＤサブタイプ（部位による）とを判別するためのバイオマーカーとして使用するための適性についてのヒートマップを示す。図４及び図５は、ＲＯＣ曲線、計算されたＡＵＣ値、並びに選択された群比較のための最適なカットオフ点についての特異度及び感度値を示している。さらに、実施例の節の終わりにある表２９～表３５は、それらの選択された群比較のためのＲＯＣ曲線の座標を示す。
まとめると、粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）の存在量は、腸疾患、特にＩＢＤ、ＣＤ及びＩ－ＣＤの良好なバイオマーカーであることが判明した。それというのも、ＰＨＧＩ存在量は、Ｈ被験体と腸疾患患者とを、Ｈ対ＩＢＳ＋ＩＢＤ＋ＣＲＣについての０．８０４のＡＵＣで正確に識別することができるからである。ＰＨＧＩはまた、総Ｆ．プラウスニッツイ存在量（ＡＵＣ：０．７２４）又はＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６９３）よりも良好な識別因子である。ＰＨＧＩ存在量のＨ＋ＩＢＳ対ＩＢＤ＋ＣＲＣについてのＡＵＣは、０．７５３であった。
さらに、ＰＨＧＩ存在量は、Ｈ被験体とＩＢＤ（ＵＣ＋ＣＤ）患者とを高い精度（ＡＵＣ：０．８１６）で識別することが示され、その存在量は、総Ｆ．プラウスニッツイ存在量（ＡＵＣ：０．７２０）又はＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６９９）よりも良好な識別因子であった。
さらに、ＰＨＧＩ存在量は、Ｈ被験体とＣＤ患者とを、８０％の特異度及び７８％の感度で判別するための（ＡＵＣ：０．８５８）、総Ｆ．プラウスニッツイ負荷量よりも正確な指標であった。さらに、９１．４８％という高さの感度値を、７３．０２％の良好な特
異度を維持しつつ達成することができた。より具体的には、ＰＨＧＩ存在量は、９１．４８％の感度を有する回腸部位（Ｉ－ＣＤ）の特に良好な指標であることが示され、８８．００％までの特異度を達成することができた。また精度値は、総Ｆ．プラウスニッツイ存在量及びＰＨＧＩＩについて得られたものよりも良好であった（ＰＨＧＩのＡＵＣ：０．９４８対総ＦＰのＡＵＣ：０．８７５及びＰＨＧＩＩのＡＵＣ：０．７７２）。
他方で、ＰＨＧＩＩ存在量は、ＩＢＤサブタイプのなかでの良好な識別能力を示した。特に、潰瘍性全大腸炎患者（ＵＣ－Ｅ３）と結腸病変を伴うＣＤ患者（Ｃ－ＣＤ）とを高い精度で判別することが示され（Ｅ３対Ｃ－ＣＤについてのＡＵＣ ０．６９１）、これらの２つの障害は、類似の臨床症状を呈することがあり、かつ両者とも結腸領域に局在される。ＵＣとＣＤとの処置及び管理における差異のため、ＵＣ－Ｅ３とＣ－ＣＤとの精密な識別に適切である。さらに、ＰＨＧＩＩは、Ｃ－ＣＤとＩＣ－ＣＤとの適切な識別因子（ＡＵＣ：０．６１１）であることが分かり、したがって、結腸領域から回腸領域までの疾患進行の指標として使用され得る。
実施例６． 患者の臨床データ及び処置データに関連する粘膜中のＦ．プラウスニッツイ及び系統群の存在量
１． 疾患活動性状態
Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群の存在量は、活動性及び非活動性のＵＣ患者の間で相違しなかった（表１８）。統計学的有意性に至らなかったが、活動性ＣＤ患者は、系統群Ｉ存在量について、寛解状態にあるＣＤ患者に対して顕著な低下を示した（Ｐ＝０．１０６）。
Figure 2022031644000031
両方の系統群を含むＦ．プラウスニッツイの存在量が寛解下により低く留まると思われる事実は、この減少が、早期の疾患段階に生ずるか、それどころか疾患発症の前にさえも生ずることがあり、内視鏡的寛解及び臨床的寛解があったとしても時間の経過と共に変化したままとなるということを示唆している。統計学的有意差が観察されないにもかかわらず、活動性ＣＤ患者は、非活動性の患者と比べて系統群Ｉの水準の低下を表した。
２． 腸切除
Ｆ．プラウスニッツイの存在量は、腸切除を受けたＣＤ患者において低下した（表１９）。興味深いことに、これは、腸手術されていない患者よりも切除されたＣＤ患者において１０分の１の低さである（Ｐ＝０．００１）より低い系統群ＩＩの存在量を原因とする
かもしれないが、その一方で、系統群Ｉの負荷量は、切除された患者と切除されていない患者とで僅かにより低いだけであった。
Figure 2022031644000032
切除されたＣＤ患者においては、より少ない数のＦ．プラウスニッツイが検知された。この減少は、系統群の計数でも再現される。この場合にそれにもかかわらず、統計学的有意差は系統群ＩＩについて達成されたにすぎなかった。それというのも恐らく、その減少は、より顕著であるからである。
３． 投薬
最終的に、治療に関する限りは、データは、試料採取の時点での患者の投薬を考慮して分析された（表２０）。どのＩＢＤ内での投薬間にも、Ｆ．プラウスニッツイ又は系統群の存在量に差異は観察されなかった。しかしながら、処置を受けない又はメサラジンが投与されたＣＤ患者は、中程度の免疫抑制剤又は抗腫瘍壊死因子を受けている患者よりも高いＦ．プラウスニッツイ負荷量を有していた。投薬は、これらの細菌性指標の通常レベルの回復とは関連しなかった。
一般的には、使用された投薬が、粘膜関連Ｆ．プラウスニッツイ又はその系統群の水準を回復しないことが観察され、それは以前の報告と一致している（非特許文献２２）。
Figure 2022031644000033
４． 疾患継続期間
疾患継続期間に関して、疾患発症からの時間と、Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群の存
在量とに、統計学的に有意な相関は見られなかった（表２１）。
Figure 2022031644000034
実施例７． 糞便試料におけるＦ．プラウスニッツイ系統群の定量の材料及び方法
１． 患者、臨床データ及び試料採取
２０人のＩＢＤ（１２人のＣＤ及び８人のＵＣ）、並びに１２人のＨからなるスペイン人のコホートを登録した（表２２）。被験体は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、
ジローナ）（スペイン、サルト）の胃腸内科によって募集された。被験体は、全ての群について年齢マッチング及び性別マッチングされた。ＩＢＤ患者は、標準的な臨床的、病理学的、かつ内視鏡的な基準に従って診断され、モントリオール分類（非特許文献２）に従って類別された。全ての患者の臨床関連データが収集された。どの被験体も、試料収集の前少なくとも１ヶ月間にわたり抗微生物処置を受けていなかった。
それぞれの被験体は糞便試料を提供し、それらの糞便試料は、受託後２４時間以内に、Dr.Josep Trueta大学病院の胃腸内科で収集された。全ての試料を均質化し、２ｍｌチュ
ーブにアリコートに分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。
この研究は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、ジローナ）及びジローナのInstitut d'Assistencia Sanitaria（スペイン、サルト）の臨床研究倫理委員会によって、２０
１５年１月に承認された。被験体からのインフォームドコンセントは、登録前に取得した。
Figure 2022031644000035
試料処置及びＤＮＡ抽出
ＤＮＡは、２００ｍｇ～５００ｍｇの糞便試料からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｓｏ
ｉｌ Ｋｉｔ（Macherey-Nagel GmbH& Co.社、ドイツ、デューレン）を使用して抽出した。ＤＮＡ回収を改善するために、それぞれの試料にＳＬ１（７００μｌ）及びＥｎｈａｎｃｅｒ ＳＸ（１５０μｌ）を添加した。その後に、ＤＮＡを、製造元からの説明書に従って抽出及び精製した。ゲノムＤＮＡは、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）で溶出させ、使用するまで－８０℃で貯蔵した。ＤＮＡ濃度及び抽出物の純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１００分光光度計（NanoDrop Technologies社、米国）で測定した。
３．ｑＰＣＲアッセイ
ｑＰＣＲアッセイは、実施例１に説明される通りに実施した。
４．データ正規化及び統計解析
データの正規化及び統計解析は、実施例１に説明される通りに実施した。
実施例８． 健康者及び疾患者における糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＩＩの保有率
全試料にわたる陽性の測定から計算されたＦ．プラウスニッツイ系統群の保有率を、疾患状態と疾患部位の両方によって分析した（表２３）。両方の系統群は、ＣＤ患者において、特にＩ－ＣＤ患者において、Ｈ被験体におけるよりも保有率が低いことが判明した。興味深いことに、Ｃ－ＣＤ患者は、より低い系統群Ｉの保有率を有していたが、ＩＣ－ＣＤ患者は、より低い系統群ＩＩの保有率を特徴としていた。それに対して、ＵＣ患者のみが、Ｈ被験体に対してより低い系統群ＩＩの保有率を有しており、このことは、Ｅ２患者においてのみ観察された。より大規模な患者のコホートによる追加のアッセイを、好ましくは観察された傾向を確認するために実施すべきである。
Figure 2022031644000036
生検試料における結果とは対照的に、全てのＩＢＤ患者は、Ｆ．プラウスニッツイ系統群の少なくとも１種を有していた。両方の系統群は、Ｈからの試料の全てにおいて、そしてＩＢＤ患者の大多数（ＵＣの７５％及びＣＤの６６．７％）において共存していた。系統群Ｉは、ＣＤの２５％（２人のＩ－ＣＤ及び１人のＩＣ－ＣＤ）並びにＵＣの２５％（一方はＥ２患者、もう一方は疾患部位を決定することができなかった患者）において排他的であったが、系統群ＩＩは、ＣＤ患者において唯一の代表として見出された（ＣＤ被験
体の８．３％）。
実施例９． 健康者及び疾患者における糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量
糞便試料からのＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量を、種々の腸障害を伴う患者とＨ被験体とで比較した（表２４）。Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉの負荷量は、分析された全てのＩＢＤ患者において、Ｈ被験体と比較して低下した。この低下は、特にＣＤ患者において顕著であり、その患者は、Ｈ被験体よりも１８６分の１の低い値を有していた。しかしながら、観察された差異は、統計学的に支持されず、それは恐らく、含まれる患者数が少ないことと、データの分散が高いことが原因であると思われる。疾患部位によってデータを解析した場合に、全てのＣＤ患者は、系統群Ｉの存在量のこの顕著な低下を示した。ＵＣ患者は、Ｈ患者とＣＤ患者との中間値を特徴としていたが、生検材料で観察されたように、Ｅ３患者が、その他のＵＣ疾患部位を伴う患者よりもＣＤ患者に似ているかを決定することはできない。それというのも、この研究ではこの疾患部位を伴う被験体しか含まれていなかったからである。Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量はまた、ＩＢＤ患者において、特に結腸病変を伴う患者（Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤのいずれか）で、Ｈと比較して低下し（表２４）、それは、これらの患者の糞便において、Ｆ．プラウスニッツイの減少が、フィーカリバクテリウム細菌の群叢全体に影響を及ぼすことを示唆している。これらの結果は、回腸病変を伴う患者においてのみ系統群ＩＩの低下が観察された生検試料で観察された結果とは対照的である。それぞれの疾患部位を伴うより多くの被験体数を含む更なる分析を、これらの観察を確かめるために実施すべきである。このことは、糞便／粘膜の間でのこの系統群の異なる分布によって説明することができるか、さもなくば炎症過程が、疾患部位に応じて様々な影響を及ぼすことを理由に説明することができる。
Figure 2022031644000037
興味深いことに、Ｈ患者及びＵＣ患者について、両者の系統群の存在量の不均衡があることが観察され、その際、系統群ＩＩは、系統群Ｉよりも１０倍多い量である。それに対して、ＣＤ患者は、両方の系統群の類似した存在量を特徴としていた。このことは、Ｈ被験体、ＣＲＣ被験体及びＩＢＳ被験体において２つの系統群の存在量が類似している一方で、ＩＢＤ患者では系統群ＩＩが系統群Ｉの数を上回ることが分かった、生検試料で観察された結果と一致していない。
ここで、糞便試料においてＩＢＤ部位の間でＦ．プラウスニッツイ系統群の負荷量において差異があることが確証された。例えば、系統群ＩＩの存在量は、遠位ＵＣ患者において、潰瘍性全大腸炎患者と比較して特に低下する。さらに、この系統群は、Ｉ－ＣＤ患者と結腸病変を伴う患者とを鑑別することも可能にした。
実施例１０． 糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量の診断バイオマーカーとしての有用性
２つの患者の群間を鑑別するための指標としての糞便中のＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量の推定精度を試験するために行われたＲＯＣ曲線解析により、系統群Ｉの負荷量の低下がＣＤ患者（特に回腸病変を伴う患者）とＨ患者との良好な識別因子であることが確認され、そのＡＵＣ値は、定められた閾値で８０％の特異度及び５８％より高い感度で、０．７５より大きかった（図６）。同様の値は、ＣＤ患者とＵＣ患者（entities）とを識別するために得られ、その識別は、ＩＣ－ＣＤとＥ３との間で優れており、そのＡＵＣ値は、０．９より大きかった。それに対して、この識別因子に関する、Ｈ患者とＵＣ患者との識別能力は、生検材料で観察された結果と比較してより低かった。
系統群ＩＩの存在量はまた、Ｈ被験体とＩＢＤ被験体とを識別することもできたが、ＵＣ患者とＣＤ患者とを判別するには適切ではなかった。生検材料においては、系統群ＩＩからのＡＵＣ値は、系統群Ｉについて得られた値よりもわずかに低いことが観察され、その一方で、糞便におけるこの指標の存在量は、Ｅ３患者と結腸病変を伴うＣＤ患者（Ｃ－ＣＤ又はＩＣ－ＣＤのいずれか）とを判別するための優れたバイオマーカーであった（ＡＵＣ＝１．０００）。
図６は、受信者動作特性解析（ＲＯＣ曲線）によって得られた曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される、糞便におけるＦ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＦ．プラウスニッツイ系統群ＩＩの存在量を、種々のＩＢＤ診断及びＩＢＤサブタイプ（部位による）の間を判別するためのバイオマーカーとして使用するための適性についてのヒートマップを示す。図７及び図８は、ＲＯＣ曲線、計算されたＡＵＣ値、並びに選択された群比較のための最適なカットオフ点についての特異度及び感度値を示している。さらに、実施例の節の終わりにある表３５～表４１は、それらの選択された群比較のためのＲＯＣ曲線の座標を提供する。
まとめると、ＰＨＧＩの存在量は、ＩＢＤの診断のための糞便における良好なバイオマーカーとして確認され、該バイオマーカーは、Ｈ被験体とＩＢＤ患者との良好な識別能力を示し、そのＡＵＣは０．７２０であり、特にＣＤの診断については０．７８５のＡＵＣを有していた。ＰＨＧＩＩの存在量はまた、ＣＤとの良好な相関を示すが、精度値（ＡＵＣ：０．７１５）は、ＰＨＧＩ存在量で得られた値よりも僅かに低い。したがって、ＰＨＧＩ存在量は、糞便試料における、ＩＢＤの検知のための、特にＣＤの検知のための良好なバイオマーカーとして確認された。
他方で、潰瘍性全大腸炎に罹患した患者（ＵＣ－Ｅ３）と結腸病変を伴うＣＤ患者（Ｃ－ＣＤ）との鑑別診断のためのバイオマーカーとしてのＰＨＧＩＩ存在量の値を、糞便において確認したが（ＡＵＣ：０．６６７）、精度値は、粘膜試料について得られた値よりも僅かに低い。
さらに、ＰＨＧＩＩは、Ｃ－ＣＤとＩＣ－ＣＤとの良好な識別因子であることが確認され（ＡＵＣ：０．８８９）、それは、以前にＣ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の回腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するにあたってのその潜在的な値を示唆している。さらに、ＲＯＣのＡＵＣ値がわずかにより低いにもかかわらず、ＰＨＧＩＩはまた、Ｉ－ＣＤとＩＣ－ＣＤとの適切な識別因子として指摘され（ＡＵＣ：０．６６７
）、それは、以前にＩ－ＣＤと診断されたヒト被験体において、該疾患の結腸領域までの拡張（ＩＣ－ＣＤ）を測定するための有用なバイオマーカーであるかもしれない。
実施例１１． 患者の臨床データ及び処置データに関連する糞便中のＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量
１． 疾患活動性状態
Ｆ．プラウスニッツイ系統群の存在量は、活動性及び非活動性のＩＢＤ患者で相違しなかった（表２５）。生検材料で観察された結果と対照的に、活動性ＩＢＤ患者は、非活動性患者よりも高い存在量を有していた。統計学的有意性には至らなかったが、非活動性ＵＣ患者は、系統群Ｉ存在量について、寛解状態にあるＵＣ患者に対して顕著な低下を示した（Ｐ＝０．０６８）。
Figure 2022031644000038
２． 腸切除
Ｆ．プラウスニッツイ系統群の存在量は、腸切除を受けたＣＤ患者において低下し（表２６）、それは生検材料で観察された結果と一致している。興味深いことに、このことは、両方の系統群の数がより少ないことの原因である可能性がある。しかしながら、これらの結果は、統計学的に支持されず、それは恐らく、患者数が少ないことと、データの分散が高いことが理由であると思われる。
Figure 2022031644000039
３． 疾患継続期間
疾患継続期間に関して、疾患発症以降の時間と、Ｆ．プラウスニッツイ系統群の存在量とに、統計学的に有意な相関は見られず（表２７）、それは生検試料において得られた結果と一致している。
Figure 2022031644000040
４． 試料採取時の投薬
最終的に、治療に関する限りは、データは、試料採取の時点での患者の投薬を考慮して分析された（表２８）。どの疾患内での投薬間にも、Ｆ．プラウスニッツイ系統群の存在量に差異は観察されなかった。生検材料と対照的に、ＣＤ患者において投薬の間の傾向は確認されなかった。興味深いことに、抗腫瘍壊死因子を伴うＵＣ患者は、Ｈ被験体で観察された存在量と類似した、糞便における両方の系統群の存在量を有していた。
Figure 2022031644000041
最終的に、患者の臨床データに関して、糞便において両方の系統群の負荷量が寛解状態ではより低いままであることが観察され、それは生検材料における本発明の結果と一致している。しかしながら、より大規模な患者のコホートにおける引き続いての研究が、これらの観察の実証のためには必要とされ、追跡研究は、糞便における予後マーカーとしてのそれらの潜在的な有用性を調べるためには興味深いことと思われる。
以前の研究と一致して、切除されたＣＤ患者においてはより少ない数のＦ．プラウスニッツイが検知された（非特許文献１５、非特許文献２２）。本発明の系統群の負荷量についての結果は、生検材料において観察された結果と一致している。しかしながらこの場合には、統計学的有意差には至らず、それは恐らく、参加した被験体のコホートが小さいことが理由であると思われる。
一般的には、使用された投薬が、ＣＤ患者の糞便における糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群の水準を回復させないことが観察され、それは生検材料に基づいた本発明の観察と一致している。

Figure 2022031644000042
Figure 2022031644000043
Figure 2022031644000044
Figure 2022031644000045

Figure 2022031644000046
Figure 2022031644000047
Figure 2022031644000048
Figure 2022031644000049

Figure 2022031644000050
Figure 2022031644000051
Figure 2022031644000052

Figure 2022031644000053
Figure 2022031644000054
Figure 2022031644000055
Figure 2022031644000056
Figure 2022031644000057
Figure 2022031644000058
Figure 2022031644000059
Figure 2022031644000060
Figure 2022031644000061
Figure 2022031644000062
Figure 2022031644000063
実施例１２． 糞便試料における総Ｆ．プラウスニッツイ、Ｆ．プラウスニッツイ系統群及びＥ．ｃｏｌｉの定量の材料及び方法
１． 患者、臨床データ及び試料採取
１１人の健康な被験体並びに２３人の炎症性腸疾患と診断された患者（ＩＢＤ）、１０人のクローン病と診断された患者（ＣＤ）、及び１３人の潰瘍性大腸炎と診断された患者
（ＵＣ）は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、ジローナ）の胃腸内科によって募集
された。それらのボランティアから、それらの処置の途中の異なる時間に６７件の糞便試料（２６件のＣＤ、３０件のＵＣ、１１件の健康者）を取得した（表４２）。
ＩＢＤ患者として募集された被験体は、標準的な臨床的、病理学的、かつ内視鏡的な基準に従って診断され、モントリオール分類（非特許文献２）に従って類別された。既知の胃腸障害を一切伴わない健康な被験体からなるコントロール群は、臨床基準に従って募集された。全ての患者からの臨床的に関連するデータ（例えば、年齢、性別、カルプロテクチンレベル、又は疾患年数）も収集した。患者全ては、相応のインフォームドコンセントに署名した。結腸鏡検査前１ヶ月以内及び手術前１ヶ月以内の抗微生物処置を、除外基準に含めた。
Figure 2022031644000064
この研究は、Dr.Josep Trueta大学病院（スペイン、ジローナ）及びジローナのInstitut d'Assistencia Sanitaria（スペイン、サルト）の臨床研究倫理委員会によって、２０
１６年５月１８日に承認された。
２． 試料収集、保存及び貯蔵
それぞれの被験体は糞便試料を寄与し、それらの糞便試料は、受託後２４時間以内に、Dr.Josep Trueta大学病院の胃腸内科で収集された。全ての被験体からの全ての試料を均
質化し、１０ｍｌチューブにアリコートに分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。
３． 試料処置及びＤＮＡ抽出
ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｓｏｉｌ Ｋｉｔ（Macherey-Nagel GmbH &Co.社、ドイツ、デューレン）を使用して抽出した。簡潔には、３０ｍｇ～７０ｍｇの糞便試料を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ｂｅａｄ－ｔｕｂｅ中に入れた。ＤＮＡ回収を改善するために、それぞれの試料に７００μｌのＳＬ１及び１５０μｌのＥｎｈａｎｃｅｒ（ＳＸ）を添加した。その後に、ＤＮＡを、製造元からの説明書に従って抽出及び精製した。ゲノムＤＮＡを、１００μｌの溶出バッファーで溶出させ、使用するまで－２０℃で貯蔵した。抽出物のＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Invitrogen detection Technologies社、米国）でＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａ
ｙ Ｋｉｔを用いて測定した。ｑＰＣＲ分析の前に、ＤＮＡ濃度を、ＤＮＡ不含の水を用
いて８ｎｇ／μｌに調整した。
４． 糞便試料から抽出されたＤＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
糞便試料からのＤＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。より具体的には、総フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（ＦＴ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）及びエシェリキア・コリ（ＥＣ）の量を評価した。細菌配列を、定量的リアルタイムＰＣＲと共にＴａｑｍａｎプローブベースのアッセイを使用して定量した。プライマー及びｑＰＣＲ条件は、実施例１に記載される通りであった。
試料は、同じプレート中で二重試験で実行した。データ解析のために、二重試験での定量の平均を使用した。それぞれの試料についての細菌存在量を、全ＤＮＡ濃度に正規化されたＣｔとして表現した。ここで、Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を通過するのに必要とされるｑＰＣＲサイクルの回数として定義される。Ｃｔレベルは、試料における標的核酸濃度の対数に反比例している。そのリアルタイムアッセイは、４０サイクルの増幅を経過する。
実施例１に対して方法論的相違を採り入れた。細菌コピー数は、総細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数に正規化するのではなく、Ｃｔを、全ＤＮＡ濃度に正規化した。ＦＴ、ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩＩ、及びＥＣのための新規アッセイは、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Applied Biosystems社、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）ではなく、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２ｘ（Promega社、米国、ウィンスコンシン州）から構成された。全ての細菌プライマーは
、Macrogen（韓国、ソウル）から購入した。そして全ての定量的ＰＣＲは、ＡｒｉａＭｘ
ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（旧Stratagene社のAgilent社、米国、カリフォルニア州、サン
タクララ）を使用して実施し、ＡｒｉａＭｘソフトウェアのバージョン１．２（旧Stratagene社のAgilent社、米国、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用して解析した。
採り入れた全ての相違を検証したが、それらの方法の間に差は認められなかった。
５． 統計解析の方法
データの統計的正規分布を、コルモゴロフ－スミルノフ検定によって解析した。データの統計的正規分布が存在するか否かに応じて、以下の群を比較するために適切な統計的検定を使用した。正規分布を有する群の比較には通常のｔ検定が使用されたが、正規分布を有さない群の比較にはマン－ホイットニーのノンパラメトリック検定が使用された。解析された群は、健康者対ＣＤ、健康者対ＵＣ、及びＣＤ対ＵＣであり、両方の疾患の種々の部位は、ＣＤについては、回腸（Ｉ）、回腸結腸（ＩＣ）及び結腸（Ｃ）であり、ＵＣについては、遠位（Ｅ２）及び広汎性（Ｅ３）であった。
これらの群に関して、解析された変量は、
－ 総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）及びＥ．ｃｏｌｉに相当する本明細書に記載される４つの細菌配列のＣｔで表現される定量、並びに、
－ これらの４つの細菌配列の定量の比率、
であった。
総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ、系統群ＩＩ及びＥ．ｃｏｌｉの間の様々な比率は、第１の配列の定量レベルから、第２の配列の定量レベルを引き算することによって得られた。
さらに、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析、つまり真陽性率（感度）対偽陽性率（１－特異度）のプロットを行って、Ｆ．プラウスニッツイ及びそれぞれの系統群の種々の腸障害を判別するための有用性を評価した。識別の精度は、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって判断された。ＡＵＣが１に向かうと、その試験の感度が高いだけでなく特異度も高いことを示しており、その一方で、ＡＵＣが０．５に向かうと、その試験の感度も特異度もないことを示している。感度及び特異度の値は、パーセント（％）で表現される。
全ての統計解析は、ＳＰＳＳ １５．０統計学的パッケージ（LEAD Technologies, Inc.社）を使用して実施した。有意水準は、Ｐ値≦０．０５の場合に確立された。図式化は
、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。
実施例１３． 健康者及び疾患者における糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＩＩの保有率
全試料にわたる陽性の測定から計算されたＦ．プラウスニッツイ系統群の保有率を、疾患状態（ＣＤ及びＵＣ）、並びに疾患部位（ＣＤについては、回腸（Ｉ）、回腸結腸（ＩＣ）及び結腸（Ｃ）、そしてＵＣについては、遠位（Ｅ２）及び広汎性（Ｅ３））の両方によって解析した（表４３）。両方の系統群は、ＣＤ患者において健康な個体よりも保有率が低いが、系統群Ｉは、系統群ＩＩよりも有意に低下した。興味深いことには、系統群Ｉは、Ｃ－ＣＤ試料において、Ｉ－ＣＤ及びＩＣ－ＣＤよりも低い保有率を有していたが、系統群ＩＩの低下は、Ｃ－ＣＤの場合に排他的であった。
実施例８とは対照的に、ＵＣ患者のみが、健康な個体と比較してより低い系統群Ｉの保有率を有していた。より低い保有率は、遠位ＵＣと比較して広汎性ＵＣの場合に排他的であった。
Figure 2022031644000065
実施例１４． 健康者及び疾患者における糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量
糞便試料からのバイオマーカーの存在量を、健康な被験体（Ｈ）及び種々のＩＢＤ患者の間で個別に（Ｈ対ＣＤ、Ｈ対ＵＣ）比較した（表４４、図９Ａ～図９Ｅ）。健康な被験体を、ＩＢＤとも比較した（ＣＤ患者及びＵＣ患者の両方を一緒に考慮して）（図９Ｆ～図９Ｉ）。
総Ｆ．プラウスニッツイの負荷量は、解析されたＩＢＤ患者において、Ｈ被験体と比較して減少した（図９Ａ）。ＣＤ患者において観察された差は統計学的な差であったが、ＵＣ患者においてはその差は統計学的に支持されなかった。
Ｆ．プラウスニッツイＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩのＣｔは高まったので、その存在量は、ＩＢＤ患者においてＨと比較して低下した（図９Ｂ及び図９Ｃ）。ＰＨＧＩの存在量は、ＣＤ患者においてのみ有意に低下し（図９Ｃ）、一方で、ＰＨＧＩＩ存在量は、ＣＤ患者及びＵＣ患者の両方で低下した（図９Ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉ存在量は、ＩＢＤにおいてＨ被験体と比較して有意に増大した（図９Ｄ）。この増大は、ＣＤ患者において特に顕著であった。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ存在量は、ＣＤ患者においてＵＣ患者と比較して有意に増大した（図９Ｅ）。
予想されるように、ＨとＩＢＤ疾患とを比較した場合に、総Ｆ．プラウスニッツイ及びその系統群の両方の存在量は、ＩＢＤ患者において低下した（図９Ｆ～図９Ｈ）が、一方でＥ．ｃｏｌｉの負荷量は増大した（図９Ｉ）。
まとめると、ＣＤ患者においては、微生物学的プロファイルは、ＦＴ、ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩＩの存在量が低下し、かつＥ．ｃｏｌｉが増大することを特徴としている。ＵＣ患者の場合には、微生物学的プロファイルは、ＰＨＧＩＩの低下及びＥ．ｃｏｌｉの増大によって定義される。
Figure 2022031644000066
バイオマーカーの比率を、健康な試料とＣＤ試料及びＵＣ試料の両方とでも比較した（表４５）。比率ＦＴ／ＥＣ、ＰＨＧＩ／ＥＣ、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣは、ＩＢＤ試料において健康な試料と比較して有意に増大した。さらにまた、ＣＤ、ＵＣ及び健康な個体の間の３つの比率については有意差が認められた（図１０Ａ、図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。またＦＴ／ＰＨＧＩの比率は、ＣＤにおいて健康な試料と比較して有意に増大した（図１０Ｄ）。最後に、３つの群間のＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩの比率において統計学的な差は認められなかった。
さらに、Ｈの比率とＩＢＤの比率とを対比した場合に、ＦＴ／ＥＣ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率においても有意差が認められた（図１０Ｅ～図１０Ｇ）。
まとめると、ＣＤ若しくはＵＣとＨとを比較した場合、又はそれらの間を比較した場合に観察される差により、ＩＢＤ試料は、糞便の微生物学的プロファイルにおけるＦＴ／ＥＣ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣの数の変化を表し、かつＦＴ／ＰＨＧＩの変化
は、ＵＣ試料の場合に排他的であると結論付けることができる。
Figure 2022031644000067
実施例１５． 糞便のＦ．プラウスニッツイ系統群の存在量の診断バイオマーカーとしての有用性
ＲＯＣ曲線解析を実施して、糞便のＦ．プラウスニッツイ全体、その系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量の、２つの患者の群間を区別するための指標としての推定精度を試験した。結果は、図１１に示される。
健康な消化状態を最も良く識別する微生物学的プロファイルは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈ対ＣＤ－ＡＵＣ：０．８６０、感度８１．８及び特異度７６．９、図１１Ａ；Ｈ対ＵＣ－ＡＵＣ：０．７１５、感度７２．７及び特異度６６．７、図１１Ｄ）、ＦＴ／ＰＨＧＩ（Ｈ対ＣＤ－ＡＵＣ：０．７０６、感度６３．６及び特異度７３．１、図１１Ｂ；Ｈ対ＵＣ－ＡＵＣ：０．６４７、感度６３．６及び特異度７０、図１１Ｅ）、及びＦＴ／ＰＨＧＩＩ（Ｈ対ＣＤ－ＡＵＣ：０．６７５、感度５４．５及び特異度６５．４、図１１Ｃ；Ｈ対ＵＣ－ＡＵＣ：０．６８２、感度７２．７及び特異度６３．３、図１１Ｆ）によって構成されている。図１１Ａ～図１１Ｆは、健康な個体を規定する細菌バイオマーカーの性能を説明している。
幾つかのマーカーは、０．７０より大きいＡＵＣ値を有する、ＣＤ患者についての良好な識別因子として確認された（図１１Ｇ～図１１Ｌ）。より具体的には、総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．７５５、感度８０．８及び特異度７２．７、図１１Ｇ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：０．７１０、感度６５．４及び特異度８１．８、図１１Ｈ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：０．７９７、感度７６．９及び特異度７２．７、図１１Ｉ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８６７、感度８０．１及び特異度８１．８、図１１Ｊ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８８５、感度８８及び特異度７２．７、図１１Ｋ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８７４、感度８０．１及び特異度８１．８、図１１Ｌ）。
同じマーカーは、ＵＣについての良好な識別因子として確認されたが、それに対して、マーカーの識別能力は、０．７４５から０．６３５の間のＡＵＣで、ＣＤ患者において観察された結果と比較してより低かった（図１１Ｍ～図１１Ｒ）：総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．６３５、感度６３．３及び特異度７２．７、図１１Ｍ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：０．６４２、感度６０及び特異度６３．６、図１１Ｎ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：０．７００、感度６３．３及び特異度６３．６、図１１Ｏ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７２７、感度７０及び特異度７２．７、図１１Ｐ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７４５、感度７０及び特異度７２．７、図１１Ｑ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７４５、感度８０及び特異度６３．６、図１１Ｒ）
。
最終的に、ＣＤ疾患とＵＣ疾患とを識別するために、２種のマーカー及び３種の比率が、０．６００から０．６６９の間のＡＵＣで、良好な識別因子であると判明した（図１１Ｓ～図１１Ｘ）：Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：０．６００、感度６１．５及び特異度６０、図１１Ｓ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：０．６２３、感度６５．４及び特異度６６．７、図１１Ｔ）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＵＣ：０．６７２、感度６０及び特異度５７．７、図１１Ｕ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．６４２、感度６１．５及び特異度５６．７、図１１Ｖ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．６６９、感度６１．５及び特異度６６．７、図１１Ｗ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．６６２、感度６１．５及び特異度６３．３、図１１Ｘ）。
さらに、ＨとＩＢＤ（両方のＣＤ疾患及びＵＣ疾患を一緒に）とを区別するために、３種のマーカー及び３種の比率が、０．６７４から０．８０５の間のＡＵＣで、良好な識別因子であると分かった（図１１Ｙ～図１１ＡＤ）：総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．６９１、感度７１．４及び特異度７２．７、図１１Ｙ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：０．６７４、感度６０．７及び特異度７２．７、図１１Ｚ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：０．７４５、感度６９．６及び特異度７２．７、図１１ＡＡ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７８９、感度８０．４及び特異度７２．７、図１１ＡＢ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８０５、感度７６．８及び特異度７２．７、図１１ＡＣ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７９７、感度７３．２及び特異度７２．７、図１１ＡＤ）。
まとめると、最良の識別因子は、ＣＤ疾患については比率ＦＴ／ＥＣ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣであり、それは、０．８５０を上回るＡＵＣ値を有し、かつ８０％を上回る感度及び特異度を有することが判明した。
ＵＣに関しては、マーカーの識別能力はより低いけれども、最良の識別因子は、比率ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣであり、それは０．７４５のＡＵＣ値及び７０％を上回る感度を有することが分かった。
以下の図面は、上記の全てのマーカーについてのＲＯＣ曲線、ＡＵＣ値、並びに最適なカットオフ点の場合の特異度及び感度値を示している。
実施例１６． 種々の病変部位を伴うＣＤにおける総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量、並びに疾患部位／範囲による鑑別診断のためのバイオマーカーとしてのそれらの有用性
実施例１６．１． 存在量
ＣＤ試料を疾患部位によって分析し、回腸（Ｉ－ＣＤ）部位、結腸（Ｃ－ＣＤ）部位及び回腸結腸（ＩＣ－ＣＤ）部位を研究した。
総Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）の存在量は、結腸に位置する炎症を伴う患者において有意に低下し、一方で、ＰＨＧＩＩは、回腸部位で有意に増大した（表４６、図１２）。
Figure 2022031644000068
マーカー内での比率を、研究された種々の部位によっても比較した。ＦＴ／ＰＨＧＩ及びＰＨＧＩ／ＥＣは、結腸部位及び回腸結腸部位を比較した場合に有意差を示したが、ＦＴ／ＰＨＧＩＩは、結腸部位と回腸部位とで有意差を示した（表４７、図１３）。
Figure 2022031644000069
実施例１６．２． 有用性
ＲＯＣ曲線解析を実施して、糞便のＦ．プラウスニッツイ全体、その系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量並びにそれらの比率の、種々の疾患部位を鑑別するための指標としての推定精度を試験した。
ＣＤ患者における回腸部位
図１４において認められるように、４種のマーカーが、ＣＤ患者における回腸部位についての、０．６３２から０．７８９の間のＡＵＣを有する良好な識別因子として確認された。より具体的には、総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．６３２、感度８３．３及び特異度４７．４、図１４Ａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＵＣ：０．６６７、感度８３．３及び特異度５７．９、図１４Ｂ）、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．７１１、感度８３．３及び特異度５７．９、図１４Ｃ）、及びＦＴ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．７８９、感度８３．３及び特異度７８．９、図１４Ｄ）である。
ＣＤ患者における回腸結腸部位
回腸結腸部位に関して、ただ１種のマーカー、つまりＦＴ／ＰＨＧＩが、０．７７９のＡＵＣ、７８．６の感度及び７２．７の特異度を有する良好な識別因子として確認された（図１５）。
ＣＤ患者における結腸部位
最後に、ＣＤ患者における結腸領域については、７種のマーカーが良好な識別因子とし
て確認された（図１６）。より具体的には、総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．７５５、感度８０．０及び特異度７５．０、図１６Ａ）、ＰＨＧＩ（ＡＵＣ：０．８４５、感度８０．０及び特異度８０．０、図１６Ｂ）、ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６８５、感度６０．０及び特異度８５．０、図１６Ｃ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７７０、感度８０．０及び特異度８０．０、図１６Ｄ）、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６４０、感度６０．０及び特異度５５．０、図１６Ｅ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７７０、感度８０．０及び特異度８５．０、図１６Ｆ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．６７０、感度６０．０及び特異度８０．０、図１６Ｇ）である。
実施例１７． Ｃ－ＣＤ及びＵＣにおける総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量、並びにＣ－ＣＤとＵＣとの鑑別診断のためのバイオマーカーとしてのそれらの有用性
結腸のＣＤとＵＣとの鑑別診断は、臨床診療に関連している。こうして、これらの２つの群間で細菌マーカー及び比率を比較した。ＵＣ患者と比較した場合に、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ及びＩＩ並びにＥ．ｃｏｌｉについてのより低い存在量が、結腸病変を伴うＣＤ患者において観察される（表４８）。比率に関しては、ＰＨＧＩ／ＥＣ、ＰＨＧＩＩ／ＥＣ及びＦＴ／ＰＨＧＩは、これらの２つの群間で有意差を示す（表４９）。
Figure 2022031644000070
Figure 2022031644000071
ＲＯＣ曲線解析を実施して、糞便のＦ．プラウスニッツイ全体、その系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量並びにそれらの比率の、結腸病変を伴うＣＤ患者とＵＣ患者とを鑑別するための指標としての推定精度を試験した。図１７において認められるように、３種のマーカーは、ＵＣについての、０．６３７から０．８８０の間のＡＵＣを有する良好な識別因子として確認された。より具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＵＣ：０．７８０、感度８０及び特異度８０、図１７Ａ）、ＦＴ／ＰＨＧＩ（ＡＵＣ：０．８８０、感度７３．３及び特異度１００、図１７Ｂ）、ＦＴ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６３７、感度８０及び特異度６０、図１７Ｃ）。
結腸部位のＣＤ患者を識別するために、７種のマーカーが関連していた：ＦＴ（ＡＵＣ：０．７４０、感度８０及び特異度７３．３、図１８Ａ）、ＰＨＧＩ（ＡＵＣ：０．８３、感度８０及び特異度９０、図１８Ｂ）、ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．７７３、感度８０及び特異度６６．７、図１８Ｃ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７６０、感度８０及び特異度
９０、図１８Ｄ）、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．６６３、感度６０及び特異度６６．７、図１８Ｅ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８６０、感度８０及び特異度１００、図１８Ｆ）、ＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７８７、感度８０及び特異度８０、図１８Ｇ）。
まとめると、ＵＣ患者とＣＤ患者の結腸病変とを鑑別診断するための最良のマーカーは、ＥＣ、ＰＨＧＩ、ＦＴ／ＰＨＧＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣである。
実施例１８． 細菌バイオマーカーの存在量、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎における疾患活動性を測定するにあたってのそれらの有用性
実施例１８．１． 存在量
糞便試料からのバイオマーカーの存在量を、ＣＤ患者及びＵＣ患者において、カルプロテクチン値が２５０μｇ／ｇより低いか又はそれより高いか否かに応じて比較した。腸粘膜の炎症の非侵襲的マーカーとしてのカルプロテクチン濃度は、ＩＢＤ疾患活動性の測定のための参照マーカーとして通常使用され、すなわち、２５０μｇ／ｇより高いカルプロテクチンの値は、炎症応答の高いレベルの徴候とみなされている（表５０）。総Ｆ．プラウスニッツイ及び系統群の負荷量は、２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチンレベルを有する群において有意に低下したが、一方でＦＴは、ＣＤ及びＵＣの両方で低下し（図１９Ａ及び図１９Ｂ）、ＰＨＧＩＩ存在量は、ＣＤ患者においてのみ低下し（図１９Ｃ）、そしてＰＨＧＩ存在量は、ＵＣ患者においてのみ低下した（図１９Ｄ）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ存在量は、有意差を示さなかった。
まとめると、総Ｆ．プラウスニッツイは、活動性の疾患のマーカーである（すなわち、２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチン値と関連する）ことが判明した。さらに、興味深いことに、ＰＨＧＩは、活動性のＵＣについて除外的なマーカーであると考えられ、ＰＨＧＩＩは、活動性のＣＤについて除外的なマーカーであると判明した。
Figure 2022031644000072
比率ＦＴ／ＥＣ、ＦＴ／ＰＨＧＩ、ＦＴ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣを、さらにＣＤ患者及びＵＣ患者においてもカルプロテクチン値に従って比較した（表５１）。ＣＤ患者に関しては、ＰＨＧＩＩ／ＥＣの比率だけが有意に増大傾向を示し（図２０Ｄ）、一方でＵＣ患者においては、３種のマーカー、つまりＦＴ／ＰＨＧＩ（図２０Ａ）、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ（図２０Ｂ）及びＰＨＧＩ／ＥＣ（図２０Ｃ）に有意性が表された。これらのデータは、活動性のＣＤ疾患がＰＨＧＩＩによって表され、かつ活動性のＵＣがＰＨＧＩによって表される、マーカーを独立して研
究している上記結果と一致している。
Figure 2022031644000073
さらに、ＣＤ患者及びＵＣ患者における、カルプロテクチン濃度と、種々のマーカー及びそれらの比率との相関を、スピアマンの相関によって研究した。予想されるように、ＦＴは、ＣＤ及びＵＣの両方においてカルプロテクチン濃度と正に相関し、さらに一方で、ＰＨＧＩは、ＵＣ患者における糞便のカルプロテクチンと正に相関し、ＰＨＧＩＩは、ＣＤにおける正の相関の傾向を示した（表５２）。比率に関しては、傾向だけが観察された（表５２）。
Figure 2022031644000074
実施例１８．２． 有用性
その後に、ＲＯＣ曲線解析を実施して、糞便のＦ．プラウスニッツイ全体、その系統群、Ｅ．ｃｏｌｉの存在量及びそれらの比率の、２５０μｇ／ｇを下回るカルプロテクチンレベルと２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチンレベルとを鑑別するための指標としての推定精度を試験した。
種々のマーカーが、ＣＤ疾患のための良好な識別因子として確認された（図２１）。より具体的には：総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．９４０、感度８０及び特異度１００、図２１Ａ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：０．８２０、感度８０及び特異度６０、図２１Ｂ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：１．０００、感度１００及び特異度１００、図２１Ｃ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８４０、感度８０及び特異度８０、図２１Ｄ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．６４０、感度６０及び特異度８０、図２１Ｅ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．８８０、感度１００及び特異度８０、図２１Ｆ）。
さらに、ＵＣに関しては、幾つかのマーカーが良好な識別因子として検証された（図２２）：総Ｆ．プラウスニッツイ（ＡＵＣ：０．９００、感度１００及び特異度７５、図２２Ａ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群Ｉ（ＡＵＣ：１．０００、感度１００及び特異度１００、図２２Ｂ）、Ｆ．プラウスニッツイ系統群ＩＩ（ＡＵＣ：０．７００、感度６０及び特異度８７．５、図２２Ｃ）、ＦＴ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７２５、感度６０及び特異度８７．５、図２２Ｄ）、ＦＴ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．７２５、感度８０及び特異度６２．５、図２２Ｅ）、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ（ＡＵＣ：０．８２５、感度８０及び特異度８７．５、図２２Ｆ）、ＰＨＧＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．９２５、感度１００及び特異度８７．５、図２２Ｇ）、及びＰＨＧＩＩ／ＥＣ（ＡＵＣ：０．７００、感度６０及び特異度８０７．５、図２２Ｈ）。
幾つかのマーカーは、両方の疾患について一般的な識別因子であるが、ＣＤ疾患についてのＰＨＩＩ及びＵＣ疾患についてのＰＨＩは、２５０μｇ／ｇを上回るカルプロテクチンレベルに関する完璧な識別因子であると考えられ、そのＡＵＣは、１．０００であり、感度及び特異度は両者とも１００％であることを強調することが重要である（図２１Ｃ及び図２２Ｂのそれぞれ）。
実施例１９． 細菌バイオマーカーの存在量、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎の患者における疾患監視のためのそれらの有用性
糞便試料を、８人のクローン病（ＣＤ）患者及び７人の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者（診断から６ヶ月を超える）から臨床診療検査における２つの異なる時点（Ｔ０及びＴ１）で収集した。疾患活動性は、炎症応答の点で定義され、炎症活性は、患者の両方の群において糞便のカルプロテクチンの濃度を測定することによって追跡した。２５０μｇ／ｇを上回る糞便のカルプロテクチンのレベルを、高いレベルの炎症応答とみなし、２５０μｇ／ｇを下回るレベルを、非炎症応答とみなした。
これらの患者群のそれぞれについて、２つのサブグループを、処置とは独立してそのカルプロテクチン尺度のみを考慮して定義した：
（＋）増大した炎症活性：２つの時点の試料の間で２５０μｇ／ｇを上回る糞便のカルプロテクチンレベルの増大を伴う患者。
（－）低下した炎症活性：２つの時点の試料の間で２５０μｇ／ｇを下回る糞便のカルプロテクチンレベルの低下を伴う患者。
総フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ（ＦＴ）、系統群Ｉ（ＰＨＧＩ）、系統群ＩＩ（ＰＨＧＩＩ）及びエシェリキア・コリ（ＥＣ）の存在量を、２つの時点の試料で分析し、それらの炎症活性の進展に従って比較した。
種々の炎症活性の進展を伴うＣＤ患者において、細菌マーカー存在量（表５３）及び比率（表５４）において非統計学的な差が観察された。
それに対して、ＦＴ及びＰＨＧＩについての統計学的有意差を示したＵＣ（表５５）が観察された。これらの２つのマーカーの存在量は、監視期間に炎症活性の増大を表す患者において有意に減少した。同様に、比率ＦＴ／ＰＨＧＩも、増大した炎症活性の進展を伴うＵＣ患者において有意差を表した（表５６）。
２つの時点の試料の間の相関を試験するために（表５７）、ピアソン及びスピアマンの両方の相関検定を実施した。ＵＣ患者においてＦＴについて有意な相関が検知され、ＰＨＧＩＩ／ＥＣにおいて傾向が観察された。
まとめると、細菌マーカー存在量及びその比率、特にＦＴ、ＰＨＧＩ及びＦＴ／ＰＨＧＩの測定は、ＵＣ患者の追跡に関連し得る。
Figure 2022031644000075
Figure 2022031644000076
Figure 2022031644000077
Figure 2022031644000078
Figure 2022031644000079
実施例２０． 細菌バイオマーカーの存在量、並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎における処置効力の予測におけるそれらの有用性
生物学的処置を受けていない炎症応答の点で活動性疾患を伴う４人のクローン病（ＣＤ）患者及び３人の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の糞便試料を収集した。生物学的処置（抗ＴＮＦ剤）に対するその炎症応答（カルプロテクチン濃度により測定）を記録し、そして患者を処置に対するそれらの応答に応じて群分けした：
－ レスポンダー：生物学的処置の導入＊後に２５０μｇ／ｇを下回るカルプロテクチンレベルの減少を示す被験体。
－ ノンレスポンダー：生物学的導入＊後にカルプロテクチンレベルの増大を示す被験体。
＊導入：種々の処置投与量が与えられて治療用量に達する時点。
生物学的処置の前のこれらの患者の糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ、系統群ＩＩ及びＥ．ｃｏｌｉの存在量を研究して、これらの細菌マーカーの処置効力の予測能力を測定した（表１６）。ＣＤ患者又はＵＣ患者のどちらにおいても、レスポンダーとノンレスポンダーとの差は、有意差ではなく、それは恐らく、該研究に含まれる被験体数が少ないことが原因であると思われる。
それにもかかわらず、傾向が観察された（図２３）。ＣＤ及びＵＣのＦＴについてのＣｔは、２８．５７％及び２６．５８％であり、ノンレスポンダーにおいてレスポンダーと比べて増大した。ＰＨＧＩについてのＣｔも、ＵＣ及びＣＤにおいて増大した（それぞれ２６．８０％及び５３．９４％）。ＰＨＧＩＩについてのＣｔは、６６．８２％であり、ＵＣのノンレスポンダーにおいて増大した。それに対して、ＥＣについてのＣｔは、ＵＣ
及びＣＤのノンレスポンダーにおいて減少した（それぞれ－２０．９１％及び１４．５３％）。
ＣＤのノンレスポンダー被験体は、ＦＴ及びＰＨＧＩの低い負荷量及びＥＣの高い負荷量を伴う微生物学的プロファイルを特徴とすることが判明した。ＵＣのノンレスポンダーは、ＦＴ及びＰＨＧＩＩの低い負荷量並びにＥＣの高い負荷量を特徴としていた。
Figure 2022031644000080
糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群Ｉ、系統群ＩＩ及びＥ．ｃｏｌｉの存在量の間の比率：ＦＴ／ＥＣ、ＦＴ／ＰＨＧＩ、ＦＴ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩ、ＰＨＧＩ／ＥＣ及びＰＨＧＩＩ／ＥＣも計算した（表５９）。改めて標本サイズが小さいため、ここでも傾向だけが観察された。ＵＣにおいてより顕著な差が見られ、そこではＦＴ／ＥＣ、ＦＴ／ＰＨＧＩＩ及びＰＨＧＩ／ＰＨＧＩＩの比率は、ノンレスポンダー被験体において増大する傾向にあり、一方でノンレスポンダーＣＤ患者においては、ＦＴ／ＥＣ比率のみが増大傾向にあった（図２４）。
Figure 2022031644000081
研究された患者数が少ないにもかかわらず、カルプロテクチンレベルが生物学的処置に応答する患者と、応答しない患者とに興味深い傾向が観察された。
実施例２において、健康者及び疾患者における糞便の総Ｆ．プラウスニッツイ、系統群及びＥ．ｃｏｌｉの存在量が測定された。全て健康な患者と比較した場合に、Ｅ．ｃｏｌｉの存在量は、ＣＤ患者及びＵＣ患者の両方において増大するが、一方で、ＣＤ患者においては、ＰＨＧＩＩは低下し、かつＦＴ及びＰＨＧＩは減少することが示された。
本実施例においては、増大したＥ．ｃｏｌｉの存在量、低下したＦＴ及びその系統群の負荷量のいずれかが、抗ＴＮＦ処置を受けたＵＣ患者及びＣＤ患者の両方における炎症応答を予測し得ることが観察された。
まとめると、改善されたカルプロテクチン値は、恐らく、改善された微生物状態と関連しており、それは、健康状態において見られる値に近い値のレスポンダー患者におけるマーカーの値である。

Claims (29)

  1. 被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
    前記ＰＨＧＩ存在量の測定は、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含み、かつ、
    前記ＰＨＧＩＩ存在量の測定は、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブを使用することを含む、方法。
  2. ヒト被験体における腸疾患の検知、及び／又はヒト被験体における腸疾患の治療的処置における薬剤の効力の予測のための有用な情報を取得する方法であって、
    ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を、請求項１に記載の方法により測定することを含み、前記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択される、方法。
  3. ヒト被験体における腸疾患を検知する方法であって、以下の工程：
    ａ． 前記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、請求項１に記載の方法により測定する工程と、
    ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較する工程と、
    を含み、ここで、被験体試料値における前記参照試料に対する有意な偏差が、腸疾患の指標となり、前記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択され、かつ、
    前記参照試料は、好ましくは、健康な被験体の試料及び／又は腸疾患の寛解状態にある患者の試料である、方法。
  4. 前記方法は、ヒト被験体における腸疾患のスクリーニング及び／又は診断方法であり、かつ前記参照試料は、健康な被験体の試料及び／又は腸疾患の寛解状態にある被験体の試料である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記方法は、ヒト被験体における腸疾患の活動性及び／又は進行を監視する方法であり、かつ前記参照試料は、同じ被験体の以前の試料である、請求項３に記載の方法。
  6. ＩＢＤに罹患しているヒト被験体における処置の効力を予測する方法であって、
    ａ． 前記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、請求項１に記載の方法により測定することと、
    ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、参照試料における相応の値と比較することと、
    を含み、ここで、被験体試料値における前記参照試料に対する有意な偏差が、該処置に対する応答の可能性が増大した指標となり、かつ、
    前記参照試料は、好ましくは、健康な被験体の試料又は腸疾患の寛解状態にある患者の試
    料である、方法。
  7. 前記腸疾患は、ＩＢＤ、好ましくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）、より好ましくはＣＤである、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ヒト被験体における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型の鑑別診断方法であって、以下の工程：
    ａ． 前記被験体からの腸試料におけるフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を、請求項１に記載の方法により測定する工程と、
    ｂ． 被験体試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせを、判別されるべきＩＢＤ表現型の参照試料における相応の値と比較することで、該被験体が罹患しているＩＢＤ表現型を決定する工程と、
    を含み、ここで、前記ＩＢＤ表現型の１つに有意に類似した値を表す被験体試料が、その被験体が前記ＩＢＤ表現型に罹患していることの指標となる、方法。
  9. 前記ＩＢＤ表現型は、
    － 以下のパラメータ：
    ・ 疾患部位、
    ・ 診断時の年齢、及び、
    ・ 挙動、
    のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＣＤ表現型、
    － 以下のパラメータ：
    ・ 疾患部位又は範囲、及び、
    ・ 重症度、
    のうちの１つ以上、好ましくは全てによって定義されるＵＣ表現型、
    からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＩＢＤ表現型は、
    － 回腸クローン病（Ｉ－ＣＤ）、回腸結腸クローン病（ＩＣ－ＣＤ）及び結腸クローン病（Ｃ－ＣＤ）からなるＣＤ表現型、並びに、
    － 潰瘍性直腸炎（ＵＣ－Ｅ１）、遠位大腸炎（ＵＣ－Ｅ２）、及び広汎性潰瘍性大腸炎又は全大腸炎（ＵＣ－Ｅ３）からなるＵＣ表現型、
    からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 判別されるべきＩＢＤ表現型は、Ｃ－ＣＤとＵＣと、又はＣ－ＣＤとＵＣ－Ｅ３とである、請求項８又は９に記載の方法。
  12. ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定、並びに任意にＦＴ及び／又はＥＣの存在量の測定は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ＰＣＲ－パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイ、及びＰＣＲ－ＥＬＩＳＡからなる群から選択される分子的方法によって行われ、好ましくは定量は、ｑＰＣＲによって行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ＰＨＧＩの存在量の測定は、配列番号１及び配列番号２の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行われる、請求項１～１２のい
    ずれか一項に記載の方法。
  14. ＰＨＧＩＩの存在量の測定は、配列番号１及び配列番号２の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＦＴの存在量の測定は、配列番号５及び配列番号６の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号７の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行われる、請求項３～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. ＥＣの存在量の測定は、配列番号１４及び配列番号１５の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー、並びに配列番号１６の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプローブを用いて行われる、請求項３～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＦＴ存在量及び／又はＥＣ存在量との前記数学的組み合わせは、ＰＨＧＩ存在量／ＥＣ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量／ＥＣ存在量、ＦＴ存在量／ＰＨＧＩ存在量、及びＦＴ存在量／ＰＨＧＩＩ存在量からなる群から選択される比率であり、ここで、存在量の測定は、ｑＰＣＲによって行われ、サイクル閾値（Ｃｔ）として表現され、前記比率は、１番目のＣｔ値から２番目のＣｔ値を引き算することによって得られる、請求項３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ＤＮＡは、ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量の測定の前に、かつ任意にＦＴ及び／又はＥＣの存在量の測定の前に腸試料から抽出される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. ＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量レベル、並びに任意にＦＴ及び／又はＥＣの存在量レベルは正規化され、好ましくは、正規化は、総細菌の定量に対して、又はＤＮＡ濃度によって行われる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記腸試料は、粘膜生検材料及び糞便試料からなる群から選択され、好ましくは糞便試料である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記方法は、腸疾患、好ましくはＩＢＤの１つ以上の他のバイオマーカーを検知及び／又は定量することを更に含み、かつ任意に、ＰＨＧＩ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量及び／又は前記更なるバイオマーカー検知及び／又は定量の結果と、腸疾患のその他の指標とを組み合わせることを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記方法は、該方法の結果をデータ媒体に記録することを更に含み、好ましくは、ここで前記データ媒体は、コンピュータ可読媒体である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせの、腸疾患の検知のための、及び／又は腸疾患の処置における薬剤の効力を予測するためのバイオマーカーとしての使用であって、前
    記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量は、請求項１に記載の方法により測定され、かつ、
    前記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択される、使用。
  24. 前記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、好ましくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）又はクローン病（ＣＤ）、より好ましくはＣＤである、請求項２３に記載の使用。
  25. ヒト被験体の腸試料における、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）及び／又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量、及び／又はそれらの数学的組み合わせ、及び／又は任意にこれらのいずれかと総Ｆ．プラウスニッツイ（ＦＴ）の存在量及び／又はＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）の存在量との数学的組み合わせの、ＩＢＤ表現型の鑑別診断のためのバイオマーカーとしての使用であって、前記被験体からの腸試料におけるＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量は、請求項１に記載の方法により測定される、使用。
  26. ＦＴ存在量及び／又はＥＣ存在量との前記数学的組み合わせは、ＰＨＧＩ存在量／ＥＣ存在量、ＰＨＧＩＩ存在量／ＥＣ存在量、ＦＴ存在量／ＰＨＧＩ存在量、及びＦＴ存在量／ＰＨＧＩＩ存在量からなる群から選択される比率であり、ここで、存在量は、サイクル閾値（Ｃｔ）として表現され、前記比率は、１番目のＣｔ値から２番目のＣｔ値を引き算することによって得られる、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用。
  27. ａ． フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群Ｉのメンバー（ＰＨＧＩ）の存在量を測定するための、配列番号３の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬と、
    ｂ． フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ系統群ＩＩのメンバー（ＰＨＧＩＩ）の存在量を測定するための、配列番号４の配列又はその少なくとも７５％の同一性を有する配列を有するプライマー及び／又はプローブからなる試薬と、
    ｃ． 任意に、前記１種以上の試薬を使用して、ヒト腸試料からＰＨＧＩ及び／又はＰＨＧＩＩの存在量を測定するための説明書と、
    を含むキット。
  28. 請求項２７に記載のキットの、腸疾患の検知のための、腸疾患の処置における薬剤の効力を予測するための、及び／又はＩＢＤ表現型の鑑別診断のための使用であって、前記腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び結腸直腸癌（ＣＲＣ）からなる群から選択される、使用。
  29. 配列番号１又はその少なくとも８０％の同一性を有する配列、配列番号２又はその少なくとも９０％の同一性を有する配列、配列番号３又はその少なくとも８０％の同一性を有する配列、及び配列番号４又はその少なくとも８５％の同一性を有する配列からなる群から選択される配列を有する核酸分子。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115919952A (zh) 2017-06-02 2023-04-07 古德盖特公司 用于治疗生态失调的葡萄皮
CA3084012A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Mitsubishi Chemical Corporation Intraoral examination method using information on bacterial group related to clinical indexes
WO2019115755A1 (en) * 2017-12-15 2019-06-20 Vib Vzw A new inflammation associated, low cell count enterotype
CZ2018456A3 (cs) * 2018-09-08 2020-01-02 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i. Způsob detekce Faecalibacterium prausnitzii pomocí metody PCR v reálném čase a sada primerů pro tento způsob detekce F. prausnitzii
US20210355546A1 (en) * 2018-11-02 2021-11-18 The Regents Of The University Of California Methods to Diagnose and Treat Cancer Using Non-Human Nucleic Acids
JP2022523596A (ja) 2019-03-13 2022-04-25 グッドガット エッセ．エッレ． 結腸直腸進行新生物、進行腺腫、及び／又は結腸直腸癌をスクリーニング、診断、及び／又はモニタリングする改善された方法
WO2023049838A1 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Diagnosis and treatment of diseases and conditions of the intestinal tract
CN114015761A (zh) * 2021-09-24 2022-02-08 上海交通大学医学院附属瑞金医院 粪便tyrDC基因丰度作为预测左旋多巴疗效生物标志物的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170478A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and kits for detecting adenomas, colorectal cancer, and uses thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174681B1 (en) 1999-03-05 2001-01-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Method and probe set for detecting cancer
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
WO2003068788A1 (en) 2002-02-13 2003-08-21 Medimolecular Pty. Ltd. Method of isolating nucleic acids from stool samples
US7696334B1 (en) * 2002-12-05 2010-04-13 Rosetta Genomics, Ltd. Bioinformatically detectable human herpesvirus 5 regulatory gene
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
US7323308B2 (en) * 2004-09-03 2008-01-29 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis of E. coli
US7901882B2 (en) 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
AU2007284651B2 (en) * 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
WO2011009099A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Metabolic biomarkers of crohn's disease
EP2486143A1 (en) * 2009-10-05 2012-08-15 AAK Patent B.V. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
US20110195862A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Pett-Ridge Jennifer Devices, methods and systems for target detection
KR20150090072A (ko) * 2012-10-23 2015-08-05 카리스 라이프 사이언스 스위스 홀딩스 게엠베하 압타머 및 이의 용도
JP2016511272A (ja) 2013-03-05 2016-04-14 レイクスユニフェルシテイト フローニンゲン 炎症を抑制するためのフィーカリバクテリウム・パラウスニッチィーｈｔｆ−ｆ（ｄｓｍ２６９４３）の使用
WO2014138999A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 University Of Ottawa Methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disease
WO2014197607A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 The Regents Of The University Of California Detection of tick-borne diseases
EP2876167A1 (en) 2013-11-21 2015-05-27 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to chemotherapy, and use of microbial modulators (pre-,pro- or synbiotics) for improving the efficacy of a cancer treatment
ES2661684T3 (es) 2014-03-03 2018-04-03 Fundacio Institut D'investigació Biomèdica De Girona Dr. Josep Trueta Método para diagnosticar cáncer colorrectal a partir de una muestra de heces humanas mediante PCR cuantitativa
CN104745620A (zh) * 2015-03-03 2015-07-01 昆明理工大学 蚕豆vfpp1c基因的植物表达载体及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170478A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and kits for detecting adenomas, colorectal cancer, and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 78, no. 2, JPN6020027970, 2012, pages 420 - 428, ISSN: 0005098977 *
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 310, JPN5018006679, 2010, pages 138 - 144, ISSN: 0005098975 *
INFLAMM BOWEL DIS, vol. 12, no. 12, JPN6020027972, 2006, pages 1136 - 1145, ISSN: 0005098978 *
THE ISME JOURNAL, vol. 5, JPN6020027968, 2011, pages 220 - 230, ISSN: 0005098976 *

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