JP2022030542A - Simple genetic analysis technique allowing visual determination using nanoparticle - Google Patents
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Description
本発明は、ナノスケールの粒子（以下、ナノ粒子）に核酸プローブを標識し（核酸プローブにて標識されたナノ粒子を、以下、プローブ標識ナノ粒子とする）、溶液中において、本プローブ標識ナノ粒子と標的遺伝子とのハイブリダイゼーションにより発生するナノ粒子の凝集と、それに伴うナノ粒子の沈殿による濁度低下より、標的遺伝子の解析を可能とする遺伝子解析技術に関するものである。 In the present invention, nanoscale particles (hereinafter referred to as nanoparticles) are labeled with a nucleic acid probe (nanoparticles labeled with the nucleic acid probe are hereinafter referred to as probe-labeled nanoparticles), and the present probe-labeled nanoparticles are placed in a solution. The present invention relates to a gene analysis technique that enables analysis of a target gene by agglomeration of nanoparticles generated by hybridization between particles and a target gene and a decrease in turbidity due to the accompanying precipitation of nanoparticles.
均一溶液系において標的核酸を検出する方法として、標的核酸とのハイブリダイゼーションにより蛍光キャラクター（蛍光強度や蛍光スペクトル等）が変化する核酸プローブ（以下、均一溶液系プローブ）を用いた遺伝子解析法が広く普及している。上記の均一溶液系プローブとして、TaqMan probe（非特許文献１）、Molecular beacons（非特許文献２）、QProbe（非特許文献３）等が汎用されている。 As a method for detecting a target nucleic acid in a homogeneous solution system, a gene analysis method using a nucleic acid probe (hereinafter referred to as a uniform solution system probe) in which the fluorescence character (fluorescence intensity, fluorescence spectrum, etc.) changes by hybridization with the target nucleic acid is widely used. It is widespread. As the uniform solution system probe, TaqMan probe (Non-Patent Document 1), Molecular beacons (Non-Patent Document 2), QProbe (Non-Patent Document 3) and the like are widely used.
遺伝子検査の場合、標的遺伝子の存在量は1～106コピー/反応チューブ程度と極めて少ない場合が殆どであり、この量の標的遺伝子を均一溶液系プローブにて直接検出することは困難であることから、主にPCRに代表される遺伝子増幅技術との組み合わせにて本プローブは使用される。その場合のメリットとして、(1)反応液の蛍光キャラクターは、遺伝子増幅過程、又は増幅完了後に、反応液を取り出すことなく、チューブの外側から測定することが可能であるため、解析工程がシンプルであり、その結果、解析時間を短縮することが可能、(2)前述(1)により反応チューブを開放する必要性がないため、増副産物によるコンタミネーションを防止することが可能、(3)均一溶液系プローブは、遺伝子過程で高頻度に発生するプライマーダイマーに代表される非特異的増幅に影響を受けず、標的遺伝子にハイブリダイズした場合にのみ蛍光キャラクターが変化するため、標的遺伝子のみを特異的に検出でき、高精度な検査が可能、といった点を主に挙げることができる。 In the case of genetic testing, the abundance of the target gene is extremely small, about 1 to 10 6 copies / reaction tube, and it is difficult to directly detect this amount of the target gene with a uniform solution probe. Therefore, this probe is mainly used in combination with gene amplification technology represented by PCR. In that case, (1) the fluorescent character of the reaction solution can be measured from the outside of the tube without taking out the reaction solution after the gene amplification process or amplification is completed, so the analysis process is simple. As a result, it is possible to shorten the analysis time, (2) it is not necessary to open the reaction tube according to (1) above, so it is possible to prevent hybridization due to the by-product, (3) uniform solution. The system probe is not affected by non-specific amplification represented by primer dimers that occur frequently in the gene process, and the fluorescent character changes only when it hybridizes to the target gene, so only the target gene is specific. The main points are that it can be detected and high-precision inspection is possible.
しかしながら、均一溶液系プローブを使用した従来法では、蛍光キャラクター変化を測定することから、リアルタイムPCR装置に代表される比較的高額な解析装置が必要となる。このため、高額な投資が困難な分野・国/地域・現場において、遺伝子解析技術の普及を妨げる要因となっている。 However, in the conventional method using a uniform solution-based probe, a relatively expensive analysis device represented by a real-time PCR device is required because the change in the fluorescent character is measured. For this reason, it is a factor that hinders the spread of gene analysis technology in fields, countries / regions, and sites where high investment is difficult.
上記の課題を解決するため、装置を使用せず、目視にて判定可能な遺伝子解析技術が、これまで複数提案されている。その幾つかを、以下、簡単に記載する。 In order to solve the above problems, a plurality of gene analysis techniques that can be visually determined without using an apparatus have been proposed so far. Some of them are briefly described below.
PCR法に代わる遺伝子増幅法として提案されたLAMP（非特許文献4)（Loop-Mediated Isothermal Amplification)法では、DNA増幅の副産物であるピロリン酸マグネシウムにより反応液の濁度が上昇するため、この濁度上昇を視認することで、標的遺伝子の有無を判定することが可能である。しかしながら、この濁度上昇は僅かであるため、目視での判定には困難が伴うことから、亜硫酸ナトリウム存在下で、クリスタルバイオレッドと二本鎖DNAとの結合によって生じる反応液の発色(紫色に変化）より、遺伝子増幅の有無を目視確認する方法が開示されている（非特許文献5)。これらの方法も、均一溶液系プローブと同様、PCR法、LAMP法等の遺伝子増幅技術との組み合わせにて実施されるが、目視判定可能な遺伝子解析技術は、標的遺伝子由来の特異的増幅産物と、非特異的増副産物を峻別できないため、非特異的増副産物の生成した場合、実際には標的遺伝子が存在しないにも関わらず、標的遺伝子が存在したと判定される偽陽性による解析エラーが発生する可能性が高く、高い精度が要求される遺伝子検査への適用は困難と認識される。 In the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method proposed as a gene amplification method instead of the PCR method, the turbidity of the reaction solution is increased by magnesium pyrophosphate, which is a by-product of DNA amplification. By visually recognizing the increase in degree, it is possible to determine the presence or absence of the target gene. However, since this increase in turbidity is slight, it is difficult to make a visual judgment. Therefore, in the presence of sodium sulfite, the color of the reaction solution caused by the binding between crystal vired and double-stranded DNA (purple). (Change) discloses a method for visually confirming the presence or absence of gene amplification (Non-Patent Document 5). Similar to the uniform solution system probe, these methods are also carried out in combination with gene amplification techniques such as PCR method and LAMP method, but the gene analysis technique that can be visually determined is a specific amplification product derived from the target gene. Since the non-specific augmentation by-product cannot be distinguished, when a non-specific augmentation by-product is generated, an analysis error occurs due to a false positive that determines that the target gene exists even though the target gene does not actually exist. It is recognized that it is difficult to apply it to genetic tests that are likely to be performed and require high accuracy.
目視にて標的遺伝子の存在を判定できるその他の解析技術として、金ナノ粒子を使用した方法が開示されている（非特許文献6)。金ナノ粒子は、凝集体を形成すると、共鳴する光の波長が長波長側シフトし、溶液は赤色から紫色ないし青色へと変化する。この金ナノ粒子の凝集に伴う色調変化を利用して、遺伝子解析への展開が試みられている。その中で最も広く使用されている仕組みは、標的遺伝子が粒子間を橋渡しするような形、すなわち架橋反応である。標的遺伝子と、相補的な配列をもつ核酸プローブを多数固定化した金ナノ粒子が多点で反応し、互いに結合すれば金ナノ粒子が三次元的に網目状につながった集合体が形成されることとなる。標的遺伝子が存在するときのみ凝集と、それに伴う色調変化が起こるので検査対象物質のセンシングが可能となる（非特許文献6)。また、その他の仕組みとして、非架橋DNAハイブリダイゼーションによる方法も開示されている（非特許文献7)。 As another analysis technique capable of visually determining the presence of a target gene, a method using gold nanoparticles is disclosed (Non-Patent Document 6). When gold nanoparticles form aggregates, the wavelength of the resonating light shifts to the long wavelength side, and the solution changes from red to purple to blue. Attempts have been made to develop into gene analysis by utilizing the change in color tone accompanying the aggregation of gold nanoparticles. The most widely used mechanism among them is a form in which a target gene bridges between particles, that is, a cross-linking reaction. The target gene and gold nanoparticles on which a large number of nucleic acid probes having complementary sequences are immobilized react at multiple points, and when they bind to each other, an aggregate in which the gold nanoparticles are connected in a three-dimensional network is formed. It will be. Only when the target gene is present, aggregation and the accompanying change in color tone occur, so that the substance to be inspected can be sensed (Non-Patent Document 6). Further, as another mechanism, a method by non-crosslinking DNA hybridization is also disclosed (Non-Patent Document 7).
金ナノ粒子を用いた方法は、標的遺伝子と粒子表面に標識した核酸プローブ間のハイブリダイゼーションに基づく方法であることから、標的遺伝子とは異なる配列をもつ遺伝子が反応液中に存在しても判定結果に影響を与えることはなく、特異性の高い方法であるといえる。しかしながら、PCR等での増幅産物を検査対象とした場合、金ナノ粒子を用いた方法では金ナノ粒子、または塩を遺伝子増幅後に追加添加する必要性があることから、反応チューブを開放する必要性がある。遺伝子増幅後に反応チューブを開放すると、増幅産物によるコンタミネーションが発生する可能性が極めて高く、このコンタミネーションは偽陽性を発生させる原因となるため、解析結果の信頼性を低下させる可能性がある。加えて、上記の工程追加により解析工程が複雑となり、前述の均一溶液系プローブを用いた方法と比較して、(1)解析に時間がかかる、(2)工程の複雑化によりヒューマンエラーの確率が高まる、といったデメリットも存在する。 Since the method using gold nanoparticles is a method based on hybridization between the target gene and the nucleic acid probe labeled on the particle surface, it is determined even if a gene having a sequence different from the target gene is present in the reaction solution. It does not affect the results and can be said to be a highly specific method. However, when the amplification product by PCR or the like is targeted for inspection, it is necessary to additionally add gold nanoparticles or salts after gene amplification in the method using gold nanoparticles, so it is necessary to open the reaction tube. There is. If the reaction tube is opened after gene amplification, it is extremely likely that contamination due to the amplification product will occur, and this contamination will cause false positives, which may reduce the reliability of the analysis results. In addition, the addition of the above steps complicates the analysis process, and compared to the method using the above-mentioned uniform solution system probe, (1) it takes time to analyze, and (2) the probability of human error due to the complexity of the steps. There are also disadvantages such as increased.
以上を踏まえ、本発明において解決しようとする課題は、前述した均一溶液系プローブの３つメリット（(1)シンプルな解析工程、(2)遺伝子増幅後は反応チューブを非開放、(3)標的遺伝子のみを特異的に検出可能）を担保しつつ、高額な解析装置を必要としない遺伝子検査技術を提供することにある。 Based on the above, the problems to be solved in the present invention are the three merits of the above-mentioned homogeneous solution system probe ((1) simple analysis step, (2) non-open reaction tube after gene amplification, (3) target. The purpose is to provide a genetic testing technology that does not require an expensive analyzer while ensuring that only genes can be specifically detected).
上記特長を有する遺伝子解析技術を提供することができれば、これまで装置への高額投資が困難であった分野・国/地域・現場においても遺伝子解析のメリットを享受することが可能になると考えられる。 If we can provide gene analysis technology with the above characteristics, it will be possible to enjoy the merits of gene analysis even in fields, countries / regions, and sites where it has been difficult to make high-value investments in equipment.
ナノ粒子に標的遺伝子に相補的な核酸プローブが標識されたプローブ標識ナノ粒子を、遺伝子増幅に必要となる材料（プライマー、Taqポリメラーゼ、反応バッファー、サンプルDNA）と共に反応チューブに添加したうえで、標的遺伝子の増幅を実施したところ、プローブ標識ナノ粒子に標識された核酸プローブと、標的遺伝子由来の増幅産物との間でハイブリダイゼーションが発生し、プローブ標識ナノ粒子が増幅産物によって架橋された結果、ナノ粒子の凝集体形成と、それに伴う、凝集体の沈殿が発生し、反応液の濁度が著しく低下する現象を発見した。上記の濁度低下は、増幅後に反応チューブを開放することなく、反応チューブの外部より観察することが可能であった。これら発見は、当該技術が、前述した課題を解決可能な遺伝子検査技術であることを示している。本発明は、かかる発見に基づきなされたものである。 Probe-labeled nanoparticles labeled with a nucleic acid probe complementary to the target gene on the nanoparticles are added to the reaction tube together with the materials required for gene amplification (primer, Taq polymerase, reaction buffer, sample DNA) and then targeted. When the gene was amplified, hybridization occurred between the hybridization probe labeled on the probe-labeled nanoparticles and the amplification product derived from the target gene, and the probe-labeled nanoparticles were crosslinked by the amplification product. We discovered a phenomenon in which the turbidity of the reaction solution is significantly reduced due to the formation of agglomerates of particles and the accompanying precipitation of agglomerates. The above-mentioned decrease in turbidity could be observed from the outside of the reaction tube without opening the reaction tube after amplification. These discoveries indicate that the technology is a genetic testing technology that can solve the above-mentioned problems. The present invention has been made on the basis of such findings.
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）核酸プローブを複数標識した平均粒子径が１ｎｍ以上かつ１０００ｎｍ未満であるナノスケールの粒子（以下、プローブ標識ナノ粒子）を溶液中で標的遺伝子と反応させ、核酸プローブと標的遺伝子間の架橋反応を発生させることにより、ナノ粒子の凝集体を形成させ、凝集体形成に伴う該ナノ粒子の沈殿による溶液の濁度低下を測定することにより、標的遺伝子の有無を判定することを含む、標的遺伝子の検出方法。
（２）標的遺伝子が遺伝子増幅産物であり、遺伝子増幅前に、プローブ標識ナノ粒子を反応チューブに添加し、遺伝子増幅途中あるいは遺伝子増幅後に、反応チューブを開放することなく、反応チューブの外側から当該ナノ粒子の沈殿に伴う濁度低下を測定する（１）記載の方法。
（３）プローブ標識ナノ粒子と標的遺伝子間の反応後に、反応チューブを超音波処理する（１）又は（２）に記載の方法。
（４）プローブ標識ナノ粒子と標的遺伝子間の反応後に、反応チューブを超音波処理した後、プローブ標識ナノ粒子が凝集していない状態では沈降しない重力加速度にて遠心する（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）標的遺伝子と結合する領域と、標的遺伝子と結合しない領域を同一分子内に有する核酸プローブを標識したプローブ標識ナノ粒子を使用する（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）標的遺伝子と結合しない領域が50塩基以上である核酸プローブを標識したプローブ標識ナノ粒子を使用する（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）プローブ標識ナノ粒子の比重が１．４～５．５である（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）プローブ標識ナノ粒子の粒子径が５０～５００nmである（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）（５）又は（６）に記載の方法に使用するための、標的遺伝子と結合する領域と、標的遺伝子と結合しない領域を同一分子内に有する核酸プローブ。
（１０）スクシンイミジル基を官能基として導入したナノ粒子を使用し、スクシンイミジル基と、核酸プローブの3’末端または5’末端に標識したアミノ基との反応により、核酸プローブがナノ粒子に標識されている、（１）～（８）のいずれかに記載の方法に使用するためのプローブ標識ナノ粒子。
（１１）プローブ標識ナノ粒子を含む、（１）～（８）のいずれかに記載の方法に使用するための遺伝子解析用試薬。
（１２）プローブ標識ナノ粒子を含む、（１）～（８）のいずれかに記載の方法に使用するための遺伝子解析用キット。
The gist of the present invention is as follows.
(1) Nanoscale particles having an average particle diameter of 1 nm or more and less than 1000 nm labeled with a plurality of nucleic acid probes (hereinafter referred to as probe-labeled nanoparticles) are reacted with a target gene in a solution to crosslink between the nucleic acid probe and the target gene. Targeting, including determining the presence or absence of a target gene by generating an aggregate of nanoparticles by generating a reaction and measuring the decrease in turbidity of the solution due to the precipitation of the nanoparticles accompanying the formation of the aggregate. How to detect genes.
(2) The target gene is a gene amplification product, and probe-labeled nanoparticles are added to the reaction tube before gene amplification, and the reaction tube is not opened during gene amplification or after gene amplification. The method according to (1), which measures the decrease in turbidity associated with the precipitation of nanoparticles.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the reaction tube is sonicated after the reaction between the probe-labeled nanoparticles and the target gene.
(4) After the reaction between the probe-labeled nanoparticles and the target gene, the reaction tube is sonicated and then centrifuged at a gravitational acceleration that does not settle when the probe-labeled nanoparticles are not aggregated (1) to (3). The method described in any of.
(5) The method according to any one of (1) to (4), which uses probe-labeled nanoparticles labeled with a nucleic acid probe having a region that binds to a target gene and a region that does not bind to the target gene in the same molecule.
(6) The method according to any one of (1) to (5), which uses probe-labeled nanoparticles labeled with a nucleic acid probe having a region that does not bind to a target gene of 50 bases or more.
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the probe-labeled nanoparticles have a specific gravity of 1.4 to 5.5.
(8) The method according to any one of (1) to (7), wherein the probe-labeled nanoparticles have a particle size of 50 to 500 nm.
(9) A nucleic acid probe having a region that binds to a target gene and a region that does not bind to the target gene in the same molecule for use in the method according to (5) or (6).
(10) Using nanoparticles introduced with a succinimidyl group as a functional group, the nucleic acid probe is labeled on the nanoparticles by the reaction between the succinimidyl group and the amino group labeled at the 3'end or 5'end of the nucleic acid probe. Yes, probe-labeled nanoparticles for use in the method according to any one of (1) to (8).
(11) A reagent for gene analysis for use in the method according to any one of (1) to (8), which comprises probe-labeled nanoparticles.
(12) A kit for gene analysis for use in the method according to any one of (1) to (8), which comprises probe-labeled nanoparticles.
本発明によれば、迅速、高感度、かつ明瞭に検査対象物質の有無を目視判定可能となる。 According to the present invention, the presence or absence of a substance to be inspected can be visually determined quickly, with high sensitivity, and clearly.
本発明の実施の態様について詳細に説明する。 Embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明は、核酸プローブを複数標識した平均粒子径が１ｎｍ以上かつ１０００ｎｍ未満であるナノスケールの粒子（以下、プローブ標識ナノ粒子）を溶液中で標的遺伝子と反応させ、核酸プローブと標的遺伝子間の架橋反応を発生させることにより、ナノ粒子の凝集体を形成させ、凝集体形成に伴うナノ粒子の沈殿による溶液の濁度低下を測定することにより、標的遺伝子の有無を判定することを含む、標的遺伝子の検出方法を提供する。 In the present invention, nanoscale particles having an average particle diameter of 1 nm or more and less than 1000 nm labeled with a plurality of nucleic acid probes (hereinafter referred to as probe-labeled nanoparticles) are reacted with a target gene in a solution, and between the nucleic acid probe and the target gene. Targeting, including determining the presence or absence of a target gene by generating an aggregate of nanoparticles by generating a cross-linking reaction and measuring the decrease in turbidity of the solution due to the precipitation of nanoparticles accompanying the formation of the aggregate. A method for detecting a gene is provided.
標的遺伝子は、特定の遺伝子配列を有するものであるとよく、一本鎖又は二本鎖のDNA、RNAなどの核酸でありうる。一本鎖ＤＮＡとして、ウイルス、逆転写産物（ｃＤＮＡ）などを例示することができ、一本鎖ＲＮＡとしては、ＮＡＳＢＡ法で得られるＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡなどを例示することができる。二本鎖DNAとしては、PCR、LAMP、LCRなどの核酸増幅法により遺伝子を増幅して得られる産物を例示することができる。 The target gene may have a specific gene sequence and may be a nucleic acid such as single-stranded or double-stranded DNA or RNA. Examples of the single-stranded DNA include viruses, reverse transcriptase (cDNA), and the like, and examples of the single-stranded RNA include RNA obtained by the NASBA method and ribosomal RNA. As the double-stranded DNA, a product obtained by amplifying a gene by a nucleic acid amplification method such as PCR, LAMP, or LCR can be exemplified.
核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成されていてもよい。また、それらの双方が介在しているキメリックオリゴヌクレオチド（ｃｈｅｍｉｒｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｄｉｔｅ）でもよい。また、２－Ｏ－メチルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）（ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの５’末端のヌククレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）部がシチジンで、そのシチジンの２’位のＯＨ基がメチル（ｍｅｔｈｙｌ）基で修飾されているもの）を使用してもよい。ＲＮＡとの親和性を高めるために、２’－Ｏ－メチルオリゴリボヌクレオチドをオリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｕｅｏｔｉｄｅ）の中に介在させていてもよい。また、安定性と相補鎖への特異性に優れた人工核酸であるＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、Ｎ－Ｏ結合性架橋構造型人工核酸［２’，４’－ＢＮＡＮＣ］を用いてもよい。核酸プローブの塩基数は５～１００であるとよく、好ましくは１０～３０、特に好ましくは１５～２５である。１００を超える場合は、合成エラーが発生しやすくなり、目的以外の配列を持つプローブが含まれる可能性が高くなり、５未満の場合は、非特異的ハイブリダイゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ、 ２２巻、 １８５９～１８６２頁、 １９８１年； Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 １４巻、６２２７～６２４５頁、１９８６年）。なお、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ＡＢＩ３９４（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ＵＳＡ））。 The nucleic acid probe may be composed of oligodeoxyribonucleotides or oligoribonucleotides. Further, a chemilic oligonucleotide (chemiric oligonucleotide) in which both of them are intervened may be used. In addition, the nucleoside portion at the 5'end of 2-O-methyloligoribonucleotides (2'-O-Methyloligoribonucleotides) is cytidine, and the 2'-position OH group of the cytidine is a methyl group. (Modified with) may be used. In order to enhance the affinity with RNA, 2'-O-methyloligoribonucleotides may be interposed in the oligodeoxynucleotide. In addition, Locked Nucleic Acid (LNA), which is an artificial nucleic acid having excellent stability and specificity to a complementary strand, and an NO-binding crosslinked artificial nucleic acid [2', 4'-BNANC] may be used. The number of bases of the nucleic acid probe is preferably 5 to 100, preferably 10 to 30, and particularly preferably 15 to 25. If it exceeds 100, a synthesis error is likely to occur, a probe having a sequence other than the target is likely to be included, and if it is less than 5, non-specific hybridization is likely to occur, and a measurement error is likely to occur. growing. The oligonucleotide of the nucleic acid probe can be produced by a usual general method for producing an oligonucleotide. For example, it can be produced by a microbial method using a chemical synthesis method, a plasmid vector, a phage vector, etc. (Tetrahedron letters, Vol. 22, pp. 1859-1862, 1981; Nucleic acids Research, Vol. 14, pp. 6227-6245, 1986. ). It is preferable to use a nucleic acid synthesizer currently on the market (for example, ABI394 (manufactured by PerkinElmer, USA)).
ナノスケールの粒子（ナノ粒子）は、粒子径（直径）がナノオーダー（１ｎｍ以上かつ１０００ｎｍ未満）である粒子を含む粒子をいい、ナノ粒子の平均粒子径（直径）は、２０～１０００ｎｍの範囲内であるとよく、好ましくは、５０～７００ｎｍの範囲内であり、より好ましくは、１００～４００ｎｍの範囲内である。平均粒子径は、ディスク遠心式粒度分布測定装置（ＣＰＳ Ｄｉｓｃ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＤＣ２４０００ ＵＨＲ、ＣＰＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．社製）を用いて測定することができる。 Nanoscale particles (nanoparticles) refer to particles containing particles having a particle size (diameter) of nanoorder (1 nm or more and less than 1000 nm), and the average particle size (diameter) of nanoparticles is in the range of 20 to 1000 nm. It is preferably in the range of 50 to 700 nm, and more preferably in the range of 100 to 400 nm. The average particle size can be measured using a disk centrifugal particle size distribution measuring device (CPS Disc Centrifuge DC24000 UHR, CPS instruments, Inc.).
ナノ粒子は、白色よりも明度が低い色に着色されたものであるとよく、好ましくは黒色である。また、比重は、１．０４よりも大きいとよく、好ましくは１．４～５．５である。ナノ粒子の比重は、１０ｗｔ％程度のナノ粒子分散液を準備し、本溶液の比重測定により測定することができる。 The nanoparticles are preferably colored in a color having a lower lightness than white, and are preferably black. Further, the specific gravity is preferably larger than 1.04, preferably 1.4 to 5.5. The specific gravity of nanoparticles can be measured by preparing a nanoparticle dispersion liquid of about 10 wt% and measuring the specific gravity of this solution.
ナノ粒子が複数の核酸プローブで標識されることにより、標的遺伝子と核酸プローブとの反応により、ナノ粒子は標的遺伝子で架橋される。核酸プローブの種類は１種類でもよいが、好ましくは、２種類以上である。例えば、LAMP法のように、標的遺伝子の増幅産物1分子内に同一配列が複数存在する場合には、核酸プローブの種類が１種類でも、核酸プローブと標的遺伝子間の架橋反応が起こりうる。標的遺伝子の増幅産物1分子内の2つ以上の領域に対して、各々相補的な２種類以上の核酸プローブを使用することで、核酸プローブと標的遺伝子間の架橋反応が起こりうる。 By labeling the nanoparticles with a plurality of nucleic acid probes, the nanoparticles are crosslinked with the target gene by the reaction between the target gene and the nucleic acid probe. The type of the nucleic acid probe may be one type, but preferably two or more types. For example, when the same sequence is present in one molecule of the amplification product of the target gene as in the LAMP method, a cross-linking reaction between the nucleic acid probe and the target gene can occur even if there is only one type of nucleic acid probe. Across-linking reaction between a nucleic acid probe and a target gene can occur by using two or more kinds of nucleic acid probes complementary to each of two or more regions in one molecule of the amplification product of the target gene.
ナノ粒子への核酸プローブの標識には、例えば、ナノ粒子の表面を核酸と親和性を有するシリカにて修飾の後、本シリカに核酸プローブを吸着させる方法、ナノ粒子表面のカルボキシル基を介してスクシンイミジル基を導入し、これを核酸プローブに導入したアミノ基と反応させる方法、ナノ粒子表面にアビジン、ストレプトアビジンを修飾し、これらと高い親和性を有するビオチンを導入した核酸プローブを反応させる方法、等が採用される。 For labeling of nanoparticles on nanoparticles, for example, a method in which the surface of nanoparticles is modified with silica having an affinity for nanoparticles and then the nucleic acid probe is adsorbed on the silica, via a carboxyl group on the surface of the nanoparticles. A method of introducing a succinimidyl group and reacting it with an amino group introduced into a nucleic acid probe, a method of modifying the surface of nanoparticles with avidin and streptavidin and reacting with a nucleic acid probe introduced with biotin having a high affinity with these. Etc. are adopted.
プローブ標識ナノ粒子は、標的遺伝子と反応する前には、溶液中に均一に分散しているとよい（均一溶液系、完全混合系）。プローブ標識ナノ粒子が均一に分散している溶液は、例えば、５７０ｎｍでの吸光度（測定セル光路長：１０ｍｍ）が、０．５～１０であるとよく、好ましくは、１～８あり、より好ましくは、２～６である。 The probe-labeled nanoparticles should be uniformly dispersed in the solution before reacting with the target gene (uniform solution system, complete mixture system). The solution in which the probe-labeled nanoparticles are uniformly dispersed may have, for example, an absorbance at 570 nm (measurement cell optical path length: 10 mm) of 0.5 to 10, preferably 1 to 8, and more preferably. Is 2 to 6.
溶液は、純水、精製水、生理食塩水、各種の緩衝液、アルコール類、アルデヒド類、ケトン類等の水より比重の小さいものであるとよく、水と完全混合可能な溶媒を含む水溶液などの水溶液を例示することができる。 The solution should have a lower specific gravity than water such as pure water, purified water, physiological saline, various buffers, alcohols, aldehydes, ketones, etc., and an aqueous solution containing a solvent that can be completely mixed with water, etc. Can be exemplified by the aqueous solution of.
溶液の比重は、０．８～１．２であるとよく、好ましくは、０．９～１．１であり、より好ましくは、０．９５～１．０５である。 The specific gravity of the solution is preferably 0.8 to 1.2, preferably 0.9 to 1.1, and more preferably 0.95 to 1.05.
ナノ粒子に標識する核酸プローブの量は、ナノ粒子の平均粒子径、標的遺伝子の存在量、測定に要求される感度等に依存するが、一般的には１～１，０００分子／粒子であるとよく、好ましくは５～２００分子／粒子であり、より好ましくは、１０～１００分子／粒子である。標識された核酸プローブの量は、標識前の核酸プローブ溶液と、標識後に回収された核酸プローブ溶液における核酸プローブ濃度を各々測定し、その差分より求めることができる。核酸プローブ濃度を測定する方法としては、例えば、紫外吸光光度法（核酸の紫外部吸収を利用した吸光光度法）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ法（一本鎖ＤＮＡと結合し、緑色の蛍光を発するＯｌｉＧｒｅｅｎを使用した蛍光測定法）を挙げることができる。 The amount of the nucleic acid probe labeled on the nanoparticles depends on the average particle size of the nanoparticles, the abundance of the target gene, the sensitivity required for measurement, etc., but is generally 1 to 1,000 molecules / particle. Often, it is preferably 5 to 200 molecules / particle, and more preferably 10 to 100 molecules / particle. The amount of the labeled nucleic acid probe can be obtained by measuring the nucleic acid probe concentrations in the nucleic acid probe solution before labeling and the nucleic acid probe solution recovered after labeling, respectively, and the difference between them. As a method for measuring the nucleic acid probe concentration, for example, an ultraviolet absorptiometry (absorptiometry using ultraviolet absorption of nucleic acid) and an OliGreen method (OliGreen that binds to single-stranded DNA and emits green fluorescence were used. Fluorescence measurement method) can be mentioned.
溶液中のナノ粒子の濃度は、ナノ粒子に標識されたプローブと標的遺伝子との架橋反応による溶液の濁度低下を測定できる濃度であるとよく、ナノ粒子、プローブ及び標的遺伝子の種類により異なりうるが、例えば、溶液中のナノ粒子の濃度は、１０９～１０１４個／ｍＬであるとよく、好ましくは、１０１０～１０１３個／ｍＬであり、より好ましくは、５×１０１０～５×１０１２個／ｍＬである。核酸プローブと標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの方法は、通常の既知方法で行なうことができる（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 １８３巻、 ２３１～２４４頁、 １９８９年； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 １４巻、 ３０３～３０８頁、 １９９６年； Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、 ６３巻、 １１４３－１１４７頁、 １９９７年）。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が０～２モル濃度、好ましくは０．１～１．０モル濃度、ｐＨは６～８、好ましくは６．５～７．５である。温度は、核酸プローブの解離温度に依存するが、一般的には２０～８０℃であるとよく、好ましくは４０～７０℃であり、反応時間は、１～６０分であるとよく、好ましくは、５～２０分である。ハイブリダイゼーションにおいては、超音波分散を行うとよい。その理由は以下のように考えられる。プローブがナノ粒子に標識されている場合、ナノ粒子自体は浮遊をしているが、その大きさの違いから、遊離状態のプローブと比較して、その移動速度は著しく低下しており、その結果、ハイブリダイゼーションが阻害されている可能性が想定される。よって、何らかの方法でナノ粒子そのもの、およびナノ粒子に修飾したプローブを高速で移動させることができれば、プローブとターゲット遺伝子との接触機会を増大させ、その結果、ハイブリダイゼーションが短時間に起こることが期待される。超音波を水溶液にあてると、音響流という流れが発生する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊａｓｊ／６３／３／６３＿ＫＪ００００４５７０７０１／＿ｐｄｆ）。この音響流によってナノ粒子そのものが高速に移動すると共に、修飾したプローブに揺れが生じ、また標的遺伝子も同様に高速に移動することも加わり、プローブと標的遺伝子との接触機会を飛躍的に増大した結果、ハイブリダイゼーションが短時間で効率的に発生することが推察される。超音波分散は、２０～３９ｋＨｚのローモードで、適当な時間（例えば、１秒～５分程度）行うことが好ましい。 The concentration of nanoparticles in the solution should be such that the decrease in turbidity of the solution due to the cross-linking reaction between the probe labeled on the nanoparticles and the target gene can be measured, and may vary depending on the type of nanoparticles, probe and target gene. However, for example, the concentration of nanoparticles in the solution is preferably 10 9 to 10 14 particles / mL, preferably 10 10 to 10 13 particles / mL, and more preferably 5 × 10 10 to 5 × 10 12 pieces / mL. The method of hybridization between the nucleic acid probe and the target gene can be carried out by a conventional known method (Analytical Biochemistry, 183, 231 to 244, 1989; Nature Biotechnology, 14, 303 to 308, 1996). Applied and Environmental Microbialology, Vol. 63, pp. 1143-1147, 1997). For example, the conditions for hybridization are a salt concentration of 0 to 2 molars, preferably 0.1 to 1.0 molars, and a pH of 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5. The temperature depends on the dissociation temperature of the nucleic acid probe, but is generally preferably 20 to 80 ° C, preferably 40 to 70 ° C, and the reaction time is preferably 1 to 60 minutes, preferably 1 to 60 minutes. 5 to 20 minutes. In hybridization, ultrasonic dispersion may be performed. The reason is considered as follows. When the probe is labeled with nanoparticles, the nanoparticles themselves are suspended, but due to their size differences, their migration rate is significantly slower than that of the free probe, resulting in , It is assumed that hybridization may be inhibited. Therefore, if the nanoparticles themselves and the probes modified to the nanoparticles can be moved at high speed in some way, it is expected that the chances of contact between the probe and the target gene will increase, and as a result, hybridization will occur in a short time. Will be done. When ultrasonic waves are applied to an aqueous solution, a flow called an acoustic flow is generated (https://www.jstage.jst.go.jp/article/jasj/63/3/63_KJ00000457701/1_pdf). This acoustic flow causes the nanoparticles themselves to move at high speed, causing the modified probe to sway, and the target gene also moves at high speed, dramatically increasing the chances of contact between the probe and the target gene. As a result, it is inferred that hybridization occurs efficiently in a short time. The ultrasonic dispersion is preferably performed in a low mode of 20 to 39 kHz for an appropriate time (for example, about 1 second to 5 minutes).
本発明において、プローブ標識ナノ粒子を溶液中で標的遺伝子と反応させると、核酸プローブと標的遺伝子間の架橋反応により、ナノ粒子の凝集体が形成され、それに伴い、ナノ粒子が沈殿し、その結果、溶液の濁度が低下する。標的遺伝子が、ナノ粒子に標識した核酸プローブ（２種）と反応（ハイブリダイゼーション）し、ナノ粒子が標的遺伝子で架橋され、凝集して沈殿し、溶液の濁度が低下する。 In the present invention, when probe-labeled nanoparticles are reacted with a target gene in solution, agglomerates of nanoparticles are formed by a cross-linking reaction between the nucleic acid probe and the target gene, and the nanoparticles are precipitated as a result. , The turbidity of the solution decreases. The target gene reacts (hybridizes) with the nucleic acid probes (2 types) labeled on the nanoparticles, and the nanoparticles are crosslinked by the target gene, aggregated and precipitated, and the turbidity of the solution is reduced.
架橋反応による溶液の濁度低下を測定することにより、標的遺伝子の有無を判定することができる。溶液の濁度が低下すれば、標的遺伝子が存在すると判定し、溶液の濁度が低下しなければ、標的遺伝子が存在しないと判定することができる（図４）。溶液の濁度は、架橋反応が起こる前には、５００～４，０００であるとよく、好ましくは、７００～４，０００であり、より好ましくは、１，０００～４，０００であり、架橋反応により、ナノ粒子が沈殿し、濁度が低下した後の溶液の濁度は、１～４００であるとよく、好ましくは、１～２００であり、より好ましくは、１～５０である。溶液の濁度が低下する前と後の濁度の差は、５００～４，０００であるとよく、好ましくは、７００～４，０００であり、より好ましくは、１，０００～４，０００である。濁度の低下は目視により観察することができるが、機器分析（例えば、分光光度計、濁度計（測定法：透視比濁法、透過光測定法、散乱(反射)光測定法）、積分球式光電光度計）による判定も可能である。例えば、溶液の濁度は、試料をよく振りまぜた後、吸収セル（１０ｍｍ）にとり、波長６００ｎｍ付近における透過光の強度を見掛けの吸光度にて測定することにより測定することができる。サンプルの濁度は、上記した測定方法にて、濁度標準液を段階希釈した溶液の吸光度を測定し、得られた吸光度と濁度の関係式を検量線として、別途測定したサンプルの吸光度より算出することができる。また、サンプルの吸光度が、検量線の測定範囲から外れた場合は、測定範囲に収まるようサンプルを純水で希釈することで精度よく測定することが可能である。 The presence or absence of the target gene can be determined by measuring the decrease in turbidity of the solution due to the cross-linking reaction. If the turbidity of the solution decreases, it can be determined that the target gene exists, and if the turbidity of the solution does not decrease, it can be determined that the target gene does not exist (FIG. 4). The turbidity of the solution is preferably 500 to 4,000, preferably 700 to 4,000, and more preferably 1,000 to 4,000, before the crosslinking reaction occurs. The turbidity of the solution after the nanoparticles are precipitated by the reaction and the turbidity is lowered is preferably 1 to 400, preferably 1 to 200, and more preferably 1 to 50. The difference between the turbidity before and after the turbidity of the solution decreases is preferably 500 to 4,000, preferably 700 to 4,000, and more preferably 1,000 to 4,000. be. The decrease in turbidity can be visually observed, but instrumental analysis (eg, spectrophotometer, turbidity meter (measurement method: turbidimetry, transmitted light measurement method, scattered (reflected) light measurement method), integration Judgment by a spherical photoelectric photometer) is also possible. For example, the turbidity of the solution can be measured by shaking the sample well, taking it in an absorption cell (10 mm), and measuring the intensity of transmitted light in the vicinity of a wavelength of 600 nm by the apparent absorbance. The turbidity of the sample is measured from the absorbance of the separately measured sample by measuring the absorbance of the solution obtained by serially diluting the turbidity standard solution by the above-mentioned measurement method and using the obtained relationship between the absorbance and the turbidity as a calibration curve. Can be calculated. Further, when the absorbance of the sample deviates from the measurement range of the calibration curve, it is possible to measure accurately by diluting the sample with pure water so as to be within the measurement range.
本発明の方法により、標的遺伝子の有無を１時間以内に判定することができ、好ましくは、１～６０分の範囲内で、より好ましくは、５～２０分の範囲内で判定することができる。 According to the method of the present invention, the presence or absence of the target gene can be determined within 1 hour, preferably within the range of 1 to 60 minutes, and more preferably within the range of 5 to 20 minutes. ..
本発明の方法により標的遺伝子の検出可能な濃度の下限は、１～１００ｎＭとなりえる。 The lower limit of the detectable concentration of the target gene by the method of the present invention can be 1 to 100 nM.
本発明により、迅速、高感度かつ明瞭に標的遺伝子の有無を判定することができる。標的遺伝子を含有するサンプルとしては、生体試料（例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等）、その他の試料（例えば、食品の抽出液、土壌、活性汚泥や堆肥からの抽出液、上水、下水、廃水、河川や湖沼の水、海水等）等でありうる。必要に応じて、標的遺伝子の検出に先立って、サンプルを前処理してもよい。前処理としては、酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理や、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理が挙げられる。また、サンプルは、通常の分析法で用いられる溶媒（水、生理食塩水、又は緩衝液等）や水混和有機溶媒で適宜希釈されていてもよい。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the presence or absence of a target gene can be rapidly, highly sensitively and clearly determined. Samples containing the target gene include biological samples (eg, whole blood, serum, plasma, urine, saliva, sputum, nasal or pharyngeal swab, spinal fluid, sheep's fluid, papillary secretions, tears, sweat, and exudates from the skin. , Extracts from tissues, cells and stools, etc.), other samples (eg, food extracts, soil, extracts from active sludge and compost, clean water, sewage, wastewater, river and lake water, seawater, etc. ) Etc. If desired, the sample may be pretreated prior to detection of the target gene. Examples of the pretreatment include chemical treatment using various chemicals such as acids, bases and surfactants, and physical treatment using heating, stirring, ultrasonic waves and the like. Further, the sample may be appropriately diluted with a solvent (water, physiological saline, buffer solution, etc.) used in a usual analytical method or a water-miscible organic solvent.
本発明においては、遺伝子増幅前に、プローブ標識ナノ粒子を反応チューブに添加し、遺伝子増幅途中あるいは遺伝子増幅後に、反応チューブを開放することなく、反応チューブの外側から当該ナノ粒子の沈殿に伴う濁度低下を測定することができる。 In the present invention, probe-labeled nanoparticles are added to the reaction tube before gene amplification, and the reaction tube is not opened during gene amplification or after gene amplification, and the nanoparticles are turbid due to precipitation from the outside of the reaction tube. The degree of decrease can be measured.
プローブ標識ナノ粒子は、遺伝子増幅するために必要な資材（例えば、プライマー、Taqポリメラーゼ、反応バッファー、サンプルDNA）と共に反応チューブに添加してよい。 Probe-labeled nanoparticles may be added to the reaction tube along with the materials required for gene amplification (eg, primers, Taq polymerase, reaction buffer, sample DNA).
プローブ標識ナノ粒子と標的遺伝子間の反応後に、反応チューブを超音波処理するとよい。その理由は以下のように考えられる。プローブがナノ粒子に標識されている場合、ナノ粒子自体は浮遊をしているが、その大きさの違いから、遊離状態のプローブと比較して、その移動速度は著しく低下しており、その結果、ハイブリダイゼーションが阻害されている可能性が想定される。よって、何らかの方法でナノ粒子そのもの、およびナノ粒子に修飾したプローブを高速で移動させることができれば、プローブとターゲット遺伝子との接触機会を増大させ、その結果、ハイブリダイゼーションが短時間に起こることが期待される。超音波を水溶液にあてると、音響流という流れが発生する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔａｇｅ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｊａｓｊ／６３／３／６３＿ＫＪ００００４５７０７０１／＿ｐｄｆ）。この音響流によってナノ粒子そのものが高速に移動すると共に、修飾したプローブに揺れが生じ、またターゲット遺伝子も同様に高速に移動することも加わり、プローブとターゲット遺伝子との接触機会を飛躍的に増大した結果、ハイブリダイゼーションが短時間で効率的に発生することが推察される。超音波分散は、２０～３９ｋＨｚのローモードで、適当な時間（例えば、１秒～５分程度）行うことが好ましい。 After the reaction between the probe-labeled nanoparticles and the target gene, the reaction tube may be sonicated. The reason is considered as follows. When the probe is labeled with nanoparticles, the nanoparticles themselves are suspended, but due to their size differences, their migration rate is significantly slower than that of the free probe, resulting in , It is assumed that hybridization may be inhibited. Therefore, if the nanoparticles themselves and the probes modified to the nanoparticles can be moved at high speed in some way, it is expected that the chances of contact between the probe and the target gene will increase, and as a result, hybridization will occur in a short time. Will be done. When ultrasonic waves are applied to an aqueous solution, a flow called an acoustic flow is generated (https://www.jstage.jst.go.jp/article/jasj/63/3/63_KJ00000457701/1_pdf). This acoustic flow causes the nanoparticles themselves to move at high speed, causing the modified probe to sway, and the target gene also moves at high speed, dramatically increasing the chances of contact between the probe and the target gene. As a result, it is inferred that hybridization occurs efficiently in a short time. The ultrasonic dispersion is preferably performed in a low mode of 20 to 39 kHz for an appropriate time (for example, about 1 second to 5 minutes).
また、プローブ標識ナノ粒子と標的遺伝子間の反応後に、反応チューブを超音波処理した後、プローブ標識ナノ粒子が凝集していない状態では沈降しない重力加速度にて遠心するとよい。プローブ標識ナノ粒子が凝集していない状態では沈降しない重力加速度は、１００G～８０００Gであるとよく、好ましくは、２００G～５０００Gであり、より好ましくは、１０００G～３０００Gである。 Further, after the reaction between the probe-labeled nanoparticles and the target gene, the reaction tube may be sonicated and then centrifuged at a gravitational acceleration that does not settle when the probe-labeled nanoparticles are not aggregated. The gravitational acceleration that does not settle when the probe-labeled nanoparticles are not aggregated is preferably 100 G to 8000 G, preferably 200 G to 5000 G, and more preferably 1000 G to 3000 G.
ナノ粒子に標識される核酸プローブは、標的遺伝子と結合する領域と、標的遺伝子と結合しない領域（以下、スペーサーと称することもある。）を同一分子内に有するものであってもよい。核酸プローブが、標的遺伝子と結合しない領域を同一分子内に有するものである場合、標的遺伝子と結合しない領域を介して、ナノ粒子が核酸プローブで標識されているとよい。例えば、標的遺伝子と結合しない領域の3’又は5’末端にアミノ基を導入しておけば、スクシンイミジル基を導入したナノ粒子と反応させることにより、ナノ粒子をプローブで標識することができる。 The nucleic acid probe labeled on the nanoparticles may have a region that binds to the target gene and a region that does not bind to the target gene (hereinafter, may be referred to as a spacer) in the same molecule. When the nucleic acid probe has a region that does not bind to the target gene in the same molecule, it is preferable that the nanoparticles are labeled with the nucleic acid probe via the region that does not bind to the target gene. For example, if an amino group is introduced at the 3'or 5'end of a region that does not bind to a target gene, the nanoparticles can be labeled with a probe by reacting with the nanoparticles into which the succinimidyl group has been introduced.
核酸プローブ分子内の標的遺伝子と結合しない領域は、５０塩基以上であるとよく、好ましくは、 ５０～５０００塩基であり、より好ましくは、５００～２０００塩基である。 The region in the nucleic acid probe molecule that does not bind to the target gene is preferably 50 bases or more, preferably 50 to 5000 bases, and more preferably 500 to 2000 bases.
本発明は、標的遺伝子の検出方法に使用するための、標的遺伝子と結合する領域と、標的遺伝子と結合しない領域を同一分子内に有する核酸プローブも提供する。 The present invention also provides a nucleic acid probe having a region that binds to a target gene and a region that does not bind to the target gene in the same molecule for use in a method for detecting a target gene.
また、本発明は、スクシンイミジル基を官能基として導入したナノ粒子を使用し、スクシンイミジル基と、核酸プローブの3’末端または5’末端に標識したアミノ基との反応により、核酸プローブがナノ粒子に標識されているプローブ標識ナノ粒子であって、標的遺伝子の検出方法に使用するための前記プローブ標識ナノ粒子も提供する。 Further, the present invention uses nanoparticles in which a succinimidyl group is introduced as a functional group, and the reaction between the succinimidyl group and the amino group labeled at the 3'end or 5'end of the nucleic acid probe causes the nucleic acid probe to become nanoparticles. Also provided are probe-labeled nanoparticles labeled, said probe-labeled nanoparticles for use in a method for detecting a target gene.
さらに、本発明は、プローブ標識ナノ粒子を含む、標的遺伝子の検出方法に使用するための遺伝子解析用試薬も提供する。 Furthermore, the present invention also provides a reagent for gene analysis for use in a method for detecting a target gene, which comprises probe-labeled nanoparticles.
さらにまた、本発明は、プローブ標識ナノ粒子を含む、標的遺伝子の検出方法に使用するための遺伝子解析用キットを提供する。 Furthermore, the present invention provides a kit for gene analysis for use in a method for detecting a target gene, which comprises probe-labeled nanoparticles.
本発明のキットは、プローブ標識ナノ粒子の他、ネガティブコントロール用標準物質、ポジティブコントロール用標準物質、反応容器、分散媒、遺伝子増幅用試薬（例えば、プライマー、Taqポリメラーゼ、反応バッファーなど）などを含んでもよい。 In addition to probe-labeled nanoparticles, the kit of the present invention contains a standard substance for negative control, a standard substance for positive control, a reaction vessel, a dispersion medium, a reagent for gene amplification (for example, a primer, a Taq polymerase, a reaction buffer, etc.) and the like. But it may be.
本発明の方法及びキットは、遺伝子検査（病原菌やウイルスの検出、遺伝子の多型、変異解析など）などに利用することができる。
The method and kit of the present invention can be used for genetic testing (detection of pathogens and viruses, gene polymorphism, mutation analysis, etc.).
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
[実施例１]ナノ粒子を用いたPCR産物の検出
＜使用ナノ粒子＞
本実施例にて使用したナノ粒子を下表1に示した。
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[Example 1] Detection of PCR products using nanoparticles <Nanoparticles used>
The nanoparticles used in this example are shown in Table 1 below.
（表１）
＜ナノ粒子へのスクシンイミジル基の導入＞
ナノ粒子へのスクシンイミジル基の導入は、以下の工程を実施することで、粒子表面のカルボキシル基を介してスクシンイミジル基を導入した。
<Introduction of succinimidyl group into nanoparticles>
To introduce the succinimidyl group into the nanoparticles, the succinimidyl group was introduced via the carboxyl group on the particle surface by carrying out the following steps.
2mlマイクロチューブに1wt%の任意のナノ粒子を0.1ml添加し、0.9mlの50mM 2-モルフォリノエタンスルホン酸バッファー（以下、MES）pH6.1を添加し、超音波洗浄機（US-610(エスエヌディー社製)）にて10秒程度超音波分散させた。 Add 0.1 ml of 1 wt% arbitrary nanoparticles to a 2 ml microtube, add 0.9 ml of 50 mM 2-morpholinoetan sulfonic acid buffer (MES) pH 6.1, and add an ultrasonic cleaner (US-610 (US-610). Ultrasonic dispersion was performed for about 10 seconds with SND)).
次に、遠心分離により上澄みを除去した後に、1-エチル‐3-(3-ジメチルアミノプロビル)カルボジイミド塩酸塩（以下、EDC）を2mg/mlの濃度で含む50mM MESバッファー(pH6.1)を0.5ml、及びN-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム（以下、solfo-NHS）を2mg/mlの濃度で含む50mM MESバッファー(pH6.1)を0.5ml添加し、超音波洗浄機（US-610(エスエヌディー社製)）にて10秒程度超音波分散した後に約1時間転倒混和させた。 Next, after removing the supernatant by centrifugation, a 50 mM MES buffer (pH 6.1) containing 1-ethyl-3- (3-dimethylaminoprovyl) carbodiimide hydrochloride (hereinafter, EDC) at a concentration of 2 mg / ml. Add 0.5 ml of 50 mM MES buffer (pH 6.1) containing 0.5 ml of N-hydroxysulfosuccinimide sodium (hereinafter, solfo-NHS) at a concentration of 2 mg / ml, and add an ultrasonic washer (US-610). After ultrasonic dispersion for about 10 seconds with D)), the mixture was overturned and mixed for about 1 hour.
その後、遠心分離により上澄みを除去した後に、50mM MESバッファー(pH6.1)を1.0ml添加し、超音波洗浄機（US-610(エスエヌディー社製)）にて10秒程度超音波分散させた。なお、この工程は更に２回（計３回）繰り返した。 Then, after removing the supernatant by centrifugation, 1.0 ml of 50 mM MES buffer (pH 6.1) was added and ultrasonically dispersed for about 10 seconds with an ultrasonic cleaner (US-610 (manufactured by SND)). .. This step was repeated twice more (three times in total).
＜使用したオリゴDNA＞
使用したオリゴDNAを表2として示す。オリゴDNAはmg、全てつくばオリゴサービス株式会社（茨城県牛久市）に製造委託した。No.4,12,13のオリゴDNAについては、アミノ基等で末端修飾されており、HPLCにて精製を実施した。それ以外のものは、脱塩を目的としたゲルろ過精製とした。
<Oligo DNA used>
The oligo DNA used is shown in Table 2. All oligo DNA was outsourced to Tsukuba Oligo Service Co., Ltd. (Ushiku City, Ibaraki Prefecture). The oligo DNAs of Nos. 4, 12, and 13 were terminally modified with amino groups and the like, and were purified by HPLC. Others were gel filtration and purification for the purpose of desalination.
（表２）使用オリゴDNAの一覧
No.1～6のオリゴDNAは、標的遺伝子に特異的な配列と標的遺伝子と関係のない長い配列とで構成される核酸プローブ（以下、長鎖プローブ）を作成するためのプライマーとして使用した。No.1～3のオリゴDNAは、大文字の部分はヒトβグロビン遺伝子に特異的な配列となっており、小文字の部分が5’末端側に付加されている。この付加された配列は、No.1についてはNo.4のオリゴDNAの配列（小文字下線部分）、No.2についてはNo.5のオリゴDNAの配列（小文字二重線部分）、No.3についてはNo.6のオリゴDNAの配列（小文字波線部分）となる。 The oligo DNAs Nos. 1 to 6 were used as primers for preparing a nucleic acid probe (hereinafter referred to as a long-chain probe) composed of a sequence specific to the target gene and a long sequence unrelated to the target gene. In the oligo DNAs No. 1 to 3, the uppercase part has a sequence specific to the human β-globin gene, and the lowercase part is added to the 5'end side. The added sequence is No. 4 oligo DNA sequence (lowercase underlined part) for No. 1, No. 5 oligo DNA sequence (lowercase double line part) for No. 2, and No. 3 Is the sequence of No. 6 oligo DNA (lowercase wavy line part).
No.7～11のオリゴDNAは、については、モデル標準遺伝子を作成するための鋳型（No.7）またはプライマーとして使用した。N0.8の3’末端側の配列(斜体下線部分)配列は、モデル標準遺伝子作成用のテンプレートとして使用するオリゴDNA（No.7）の5’末端配列(斜体下線部分)と同じ配列であり、N0.9の3’末端側の配列(斜体二重線部分)配列は、モデル標準遺伝子作成用のテンプレートとして使用するオリゴDNA（No.7）の3’末端配列(斜体二重線部分)と相補的な配列となっている。よって、No.7をテンプレートとし、N0.8,9をプライマーとしたPCRを実施することで、No.7配列の両末端に各プライマーの5’末端側の配列が付加されたPCR産物を得ることができる。また、N0.8の5’末端側の配列(大文字二重線部分)配列とNo.10の配列は同じであり、N0.9の5’末端側の配列(大文字下線部分)配列とNo.11の配列は同じである。このため、No.10,11は、前述のNo.7をテンプレートとしN0.8,9をプライマーとしてPCRすることで得られたモデル標準遺伝子を増幅するためのプライマーとして使用可能である。 The oligo DNAs of Nos. 7 to 11 were used as a template (No. 7) or a primer for creating a model standard gene. The 3'endline (underlined part) sequence of N0.8 is the same as the 5'endline (underlined part) of oligo DNA (No. 7) used as a template for model standard gene generation. , N0.9 3'end line (oblique double line part) sequence is the 3'end sequence (oblique double line part) of oligo DNA (No.7) used as a template for model standard gene creation. It is a complementary sequence to. Therefore, by performing PCR using No. 7 as a template and N0.8, 9 as primers, a PCR product in which the 5'end side sequence of each primer is added to both ends of the No. 7 sequence is obtained. be able to. In addition, the sequence of N0.8 on the 5'end side (uppercase double line part) and the sequence of No. 10 are the same, and the sequence of N0.9 on the 5'end side (uppercase underlined part) and No. The array of 11 is the same. Therefore, Nos. 10 and 11 can be used as primers for amplifying the model standard gene obtained by PCR using the above-mentioned No. 7 as a template and N0.8, 9 as a primer.
No.10,11のオリゴDNAについては、標的遺伝子を検出するプライマーとしても使用した。No.12,13のオリゴDNAは、前述の長鎖プローブとは異なり、標的遺伝子に相補的な配列のみを有する核酸プローブ（以下、短鎖プローブ）となる。No.14のオリゴDNAは、ランダムな配列を有するオリゴDNAであり、非標的遺伝子として使用した。 The No. 10 and 11 oligo DNAs were also used as primers to detect the target gene. The oligo DNAs of Nos. 12 and 13 are different from the above-mentioned long-chain probes, and are nucleic acid probes having only a sequence complementary to the target gene (hereinafter referred to as short-chain probes). The oligo DNA of No. 14 was an oligo DNA having a random sequence and was used as a non-target gene.
また、No.12,13のオリゴDNA については5'末端がアミノ基, 3'末端はリン酸基にて修飾されている。 The oligo DNAs of Nos. 12 and 13 are modified with an amino group at the 5'end and a phosphate group at the 3'end.
＜長鎖プローブの作製＞
長いスペーサーを有する核酸プローブ（以下、長鎖プローブ）は、まず標的遺伝子に相補的な配列が5’末端に付加されたヒトβグロビン遺伝子に特異的なプライマー（表2中のNo.2,3のプライマー）を、No.1オリゴDNAとそれぞれペア（No.1,2およびNo.1,3のペア）で使用し、ヒトゲノムをテンプレートとしてPCRを実施することで2種類のPCR産物を得た。その具体的な条件を以下に示す。
<Manufacturing of long-chain probe>
A nucleic acid probe having a long spacer (hereinafter referred to as a long-chain probe) is a primer specific to the human β-globin gene (No. 2 and 3 in Table 2) in which a sequence complementary to the target gene is added to the 5'end. Primers) were used in pairs with No. 1 oligo DNA (pairs of No. 1, 2 and No. 1, 3), respectively, and PCR was performed using the human genome as a template to obtain two types of PCR products. .. The specific conditions are shown below.
PCRは、Life touch（Bioer社製）を用いて実施した。PCRサイクルは、まず120秒間 94℃を維持し、耐熱性DNAポリメラーゼを活性化させた後、解離ステップ：94℃、15秒、アニーリングステップ：66℃、15秒、伸長ステップ：68℃、120秒の温度サイクルを、40サイクル実施をした。PCRチューブには、ヒトゲノムDNA（ロッシュ社製）を3ng/チューブ、耐熱性DNAポリメラーゼとしてKOD-plus（東洋暴社製）を0.4μL、10×KOD-plusバッファー（東洋暴社製）を2μL添加し、フォワードプライマーとしてNo.1オリゴDNA（arbF1_B-gbF1）を終濃度200nM、リバースプライマーとしてNo.2オリゴDNA （arbR1_B-gbR1）又はNo.3オリゴDNA（arbR2_B-gbR1）を終濃度200mM、dNTPを終濃度0.2mM、硫酸マグネシウムを終濃度1.0mMとなるよう添加した上で、トータル液量が20μLとなるよう滅菌済ミリ水を添加した。 PCR was performed using Life touch (manufactured by Bioer). The PCR cycle is first maintained at 94 ° C for 120 seconds to activate the thermostable DNA polymerase, then dissociation step: 94 ° C, 15 seconds, annealing step: 66 ° C, 15 seconds, extension step: 68 ° C, 120 seconds. The temperature cycle of was 40 cycles. To the PCR tube, add 3 ng / tube of human genomic DNA (manufactured by Roche), 0.4 μL of KOD-plus (manufactured by Toyo Ryosha) as a heat-resistant DNA polymerase, and 2 μL of 10 × KOD-plus buffer (manufactured by Toyo Ryosha). The final concentration of No. 1 oligo DNA (arbF1_B-gbF1) as a forward primer is 200 nM, and the final concentration of No. 2 oligo DNA (arbR1_B-gbR1) or No. 3 oligo DNA (arbR2_B-gbR1) as a reverse primer is 200 mM, dNTP. Was added to a final concentration of 0.2 mM and magnesium sulfate was added to a final concentration of 1.0 mM, and sterilized milliwater was added so that the total liquid volume was 20 μL.
ここで得られた増幅産物を、Agilent 2100 bioanalyzer (アジレントテクノリジーズ社製)を用いて電気泳動し、目的産物長（1,013 bp）に相当するピークより、得られた目的産物の濃度を定量した後、その値に基づき、目的産物を10,000コピー/μLの濃度で含む溶液を、滅菌済ミリQ水を用いて調整した。 The amplified product obtained here was electrophoresed using an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies), and the concentration of the obtained target product was quantified from the peak corresponding to the target product length (1,013 bp). Then, based on that value, a solution containing the desired product at a concentration of 10,000 copies / μL was prepared with sterile Milli-Q water.
次に、上記の目的産物をテンプレートとして、5’末端がアミノ基にて標識されたNo.4オリゴDNA（5-aminoF1）と、No.5オリゴDNA（arbR1）またはNo.6オリゴDNA（arbR2）をペアで使用し、2種類のPCR産物を得た。フォワードプライマーは、5’末端がアミノ基標識されていることから、フォワードプライマーより伸長する側のDNA鎖の5’末端はアミノ基にて標識されることとなる。その具体的な条件を以下に示す。 Next, using the above target product as a template, No. 4 oligo DNA (5-aminoF1) labeled with an amino group at the 5'end and No. 5 oligo DNA (arbR1) or No. 6 oligo DNA (arbR2). ) Was used in pairs to obtain two types of PCR products. Since the 5'end of the forward primer is labeled with an amino group, the 5'end of the DNA strand on the extension side of the forward primer is labeled with an amino group. The specific conditions are shown below.
PCRは、Life touch（Bioer社製）を用いて実施した。PCRサイクルは、まず120秒間 94℃を維持し、耐熱性DNAポリメラーゼを活性化させた後、解離ステップ：94℃、15秒、アニーリングステップ：66℃、15秒、伸長ステップ：68℃、120秒の温度サイクルを、40サイクル実施をした。PCRチューブには上記で調整した目的産物溶液（10,000コピー/μL）を1μL、耐熱性DNAポリメラーゼとしてKOD-plus（東洋紡社製）を1μL、10×KOD-plusバッファー（東洋紡社製）を5μL添加し、フォワードプライマーとしてNo.4オリゴDNA（5-aminoF1）を終濃度500nM、リバースプライマーとしてNo.5オリゴDNA（arbR1）またはNo.6オリゴDNA（arbR2）を終濃度100nM、dNTPを終濃度0.2mM、硫酸マグネシウムを終濃度1.0mMとなるよう添加した上で、トータル液量が50μLとなるよう滅菌済ミリ水を添加した。 PCR was performed using Life touch (manufactured by Bioer). The PCR cycle is first maintained at 94 ° C for 120 seconds to activate the thermostable DNA polymerase, then dissociation step: 94 ° C, 15 seconds, annealing step: 66 ° C, 15 seconds, extension step: 68 ° C, 120 seconds. The temperature cycle of was 40 cycles. Add 1 μL of the target product solution (10,000 copies / μL) prepared above, 1 μL of KOD-plus (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.) as a heat-resistant DNA polymerase, and 5 μL of 10 × KOD-plus buffer (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.) to the PCR tube. The final concentration of No. 4 oligo DNA (5-aminoF1) as a forward primer is 500 nM, the final concentration of No. 5 oligo DNA (arbR1) or No. 6 oligo DNA (arbR2) is 100 nM as a reverse primer, and the final concentration of dNTP is 0.2. After adding mM and magnesium sulfate to a final concentration of 1.0 mM, sterilized milliwater was added to a total liquid volume of 50 μL.
上記のように、PCRは、フォワードプライマーをリバースプライマーに対して5倍量添加するアシメトリックPCRにて実施したことから、5’末端がアミノ基標識された一本鎖DNAが多く増幅され、その一本鎖DNAは、標的遺伝子と相補的な配列を持つリバースプライマーを用いてPCRを実施したことから、増幅産物の3’末端には標的遺伝子の相補鎖が導入されたPCR産物が得られた。このPCR産物を、長鎖プローブとして使用した。
PCR後、NucleoSpin（タカラバイオ社製）にて精製し（溶出液：滅菌済ミリQ）、Agilent 2100 bioanalyzer (アジレントテクノリジーズ社製)にて目的産物が得られたことを確認した。次に、PCR産物中の一本鎖DNAの濃度を、Quant-iTTM OliGreenTM ssDNA Reagent（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、本製品の取扱説明書に従って定量し、その際の蛍光測定装置は、DTX800（ベックマンコールター社製）を用いた。
As described above, since PCR was carried out by asymmetric PCR in which a forward primer was added in an amount of 5 times that of the reverse primer, a large amount of single-stranded DNA labeled with an amino group at the 5'end was amplified. Since the single-stranded DNA was PCRed using a reverse primer having a sequence complementary to the target gene, a PCR product in which the complementary strand of the target gene was introduced at the 3'end of the amplification product was obtained. .. This PCR product was used as a long-chain probe.
After PCR, it was purified by NucleoSpin (manufactured by Takara Bio Inc.) (eluent: sterilized Milli-Q), and it was confirmed that the target product was obtained by Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies). Next, the concentration of single-stranded DNA in the PCR product is quantified using Quant-iT TM OliGreen TM ssDNA Reagent (manufactured by Thermo Fisher Scientific) according to the instruction manual of this product, and the fluorescence measurement at that time is performed. The device used was DTX800 (manufactured by Beckman Coulter).
＜ナノ粒子への核酸プローブの修飾＞
ナノ粒子への核酸プローブの修飾は、粒子表面に導入したスクシンイミジル基と核酸プローブに修飾したアミノ基との反応させることで実施した。以下にその詳細を示す。
<Modification of nucleic acid probe to nanoparticles>
The modification of the nucleic acid probe to the nanoparticles was carried out by reacting the succinimidyl group introduced into the particle surface with the amino group modified to the nucleic acid probe. The details are shown below.
前述の方法で調整した0.1wt%のスクシンイミジル基導入済のナノ粒子を1mlが入った2mlマイクロチューブに、末端にアミノ基導入済みの核酸プローブを任意の濃度にて1ml添加し、室温にて2時間反応をさせた。核酸プローブは、前述の方法で調整した短鎖プローブ及び長鎖プローブ（各々2種類）を使用し、1つの反応チューブにつきプローブを1種類のみ添加・反応させたため、合計4反応を実施したこととなる。 To a 2 ml microtube containing 1 ml of 0.1 wt% succinimidyl group-introduced nanoparticles prepared by the above method, add 1 ml of an amino group-introduced nucleic acid probe to the terminal at an arbitrary concentration and add 2 at room temperature. It was time-reacted. As the nucleic acid probe, a short-chain probe and a long-chain probe (two types each) prepared by the above method were used, and only one type of probe was added and reacted per reaction tube, so a total of four reactions were carried out. Become.
その後、遠心分離により上澄みを除去した後に、1mlの停止バッファー（エタノールアミンを終濃度100mM含む50mM MESバッファー(pH6.1)）を添加し、10秒程度超音波分散した後に約10分間転倒混和させた。
次に、遠心分離により上澄みを除去した後に、1mlのブロッキングバッファー（カゼイン酸ナトリウムを1%含む50mM MESバッファー(pH6.1)）を添加し、10秒程度超音波分散した後に約2時間転倒混和させた。
Then, after removing the supernatant by centrifugation, add 1 ml of stop buffer (50 mM MES buffer (pH 6.1) containing ethanolamine at a final concentration of 100 mM), ultrasonically disperse for about 10 seconds, and then invert and mix for about 10 minutes. rice field.
Next, after removing the supernatant by centrifugation, add 1 ml of blocking buffer (50 mM MES buffer (pH 6.1) containing 1% sodium caseinate), ultrasonically disperse for about 10 seconds, and then invert and mix for about 2 hours. I let you.
その後、遠心分離により上澄みを除去した後に、TEバッファー(ニッポンジーン社製)を１ml添加し、10秒程度超音波分散した。これを再度（計２回）繰り返し、核酸プローブが標識されたナノ粒子（プローブ標識ナノ粒子）懸濁液を得た。 Then, after removing the supernatant by centrifugation, 1 ml of TE buffer (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was added, and the mixture was ultrasonically dispersed for about 10 seconds. This was repeated again (twice in total) to obtain a suspension of nanoparticles labeled with a nucleic acid probe (probe-labeled nanoparticles).
＜モデル標的遺伝子の作製＞
モデル標的遺伝子は、No.7のオリゴDNAをテンプレートとし、No.8,9のオリゴDNAをプライマーとしてPCRを実施した。PCRは、Life touch（Bioer社製）を用いて実施した。PCRサイクルは、まず120秒間 94℃を維持し、耐熱性DNAポリメラーゼを活性化させた後、解離ステップ：94℃、15秒、アニーリングステップ：66℃、15秒、伸長ステップ：68℃、120秒の温度サイクルを、40サイクル実施をした。PCRチューブには、テンプレートとしてNo.7のオリゴDNAを10,000コピー/チューブ、耐熱性DNAポリメラーゼとしてKOD-plus（東洋紡社製）を0.4μL、10×KOD-plusバッファー（東洋紡社製）を2μL添加し、フォワードプライマーとしてNo.8オリゴDNA（tag-temp_1st_Fw）を終濃度200nM、リバースプライマーとしてNo.9オリゴDNA （tag-temp_1st_Rv）を終濃度200mM、dNTPを終濃度0.2mM、硫酸マグネシウムを終濃度1.0mMとなるよう添加した上で、トータル液量が20μLとなるよう滅菌済ミリ水を添加した。
<Preparation of model target gene>
For the model target gene, PCR was performed using No. 7 oligo DNA as a template and No. 8 and 9 oligo DNA as primers. PCR was performed using Life touch (manufactured by Bioer). The PCR cycle is first maintained at 94 ° C for 120 seconds to activate the thermostable DNA polymerase, then dissociation step: 94 ° C, 15 seconds, annealing step: 66 ° C, 15 seconds, extension step: 68 ° C, 120 seconds. The temperature cycle of was 40 cycles. To the PCR tube, add 10,000 copies / tube of No. 7 oligo DNA as a template, 0.4 μL of KOD-plus (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.) as a heat-resistant DNA polymerase, and 2 μL of 10 × KOD-plus buffer (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.). The final concentration of No. 8 oligo DNA (tag-temp_1st_Fw) as a forward primer is 200 nM, the final concentration of No. 9 oligo DNA (tag-temp_1st_Rv) is 200 mM as a reverse primer, the final concentration of dNTP is 0.2 mM, and the final concentration of magnesium sulfate is magnesium sulfate. After adding to 1.0 mM, sterilized milliwater was added so that the total liquid volume was 20 μL.
ここで得られた増幅産物を、Agilent 2100 bioanalyzer (アジレントテクノリジーズ社製)を用いて電気泳動し、目的産物長（145 bp）に相当するピークより、得られた目的産物の濃度を定量した後、その値に基づき、目的産物を10,000コピー/μLの濃度で含む溶液を、滅菌済ミリQ水を用いて調整した。 The amplified product obtained here was electrophoresed using an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies), and the concentration of the obtained target product was quantified from the peak corresponding to the target product length (145 bp). Then, based on that value, a solution containing the desired product at a concentration of 10,000 copies / μL was prepared with sterile Milli-Q water.
更に上記PCR産物をテンプレートとして、No.10,11のオリゴDNAをプライマーとしたPCRを実施した。PCRにおける装置、及びPCRサイクル条件は、上記条件と同じである。PCRチューブには、テンプレートとして前術のPCR産物を10,000コピー/チューブ、耐熱性DNAポリメラーゼとしてKOD-plus（東洋暴社製）を0.4μL、10×KOD-plusバッファー（東洋暴社製）を2μL添加し、フォワードプライマーとしてNo.10オリゴDNA（tag-Fw）を終濃度200nM、リバースプライマーとしてNo.11オリゴDNA （tag-Rv）を終濃度200mM、dNTPを終濃度0.2mM、硫酸マグネシウムを終濃度1.0mMとなるよう添加した上で、トータル液量が20μLとなるよう滅菌済ミリ水を添加した。 Furthermore, PCR was carried out using the above PCR product as a template and the oligo DNAs of Nos. 10 and 11 as primers. The apparatus and PCR cycle conditions in PCR are the same as the above conditions. For the PCR tube, 10,000 copies / tube of the PCR product of the previous operation as a template, 0.4 μL of KOD-plus (manufactured by Toyo Ryosha) as a heat-resistant DNA polymerase, and 2 μL of 10 × KOD-plus buffer (manufactured by Toyo Ryosha). Addition of No. 10 oligo DNA (tag-Fw) as a forward primer with a final concentration of 200 nM, No. 11 oligo DNA (tag-Rv) as a reverse primer with a final concentration of 200 mM, dNTP with a final concentration of 0.2 mM, and magnesium sulfate with a final concentration. After adding to a concentration of 1.0 mM, sterilized milliwater was added to a total liquid volume of 20 μL.
得られたPCR産物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (プロメガ社製)にて精製した後、精製後のPCR産物を、Agilent 2100 bioanalyzer (アジレントテクノリジーズ社製)を用いて電気泳動し、目的産物長（145 bp）に相当するピークより、得られた目的産物の濃度を定量した。本PCR産物は、核酸ブローブに対して相補的な配列を有しており、これをモデル標的遺伝子として使用した。 The obtained PCR product is purified by Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (manufactured by Promega), and the purified PCR product is electrophoresed using Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Agilent Technologies). Then, the concentration of the obtained target product was quantified from the peak corresponding to the target product length (145 bp). This PCR product has a sequence complementary to the nucleic acid probe, which was used as a model target gene.
＜ナノ粒子を用いた凝集・沈殿条件の確認＞
PCRチューブに、長鎖プローブまたは短鎖プローブを任意のプローブ濃度にて添加し、表面を核酸プローブ修飾した0.1wt%ナノ粒子（ラテックスビーズ、またはシリカビーズ）を10μL、5× PrimeSTAR GXL Bufferを4μL添加し、ターゲット遺伝子（モデル標的遺伝子、または非標的遺伝子）を任意の濃度となるよう添加した後、全量が20μLとなるよう滅菌済ミリQ水を添加した。
<Confirmation of aggregation / precipitation conditions using nanoparticles>
Add 10 μL of 0.1 wt% nanoparticles (latex beads or silica beads) with a surface modified to a nucleic acid probe by adding a long-chain probe or short-chain probe at an arbitrary probe concentration to the PCR tube, and 4 μL of 5 × PrimeSTAR GXL Buffer. After addition, the target gene (model target gene or non-target gene) was added to an arbitrary concentration, and then sterilized Milli-Q water was added so that the total volume was 20 μL.
上記を調整後、ultra sonic cleaner USK type (アズワン社製)を用いて任意の強度（超音波処理なし、low mode、又はhigh mode）にて超音波処理を5秒間実施後、目視にて沈殿の有無を確認した。 After adjusting the above, ultrasonic treatment is performed for 5 seconds at an arbitrary intensity (no ultrasonic treatment, low mode, or high mode) using an ultra sonic cleaner USK type (manufactured by AS ONE), and then the precipitate is visually precipitated. Confirmed the presence or absence.
＜結果＞
ナノ粒子の沈殿が発生する条件を特定することを目的に、モデル標的遺伝子のPCR産物を用いた実験を実施した。併せて、ナノ粒子の沈殿が標的遺伝子と核酸プローブ間のハイブリダイゼーションに由来することを確認する目的で、モデル標的遺伝子に代えて、非標的遺伝子としてNo.14オリゴDNA（Non-tag）を終濃度で40nM添加した反応系を用意した。また、核酸プローブの種類、ナノ粒子の種類、ナノ粒子表面に核酸プローブを標識する際の核酸プローブ濃度、モデル標的遺伝子の添加量、超音波処理条件を各々変化させた96系列の反応系を準備し、沈殿の有無を確認した。その結果を、表3として示す。本表では、沈殿が確認された場合は○、確認されなかった場合は×と表記した。
<Result>
Experiments were conducted using PCR products of model target genes for the purpose of identifying the conditions under which nanoparticles precipitate. At the same time, in order to confirm that the precipitation of nanoparticles is derived from hybridization between the target gene and the nucleic acid probe, the No. 14 oligo DNA (Non-tag) was terminated as a non-target gene instead of the model target gene. A reaction system to which 40 nM was added at a concentration was prepared. In addition, we prepared 96 series of reaction systems in which the types of nucleic acid probes, the types of nanoparticles, the concentration of nucleic acid probes when labeling nucleic acid probes on the surface of nanoparticles, the amount of model target gene added, and the ultrasonic treatment conditions were changed. Then, the presence or absence of precipitation was confirmed. The results are shown in Table 3. In this table, if precipitation is confirmed, it is indicated by ○, and if it is not confirmed, it is indicated by ×.
本結果より、試験No.126,127、及び試験No.138,139の場合にのみ沈殿が発生することが分かった。これらの条件は、核酸プローブとして長鎖プローブ、ナノ粒子としてシリカビーズ、プローブ濃度として50nMまたは100nM、超音波処理をlow modeにて実施、モデル標的遺伝子を20nMまたは40nM添加した条件であった。以上の結果より、本実施例にて使用した材料を用いてナノ粒子の凝集が発生する条件を特定することができた。また、PCRにおける増幅産物量は、通常の条件下では100nM以上となるため、今回の結果より、本法はPCR産物を検出するうえで十分な感度を有することが示された。 From this result, it was found that precipitation occurs only in the cases of Test No. 126,127 and Test No. 138,139. These conditions were a long-chain probe as a nucleic acid probe, silica beads as nanoparticles, a probe concentration of 50 nM or 100 nM, ultrasonic treatment in low mode, and addition of a model target gene of 20 nM or 40 nM. From the above results, it was possible to specify the conditions under which the agglomeration of nanoparticles occurs using the material used in this example. In addition, since the amount of amplified product in PCR is 100 nM or more under normal conditions, this result shows that this method has sufficient sensitivity for detecting PCR products.
（表３）ナノ粒子を用いたPCR産物の検出結果一覧
（表３続き）
（表３続き）
（表３続き）
(Continued from Table 3)
(Continued from Table 3)
(Continued from Table 3)
[実施例２]
実施例１より、ナノ粒子の沈殿により、PCR産物を検出可能な条件を特定することができた。本実施例では、実施例1にて特定した条件にて、PCR実施前にPCR反応液にナノ粒子を添加し、PCR反応後にチューブ非開放で、ナノ粒子の沈殿より標的遺伝子が目視判定可能であるかを検討した。
[Example 2]
From Example 1, it was possible to specify the conditions under which the PCR product can be detected by the precipitation of nanoparticles. In this example, under the conditions specified in Example 1, nanoparticles are added to the PCR reaction solution before PCR, and the tube is not opened after the PCR reaction, and the target gene can be visually determined from the precipitate of nanoparticles. I examined whether there was.
＜ナノ粒子を用いたPCR＞
本PCRは、LifeEco thermal cycler（Bioer社製）を用いて実施した。
<PCR using nanoparticles>
This PCR was performed using a LifeEco thermal cycler (manufactured by Bioer).
PCRチューブには、長鎖プローブを100nMの濃度にて添加し、表面を核酸プローブ修飾した0.1wt%ナノ粒子（ラテックスビーズ、またはシリカビーズ）を10μL、耐熱性DNAポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を1μL、5× PrimeSTAR GXL Buffer（タカラバイオ社製）を4μL添加し、フォワードプライマーとしてNo.10オリゴDNA（tag-Fw）を終濃度1,000nM、リバースプライマーとしてNo.11オリゴDNA （tag-Rv）を終濃度300mM、dNTPを終濃度0.2mM、テンプレートとしてモデル標的遺伝子を101～107コピー/チューブ、又は非標的遺伝子としてNo.14オリゴDNA（Non-tag）を107コピー/チューブにて添加した上で、トータル液量が20μLとなるよう滅菌済ミリ水を添加した。核酸プローブ結合領域を持つ一本鎖DNAを生成させるため、フォワードプライマーをリバースプライマーに対して約3.3倍量添加した。 To the PCR tube, add a long-chain probe at a concentration of 100 nM, add 10 μL of 0.1 wt% nanoparticles (latex beads or silica beads) whose surface is modified with a nucleic acid probe, and use PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara) as a heat-resistant DNA polymerase. Add 1 μL of Bio) and 4 μL of 5 × PrimeSTAR GXL Buffer (Takara Bio), and add No. 10 oligo DNA (tag-Fw) as a forward primer to a final concentration of 1,000 nM and No. 11 oligo DNA as a reverse primer. (Tag-Rv) has a final concentration of 300 mM, dNTP has a final concentration of 0.2 mM, model target gene is 10 1 to 10 7 copies / tube as a template, or No. 14 oligo DNA (Non-tag) is 10 7 as a non-target gene. After adding by copy / tube, sterilized milliwater was added so that the total liquid volume was 20 μL. Approximately 3.3 times the amount of forward primer was added to the reverse primer in order to generate single-stranded DNA having a nucleic acid probe binding region.
PCRサイクルは、解離ステップ：98℃、10秒、アニーリングステップ：55℃、15秒、伸長ステップ：68℃、5秒の温度サイクルを、50サイクル実施をした。PCR完了後、一部の反応チューブについて、ultra sonic cleaner USK type (アズワン社製)を用いて超音波処理（low mode、40kHz）を5秒間実施した。この反応液を、ボルテックス混和し、更にチビタン（アズワン社製）にてスピンダウンした後、ナノ粒子の沈降を目視にて確認し、デジタルカメラにて写真を撮影した。また、PCR増幅産物は、2％ アガロースゲルを用いた電気泳動を行い、そのゲルをエチジウムブロマイド（インビトロジェン社製）にて室温にて15分間染色した。染色後のゲルイメージは、E-Box (和研薬社製)にて取得した。なお、その他の方法および使用資材は、実施例1に記載の通りとなる。 The PCR cycle was 50 cycles of dissociation step: 98 ° C, 10 seconds, annealing step: 55 ° C, 15 seconds, extension step: 68 ° C, 5 seconds. After the PCR was completed, some reaction tubes were subjected to ultrasonic treatment (low mode, 40 kHz) for 5 seconds using an ultra sonic cleaner USK type (manufactured by AS ONE Corporation). This reaction solution was vortex-mixed, further spun down with Chibitan (manufactured by AS ONE Corporation), and then the sedimentation of nanoparticles was visually confirmed, and a photograph was taken with a digital camera. The PCR amplification product was electrophoresed on a 2% agarose gel, and the gel was stained with ethidium bromide (manufactured by Invitrogen) at room temperature for 15 minutes. The gel image after staining was acquired by E-Box (manufactured by Waken Yakuhin Co., Ltd.). The other methods and materials used are as described in Example 1.
＜結果＞
結果を図1～3に示す。
ナノ粒子としてシリカビーズを用いた場合、モデル標的遺伝子を添加した全ての反応チューブで沈殿が発生し、濁度の低下が観察された（図1 (1)～(7)）。一方、非標的遺伝子を添加した系では、沈殿は発生せず濁度の低下も確認されなかった（図1 (8)）。電気泳動結果より（図2）、モデル標的遺伝子を添加した系（図2 レーン1～7）では目的産物由来のバンドが確認され、非標的遺伝子を添加した系（図2 レーン8）では確認されなかった。この結果より、ナノ粒子としてシリカビーズを用いた系では、モデル標的遺伝子と核酸プローブ間のハイブリダイゼーションにより、ナノビーズの沈殿が発生し、それに伴う濁度低下が発生したことが示された。併せて、本法は、シンプルな解析工程（PCR実施後、反応チューブを開放することのない工程）にて、標的遺伝子の特異的検出が目視判定にて可能であることが示された。また、101コピー/チューブでの検出も可能であったことから、通常のPCRと同程度の感度であり、本法は実用的な感度を有することが示された。
<Result>
The results are shown in Figures 1 to 3.
When silica beads were used as nanoparticles, precipitation occurred in all reaction tubes to which the model target gene was added, and a decrease in turbidity was observed (Figs. 1 (1) to (7)). On the other hand, in the system to which the non-target gene was added, no precipitation occurred and no decrease in turbidity was confirmed (Fig. 1 (8)). From the electrophoresis results (Fig. 2), the band derived from the target product was confirmed in the system to which the model target gene was added (Fig. 2,
ナノ粒子としてラテックスビーズを用いた場合、添加した遺伝子の種類・濃度に依らず全ての反応系で、ビーズの沈殿に伴う濁度低下を観察することはできなかった（図3 (1)～(8)）。電気泳動の結果、モデル標的遺伝子を添加した系（図3 (1)～(7)）では、目的産物由来のバンドが確認されたことから（非掲載データ）、ナノ粒子としてラテックスビーズを使用した場合、モデル標的遺伝子と核酸プローブ間のハイブリダイゼーションが発生したものの、ビーズの沈降と濁度低下は発生しないことが示された。
When latex beads were used as nanoparticles, the decrease in turbidity due to bead precipitation could not be observed in all reaction systems regardless of the type and concentration of the added gene (Fig. 3 (1)-(Fig. 3 (1)-(" 8)). As a result of electrophoresis, in the system to which the model target gene was added (Figs. 3 (1) to (7)), bands derived from the target product were confirmed (data not shown), so latex beads were used as nanoparticles. In this case, it was shown that hybridization between the model target gene and the nucleic acid probe occurred, but no bead sedimentation and turbidity reduction occurred.
本発明は、遺伝子解析技術として利用できる。 The present invention can be used as a gene analysis technique.
＜配列番号１～１４＞実施例１で使用したオリゴＤＮＡの塩基配列を示す。 <SEQ ID NOS: 1 to 14> The base sequence of the oligo DNA used in Example 1 is shown.
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