JP2022024190A - 原着タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びに原着タンパク質成形体用着色剤 - Google Patents

Abstract

【課題】従来とは異なる原着色素によって着色されたタンパク質成形体を提供すること。【解決手段】タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、原着タンパク質成形体が開示される。原着タンパク質成形体は、繊維又はフィルムであってもよい。【選択図】なし

Description

本発明は、原着タンパク質成形体及びその製造方法、成形用原液及びその製造方法、並びに原着タンパク質成形体用着色剤に関する。

特許文献１は、原着色素として酸性染料、塩基性染料、蛍光染料等の原着色素で着色されたタンパク質繊維を開示している。ここでの原着色素は、タンパク質繊維を紡糸によって製造するためドープ液に添加される色素である。

特許第５４０７００６号公報

原着色素による着色の程度は、タンパク質、及びタンパク質材料を溶解する溶媒の種類によって変化する。そのため、例えば、少量の原着色素では、タンパク質繊維等の成形体を十分に着色できないことがある。したがって、原着色素の選択肢は出来るだけ多いことが望ましい。本発明の一側面の目的は、従来とは異なる原着色素によって着色されたタンパク質成形体を提供することにある。

本発明者が鋭意検討した結果、タンパク質成形体を得るための成形用原液に、プリン環を有するプリン塩基化合物を添加することにより、少量のプリン塩基化合物であっても十分に着色された原着タンパク質成形体が得られることを見出した。本発明は係る知見に基づいて完成されたものである。

すなわち、本発明の一側面は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、原着タンパク質成形体に関する。

本発明の別の一側面は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物とを含有する、原着タンパク質成形体を得るための成形用原液に関する。この成形用原液は、例えば、タンパク質を含む原料粉体、プリン環を有するプリン塩基化合物、及び溶媒を含むタンパク質含有液を準備することと、前記タンパク質含有液中の前記タンパク質を前記溶媒に溶解させることと、を含む方法によって得ることができる。この成形用原液を用いた成形により、着色したタンパク質成形体を形成することを含む方法によって、原着タンパク質成形体を製造することができる。プリン塩基化合物は、原料粉体中に含まれていてもよい。原料粉体が、タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物、又は、前記タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体であってもよい。

本発明の更に別の一側面は、プリン環を有するプリン塩基化合物を含む、原着タンパク質成形体用着色剤に関する。この着色剤は、例えば上記方法によって成形用原液、及び原着タンパク質成形体を製造するために用いることができる。

本発明によれば、従来とは異なる原着色素によって着色されたタンパク質成形体を提供することができる。

原着タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 天然フィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 天然フィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

一実施形態に係る原着タンパク質成形体は、タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する。ここで、「原着」とは、成形用原液から各種の成形方法によって形成された成形体自体が、その内部も含めて着色されることを意味し、形成された成形体の表面を後から染色して得られる着色成形体とは異なる。本実施形態に係る原着タンパク質成形体は、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物が原着色素として作用することによって、着色されている。原着色素（ここではプリン塩基化合物）を含まない成形用原液から得られた成形体と比較して、着色していることが目視で確認できるタンパク質成形体は、原着タンパク質成形体とみなすことができる。

原着タンパク質成形体は、主としてタンパク質によって形成された成形体である。成形体におけるタンパク質の割合は、例えば、成形体の質量を基準として、８０質量％以上、又は９０質量％以上であってもよい。タンパク質の詳細は後述される。

プリン塩基化合物は、１個以上のプリン環を有する化合物である。プリン環は、アデニン環、グアニン環、ヒボキサンチン環、キサンチン環、テオブロミン環、カフェイン環、尿酸環、イソグアニン環、又はこれらの組み合わせであってもよい。プリン塩基化合物が、プリン環及びピリミジン環を有していてもよい。プリン塩基化合物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、又はＤＮＡに由来する化合物であってもよい。ＤＮＡに由来するプリン塩基化合物は、プリン環としてアデニン環又はグアニン環を有する化合物であってもよい。プリン塩基化合物は、ヌクレオシド又はヌクレオチドであってもよい。ＤＮＡに由来するプリン塩基化合物の例としては、デオキシアデノシン一リン酸、及び２’－デオキシグアノシン５’－一リン酸ナトリウムが挙げられる。

プリン塩基化合物の分解物は、例えば、イミダゾール環とプリン環の６員環部分に由来する置換基とを有するイミダゾール化合物であり得る。プリン環の６員環部分に由来する置換基は、典型的には、イミダゾール環の４位及び５位に結合する。置換基の例としては、カルボキサミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２）、ホルムアミノ基（－ＮＨＣＨＯ）、及びアミノ基（－ＮＨ_２）が挙げられる。

原着タンパク質成形体におけるプリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が、タンパク質の質量に対して０．５質量％以上であってもよい。プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が０．５質量％以上であると、タンパク質成形体が特に着色され易い。同様の観点から、プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量が１．０質量％以上であってもよい。プリン塩基化合物及びその分解物の合計の含有量の上限は、特に制限されないが、１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよい。プリン塩基化合物の含有量がこれら数値範囲内にあってもよい。

原着タンパク質成形体は、溶媒を更に含み得る。この溶媒は、通常、成形体を得るために用いられた成形用原液に含まれていた溶媒である。この溶媒は、例えばギ酸等の酸化合物（特に、有機酸化合物）を含んでいてもよい。原着タンパク質成形体における溶媒の含有量は、例えば、タンパク質の質量に対して０．０００１～１質量％であってもよい。

原着タンパク質成形体は、例えば、タンパク質、プリン塩基化合物及びこれらを溶解している溶媒を含有する成形用原液を用いた成形により、着色したタンパク質成形体を形成することを含む方法によって、製造することができる。プリン塩基化合物を含有する成形用原液を用いることにより、十分に着色した原着タンパク質成形体を得ることができる。プリン塩基化合物の少なくとも一部が、原着タンパク質成形体が形成される過程で、溶媒との反応及び／又は熱履歴等の影響で分解し得る。

成形用原液におけるタンパク質の濃度は、例えば、成形用原液の質量を基準として、５～５０質量％であってもよい。プリン塩基化合物の量は、タンパク質の質量に対して、０．５質量％以上、又は１．０質量％以上であってもよく、１０質量％以下、又は８質量％以下であってもよい。

成形用原液は、例えば、タンパク質を含む原料粉体、プリン塩基化合物、及び溶媒を含有するタンパク質含有液を準備することと、タンパク質含有液中のタンパク質を溶媒に溶解させることと、を含む方法により、得ることができる。プリン塩基化合物は、原料粉体に含まれていてもよいし、原料粉体とは別に溶媒中に溶解又は分散していていもよい。原料粉体が、例えば、タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物を含む粉体であっても、タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体であってもよい。成形用原液を得る方法が、溶媒を加熱することを更に含んでもよい。タンパク質含有液は、例えば、プリン塩基化合物を溶媒に分散又は溶解させるため、タンパク質を溶媒に溶解させるため、又は後述のように不溶分を除去するためのうち少なくともいずれかの目的で、加熱され得る。

タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物を含む原料粉体は、宿主の培養により生成及び蓄積されたタンパク質を含む培養培地から回収された粉体であってもよい。宿主の粉砕物を溶媒と混合してもよいし、宿主をタンパク質含有液中で粉砕してもよい。タンパク質を溶媒に溶解させる前又は後に、宿主の粉砕等によって生じた夾雑物を含む不溶分が除去される。不溶分の除去の際、タンパク質含有液を加熱してもよい。不溶分の除去のための加熱温度は、例えば２０～７０℃である。

タンパク質及びプリン塩基化合物を含む粉体は、宿主の培養により生成及び蓄積されたタンパク質を含む培養培地から回収及び精製されたタンパク質を含む粉体であってもよい。タンパク質は、通常の方法で培養培地から回収及び精製することができる。精製されたタンパク質を含む粉体中に、宿主に由来するプリン塩基化合物が残存していてもよい。

タンパク質が宿主内に溶解状態で発現した場合、培養終了後、宿主を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁させることと、懸濁液中で超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主を破砕して、無細胞抽出液を得ることと、無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質を単離精製することと、を含む方法により、精製されたタンパク質を含む粉体を得ることができる。上清からタンパク質を単離精製する方法として、例えば溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、電気泳動法、又はこれらの組み合わせを採用することができる。

発現したタンパク質が宿主の細胞内に不溶体を形成している場合、上記と同様の方法で回収された宿主を破砕して粉砕物を得ることと、遠心分離等によってタンパク質の不溶体を回収することと、タンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化してタンパク質を含む溶液を得ることと、該溶液からタンパク質を単離精製することとを含む方法により、精製されたタンパク質を含む粉体を得ることができる。溶液からのタンパク質を単離精製する方法は、上清からタンパク質を単離精製する場合と同様の方法であることができる。

発現したタンパク質が細胞外に分泌された場合、培養上清からタンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の方法によりタンパク質を単離精製することができる。

原着色素として用いられるプリン塩基化合物は、タンパク質を溶媒に溶解させる前にタンパク質含有液に加えられてもよいし、タンパク質を溶媒に溶解させた後でタンパク質含有液に加えられてもよい。原料粉体が、宿主に由来するプリン塩基化合物を含んでいてもよい。プリン塩基化合物が溶媒中に溶解していてもよい。プリン塩基化合物を溶媒に溶解させるために、タンパク質含有液を加熱してもよい。プリン塩基化合物の溶解のための加熱温度は、例えば２０～７０℃である。

タンパク質含有液中のタンパク質は、例えば、タンパク質含有液を加熱することにより、溶媒に溶解される。タンパク質の溶解のための加熱温度は、例えば２０～７０℃、又は２５～４０℃であってもよい。原料粉体が宿主若しくはその粉砕物を含む粉体である場合、タンパク質含有液を加熱することによって、タンパク質が宿主又はその粉砕物から抽出され、それによりタンパク質が溶媒に溶解する。

タンパク質含有液を調製するための溶媒としては、例えば酸化合物（特に、有機酸化合物）を用いることができる。酸化合物とプリン塩基化合物との組み合わせにより、着色されたタンパク質成形体がより一層容易に形成される傾向がある。これは、酸化合物とプリン塩基化合物の化学反応に因るものと考えられる。溶媒として用いられ得る有機酸化合物の例としては、ギ酸、酢酸、クエン酸、及びシュウ酸が挙げられる。タンパク質含有液は、酸化合物以外の溶媒を含んでいてもよい。溶媒が酸化合物の水溶液であってもよい。溶媒の全量に対する酸化合物の割合は、例えば５０～１００質量％、７０～１００質量％、又は９０～１００質量％であってもよい。

原着タンパク質成形体の形状は、特に制限されないが、繊維又はフィルムであってもよい。

原着タンパク質成形体としての原着タンパク質繊維は、成形用原液をドープ液として用いた紡糸方法によって、製造することができる。紡糸方法としては、例えば、湿式紡糸、乾式紡糸、乾湿式紡糸又は溶融紡糸等の通常の方法を利用できる。紡糸方法が、湿式紡糸又は乾湿式紡糸であってもよい。

図１は、原着タンパク質維を製造するための紡糸装置の一例を示す模式図である。図１に示す紡糸装置は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾燥装置４とを有している。

紡糸装置１０の貯槽７に貯蔵されたドープ液６（成形用原液）が、ギアポンプ８により口金９から押し出される。ドープ液を押し出す方法はこれに限られず、例えば、シリンダーに充填されたドープ液を、シリンジポンプを用いてノズルから押し出してもよい。押し出されたドープ液６は、エアギャップ１９を経て、凝固液槽２０の凝固液１１内に導入される。凝固液１１内で溶媒が除去されることにより、タンパク質が凝固し、繊維状の凝固体である原着タンパク質繊維が形成される。原着タンパク質繊維は、延伸浴槽２１内の温水１２中に導入され、そこで延伸される。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。延伸された原着タンパク質繊維は、乾燥装置４の糸道２２内に導入され、糸道２２を通過しながら乾燥される。乾燥された原着タンパク質繊維３６が巻き取られて、原着タンパク質繊維の巻糸体５が得られる。紡糸装置１０は、原着タンパク質繊維３６の移動経路上に設けられた糸ガイド１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、１８ｆ及び１８ｇを有している。

凝固液１１は、ドープ液から脱溶媒できる溶媒であればよく、その例としては、メタノール、エタノール及び２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール、並びにアセトンを挙げることができる。凝固液１１は、水を含んでいてもよい。凝固液１１の温度は、０～３０℃であってもよい。

口金９として、直径０．１～０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプを使用してもよい。その場合、押出し速度は１ホール当たり、０．２～６．０ｍｌ／時間、又は１．４～４．０ｍｌ／時間であってもよい。原着タンパク質繊維が凝固液１１中を通過する距離は、脱溶媒が十分に行える長さであればよく、例えば、２００～５００ｍｍである。未延伸の原着タンパク質繊維の引き取り速度は、１～２０ｍ／分、又は１～３ｍ／分であってもよい。凝固液１１中での原着タンパク質繊維の滞留時間は、０．０１～３分、又は０．０５～０．１５分であってもよい。凝固液１１中で原着タンパク質繊維を延伸してもよい。凝固液１１中での延伸は、前延伸ということがある。多段の凝固液槽２０が設けられてもよい。

原着タンパク質繊維維は、例えば、凝固液槽２０内での前延伸、延伸浴槽２１内での湿熱延伸、乾熱延伸又はこれらの組み合わせにより、延伸される。

湿熱延伸では、未延伸、又は凝固液槽２０内で前延伸された原着タンパク質繊維が延伸浴槽２１内の温水１２中で延伸される。温水１２の温度は、例えば、５０～９０℃、又は７５～８５℃であってもよい。温水１２に有機溶剤等を加えられてもよい。温水に代えて、スチーム加熱中で湿熱延伸を行ってもよい。湿熱延伸の延伸倍率は、例えば、１～１０倍、又は２～８倍であってもよい。

乾熱延伸は、電気管状炉、乾熱板等を使用して行うことができる。乾熱延伸の温度は、例えば、１４０～２７０℃、又は１６０～２３０℃であってもよい。乾熱延伸における延伸倍率は、例えば、０．５～８倍、又は１～４倍であってもよい。

最終的な延伸倍率は、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、１倍超、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、又は９倍以上であってもよく、４０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１４倍以下、１３倍以下、１２倍以下、１１倍以下、又は１０倍以下であってもよい。

原着タンパク質成形体としての原着タンパク質フィルムは、例えば、成形用原液をドープ溶液として用い、これを基材表面にキャスト成形することと、形成された塗膜を乾燥する、及び／又は脱溶媒することとを含む方法により得ることができる。

原着タンパク質フィルムを製造するためのドープ溶液の粘度は１５～８０ｃＰ（センチポアズ）、又は２０～７０ｃＰであってもよい。タンパク質の濃度は、ドープ溶液全量を１００質量％として、３～５０質量％、３．５～３５質量％、又は４．２～１５．８質量％であってもよい。

基材は、樹脂基板、ガラス基板、金属基板等であってよい。基材は、形成されたフィルムを容易に剥離できる観点から、樹脂基板であってもよい。樹脂基板は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂フィルム、ポリプロピレン（ＰＰ）フィルム、又はこれらのフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってよい。基材は、ＨＦＩＰ、ＤＭＳＯ溶媒等に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後のフィルムを容易に剥離できる観点から、ＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルム表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムであってもよい。

キャスト成形の一例は、ドープ液を基材表面に流延することと、塗膜の厚さをアプリケーター、ナイフコーター、バーコーター等の膜厚制御手段を使用して所定の厚さに調整することとを含む。所定の厚さは、塗膜の乾燥及び／又は脱溶媒後の厚さが、例えば１～１０００μｍとなる範囲で設定される。

塗膜の乾燥及び脱溶媒は、乾式又は湿式で行うことができる。乾式で行う方法の例としては、真空乾燥、熱風乾燥、風乾を挙げることができる。湿式で行う方法の例としては、塗膜を脱溶媒液に浸漬する方法を挙げることができる。脱溶媒液の例として、水、メタノール、エタノール、２－プロパノール等の炭素数１～５の低級アルコール等のアルコール液、水とアルコールとの混合液を挙げることができる。脱溶媒液の温度は０～９０℃であってもよい。

乾燥及び／又は脱溶媒後、形成された原着タンパク質フィルムを、水中で１軸延伸又は２軸延伸してもよい。２軸延伸は、逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしてもよい。延伸倍率は、縦、横ともに、１．０１～６倍、又は１．０５～４倍であってもよい。この範囲であると応力－歪のバランスがとりやすい。水中延伸は、例えば２０～９０℃の水温で行うことができる。延伸後の原着タンパク質フィルムを、５０～２００℃で５～６００秒間の乾熱処理により、熱固定してもよい。この熱固定により、常温における寸法安定性に優れた原着タンパク質フィルムが得られる。通常、１軸延伸したフィルムは、１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。

原着タンパク質成形体を形成するタンパク質は、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質は、クモ糸タンパク質、又は絹タンパク質であってもよい。

構造タンパク質であるクモ糸タンパク質の代表例は、フィブロインである。フィブロインは、人為的に製造された人造フィブロインであってもよい。人造フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインのアミノ酸配列と同一でも異なっていてもよい。

フィブロインは、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質であってもよい。スパイダーシルクタンパク質を産生するクモとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、ヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモ、並びに、アシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが挙げられる。スパイダーシルクタンパク質は、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）であってもよい。

スパイダーシルクタンパク質の具体例としては、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、及び、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）が挙げられる。

天然フィブロインのその他の具体例としては、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。

フィブロインが、改変フィブロインであってもよい。改変フィブロインは、天然フィブロインのアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有するフィブロインであっても、天然フィブロインに依らず人工的に設計及び合成されたフィブロインであってもよい。改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインのアミノ酸配列を、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加すること改変したアミノ酸配列を有していてもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。

改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインであってもよい。ｍは２～３００、又は１０～３００の整数を示す。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側に付加されたＮ末端配列、ドメイン配列のＣ末端側に付加されたＣ末端配列、又はこれらの両方を更に含んでいてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、特に限定されないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。

本明細書において「ドメイン配列」は、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列を意味する。

式１及び２中の（Ａ）_ｎモチーフは、主としてアラニン残基から構成されるアミノ酸配列である。（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２７、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６であってよい。フィブロイン中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一又は異なるアミノ酸配列を有する。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は、４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。ドメイン配列を構成するｍ個の（Ａ）_ｎモチーフのうち７個以上が、アラニン残基のみで構成されてもよい。

式１及び２中のＲＥＰは、２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。フィブロイン中に複数存在するＲＥＰは、互いに同一又は異なるアミノ酸配列を有する。

改変フィブロインは、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（以下「第１の改変フィブロイン」という。）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第２の改変フィブロイン」という。）、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第３の改変フィブロイン」という）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（以下「第４の改変フィブロイン」という。）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第５の改変フィブロイン」という。）、又は、グルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（以下「第６の改変フィブロイン」）であってもよい。ここでの分類は便宜的なものであり、１種の改変フィブロインがこれらの２以上の分類に該当し得る。

第１の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでいてもよい。第１の改変フィブロインにおける（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６であってもよい。第１の改変フィブロインにおけるＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００、１０～１５０、２０～１００、又は２０～７５であってもよい。式１で表されるドメイン配列において、グリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数が、アミノ酸残基数全体に対して、４０％以上、６０％以上、又は７０％以上であってもよい。

第１の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列と、配列番号１、２又は３のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるＣ末端配列とを有していてもよい。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一である。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一である、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

第１の改変フィブロインの具体例として、配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は、９５％以上であってもよい。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列を、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加し、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍に増やし、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。

第２の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較してグリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然フィブロインにおいて少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたものに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されていてもよい。第２の改変フィブロインにおいて、グリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。

第２の改変フィブロインが式１で表されるドメイン配列を含んでもよい。式１のドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列中において、全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。

第２の改変フィブロインにおいて、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が高められていてもよい。第２の改変フィブロインのドメイン配列におけるＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が、３０％以下、２０％以下、１０％以下、６％以下、４％以下、又は２％以下であってもよい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、ｚ／ｗの算出方法と同様の方法で算出することができる。

ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１で表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が重複なく５０個抽出された場合、ｚは５０×３＝１５０である。例えばＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列のように、２つのＸＧＸに含まれるＸが存在する場合、重複分を控除してｚを計算する。したがって、ＸＧＸＧＸにおけるアミノ酸残基の数は５としてｚに算入される。ｗは、式１で表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である。ここで、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフは除かれている。

ここで、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインから、６６３種類の天然フィブロイン（このうち、クモ類由来の天然フィブロインは４１５種類）が抽出される。抽出されたフィブロインのうち、式１で表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下であるもののアミノ酸配列について、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図３に示す。図３の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３に示されるように、天然フィブロインにおけるｚ／ｗは、最大で５０．８６％である。

第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上、５６．１％以上、５８．７％以上、７０％以上、８０％以上であってもよい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。

第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、ｚ／ｗが５０．９％以上になるように塩基配列を置換してもよい。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

グリシン残基を置換する別のアミノ酸残基は、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、又は、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基であってもよく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基であってもよく、グルタミン（Ｑ）残基であってもよい。

第２の改変フィブロインの具体例として、配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然フィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）_ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然フィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。ギザ比率の詳細は後述される。

配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であってもよい。

第２の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加されたタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。

グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。

抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。

タグ配列は、特定のプロテアーゼで切り離すことが可能であってもよい。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。

タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であってもよい。

第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

第３の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインから（Ａ）_ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）_ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）_ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）_ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するドメイン配列を有していてもよい。第３の改変フィブロインが、天然フィブロインと比較して、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。

第３の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでいてもよい。式１で表されるドメイン配列において隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３である組み合わせに含まれるアミノ酸残基の合計が、最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は８３％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％であってもよい。

ｘ／ｙの算出方法を図２を参照しながら更に詳細に説明する。図２は、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。図２のドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から、（Ａ）_ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフという配列を有する。

隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットを、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図２には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。これ以外にも選択方法は存在する。

次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。

図２中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。

各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる。このとき、ＲＥＰだけでなく（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数も算入される。足し合わせた合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）がｘとする。図２に示した例では、パターン１の合計値が最大である。

第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、又は８０％以上であってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３で、ｘ／ｙが８９．６％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．８～３．４で、ｘ／ｙが７７．１％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．９～８．４で、ｘ／ｙが７５．９％以上であってもよい。ギザ比率が１：１．９～４．１で、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。

第３の改変フィブロインのドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフのうち７個以上がアラニン残基のみで構成される場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、又は８０％以上でってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であってもよい。

ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されている６６３種類のフィブロインのうち、式１で表されるドメイン配列で構成される天然フィブロインのアミノ酸配列に関して、上述の算出方法によりｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図４に示す。図４の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図４に示されるように、天然フィブロインにおけるｘ／ｙは、最大で６４．１４％である。

第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）_ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。例えば、天然フィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、第３のフィブロインを得ることもできる。天然フィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

第３の改変フィブロインの具体例として、配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然フィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然フィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。

配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するドメイン配列において、隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比（ギザ比率）が１．８～１１．３である組み合わせにおけるアミノ酸残基数の合計が最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。

第３の改変フィブロインが、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。

タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）、若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの拝謁同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するドメイン配列において、隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組み合わせであって、アミノ酸残基数が少ない方のＲＥＰのアミノ酸残基数に対する他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３である組み合わせにおけるアミノ酸残基数の合計が最大でｘであり、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。

第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

第４の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然フィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有する。

第４の改変フィブロインの具体例として、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。

第５の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有していてもよい。局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４個の疎水性指標の大きいアミノ酸残基で構成されていてもよい。

アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。

疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基、又は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。

第５の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、天然フィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことにより改変されていてもよい。

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、第５の改変フィブロインを得ることもできる。

第５の改変フィブロインは、式１で表されるドメイン配列を含んでもよい。ドメイン配列のうち最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列（以下、「配列Ａ」ということがある。）において、ＲＥＰ中で連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、アミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。

ｐ／ｑの計算においては、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。

例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所重複なく抽出された場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基が重複なく２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図５に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である。ここで、Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）_ｎモチーフは算入されない。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図５の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。

第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上、７％以、１０％以上、２０％以上で、又は３０％以上であってもよい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより第５の改変フィブロインを得ることもできる。天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。

第５の改変フィブロインのより具体例として、配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。

配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。

第５の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。

タグ配列を含む改変フィブロインの具体例として、配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、ｐ／ｑが６．２％以上であってもよい。

第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。

第６の改変フィブロインのＲＥＰは、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含んでいてもよい。

第６の改変フィブロインのＲＥＰがＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、１％以、５％以上、又は１０％以上であってもよい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。

本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、ＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、（Ａ）_ｎモチーフを除く全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。

ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。

図６は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図６を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図６に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図６中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図６中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図６の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。

第６の改変フィブロインのグルタミン残基含有率が９％以下、７％以下、４％以下、又は０％であってもよい。

本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列（図６の「領域Ａ」に相当する配列）において、全てのＲＥＰに含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、（Ａ）_ｎモチーフを除いた全てのＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。

第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するドメイン配列を有していてもよい。

「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であってもよい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。疎水性指標の大きいアミノ酸残基が、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基、又は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。

第６の改変フィブロインにおけるＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上、－０．７以上、０以上で、０．３以上、又は０．４以上であってもよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下、又は０．７以下であってもよい。

本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからＣ末端までの配列を除いた配列（図６の「領域Ａ」に相当する配列。）において、全てのＲＥＰの各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、（Ａ）_ｎモチーフを除いた全てのＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。

第６の改変フィブロインは、天然フィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変が行われたアミノ酸配列を有していてもよい。

第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然フィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。天然フィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより第６の改変フィブロインを得ることもできる。

第６の改変フィブロインの具体例として、配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。

配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１若しくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインにおいて、グルタミン残基含有率が９％以下であってもよい。同改変フィブロインにおけるＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であってもよい。

第６の改変フィブロインは、Ｎ末端、Ｃ末端又はこれらの両方に付加された上述のタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体例として、配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号４０（ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又はこれらアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。ここでも配列同一性は９５％以上であってもよい。配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列において、グルタミン残基含有率は９％以下である（表３）。

配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインにおいて、グルタミン残基含有率が９％以下であってもよい。同改変フィブロインにおいて、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であってもよい。

第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。

改変フィブロインは、例えば、改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

１．改変クモ糸フィブロインの製造
（１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号１１で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。

ＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。この核酸の５’末端にＮｄｅＩサイトを付加し、この核酸の終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、ＰＲＴ７９９をコードする核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した。切り出された核酸をタンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。

（２）タンパク質の発現
得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターにより、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。次いで、培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬの表４に示されるシード培養用培地に、ＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまで、約１５時間かけてフラスコ培養を行い、シード培養液を得た。

得られたシード培養液を、５００ｍＬの表５に示される生産培地を添加したジャーファーメンターに、ＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を行った。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。添加後、培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養を２０時間継続した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。
その後、培養液に対して、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導した。ＩＰＴＧを添加してから２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするクモ糸フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とするクモ糸フィブロインの発現を確認した。

（３）タンパク質の精製
回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）中に懸濁させた。懸濁液を６０℃で３０分間、スターラーで撹拌することにより、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収た。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除くことにより、改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」の凍結乾燥粉末を得た。

２．改変クモ糸フィブロイン繊維の作製
（１）原着色素
原着色素として、以下の材料を準備した。
プリン塩基化合物：
・ＤＮＡ：魚類***由来のＤＮＡ
・ｄＡＭＰ：デオキシアデノシン一リン酸(abcam, 純度：＞９８％）
・ｄＧＭＰ：２’－デオキシグアノシン５’－一リン酸ナトリウム水和物（SIGMA、純度≧９９％（ＨＰＬＣ））
ピリミジン塩基化合物：
・ｄＴＭＰ：チミジン５’－一リン酸二ナトリウム水和物（sigma、純度；≧９９％）
・ｄＣＭＰ：２’－デオキシシチジン５’－一りん酸水和物（東京化成、純度＞９８．０％（ＨＰＬＣ））

（２）ギ酸溶液の調製
ギ酸（株式会社朝日化学工業所）に、各原着色素を添加して、原着色素のギ酸溶液を調整した。原着色素の濃度がギ酸溶液の全質量に対して１質量％又は５質量％である２種の溶液を調製した。得られたギ酸溶液から、ゴミ及び泡を取り除いた。

（３）ギ酸溶液の呈色試験
試験１
ＤＮＡ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、又はｄＣＭＰのギ酸溶液を、ターボサーモシェイカー（バイオメディカルサイエンス株式会社、BSR-TMS-200）を用いて、室温で２０００ｒｐｍで撹拌した。撹拌後の呈色の有無を目視で確認した。下記表６に示される呈色程度は、以下の基準で判定された結果である。
＋＋：濃い呈色
＋：薄い呈色
－：呈色無し

試験２
ＤＮＡ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰのギ酸溶液を、ターボサーモシェイカー（バイオメディカルサイエンス株式会社、BSR-TMS-200）を用いて、室温で２０００ｒｐｍで撹拌した。撹拌後の各ギ酸溶液を、７０℃で１時間、加熱処理した。その後の呈色の有無を目視で確認した。試験１と同様の基準で呈色程度を評価した。結果を表７に示す。

試験３
改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」の凍結乾燥粉末をギ酸中に懸濁させた。改変クモ糸フィブロインの量は、懸濁液の質量を基準として２６質量％とした。この懸濁液に、原着色素としてのｄＡＭＰを溶解させた。ｄＡＭＰの量は、ドープ液中の改変クモ糸フィブロイン及びｄＡＭＰの合計質量に対し、１質量％とした。その後、シェーカーを用いて懸濁液を浸透することにより、改変クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させて、改変クモ糸フィブロイン及びｄＡＭＰを含むギ酸溶液を得た。得られたギ酸溶液を、７０℃で１時間、加熱処理した。加熱処理後のギ酸溶液は濃い茶色に呈色していた。

試験１、２及び３から、プリン塩基化合物と酸化合物との組み合わせによる呈色が確認された。したがって、これらの組み合わせを含む成形用原液を用いることにより、原着タンパク質成形体を得ることができると考えられる。

（４）ドープ液の調整
改変クモ糸フィブロイン「ＰＲＴ７９９」の凍結乾燥粉末をギ酸中に懸濁させた。改変クモ糸フィブロインの量は、懸濁液の質量を基準として２６質量％とした。この懸濁液に、原着色素としてのＤＮＡを溶解させた。ＤＮＡの量は、ドープ液中の改変クモ糸フィブロインの質量に対し、１質量％又は５質量％とした。その後、シェーカーを用いて懸濁液を浸透することにより、改変クモ糸フィブロインを３時間かけて溶解させて、ドープ液を得た。ドープ液中のゴミ及び泡を取り除いた。ドープ液の粘度は、６０℃において５０００ｃＰであった。

（５）紡糸
改変クモ糸フィブロイン及び原着色素を含むドープ液を、メタノールを含む凝固浴中に吐出することにより、紡糸した。紡糸により形成された繊維を延伸及び乾燥して、改変クモ糸フィブロイン繊維のフィラメントを得た。得られたフィラメントをボビンに巻き取った。比較のため、原着色素を含まないドープ液を用いて、同様に改変クモ糸フィブロインの繊維を作製した。原着色素を含まないドープ液を用いて得た繊維が透明であったのに対して、原着色素としてＤＮＡを含むドープ液を用いて得た繊維は、灰色に呈色していた。
凝固浴温度：５～１０℃
延伸倍率：４．５２倍
乾燥温度：８０℃

１…押出し装置、２…未延伸糸製造装置、３…湿熱延伸装置、４…乾燥装置、６…ドープ液、１０…紡糸装置、２０…凝固液槽、２１…延伸浴槽、３６…原着タンパク質繊維。

Claims (17)

1. タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物及び／又はその分解物と、を含有する、原着タンパク質成形体。
2. 前記プリン塩基化合物が、ＤＮＡ、又はＤＮＡに由来する化合物である、請求項１に記載の原着タンパク質成形体。
3. 前記プリン塩基化合物の含有量及びその分解物の合計の含有量が、前記タンパク質の質量に対し、０．５質量％以上である、請求項１又は２に記載の原着タンパク質成形体。
4. 溶媒を更に含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の原着タンパク質成形体。
5. 前記溶媒が酸化合物を含む、請求項４に記載の原着タンパク質成形体。
6. 当該原着タンパク質成形体が繊維又はフィルムである、請求項１～５のいずれか一項に記載の原着タンパク質成形体。
7. 前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の原着タンパク質成形体。
8. 前記構造タンパク質がクモ糸タンパク質を含む、請求項７に記載の原着タンパク質成形体。
9. タンパク質と、プリン環を有するプリン塩基化合物と、を含有する、原着タンパク質成形体を得るための成形用原液。
10. 前記プリン塩基化合物が、ＤＮＡ、又はＤＮＡに由来する化合物である、請求項９に記載の成形用原液。
11. 前記タンパク質がクモ糸タンパク質を含む構造タンパク質である、請求項９又は１０に記載の成形用原液。
12. 原着タンパク質成形体を得るための成形用原液を製造する方法であって、
    タンパク質を含む原料粉体、プリン環を有するプリン塩基化合物、及び溶媒を含有し、前記プリン塩基化合物が前記原料粉体中に含まれていてもよい、タンパク質含有液を準備することと、
    前記タンパク質含有液中の前記タンパク質を前記溶媒に溶解させることと、を含み、
    前記原料粉体が、前記タンパク質が発現した宿主若しくはその粉砕物である、又は、前記タンパク質及び前記プリン塩基化合物を含む粉体である、
    方法。
13. 前記溶媒が酸化合物を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記タンパク質含有液を加熱することを更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記タンパク質がクモ糸タンパク質を含む構造タンパク質である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の成形用原液を用いた成形により、原着タンパク質成形体を形成することを含む、原着タンパク質成形体を製造する方法。
17. プリン環を有するプリン塩基化合物を含む、原着タンパク質成形体用着色剤。

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