JP2022014809A - Parechovirus detection primer set and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、パレコウイルス検出用プライマーセット及びその使用に関する。より具体的には、パレコウイルスをLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法で検出するためのプライマーセット、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのキット及びパレコウイルスの検出方法に関する。 The present invention relates to a primer set for detecting parechovirus and its use. More specifically, the present invention relates to a primer set for detecting Parechovirus by the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method, a kit for detecting Parechovirus by the LAMP method, and a method for detecting Parechovirus.
パレコウイルス(HPeV)は、主として小児に感染し上気道炎や胃腸炎などを引き起こす、いわゆる“感冒”の原因ウイルスである。HPeVのうち特に3型(HPeV3)では、成人や多くの小児では無症状もしくは軽微な胃腸炎で経過するが、HPeV3は、生後1ヶ月前後の乳児に感染すると、しばしば敗血症様症状・脳炎などを呈し、重症化する。 Parechovirus (HPeV) is a so-called "cold" virus that mainly infects children and causes upper respiratory tract inflammation and gastroenteritis. Among HPeV, type 3 (HPeV3), especially in adults and many children, progresses with asymptomatic or mild gastroenteritis, but when infected with infants around 1 month old, HPeV3 often causes sepsis-like symptoms and encephalitis. It presents and becomes severe.
パレコウイルスの検出方法としては、PCR法を用いる検出方法が知られている(非特許文献1)。しかしながら、PCR法は、結果が判明するまでに最短でも16~24時間、通常は2~3日かかる。 As a detection method for parechovirus, a detection method using a PCR method is known (Non-Patent Document 1). However, the PCR method takes a minimum of 16 to 24 hours, usually 2 to 3 days, before the results are known.
LAMP法は、4~6種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である(例えば、特許文献1を参照)。LAMP法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、PCR法と比較して迅速に測定することができ、4つ以上のプライマーを設定することから特異性も高い。 The LAMP method is a gene amplification method that amplifies a target gene by an isothermal reaction using 4 to 6 types of primers and detects the presence of the target gene by the turbidity of the reaction solution (see, for example, Patent Document 1). .. Since the LAMP method is an isothermal reaction, it can be carried out with a simple device, and it can be measured more rapidly than the PCR method, and it has high specificity because four or more primers are set. ..
LAMP法が成功するか否かは、プライマーの設計による。プライマー設計においては、プライマー間距離、各プライマー領域のTm値、各プライマー領域の末端安定性、GC含量、二次構造等が重要であり、これを設計するための設計支援ソフトも存在するものの、ソフトで設計したプライマーが高効率且つ高特異的に標的核酸を増幅するとは限らない。特に、LAMP法をウイルスの検出等に用いる場合には、まず最適な標的配列を特定し、その配列を特異的に増幅できるプライマーを作製しなければならない。
これまで、パレコウイルスを特異的にLAMP法で検出するための標的配列及びプライマーは見出されていなかった。
The success of the LAMP method depends on the primer design. In primer design, the distance between primers, the Tm value of each primer region, the terminal stability of each primer region, the GC content, the secondary structure, etc. are important, and although there is design support software for designing these, Softly designed primers do not always amplify the target nucleic acid with high efficiency and high specificity. In particular, when the LAMP method is used for virus detection or the like, it is necessary to first identify the optimum target sequence and prepare a primer capable of specifically amplifying the sequence.
So far, no target sequence and primer for specifically detecting parechovirus by the LAMP method have been found.
従来、パレコウイルスの検出はPCR法により行われてきた。しかしながら、PCR法は、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において、このタイムラグは大きな問題である。 Conventionally, detection of parechovirus has been performed by the PCR method. However, the PCR method is currently not available at any facility. In addition, since it takes several days for the results to be known, this time lag is a big problem in the clinical practice of newborns whose symptoms change on an hourly basis.
このような背景のもと、本発明は、パレコウイルスを、LAMP法を用いて簡便に検出する技術を提供することを目的とする。 Against this background, it is an object of the present invention to provide a technique for easily detecting a parechovirus using the LAMP method.
本発明は以下の通りである。
[1] パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号2に記載の塩基配列、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号7に記載の塩基配列、又は配列番号7に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。
[2] 配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、[1]に記載のプライマーセット。
[3] パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号3に記載の塩基配列、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号6に記載の塩基配列、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号8に記載の塩基配列、又は配列番号8に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。
[4] 配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、[3]に記載のプライマーセット。
[5] パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号10に記載の塩基配列、又は配列番号10に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号11に記載の塩基配列、又は配列番号11に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列、又は配列番号12に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。
[6] 配列番号10に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、[5]に記載のプライマーセット。
[7] [1]~[6]のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのキット。
[8] パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に[1]~[6]のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。
The present invention is as follows.
[1] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[2] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [1].
[3] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[4] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [3].
[5] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[6] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [5].
[7] A kit for detecting parechovirus by the LAMP method, which comprises the primer set according to any one of [1] to [6].
[8] A method for detecting parechovirus.
A step of mixing a biological sample with the primer set according to any one of [1] to [6] and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method is included.
A detection method in which the detection of an isothermal amplification reaction after the step indicates that the parechovirus was present in the biological sample.
本発明によれば、パレコウイルスを簡便に検出する技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technique for easily detecting a parechovirus.
上述したように、LAMP法は、4~6種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である。 As described above, the LAMP method is a gene amplification method in which the target gene is amplified by an isothermal reaction using 4 to 6 types of primers, and the presence of the target gene is detected by the turbidity of the reaction solution.
LAMP法は、同じ遺伝子増幅技術であるPCR法に比べて増幅効率が高く、核酸を15分~1時間で109~1010倍に増幅することができる。また、LAMP法は、最低4種類のプライマーを用いる核酸増幅法であるため、2種類のプライマーを用いるPCR法と比較して特異性が極めて高い。また、LAMP法は、等温(約63℃)での遺伝子増幅が可能であることから、従来の機器と比べると小型で安価な反応装置で実施することができる。 The LAMP method has higher amplification efficiency than the PCR method, which is the same gene amplification technique, and can amplify nucleic acid 10 9 to 10 times in 15 minutes to 1 hour. Further, since the LAMP method is a nucleic acid amplification method using at least four kinds of primers, the specificity is extremely high as compared with the PCR method using two kinds of primers. In addition, since the LAMP method can amplify genes at an isothermal temperature (about 63 ° C.), it can be carried out with a reaction device that is smaller and cheaper than conventional equipment.
LAMP法では、2本鎖の鋳型核酸の塩基配列に6つの領域を規定し、これらの領域の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。より具体的には、鋳型核酸の一方の鎖の3’末端側から順にF3c、F2c、F1cという領域と、同一鎖の5’末端側から順にB3、B2、B1という領域をそれぞれ規定する。そして、これらの領域の塩基配列に基づいて、FIP、F3、BIP、B3と呼ばれる4種類のプライマーを設計する。 In the LAMP method, six regions are defined in the base sequence of the double-stranded template nucleic acid, and a primer is designed based on the base sequence of these regions. More specifically, the regions F3c, F2c, and F1c are defined in order from the 3'end side of one strand of the template nucleic acid, and the regions B3, B2, and B1 are defined in order from the 5'end side of the same strand. Then, four types of primers called FIP, F3, BIP, and B3 are designed based on the base sequences of these regions.
FIPは、F2c領域と相補的な塩基配列であるF2領域の塩基配列を3’末端側に持ち、5’末端側にF1c領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。F3は、F3c領域と相補的な塩基配列であるF3領域の塩基配列を持つように設計する。BIPは、B2領域の塩基配列を3’末端側に持ち、5’末端側にB1領域と相補的な塩基配列であるB1c領域の塩基配列を持つように設計する。B3は、B3領域の塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーは、設計支援ソフト(http://primerexplorer.jp/)等を利用して適宜設計することができる。 FIP is designed to have the base sequence of the F2 region, which is a base sequence complementary to the F2c region, on the 3'end side and the same base sequence as the base sequence of the F1c region on the 5'end side. F3 is designed to have a base sequence of the F3 region, which is a base sequence complementary to the F3c region. The BIP is designed to have the base sequence of the B2 region on the 3'end side and the base sequence of the B1c region, which is a base sequence complementary to the B1 region, on the 5'end side. B3 is designed to have the base sequence of the B3 region. These primers can be appropriately designed by using design support software (http://primerexplorer.jp/) or the like.
LAMP法においては、上記のFIP、F3、BIP、B3の4種類のプライマーに加えて、LF、LBと呼ばれるプライマー(ループプライマー)を用いることができる。ループプライマーは、ダンベル構造の5’末端側にあるループの1本鎖部分(LF:F1領域とF2領域の間の塩基配列、LB:B1領域とB2領域の間の塩基配列)に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、LAMP法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。LF、LBも、上述した設計支援ソフト等を利用して設計することができる。 In the LAMP method, in addition to the above-mentioned four types of primers of FIP, F3, BIP and B3, primers (loop primers) called LF and LB can be used. The loop primer is complementary to the single-stranded portion of the loop on the 5'end side of the dumbbell structure (LF: base sequence between F1 and F2 regions, LB: base sequence between B1 and B2 regions). Design to have a base sequence. By additionally using these primers, the starting point of nucleic acid synthesis in nucleic acid amplification by the LAMP method is increased, and it is possible to shorten the reaction time and increase the detection sensitivity. LF and LB can also be designed by using the above-mentioned design support software and the like.
[プライマーセット]
1実施形態において、本発明は、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号2に記載の塩基配列、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号7に記載の塩基配列、又は配列番号7に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセットを提供する。
[Primer set]
In one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. One or more bases have been deleted, substituted or added in a primer consisting of a base sequence in which a base has been deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2. In the primer consisting of a base sequence, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5. A primer consisting of the base sequence described or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 7 A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the described base sequence, and one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which the base of the above is deleted, substituted or added, and which amplifies the Parecovirus RNA.
また、1実施形態において、本発明は、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号6に記載の塩基配列、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号8に記載の塩基配列、又は配列番号8に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセットを提供する。 Further, in one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A primer consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in which one or more bases are deleted, substituted or added. Primer consisting of the base sequence obtained, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of the base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A primer consisting of the base sequence set forth in 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in 8, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, or 1 or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which a plurality of bases are deleted, substituted or added, and which amplifies Parecovirus RNA.
また、1実施形態において、本発明は、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号10に記載の塩基配列、又は配列番号10に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号11に記載の塩基配列、又は配列番号11に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号12に記載の塩基配列、又は配列番号12に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセットを提供する。 Further, in one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. A primer consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 in which one or more bases are deleted, substituted or added. Primer consisting of the base sequence obtained, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of the base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A primer consisting of the base sequence set forth in 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in 12 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 1 or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which a plurality of bases are deleted, substituted or added, and which amplifies Parecovirus RNA.
実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットは、パレコウイルスをLAMP法で検出するために好適に用いることができる。 As will be described later in Examples, the primer set of this embodiment can be suitably used for detecting parechovirus by the LAMP method.
パレコウイルス(HPeV)は、19種類の遺伝子型が存在し、パレコウイルス1型(HPeV1)、パレコウイルス2型(HPeV2)及びパレコウイルス3型(HPeV3)などが存在する。なかでも、HPeV3は、生後1ヶ月前後の乳児ではしばしば敗血症様症状・脳炎などを呈するため重要である。 There are 19 types of genotypes of Parechovirus (HPeV), including Parechovirus type 1 (HPeV1), Parechovirus type 2 (HPeV2), and Parechovirus type 3 (HPeV3). Among them, HPeV3 is important because infants around 1 month old often exhibit sepsis-like symptoms and encephalitis.
本実施形態のプライマーセットの開発は困難であり、多数のプライマーセットを作製し、パレコウイルスの検出試験を積み重ねた結果得られたものである。パレコウイルス検出用プライマーの設計には、LAMP法用のプライマー設計支援ソフトを用いたが、翻訳領域の塩基配列を基にプライマーセットを設計しても、実用に耐えるプライマーセットは得られなかった。そこで、5’側非翻訳領域(5’untranslated region;5’UTR領域)の塩基配列に着目し、5’UTR領域の塩基配列を基にプライマーセットを網羅的に設計した。候補となったプライマーセットのうち、予備的検討で実用に耐えうるものの選択を行い、パレコウイルスを実用的に検出可能な本実施形態のプライマーセットが得られたものである。 Development of the primer set of this embodiment is difficult, and it was obtained as a result of preparing a large number of primer sets and accumulating detection tests for parechovirus. The primer design support software for the LAMP method was used to design the primer for detecting Parechovirus, but even if the primer set was designed based on the base sequence of the translation region, a primer set that could withstand practical use could not be obtained. .. Therefore, we focused on the base sequence of the 5'untranslated region (5'UTR region) and comprehensively designed the primer set based on the base sequence of the 5'UTR region. From the candidate primer sets, those that can withstand practical use were selected in a preliminary study, and the primer set of the present embodiment capable of practically detecting parechovirus was obtained.
また、本実施形態のプライマーセットを用いて、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス等のパレコウイルス以外のウイルスの検出を試みた結果、本実施形態のプライマーセットは交差反応を示さないことが確認された。 Further, as a result of trying to detect viruses other than parechovirus such as adenovirus, coxsackievirus, echovirus, enterovirus, and norovirus using the primer set of the present embodiment, the primer set of the present embodiment does not show a cross-reaction. It was confirmed that.
また、臨床検体を用いて、従来法であるPCR法と、本実施形態のプライマーセットを用いたLAMP法により、パレコウイルスを検出した結果、両者の結果は完全に一致することが確認された。 In addition, as a result of detecting parechovirus by the conventional PCR method using clinical specimens and the LAMP method using the primer set of the present embodiment, it was confirmed that the results of both were completely in agreement. ..
したがって、本実施形態のプライマーセットを用いたLAMP法により、パレコウイルスを実用的に迅速に検出することができる。 Therefore, the parechovirus can be detected practically and rapidly by the LAMP method using the primer set of the present embodiment.
本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号1、2、4、5、7及び9に記載の塩基配列からなるプライマーは、HPeVのRNAを増幅することができる。また、本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号1、3、4、6、8及び9に記載の塩基配列からなるプライマーは、HPeVのRNAを増幅することができる。また、配列番号10、11、4、5、12及び9に記載の塩基配列からなるプライマーは、HPeVのRNAを増幅することができる。HPeV3の5’UTR領域の塩基配列を配列番号10に示す。 In the primer set of this embodiment, the primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 and 9 can amplify the RNA of HPeV. Further, in the primer set of the present embodiment, the primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 8 and 9 can amplify the RNA of HPeV. In addition, the primer consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, 4, 5, 12 and 9 can amplify the RNA of HPeV. The base sequence of the 5'UTR region of HPeV3 is shown in SEQ ID NO: 10.
HPeVは、前述のように19種類存在し、HPeV3以外にHPeV1も存在する。実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットを用いることにより、HPeV3の他にHPeV1も検出することができる。HPeV1はHPeV感染の中で最も頻度が多いとされているため、HPeV3の他、HPeV1も検出できることは、HPeV3のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。 As described above, there are 19 types of HPeV, and HPeV1 also exists in addition to HPeV3. As will be described later in the examples, HPeV1 can be detected in addition to HPeV3 by using the primer set of this embodiment. Since HPeV1 is considered to be the most frequent HPeV infection, the ability to detect HPeV1 in addition to HPeV3 is advantageous in terms of clinical needs over those that can detect only HPeV3.
配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号10に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したF3プライマーに対応する。また、配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したFIPプライマーに対応する。また、配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したBIPプライマーに対応する。また、配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したB3プライマーに対応する。また、配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したLFプライマーに対応する。また、配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したLBプライマーに対応する。 The primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 correspond to the above-mentioned F3 primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 correspond to the above-mentioned FIP primer. Further, the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponds to the above-mentioned BIP primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 correspond to the above-mentioned B3 primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 correspond to the above-mentioned LF primer. Further, the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 corresponds to the above-mentioned LB primer.
本実施形態のプライマーセットは、配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 The primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and the primer set forth in SEQ ID NO: 5. It may contain a primer consisting of a base sequence, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号1に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 Further, the primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6. It may contain a primer having the base sequence shown, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号10に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 Further, the primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5. It may contain a primer having the base sequence shown, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
本実施形態のプライマーセットは、プライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、LAMP法によるパレコウイルスの検出を行うことができる。したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号1~12に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。 The primer set of the present embodiment can detect parechovirus by the LAMP method even if the base sequence of the primer contains some mutations. Therefore, the primer set of the present embodiment may include a primer having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 12.
ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたLAMP法によってパレコウイルスRNAを増幅することができる限り特に限定されず、例えば2~4個であってもよく、例えば2~3個であってもよい。 Here, the plurality is not particularly limited as long as the parechovirus RNA can be amplified by the LAMP method using a primer set, and may be, for example, 2 to 4, for example, 2 to 3. You may.
[キット]
1実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、パレコウイルスをLAMP法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてLAMP法を行うことにより、試料中に存在するパレコウイルスを簡便に検出することができる。
[kit]
In one embodiment, the present invention provides a kit for detecting parechovirus by the LAMP method, which comprises the above-mentioned primer set. By performing the LAMP method using the kit of this embodiment, the parechovirus present in the sample can be easily detected.
本実施形態のキットは、上述したプライマーセットのほか、熱耐性逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質であるdNTP、陰性コントロール、陽性コントロール、DNA抽出試薬等を含んでいてもよい。 In addition to the primer set described above, the kit of the present embodiment may include a heat-resistant reverse transcriptase, a DNA polymerase, a buffer solution, a substrate dNTP, a negative control, a positive control, a DNA extraction reagent, and the like.
DNAポリメラーゼとしては鎖置換型DNAポリメラーゼを使用することができる。鎖置換型DNAポリメラーゼとは、鋳型DNAに相補的なDNA鎖を合成していく過程で、伸長方向に2本鎖領域があった場合に、その鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができるDNAポリメラーゼである。 As the DNA polymerase, a strand-substituted DNA polymerase can be used. The strand-replacement type DNA polymerase is to continue the complementary strand synthesis while dissociating the strand when there is a double-stranded region in the elongation direction in the process of synthesizing the DNA strand complementary to the template DNA. It is a DNA polymerase that can be used.
DNAポリメラーゼとしては、通常LAMP法で用いられているものを使用することができ、例えば、Bst DNAポリメラーゼ、Bca(Exo-)DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメント、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。 As the DNA polymerase, those usually used in the LAMP method can be used, for example, Bst DNA polymerase, Bca ( Exo- ) DNA polymerase, Klenow fragment of DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo). - ) DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase, KOD DNA polymerase and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.
[パレコウイルスの検出方法]
1実施形態において、本発明は、パレコウイルスの検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法を提供する。
[Parechovirus detection method]
In one embodiment, the present invention is a method for detecting a parechovirus, which comprises a step of mixing a biological sample with the above-mentioned primer set and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method, and the isothermal amplification reaction is detected after the step. Provided is a detection method indicating that the parechovirus was present in the biological sample.
上述したように、従来、パレコウイルスの検出はPCR法により行われてきた。しかしながら、PCR法は、操作が煩雑であり、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが困難である。 As described above, conventionally, the detection of parechovirus has been performed by the PCR method. However, the PCR method is complicated to operate and cannot be performed at any facility at present. In addition, it takes several days for the results to be known, which makes it difficult to use in clinical practice of newborns whose symptoms change on an hourly basis.
これに対し、本実施形態の検出方法によれば、従来法であるPCR法と比較して操作が簡便であるため、どこの施設でも使用可能であり、また、数時間で結果が出るため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが可能である。 On the other hand, according to the detection method of the present embodiment, since the operation is simpler than the conventional PCR method, it can be used at any facility, and the result is obtained in several hours. It can be used in the clinical setting of newborns whose symptoms change on an hourly basis.
この結果、患者がパレコウイルスに感染しているか否かを迅速に判断し、適切に治療を行うことが容易になる。 As a result, it becomes easy to quickly determine whether or not the patient is infected with the parechovirus and to appropriately treat the patient.
生体試料としては、血液、尿、便、羊水、臍帯血、膿、髄液これらの試料から抽出したRNA等が挙げられる。試料をそのままLAMP法に適用することもできるが、試料から抽出したRNAをLAMP法に適用することが好ましい。 Examples of biological samples include blood, urine, stool, amniotic fluid, umbilical cord blood, pus, cerebrospinal fluid, and RNA extracted from these samples. Although the sample can be applied to the LAMP method as it is, it is preferable to apply the RNA extracted from the sample to the LAMP method.
LAMP法による等温増幅反応は、生体試料に、上述したプライマーセット、熱耐性逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質であるdNTP等を混合し、DNA増幅温度でインキュベートすることにより実施することができる。DNA増幅温度は、使用するDNAポリメラーゼによって異なるが、約60~70℃である。 The isothermal amplification reaction by the LAMP method can be carried out by mixing the above-mentioned primer set, heat-resistant reverse transcriptase, DNA polymerase, buffer solution, dNTP which is a substrate, etc. with a biological sample and incubating at the DNA amplification temperature. can. The DNA amplification temperature varies depending on the DNA polymerase used, but is about 60 to 70 ° C.
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[実験例1]
(1)サンプル採取とPCR法によるパレコウイルスの検出
パレコウイルス感染症を疑った患者6人の便(試料)から採取した試料について、アウタープライマーとして、配列番号14に記載のフォワードプライマー及び配列番号15に記載のリバースプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号16に記載のフォワードプライマー及び配列番号17に記載のリバースセンスプライマーを用いたnested-PCR法を行い、検出されたパレコウイルスについて、さらに遺伝子型の判定のためにさらに、アウタープライマーとして、配列番号18に記載のフォワードプライマー及び配列番号19に記載のリバースセンスプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号18に記載のフォワードプライマー及び配列番号20に記載のリバースセンスプライマーを用いたnested-PCR法を行ったところ、6つの試料中4つの試料でHPeV3が検出された。
[Experimental Example 1]
(1) Sample collection and detection of Parecovirus by PCR method The forward primers and sequences shown in SEQ ID NO: 14 are used as outer primers for samples collected from the stools (samples) of 6 patients suspected of having Parecovirus infection. A nested-PCR method was performed using the reverse primer set forth in No. 15 and the forward primer set forth in SEQ ID NO: 16 and the reverse sense primer set forth in SEQ ID NO: 17 as nested primers. Further, for the determination of genotype, the forward primer set forth in SEQ ID NO: 18 and the reverse sense primer set forth in SEQ ID NO: 19 are used as outer primers, and the forward primer and SEQ ID NO: set forth in SEQ ID NO: 18 are used as nested primers. When the nested-PCR method using the reverse sense primer described in 20 was performed, HPeV3 was detected in 4 out of 6 samples.
(2)試料からのウイルスRNAの精製
(1)でHPeV3が検出された試料50~100μLを200μLの滅菌蒸留水で希釈し、5分間撹拌した。次に、4℃、15000回転で5分間遠心分離し、上清を、QIAmp Viral RNA Mini Kit(Qiagen社製)を用い、ウイルスRNAを抽出した。
(2) Purification of viral RNA from the sample 50 to 100 μL of the sample in which HPeV3 was detected in (1) was diluted with 200 μL of sterile distilled water and stirred for 5 minutes. Next, centrifugation was performed at 4 ° C. and 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was extracted with viral RNA using QIAmp Viral RNA Mini Kit (manufactured by Qiagen).
(3)LAMP法のためのプライマー設計
HPeV3のゲノム配列はNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のウェブサイトからダウンロードした。このゲノム配列を用いて、LAMP法のためのプライマーセットを作成した。その際、プライマーセットを設計する領域として、5’UTR領域に着目し、この領域を基にプライマーセットを設計した。プライマーの設計にはPrimerExplorer V5(栄研化学株式会社製)を利用した。配列番号13に記載の塩基配列からなるHPeV3の5’UTR領域は700塩基の長さがあるが、これを用いてPrimerExplorer V5によるプライマーの設計を試みたが、候補となる配列は作成できなかった。LAMP法に用いるプライマーセットはF2の外側からB2の外側までが120~160塩基、F2とF3の間が0~60塩基になるように設計するのが良いとされている。従って、全プライマー作成に必要な参照配列の塩基数は、F3が、最大160+60×2+約20塩基、B3プライマーが320塩基程度と考えた。
次に、5’UTR領域のうち1~400番目の塩基、11~410番目、21~420番目、…、201~600番目、…、301~700番目というように検索する配列を400塩基とし、5’UTR領域内でその場所を10塩基ずつずらしながら、5’UTR領域でLAMP法のプライマーセット候補となるFIP、BIP、F3、B3のプライマーセットを全て抽出した。抽出結果を表1に示す。
(3) Primer design for the LAMP method The genome sequence of HPeV3 was downloaded from the website of National Center for Biotechnology Information (NCBI). Using this genomic sequence, a primer set for the LAMP method was prepared. At that time, we focused on the 5'UTR region as a region for designing the primer set, and designed the primer set based on this region. PrimerExplorer V5 (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) was used for the design of the primer. The 5'UTR region of HPeV3 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 has a length of 700 bases, and an attempt was made to design a primer by PrimerExplorer V5 using this, but a candidate sequence could not be created. .. It is said that the primer set used in the LAMP method should be designed so that the range from the outside of F2 to the outside of B2 is 120 to 160 bases, and the range between F2 and F3 is 0 to 60 bases. Therefore, the number of bases in the reference sequence required to prepare all the primers was considered to be 160 + 60 × 2 + about 20 bases at the maximum for F3 and about 320 bases for the B3 primer.
Next, the sequence to be searched for in the 5'UTR region, such as the 1st to 400th bases, the 11th to 410th bases, the 21st to 420th bases, ..., the 201st to 600th bases, ..., and the 301st to 700th bases, is set to 400 bases. While shifting the location by 10 bases in the 5'UTR region, all the primer sets of FIP, BIP, F3, and B3, which are candidates for the primer set of the LAMP method, were extracted in the 5'UTR region. The extraction results are shown in Table 1.
(4)LAMP法によるパレコウイルスの検出
(3)で抽出されたプライマーセットは、P-a、P-b、P-c、P-d、P-e、P1、P2、P3の8種類存在した。このうち、最も高頻に抽出されたプライマーセットは、表2に示したP1、P2及びP3の3つで、合計12回候補として抽出された。一方、残りの5つのプライマーセットは、P-aが2回候補として、その他のP-b、P-c、P-d、P-eの4つが1回のみ、抽出された。そこで、最も高頻度に抽出されたプライマーセット(P1、P2、およびP3)を用いて、水のみを含む試料(蒸留水)と、HPeV3のウイルスRNAが含まれている試料において、LAMP法により増幅を行い、増幅の有無を確認した。
(4) Detection of Parechovirus by LAMP method There are eight types of primer sets extracted in (3): P-a, P-b, P-c, P-d, P-e, P1, P2, and P3. Were present. Of these, the most frequently extracted primer sets were P1, P2, and P3 shown in Table 2, which were extracted as candidates 12 times in total. On the other hand, in the remaining five primer sets, P-a was extracted twice as a candidate, and the other four P-b, P-c, P-d, and P-e were extracted only once. Therefore, using the primer sets (P1, P2, and P3) extracted most frequently, the sample containing only water (distilled water) and the sample containing HPeV3 virus RNA were amplified by the LAMP method. Was performed, and the presence or absence of amplification was confirmed.
LAMP法による増幅は、Loopamp RNA Amplification Kit(栄研化学株式会社製)を用いて行なった。具体的には、PCR用チューブに、(2)で調製したウイルスRNA5μL、熱耐性逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、緩衝液、dNTPs、プライマーセットを混合して撹拌し、スピンダウンを行なったのちに、63℃で1時間反応させた。その後、80℃、5分間加熱することによりで酵素を失活させた。増幅産物は蛍光色素によって可視化した。 Amplification by the LAMP method was performed using a Loopamp RNA Amplification Kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). Specifically, 5 μL of the virus RNA prepared in (2), heat-resistant reverse transcriptase, DNA polymerase, buffer solution, dNTPs, and primer set were mixed in a PCR tube, stirred, and then spun down. The reaction was carried out at 63 ° C. for 1 hour. Then, the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 5 minutes. The amplification product was visualized with a fluorescent dye.
プライマーセットP1、P2又はP3を用いるLAMP法では、蒸留水を試料として用いた場合は、いずれも増幅が確認されなかった。一方、また、PCR法でHPeV3が検出された試料においては、HPeV3のウイルスRNAが含まれている試料においては、P1では、18回試行して6回陽性、P2では、18回試行して8回陽性、P3では、7回試行して6回陽性となり、P1、P2及びP3を用いるLAMP法では、増幅が確認される場合とされない場合とがあり、再現性が得られなかった。 In the LAMP method using the primer sets P1, P2 or P3, no amplification was confirmed when distilled water was used as a sample. On the other hand, in the sample in which HPeV3 was detected by the PCR method, in the sample containing the viral RNA of HPeV3, P1 was tried 18 times and positive 6 times, and P2 was tried 18 times and 8 times. In the case of positive times and P3, 7 trials were made and 6 times positive, and in the LAMP method using P1, P2 and P3, amplification may or may not be confirmed, and reproducibility could not be obtained.
[実験例2]
(HPeV3検出用プライマーの検討)
実験例1で用いたプライマーセットP1、P2及びP3のF3、FIP、BIP、B3に加えて、LF及びLBを含む、表3に記載のプライマーセットP4、P5及びP6を設計した。このうち、P4は、PrimerExplorer V5(栄研化学株式会社製)を利用して設計したが、P5とP6は、PrimerExplorer V5では設計できなかったため、手作業にて設計した。このプライマーセットP4、P5及びP6をそれぞれ用い、実験例1と同様の条件で、LAMP法を行った。
[Experimental Example 2]
(Examination of primer for HPeV3 detection)
The primer sets P4, P5 and P6 shown in Table 3, which include LF and LB in addition to the primer sets P1, P2 and P3 F3, FIP, BIP and B3 used in Experimental Example 1, were designed. Of these, P4 was designed using PrimerExplorer V5 (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), but P5 and P6 were designed manually because they could not be designed with PrimerExplorer V5. Using these primer sets P4, P5 and P6, respectively, the LAMP method was performed under the same conditions as in Experimental Example 1.
図1に、プライマーセットP4、P5及びP6を用いた増幅結果を示す。図1に示したように、蒸留水を試料として用いた場合は、実験例1と同様にいずれも増幅が確認されなかったが、HPeV3のウイルスRNAが含まれている試料においては、P4では、19回試行して19回陽性、P5では、19回試行して19回陽性、P6では、8回試行して、8回陽性と、再現性よく増幅が確認された。 FIG. 1 shows the amplification results using the primer sets P4, P5 and P6. As shown in FIG. 1, when distilled water was used as a sample, amplification was not confirmed in any of the samples as in Experimental Example 1, but in the sample containing the virus RNA of HPeV3, in P4, Amplification was confirmed with good reproducibility, with 19 trials and 19 positives, 19 trials and 19 positives for P5, and 8 trials and 8 positives for P6.
[実験例3]
(RT-LAMP法の至適条件の検討)
実験例2で見出したパレコウイルス検出用プライマーセットP4、P5及びP6について、LAMP法の測定条件を変更し、至適なLAMP法の測定条件の検討を行なった。
(1)至適反応温度の確認
LAMP法の反応を63℃以外に、59℃、61℃、65℃、67℃の4つの温度条件で行なった。その結果、59℃と67℃では増幅が確認できず、61℃、65℃で増幅が確認できた。従って、至適な反応温度は63℃であることを確認した。
[Experimental Example 3]
(Examination of optimal conditions for RT-LAMP method)
For the primer sets P4, P5 and P6 for detecting Parechovirus found in Experimental Example 2, the measurement conditions of the LAMP method were changed, and the optimum measurement conditions of the LAMP method were examined.
(1) Confirmation of optimum reaction temperature The reaction of the LAMP method was carried out under four temperature conditions of 59 ° C, 61 ° C, 65 ° C and 67 ° C in addition to 63 ° C. As a result, amplification could not be confirmed at 59 ° C and 67 ° C, but amplification was confirmed at 61 ° C and 65 ° C. Therefore, it was confirmed that the optimum reaction temperature was 63 ° C.
(2)反応時間と、試料のウイルスRNA量の関係
試料のウイルスRNA量を118ng、11.8ng、1.18ng、0.118ngに調整し、反応時間を20分、30分、40分、50分、60分に設定してLAMP法を行なった。結果を表4に示す。その結果、プライマーセットP4及びP5ではどのRNA量でも20分から陽性が目視できるようになった。また、反応時間30分では、P4、P5及びP6の全てのプライマーセットで、どのRNA量でも陽性が確認できた。このことから、P4、P5及びP6を用いるLAMP法では、ウイルスRNA量は118pgまでは増幅可能であることを確認し、また、最短反応時間は30分であることを確認した。
(2) Relationship between reaction time and amount of virus RNA in the sample The amount of virus RNA in the sample was adjusted to 118 ng, 11.8 ng, 1.18 ng, 0.118 ng, and the reaction time was 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes. The LAMP method was performed by setting the minutes and 60 minutes. The results are shown in Table 4. As a result, in the primer sets P4 and P5, positive results could be visually observed from 20 minutes regardless of the amount of RNA. In addition, when the reaction time was 30 minutes, positive results were confirmed for all RNA amounts in all the primer sets of P4, P5 and P6. From this, it was confirmed that the amount of viral RNA could be amplified up to 118 pg by the LAMP method using P4, P5 and P6, and the shortest reaction time was 30 minutes.
一方、通常のPCR法では、測定可能な試料のゲノム量は5~200ng程度と言われている。このことからも、本発明のプライマーセットを用いるLAMP法は、通常のPCR法と同等以上の検出感度を持っていることが判明した。
更に、HPeV3のウイルスRNAが含まれている試料を用いて、32.0~58.8ngの範囲でウイルスRNAを持ち込み、通常のPCR法を行なった。PCR法は、検出感度は反応のサイクル数に依存するため、40サイクルの高感度法で行なった。そのPCR産物の電気泳動結果を図2に示す。図2で示したように、PCR産物は電気泳動でかろうじて目視でき、検出感度の下限域であった。従って、本発明のプライマーセットを用いるLAMP法は、通常のPCR法と比較しても十分感度が良いことが実証された。
On the other hand, in the usual PCR method, it is said that the amount of the genome of the measurable sample is about 5 to 200 ng. From this, it was found that the LAMP method using the primer set of the present invention has a detection sensitivity equal to or higher than that of the usual PCR method.
Furthermore, using a sample containing the viral RNA of HPeV3, the viral RNA was brought in in the range of 32.0 to 58.8 ng, and the usual PCR method was performed. Since the detection sensitivity depends on the number of reaction cycles, the PCR method was performed by a high-sensitivity method of 40 cycles. The electrophoresis result of the PCR product is shown in FIG. As shown in FIG. 2, the PCR product was barely visible by electrophoresis and was in the lower limit of detection sensitivity. Therefore, it was demonstrated that the LAMP method using the primer set of the present invention has sufficiently high sensitivity as compared with the usual PCR method.
[実験例4]
(パレコウイルス検出用プライマーの交差反応の検討)
Basic Local Alignment Search Tool(blast)を用いて、プライマーセットP4、P5及びP6と各種ウイルスのホモロジー検索をin silicoで検討した。その結果、実験例2で見出したパレコウイルス検出用プライマーは、HPeV3以外にHPeV1、HPeV4、HPeV8、HPeV14及びHPeV18に交差反応性を持つ可能性が明らかになった。一方、非パレコウイルス属には交差反応性を認めなかった。このことを確認するために、実験例2で見出したプライマーセットP4、P5、P6の各プライマーセットを用いたLAMP法により、パレコウイルス以外のウイルスのRNA、及びHPeV3以外のパレコウイルスが増幅されるか否かを検討した。
[Experimental Example 4]
(Examination of cross-reactivity of primers for detecting parechovirus)
Primer sets P4, P5 and P6 and various virus homology searches were examined in silico using the Basic Local Alignment Search Tool (blast). As a result, it was clarified that the primer for detecting Parechovirus found in Experimental Example 2 may have cross-reactivity with HPeV1, HPeV4, HPeV8, HPeV14 and HPeV18 in addition to HPeV3. On the other hand, no cross-reactivity was observed in the non-parechovirus genus. In order to confirm this, RNA of viruses other than Parechovirus and Parechovirus other than HPeV3 are amplified by the LAMP method using each of the primer sets P4, P5, and P6 found in Experimental Example 2. I examined whether or not it would be done.
まず、アデノウイルス、コクサッキーウイルスB5、エコーウイルス11、エンテロウイルスD68、エンテロウイルスA71、HPeV1及びHPeV3(2株)の各細胞株、及びアデノウイルス感染患者の便1検体とノロウイルス感染患者の便3検体を用いて、実験例1と同様の方法により、プライマーセットP4、P5、P6の各プライマーセットを用いるLAMP法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。 First, using adenovirus, coxsackievirus B5, echovirus 11, enterovirus D68, enterovirus A71, HPeV1 and HPeV3 (2 strains) cell lines, and 1 stool sample from adenovirus-infected patients and 3 stool samples from norovirus-infected patients. By the same method as in Experimental Example 1, amplification was performed by the LAMP method using each of the primer sets P4, P5, and P6, and the presence or absence of amplification was confirmed.
また、上記の各検体について、PCR法を用いたエンテロウイルス遺伝子検査、アデノウイルス遺伝子検査及びパレコウイルス遺伝子検査により、増幅の有無を確認した。その結果を図3及び表5に示す。なお、図3はプライマーセットP6用いて増幅した結果を示す。 In addition, the presence or absence of amplification was confirmed for each of the above samples by enterovirus genetic test, adenovirus genetic test, and parechovirus genetic test using the PCR method. The results are shown in FIGS. 3 and 5. Note that FIG. 3 shows the results of amplification using the primer set P6.
その結果、表5及び図3に示したように、プライマーセットP4、P5、P6のいずれも、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス及びノロウイルスのRNAを増幅せず、交差反応しないことが明らかとなった。また、プライマーセットP4、P5、P6のいずれも、HPeV3の他、HPeV1のRNAを増幅することが明らかとなった。この結果から、これらのプライマーセットにより、特異的にパレコウイルスを検出できることが確認された。なお、プライマーセットP4、P5、P6はいずれも、HPeV3の他にHPeV1にも反応性を示し、パレコウイルスの型別判定はできなかったが、HPeV1はHPeV感染の中で最も頻度が多いとされているため、HPeV3の他、HPeV1も検出できることは、HPeV3のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。 As a result, as shown in Table 5 and FIG. 3, it is clear that none of the primer sets P4, P5, and P6 amplifies the RNAs of adenovirus, coxsackievirus, echovirus, enterovirus, and norovirus, and does not cross-react. became. In addition, it was revealed that all of the primer sets P4, P5, and P6 amplify RNA of HPeV1 in addition to HPeV3. From this result, it was confirmed that the parechovirus can be specifically detected by these primer sets. The primer sets P4, P5, and P6 all showed reactivity with HPeV1 in addition to HPeV3, and the type of parechovirus could not be determined, but HPeV1 was the most frequent among HPeV infections. Therefore, the fact that HPeV1 can be detected in addition to HPeV3 is advantageous in terms of clinical needs over those that can detect only HPeV3.
また、プライマーセットP4、P5及びP6で増幅が確認されたHPeV1及びHPeV3の各検体は、PCR法によるパレコウイルス遺伝子検査でも増幅が確認された。プライマーセットP4、P5及びP6を用いた、本発明のLAMP法による簡便なパレコウイルスの検出の結果が、PCR法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致することは、本発明の検出方法が、信頼性が高いことを示している。 In addition, each sample of HPeV1 and HPeV3 whose amplification was confirmed by the primer sets P4, P5 and P6 was also confirmed to be amplified by the Parechovirus genetic test by the PCR method. It is the present invention that the result of the simple detection of parechovirus by the LAMP method of the present invention using the primer sets P4, P5 and P6 completely matches the result of the detection of the parechovirus using the PCR method. The detection method of is highly reliable.
[実験例5]
(患者検体を用いたLAMP法によるパレコウイルスの検出)
HPeV感染を疑わせる患者6名(患者A、患者B、患者C、患者D、患者E、患者F)から、糞便を採取し、実験例1と同様の方法でウイルスRNAを抽出した。この検体を用いてプライマーセットP4、P5及びP6を用いるLAMP法でパレコウイルスの検出を行った。その結果を図4に示す。
図4に示したように、プライマーセットP4、P5、P6のいずれにおいても、患者C、患者D、患者E及び患者Fの4人の検体で陽性となった。一方、2つの検体(患者A及び患者B)では陰性であった。
同様にこれらの検体を実験例1に示したnested-PCR法によって確認したところ、LAMP法で陽性になった患者はすべてHPeV3感染症患者であることが確認され、一方、LAMP法で陰性であった検体はPCR法によりHPeV3が検出されなかった。なお、LAMP法の結果は、糞便を採取してから2時間で判明したが、上記のPCR法では、結果判明に2日間を要した。
以上の結果から、プライマーセットP4、P5及びP6を用いる本発明のLAMP法による簡便なパレコウイルスの検出の結果は、PCR法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致しており、本発明のパレコウイルスの検出方法は、信頼性が高くかつ、臨床的にも有用であることを示している。
[Experimental Example 5]
(Detection of parechovirus by LAMP method using patient sample)
Feces were collected from 6 patients (patient A, patient B, patient C, patient D, patient E, patient F) suspected of having HPeV infection, and viral RNA was extracted by the same method as in Experimental Example 1. Using this sample, Parechovirus was detected by the LAMP method using primer sets P4, P5 and P6. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 4, all of the primer sets P4, P5, and P6 were positive in the four specimens of patient C, patient D, patient E, and patient F. On the other hand, two specimens (patient A and patient B) were negative.
Similarly, when these samples were confirmed by the nested-PCR method shown in Experimental Example 1, it was confirmed that all the patients who were positive by the LAMP method were HPeV3 infectious disease patients, while they were negative by the LAMP method. HPeV3 was not detected in the sample by the PCR method. The result of the LAMP method was found 2 hours after the stool was collected, but it took 2 days to find the result by the above PCR method.
From the above results, the result of simple detection of parechovirus by the LAMP method of the present invention using the primer sets P4, P5 and P6 is completely in agreement with the result of the detection of parechovirus using the PCR method. The method for detecting parechovirus of the present invention has been shown to be highly reliable and clinically useful.
本発明によれば、パレコウイルスを迅速かつ簡便に検出する技術を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a technique for quickly and easily detecting a parechovirus.
Claims (8)
配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号2に記載の塩基配列、又は配列番号2に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号7に記載の塩基配列、又は配列番号7に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting parechovirus by the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
配列番号2に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号7に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項1に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to claim 1.
配列番号1に記載の塩基配列、又は配列番号1に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号3に記載の塩基配列、又は配列番号3に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号6に記載の塩基配列、又は配列番号6に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号8に記載の塩基配列、又は配列番号8に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting Parechovirus by the LAMP method,
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
配列番号3に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号6に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号8に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項3に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
3. The primer set according to claim 3.
配列番号10に記載の塩基配列、又は配列番号10に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号11に記載の塩基配列、又は配列番号11に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列、又は配列番号4に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列、又は配列番号5に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列、又は配列番号12に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列、又は配列番号9に記載の塩基配列において1又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスRNAを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting Parechovirus by the LAMP method,
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
配列番号11に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号4に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号5に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号12に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号9に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項5に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
5. The primer set according to claim 5.
生体試料に請求項1~6のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してLAMP法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。 Parechovirus detection method
A step of mixing a biological sample with the primer set according to any one of claims 1 to 6 and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method is included.
A detection method in which the detection of an isothermal amplification reaction after the step indicates that the parechovirus was present in the biological sample.
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