JP2022014809A - Parechovirus detection primer set and uses thereof - Google Patents

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忠史 横山
Tadashi Yokoyama
優子 田崎
Yuko Tazaki
なつみ 井上
Natsumi INOUE
直俊 杉本
Naotoshi Sugimoto
泰三 和田
Taizo Wada
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Kanazawa University NUC
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Abstract

To provide techniques to easily detect parechovirus.SOLUTION: Provided is a primer set for detecting parechovirus by the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method. Provided is a primer set that contains primers consisting of a specific base sequence or a mutant sequence thereof and amplifies parechovirus RNA. Provided is a kit for detecting parechovirus by the LAMP method, comprising a primer set. Provided is a detection method comprising mixing a primer set and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method, the detection of the isothermal amplification reaction after the step indicating that the parechovirus has been present in a biological sample.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、パレコウイルス検出用プライマーセット及びその使用に関する。より具体的には、パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセット、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット及びパレコウイルスの検出方法に関する。 The present invention relates to a primer set for detecting parechovirus and its use. More specifically, the present invention relates to a primer set for detecting Parechovirus by the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method, a kit for detecting Parechovirus by the LAMP method, and a method for detecting Parechovirus.

パレコウイルス（ＨＰｅＶ）は、主として小児に感染し上気道炎や胃腸炎などを引き起こす、いわゆる“感冒”の原因ウイルスである。ＨＰｅＶのうち特に３型（ＨＰｅＶ３）では、成人や多くの小児では無症状もしくは軽微な胃腸炎で経過するが、ＨＰｅＶ３は、生後１ヶ月前後の乳児に感染すると、しばしば敗血症様症状・脳炎などを呈し、重症化する。 Parechovirus (HPeV) is a so-called "cold" virus that mainly infects children and causes upper respiratory tract inflammation and gastroenteritis. Among HPeV, type 3 (HPeV3), especially in adults and many children, progresses with asymptomatic or mild gastroenteritis, but when infected with infants around 1 month old, HPeV3 often causes sepsis-like symptoms and encephalitis. It presents and becomes severe.

パレコウイルスの検出方法としては、ＰＣＲ法を用いる検出方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、ＰＣＲ法は、結果が判明するまでに最短でも１６～２４時間、通常は２～３日かかる。 As a detection method for parechovirus, a detection method using a PCR method is known (Non-Patent Document 1). However, the PCR method takes a minimum of 16 to 24 hours, usually 2 to 3 days, before the results are known.

ＬＡＭＰ法は、４～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である（例えば、特許文献１を参照）。ＬＡＭＰ法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、ＰＣＲ法と比較して迅速に測定することができ、４つ以上のプライマーを設定することから特異性も高い。 The LAMP method is a gene amplification method that amplifies a target gene by an isothermal reaction using 4 to 6 types of primers and detects the presence of the target gene by the turbidity of the reaction solution (see, for example, Patent Document 1). .. Since the LAMP method is an isothermal reaction, it can be carried out with a simple device, and it can be measured more rapidly than the PCR method, and it has high specificity because four or more primers are set. ..

ＬＡＭＰ法が成功するか否かは、プライマーの設計による。プライマー設計においては、プライマー間距離、各プライマー領域のＴｍ値、各プライマー領域の末端安定性、ＧＣ含量、二次構造等が重要であり、これを設計するための設計支援ソフトも存在するものの、ソフトで設計したプライマーが高効率且つ高特異的に標的核酸を増幅するとは限らない。特に、ＬＡＭＰ法をウイルスの検出等に用いる場合には、まず最適な標的配列を特定し、その配列を特異的に増幅できるプライマーを作製しなければならない。
これまで、パレコウイルスを特異的にＬＡＭＰ法で検出するための標的配列及びプライマーは見出されていなかった。 The success of the LAMP method depends on the primer design. In primer design, the distance between primers, the Tm value of each primer region, the terminal stability of each primer region, the GC content, the secondary structure, etc. are important, and although there is design support software for designing these, Softly designed primers do not always amplify the target nucleic acid with high efficiency and high specificity. In particular, when the LAMP method is used for virus detection or the like, it is necessary to first identify the optimum target sequence and prepare a primer capable of specifically amplifying the sequence.
So far, no target sequence and primer for specifically detecting parechovirus by the LAMP method have been found.

国際公開第２０００／０２８０８２号International Publication No. 2000/028082

Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３４４６－３４５３，２００８J. Clin. Microbiol. 46: 3446-3453,2008

従来、パレコウイルスの検出はＰＣＲ法により行われてきた。しかしながら、ＰＣＲ法は、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において、このタイムラグは大きな問題である。 Conventionally, detection of parechovirus has been performed by the PCR method. However, the PCR method is currently not available at any facility. In addition, since it takes several days for the results to be known, this time lag is a big problem in the clinical practice of newborns whose symptoms change on an hourly basis.

このような背景のもと、本発明は、パレコウイルスを、ＬＡＭＰ法を用いて簡便に検出する技術を提供することを目的とする。 Against this background, it is an object of the present invention to provide a technique for easily detecting a parechovirus using the LAMP method.

本発明は以下の通りである。
［１］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［２］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［１］に記載のプライマーセット。
［３］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［４］ 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［３］に記載のプライマーセット。
［５］ パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。
［６］ 配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、［５］に記載のプライマーセット。
［７］ ［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。
［８］ パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に［１］～［６］のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。 The present invention is as follows.
[1] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[2] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [1].
[3] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[4] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [3].
[5] A primer set for detecting parechovirus by the LAMP method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA.
[6] A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to [5].
[7] A kit for detecting parechovirus by the LAMP method, which comprises the primer set according to any one of [1] to [6].
[8] A method for detecting parechovirus.
A step of mixing a biological sample with the primer set according to any one of [1] to [6] and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method is included.
A detection method in which the detection of an isothermal amplification reaction after the step indicates that the parechovirus was present in the biological sample.

本発明によれば、パレコウイルスを簡便に検出する技術を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a technique for easily detecting a parechovirus.

実験例１における、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法で、試料のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。It is a photograph showing the result of amplifying the RNA of a sample by the LAMP method using each primer set of P4, P5, and P6 in Experimental Example 1. 実験例３における、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡをＰＣＲ法で増幅した結果を示す写真である。It is a photograph which shows the result of having amplified the virus RNA of HPeV3 by the PCR method in Experimental Example 3. 実験例４における、プライマーセットＰ６を用いるＬＡＭＰ法で、各ウイルス検体又は細胞株のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。It is a photograph showing the result of amplifying RNA of each virus sample or cell line by the LAMP method using the primer set P6 in Experimental Example 4. 実験例５における、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法で、患者検体のＲＮＡを増幅した結果を示す写真である。It is a photograph showing the result of amplifying RNA of a patient sample by the LAMP method using each primer set of P4, P5, and P6 in Experimental Example 5.

上述したように、ＬＡＭＰ法は、４～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応溶液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である。 As described above, the LAMP method is a gene amplification method in which the target gene is amplified by an isothermal reaction using 4 to 6 types of primers, and the presence of the target gene is detected by the turbidity of the reaction solution.

ＬＡＭＰ法は、同じ遺伝子増幅技術であるＰＣＲ法に比べて増幅効率が高く、核酸を１５分～１時間で１０９～１０１０倍に増幅することができる。また、ＬＡＭＰ法は、最低４種類のプライマーを用いる核酸増幅法であるため、２種類のプライマーを用いるＰＣＲ法と比較して特異性が極めて高い。また、ＬＡＭＰ法は、等温（約６３℃）での遺伝子増幅が可能であることから、従来の機器と比べると小型で安価な反応装置で実施することができる。 The LAMP method has higher amplification efficiency than the PCR method, which is the same gene amplification technique, and can amplify nucleic acid 10 9 to 10 times in 15 minutes to 1 hour. Further, since the LAMP method is a nucleic acid amplification method using at least four kinds of primers, the specificity is extremely high as compared with the PCR method using two kinds of primers. In addition, since the LAMP method can amplify genes at an isothermal temperature (about 63 ° C.), it can be carried out with a reaction device that is smaller and cheaper than conventional equipment.

ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型核酸の塩基配列に６つの領域を規定し、これらの領域の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。より具体的には、鋳型核酸の一方の鎖の３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、同一鎖の５’末端側から順にＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域をそれぞれ規定する。そして、これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３と呼ばれる４種類のプライマーを設計する。 In the LAMP method, six regions are defined in the base sequence of the double-stranded template nucleic acid, and a primer is designed based on the base sequence of these regions. More specifically, the regions F3c, F2c, and F1c are defined in order from the 3'end side of one strand of the template nucleic acid, and the regions B3, B2, and B1 are defined in order from the 5'end side of the same strand. Then, four types of primers called FIP, F3, BIP, and B3 are designed based on the base sequences of these regions.

ＦＩＰは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。Ｆ３は、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰは、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。Ｂ３は、Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーは、設計支援ソフト（http://primerexplorer.jp/）等を利用して適宜設計することができる。 FIP is designed to have the base sequence of the F2 region, which is a base sequence complementary to the F2c region, on the 3'end side and the same base sequence as the base sequence of the F1c region on the 5'end side. F3 is designed to have a base sequence of the F3 region, which is a base sequence complementary to the F3c region. The BIP is designed to have the base sequence of the B2 region on the 3'end side and the base sequence of the B1c region, which is a base sequence complementary to the B1 region, on the 5'end side. B3 is designed to have the base sequence of the B3 region. These primers can be appropriately designed by using design support software (http://primerexplorer.jp/) or the like.

ＬＡＭＰ法においては、上記のＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、Ｂ３の４種類のプライマーに加えて、ＬＦ、ＬＢと呼ばれるプライマー（ループプライマー）を用いることができる。ループプライマーは、ダンベル構造の５’末端側にあるループの１本鎖部分（ＬＦ：Ｆ１領域とＦ２領域の間の塩基配列、ＬＢ：Ｂ１領域とＢ２領域の間の塩基配列）に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。ＬＦ、ＬＢも、上述した設計支援ソフト等を利用して設計することができる。 In the LAMP method, in addition to the above-mentioned four types of primers of FIP, F3, BIP and B3, primers (loop primers) called LF and LB can be used. The loop primer is complementary to the single-stranded portion of the loop on the 5'end side of the dumbbell structure (LF: base sequence between F1 and F2 regions, LB: base sequence between B1 and B2 regions). Design to have a base sequence. By additionally using these primers, the starting point of nucleic acid synthesis in nucleic acid amplification by the LAMP method is increased, and it is possible to shorten the reaction time and increase the detection sensitivity. LF and LB can also be designed by using the above-mentioned design support software and the like.

［プライマーセット］
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。 [Primer set]
In one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1. One or more bases have been deleted, substituted or added in a primer consisting of a base sequence in which a base has been deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2. In the primer consisting of a base sequence, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5. A primer consisting of the base sequence described or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 7 A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the described base sequence, and one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which the base of the above is deleted, substituted or added, and which amplifies the Parecovirus RNA.

また、１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。 Further, in one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A primer consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in which one or more bases are deleted, substituted or added. Primer consisting of the base sequence obtained, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of the base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A primer consisting of the base sequence set forth in 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in 8, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, or 1 or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which a plurality of bases are deleted, substituted or added, and which amplifies Parecovirus RNA.

また、１実施形態において、本発明は、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセットを提供する。 Further, in one embodiment, the present invention is a primer set for detecting parecovirus by the LAMP method, and is one or more in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. A primer consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted or added, a base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, or a base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 in which one or more bases are deleted, substituted or added. Primer consisting of the base sequence obtained, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, or the primer consisting of the base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A primer consisting of the base sequence set forth in 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5, the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, or SEQ ID NO: A primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in 12 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 or 1 or in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. Provided is a primer set containing a primer consisting of a base sequence in which a plurality of bases are deleted, substituted or added, and which amplifies Parecovirus RNA.

実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットは、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するために好適に用いることができる。 As will be described later in Examples, the primer set of this embodiment can be suitably used for detecting parechovirus by the LAMP method.

パレコウイルス（ＨＰｅＶ）は、１９種類の遺伝子型が存在し、パレコウイルス１型（ＨＰｅＶ１）、パレコウイルス２型（ＨＰｅＶ２）及びパレコウイルス３型（ＨＰｅＶ３）などが存在する。なかでも、ＨＰｅＶ３は、生後１ヶ月前後の乳児ではしばしば敗血症様症状・脳炎などを呈するため重要である。 There are 19 types of genotypes of Parechovirus (HPeV), including Parechovirus type 1 (HPeV1), Parechovirus type 2 (HPeV2), and Parechovirus type 3 (HPeV3). Among them, HPeV3 is important because infants around 1 month old often exhibit sepsis-like symptoms and encephalitis.

本実施形態のプライマーセットの開発は困難であり、多数のプライマーセットを作製し、パレコウイルスの検出試験を積み重ねた結果得られたものである。パレコウイルス検出用プライマーの設計には、ＬＡＭＰ法用のプライマー設計支援ソフトを用いたが、翻訳領域の塩基配列を基にプライマーセットを設計しても、実用に耐えるプライマーセットは得られなかった。そこで、５’側非翻訳領域（５’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ領域）の塩基配列に着目し、５’ＵＴＲ領域の塩基配列を基にプライマーセットを網羅的に設計した。候補となったプライマーセットのうち、予備的検討で実用に耐えうるものの選択を行い、パレコウイルスを実用的に検出可能な本実施形態のプライマーセットが得られたものである。 Development of the primer set of this embodiment is difficult, and it was obtained as a result of preparing a large number of primer sets and accumulating detection tests for parechovirus. The primer design support software for the LAMP method was used to design the primer for detecting Parechovirus, but even if the primer set was designed based on the base sequence of the translation region, a primer set that could withstand practical use could not be obtained. .. Therefore, we focused on the base sequence of the 5'untranslated region (5'UTR region) and comprehensively designed the primer set based on the base sequence of the 5'UTR region. From the candidate primer sets, those that can withstand practical use were selected in a preliminary study, and the primer set of the present embodiment capable of practically detecting parechovirus was obtained.

また、本実施形態のプライマーセットを用いて、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、ノロウイルス等のパレコウイルス以外のウイルスの検出を試みた結果、本実施形態のプライマーセットは交差反応を示さないことが確認された。 Further, as a result of trying to detect viruses other than parechovirus such as adenovirus, coxsackievirus, echovirus, enterovirus, and norovirus using the primer set of the present embodiment, the primer set of the present embodiment does not show a cross-reaction. It was confirmed that.

また、臨床検体を用いて、従来法であるＰＣＲ法と、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルスを検出した結果、両者の結果は完全に一致することが確認された。 In addition, as a result of detecting parechovirus by the conventional PCR method using clinical specimens and the LAMP method using the primer set of the present embodiment, it was confirmed that the results of both were completely in agreement. ..

したがって、本実施形態のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルスを実用的に迅速に検出することができる。 Therefore, the parechovirus can be detected practically and rapidly by the LAMP method using the primer set of the present embodiment.

本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号１、２、４、５、７及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。また、本実施形態のプライマーセットにおいて、配列番号１、３、４、６、８及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。また、配列番号１０、１１、４、５、１２及び９に記載の塩基配列からなるプライマーは、ＨＰｅＶのＲＮＡを増幅することができる。ＨＰｅＶ３の５’ＵＴＲ領域の塩基配列を配列番号１０に示す。 In the primer set of this embodiment, the primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 and 9 can amplify the RNA of HPeV. Further, in the primer set of the present embodiment, the primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 8 and 9 can amplify the RNA of HPeV. In addition, the primer consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11, 4, 5, 12 and 9 can amplify the RNA of HPeV. The base sequence of the 5'UTR region of HPeV3 is shown in SEQ ID NO: 10.

ＨＰｅＶは、前述のように１９種類存在し、ＨＰｅＶ３以外にＨＰｅＶ１も存在する。実施例において後述するように、本実施形態のプライマーセットを用いることにより、ＨＰｅＶ３の他にＨＰｅＶ１も検出することができる。ＨＰｅＶ１はＨＰｅＶ感染の中で最も頻度が多いとされているため、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１も検出できることは、ＨＰｅＶ３のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。 As described above, there are 19 types of HPeV, and HPeV1 also exists in addition to HPeV3. As will be described later in the examples, HPeV1 can be detected in addition to HPeV3 by using the primer set of this embodiment. Since HPeV1 is considered to be the most frequent HPeV infection, the ability to detect HPeV1 in addition to HPeV3 is advantageous in terms of clinical needs over those that can detect only HPeV3.

配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦ３プライマーに対応する。また、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＦＩＰプライマーに対応する。また、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢＩＰプライマーに対応する。また、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＢ３プライマーに対応する。また、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＦプライマーに対応する。また、配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーは、上述したＬＢプライマーに対応する。 The primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 correspond to the above-mentioned F3 primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 correspond to the above-mentioned FIP primer. Further, the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponds to the above-mentioned BIP primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 correspond to the above-mentioned B3 primer. Further, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 correspond to the above-mentioned LF primer. Further, the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 corresponds to the above-mentioned LB primer.

本実施形態のプライマーセットは、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 The primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and the primer set forth in SEQ ID NO: 5. It may contain a primer consisting of a base sequence, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.

また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 Further, the primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6. It may contain a primer having the base sequence shown, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.

また、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマーを含んでいてもよい。 Further, the primer set of the present embodiment includes a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11, a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5. It may contain a primer having the base sequence shown, a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.

本実施形態のプライマーセットは、プライマーの塩基配列が多少変異を含んでいても、ＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出を行うことができる。したがって、本実施形態のプライマーセットは、配列番号１～１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプライマーを含んでいてもよい。 The primer set of the present embodiment can detect parechovirus by the LAMP method even if the base sequence of the primer contains some mutations. Therefore, the primer set of the present embodiment may include a primer having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 12.

ここで、複数個とは、プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によってパレコウイルスＲＮＡを増幅することができる限り特に限定されず、例えば２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。 Here, the plurality is not particularly limited as long as the parechovirus RNA can be amplified by the LAMP method using a primer set, and may be, for example, 2 to 4, for example, 2 to 3. You may.

［キット］
１実施形態において、本発明は、上述したプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットを用いてＬＡＭＰ法を行うことにより、試料中に存在するパレコウイルスを簡便に検出することができる。 [kit]
In one embodiment, the present invention provides a kit for detecting parechovirus by the LAMP method, which comprises the above-mentioned primer set. By performing the LAMP method using the kit of this embodiment, the parechovirus present in the sample can be easily detected.

本実施形態のキットは、上述したプライマーセットのほか、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ、陰性コントロール、陽性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬等を含んでいてもよい。 In addition to the primer set described above, the kit of the present embodiment may include a heat-resistant reverse transcriptase, a DNA polymerase, a buffer solution, a substrate dNTP, a negative control, a positive control, a DNA extraction reagent, and the like.

ＤＮＡポリメラーゼとしては鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に２本鎖領域があった場合に、その鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができるＤＮＡポリメラーゼである。 As the DNA polymerase, a strand-substituted DNA polymerase can be used. The strand-replacement type DNA polymerase is to continue the complementary strand synthesis while dissociating the strand when there is a double-stranded region in the elongation direction in the process of synthesizing the DNA strand complementary to the template DNA. It is a DNA polymerase that can be used.

ＤＮＡポリメラーゼとしては、通常ＬＡＭＰ法で用いられているものを使用することができ、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ－Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられるがこれらに限定されない。 As the DNA polymerase, those usually used in the LAMP method can be used, for example, Bst DNA polymerase, Bca ( Exo- ) DNA polymerase, Klenow fragment of DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo). - ) DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase, KOD DNA polymerase and the like can be mentioned, but the present invention is not limited thereto.

［パレコウイルスの検出方法］
１実施形態において、本発明は、パレコウイルスの検出方法であって、生体試料に上述したプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法を提供する。 [Parechovirus detection method]
In one embodiment, the present invention is a method for detecting a parechovirus, which comprises a step of mixing a biological sample with the above-mentioned primer set and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method, and the isothermal amplification reaction is detected after the step. Provided is a detection method indicating that the parechovirus was present in the biological sample.

上述したように、従来、パレコウイルスの検出はＰＣＲ法により行われてきた。しかしながら、ＰＣＲ法は、操作が煩雑であり、現在どこの施設でも行えるものではない。また、結果が判明するまでに数日かかるため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが困難である。 As described above, conventionally, the detection of parechovirus has been performed by the PCR method. However, the PCR method is complicated to operate and cannot be performed at any facility at present. In addition, it takes several days for the results to be known, which makes it difficult to use in clinical practice of newborns whose symptoms change on an hourly basis.

これに対し、本実施形態の検出方法によれば、従来法であるＰＣＲ法と比較して操作が簡便であるため、どこの施設でも使用可能であり、また、数時間で結果が出るため、時間単位で症状が変化する新生児の臨床現場において使用することが可能である。 On the other hand, according to the detection method of the present embodiment, since the operation is simpler than the conventional PCR method, it can be used at any facility, and the result is obtained in several hours. It can be used in the clinical setting of newborns whose symptoms change on an hourly basis.

この結果、患者がパレコウイルスに感染しているか否かを迅速に判断し、適切に治療を行うことが容易になる。 As a result, it becomes easy to quickly determine whether or not the patient is infected with the parechovirus and to appropriately treat the patient.

生体試料としては、血液、尿、便、羊水、臍帯血、膿、髄液これらの試料から抽出したＲＮＡ等が挙げられる。試料をそのままＬＡＭＰ法に適用することもできるが、試料から抽出したＲＮＡをＬＡＭＰ法に適用することが好ましい。 Examples of biological samples include blood, urine, stool, amniotic fluid, umbilical cord blood, pus, cerebrospinal fluid, and RNA extracted from these samples. Although the sample can be applied to the LAMP method as it is, it is preferable to apply the RNA extracted from the sample to the LAMP method.

ＬＡＭＰ法による等温増幅反応は、生体試料に、上述したプライマーセット、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ等を混合し、ＤＮＡ増幅温度でインキュベートすることにより実施することができる。ＤＮＡ増幅温度は、使用するＤＮＡポリメラーゼによって異なるが、約６０～７０℃である。 The isothermal amplification reaction by the LAMP method can be carried out by mixing the above-mentioned primer set, heat-resistant reverse transcriptase, DNA polymerase, buffer solution, dNTP which is a substrate, etc. with a biological sample and incubating at the DNA amplification temperature. can. The DNA amplification temperature varies depending on the DNA polymerase used, but is about 60 to 70 ° C.

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

［実験例１］
（１）サンプル採取とＰＣＲ法によるパレコウイルスの検出
パレコウイルス感染症を疑った患者６人の便（試料）から採取した試料について、アウタープライマーとして、配列番号１４に記載のフォワードプライマー及び配列番号１５に記載のリバースプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１６に記載のフォワードプライマー及び配列番号１７に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行い、検出されたパレコウイルスについて、さらに遺伝子型の判定のためにさらに、アウタープライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号１９に記載のリバースセンスプライマーを用い、ネステッドプライマーとして、配列番号１８に記載のフォワードプライマー及び配列番号２０に記載のリバースセンスプライマーを用いたｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法を行ったところ、６つの試料中４つの試料でＨＰｅＶ３が検出された。 [Experimental Example 1]
(1) Sample collection and detection of Parecovirus by PCR method The forward primers and sequences shown in SEQ ID NO: 14 are used as outer primers for samples collected from the stools (samples) of 6 patients suspected of having Parecovirus infection. A nested-PCR method was performed using the reverse primer set forth in No. 15 and the forward primer set forth in SEQ ID NO: 16 and the reverse sense primer set forth in SEQ ID NO: 17 as nested primers. Further, for the determination of genotype, the forward primer set forth in SEQ ID NO: 18 and the reverse sense primer set forth in SEQ ID NO: 19 are used as outer primers, and the forward primer and SEQ ID NO: set forth in SEQ ID NO: 18 are used as nested primers. When the nested-PCR method using the reverse sense primer described in 20 was performed, HPeV3 was detected in 4 out of 6 samples.

（２）試料からのウイルスＲＮＡの精製
（１）でＨＰｅＶ３が検出された試料５０～１００μＬを２００μＬの滅菌蒸留水で希釈し、５分間撹拌した。次に、４℃、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清を、ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、ウイルスＲＮＡを抽出した。 (2) Purification of viral RNA from the sample 50 to 100 μL of the sample in which HPeV3 was detected in (1) was diluted with 200 μL of sterile distilled water and stirred for 5 minutes. Next, centrifugation was performed at 4 ° C. and 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was extracted with viral RNA using QIAmp Viral RNA Mini Kit (manufactured by Qiagen).

（３）ＬＡＭＰ法のためのプライマー設計
ＨＰｅＶ３のゲノム配列はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトからダウンロードした。このゲノム配列を用いて、ＬＡＭＰ法のためのプライマーセットを作成した。その際、プライマーセットを設計する領域として、５’ＵＴＲ領域に着目し、この領域を基にプライマーセットを設計した。プライマーの設計にはＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用した。配列番号１３に記載の塩基配列からなるＨＰｅＶ３の５’ＵＴＲ領域は７００塩基の長さがあるが、これを用いてＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５によるプライマーの設計を試みたが、候補となる配列は作成できなかった。ＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットはＦ２の外側からＢ２の外側までが１２０～１６０塩基、Ｆ２とＦ３の間が０～６０塩基になるように設計するのが良いとされている。従って、全プライマー作成に必要な参照配列の塩基数は、Ｆ３が、最大１６０＋６０×２＋約２０塩基、Ｂ３プライマーが３２０塩基程度と考えた。
次に、５’ＵＴＲ領域のうち１～４００番目の塩基、１１～４１０番目、２１～４２０番目、…、２０１～６００番目、…、３０１～７００番目というように検索する配列を４００塩基とし、５’ＵＴＲ領域内でその場所を１０塩基ずつずらしながら、５’ＵＴＲ領域でＬＡＭＰ法のプライマーセット候補となるＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３のプライマーセットを全て抽出した。抽出結果を表１に示す。 (3) Primer design for the LAMP method The genome sequence of HPeV3 was downloaded from the website of National Center for Biotechnology Information (NCBI). Using this genomic sequence, a primer set for the LAMP method was prepared. At that time, we focused on the 5'UTR region as a region for designing the primer set, and designed the primer set based on this region. PrimerExplorer V5 (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) was used for the design of the primer. The 5'UTR region of HPeV3 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 has a length of 700 bases, and an attempt was made to design a primer by PrimerExplorer V5 using this, but a candidate sequence could not be created. .. It is said that the primer set used in the LAMP method should be designed so that the range from the outside of F2 to the outside of B2 is 120 to 160 bases, and the range between F2 and F3 is 0 to 60 bases. Therefore, the number of bases in the reference sequence required to prepare all the primers was considered to be 160 + 60 × 2 + about 20 bases at the maximum for F3 and about 320 bases for the B3 primer.
Next, the sequence to be searched for in the 5'UTR region, such as the 1st to 400th bases, the 11th to 410th bases, the 21st to 420th bases, ..., the 201st to 600th bases, ..., and the 301st to 700th bases, is set to 400 bases. While shifting the location by 10 bases in the 5'UTR region, all the primer sets of FIP, BIP, F3, and B3, which are candidates for the primer set of the LAMP method, were extracted in the 5'UTR region. The extraction results are shown in Table 1.

Figure 2022014809000001
Figure 2022014809000001

（４）ＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出
（３）で抽出されたプライマーセットは、Ｐ－ａ、Ｐ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の８種類存在した。このうち、最も高頻に抽出されたプライマーセットは、表２に示したＰ１、Ｐ２及びＰ３の３つで、合計１２回候補として抽出された。一方、残りの５つのプライマーセットは、Ｐ－ａが２回候補として、その他のＰ－ｂ、Ｐ－ｃ、Ｐ－ｄ、Ｐ－ｅの４つが１回のみ、抽出された。そこで、最も高頻度に抽出されたプライマーセット（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３）を用いて、水のみを含む試料（蒸留水）と、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料において、ＬＡＭＰ法により増幅を行い、増幅の有無を確認した。 (4) Detection of Parechovirus by LAMP method There are eight types of primer sets extracted in (3): P-a, P-b, P-c, P-d, P-e, P1, P2, and P3. Were present. Of these, the most frequently extracted primer sets were P1, P2, and P3 shown in Table 2, which were extracted as candidates 12 times in total. On the other hand, in the remaining five primer sets, P-a was extracted twice as a candidate, and the other four P-b, P-c, P-d, and P-e were extracted only once. Therefore, using the primer sets (P1, P2, and P3) extracted most frequently, the sample containing only water (distilled water) and the sample containing HPeV3 virus RNA were amplified by the LAMP method. Was performed, and the presence or absence of amplification was confirmed.

ＬＡＭＰ法による増幅は、Ｌｏｏｐａｍｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（栄研化学株式会社製）を用いて行なった。具体的には、ＰＣＲ用チューブに、（２）で調製したウイルスＲＮＡ５μＬ、熱耐性逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、ｄＮＴＰｓ、プライマーセットを混合して撹拌し、スピンダウンを行なったのちに、６３℃で１時間反応させた。その後、８０℃、５分間加熱することによりで酵素を失活させた。増幅産物は蛍光色素によって可視化した。 Amplification by the LAMP method was performed using a Loopamp RNA Amplification Kit (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.). Specifically, 5 μL of the virus RNA prepared in (2), heat-resistant reverse transcriptase, DNA polymerase, buffer solution, dNTPs, and primer set were mixed in a PCR tube, stirred, and then spun down. The reaction was carried out at 63 ° C. for 1 hour. Then, the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 5 minutes. The amplification product was visualized with a fluorescent dye.

Figure 2022014809000002
Figure 2022014809000002

プライマーセットＰ１、Ｐ２又はＰ３を用いるＬＡＭＰ法では、蒸留水を試料として用いた場合は、いずれも増幅が確認されなかった。一方、また、ＰＣＲ法でＨＰｅＶ３が検出された試料においては、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料においては、Ｐ１では、１８回試行して６回陽性、Ｐ２では、１８回試行して８回陽性、Ｐ３では、７回試行して６回陽性となり、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を用いるＬＡＭＰ法では、増幅が確認される場合とされない場合とがあり、再現性が得られなかった。 In the LAMP method using the primer sets P1, P2 or P3, no amplification was confirmed when distilled water was used as a sample. On the other hand, in the sample in which HPeV3 was detected by the PCR method, in the sample containing the viral RNA of HPeV3, P1 was tried 18 times and positive 6 times, and P2 was tried 18 times and 8 times. In the case of positive times and P3, 7 trials were made and 6 times positive, and in the LAMP method using P1, P2 and P3, amplification may or may not be confirmed, and reproducibility could not be obtained.

［実験例２］
（ＨＰｅＶ３検出用プライマーの検討）
実験例１で用いたプライマーセットＰ１、Ｐ２及びＰ３のＦ３、ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｂ３に加えて、ＬＦ及びＬＢを含む、表３に記載のプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を設計した。このうち、Ｐ４は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）を利用して設計したが、Ｐ５とＰ６は、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５では設計できなかったため、手作業にて設計した。このプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６をそれぞれ用い、実験例１と同様の条件で、ＬＡＭＰ法を行った。 [Experimental Example 2]
(Examination of primer for HPeV3 detection)
The primer sets P4, P5 and P6 shown in Table 3, which include LF and LB in addition to the primer sets P1, P2 and P3 F3, FIP, BIP and B3 used in Experimental Example 1, were designed. Of these, P4 was designed using PrimerExplorer V5 (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.), but P5 and P6 were designed manually because they could not be designed with PrimerExplorer V5. Using these primer sets P4, P5 and P6, respectively, the LAMP method was performed under the same conditions as in Experimental Example 1.

Figure 2022014809000003
Figure 2022014809000003

図１に、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いた増幅結果を示す。図１に示したように、蒸留水を試料として用いた場合は、実験例１と同様にいずれも増幅が確認されなかったが、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料においては、Ｐ４では、１９回試行して１９回陽性、Ｐ５では、１９回試行して１９回陽性、Ｐ６では、８回試行して、８回陽性と、再現性よく増幅が確認された。 FIG. 1 shows the amplification results using the primer sets P4, P5 and P6. As shown in FIG. 1, when distilled water was used as a sample, amplification was not confirmed in any of the samples as in Experimental Example 1, but in the sample containing the virus RNA of HPeV3, in P4, Amplification was confirmed with good reproducibility, with 19 trials and 19 positives, 19 trials and 19 positives for P5, and 8 trials and 8 positives for P6.

［実験例３］
（ＲＴ－ＬＡＭＰ法の至適条件の検討）
実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６について、ＬＡＭＰ法の測定条件を変更し、至適なＬＡＭＰ法の測定条件の検討を行なった。
（１）至適反応温度の確認
ＬＡＭＰ法の反応を６３℃以外に、５９℃、６１℃、６５℃、６７℃の４つの温度条件で行なった。その結果、５９℃と６７℃では増幅が確認できず、６１℃、６５℃で増幅が確認できた。従って、至適な反応温度は６３℃であることを確認した。 [Experimental Example 3]
(Examination of optimal conditions for RT-LAMP method)
For the primer sets P4, P5 and P6 for detecting Parechovirus found in Experimental Example 2, the measurement conditions of the LAMP method were changed, and the optimum measurement conditions of the LAMP method were examined.
(1) Confirmation of optimum reaction temperature The reaction of the LAMP method was carried out under four temperature conditions of 59 ° C, 61 ° C, 65 ° C and 67 ° C in addition to 63 ° C. As a result, amplification could not be confirmed at 59 ° C and 67 ° C, but amplification was confirmed at 61 ° C and 65 ° C. Therefore, it was confirmed that the optimum reaction temperature was 63 ° C.

（２）反応時間と、試料のウイルスＲＮＡ量の関係
試料のウイルスＲＮＡ量を１１８ｎｇ、１１．８ｎｇ、１．１８ｎｇ、０．１１８ｎｇに調整し、反応時間を２０分、３０分、４０分、５０分、６０分に設定してＬＡＭＰ法を行なった。結果を表４に示す。その結果、プライマーセットＰ４及びＰ５ではどのＲＮＡ量でも２０分から陽性が目視できるようになった。また、反応時間３０分では、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６の全てのプライマーセットで、どのＲＮＡ量でも陽性が確認できた。このことから、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法では、ウイルスＲＮＡ量は１１８ｐｇまでは増幅可能であることを確認し、また、最短反応時間は３０分であることを確認した。 (2) Relationship between reaction time and amount of virus RNA in the sample The amount of virus RNA in the sample was adjusted to 118 ng, 11.8 ng, 1.18 ng, 0.118 ng, and the reaction time was 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes. The LAMP method was performed by setting the minutes and 60 minutes. The results are shown in Table 4. As a result, in the primer sets P4 and P5, positive results could be visually observed from 20 minutes regardless of the amount of RNA. In addition, when the reaction time was 30 minutes, positive results were confirmed for all RNA amounts in all the primer sets of P4, P5 and P6. From this, it was confirmed that the amount of viral RNA could be amplified up to 118 pg by the LAMP method using P4, P5 and P6, and the shortest reaction time was 30 minutes.

Figure 2022014809000004
Figure 2022014809000004

一方、通常のＰＣＲ法では、測定可能な試料のゲノム量は５～２００ｎｇ程度と言われている。このことからも、本発明のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法は、通常のＰＣＲ法と同等以上の検出感度を持っていることが判明した。
更に、ＨＰｅＶ３のウイルスＲＮＡが含まれている試料を用いて、３２．０～５８．８ｎｇの範囲でウイルスＲＮＡを持ち込み、通常のＰＣＲ法を行なった。ＰＣＲ法は、検出感度は反応のサイクル数に依存するため、４０サイクルの高感度法で行なった。そのＰＣＲ産物の電気泳動結果を図２に示す。図２で示したように、ＰＣＲ産物は電気泳動でかろうじて目視でき、検出感度の下限域であった。従って、本発明のプライマーセットを用いるＬＡＭＰ法は、通常のＰＣＲ法と比較しても十分感度が良いことが実証された。 On the other hand, in the usual PCR method, it is said that the amount of the genome of the measurable sample is about 5 to 200 ng. From this, it was found that the LAMP method using the primer set of the present invention has a detection sensitivity equal to or higher than that of the usual PCR method.
Furthermore, using a sample containing the viral RNA of HPeV3, the viral RNA was brought in in the range of 32.0 to 58.8 ng, and the usual PCR method was performed. Since the detection sensitivity depends on the number of reaction cycles, the PCR method was performed by a high-sensitivity method of 40 cycles. The electrophoresis result of the PCR product is shown in FIG. As shown in FIG. 2, the PCR product was barely visible by electrophoresis and was in the lower limit of detection sensitivity. Therefore, it was demonstrated that the LAMP method using the primer set of the present invention has sufficiently high sensitivity as compared with the usual PCR method.

［実験例４］
（パレコウイルス検出用プライマーの交差反応の検討）
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ｂｌａｓｔ）を用いて、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６と各種ウイルスのホモロジー検索をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで検討した。その結果、実験例２で見出したパレコウイルス検出用プライマーは、ＨＰｅＶ３以外にＨＰｅＶ１、ＨＰｅＶ４、ＨＰｅＶ８、ＨＰｅＶ１４及びＨＰｅＶ１８に交差反応性を持つ可能性が明らかになった。一方、非パレコウイルス属には交差反応性を認めなかった。このことを確認するために、実験例２で見出したプライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、パレコウイルス以外のウイルスのＲＮＡ、及びＨＰｅＶ３以外のパレコウイルスが増幅されるか否かを検討した。 [Experimental Example 4]
(Examination of cross-reactivity of primers for detecting parechovirus)
Primer sets P4, P5 and P6 and various virus homology searches were examined in silico using the Basic Local Alignment Search Tool (blast). As a result, it was clarified that the primer for detecting Parechovirus found in Experimental Example 2 may have cross-reactivity with HPeV1, HPeV4, HPeV8, HPeV14 and HPeV18 in addition to HPeV3. On the other hand, no cross-reactivity was observed in the non-parechovirus genus. In order to confirm this, RNA of viruses other than Parechovirus and Parechovirus other than HPeV3 are amplified by the LAMP method using each of the primer sets P4, P5, and P6 found in Experimental Example 2. I examined whether or not it would be done.

まず、アデノウイルス、コクサッキーウイルスＢ５、エコーウイルス１１、エンテロウイルスＤ６８、エンテロウイルスＡ７１、ＨＰｅＶ１及びＨＰｅＶ３（２株）の各細胞株、及びアデノウイルス感染患者の便１検体とノロウイルス感染患者の便３検体を用いて、実験例１と同様の方法により、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６の各プライマーセットを用いるＬＡＭＰ法によりそれぞれ増幅し、増幅の有無を確認した。 First, using adenovirus, coxsackievirus B5, echovirus 11, enterovirus D68, enterovirus A71, HPeV1 and HPeV3 (2 strains) cell lines, and 1 stool sample from adenovirus-infected patients and 3 stool samples from norovirus-infected patients. By the same method as in Experimental Example 1, amplification was performed by the LAMP method using each of the primer sets P4, P5, and P6, and the presence or absence of amplification was confirmed.

また、上記の各検体について、ＰＣＲ法を用いたエンテロウイルス遺伝子検査、アデノウイルス遺伝子検査及びパレコウイルス遺伝子検査により、増幅の有無を確認した。その結果を図３及び表５に示す。なお、図３はプライマーセットＰ６用いて増幅した結果を示す。 In addition, the presence or absence of amplification was confirmed for each of the above samples by enterovirus genetic test, adenovirus genetic test, and parechovirus genetic test using the PCR method. The results are shown in FIGS. 3 and 5. Note that FIG. 3 shows the results of amplification using the primer set P6.

Figure 2022014809000005
Figure 2022014809000005

その結果、表５及び図３に示したように、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれも、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス及びノロウイルスのＲＮＡを増幅せず、交差反応しないことが明らかとなった。また、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれも、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１のＲＮＡを増幅することが明らかとなった。この結果から、これらのプライマーセットにより、特異的にパレコウイルスを検出できることが確認された。なお、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６はいずれも、ＨＰｅＶ３の他にＨＰｅＶ１にも反応性を示し、パレコウイルスの型別判定はできなかったが、ＨＰｅＶ１はＨＰｅＶ感染の中で最も頻度が多いとされているため、ＨＰｅＶ３の他、ＨＰｅＶ１も検出できることは、ＨＰｅＶ３のみ検出できるものよりも臨床的なニーズという点において有利である。 As a result, as shown in Table 5 and FIG. 3, it is clear that none of the primer sets P4, P5, and P6 amplifies the RNAs of adenovirus, coxsackievirus, echovirus, enterovirus, and norovirus, and does not cross-react. became. In addition, it was revealed that all of the primer sets P4, P5, and P6 amplify RNA of HPeV1 in addition to HPeV3. From this result, it was confirmed that the parechovirus can be specifically detected by these primer sets. The primer sets P4, P5, and P6 all showed reactivity with HPeV1 in addition to HPeV3, and the type of parechovirus could not be determined, but HPeV1 was the most frequent among HPeV infections. Therefore, the fact that HPeV1 can be detected in addition to HPeV3 is advantageous in terms of clinical needs over those that can detect only HPeV3.

また、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６で増幅が確認されたＨＰｅＶ１及びＨＰｅＶ３の各検体は、ＰＣＲ法によるパレコウイルス遺伝子検査でも増幅が確認された。プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いた、本発明のＬＡＭＰ法による簡便なパレコウイルスの検出の結果が、ＰＣＲ法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致することは、本発明の検出方法が、信頼性が高いことを示している。 In addition, each sample of HPeV1 and HPeV3 whose amplification was confirmed by the primer sets P4, P5 and P6 was also confirmed to be amplified by the Parechovirus genetic test by the PCR method. It is the present invention that the result of the simple detection of parechovirus by the LAMP method of the present invention using the primer sets P4, P5 and P6 completely matches the result of the detection of the parechovirus using the PCR method. The detection method of is highly reliable.

［実験例５］
（患者検体を用いたＬＡＭＰ法によるパレコウイルスの検出）
ＨＰｅＶ感染を疑わせる患者６名（患者Ａ、患者Ｂ、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ、患者Ｆ）から、糞便を採取し、実験例１と同様の方法でウイルスＲＮＡを抽出した。この検体を用いてプライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いるＬＡＭＰ法でパレコウイルスの検出を行った。その結果を図４に示す。
図４に示したように、プライマーセットＰ４、Ｐ５、Ｐ６のいずれにおいても、患者Ｃ、患者Ｄ、患者Ｅ及び患者Ｆの４人の検体で陽性となった。一方、２つの検体（患者Ａ及び患者Ｂ）では陰性であった。
同様にこれらの検体を実験例１に示したｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ法によって確認したところ、ＬＡＭＰ法で陽性になった患者はすべてＨＰｅＶ３感染症患者であることが確認され、一方、ＬＡＭＰ法で陰性であった検体はＰＣＲ法によりＨＰｅＶ３が検出されなかった。なお、ＬＡＭＰ法の結果は、糞便を採取してから２時間で判明したが、上記のＰＣＲ法では、結果判明に２日間を要した。
以上の結果から、プライマーセットＰ４、Ｐ５及びＰ６を用いる本発明のＬＡＭＰ法による簡便なパレコウイルスの検出の結果は、ＰＣＲ法を用いたパレコウイルスの検出の結果と完全に一致しており、本発明のパレコウイルスの検出方法は、信頼性が高くかつ、臨床的にも有用であることを示している。 [Experimental Example 5]
(Detection of parechovirus by LAMP method using patient sample)
Feces were collected from 6 patients (patient A, patient B, patient C, patient D, patient E, patient F) suspected of having HPeV infection, and viral RNA was extracted by the same method as in Experimental Example 1. Using this sample, Parechovirus was detected by the LAMP method using primer sets P4, P5 and P6. The results are shown in FIG.
As shown in FIG. 4, all of the primer sets P4, P5, and P6 were positive in the four specimens of patient C, patient D, patient E, and patient F. On the other hand, two specimens (patient A and patient B) were negative.
Similarly, when these samples were confirmed by the nested-PCR method shown in Experimental Example 1, it was confirmed that all the patients who were positive by the LAMP method were HPeV3 infectious disease patients, while they were negative by the LAMP method. HPeV3 was not detected in the sample by the PCR method. The result of the LAMP method was found 2 hours after the stool was collected, but it took 2 days to find the result by the above PCR method.
From the above results, the result of simple detection of parechovirus by the LAMP method of the present invention using the primer sets P4, P5 and P6 is completely in agreement with the result of the detection of parechovirus using the PCR method. The method for detecting parechovirus of the present invention has been shown to be highly reliable and clinically useful.

本発明によれば、パレコウイルスを迅速かつ簡便に検出する技術を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a technique for quickly and easily detecting a parechovirus.

Claims (8)

パレコウイルスをＬｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列、又は配列番号２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列、又は配列番号７に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting parechovirus by the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA. 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項１に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
The primer set according to claim 1. パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列、又は配列番号１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列、又は配列番号３に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列、又は配列番号６に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列、又は配列番号８に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting Parechovirus by the LAMP method,
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA. 配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項３に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
3. The primer set according to claim 3. パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのプライマーセットであって、
配列番号１０に記載の塩基配列、又は配列番号１０に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列、又は配列番号１１に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列、又は配列番号５に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列、又は配列番号１２に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列、又は配列番号９に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマー、
を含み、パレコウイルスＲＮＡを増幅する、プライマーセット。 A primer set for detecting Parechovirus by the LAMP method,
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 or a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9. Or a primer consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
A primer set that contains and amplifies parechovirus RNA. 配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー、及び
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー、
を含む、請求項５に記載のプライマーセット。 Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4,
Primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
A primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9.
5. The primer set according to claim 5. 請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、パレコウイルスをＬＡＭＰ法で検出するためのキット。 A kit for detecting parechovirus by the LAMP method, which comprises the primer set according to any one of claims 1 to 6. パレコウイルスの検出方法であって、
生体試料に請求項１～６のいずれか一項に記載のプライマーセットを混合してＬＡＭＰ法による等温増幅反応を行う工程を含み、
前記工程後に等温増幅反応が検出されることが、前記生体試料中にパレコウイルスが存在していたことを示す、検出方法。 Parechovirus detection method
A step of mixing a biological sample with the primer set according to any one of claims 1 to 6 and performing an isothermal amplification reaction by the LAMP method is included.
A detection method in which the detection of an isothermal amplification reaction after the step indicates that the parechovirus was present in the biological sample.
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