JP2022001021A - Cd26 specific chimeric antigen receptor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、遺伝子修飾された免疫細胞で遺伝子修飾した免疫細胞、疾患の治療等に使用するため前記遺伝子修飾された免疫細胞等に関する。 The present invention has been genetically modified to express a CD26-specific chimeric antigen receptor (hereinafter referred to as CAR), a polynucleotide encoding the CAR, an expression vector containing the polynucleotide, and the CAR on the cell surface membrane. The present invention relates to an immune cell genetically modified with an immune cell, the genetically modified immune cell for use in the treatment of a disease, or the like.
１９９３年にイスラエルのグループによって、遺伝子操作を加えた人工Ｔ細胞受容体を患者Ｔ細胞に遺伝子導入し、そのＴ細胞を体外で増幅した後に患者に輸注するという遺伝子、細胞治療法が考案された。この人工Ｔ細胞受容体はキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下ＣＡＲと記す）と命名された。ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体可変領域の軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）のＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つキメラタンパクの総称である。ＣＡＲを発現させたＴ細胞はｓｃＦｖ領域で腫瘍抗原を認識した後、その認識シグナルを細胞内のＣＤ３ζドメインを通じてＴ細胞内に伝達することで活性化する。さらに、Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとＣＤ３ζ鎖の間に共刺激分子（ＣＤ２８または４−１ＢＢの一方、あるいはその両者）を組み込まれたＣＡＲは第２世代、第３世代ＣＡＲとよばれ、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞障害活性と増殖能が高いことが示されている（非特許文献１：Ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｏｏｄ ２０１３）。 In 1993, an Israeli group devised a gene and cell therapy method in which a genetically engineered artificial T cell receptor was introduced into a patient's T cell, the T cell was amplified in vitro and then infused into the patient. .. This artificial T cell receptor was named Chimeric Antigen Receptor (hereinafter referred to as CAR). CAR is a single-chain antibody (single chain variable fragment: scFv) in which a light chain (VL) and a heavy chain (VH) of a monoclonal antibody variable region specific to a tumor antigen are bound in series to the N-terminal side, and T cells. It is a general term for chimeric proteins having a CD3ζ chain of a receptor (TCR) on the C-terminal side. T cells expressing CAR recognize tumor antigens in the scFv region and then activate by transmitting the recognition signal into the T cells through the intracellular CD3ζ domain. In addition, CARs incorporating a costimulatory molecule (one or both of CD28 and 4-1BB) between scFv and the CD3ζ chain to enhance T cell activation are second and third generation CARs. It has been shown that CAR-T cells have high cytotoxic activity and proliferative ability (Non-Patent Document 1: Masu et al. Body 2013).
現在、世界中でＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた治療法の開発が進められているが、どのような腫瘍抗原を標的とするのかは重要なポイントのひとつである。例えば、Ｂリンパ球に由来する腫瘍が発現するＣＤ１９分子は、このＣＡＲ−Ｔ療法の良い標的であり、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などに対するＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ療法は実臨床で高い効果を示している（非特許文献２：Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１８；３７８：４３９−４４８ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１７０９８６６）（非特許文献３：Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１９；３８０：４５−５６ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１８０４９８０）。ＣＤ３３を標的とする第２世代のＣＡＲについては、公開されている（特許文献１：ＷＯ２０１５／０５７３３１）。また、より効果の期待できる、第３世代については、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲが構築され、その臨床効果について、報告がされている（非特許文献４：Ｃａｒｌｏｓ Ａ． Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｆｃｕｌａｒ−ｔｈｅｒａｐｙ， ｖｏｌ．２６， Ｎｏ． １２， ｐ． ２７２７−２７３７， ２０１８）。 Currently, the development of therapeutic methods using CAR-T cells is underway all over the world, and what kind of tumor antigen is targeted is one of the important points. For example, the CD19 molecule expressed by tumors derived from B lymphocytes is a good target for this CAR-T therapy, such as CD19 CAR- for B-cell acute lymphoblastic leukemia and diffuse large B-cell lymphoma. T therapy has shown high efficacy in clinical practice (Non-Patent Document 2: Made et al. N Engl J Med 2018; 378: 439-448DOI: 10.1056 / NEJMoa1709866) (Non-Patent Document 3: Schuster et al. N Engl J Med 2019; 380: 45-56DOI: 10.1056 / NEJMoa1804980). The second generation CAR targeting CD33 has been published (Patent Document 1: WO2015 / 057331). In addition, for the third generation, which is expected to be more effective, a CAR targeting CD19 has been constructed, and its clinical effect has been reported (Non-Patent Document 4: Carlos A. Ramos et al. Molefcular-therapy). , Vol. 26, No. 12, p. 2727-2737, 2018).
一方、悪性中皮腫や腎癌、大腸癌、肝癌、肺癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、更にＴリンパ球に由来する造血器腫瘍などの腫瘍細胞は高率にＣＤ２６を発現することから、これらの治療ではＣＤ２６が良い標的となるものと考えられ、本発明者らは、ヒト化抗ＣＤ２６抗体であるＹＳ１１０を開発し（特許文献２：ＷＯ２００７０１４１６９）、悪性中皮腫や腎癌を対象とする第Ｉ相試験で優れた効果を報告した（Ａｎｇｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７）。また、ＹＳ１１０と他の抗がん剤とを組み合わせた癌治療用組成物についても、開示している（特許文献３：ＷＯ２０１７／０４３６１３）。このＹＳ１１０のＶＬとＶＨをｓｃＦｖとしてＣＡＲに用いるＣＤ２６ ＣＡＲ−Ｔ療法はＣＤ２６を発現する腫瘍に有効であろうと期待される。しかしながら、標的細胞が異なると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の挙動も異なることが知られており、この試みは不成功に終わっている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ．２０１９， Ａｕｇ；４１（４）：４９０−４９６）。Ｚｈｏｕらは、４−１ＢＢ を共刺激分子とする第２世代ＣＤ２６ ＣＡＲを構築し（ＹＳ１１０−４−１ＢＢ）、これをＴ細胞に遺伝子導入したが、ＣＤ２６ ＣＡＲ−Ｔ細胞に特にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて増殖が得られなかったと報告しており、この原因として、Ｚｈｏｕらは、Ｔ細胞がもともと発現しているＣＤ２６と強制発現されたＣＤ２６ ＣＡＲとが反応し、Ｔ細胞に細胞死が誘導されたものと考察している。 On the other hand, tumor cells such as malignant mesothelioma, renal cancer, colon cancer, liver cancer, lung cancer, prostate cancer, gastrointestinal stromal tumor, thyroid cancer, and hematopoietic tumor derived from T lymphocytes express CD26 at a high rate. Therefore, it is considered that CD26 is a good target for these treatments, and the present inventors have developed YS110, which is a humanized anti-CD26 antibody (Patent Document 2: WO200701149169), and malignant mesothelioma and kidney. An excellent effect was reported in a phase I study in cancer (Angevin et al. Br J Cancer 2017). Further, a composition for treating cancer in which YS110 is combined with another anticancer agent is also disclosed (Patent Document 3: WO2017 / 043613). It is expected that the CD26 CAR-T therapy using VL and VH of YS110 as scFv for CAR will be effective for tumors expressing CD26. However, it is known that different target cells behave differently as CAR-T cells, and this attempt has been unsuccessful (Zhou et al. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2019, Aug; 41 (4): 490. -496). Zhou et al. Constructed a second-generation CD26 CAR with 4-1BB as a co-stimulator (YS110-4-1BB) and introduced it into T cells, but proliferated in CD26 CAR-T cells, especially in vitro. The cause of this was that CD26, which was originally expressed by T cells, reacted with CD26 CAR, which was forcibly expressed, and cell death was induced in T cells. I'm considering it.
また、ＣＤ２６を標的とする、共刺激分子をＣＤ２８とする第２世代のＣＡＲについても報告がある（非特許文献５：Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｎｏｔｈｅｒａｐｙ， ２０２０ Ａｐｒ ２１． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１３７５−０２０−０８２４−ｙ． Ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。 There is also a report on a second-generation CAR targeting CD26 and using CD28 as a co-stimulator molecule (Non-Patent Document 5: Zhou et al., Immunotherapy, 2020 Apr 21. Doi: 10.1038 / s41375-. 020-0824-y. Online a head of patent).
しかし、より効果の期待できる、ＣＤ２６を標的とする第３世代のＣＡＲ−Ｔについては、４−１−ＢＢがｉｎ ｖｉｖｏ でｅｘｐａｎｓｉｏｎが得られないことから、他のマーカーを標的とするものについては、これまで報告がなかった。 However, for the 3rd generation CAR-T targeting CD26, which is expected to be more effective, since 4-1-BB cannot obtain an expansion in vivo, those targeting other markers are not available. , There have been no reports so far.
悪性中皮腫や腎癌、大腸癌、肝癌、肺癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、更にＴリンパ球に由来する造血器腫瘍などの腫瘍細胞は高率にＣＤ２６を発現するが、これらの疾患はいずれも有効な治療が少なく新しい治療が期待されている。本発明者らは、このような状況の中でＣＤ２６を標的とする抗体に着目し、これをin vitroで効率よく増殖させることが前記の難治性疾患の新たな治療を開発するうえに有意義であるとの観点で研究を進めた。したがって、本発明の目的は、腫瘍細胞等に発現するＣＤ２６を標的とするＣＡＲとして、ＣＡＲ−Ｔ細胞をより効率的に増殖させ、新たな治療に有益なＣＡＲ等を提供することにある。 Tumor cells such as malignant mesoderma, renal cancer, colon cancer, liver cancer, lung cancer, prostate cancer, gastrointestinal stromal tumor, thyroid cancer, and hematopoietic tumor derived from T lymphocytes express CD26 at a high rate. , All of these diseases have few effective treatments, and new treatments are expected. Under such circumstances, the present inventors focused on an antibody targeting CD26, and it is meaningful to efficiently propagate it in vitro in developing a new treatment for the above-mentioned intractable disease. I proceeded with the research from the viewpoint of existence. Therefore, an object of the present invention is to proliferate CAR-T cells more efficiently as CARs targeting CD26 expressed in tumor cells and the like, and to provide CARs and the like useful for new treatments.
本発明者らは、ＣＤ２６を標的とする抗体を研究する中で、驚くべきことに第３世代のＣＡＲで遺伝子修飾された免疫細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで良好な増殖を示し、従来の第２世代のＣＡＲには見られない、優れた抗腫瘍効果を示すことを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記に掲げるものに関する：
In our research on antibodies targeting CD26, we surprisingly found that 3rd generation CAR-modified immune cells showed good in vitro proliferation and were conventional 2nd generation. The present invention was completed by discovering for the first time that it exhibits an excellent antitumor effect not found in CAR.
That is, the present invention relates to the following:
［１］ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ。
［２］細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、［１］に記載のＣＡＲ。
［３］ヒンジが、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、およびＩｇＧ１ヒンジより選択される、［１］または［２］に記載のＣＡＲ。
[1] A CD26-specific chimeric antigen receptor (hereinafter referred to as CAR).
(A) Extracellular ligand binding domain containing VH and VL derived from monoclonal anti-CD26 antibody,
(B) Hinge,
The CAR comprising (c) a transmembrane domain and (d) a cytoplasmic domain comprising a CD3ζ signaling domain and a co-stimulating domain from 4-1BB and CD28.
[2] The CAR according to [1], wherein the extracellular ligand binding domain contains scFv.
[3] The CAR according to [1] or [2], wherein the hinge is selected from the FcRIIIα hinge, the CD8α hinge, and the IgG1 hinge.
［４］ヒンジが、ＣＤ８αヒンジを含む、［１］〜［３］に記載のＣＡＲ。
［５］膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含む、［１］〜［４］に記載のＣＡＲ。
［６］ヒンジが、ＣＤ８αヒンジであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８である、［１］〜［５］に記載のＣＡＲ。
［７］ 細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸番号２０〜２６０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［６］に記載のＣＡＲ。
［８］ＶＨが、配列番号１のアミノ酸番号１４５〜２６０より選択されるアミノ酸配列からなり、かつＶＬが、配列番号２１〜１２９より選択されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［７］に記載のＣＡＲ。
［９］膜貫通ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３１４〜３８４のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［８］に記載のＣＡＲ。
［１０］ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号１のアミノ酸番号４２７〜５３９で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［９］に記載のＣＡＲ。
[4] The CAR according to [1] to [3], wherein the hinge includes a CD8α hinge.
[5] The CAR according to [1] to [4], wherein the transmembrane domain comprises CD28.
[6] The CAR according to [1] to [5], wherein the hinge is a CD8α hinge and the transmembrane domain is CD28.
[7] The extracellular ligand-binding domain consists of the amino acid sequences represented by
[8] VH consists of an amino acid sequence selected from amino acid numbers 145 to 260 of SEQ ID NO: 1, and VL consists of an amino acid sequence selected from amino acid numbers 21 to 129 of SEQ ID NO: 1 or lacks several amino acids. The CAR according to [1] to [7], which comprises an amino acid sequence having 95% equivalent to each of the above sequences by loss, substitution, or addition.
[9] The transmembrane domain consists of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence of amino acid numbers 314 to 384 of SEQ ID NO: 1, or a few amino acids are deleted, substituted, or added to each of the above sequences. The CAR according to [1] to [8], which comprises an amino acid sequence having 95% equivalence with respect to the above.
[10] The CD3ζ signaling domain consists of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 427-539 of SEQ ID NO: 1, or by deletion, substitution, or addition of several amino acids, to each of the above sequences. The CAR according to [1] to [9], which comprises an amino acid sequence having 95% equivalence.
［１１］４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３８５〜４２６で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［１０］に記載のＣＡＲ。
［１２］ＣＤ２８由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３４４〜３８４で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［１１］に記載のＣＡＲ。
［１３］シグナルペプチドをさらに含む、［１］〜［１２］に記載のＣＡＲ。
［１４］シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸番号１〜２０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１３］に記載のＣＡＲ。
[11] The costimulatory domain derived from 4-1BB consists of the amino acid sequence represented by amino acid number 385-426 of SEQ ID NO: 1, or several amino acids are deleted, substituted, or added, respectively. The CAR according to [1] to [10], which comprises an amino acid sequence having 95% equivalence with respect to the sequence of.
[12] The co-stimulation domain derived from CD28 consists of the amino acid sequences represented by amino acid numbers 344 to 384 of SEQ ID NO: 1, or several amino acids are deleted, substituted, or added to each of the above-mentioned sequences. The CAR according to [1] to [11], which comprises an amino acid sequence having 95% equivalence with respect to [1] to [11].
[13] The CAR according to [1] to [12], further comprising a signal peptide.
[14] The signal peptide consists of the amino acid sequences represented by
［１５］［１］〜［１４］に記載のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［１７］［１］〜［１４］に記載のＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞。
［１８］炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、［１７］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［１９］ＴＣＲの発現が抑制されている、［１８］に記載の遺伝子修飾遺伝子修飾された免疫細胞。
［２０］ＣＤ２６の発現が抑制されている、［１７］〜［１９］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［２１］少なくとも１種の免疫抑制剤または化学療法剤に対して耐性になるよう修飾されている、［１７］〜［２０］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［２２］疾患の治療において使用するための、［１７］〜［２１］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２３］患者がヒトである、［２２］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２４］疾患が、ＣＤ２６発現細胞を特徴とする前癌性または癌疾患である、［２２］または［２３］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２５］疾患がＣＤ２６発現細胞の過剰量を特徴とする疾患である、［２２］〜［２４］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２６］疾患が、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、［２２］〜［２５］のいずれかに記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
[15] A polynucleotide encoding the CAR according to [1] to [14].
[16] An expression vector containing the polynucleotide according to [15].
[17] Immune cells expressing the CAR according to [1] to [14] on the cell surface membrane.
[18] The genetically modified immune cell according to [17], which is derived from an inflammatory T lymphocyte, a cytotoxic T lymphocyte, a regulatory T lymphocyte, or a helper T lymphocyte.
[19] The gene-modified gene-modified immune cell according to [18], wherein the expression of TCR is suppressed.
[20] The gene-modified immune cell according to [17] to [19], wherein the expression of CD26 is suppressed.
[21] The genetically modified immune cells according to [17] to [20], which are modified to be resistant to at least one immunosuppressive agent or chemotherapeutic agent.
[22] The pharmaceutical composition comprising the genetically modified immune cells according to [17] to [21] for use in the treatment of a disease.
[23] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the therapy according to [22], wherein the patient is a human.
[24] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the therapy according to [22] or [23], wherein the disease is a precancerous or cancerous disease characterized by CD26 expressing cells.
[25] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to [22] to [24], wherein the disease is a disease characterized by an excess of CD26 expressing cells.
[26] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to any one of [22] to [25], wherein the disease is kidney cancer, prostate cancer, or lung cancer.
［２７］疾患が、造血器腫瘍である、［２２］〜［２６］のいずれかに記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２８］造血器腫瘍が、白血病である、［２７］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２９］白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、［２８］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３０］白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、［２９］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３１］造血器腫瘍が、悪性リンパ増殖性障害である、［３０］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３２］悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、［３１］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３３］リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、［３２］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
[27] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to any of [22] to [26], wherein the disease is a hematopoietic tumor.
[28] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to [27], wherein the hematopoietic tumor is leukemia.
[29] Leukemia is selected from the group consisting of acute myelogenous leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and myelodysplastic syndrome, [28]. A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described in.
[30] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to [29], wherein the leukemia is acute myeloid leukemia (AML).
[31] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to [30], wherein the hematopoietic tumor is a malignant lymphoproliferative disorder.
[32] A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment according to [31], wherein the malignant lymphoproliferative disorder is lymphoma.
[33] Used in the treatment according to [32], wherein the lymphoma is selected from the group consisting of multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt lymphoma, and follicular lymphoma (small cell type and large cell type). A pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for.
［３４］（ａ）免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）［１］〜［１４］のいずれかに記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
［３５］
（ｃ）ＣＡＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる工程をさらに含む、［３４］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
［３６］
前記免疫細胞がドナーから提供される、［３４］または［３５］に記載の製造方法。
［３９］
前記免疫細胞が患者自身から提供される、［３４］〜［３６］のいずれかに記載の製造方法。
[34] (a) Step of preparing immune cells,
(B) A step of expressing at least one CAR according to any one of [1] to [14] on the surface of the cell.
A method for producing a genetically modified immune cell, including.
[35]
(C) The method for producing a gene-modified immune cell according to [34], further comprising the step of growing CAR in vitro.
[36]
The production method according to [34] or [35], wherein the immune cells are provided by a donor.
[39]
The production method according to any one of [34] to [36], wherein the immune cells are provided by the patient himself / herself.
本発明により、従来のＣＤ２６を標的とするＣＡＲを遺伝子修飾した免疫細胞には見られない、良好な増殖効果、およびｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける優れた腫瘍抑制効果を有する、第３世代のＣＡＲ等を提供することができる。またそれにより、ＣＤ２６を発現する腫瘍細胞、特に造血器腫瘍細胞等に対して、従来にない臨床効果が期待できる。 According to the present invention, a third-generation CAR and the like, which have a good proliferative effect and an excellent tumor-suppressing effect in vivo and in vitro, which are not found in conventional immune cells genetically modified with CAR targeting CD26, etc. Can be provided. Further, it can be expected to have an unprecedented clinical effect on tumor cells expressing CD26, particularly hematopoietic tumor cells and the like.
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
以下、本発明について説明する。
Unless otherwise defined herein, all technical and scientific terms used are identical to those commonly understood by those skilled in the art of gene therapy, biochemistry, genetics, and molecular biology. It has meaning.
Hereinafter, the present invention will be described.
本発明の好ましい態様において、本発明は、
ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ、に関する。
In a preferred embodiment of the invention, the invention
A CD26-specific chimeric antigen receptor (hereinafter referred to as CAR).
(A) Extracellular ligand binding domain containing VH and VL derived from monoclonal anti-CD26 antibody,
(B) Hinge,
With respect to said CAR, which comprises (c) a transmembrane domain and (d) a cytoplasmic domain comprising a CD3ζ signaling domain and a costimulatory domain derived from 4-1BB and CD28.
本発明において、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。ＣＡＲは通常、細胞外単鎖抗体（ｓがＴ細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したものからなり、Ｔ細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるＣＡＲの一例は、ＣＤ２６抗原に対するＣＡＲである。
本発明おいて、「ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体」または「ＣＤ２６特異的ＣＡＲ」は、ＣＤ２６抗原を特異的に抗原認識するペプチドを指すが、これに加えて他のマーカーを認識する場合もある。
In the present invention, the "chimeric antigen receptor" or "CAR" is a binding domain for a component present on a target cell, eg, a desired antigen, in order to produce a chimeric protein exhibiting specific anti-target cell immunoreactivity. For example, it represents a molecule that combines antibody-based specificity against a tumor antigen) with an intracellular domain that activates a receptor on immune cells, preferably T cells. CAR usually consists of an extracellular single-chain antibody (s fused to the intracellular signaling domain of the T cell antigen receptor complex ζ chain, and when expressed in T cells, is an antigen based on the specificity of the monoclonal antibody. It has the ability to re-direct recognition. An example of a CAR used in the present invention is a CAR against the CD26 antigen.
In the present invention, "CD26-specific chimeric antigen receptor" or "CD26-specific CAR" refers to a peptide that specifically recognizes a CD26 antigen, but may also recognize other markers. ..
本発明において、特に明記されない限り、「抗体」という用語はその機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷または完全長抗体を包含する。
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体、あるいは抗体分子である。モノクローナル抗ＣＤ２６抗体とは、ＣＤ２６に対するモノクローナル抗体を意味する。
本発明において、モノクローナル抗ＣＤ２６抗体は、ヒト化抗体であってもよく、ヒ卜ＣＤ２６に特異的に結合する。
In the present invention, unless otherwise specified, the term "antibody" should be understood to include its functional antibody fragment. The term also includes intact or full-length antibodies, including antibodies of any class or subclass including IgG and its subclasses, IgM, IgE, IgA, and IgD.
In the present invention, the "monoclonal antibody" is an antibody or antibody molecule obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell. The monoclonal anti-CD26 antibody means a monoclonal antibody against CD26.
In the present invention, the monoclonal anti-CD26 antibody may be a humanized antibody and specifically binds to the humanized CD26.
「ヒト抗体」は、抗原負荷に応答して特定のヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウス由来の抗体である。この技術において、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素は、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された断絶を含有する胚幹細胞株から得られたマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを使用して、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅ A "human antibody" is an antibody derived from a transgenic mouse genetically engineered to produce a particular human antibody in response to antigen loading. In this technique, elements of the human heavy and light chain loci are introduced into mouse strains obtained from embryonic stem cell lines containing targeted disruptions of the endogenous heavy and light chain loci. Transgenic mice can synthesize human antibodies specific for human antigens, and mice can be used to produce human antibody-secreting hybridomas. Methods for obtaining human antibodies from transgenic mice are described in Greenetal. , NatureGenet. 7:13 (1994), Lombe
ｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により説明されている。ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、及びファージディスプレイ技術により構築することができ、これらは全て、当該技術分野において知られている。（例えば、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、インビトロでのヒト抗体及びその断片の産生に関して、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３を参照されたい）。この技術において、抗体可変ドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージの主要または微量外被タンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として表示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。このようにして、ファージは、Ｂ 細胞の特性のいくつかを模倣する。 rgetal. , Nature 368: 856 (1994), and Tyloletal. , Int. Immun. 6: 579 (1994). Human antibodies can also be constructed by gene or chromosomal transfection methods and phage display techniques, all of which are known in the art. (See, for example, McCaffertyetal., 1990, Nature 348: 552-553, for in vitro production of human antibodies and fragments thereof from the immunoglobulin variable domain gene repertoire from non-immunized donors). In this technique, the antibody variable domain gene is cloned in-frame into the major or trace coat protein gene of the fibrous bacteriophage and displayed as a functional antibody fragment on the surface of phage particles. Since fibrous particles contain single-stranded DNA copies of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody also results in selection of the gene encoding the antibody exhibiting those properties. In this way, phage mimic some of the properties of B cells.
ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができるが、それらの検討については、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎａｎｄＣｈｉｓｗｅｌｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成されてもよい。（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。 Phage display can be performed in a variety of formats, but see, for example, JohnsonandChishwell, CurrentOpinioninStructuralBiology 3: 5564-571 (1993) for a discussion of them. Human antibodies may also be produced by in vitro activated B cells. (See U.S. Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275).
本発明の抗ＣＤ２６抗体は、マウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０と同じエピ卜一プに結合する。ある実施態様において、本明細書において記載される抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいて、ヒ卜ＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０の結合を遮断する能力がある（マウスモノクロ一ナル抗体１４Ｄ１０と競合する）。本発明において、抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいてヒ卜ＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１Ｆ７の結合を遮断する能力がある（マウスモノクローナル抗体１Ｆ７と競合する）。 The anti-CD26 antibody of the present invention binds to the same epithelium as the mouse monoclonal antibody 14D10. In certain embodiments, the anti-CD26 antibody described herein is capable of blocking the binding of the mouse monoclonal antibody 14D10 to the mouse CD26 in a competitive assay (competing with the mouse monoclonal antibody 14D10). In the present invention, the anti-CD26 antibody is capable of blocking the binding of mouse monoclonal antibody 1F7 to human CD26 in a competitive assay (competing with mouse monoclonal antibody 1F7).
本発明において、モノクローナル抗ＣＤ２６抗体は、ヒト化抗体である「ＹＳ１１０」であってもよいがこれに限定されない。ヒ卜化抗ＣＤ２６抗体である「ＹＳ１１０」とは、重鎖定常領域が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列からなり、軽鎖定常領域が配列番号１８に記載されたアミノ酸配列からなる抗体を意味する。ＹＳ１１０についてはＷＯ２００８／１１４８７６を参照されたい。 In the present invention, the monoclonal anti-CD26 antibody may be, but is not limited to, the humanized antibody "YS110". "YS110", which is an anti-CD26 antibody, means an antibody in which the heavy chain constant region consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and the light chain constant region consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18. do. Please refer to WO2008 / 114876 for YS110.
本発明において、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができる場合がある。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＣＤ２６抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変断片を含む単鎖抗体断片を含むがこれに限定されない。さらに好ましい対応において、ＶＬおよびＶＨは、任意で、ヒト化されていてもよい。 In the present invention, the term "extracellular ligand binding domain" is defined as an oligopeptide or polypeptide capable of binding to a ligand, as used herein. Preferably, the domain may be able to interact with cell surface molecules. For example, extracellular ligand binding domains may be selected to recognize ligands that act as cell surface markers on target cells associated with a particular disease state. In a preferred embodiment, the extracellular ligand binding domain comprises a single chain antibody fragment comprising a variable fragment of a light chain (VL ) and a heavy chain ( VH ) of a target antigen-specific monoclonal anti-CD26 antibody conjugated by a flexible linker. Is not limited to this. In a more preferred response, VL and VH may optionally be humanized.
本発明において、可変断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２ 断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（ＶＨ）領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えばｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む。この用語は、遺伝子操作されたおよび／または他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖを包含する。特に好ましくは、ｓｃＦＶであるがこれに限定されない。
本発明において、「ドメイン」の用語は、一般的な意味を示し、タンパク質、ペプチド等の特定の機能を示す部分を指すが、これに限定されず、其の他の部分を含んでいてもよい。
In the present invention, the variable fragment is a fragment antigen binding (Fab) fragment, an F (ab') 2 fragment, a Fab'fragment, an Fv fragment, a recombinant IgG (rIgG) fragment, and a variable capable of specifically binding to an antigen. Includes a heavy chain (VH) region, a single chain antibody fragment containing a single chain variable fragment (scFv), and a functional (antigen binding) antibody fragment containing a single domain antibody (eg, sdAb, sdFv, Nanobody) fragment. The term refers to genetically engineered and / or otherwise modified forms of immunoglobulins such as intrabody, peptide body, chimeric antibody, fully human antibody, humanized antibody, and heteroconjugate antibody, multispecificity. For example, it includes bispecific antibodies, diabodies, tribodies, and tetrabodies, tandem di-scFv, tandem tri-scFv. Particularly preferred is scFV, but is not limited to this.
In the present invention, the term "domain" has a general meaning and refers to a portion indicating a specific function such as a protein or a peptide, but is not limited to this, and may include other portions. ..
本発明における好ましい態様において、本発明のＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、ヒンジを含んでいてもよい。本発明におけるヒンジは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にあってもよい。本明細書において使用される「ヒンジ」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、本明細書において、ヒトＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、もしくはＩｇＧ１の一部、またはこれらのポリペプチドとの好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＤ８αヒンジであるが、これに限定されない。
本発明の好ましい態様において、ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、膜貫通ドメインを含んでもよい。適切な膜貫通ドメインの特徴的は、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、特にＴ細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、またはδのようなＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、またはγ鎖、Ｆｃ受容体、具体的には、Ｆｃγ受容体ＩＩＩまたはＣＤタンパク質のサブユニット鎖であり得る。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のα鎖、β鎖、またはζ鎖等に由来し、すなわち少なくともその膜貫通領域含むものが含まれる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＣＤ２８であるが、これに限定されない。
本発明において、好ましいヒンジと膜貫通ドメインとの組み合わせは、ヒンジが、ＣＤ８αヒンジであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８であるが、これに限定されない。
本発明の一態様において、本発明のＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメインを含んでもよい。
In a preferred embodiment of the invention, the CD26-specific chimeric antigen receptor or CAR of the invention may comprise a hinge. The hinge in the present invention may be between the extracellular ligand binding domain and the transmembrane domain. As used herein, the term "hinge" usually means an oligopeptide or polypeptide that functions to link a transmembrane domain to an extracellular ligand binding domain. Specifically, the hinge region is used to provide more mobility and accessibility to the extracellular ligand binding domain. The hinge region may contain up to 300 amino acids, preferably 10-100 amino acids, most preferably 25-50 amino acids. The hinge region can be derived from all or part of a naturally occurring molecule, eg, all or part of the extracellular region of CD8, CD4, CD28, or all or part of the antibody constant region. Alternatively, the hinge region may be a synthetic sequence that corresponds to a naturally occurring hinge sequence, or may be a fully synthetic hinge sequence. In a preferred embodiment, the hinge domain herein is preferably at least 80%, more preferably at least 90%, 95% with a human CD8α chain, FcγRIIIα receptor, or part of IgG1, or a polypeptide thereof. , 97%, 99%, or 100% of hinge polypeptides showing sequence identity. A CD8α hinge is preferred, but is not limited thereto.
In a preferred embodiment of the invention, the CD26-specific chimeric antigen receptor or CAR may comprise a transmembrane domain. Characteristic of suitable transmembrane domains are expressed and intended targets on the surface of cells, preferably immune cells, particularly T cells, specifically lymphocytes or natural killer (NK) cells, etc. in the present invention. Includes the ability to interact together to direct the cellular response of immune cells to cells. The transmembrane domain can be of either natural or synthetic origin. The transmembrane domain can be derived from any membrane-bound protein or transmembrane protein. As a non-limiting example, transmembrane polypeptides are subunits of T cell receptors such as α, β, γ, or δ, polypeptides that make up the CD3 complex, IL2 receptor p55 (α chain). , P75 (β chain), or γ chain, Fc receptor, specifically a subunit chain of Fcγ receptor III or CD protein. In the transmembrane region, T cell receptors, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 α-chain, β-chain. , Or those derived from the ζ chain or the like, that is, those containing at least the transmembrane region thereof are included. Alternatively, the transmembrane domain may be synthetic and may contain predominantly hydrophobic residues such as leucine and valine. Particularly preferred is CD28, but is not limited to this.
In the present invention, the preferred combination of hinge and transmembrane domain is, but is not limited to, the hinge is a CD8α hinge and the transmembrane domain is CD28.
In one aspect of the invention, the CD26-specific chimeric antigen receptor or CAR of the invention may comprise a cytoplasmic domain comprising a CD3ζ signaling domain and a costimulatory domain derived from 4-1BB and CD28.
本発明に使用される細胞内ドメインは、同一分子内に存在する細胞外ドメインが抗原と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。
本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことがある。ＧＩＴＲの細胞内ドメインは、同一の機能を有するその変異体を含む。用語「変異体」は、１個又は数個〜複数個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む任意の変異体を意味するが、ただし、当該変異体は元の配列が保持していたものと同一の機能を実質的に保持する。例えば、本発明に使用するＧＩＴＲの細胞内ドメインは、ＧＩＴＲ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４１８６．１）のアミノ酸番号１９３〜２４１（配列番号２８）を含む細胞内ドメインが例示される。本発明のＣＡＲはＧＩＴＲの細胞内ドメインに加えて他のポリペプチドに由来する細胞内ドメインを使用することができる。このような細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体及び共刺激分子に由来する細胞質配列、並びにそれらの配列の同一の機能を有する任意の変異体が含まれる。ＴＣＲ複合体のみを介して発生されたシグナルはＴ細胞の活性化に不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。天然のＴ細胞活性化は、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲ複合体を介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって伝達されている。好適な態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとして、前記一次細胞質シグナル伝達配列及び／又は二次細胞質シグナル伝達配列を含む。
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。活性化を刺激する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第３８３−３８４頁（１９８９）］。一方、抑制的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含む［ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６２巻、第２号、第８９７−９０２頁（１９９９）］。本発明には、ＩＴＡＭ又はＩＴＩＭを有する細胞内ドメインが使用できる。
本発明で使用できるＩＴＡＭを有する細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを包含する。
The intracellular domain used in the present invention is a molecule capable of transmitting a signal intracellularly when an extracellular domain existing in the same molecule binds to (interacts with) an antigen.
The CAR of the present invention may include the intracellular domain of GITR as the intracellular domain. The intracellular domain of GITR contains its variants with the same function. The term "variant" means any variant containing one or several to multiple amino acid substitutions, deletions or additions, provided that the variant was retained by the original sequence. Substantially retains the same function. For example, the intracellular domain of GITR used in the present invention is exemplified by the intracellular domain containing amino acid numbers 193 to 241 (SEQ ID NO: 28) of GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1). The CAR of the present invention can use the intracellular domain derived from other polypeptides in addition to the intracellular domain of GITR. Such intracellular domains include cytoplasmic sequences derived from TCR complexes and co-stimulatory molecules, as well as any variant of those sequences having the same function. It is known that signals generated solely through the TCR complex are inadequate for T cell activation, and that secondary or co-stimulatory signals are also required. Native T-cell activation acts in two different types of cytoplasmic signaling sequences, ie, sequences that initiate antigen-dependent primary activation via the TCR complex (primary cytoplasmic signaling sequences) and antigen-independent. It is transmitted by a sequence that provides a secondary or co-stimulatory signal (secondary cytoplasmic signaling sequence). In a preferred embodiment, the CAR of the present invention comprises, as the intracellular domain, the primary cytoplasmic signaling sequence and / or the secondary cytoplasmic signaling sequence.
The primary cytoplasmic signaling sequence regulates the primary activation of the TCR complex. Primary cytoplasmic signaling sequences that stimulate activation may include signaling motifs known as immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) [Nature, Vol. 338, pp. 383-384 (Nature). 1989)]. On the other hand, the inhibitory primary cytoplasmic signaling sequence contains a signaling motif known as the immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) [Journal of Immunology (J Immunol.), Vol. 162, No. 2, 897-902 (1999)]. An intracellular domain having ITM or ITIM can be used in the present invention.
The intracellular domain having ITAM that can be used in the present invention includes, for example, ITAM derived from CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.
本発明によるＣＡＲのシグナリングドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナリングドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１種の活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナリングドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。 ＣＡＲにおいて使用するためのシグナリングドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナリングを開始するために協調的に作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナリングドメインには、細胞質シグナリング配列の２種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるＩＴＡＭとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例には、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれ得る。ＣＤ３ζシグナリングドメインが含まれ得る。 The signaling domain or intracellular signaling domain of CAR according to the present invention is responsible for intracellular signaling after binding of an extracellular ligand binding domain to a target, which results in immune cell activation and immune response. In other words, the signaling domain is responsible for the activation of at least one of the normal effector functions of the immune cell in which CAR is expressed. For example, the effector function of T cells can be cytolytic activity, or helper activity including the secretion of cytokines. Thus, the term "signaling domain" refers to the portion of a protein that transmits an effector signal function signal and directs the cell to perform a specialized function. Preferred examples of signaling domains for use in CAR are the cytoplasmic sequences of T cell receptors and co-receptors that act cooperatively to initiate signaling after antigen receptor association, as well as those having the same functional capacity. Can be a derivative or variant of the sequence and a synthetic sequence. The signaling domain has two distinct classes of cytoplasmic signaling sequences, one that initiates antigen-dependent primary activation and acts antigen-independently to provide secondary or co-stimulating signals. Things) are included. The primary cytoplasmic signaling sequence may include a signaling motif known as ITAM, which is an immunoreceptor-activating tyrosine motif. ITAM is a well-defined signaling motif found in the intracytoplasmic tail of various receptors that serves as a binding site for syk / zap70 class tyrosine kinases. Examples of ITAM used in the present invention include, but are not limited to, those derived from TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d. obtain. The CD3ζ signaling domain may be included.
本発明の別の形態において、細胞内シグナリングドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、いくつかの態様では、天然の状況ではそのような受容体と協調して作用し、抗原受容体結合後、シグナリングを開始する共受容体の配列、および／またはそのような分子の任意の誘導体もしくは変異体、および／または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。天然のＴＣＲに関しては、完全活性化は一般に、ＴＣＲを介するシグナリングだけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、完全な活性化を促進するために、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分もＣＡＲに含まれる。単一の免疫受容体活性化ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）、活性化ドメインと１つの共刺激ドメイン、または活性化ドメインと１もしくは複数の共刺激ドメインを有するＣＡＲに組み込むことができ、このＣＡＲはヘテロ二官能性ドメインの投与により分解される。
本発明に含まれる共刺激ドメインは、特に限定されないが、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、およびＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。好まし右派いくつかの態様では、同じＣＡＲは活性化成分と共刺激成分の両方を含み、他の態様では、活性化ドメインは１つのＣＡＲによって提供され、共刺激成分は別のＣＡＲまたは別の抗原を認識するリガンドによって提供される。
特定の実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３−ゼータ）細胞内ドメインに連結したＣＤ２８膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結したキメラＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはキメラＣＤ２７共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２７およびＤＡＰ１０共刺激ドメインを含む。
本発明の好ましい実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦＶを含む。本発明において「ｓｃＦＶを含む」とは一般的な意味を示し、ｓｃＦＶ以外のその他の断片を含んでいてもよく、また、断片に限らず慣用的な意味において、すべての抗体のいずれか１つ以上を含んでいてもよい。
In another embodiment of the invention, the intracellular signaling domain comprises the cytoplasmic sequence of a T cell receptor (TCR), and in some embodiments, in its natural context, it acts in concert with such receptor and antigen. Includes sequences of co-receptors that initiate signaling after receptor binding, and / or any derivative or variant of such molecule, and / or any synthetic sequence having the same functional capacity. For native TCRs, full activation generally requires not only TCR-mediated signaling, but also co-stimulation signals. Therefore, in some embodiments, the CAR also contains a component for generating a secondary or co-stimulating signal in order to promote complete activation. It can be integrated into a single immunoreceptor activation domain (eg, ITAM), a CAR with an activation domain and one co-stimulation domain, or a CAR with an activation domain and one or more co-stimulation domains, the CAR being heterozygous. It is degraded by administration of the bifunctional domain.
The co-stimulation domain included in the present invention is not particularly limited, but in some embodiments, the CAR is a signaling domain and / or a signal transduction domain of a co-stimulation receptor such as CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, and ICOS. Includes transmembrane portion. Preferable right wing In some embodiments, the same CAR contains both an activating component and a co-stimulating component, in other embodiments, the activating domain is provided by one CAR and the co-stimulating component is another CAR or another. Provided by a ligand that recognizes the antigen.
In certain embodiments, the intracellular signaling domain comprises a CD28 transmembrane domain and a signaling domain linked to the intracellular domain of CD3 (eg, CD3-zeta). In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD28 and CD137 (4-1BB, TNFRSF9) co-stimulating domain linked to the CD3 zeta intracellular domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD28 or CD137 (4-1BB, TNFRSF9) co-stimulating domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD28 and OX40 co-stimulating domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD27 co-stimulation domain. In some embodiments, the intracellular signaling domain comprises a chimeric CD27 and DAP10 co-stimulating domain.
In a preferred embodiment of the invention, the extracellular ligand binding domain comprises scFV. In the present invention, "including scFV" has a general meaning and may contain other fragments other than scFV, and is not limited to fragments and is any one of all antibodies in an idiomatic sense. The above may be included.
本発明の別の態様において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
本発明の好ましい形態において、ヒンジは、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、およびＩｇＧ１ヒンジより選択されるがこれに限定されない。特に好ましくはヒンジは、ＣＤ８αヒンジを含むが、これに限定されない。
本発明の好ましい形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８を含むが、これに限定されいない。
本発明の好ましい形態において、ヒンジがＣＤ８αヒンであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８である場合があるが、これに限定されない。
In another aspect of the invention, the signaling domain of the CAR of the invention comprises a co-stimulating signal molecule. Co-stimulatory molecules are cell surface molecules other than antigen receptors or their ligands that are required for an efficient immune response. A "co-stimulatory ligand" is a primary signal that specifically binds to a co-stimulatory molecule on a T cell, thereby providing, for example, by binding the TCR / CD3 complex to a peptide-loaded MHC molecule. In addition, refers to molecules on antigen-presenting cells that provide signals that mediate T cell responses, including, but not limited to, proliferation activation, differentiation, and the like. Co-stimulatory ligands include CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducible co-stimulatory ligand (ICOS-L), and cell-cell adhesion. Molecules (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, phosphotoxin β receptor, 3 / TR6, ILT3, ILT4, agonist or antibody that binds to the toll ligand receptor, and B7-H3. Ligsins that specifically bind to, but are not limited to, costimulatory ligands include, but are not limited to, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, Specific to co-stimulatory molecules present on T cells, such as ICOS, lymphocyte function-related antigen 1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, and ligands that specifically bind to CD83. Also included are antibodies that bind to.
In a preferred embodiment of the invention, the hinge is selected from, but not limited to, the FcRIIIα hinge, the CD8α hinge, and the IgG1 hinge. Particularly preferably, the hinge includes, but is not limited to, a CD8α hinge.
In a preferred embodiment of the invention, the transmembrane domain includes, but is not limited to, CD28.
In a preferred embodiment of the invention, the hinge may be CD8α hin and the transmembrane domain may be CD28, but not limited to.
本発明の好ましい形態において、本発明は、細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１アミノ酸番号２０〜２６０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなるＣＡＲに関する。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
本発明の別の態様において、本発明のＶＨおよびＶＬは腫瘍抗原の結合に寄与する。好ましくは本発明のＶＨおよびＶＬはＣＤ２６への結合に寄与する。
In a preferred embodiment of the invention, the invention comprises an extracellular ligand binding domain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 amino acid numbers 20-260, or with several amino acids deleted, substituted or added. Thereby relating to a CAR consisting of an amino acid sequence having 95% equivalence to each of the above sequences. Even if the equivalence is lower than 95%, there is no problem if it has a function, for example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, It may be 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
In another aspect of the invention, the VHs and VLs of the invention contribute to the binding of tumor antigens. Preferably the VHs and VLs of the present invention contribute to binding to CD26.
別の態様において、ＶＨが、配列番号１の１４５〜２６０より選択されるアミノ酸配列からなり、かつＶＬが、配列番号１の２１〜１２９より選択されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。 In another embodiment, the VH consists of the amino acid sequence selected from 145-260 of SEQ ID NO: 1 and the VL consists of the amino acid sequence selected from 21-129 of SEQ ID NO: 1 or several amino acids. May consist of an amino acid sequence having 95% equivalence to each of the above sequences by deletion, substitution, or addition. Even if the equivalence is lower than 95%, there is no problem if it has a function, for example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, It may be 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
本発明の一態様において、膜貫通ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３１４〜３８４のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。 In one embodiment of the invention, the transmembrane domain consists of the amino acid sequence represented by the amino acid sequence of amino acids 314-384 of SEQ ID NO: 1, or by deletion, substitution, or addition of several amino acids. It may consist of an amino acid sequence having 95% equivalence to each of the above sequences. Even if the equivalence is lower than 95%, there is no problem if it has a function, for example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, It may be 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
本発明の一態様において、ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号１のアミノ酸番号４２７〜５３９で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合があるがこれに限定されない。 In one embodiment of the invention, the CD3ζ signaling domain consists of the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 427-539 of SEQ ID NO: 1, or by deletion, substitution, or addition of several amino acids, respectively. It may consist of, but is not limited to, an amino acid sequence having 95% equivalence to the sequence of.
本発明の別の態様において、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは天然のポリペプチドに由来するものでもよく、人為的に設計したものでもよい。天然のポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から取得することができる。例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。また、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、例えば長さが２〜１０個のアミノ酸配列からなるリンカーを、膜貫通ドメインと前記（ｂ）の細胞内ドメインとの間に配置することができる。特にグリシン−セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。
本発明の一態様において、本発明の４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが配列番号（３８５〜４２６）で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなっていてもよい。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
In another aspect of the invention, the CAR comprises a transmembrane domain. The transmembrane domain may be derived from a natural polypeptide or may be artificially designed. Transmembrane domains from native polypeptides can be obtained from any membrane binding or transmembrane protein. For example, T cell receptor α, β chain, CD3ζ chain, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154. , GITR transmembrane domains can be used. Also, artificially designed transmembrane domains are polypeptides that primarily contain hydrophobic residues such as leucine and valine. It is also preferred that phenylalanine, tryptophan and valine triplets are found at each end of the synthetic transmembrane domain. Optionally, a short oligopeptide or polypeptide linker, eg, a linker consisting of an amino acid sequence of 2-10 length, can be placed between the transmembrane domain and the intracellular domain of (b) above. In particular, a linker sequence having a glycine-serine continuous sequence can be used.
In one embodiment of the invention, the 4-1BB-derived co-stimulation domain of the invention consists of the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO: (385-426), or several amino acids are deleted, substituted or added. Thereby, it may consist of an amino acid sequence having 95% equivalent to each of the above sequences. Even if the equivalence is lower than 95%, there is no problem if it has a function, for example, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, It may be 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%.
本発明の別の態様において、ＣＤ２８由来の共刺激ドメインが配列番号（３４４〜３８４）で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。 In another aspect of the invention, the CD28-derived co-stimulation domain consists of the amino acid sequence set forth by SEQ ID NO: (344-384), or by deletion, substitution, or addition of several amino acids. It may consist of an amino acid sequence with 95% equivalence to each sequence.
本発明の一側面として、本発明のＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含んでもよい。シグナルペプチドは多くの分泌タンパク質、膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５〜３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして前記に例示したタンパク質分子の多くはシグナルペプチド配列を有していることから、これらのシグナルペプチドを本発明のＣＡＲのシグナルペプチドとして使用することができる。
本発明の別の態様として、シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸番号１〜２０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合があるがこれに限定されない。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
As one aspect of the invention, the CAR of the invention may further comprise a signal peptide. The signal peptide is present at the N-terminus of many secretory proteins, membrane proteins, and has a length of 15 to 30 amino acids. Since many of the protein molecules exemplified above as the intracellular domain have a signal peptide sequence, these signal peptides can be used as the signal peptide of the CAR of the present invention.
As another aspect of the present invention, the signal peptide consists of the amino acid sequences represented by
ＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド
本発明は、好ましい態様として、本発明のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチドに関する。本発明は、本発明による抗ＣＤ２６ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、本発明による抗ＣＤ３３ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１種を含むベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターにも関する。 ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。
A polynucleotide encoding a CAR The present invention relates to a polynucleotide encoding a CAR of the present invention as a preferred embodiment. The present invention also relates to a vector comprising at least one of a polynucleotide encoding an anti-CD26 CAR according to the invention, a polynucleotide encoding an anti-CD33 CAR according to the invention, preferably a lentiviral vector. Polynucleotides are expression cassettes or expression vectors (eg, plasmids for introduction into bacterial host cells, or viral vectors such as baculovirus vectors for transfection of insect host cells, or transfection of mammalian host cells. Can be present in a plasmid or viral vector, such as a lentivirus for.
具体的な態様において、２Ａペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされた２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２００８）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。
In a specific embodiment, one polynucleotide or vector comprising a nucleic acid sequence encoding a ribosome skip sequence, such as a sequence encoding a 2A peptide, may include a different nucleic acid sequence. The 2A peptide identified in the aftvirus subgroup of picornavirus causes a ribosome "skip" from one codon to the next, where no peptide bond is formed between the two amino acids encoded by the codon ((Donnelly). And Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)). "Codon" means 3 nucleotides on an mRNA (or sense strand of a DNA molecule) that is translated into one amino acid residue by the ribosome. Thus, when a polypeptide is separated by an in-
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、２種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。 To direct a transmembrane polypeptide to the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence, or presequence) is provided within the polynucleotide or vector sequence. The secretory signal sequence is functionally linked to the transmembrane nucleic acid sequence. That is, the two sequences are bound in the correct reading frame and positioned so that the newly synthesized polypeptide is directed into the secretory pathway of the host cell. The secretory signal sequence is generally located at 5'of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide of interest, but certain secretory signal sequences may be located elsewhere in the nucleic acid sequence of interest (eg, Welch et al.). , U.S. Pat. No. 5,037,743; see Holland et al., U.S. Pat. No. 5,143,830).
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識する。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
本発明の別の態様において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、特定されたＣＡＲのアミノ酸配列から常法により容易に作製することができる。前記に記載した各ドメインのアミノ酸配列を示すＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び／又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製できる。例えば、これらの塩基配列をもとに、ポリヌクレオチドを合成することができ、また、ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
Those skilled in the art recognize that considerable sequence variation is possible in these polynucleotide molecules, given the degeneracy of the genetic code. Preferably, the nucleic acid sequences of the invention are codon-optimized for expression in mammalian cells, preferably in human cells. Codon optimization refers to the exchange of codons, which are normally rare in a given species of highly expressed gene, with codons that are generally more frequent in such species of highly expressed gene in the sequence of interest. Such codons encode amino acids as codons to be exchanged.
In another aspect of the invention, the invention provides a polynucleotide encoding the CAR of the invention. The polynucleotide encoding CAR can be easily prepared by a conventional method from the amino acid sequence of the specified CAR. It is possible to obtain a base sequence encoding an amino acid sequence from the NCBI RefSeq ID indicating the amino acid sequence of each domain described above or the Accession number of GenBank, and standard molecular biological and / or chemical procedures can be used. Can be used to make the polynucleotides of the invention. For example, a polynucleotide can be synthesized based on these base sequences, and a polynucleotide of the present invention can be prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using a polymerase chain reaction (PCR). can do.
本発明のポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別のポリヌクレオチドと連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、ポリヌクレオチドの効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含むポリヌクレオチドを連結してもよい。また、更に本発明のポリヌクレオチドに加えて、当該ポリヌクレオチドの発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
本発明の好ましい局面として、前記ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターに関する。
The polynucleotide of the invention can be linked to another polynucleotide so that it is expressed under the control of a suitable promoter. As the promoter, any one that constitutively promotes expression, one that is induced by a drug or the like (for example, tetracycline or doxorubicin) can be used. Also, in order to achieve efficient transcription of a polynucleotide, a polynucleotide containing a promoter or other regulatory element that cooperates with a transcription initiation site, such as an enhancer sequence or a terminator sequence, may be ligated. Further, in addition to the polynucleotide of the present invention, a gene that can be a marker for confirming the expression of the polynucleotide (for example, a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, a gene encoding a fluorescent protein, etc.) is incorporated. But it may be.
As a preferred aspect of the present invention, the present invention relates to an expression vector containing the polynucleotide.
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。 The term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked. The "vector" in the present invention includes a viral vector, a plasmid, an RNA vector, or a linear or circular DNA molecule or RNA molecule which may consist of a chromosomal nucleic acid, a non-chromosomal nucleic acid, a semi-synthetic nucleic acid, or a synthetic nucleic acid. , Not limited to these. Preferred vectors are those capable of autonomous replication of the nucleic acids to which they are linked (episome vector) and / or those capable of expression (expression vector). A number of suitable vectors are known to those of skill in the art and are commercially available.
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
Viral vectors include retrovirus, adenovirus, parvovirus (eg, adeno-associated virus), coronavirus, orthomixovirus (eg, influenza virus), rabdovirus (eg, mad dog disease virus and bullous stomatitis virus), paramixo. Negative-strand RNA viruses such as viruses (eg, measles and Sendai), plus-strand RNA viruses such as picornavirus and alphavirus, and adenovirus, herpesvirus (eg,
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、３種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスＲＮＡが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のＤＮＡへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスＤＮＡである。「組込みレンチウイルスベクター（またはＬＶ）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはＮＩＬＶ）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。 "Lentiviral vectors" are extremely promising for gene delivery due to their relatively large packaging capacity, reduced immunogenicity, and their ability to stably transduce a wide range of different cell types with high efficiency. , HIV-based lentiviral vector. Lentiviral vectors are usually produced after transient transfection of three or more plasmids (packaging, envelope, and transfer) into producing cells. Similar to HIV, lentiviral vectors invade target cells through the interaction of viral surface glycoproteins with receptors on the cell surface. After invasion, viral RNA undergoes reverse transcriptase mediated by the viral reverse transcriptase complex. The product of reverse transcription is double-stranded linear viral DNA, which serves as a substrate for viral integration into the DNA of infected cells. "Integrated lentiviral vector (or LV)" means, as a non-limiting example, such a vector that can be integrated into the genome of a target cell. Conversely, "non-integrated lentiviral vector (or NILV)" means an efficient gene delivery vector that is not integrated into the genome of the target cell through the action of viral integrase.
送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。
細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。
「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。
Delivery vectors and vectors may be associated with or combined with cell permeation treatment techniques such as sonoporation or electroporation, or variants of these techniques.
Cells represent living eukaryotic cells, primary cells, and cell lines derived from these organisms for in vitro culture.
"Primary cells" have undergone little population doubling and are therefore the main function of the tissue from which they are derived compared to tumorigenic continuous cell lines or artificially immortalized cell lines. Represents cells taken directly from living tissue (ie, biopsy material) and established for growth in vitro, which better represent the components and characteristics.
非限定的な例として、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；Ｍｏｌｔ ４細胞からなる群より選択される。
これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。
As a non-limiting example, the cell lines are CHO-K1 cells; HEK293 cells; Caco2 cells; U2-OS cells; NIH3T3 cells; NSO cells; SP2 cells; CHO-S cells; DG44 cells; K-562 cells, U. -937 cells; MRC5 cells; IMR90 cells; Jurkat cells; HepG2 cells; HeLa cells; HT-1080 cells; HCT-116 cells; Hu-h7 cells; Hubec cells; Molt 4 cells.
All of these cell lines can be modified by the methods of the invention to provide a cell line model for the production, expression, quantification, detection and study of genes or proteins of interest; Models can also be used to screen for bioactive molecules of interest in various areas such as research and fabrication, as well as non-limiting examples of chemicals, biofuels, therapeutics, and agriculture.
ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞
本発明の好ましい態様において、本発明は、本発明のＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞に関する。
本発明の、ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、本発明のＣＡＲを発現する細胞は、前記のＣＡＲをコードするペプチドが導入、発現した細胞である。
本発明の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やＣＡＲの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、ＴＣＲの発現が抑制されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、ＣＤ２６の発現が抑制されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、少なくとも１種の免疫抑制剤または化学療法剤に対して耐性になるよう修飾されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
Immune Cell Expressing CAR on Cell Surface Membrane In a preferred embodiment of the invention, the present invention relates to an immune cell expressing CAR on the cell surface membrane.
The cell expressing the CAR of the present invention, which expresses the CAR on the cell surface membrane of the present invention, is a cell into which the peptide encoding the above-mentioned CAR has been introduced and expressed.
The cell of the present invention is activated by transmitting a signal into the cell by binding to a specific antigen via CAR. The activation of cells expressing CAR differs depending on the type of host cell and the intracellular domain of CAR, and can be confirmed, for example, by using cytokine release, cell proliferation rate improvement, cell surface molecule change, and the like as indicators. .. For example, the release of cytotoxic cytokines (tumor necrosis factor, lymphotoxin, etc.) from activated cells results in the destruction of antigen-expressing target cells. In addition, it stimulates other immune cells such as B cells, dendritic cells, NK cells, macrophages, etc. by releasing cytokines and changing cell surface molecules.
In another aspect of the invention, the genetically modified immune cells of the invention are genetically modified from inflammatory T lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T lymphocytes, or helper T lymphocytes. It may be an immune cell.
In another aspect of the invention, the gene-modified immune cell of the invention may be a gene-modified immune cell in which the expression of TCR is suppressed.
In another aspect of the present invention, the gene-modified immune cell of the present invention may be a gene-modified immune cell in which the expression of CD26 is suppressed.
In another aspect of the invention, the genetically modified immune cell of the invention is a genetically modified immune cell that has been modified to be resistant to at least one immunosuppressive or chemotherapeutic agent. May be.
医薬組成物
本発明の好ましい態様において、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明に係の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物に関する。
本発明の一態様において、本発明は、患者がヒトである、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患が、ＣＤ２６発現細胞を特徴とする前癌性または癌疾患である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患がＣＤ２６発現細胞の過剰量を特徴とする疾患である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患が、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、 疾患が、造血器腫瘍である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、造血器腫瘍が、白血病である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、造血器腫瘍が、悪性リンパ増殖性障害である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
Pharmaceutical Compositions In a preferred embodiment of the invention, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells according to the invention for use in the treatment of a disease.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the patient is a human.
In one aspect of the invention, the invention is also a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the disease is a precancerous or cancerous disease characterized by CD26 expressing cells. good.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the disease is a disease characterized by an excess of CD26 expressing cells.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the disease is kidney cancer, prostate cancer, or lung cancer.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the disease is a hematopoietic tumor.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the hematopoietic tumor is leukemia.
In one aspect of the invention, the invention comprises a group of leukemias consisting of acute myelogenous leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and myelodysplastic syndrome. It may be a pharmaceutical composition containing genetically modified immune cells for use in the above-mentioned treatment, which is more selected.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the leukemia is acute myeloid leukemia (AML).
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the hematopoietic tumor is a malignant lymphoproliferative disorder.
In one aspect of the invention, the invention may be a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for use in the treatment described above, wherein the malignant lymphoproliferative disorder is lymphoma.
In one aspect of the invention, the invention is described above, wherein the lymphoma is selected from the group consisting of multiple myeloma, non-Hodgkin's lymphoma, Burkitt lymphoma, and follicular lymphoma (small cell and large cell types). It may be a pharmaceutical composition containing genetically modified immune cells for use in treatment.
本発明は、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態を治療するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態を治療するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物は、本明細書中に記載される抗体等のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６の異常発現に関連する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は変更したまたは異常なＣＤ２６発現に関連する状態である（いくつかの実施形態では、上昇または減少したＣＤ２６発現（正常試料に比べて）ならびに／あるいはＣＤ２６発現を通常欠く組織および／もしくは細胞における発現の存在またはＣＤ２６発現を通常有する組織もしくは細胞におけるＣＤ２６発現の欠如等の不適切な発現）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６過剰発現に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は少なくとも部分的にＣＤ２６により媒介される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６を発現する細胞に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６を発現する細胞の増殖に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞の増殖は異常である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞は腫瘍細胞であり、腫瘍細胞は悪性または良性であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、癌細胞がＣＤ２６＋癌細胞であるかＣＤ２６を発現する（つまり、ＣＤ２６発現癌）癌である（ＣＤ２６を発現するさらなる細胞は上記に記載される）。 The present invention further provides a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for treating a condition associated with CD26 expression in a subject. In some embodiments, a pharmaceutical composition comprising genetically modified immune cells for treating a condition associated with CD26 expression in a subject is effective comprising a polypeptide such as an antibody described herein. Includes administering to a subject an amount of the composition. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is associated with abnormal expression of CD26. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is a condition associated with altered or abnormal CD26 expression (in some embodiments, increased or decreased CD26 expression (compared to normal samples) and / Alternatively, improper expression such as the presence of expression in tissues and / or cells that normally lack CD26 expression or lack of CD26 expression in tissues or cells that normally have CD26 expression). In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is a condition associated with CD26 overexpression. In some embodiments, the conditions associated with CD26 expression are at least partially mediated by CD26. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is a condition associated with cells expressing CD26. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is a condition associated with the proliferation of cells expressing CD26. In some embodiments, the proliferation of cells expressing CD26 is abnormal. In some embodiments, the cell expressing CD26 is a T cell. In some embodiments, the cells expressing CD26 are tumor cells, which may be malignant or benign. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is that the cancer cell is a CD26 + cancer cell or a cancer that expresses CD26 (ie, CD26-expressing cancer) (further cells that express CD26 are described above. Ru).
いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態は増殖性障害である。いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態は癌である。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ２６＋血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞リンパ腫等のＴ細胞癌である。たとえば、いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫または急性リンパ芽球性白血病である。他の実施形態では、癌は、Ｔ細胞ＣＤ３０＋未分化大細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、末梢Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病、または成人Ｔ細胞白血病である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、膵癌、腎臓癌、またはリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｂ細胞癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、脳癌、リンパ癌、皮膚癌、骨癌、直腸癌、肉腫、肺癌、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、またはＢ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ２６の過剰発現に関連する。いくつかの実施形態では、癌は中皮腫ではない。いくつかの実施形態では、癌は黒色腫ではない。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は腎癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌腫である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は炎症性疾患または炎症性障害である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患はＣＤ２６の過剰発現に関連する。
他の実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は血管新生である。
In some embodiments, the condition associated with CD26 expression in the subject is a proliferative disorder. In some embodiments, the condition associated with CD26 expression in the subject is cancer. In some embodiments, the cancer is a CD26 + hematological malignancies. In some embodiments, the cancer is a T-cell cancer such as T-cell lymphoma. For example, in some embodiments, the cancer is T-cell lymphoblastic lymphoma or acute lymphoblastic leukemia. In another embodiment, the cancer is T cell CD30 + anaplastic large cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is peripheral T-cell lymphoma, T-cell chronic lymphocytic leukemia, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, angiocentral T-cell lymphoma, HTLV-related T-cell leukemia, or adult T-cell leukemia. be. In some embodiments, the cancer is a solid tumor. In some embodiments, the cancer is pancreatic cancer, kidney cancer, or lymphoma. In some embodiments, the cancer is B-cell cancer, thyroid cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colon cancer, bladder cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, testis cancer, uterine cancer, brain cancer, lymph cancer, Skin cancer, bone cancer, rectal cancer, sarcoma, lung cancer, B-cell chronic lymphocytic leukemia, or B-cell lymphoma. In some embodiments, the cancer is associated with overexpression of CD26. In some embodiments, the cancer is not mesothelioma. In some embodiments, the cancer is not melanoma. In some embodiments, the cancer is lymphoma, kidney cancer, prostate cancer, or lung cancer. In some embodiments, the cancer is lymphoma. In some embodiments, the cancer is a renal carcinoma. In some embodiments, the cancer is a prostate carcinoma. In some embodiments, the cancer is lung cancer.
In some embodiments, the condition associated with CD26 expression is an inflammatory disease or disorder. In some embodiments, the inflammatory disease is associated with overexpression of CD26.
In another embodiment, the condition associated with CD26 expression is angiogenesis.
さらなる実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、これらに限定されないが、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患または自己免疫障害等の活性化された免疫状態を伴う状態である。いくつかの実施形態では、状態は、アジソン病、脱毛、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、慢性疲労症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、狼瘡、メニエール多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、脈管炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、活性化された免疫状態を伴う状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連する。 In a further embodiment, the condition associated with CD26 expression is, but is not limited to, a condition associated with an activated immune condition such as graft-versus-host disease and autoimmune disease or autoimmune disorder. In some embodiments, the condition is Addison's disease, hair loss, tonic spondylitis, antiphospholipid antibody syndrome, Bechet's disease, chronic fatigue syndrome, Crohn's disease, ulcerative colitis, diabetes, fibromyalgia, Goodpasture's syndrome. , Graves' disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), scab, Meniere multiple sclerosis, severe myasthenia, pemphigus vulgaris, primary biliary cirrhosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, rheumatoid fever, sarcoidosis, strong Dermatosis, vasculitis, leukoplakia, or Wegener's granulomatosis. In some embodiments, the condition with activated immune status is associated with overexpression of CD26.
遺伝子修飾された免疫細胞の製造
本発明の好ましい態様において、本発明は、
（ａ）免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法の関する。
本発明のさらなる態様において、本発明は、
（ｃ）ＣＡＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる工程をさらに含む、前記の遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法に関する。
本発明のさらなる態様において、本発明は、
本発明の一態様において、本発明のＣＡＲを発現する細胞の製造方法は、前記に記載するＣＡＲをコードするポリペプチドを細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で実施される。例えば、本発明のポリペプチドを含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
Production of Genetically Modified Immune Cells In a preferred embodiment of the invention, the invention
(A) Step of preparing immune cells,
(B) A step of expressing at least one CAR according to any one of
Involved in methods of producing genetically modified immune cells, including.
In a further aspect of the invention, the invention
(C) The present invention relates to a method for producing the above-mentioned gene-modified immune cell, further comprising a step of growing CAR in vitro.
In a further aspect of the invention, the invention
In one aspect of the present invention, the method for producing a cell expressing the CAR of the present invention is characterized by comprising the step of introducing the polypeptide encoding the CAR described above into the cell. The step is performed ex vivo. For example, it can be produced by transforming cells in vitro using a viral vector or a non-viral vector containing the polypeptide of the present invention.
本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）］、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。Ｔ細胞には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたＣＡＲを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞にポリペプチドを導入することが好ましい。 The method of the present invention can use mammalian cells such as cells derived from humans or cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows and dogs. The cells used in the method of the present invention are not particularly limited, and any cells can be used. For example, cells collected, isolated, purified, or induced from blood (peripheral blood, cord blood, etc.), body fluids such as bone marrow, tissues or organs can be used. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), immune cells [dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages, monocytes, NK cells or bloodline cells (neutrophils, basal cells)], umbilical cord blood mononuclear cells, Fibroblasts, precursor fat cells, hepatocytes, cutaneous keratinized cells, mesenchymal stem cells, adipose stem cells, various cancer cell lines or nerve stem cells can be used. In the present invention, it is particularly preferable to use T cells, T cell progenitor cells (hematopoietic stem cells, lymphocyte progenitor cells, etc.) or cell populations containing these. T cells include CD8-positive T cells, CD4-positive T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, or tumor-infiltrating lymphocytes. Cell populations containing T cells and T cell progenitor cells include PBMCs. The cells may be collected from a living body, expanded and cultured, or established as a cell line. When it is desired to transplant the produced CAR-expressing cell or a cell differentiated from the cell into a living body, it is preferable to introduce the polypeptide into the living body itself or a cell collected from the same kind of living body. ..
本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドをベクターに挿入して、このベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。 A polypeptide encoding the CAR of the present invention can be inserted into a vector and the vector can be introduced into cells. For example, retrovirus vector (including oncoretrovirus vector, lentivirus vector, pseudotype vector), adenovirus vector, adeno-associated virus (AAV) vector, Simian virus vector, vaccinia virus vector or Sendai virus vector, Epstein-Bar. A virus vector such as a virus (EBV) vector or an HSV vector can be used. As the above-mentioned viral vector, one having a defect in replication ability so as not to be self-replicating in infected cells is suitable.
また、リポソーム及び国際公開第９６／１００３８号パンフレット、国際公開第９７／１８１８５号パンフレット、国際公開第９７／２５３２９号パンフレット、国際公開第９７／３０１７０号パンフレット及び国際公開第９７／３１９３４号パンフレット（いずれも、出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも本発明に使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明のポリペプチドを導入することができる。 In addition, liposomes and International Publication No. 96/10038 Pamphlet, International Publication No. 97/18185 Pamphlet, International Publication No. 97/25329 Pamphlet, International Publication No. 97/30170 Pamphlet and International Publication No. 97/31934 pamphlet (either Also, a non-viral vector can be used in the present invention in combination with a condensing agent such as a cationic lipid described in the present specification). In addition, the polypeptide of the invention can be introduced into cells by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran, electroporation, particle bombardment.
例えばレトロウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号公報）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０−６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。 For example, when using a retroviral vector, it is possible to select appropriate packaging cells based on the LTR sequence and packaging signal sequence possessed by the vector, and prepare and carry out retroviral particles using this. can. For example, PG13 (ATCC CRL-10686), PA317 (ATCC CRL-9078), GP + E-86 and GP + envelopeAm-12 (US Pat. No. 5,278,056), Psi-Crip [Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 85, No. 6460-6464 (1988)] packaging cells are exemplified. In addition, retrovirus particles can be produced using 293 cells or 293T cells having high transfection efficiency. Retroviral vectors prepared based on many types of retroviruses and packaging cells that can be used for packaging the vectors are widely marketed by various companies.
ポリペプチドを細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる［例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット（いずれも出典明示により本明細書の一部とする）］。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン又はＤＥＡＥ−デキストランを使用することができる。 In the process of introducing a polypeptide into cells, functional substances that improve the introduction efficiency can also be used [for example, International Publication No. 95/26200 Pamphlet, International Publication No. 00/01836 pamphlet (both are books by explicit source). Make it part of the specification)]. Examples of the substance that improves the introduction efficiency include a substance having an activity of binding to a viral vector, for example, a substance such as fibronectin or a fibronectin fragment. Preferably, a fibronectin fragment having a heparin binding site, for example, a fragment commercially available as retronectin (RetroNectin, registered trademark, CH-296, manufactured by Takara Bio Inc.) can be used. In addition, polybrene, fibroblast growth factor, V-type collagen, polylysine or DEAE-dextran, which are synthetic polycations having an action of improving the efficiency of infecting cells of retrovirus, can be used.
本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコ又はバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。 In a preferred embodiment of the present invention, the functional substance is immobilized on a suitable solid phase, for example, a container (plate, petri dish, flask or bag, etc.) or carrier (microbeads, etc.) used for cell culture. Can be used in.
本発明のＣＡＲを発現する細胞は、前記（３）の製造方法により、前記のＣＡＲをコードするポリペプチドが導入・発現した細胞である。本発明の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やＣＡＲの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。 The cell expressing the CAR of the present invention is a cell in which the polypeptide encoding the CAR is introduced / expressed by the production method (3). The cell of the present invention is activated by transmitting a signal into the cell by binding to a specific antigen via CAR. The activation of cells expressing CAR differs depending on the type of host cell and the intracellular domain of CAR, and can be confirmed, for example, by using cytokine release, cell proliferation rate improvement, cell surface molecule change, and the like as indicators. .. For example, the release of cytotoxic cytokines (tumor necrosis factor, lymphotoxin, etc.) from activated cells results in the destruction of antigen-expressing target cells. In addition, it stimulates other immune cells such as B cells, dendritic cells, NK cells, macrophages, etc. by releasing cytokines and changing cell surface molecules.
ＣＡＲを発現する細胞は疾患の治療剤として使用することができる。該治療剤は、ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいてもよい。該賦形剤としては、例えば、本発明のポリペプチドを活性成分として含む組成物に関して記載された上述の薬学的に許容できる賦形剤、種々の細胞培養培地、等張食塩水などが挙げられる。ＣＡＲを発現する細胞が投与される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん［血液がん（白血病）、固形腫瘍など］、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。前記の疾患において減少もしくは消失が望まれる細胞が有している抗原、すなわち腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等に結合する本発明のＣＡＲを発現する細胞がこれら疾患の治療のために投与される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含む治療剤は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。本発明の別の形態において、本発明は、前記免疫細胞がドナーから提供される、前記の製造方法にも関する。 Cells expressing CAR can be used as a therapeutic agent for diseases. The therapeutic agent contains cells expressing CAR as an active ingredient, and may further contain a suitable excipient. Examples of the excipient include the above-mentioned pharmaceutically acceptable excipients described for the composition containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient, various cell culture media, isotonic saline solution and the like. .. The disease to which the cells expressing CAR are administered is not particularly limited as long as it is a disease that is sensitive to the cells, but for example, cancer [blood cancer (leukemia), solid tumor, etc.], inflammatory disease, etc. / Examples are infectious diseases caused by autoimmune diseases (asthma, eczema), hepatitis, viruses such as influenza and HIV, bacteria and fungi, such as tuberculosis, MRSA, VRE and deep fungal diseases. A cell expressing CAR of the present invention that binds to an antigen possessed by a cell whose reduction or disappearance is desired in the above-mentioned disease, that is, a tumor antigen, a viral antigen, a bacterial antigen, or the like is administered for the treatment of these diseases. .. The cells of the present invention can also be used for bone marrow transplantation, prevention of infectious diseases after irradiation, donor lymphocyte infusion for the purpose of relieving recurrent leukemia, and the like. Therapeutic agents containing CAR-expressing cells as an active ingredient are, but are not limited to, intradermal, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intraarterial, and intravenous by parenteral administration, eg, injection or infusion. It can be administered internally, intratumorally, or intraefferent lymph vessels. In another embodiment of the invention, the invention also relates to said manufacturing method, wherein the immune cells are provided by a donor.
例１．ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ ＣＡＲの検出
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２ ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリートメントプレートに２０μｇ／ｍｌに調整したレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ）を１ｗｅｌｌあたり２００μＬ加え、４℃で１２時間静置した。２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５００μＬをｗｅｌｌに加え、３０分室温でブロッキングを行った。２％ＢＳＡ／ＰＢＳでｗｅｌｌを洗浄後、レトロウイルス上清をレトロネクチン処理プレートに加え、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／１ｗｅｌｌずつ加え、５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、細胞をｗｅｌｌの底面に接着させた。細胞は適宜培地を添加し、導入３日後から適宜フラスコ等に拡大培養した。ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ＣＡＲの発現は、導入３日後に細胞をＰＢＳ５０μＬに懸濁し、Ｔａｇ（Ｆｃ）が付加されたリコンビナントＣＤ２６（Ａｂｃａｍ）０．５μＬ（１μｇ／μＬ）を加えたのち２０分室温で静置し、その後ＰＥで蛍光標識された抗Ｆｃ抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）１μＬを添加し、２０分氷冷後にＦＡＣＳ Ｃａｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ Ｊｏで解析した。ＣＤ２６ ＣＡＲ ２ｎｄとＣＤ２６ ＣＡＲ ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６ ＣＡＲが検出された（図２Ａ）。
Example 1. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated CD3 / CD28 Dynabeads (Invitrogen) with 25 μL / 1 × 10 6 cells and recombinant IL-2 30 U / mL was added to the detection transduction Day-2 of CD26 CAR introduced into PBMCs. Culture was started in RPMI 1640 medium (10% FCS). To
例２．ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ８ＣＡＲの検出
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２ ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリートメントプレートに２０μｇ／ｍｌに調整したレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ ｂｉｏ）を１ｗｅｌｌあたり２００μＬ加え、４℃で１２時間静置した。２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５００μＬをｗｅｌｌに加え、３０分室温でブロッキングを行った。２％ＢＳＡ／ＰＢＳでｗｅｌｌを洗浄後、レトロウイルス上清をレトロネクチン処理プレートに加え、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／１ｗｅｌｌずつ加え、５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、細胞をｗｅｌｌの底面に接着させた。細胞は適宜培地を添加し、導入３日後から適宜フラスコ等に拡大培養した。ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ＣＡＲの発現は、導入３日後に細胞をＰＢＳ１００μＬに懸濁し、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを添加し、２０分氷冷後にＦＡＣＳ Ｃａｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ Ｊｏで解析した。
なお、ＣＡＲ導入前のＰＢＭＣｓ は約３５％がもともとＣＤ８陽性である。ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄもしくはＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄの導入によってＧＦＰ陽性となった細胞でＣＤ８ＣＡＲが検出された（図２Ｂ）。
Example 2. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated CD3 / CD28 Dynabeads (Invitrogen) with 25 μL / 1 × 10 6 cells and recombinant IL-2 30 U / mL was added to the detection transduction Day-2 of CD8 CAR introduced into PBMCs. Culturing was started in RPMI1640 medium (10% FCS). To
About 35% of PBMCs before the introduction of CAR are originally CD8 positive. CD8CAR was detected in GFP-positive cells by introduction of CD8CAR2nd or CD8CAR3rd (FIG. 2B).
例３．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現
ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現は、形質導入後３日目にＡＰＣで標識された抗ＣＤ２６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて検討した。細胞をそれぞれＰＢＳ１００μＬに懸濁し、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ２６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１．０μＬを添加し２０分氷冷した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ Ｊｏで解析した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６の発現は低下していた（図３Ａ）。
Example 3. CD26 expression after CD26 CAR introduction CD26 expression after transduction of CD26 CAR was examined using an APC-labeled anti-CD26 antibody (BioLegend) 3 days after transduction. Each cell was suspended in 100 μL of PBS, 1.0 μL of anti-CD26 antibody (BioLegend) fluorescently labeled with APC was added, ice-cooled for 20 minutes, and then detected by FACS Cant (BD Biosciences). The results were analyzed by Flow Jo. The expression of CD26 was decreased in both CD26CAR2nd and CD26CAR3rd (FIG. 3A).
例４．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８ｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２ ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリーメントプレートに１ｗｅｌｌあたりＰＢＭＣｓ５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを１ｍｌ加えて形質導入した。なお、形質導入しない細胞、ＣＤ８ＣＡＲを形質導入する細胞、ＣＤ２６ＣＡＲを形質導入する細胞は各２ｗｅｌｌずつ形質導入した。適宜リコンビナントＩＬ−２ ３０Ｕ／Ｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）を添加し、Ｄａｙ３に２ｗｅｌｌずつ形質導入していた細胞を回収し、１つのフラスコに拡大し細胞培養した。以後、適宜培地を足して拡大し、Ｄａｙ６にＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を１サンプルにつき２５μＬ加えた。ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖は、Ｄａｙ１０に細胞数をカウントして比較した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれも、ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄやＣＤＣＡＲ ３ｒｄと同様に増殖した（図４Ａ）。
Example 4. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated CD3 / CD28ynabeads (Invitrogen) with 25 μL / 1 × 10 6 cells and recombinant IL-2 30 U / mL was added to RPMI1640 on the cell proliferation transduction Day-2 after CD26 CAR introduction. Culture was started in medium (10% FCS).
例５．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ６９発現
ＣＡＲ導入後Ｄａｙ１０のＰＢＭＣｓを１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ、ＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに、それぞれ１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加えて１２時間共培養したのち、プレートを４００×ｇ、３分遠心分離した。上清を除去した後、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１μＬを加え、２０分氷冷した後に、ＰＢＳ２００μＬを加えてプレートを４００×ｇ，３ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後、上清を除去しＰＢＳ２００μＬを加え、再度４００×ｇ、３分遠心分離し、上清を除去しＰＢＳ２００μを加えてＦＡＣＳ Ｃａｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ Ｊｏで解析した。リンパ球の活性化に伴って発現するＣＤ６９は、ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ６９の発現誘導が認められた（図５Ａ）。
Example 5. CD69 expression after CD26 CAR introduction After CAR introduction, PBMCs of
例６．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＩＦＮ−γ産生
リンパ球の活性化に伴って分泌されるＩＦＮ−γは、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ Ｄｕｏ Ｓｅｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、プロトコールに沿ってＥＬＩＳＡ法で確認した。まず、ＣＡＲ導入後Ｄａｙ１０のＰＢＭＣｓを１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ、ＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに、それぞれ１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加えて１２時間共培養した。また、ＥＬＩＳＡ前日にプレートに４μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで調整したＣａｐｔｕｒｅ Ａｂ １００μＬ を加えて室温で一晩静置した。上清を除去した後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）３００μＬを加えてブロッキングを行い、室温で１時間静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。プレートに細胞培養後の上清１００μＬを加え、２時間静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４００ｎｇ／ｍｌとなるよう調整したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｂを１００μＬ加えた後１時間室温で静置し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを１００μＬ加え、３０分室温で静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １００μＬを加えた。３０分室温で静置後、ＴＭＢ ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ５０μＬを加えて、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで測定した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＩＦＮ−γの分泌が認められた（図６Ａ）。
Example 6. IFN-γ secreted with the activation of IFN-γ-producing lymphocytes after the introduction of CD26CAR was confirmed by the ELISA method using Human IFN-gamma Duo Set (R & D System) according to the protocol. First, after CAR introduction, PBMCs of
例７．ＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果は、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＰＢＭＣｓ（エフェクター細胞）を、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＣＤ２６陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞（ターゲット細胞）と共培養したのち、ルシフェラーゼ活性の測定によりターゲット細胞数を定量した。
Example 7. Antitumor effect of CD26CAR (in vitro)
For the antitumor effect of CD26CAR in vitro, PBMCs (effector cells) after introduction of CD26CAR are co-cultured with CD26-positive Karpas299 cells (target cells) into which a luciferase gene has been introduced, and then the number of target cells is quantified by measuring the luciferase activity. did.
まず、ターゲット細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに１００μＬずつ加えた。エフェクター細胞を、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ；Ｔ）を１０：１、５：１、１：１となるように細胞濃度を調整して１００μＬずつ各３ｗｅｌｌに添加した。陰性コントロールとして、Ｅ：Ｔ＝０：１の群として、ＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬを各３ｗｅｌｌ添加した。プレートを２４時間培養し、Ｓｔｅａｄｙ Ｇｒｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、プロトコールに沿って確認した。まず、培養後のプレートを４００×ｇ、５分遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳ５０μＬを加えて、よくピペッティングした後、細胞を別プレートに移した。再度４００×ｇ、５分遠心分離した後上清を除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを２５μＬずつ添加し、５分室温で静置し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを測定した。その結果、エフェクター細胞とターゲット細胞の比１：１において、ＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄの抗腫瘍効果はＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄのそれに優っていた（ｐ＝０．００５）。このことは、エフェクター細胞とターゲット細胞の比５：１においても確認された（ｐ＝０．０１３）。一方、コントロールのＣＤ８ ＣＡＲ ３ｒｄには、１：１、５：１、１０：１のいずれにおいても細胞傷害性を認めなかったが、ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄはその比が高まるにつれて細胞傷害性を発揮し、１０：１においてはＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄとの間に有意差を認めた（ｐ＝０．０１３）。この事は、第２世代ＣＡＲの導入によって活性化したエフェクター細胞は非特異的に細胞を傷害することを意味しており、ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄがターゲット細胞に発揮する抗腫瘍効果はＣＤ２６の発現によって制御されない可能性、すなわち実臨床においては副作用の可能性を示唆している（図７Ａ）。 First, target cells were adjusted to 1 × 10 5 cells / ml with RPMI 1640 medium and 100 μL each was added to a 96-well plate. Effector cells were added to each 3 well by adjusting the cell concentration so that the Effector: Target ratio (E; T) was 10: 1, 5: 1, 1: 1. As a negative control, 100 μL of RPMI 1640 medium was added as a group of E: T = 0: 1 in 3 wells each. The plates were cultured for 24 hours and confirmed according to the protocol using the Steady Gro Luciferase Assay System (Promega). First, the cultured plate was centrifuged at 400 × g for 5 minutes, and the supernatant was removed. After adding 50 μL of PBS and pipetting well, the cells were transferred to another plate. After centrifuging at 400 × g for 5 minutes again, the supernatant was removed, 25 μL of Luciferase substrate was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the luminescence was measured. As a result, the antitumor effect of CD26CAR3rd was superior to that of CD26CAR2nd at a ratio of effector cells to target cells of 1: 1 (p = 0.005). This was also confirmed at a ratio of effector cells to target cells of 5: 1 (p = 0.013). On the other hand, the control CD8 CAR 3rd did not show cytotoxicity in any of 1: 1, 5, 1, and 10: 1, but CD8 CAR2nd exhibited cytotoxicity as the ratio increased. In No. 1, a significant difference was observed from CD8CAR3rd (p = 0.013). This means that the effector cells activated by the introduction of the second generation CAR non-specifically damage the cells, and the antitumor effect exerted by CD26 CAR2nd on the target cells may not be regulated by the expression of CD26. It suggests sex, that is, the possibility of side effects in clinical practice (Fig. 7A).
本発明は、ＣＤ２６を発現する腫瘍細胞を対象としたＣＡＲ−Ｔ療法を臨床において行うための基礎的な技術となる。 The present invention is a basic technique for clinically performing CAR-T therapy for tumor cells expressing CD26.
Claims (37)
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ。 A CD26-specific chimeric antigen receptor (hereinafter referred to as CAR).
(A) Extracellular ligand binding domain containing VH and VL derived from monoclonal anti-CD26 antibody,
(B) Hinge,
The CAR comprising (c) a transmembrane domain and (d) a cytoplasmic domain comprising a CD3ζ signaling domain and a co-stimulating domain from 4-1BB and CD28.
（ｂ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。 (A) Step of preparing immune cells,
(B) A step of expressing at least one CAR according to any one of claims 1 to 14 on the surface of the cell.
A method for producing a genetically modified immune cell, including.
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