JP2022000003A - Nucleic acid extraction method and water treatment system for organism - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、生体の核酸抽出方法及び水処理システムに関する。 The present disclosure relates to a nucleic acid extraction method and a water treatment system for a living body.
例えば、ゲノム解析、定性(検出、同定)・定量、大量複製(増幅、増殖)などを行うため、食品、医療・医薬品、農業の技術分野を中心としたあらゆる技術分野で、ウイルス、原核生物(真正細菌、古細菌)、真核生物(藻類、原生生物、菌類、粘菌)、小型動物(ワムシなど)などの微生物や、動植物、人の組織などの各種生体から核酸を抽出/回収する手法に関する研究開発が盛んに行われている。 For example, for genome analysis, qualitative (detection, identification) / quantification, mass replication (amplification, proliferation), etc., in all technical fields centered on food, medical / pharmaceutical, and agricultural technical fields, viruses and eukaryotes ( Techniques for extracting / recovering nucleic acids from microorganisms such as eubacteria (eubacteria), eukaryotes (algae, protozoa, fungi, slime), small animals (worms, etc.), and various living organisms such as animals, plants, and human tissues. Research and development is being actively carried out.
このような核酸抽出方法に関する研究開発成果は、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法などの遺伝子増幅法を用いた検査の迅速化、高精度化、高効率化などに活かされている。 The results of research and development on such a nucleic acid extraction method have been utilized for speeding up, improving accuracy, and improving efficiency of tests using a gene amplification method such as the PCR (polymerase chain reaction) method.
また、定量的PCR(qPCR)法は、各種排水などの水処理を行った後の処理水を河川や湖沼、海、地下水等の公共水域に放流するにあたり、環境や漁業、人等への悪影響を防ぐため、処理水に含まれる微生物等の定量検査、ひいては排水基準、環境基準等に係るコンプライアンスなど、放流水の管理に用いる場合もある。 In addition, the quantitative PCR (qPCR) method has an adverse effect on the environment, fisheries, people, etc. when the treated water after water treatment such as various wastewaters is discharged to public water areas such as rivers, lakes, seas, and groundwater. In order to prevent this, it may be used for the management of discharged water, such as quantitative inspection of microorganisms contained in treated water, and compliance with wastewater standards, environmental standards, etc.
ここで、定量的PCR法による微生物の検査精度、すなわち定量精度を確保するためには、例えば、サンプリングなどして得られた試料水(試料液)からこれに含まれる微生物の核酸の抽出効率/回収率を極力高めることが重要になる。 Here, in order to ensure the inspection accuracy of microorganisms by the quantitative PCR method, that is, the quantitative accuracy, for example, the extraction efficiency of the nucleic acid of the microorganism contained therein from the sample water (sample solution) obtained by sampling or the like / It is important to increase the recovery rate as much as possible.
これに対し、特許文献1では、微生物溶解酵素反応処理の前と後の抽出用溶液に対し、圧力サイクル処理又は超音波処理を行うことで、効率よく微生物由来の核酸を回収できるようにしている。
On the other hand, in
また、微生物由来の核酸の回収率を高めるために、エタノール沈殿を行う際に、DNAと共沈するtRNA、グリコーゲンなどの多糖類、ポリアクリルアミドなどのキャリアを添加する手法も多用されている。 Further, in order to increase the recovery rate of nucleic acid derived from microorganisms, a method of adding a carrier such as tRNA co-precipitating with DNA, a polysaccharide such as glycogen, or polyacrylamide is often used when performing ethanol precipitation.
しかしながら、圧力サイクル処理や超音波処理、キャリアを用いるなどの従来の核酸抽出、精製手法は、操作が非常に複雑で、多大な時間を要する、高コスト化するなどの問題があった。 However, conventional nucleic acid extraction and purification methods such as pressure cycle treatment, ultrasonic treatment, and the use of carriers have problems such as extremely complicated operation, a large amount of time, and high cost.
このため、従来と比較し、より容易で効率的に、且つ優れた核酸抽出率で効果的に微生物などの生体の核酸抽出が行える手法が強く望まれていた。 Therefore, there has been a strong demand for a method capable of extracting nucleic acid of a living body such as a microorganism more easily, efficiently, and effectively with an excellent nucleic acid extraction rate as compared with the conventional method.
本開示は、上記事情に鑑み、微生物などの生体の核酸をより効率的で、且つ著しく優れた高抽出(回収)率で抽出することを可能にする生体の核酸抽出方法及びこれを用いる水処理システムを提供することを目的とする。 In view of the above circumstances, the present disclosure discloses a nucleic acid extraction method for a living body that enables more efficient extraction of nucleic acid of a living body such as a microorganism with a remarkably excellent high extraction (recovery) rate, and a water treatment using the same. The purpose is to provide a system.
本開示の生体の核酸抽出方法の一態様は、生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び前記次亜塩素酸ナトリウムを添加した前記試料液から核酸抽出対象の前記微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。 One aspect of the method for extracting nucleic acid in a living body of the present disclosure is to add sodium hypochlorite to a sample solution for extracting nucleic acid in a living body so that the concentration is within a concentration range predetermined in advance by a test. The present invention includes a step of adding sodium hypochlorite and a nucleic acid extraction step of extracting the nucleic acid of the microorganism to be extracted from the sample solution to which the sodium hypochlorite is added.
本開示の水処理システムの一態様は、処理対象の水の水質を改善する水処理部と、上記の生体の核酸抽出方法を用い、前記水を前記水処理部で処理した後の処理水の中の生体量を定量する生体定量部と、前記生体定量部で定量した前記生体量が予め設定した設定値以下の場合に前記処理水を排出する排水部と、を備えた。 One aspect of the water treatment system of the present disclosure is a water treatment unit that improves the water quality of the water to be treated, and the treated water after the water is treated by the water treatment unit using the above-mentioned biological nucleic acid extraction method. It is provided with a biometric unit for quantifying the biometric amount in the water, and a drainage unit for discharging the treated water when the biometric amount quantified by the biometric unit is equal to or less than a preset set value.
なお、本開示における「生体」とは、微生物(顕微鏡などを用いなければ肉眼でその存在を判別できないほどの大きさの生体、ウイルスを含む)だけでなく、人間、動植物などの多細胞生物の一部を構成する組織(血液なども含む)などを含む。
また、本開示における「試料液」は、生体の核酸抽出が行われるための「液体の試料」を意味するものである。
The term "living organism" as used in the present disclosure refers to not only microorganisms (including living organisms and viruses whose existence cannot be discerned with the naked eye without using a microscope), but also multicellular organisms such as humans, animals and plants. Includes tissues that make up a part (including blood).
Further, the "sample solution" in the present disclosure means a "liquid sample" for performing nucleic acid extraction of a living body.
本開示の生体の核酸抽出方法によれば、微生物などの生体の核酸をより効率的で、且つ著しく優れた高抽出(回収)率で抽出することを可能になる。 According to the method for extracting nucleic acid in a living body of the present disclosure, it becomes possible to extract nucleic acid in a living body such as a microorganism more efficiently and with a remarkably excellent high extraction (recovery) rate.
本開示の水処理システムによれば、上記の生体の核酸抽出方法を用いて処理水の検査を行うことで、信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 According to the water treatment system of the present disclosure, it is possible to realize highly reliable water treatment by inspecting the treated water using the above-mentioned nucleic acid extraction method for living organisms.
以下、図1から図4を参照し、一実施形態に係る生体の核酸抽出方法及び水処理システムについて説明する。 Hereinafter, a method for extracting nucleic acid of a living body and a water treatment system according to an embodiment will be described with reference to FIGS. 1 to 4.
ここで、本実施形態においては、本開示の水処理システムが工業排水などの排水を処理して公共水域に放流する、もしくは処理水を再利用するための水処理システムであるものとして説明を行う。また、本実施形態では、本開示の生体の核酸抽出方法を本実施形態の水処理システムで処理した処理水中の微生物(ウイルスを含む:生体)の核酸を抽出し、放流、再利用の前に処理水の処理状況を確認、管理するために用いるものとして説明を行う。
但し、本実施形態の水処理システムや生体の核酸抽出方法は、その適用、用途、方法を本実施形態のように限定する必要はなく、あらゆる水処理、あらゆる生体の核酸抽出を要するケースに適用可能である。
なお、本実施形態では、以下、「生体の核酸抽出方法」を「微生物の核酸抽出方法」という。
Here, in the present embodiment, it is assumed that the water treatment system of the present disclosure is a water treatment system for treating wastewater such as industrial wastewater and discharging it to a public water area, or for reusing the treated water. .. Further, in the present embodiment, the nucleic acid extraction method of the living body of the present disclosure is used to extract the nucleic acid of a microorganism (including a virus: living body) in the treated water treated by the water treatment system of the present embodiment, and before the release and reuse. The explanation will be given as it is used to confirm and manage the treatment status of treated water.
However, the water treatment system of the present embodiment and the nucleic acid extraction method of a living body do not need to be limited in its application, use and method as in the present embodiment, and are applied to cases where any water treatment and nucleic acid extraction of a living body are required. It is possible.
In the present embodiment, the "nucleic acid extraction method for living organisms" is hereinafter referred to as "nucleic acid extraction method for microorganisms".
(水処理システム)
本実施形態の水処理システム1は、図1に示すように、検出対象の微生物を含有し得る工業排水などの排水(処理対象の水)W1を一時的に貯留する貯水部2と、排水W1を浄化処理、すなわち、水質を改善するための水処理部3と、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、水処理部3で浄化処理した後の処理水W2からサンプリングした試料液(試料、試料水)W2’を用い、処理水W2中の微生物量(生体量)を計測(定量)するための微生物定量部(生体定量部)4と、微生物定量部4で微生物の微生物量が予め設定した設定値以下の場合に処理水W2を排出する排水部5と、を備えて構成されている。
(Water treatment system)
As shown in FIG. 1, the
水処理部3は、例えば、活性汚泥法などの生物処理や、凝集沈殿、ろ過、UV照射などの高度処理などの物理化学的処理を施し、排水中のN(窒素)、P(リン)、C(有機炭素などの炭素)、重金属類などの有害物質の除去、分離、濃度調整、その他、pHの調整などの適宜必要な処理を行い、処理対象の排水W1に対し浄化処理を施す。
The
微生物定量部4は、水処理部3で処理した後の処理水W2に対し、処理水W2中に含有する微生物を定量し、排出の要否を判定するために具備されている。
The
この微生物定量部4では、例えば、排水部5から処理水W2を河川、湖沼、海などの公共水域等に放流した場合に、あるいは処理水W2を再生水として再利用するような場合に、自然環境、漁業や農業などの産業、人等への悪影響、不都合な事象を発生させ得る微生物を検出し、その微生物量の定量を行う。なお、処理水W2中に微生物の存在によって悪影響、不都合な事象を発生させる場合だけでなく、存在していることが好ましい微生物を検出、定量することも勿論あり得る。
In the
なお、本実施形態における微生物(生体)としては、例えば、ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、結核菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、レンサ球菌、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス、ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、HIVなど、あらゆるウイルス、原核生物(真正細菌、古細菌)、真核生物(藻類、原生生物、菌類、粘菌)、小型動物(ワムシなど)などが挙げられる。すなわち、本実施形態における微生物は、その検出、定量を要するあらゆる微生物(ウイルスを含む)が対象となる。なお、本開示の生体の核酸抽出方法における生体には、多細胞生物の一部を構成する組織なども含まれ、生体を必ずしも微生物に限定しなくてもよい。 Examples of the microorganism (living body) in the present embodiment include staphylococcus, Escherichia coli, Salmonella, pyogenic, cholera, diarrhea, charcoal, tuberculosis, botulinum, tetanus, rentha, and tinea. Candida, Aspergillus, Norovirus, Rotavirus, Influenza virus, Adenovirus, Coronavirus, Meadow virus, Ruin virus, Hepatitis virus, Herpesvirus, HIV, etc. Examples include algae, protozoa, fungi, slime molds), small animals (worms, etc.). That is, the microorganisms in the present embodiment are all microorganisms (including viruses) that need to be detected and quantified. In addition, the living body in the nucleic acid extraction method of the living body of the present disclosure includes tissues constituting a part of multicellular organisms, and the living body does not necessarily have to be limited to microorganisms.
ちなみに、河川や海などの公共水域などに処理水W2を放流する場合には、漁業への影響を十分に考慮することが求められる。例えば、フグやハマチ、カキ、サケなどの養殖場においては、微生物由来の病気の発症などを防ぐために多大な労力、コストを要している。このため、処理水W2放流する放流箇所の付近への影響だけでなく、広域への影響を考慮することが重要とされている。また、農業など、他の業種に対しても同様であり、さらに、動植物、人などへの影響も当然に考慮することが求められる。 Incidentally, when the treated water W2 is discharged into a public water area such as a river or the sea, it is required to fully consider the influence on the fishing industry. For example, in aquaculture farms such as blowfish, yellowtail, oysters, and salmon, a great deal of labor and cost are required to prevent the onset of diseases derived from microorganisms. Therefore, it is important to consider not only the influence on the vicinity of the discharge point where the treated water W2 is discharged but also the influence on a wide area. The same applies to other industries such as agriculture, and it is naturally required to consider the impact on animals, plants and people.
本実施形態の微生物定量部4は、処理水W2からサンプリングした試料液W2’に対し、検出・定量対象の微生物の細胞壁、細胞膜、細胞質、その他、核酸を囲繞するように存在する組織などを破壊(溶解)し、核酸(DNA及び/又はRNA)を抽出する。なお、ウイルスの場合は、カプシッド、エンベロープなどを破壊して核酸を抽出する。
The
そして、定量的PCR法などのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて、抽出した核酸を増幅するとともにその定量を行う。
定量的PCR(qPCR)法は、周知の通り、決められたサイクル数までの一連のPCRによって発生した蛍光物質を測定する手法であり、qPCR検査での核酸合成を計測し、蛍光強度から鋳型DNA(主にcDNA)の量(核酸量)を求めることができる。このため、食品、医療分野だけでなく、各種排水W1などの水処理を行った後の処理水W2を河川や湖沼、海、地下水等の公共水域などに放流するにあたり、処理水W2に含まれる微生物等の定量検査、ひいては排水基準、環境基準等に係るコンプライアンスなど、放流水の管理などにも用いられている。なお、主な定量的PCR法としては、i)MPN−PCR法、ii)競合的PCR法、iii)定量的リアルタイムPCR法などが挙げられる。
Then, the extracted nucleic acid is amplified and quantified by using a PCR (polymerase chain reaction) method such as a quantitative PCR method.
As is well known, the quantitative PCR (qPCR) method is a method for measuring a fluorescent substance generated by a series of PCRs up to a predetermined number of cycles. Nucleic acid synthesis in a qPCR test is measured, and template DNA is measured from the fluorescence intensity. The amount of (mainly cDNA) (nucleic acid amount) can be determined. Therefore, not only in the food and medical fields, but also in the treated water W2 when the treated water W2 after water treatment such as various wastewaters W1 is discharged to public water areas such as rivers, lakes, marshes, seas, and groundwater. It is also used for quantitative inspection of microorganisms, and for management of discharged water such as compliance with wastewater standards and environmental standards. Examples of the main quantitative PCR method include i) MPN-PCR method, ii) competitive PCR method, and iii) quantitative real-time PCR method.
核酸(遺伝子)の量は、Ct値(Threshhold Cycle)を測定することで算出することができる。Ct値とは、一定の増幅産物量になるPCRサイクル数を意味し、Ct値は標的となる核酸の初期量に反比例することから、Ct値を測定することで、核酸の量を算出することができる。 The amount of nucleic acid (gene) can be calculated by measuring the Ct value (Thrshhold Cycle). The Ct value means the number of PCR cycles that results in a constant amount of amplification product, and since the Ct value is inversely proportional to the initial amount of the target nucleic acid, the amount of nucleic acid is calculated by measuring the Ct value. Can be done.
具体的には、例えば、まず、既知のDNA量を含む試料を段階希釈した標準液列を用いて、初期DNA量に応じて等間隔に並んだ増幅曲線を得る。増幅曲線が立ち上がる地点に閾値を設定し、増幅曲線と交わる点をCt値として求める。次に、Ct値と初期DNA量との間で直線の検量線を作成する。そして、未知のDNA量を含む試料についても同様にCt値を測定し、検量線と照らし合わせることで未知のDNA量を含む試料の初期DNA量を求める。 Specifically, for example, first, an amplification curve arranged at equal intervals according to the initial amount of DNA is obtained by using a standard liquid train in which a sample containing a known amount of DNA is serially diluted. A threshold value is set at the point where the amplification curve rises, and the point where the amplification curve intersects is obtained as the Ct value. Next, a straight calibration curve is created between the Ct value and the initial DNA amount. Then, the Ct value is measured in the same manner for the sample containing the unknown DNA amount, and the initial DNA amount of the sample containing the unknown DNA amount is obtained by comparing with the calibration curve.
なお、より簡易的な定量方法として、PCRの結果として得られた増幅曲線のうち、直線的な部分を選択し、当該部分を外挿して算出された切片における蛍光強度を初期核酸量として用いてもよい。 As a simpler quantification method, a linear portion is selected from the amplification curves obtained as a result of PCR, and the fluorescence intensity in the section calculated by extrapolating the portion is used as the initial nucleic acid amount. May be good.
ここで、本実施形態の微生物定量部4で核酸の量を定量する手法は、微生物の核酸量を定量することが可能であれば、例えば、培養法、FRET(Fluorescent resonance energy transfer)法、CPRINS−FISH(Cycling primed in situ amplification−fluorescence in situ hybridization)法などを用いてもよく、必ずしもPCR法(定量的PCR法)に限定しなくてもよい。
Here, the method for quantifying the amount of nucleic acid in the
本実施形態の水処理システム1では、微生物定量部4での微生物の定量検査に基づいて、処理水W2中の微生物量が適正であると判断された場合には、排水部5に処理水W2を送り、この排水部5から、適宜、工業水域に放流したり、再生水として再利用する。また、処理水W2中の微生物量が適正であると判断された場合には、例えば、排水部5に送る前に、あるいは排水部5から返送ライン6を通じて貯水部2に処理水W2を返送する。
In the
ここで、従来、核酸増幅を行う前処理としての微生物の核酸抽出方法としては、例えば、微生物を熱処理する方法、界面活性剤を添加する方法、フェノール抽出法、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、DNA抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーの使用などが用いられている。また、これらの方法を2種以上組み合わせて行うケースもある。 Here, conventionally, as a method for extracting a nucleic acid of a microorganism as a pretreatment for amplifying a nucleic acid, for example, a method of heat-treating a microorganism, a method of adding a surfactant, a phenol extraction method, an osmotic shock method, a freeze-thaw method, and the like. Enzyme digestion methods, use of DNA extraction kits, sonication methods, French press methods, use of homogenizers, etc. are used. In addition, there are cases where two or more of these methods are combined.
しかしながら、本願の発明者の鋭意研究によって、上記従来の微生物などの生体の核酸抽出方法は多大な時間や労力、コストを要する上、核酸抽出効率が低くなるケースがあることが確認された。このため、より容易で効率的且つ優れた核酸抽出効率で効果的に微生物などの生体の核酸を抽出可能な方法の開発が求められ、本願の発明者はこの点に関する研究に注力し、本開示の生体の核酸抽出方法を発明にするに至った。 However, through diligent research by the inventor of the present application, it has been confirmed that the conventional nucleic acid extraction method for living organisms such as microorganisms requires a great deal of time, labor and cost, and the nucleic acid extraction efficiency may be low. Therefore, it is required to develop a method capable of extracting living nucleic acids such as microorganisms more easily, efficiently and effectively with excellent nucleic acid extraction efficiency, and the inventor of the present application has focused on research on this point and disclosed the present invention. We have invented a method for extracting nucleic acids from living organisms.
(微生物などの生体の核酸抽出方法)
本実施形態の微生物の核酸抽出方法は、微生物の核酸増幅を行う前工程(前処理工程)として、微生物の核酸抽出が行われるための試料液W2’に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように酸化剤を添加する酸化剤添加工程と、酸化剤を添加した試料液W2’から核酸抽出対象の微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、を備える。
また、本実施形態の酸化剤添加工程は次亜塩素酸ナトリウム添加工程であり、酸化剤として次亜塩素酸(次亜塩素酸ナトリウム溶液)を添加する。
(Nucleic acid extraction method for living organisms such as microorganisms)
The method for extracting nucleic acid of a microorganism of the present embodiment is within a concentration range predetermined by a test with respect to a sample solution W2'for extracting nucleic acid of a microorganism as a pre-step (pretreatment step) for amplifying the nucleic acid of the microorganism. It is provided with an oxidant addition step of adding an oxidant so as to have a concentration of the above, and a nucleic acid extraction step of extracting the nucleic acid of the nucleic acid to be extracted from the sample solution W2'to which the oxidant is added.
Further, the oxidant addition step of the present embodiment is a sodium hypochlorite addition step, and hypochlorous acid (sodium hypochlorite solution) is added as an oxidant.
さらに、本実施形態の微生物の核酸抽出方法は、酸化剤の次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程(酸化剤濃度決定工程)を備える。
この次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における前記試験では、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液W2’を用意し、定量的PCR法を用い、それぞれの試料液W2’に対して、図2に示すようなアンプリコン増幅曲線(PRCサイクルと蛍光強度の関係の曲線)を作成する。そして、得られたアンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する。
Further, the method for extracting a microorganism nucleic acid of the present embodiment includes a sodium hypochlorite concentration determining step (oxidizing agent concentration determining step) for determining a concentration range of sodium hypochlorite as an oxidizing agent.
In the test in the step of determining the sodium hypochlorite concentration, a plurality of sample solutions W2'with different sodium hypochlorite concentrations were prepared, and a quantitative PCR method was used for each sample solution W2'. An amplicon amplification curve (curve of the relationship between the PRC cycle and the fluorescence intensity) as shown in FIG. 2 is created. Then, the concentration range of sodium hypochlorite is determined based on the obtained amplicon amplification curve.
そして、必要に応じて添加した次亜塩素酸ナトリウムを中和処理した後の試料液W2’に対して、従来の核酸抽出、精製、定量の操作を行う。例えば、Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2(日鉄環境株式会社製)などの検査キットを用い、プロトコールに従い、試料液W2’に対して微生物の核酸の抽出及び精製を行う。 Then, the conventional nucleic acid extraction, purification, and quantification operations are performed on the sample liquid W2'after the neutralization treatment of the added sodium hypochlorite as needed. For example, Extrap Soil DNA Kit Plus ver. Using a test kit such as 2 (manufactured by Nippon Steel Environment Co., Ltd.), the nucleic acid of the microorganism is extracted and purified from the sample solution W2'according to the protocol.
したがって、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及びこれを用いた水処理システム1においては、PCR法などの核酸抽出を行う前段の前工程として、本願の発明者の鋭意研究の成果に基づき、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程、次亜塩素酸ナトリウム添加工程を備え、試料液W2’に対し核酸抽出を行う微生物に応じた濃度となるように次亜塩素酸ナトリウム(次亜塩素酸ナトリウム溶液)を添加する。これにより、従来と比較し、格段に優れた核酸抽出率(核酸回収率)で核酸を抽出することが可能になる。本願の発明者の鋭意研究の成果としては、図2及び図3に示すように、従来(0重量ppm(以下、ppmと記載))と比較して10〜100倍の核酸抽出率の向上効果が確認されている。なお、図3の縦軸は、無処理のDNA初期濃度を1とした場合のDNA初期濃度の相対値であり、横軸は、次亜塩素酸ナトリウム濃度である。
Therefore, in the nucleic acid extraction method for microorganisms of the present embodiment and the
すなわち、本願の発明者による格別顕著な知見、研究成果に基づいて、核酸抽出対象の微生物(細胞壁、細胞膜などの破壊の困難性/容易性)に対応した濃度になるように適量の次亜塩素酸ナトリウムを試料に添加するだけで、従来よりも格段に優れた核酸抽出を実現することが可能になる。 That is, based on the exceptionally remarkable findings and research results by the inventor of the present application, an appropriate amount of hypochlorite is used so as to have a concentration corresponding to the microorganism (difficulty / ease of destruction of cell wall, cell membrane, etc.) to be extracted with nucleic acid. By simply adding sodium acid acid to the sample, it becomes possible to realize much better nucleic acid extraction than before.
言い換えれば、細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの溶解(破壊)の困難性/容易性が異なる各種の核酸抽出対象の微生物に対し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、核酸を痛めることなく、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。 In other words, nucleic acids can be extracted by simply adjusting the concentration of sodium hypochlorite for various nucleic acid target microorganisms that have different difficulty / ease of lysis (destruction) of cell walls, cell membranes, cytoplasms, capsids, envelopes, etc. Nucleic acid can be extracted with a very excellent nucleic acid extraction rate by suitably destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. without damaging the nucleic acid.
よって、従来のように煩雑な作業等を不要にし、容易で、効率的且つ効果的に微生物の核酸を抽出することが可能な画期的な微生物の核酸抽出方法を実現、提供することができる。 Therefore, it is possible to realize and provide an epoch-making microbial nucleic acid extraction method capable of easily, efficiently and effectively extracting microbial nucleic acid without the need for complicated work as in the past. ..
また、定量的PCR法を用いた試験を実施し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液W2’に対してアンプリコン増幅曲線を作成することによって、核酸抽出対象の微生物の核酸抽出に最適な次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定することができる。
これにより、次亜塩素酸ナトリウム添加工程で、試験で決定した次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となるように次亜塩素酸ナトリウムを試料液に添加することによって、核酸抽出率ひいては信頼性の高い核酸抽出を実現することが可能になる。すなわち、より確実に、容易で効率的且つ効果的に微生物の核酸抽出を実現することが可能になる。
In addition, by conducting a test using a quantitative PCR method and creating an amplicon amplification curve for a plurality of sample solutions W2'with different concentrations of sodium hypochlorite, nucleic acid extraction of the nucleic acid to be extracted. The optimum concentration range of sodium hypochlorite can be determined.
As a result, in the sodium hypochlorite addition step, by adding sodium hypochlorite to the sample solution so as to be within the concentration range of sodium hypochlorite determined in the test, the nucleic acid extraction rate and thus the reliability are high. It becomes possible to realize nucleic acid extraction. That is, it becomes possible to more reliably, easily, efficiently and effectively extract nucleic acid of microorganisms.
ここで、一例として示した図2及び図3のように、本実施形態の微生物の核酸抽出方法の次亜塩素酸ナトリウム添加工程では、濃度が0.5〜8ppm、好ましくは0.5〜2ppmが次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となる。この濃度範囲は、本願の発明者によって行われた各種微生物、生体の核酸抽出の試験の知見に基づいたものである。 Here, as shown in FIGS. 2 and 3 as an example, in the sodium hypochlorite addition step of the method for extracting the nucleic acid of the microorganism of the present embodiment, the concentration is 0.5 to 8 ppm, preferably 0.5 to 2 ppm. Is the concentration range of sodium hypochlorite. This concentration range is based on the findings of the nucleic acid extraction tests of various microorganisms and living organisms conducted by the inventor of the present application.
また、本実施形態の水処理システム1は、微生物定量部4で微生物量を定量する前の排水W1を一時的に貯留する貯水部2と、微生物定量部4で微生物量が設定値を上回った場合に処理水W2を貯水部2に戻す返送ライン6と、を備えている。
さらに、本実施例の水処理システム1は、微生物定量部4での微生物量の定量結果に基づいて処理水W2を排水部5又は貯水部2に送るためのポンプなどを有する送水装置7と、送水装置7の駆動を制御する制御部8と、をさらに備えている。
Further, in the
Further, the
そして、貯水部2と返送ライン6とを備えることで、微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水W2の微生物量を効率的且つ効果的に検出し、排水部5を通じて処理水W2を外部に排出できないと判断された場合に、返送ライン6によって処理水W2を貯水部2に戻すことができる。これにより、処理水W2の再処理を行うことができ、また、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
Then, by providing the
また、送水装置7と制御部8とを備えることで、微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水W2の微生物量を効率的且つ効果的に検出し、処理水W2を排水部5を通じて外部に排出する可否判断結果に応じて、制御部8が送水装置7を駆動制御し、処理水W2を自動的に貯水部2に戻したり、排水部5に送って排出することが可能になる。これにより、より一層効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
Further, by providing the
ここで、本実施例の水処理システム1において、水処理部3は、例えば、水をろ過処理するろ過部3aを備えたり、水を除菌処理する除菌部3bを備えて構成されている。
Here, in the
例えば、砂ろ過、MF膜、UF膜、RO膜などのろ過手段を単数又は複数組み合わせてろ過部3aが構成されている場合には、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水W2の微生物量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要なろ過手段、ろ過手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
For example, when the
また、例えば、UV照射殺菌、オゾン殺菌、殺菌剤添加などの除菌手段を単数又は複数組み合わせて除菌部が構成されている場合に、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用いて、処理水W2の微生物量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要な除菌手段、除菌手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 Further, for example, when the sterilizing unit is composed of one or a plurality of sterilizing means such as UV irradiation sterilization, ozone sterilization, and addition of a sterilizing agent, the treatment is performed using the microorganism nucleic acid extraction method of the present embodiment. Since the amount of microorganisms in water W2 can be detected efficiently and effectively, a necessary combination of sterilizing means and sterilizing means can be easily selected. This makes it possible to realize more efficient and reliable water treatment.
よって、返送ライン6を通じて貯水部2ひいては水処理部3に処理水W2が戻された場合に、処理水W2の再処理を行うことができ、また、適宜ろ過手段や除菌手段を選択、組み合わせるなどして、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。
Therefore, when the treated water W2 is returned to the
ここで、除菌剤(殺菌剤)を排水W1や返送処理水W2に添加して微生物を除菌処理する場合には、例えば、除菌剤として、細胞壁や微生物の集合体からなるバイオフィルムなどを破壊し、殺菌できるものであることが好ましい。例えば、ハロゲン系殺菌剤、オゾン、過酸化水素等が挙げられる。ハロゲン系殺菌剤としては、例えば、次亜塩素酸(HClO)及びその塩(例えば、次亜塩素酸ナトリウム等)、アンモニアクロラミン(NH2Cl)、ブロムクロルジメチルヒダントイン(Br,Cl−DMH)、ブロムスルファミン酸(BrNHSO3H)、ブロムクロラミン(NH4Br+HClO)等が挙げられる。中でも、殺菌力の強さから、ハロゲン系殺菌剤又はオゾンが好ましく、次亜塩素酸及びその塩がより好ましい。 Here, when a sterilizing agent (bactericidal agent) is added to the wastewater W1 or the return treated water W2 to sterilize the microorganisms, for example, the sterilizing agent is a biofilm composed of a cell wall or an aggregate of microorganisms. It is preferable that the film can be destroyed and sterilized. For example, halogen-based disinfectants, ozone, hydrogen peroxide and the like can be mentioned. Examples of the halogen-based bactericide include hypochlorous acid (HClO) and salts thereof (for example, sodium hypochlorite, etc.), ammonia chloramine (NH 2 Cl), bromchlordimethylhydantoin (Br, Cl-DMH), and the like. Examples thereof include bromsulfamic acid (BrNHSO 3 H) and bromchloramine (NH 4 Br + HClO). Of these, halogen-based bactericides or ozone are preferable, and hypochlorous acid and salts thereof are more preferable, because of their strong bactericidal activity.
また、除菌剤を添加した場合には必要に応じて中和処理することが望ましい。例えば、除菌剤として次亜塩素酸ナトリウムを使用した場合には、中和剤としてチオ硫酸ナトリウム等が挙げられる。 In addition, when a disinfectant is added, it is desirable to neutralize it as necessary. For example, when sodium hypochlorite is used as the disinfectant, sodium thiosulfate or the like can be mentioned as the neutralizing agent.
(実施例)
次に、以下、火力発電所などから排出される排ガスから湿式排ガス脱硫装置によって硫黄酸化物を除去する際に発生する排液(例えば、石灰石膏法で使用される吸収液(スラリー)を含む排水W1を浄化処理し、本実施形態の微生物の核酸抽出方法を用い、処理後の処理水W2中の微生物量の検査に本実施形態の微生物の核酸抽出方法を適用した一例を挙げ、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及び水処理システム1をより具体的に説明する。
(Example)
Next, hereinafter, wastewater containing an absorption liquid (slurry) used in the limestone method (for example, wastewater) generated when sulfur oxides are removed from exhaust gas discharged from a thermal power plant or the like by a wet exhaust gas desulfurization apparatus. The present embodiment cites an example in which the microorganism nucleic acid extraction method of the present embodiment is applied to the inspection of the amount of microorganisms in the treated water W2 after the treatment by purifying W1 and using the microorganism nucleic acid extraction method of the present embodiment. The method for extracting the nucleic acid of the microorganism and the
ここで、排ガスと接触し、硫黄酸化物を吸収した吸収液は、化学的酸素要求量(COD)が高いケースがある。本願の発明者による鋭意研究によって、これは、硫黄酸化物を吸収した吸収液の排液において、独立栄養細菌である硫黄酸化細菌(例えばThermithiobacillus属細菌)が増殖したことが一要因であることが知見として得られている。また、硫黄酸化細菌が増殖すると、硫黄酸化細菌の産出物(有機物)を利用して増殖する従属栄養細菌(例えばPseudomonas属細菌)が増殖し、増殖した従属栄養細菌によっても糖類等の有機物が産出されることから、排液のCODが上昇するおそれがある。 Here, there are cases where the absorption liquid that has come into contact with the exhaust gas and has absorbed the sulfur oxide has a high chemical oxygen demand (COD). According to the diligent research by the inventor of the present application, this is partly due to the proliferation of sulfur-oxidizing bacteria (for example, the bacterium belonging to the genus Thermithiobacillus), which are autotrophic bacteria, in the drainage of the absorption liquid that has absorbed sulfur oxides. Obtained as a finding. In addition, when sulfur-oxidizing bacteria grow, heterotrophic bacteria (for example, Pseudomonas spp.) That grow using the products (organic substances) of sulfur-oxidizing bacteria grow, and the grown heterotrophic bacteria also produce organic substances such as sugars. Therefore, there is a risk that the COD of the drainage will increase.
そして、CODが排水基準よりも高いと、排水を河川等の公共水域に放流することが当然にできないため、水処理システム1によって浄化処理を施すことになる。
If the COD is higher than the wastewater standard, the wastewater cannot be discharged to a public water area such as a river, so that the
一方、排水基準に規定されていない硫黄酸化細菌を含む処理水W2を下水管などを通じて放流、排水すると、下水管など、下水処理施設のコンクリート腐食を発生させることが知られている。
具体的に、下水中に含まれた硫酸還元菌によって嫌気状態の下水中の硫酸イオンが還元されて硫化水素が発生し、硫化水素が下水中から空気中に放出されるとともに、コンクリート表面の結露などに吸収、溶解される。この状態で、硫黄酸化細菌が好気状態のコンクリート表面に存在すると、結露などに吸収された硫化水素が硫黄酸化細菌によって酸化されて硫酸が発生し、この硫酸によってコンクリートが溶け、いわゆるコンクリート腐食が発生する。このような微生物を要因として地中の下水道などのコンクリート腐食が発生すると、コンクリートが粘土のような状態となってコンクリート構造物の耐力が喪失し、下水道施設としての機能は勿論、予期せぬ突然の道路の陥没、地盤沈下などを発生させることがある。
On the other hand, it is known that when treated water W2 containing sulfur-oxidizing bacteria, which is not specified in the wastewater standard, is discharged and drained through a sewage pipe or the like, concrete corrosion of a sewage treatment facility such as a sewage pipe is generated.
Specifically, sulfate-reducing bacteria contained in sewage reduce sulfate ions in anaerobic sewage to generate hydrogen sulfide, hydrogen sulfide is released from the sewage into the air, and dew condensation on the concrete surface. Absorbed and dissolved in such as. In this state, if sulfur-oxidizing bacteria are present on the aerobic concrete surface, hydrogen sulfide absorbed by dew condensation is oxidized by sulfur-oxidizing bacteria to generate sulfuric acid, and this sulfuric acid melts the concrete, causing so-called concrete corrosion. appear. When concrete corrosion such as sewerage in the ground occurs due to such microorganisms, the concrete becomes like clay and the bearing capacity of the concrete structure is lost, and the function as a sewerage facility is of course unexpectedly sudden. It may cause the collapse of the road and the subsidence of the ground.
このため、硫黄酸化物を吸収した吸収液を含む排水W1を浄化処理した処理水W2に対して、微生物の硫黄酸化細菌や硫酸還元菌の菌量を定量し確認してから公共水域等に放流することが望まれる。 For this reason, the amount of sulfur-oxidizing bacteria and sulfate-reducing bacteria, which are microorganisms, is quantified and confirmed with respect to the treated water W2 obtained by purifying the wastewater W1 containing the absorbing liquid that has absorbed sulfur oxides, and then discharged into public water areas. It is desirable to do.
本実施例では、このような処理水中の硫黄酸化細菌の菌量を検査するために、本実施形態の微生物の核酸抽出方法及び水処理システム1を適用し、排水中の硫黄酸化細菌の菌体量を、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の増幅用プライマー対を用いたPCR法によって検出した。なお、検出された硫黄酸化細菌の菌体量に応じて、酸化性殺菌剤の量を調整し、処理水W2を殺菌(除菌)処理するなどした後に放流することになる。
In this embodiment, in order to inspect the amount of sulfur-oxidizing bacteria in such treated water, the microorganism nucleic acid extraction method and the
ちなみに、使用される吸収液は、硫黄酸化物を吸収可能なものであれば任意であり、例えば、石灰石を溶解(分散)させたスラリー(石灰石膏法)、水酸化ナトリウム水溶液(苛性ソーダ法)、水酸化マグネシウムを溶解(分散)させたスラリー(マグネシウム法)を適用することができる。本実施例では、一例として、石灰石を溶解させた(分散させた)スラリーを吸収液として使用したケースを基に説明を行う。 By the way, the absorption liquid used is arbitrary as long as it can absorb sulfur oxides, for example, a slurry in which limestone is dissolved (dispersed) (lime gypsum method), an aqueous solution of sodium hydroxide (caustic soda method), and the like. A slurry (magnesium method) in which magnesium hydroxide is dissolved (dispersed) can be applied. In this embodiment, as an example, a case where a slurry in which limestone is dissolved (dispersed) is used as an absorption liquid will be described.
また、核酸抽出対象の微生物である硫黄酸化細菌は、サルファイド(S2−)、元素硫黄(SO)、チオ硫酸、ポリチオン酸、亜硫酸等の還元型無機硫黄化合物の酸化エネルギーを増殖のエネルギーとして利用する細菌である。硫黄酸化細菌としては、例えば、Beggiatoa属、Thiothrix属、Thiobacterium属等の一時的に体内に硫黄を沈着する細菌;Thiobacillus属、Thermithiobacillus属、Thiomonas属、Thiomicrospira属等の菌体内に硫黄を蓄積しない中温性細菌;Thermothrix属等の好熱性細菌;Acidianus属、Metallosphaera属、Sulfolobus属等の超高熱細菌等が挙げられる。本実施例では、一例として、脱硫装置内に存在する硫黄酸化細菌が、Thermithiobacillus属に属する細菌であるものとして説明を行っている。 Further, sulfur-oxidizing bacteria are microorganisms of the nucleic acid extraction target is utilized sulfide (S 2-), elemental sulfur (SO), thiosulfate, polythionic acid, the oxidation energy of the reduced inorganic sulfur compounds sulfite as energy growth It is a bacterium that does. Sulfur-oxidizing bacteria include, for example, bacteria that temporarily deposit sulfur in the body such as Beggiatoa, Thiothrix, Thiobacillus; Sexual bacteria; thermophilic bacteria such as Thermothrix; ultrahyperthermic bacteria such as Acidianus, Metallosphaera, Sulflobus and the like. In this embodiment, as an example, the sulfur-oxidizing bacterium existing in the desulfurization apparatus is described as being a bacterium belonging to the genus Thermithiobacillus.
そして、本実施例では、処理水W2中の硫黄酸化細菌の菌体量を硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の増幅用プライマー対を用いたPCR法により検出し定量する。 Then, in this example, the amount of sulfur-oxidizing bacteria in the treated water W2 is detected and quantified by a PCR method using a primer pair for amplifying a known gene of sulfur-oxidizing bacteria.
処理水W2中の硫黄酸化細菌の菌体量は、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の量として検出される。既知の遺伝子としては、硫黄酸化細菌が有する遺伝子であって、硫黄酸化細菌に特有のものであればよく、例えば、硫黄代謝に関与する遺伝子を用いることができる。硫黄代謝には、Paracoccus sulfur oxidation pathway(PSO経路、sox経路ともいう)と、S4 intermediatepathway(S4経路)とが存在する。PSO経路には、sox遺伝子クラスターにコードされている酵素(soxXAYZBCD)が主要な役割を担っている。当該酵素として具体的には、例えば、soxYZ、soxXA、soxB、soxCD等が挙げられる。中でも、既知の遺伝子としては、soxB遺伝子が好ましい。硫黄酸化細菌のsoxB遺伝子は、例えば、配列番号1で表される塩基配列からなる。 The amount of sulfur-oxidizing bacteria in the treated water W2 is detected as the amount of known genes of sulfur-oxidizing bacteria. The known gene may be a gene possessed by a sulfur-oxidizing bacterium and is unique to the sulfur-oxidizing bacterium, and for example, a gene involved in sulfur metabolism can be used. Paracoccus sulfur oxidation passage (also referred to as PSO pathway or sox pathway) and S4 intermediatepathway (S4 pathway) exist in sulfur metabolism. The enzyme encoded by the sox gene cluster (soxXAYZBCD) plays a major role in the PSO pathway. Specific examples of the enzyme include soxYZ, soxXA, soxB, soxCD and the like. Among them, the soxB gene is preferable as a known gene. The soxB gene of a sulfur-oxidizing bacterium consists of, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
一方、S4経路に関与する遺伝子としては、例えば、チオ硫酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、亜硫酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、テトラチオン酸ハイドラロラーゼ(4THase)遺伝子等が挙げられる。 On the other hand, examples of genes involved in the S4 pathway include thiosulfate dehydrogenase gene, sulfite dehydrogenase gene, tetrathionate hydralolase (4THase) gene and the like.
既知の遺伝子の増幅用プライマー対は、標的となる遺伝子の塩基配列、Tm値、GC含量等を勘案して、公知の方法を用いて設計することができる。
例えば、soxB遺伝子、特に、配列番号1で表される塩基配列からなる領域の増幅用プライマー対としては、例えば、表1及び以下の1)〜8)からなる群より選ばれる1種以上のプライマー対等が挙げられる。
A known gene amplification primer pair can be designed by a known method in consideration of the base sequence, Tm value, GC content, etc. of the target gene.
For example, as the primer pair for amplification of the soxB gene, particularly the region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, one or more primers selected from the group consisting of Table 1 and 1) to 8) below, for example. Equality can be mentioned.
1)配列番号2で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号3で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
2)配列番号4で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号5で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
3)配列番号6で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号7で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
4)配列番号8で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号9で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
5)配列番号10で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号11で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
6)配列番号12で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号13で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
7)配列番号14で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号15で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
8)配列番号16で表される塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号17で表される塩基配列からなるリバースプライマー;
1) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3;
2) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5;
3) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7;
4) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;
5) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11;
6) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13;
7) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15;
8) A forward primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 and a reverse primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 17;
上記のプライマー対は、使用可能なプライマー対の一例である。通常、プライマーは15塩基以上30塩基以下程度の長さに設計できることから、上記のプライマー対において、GC含量やTm値を鑑みて、塩基長を例えば、1塩基、2塩基、3塩基、5塩基、10塩基程度、増加又は減少させたものも同様に用いることができる。 The above primer pair is an example of a usable primer pair. Normally, the primer can be designed to have a length of about 15 bases or more and 30 bases or less. Therefore, in the above primer pair, the base length is set to, for example, 1 base, 2 bases, 3 bases, or 5 bases in consideration of the GC content and the Tm value. Similarly, those having an increase or decrease of about 10 bases can also be used.
上述した既知の遺伝子を標的としたPCR法では、排水W1中に含まれる硫黄酸化細菌の菌体量を、硫黄酸化細菌の既知の遺伝子の量として定量することができる。このとき、処理水W2中に含まれる硫黄酸化細菌から核酸を抽出した後、得られた抽出液を鋳型試料としてPCRを行うという2段階の操作を行うことで、3時間以上1日間以下の短時間で測定結果を得ることができる。 In the above-mentioned PCR method targeting known genes, the amount of sulfur-oxidizing bacteria contained in the wastewater W1 can be quantified as the amount of known genes of sulfur-oxidizing bacteria. At this time, by performing a two-step operation of extracting nucleic acid from the sulfur-oxidizing bacteria contained in the treated water W2 and then performing PCR using the obtained extract as a template sample, a short period of 3 hours or more and 1 day or less is performed. Measurement results can be obtained in time.
(硫黄酸化細菌のDNA抽出方法)
ここで、PCR法による菌体量の定量を行うための前処理では、例えば、Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2(日鉄環境株式会社製)を用い、プロトコールに従い、脱硫装置から採取した石膏サンプルより硫黄酸化細菌のDNAの抽出及び精製を行う。
(DNA extraction method for sulfur-oxidizing bacteria)
Here, in the pretreatment for quantifying the amount of cells by the PCR method, for example, Extrap Soil DNA Kit Plus ver. Using 2 (manufactured by Nippon Steel Environment Co., Ltd.), DNA of sulfur-oxidizing bacteria is extracted and purified from the gypsum sample collected from the desulfurization apparatus according to the protocol.
本実施例の硫黄酸化細菌のDNA抽出方法(本実施例の微生物の核酸抽出方法)では、まず、次亜塩素酸ナトリウム濃度(終濃度)が0.5ppm(Case1)、1ppm(Case2)、2ppm(Case3)、4ppm(Case4)、8ppm(Case5)、16ppm(Case6)となるように、対象生物懸濁液の試料液1ccに対し、次亜塩素酸ナトリウム濃度が異なるそれぞれの次亜塩素酸ナトリウム溶液を1cc添加してCase1〜Case6の6種の試料液(混合液)W2’を生成し、ボルテックスミキサーなどを用いてそれぞれ30min間振とうする。なお、試料液W2’の温度は25℃とした。 In the DNA extraction method of sulfur-oxidizing bacteria of this example (nucleic acid extraction method of microorganisms of this example), first, the sodium hypochlorite concentration (final concentration) is 0.5 ppm (Case1), 1 ppm (Case2), and 2 ppm. (Case3), 4 ppm (Case4), 8 ppm (Case5), 16 ppm (Case6) Sodium hypochlorite with different sodium hypochlorite concentration with respect to 1 cc of sample solution of the target biological suspension. Add 1 cc of the solution to generate 6 kinds of sample liquids (mixed liquids) W2'of Case1 to Case6, and shake each for 30 minutes using a vortex mixer or the like. The temperature of the sample liquid W2'was set to 25 ° C.
このように振とう処理した後、対象生物懸濁液と次亜塩素酸ナトリウムとの混合液である6種の試料液W2’にそれぞれ、チオ硫酸ナトリウムなどの中和剤溶液を添加し、各試料液W2’中に残存する残留塩素を中和することが望ましい。本実施例では、チオ硫酸ナトリウム溶液を用い、添加した次亜塩素酸ナトリウムの量に対応した当量のチオ硫酸ナトリウム溶液を添加して中和処理を行っている。 After the shaking treatment in this way, a neutralizing agent solution such as sodium thiosulfate was added to each of the six sample solutions W2', which is a mixed solution of the target biological suspension and sodium hypochlorite, and each was added. It is desirable to neutralize the residual chlorine remaining in the sample solution W2'. In this example, a sodium thiosulfate solution is used, and an equivalent amount of the sodium thiosulfate solution corresponding to the amount of added sodium hypochlorite is added for neutralization treatment.
次に、対象生物懸濁液と次亜塩素酸ナトリウム溶液とチオ硫酸ナトリウム溶液の混合液であるそれぞれの試料液W2’を、遠心分離機を用いて13500rpm、10分間、遠心分離処理する。 Next, each sample solution W2'which is a mixture of the target biological suspension, the sodium hypochlorite solution and the sodium thiosulfate solution is centrifuged at 13500 rpm for 10 minutes using a centrifuge.
そして、本実施例では、このように遠心分離処理して固液分離して得られたペレット(PCR法による菌体量の定量を行うための前処理を行った後のペレット)から、例えば、Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2(日鉄環境株式会社製)を用い、プロトコールに従い、硫黄酸化細菌の核酸(DNA)の抽出及び精製を行う。 Then, in this embodiment, for example, from the pellets obtained by centrifugation and solid-liquid separation in this way (pellets after pretreatment for quantifying the amount of cells by the PCR method), for example. Exec Soil DNA Kit Plus ver. 2 (manufactured by Nippon Steel Environment Co., Ltd.) is used to extract and purify the nucleic acid (DNA) of sulfur-oxidizing bacteria according to the protocol.
硫黄酸化細菌の核酸の抽出及び精製のプロトコールは以下の通りである。 The protocol for extracting and purifying nucleic acid of sulfur-oxidizing bacteria is as follows.
1)Bead Tubesに、試料のペレット:0.5g(ちなみに、液体試料の場合は500μL)、Extraction Buffer(主成分/リン酸水素二ナトリウムの混合物):950μL、Lysis Solution(主成分/ドデシル硫酸ナトリウムの混合物):50μLを添加する。
なお、濃縮が必要な場合には、メンブレンフィルターを用いて試料中の微生物をろ過・捕捉し、このフィルターから核酸を抽出するようにすることが望ましい。
1) In Bed Tubes, sample pellets: 0.5 g (by the way, 500 μL in the case of liquid sample), Extension Buffer (main component / mixture of disodium hydrogen phosphate): 950 μL, Lysis Solution (main component / sodium dodecyl sulfate). Mixture): 50 μL is added.
When concentration is required, it is desirable to filter and capture microorganisms in the sample using a membrane filter and extract nucleic acid from this filter.
2)ボルテックスミキサーで5秒間撹拌する。 2) Stir with a vortex mixer for 5 seconds.
3)ビーズビーティング(4〜6m/秒又は4200〜6800rpmで30〜45秒間)を行う。 3) Perform bead beating (4 to 6 m / sec or 4200 to 6800 rpm for 30 to 45 seconds).
4)遠心分離(14000×g、5分、4℃)を行う。 4) Centrifuge (14000 xg, 5 minutes, 4 ° C).
5)上清600μLを1.5mLチューブに移し、PP Solution(酢酸ナトリウム溶液):300μLを添加する。 5) Transfer 600 μL of the supernatant to a 1.5 mL tube and add PP Solution (sodium acetate solution): 300 μL.
6)5)のチューブを10回程度転倒混和し、撹拌する。 6) Mix the tube of 5) by inversion about 10 times and stir.
7)遠心分離(14000×g、5分、4℃)を行う。 7) Centrifuge (14000 xg, 5 minutes, 4 ° C).
8)上清800μLを2mLチューブに移す。 8) Transfer 800 μL of the supernatant to a 2 mL tube.
9)8)のチューブにMBs Solution(主成分/グアニジン塩酸塩、三二酸化鉄の混合物):50μL、Binding Solution(主成分/グアニジンチオシアン酸塩の混合物):890μLを添加する。 9) Add 50 μL of MBs Solution (mixture of main component / guanidine hydrochloride and iron sesquioxide) and 890 μL of Binding Solution (mixture of main component / guanidine thiocyanate) to the tube of 8).
10)9)のチューブを2分間程度転倒混和し、よく撹拌する。 10) Mix the tube of 9) by inversion for about 2 minutes and stir well.
11)10)のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドにセットする。 11) Spin down the tube of 10) and set it on the magnetic stand.
12)1分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去する。 12) After magnetizing for 1 minute or more, remove the supernatant using a micropipette.
13)12)のチューブにWashing Solution(主成分/グアニジンチオシアン酸塩の混合物):800μLを添加し、ボルテックスミキサー(低速)で十分に撹拌する。 13) Add 800 μL of Washing Solution (mixture of main component / guanidin thiocyanate) to the tube of 12), and stir well with a vortex mixer (low speed).
14)13)のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドにセットして1分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去する。 14) Spin down the tube of 13), set it on a magnetic stand, collect magnetism for 1 minute or more, and then remove the supernatant using a micropipette.
15)70%エタノール溶液:1mLを添加し、ボルテックスミキサー(低速)で十分に撹拌する。 15) Add 1 mL of 70% ethanol solution and stir well with a vortex mixer (low speed).
16)15)のチューブをスピンダウンし、マグネティックスタンドで1分以上集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去する。 16) Spin down the tube of 15), collect magnetism on a magnetic stand for 1 minute or longer, and then remove ethanol using a micropipette.
17)15)〜16)の工程を再度繰り返す。 17) The steps 15) to 16) are repeated again.
18)チューブの蓋をあけたまま、室温で磁性粒子を10分間程度風乾する。 18) With the tube lid open, air dry the magnetic particles at room temperature for about 10 minutes.
19)溶出液(TEバッファー、滅菌水等):100μLを添加後、ボルテックスミキサー(低速)で十分に撹拌する。 19) Eluate (TE buffer, sterile water, etc.): After adding 100 μL, stir well with a vortex mixer (low speed).
20)途中で数回攪拌しながら、65℃のヒートブロック(またはウォーターバス)で5〜10分間加温する。 20) Heat with a heat block (or water bath) at 65 ° C. for 5 to 10 minutes while stirring several times in the middle.
21)マグネティックスタンドにチューブをセットして集磁したのち、溶出液を新しいチューブに移す。 21) After setting the tube on the magnetic stand and collecting magnetism, transfer the eluate to a new tube.
これにより、核酸が溶出して含有された溶出液(試料液)が得られる。 As a result, an eluate (sample solution) containing the eluate of nucleic acid can be obtained.
次に、精製したサンプルを鋳型として、前述の表1に示した8種類のプライマー対のうち、プライマー対5〜8を用い、リアルタイムPCR法によってsoxB遺伝子の量を定量した。PCRの反応条件は、初期変性として98℃2分間反応を行った後、「98℃10秒間のDNA変性反応、55℃10秒間のアニーリング、68℃30秒間の伸長反応」を45サイクル行うこととした。
Next, using the purified sample as a template, the amount of the soxB gene was quantified by a real-time PCR method using
これにより、プライマー対のうちプライマー対8を用い、サイクル数を45サイクルとしたリアルタイムPCR法の結果である図2に示すような次亜塩素酸ナトリウム濃度を変化させた場合の各アンプリコン増幅曲線(PRCサイクルと蛍光強度の関係の曲線)を得ることができる。
As a result, each amplicon amplification curve when the sodium hypochlorite concentration is changed as shown in FIG. 2, which is the result of the real-time PCR method in which the
よって、次亜塩素酸ナトリウムを添加する前処理を行い、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出できることが実証された。また、各アンプリコン増幅曲線から、次亜塩素酸ナトリウム濃度が0.5〜8ppmとなるように試料液W2’に次亜塩素酸ナトリウムを添加すれば、従来よりも優れた核酸抽出率で好適に各種微生物の核酸を抽出できることも実証された。 Therefore, simply by performing a pretreatment to add sodium hypochlorite and adjusting the concentration of sodium hypochlorite, the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. are suitably destroyed, and excellent nucleic acid extraction is performed. It was demonstrated that nucleic acid can be extracted at a rate. Further, from each amplicon amplification curve, if sodium hypochlorite is added to the sample solution W2'so that the sodium hypochlorite concentration is 0.5 to 8 ppm, it is suitable for a nucleic acid extraction rate superior to the conventional one. It was also demonstrated that nucleic acids of various microorganisms can be extracted.
なお、上記のようにして排水W1の処理水W2中の微生物定量結果に基づき、必要に応じて処理水W2に殺菌剤を添加するなどする。このとき、殺菌に使用する酸化性殺菌剤の量は、硫黄酸化細菌の菌体量に応じて、適宜調整することができる。また、使用する酸化性殺菌剤の種類に応じても、適宜調整することができる。例えば、酸化性殺菌剤として次亜塩素酸ナトリウムを用いる場合に、次亜塩素酸ナトリウムの添加量は、処理水W2中の終濃度が1ppm以上70ppm以下となるような量とすることができる。 As described above, a bactericide is added to the treated water W2 as necessary based on the quantification result of microorganisms in the treated water W2 of the waste water W1. At this time, the amount of the oxidizing fungicide used for sterilization can be appropriately adjusted according to the amount of cells of sulfur-oxidizing bacteria. Further, it can be appropriately adjusted according to the type of the oxidizing fungicide to be used. For example, when sodium hypochlorite is used as the oxidizing bactericidal agent, the amount of sodium hypochlorite added can be such that the final concentration in the treated water W2 is 1 ppm or more and 70 ppm or less.
酸化性殺菌剤による殺菌時間は、例えば、1分間以上24時間以下程度とすることができ、1分間以上12時間以下が好ましく、1分間以上6時間以下がより好ましい。殺菌時間を上記下限値以上とすることで、より十分な殺菌効果が得られ、一方、上記上限値以下であることで、脱硫装置への腐食等の損傷を軽減することができる。 The sterilization time with the oxidizing fungicide can be, for example, about 1 minute or more and 24 hours or less, preferably 1 minute or more and 12 hours or less, and more preferably 1 minute or more and 6 hours or less. When the sterilization time is not less than the above lower limit value, a more sufficient sterilization effect can be obtained, while when it is not more than the above upper limit value, damage such as corrosion to the desulfurization apparatus can be reduced.
以上、本開示の生体の核酸抽出方法及び水処理システム1の実施形態について説明したが、本開示に係る生体の核酸抽出方法及び水処理システム1は、上記の実施形態に限定されるものではなく、変更例等を含め、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。
Although the living body nucleic acid extraction method and the embodiment of the
例えば、本実施形態では、次亜塩素酸ナトリウム添加工程において、微生物(生体)の核酸抽出が行われるための試料液W2’に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加するものとした。
また、本実施形態では、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における試験で、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液W2’を用意し、定量的PCR法を用い、それぞれの試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、アンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定するものとした。
For example, in the present embodiment, in the sodium hypochlorite addition step, the concentration of the sample liquid W2'for extracting nucleic acid of a microorganism (living body) is set to be within the concentration range predetermined by the test. Sodium chlorite was added.
Further, in the present embodiment, in the test in the step of determining the sodium hypochlorite concentration, a plurality of sample solutions W2'with different sodium hypochlorite concentrations are prepared, and a quantitative PCR method is used to prepare each sample solution. On the other hand, an amplicon amplification curve was created, and the concentration range of sodium hypochlorite was determined based on the amplicon amplification curve.
これに対し、図4に示すように、次亜塩素酸は、pHの違いによって次亜塩素酸(HClO)、次亜塩素酸イオン(ClO−)、溶存塩素ガス(Cl2)の3種の溶存形態に変化し、これら3種の溶存の割合がpHによって異なる。
このため、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を一定とした場合であっても、試料液W2’のpHを調整すれば、酸化力が強い次亜塩素酸(HClO)の割合(濃度)を調整することができ、核酸抽出対象の微生物の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊の困難性に合わせてpHを調整したり、検査対象の水W1、W2のpHに応じて次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整、設定するだけで、結果的に核酸抽出に有効な次亜塩素酸の濃度を調整することができ、本実施形態と同様に、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。
On the other hand, as shown in FIG. 4, hypochlorous acid has three types , hypochlorous acid (HClO), hypochlorite ion (ClO − ), and dissolved chlorine gas (Cl 2), depending on the pH. It changes to a dissolved form, and the dissolved ratio of these three types varies depending on the pH.
Therefore, even when the concentration of sodium hypochlorite is constant, the proportion (concentration) of hypochlorite (HClO) having strong oxidizing power can be adjusted by adjusting the pH of the sample solution W2'. It is possible to adjust the pH according to the difficulty of destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. of the nucleic acid to be extracted, or to adjust the pH according to the pH of the water W1 and W2 to be inspected. By simply adjusting and setting the concentration of sodium, the concentration of hypochlorite effective for nucleic acid extraction can be adjusted as a result, and nucleic acid is extracted with a very excellent nucleic acid extraction rate as in the present embodiment. It will be possible to do.
なお、本実施形態では、核酸抽出対象の微生物などの生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを好適に破壊するために、前処理として次亜塩素酸ナトリウムを試料液W2’に添加するものとした。
一方、次亜塩素酸ナトリウム以外の酸化剤であっても同様の作用効果を奏功することができ得る。また、上記のように他の酸化剤においてもpHによって溶存形態、ひいては核酸抽出対象の微生物などの生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊に適した形態が変化する。
このため、細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊の困難性に合わせ、酸化剤の選択、濃度やpHの調整を行うことで、やはり、本実施形態と同様の作用効果を得ることができると言える。
このような酸化剤としては、公知のあらゆる酸化剤を適用することが可能である。例えば、ハロゲン系のアンモニアクロラミン(NH2Cl)、ブロムクロルジメチルヒダントイン(Br,Cl−DMH)、ブロムスルファミン酸(BrNHSO3H)、ブロムクロラミン(NH4Br+HClO)などを挙げることができる。また、オゾンや過酸化水素、過マンガン酸カリウム、第一鉄、第二鉄、0価の鉄なども挙げることができる。
なお、例えば、生体の細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどの破壊して核酸抽出率を向上させる目的、関連からすると、ヨウ素酸のように酸性溶液中で酸化力が強く、塩基性溶液中で酸化力が弱い傾向が大きい酸化剤と比較し、次亜塩素酸ナトリウムのように中性域の溶液中で酸化力が強く、酸性、塩基性が強くなるほど溶液中で酸化力が低くなる酸化剤(図4のような傾向を示す酸化剤)の適用がより好ましいことが発明者の鋭意研究によって確認されている。
In this embodiment, sodium hypochlorite is added to the sample solution W2'as a pretreatment in order to suitably destroy the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. of a living body such as a microorganism to be extracted with nucleic acid. I made it.
On the other hand, even an oxidizing agent other than sodium hypochlorite can exert the same effect. Further, as described above, the dissolved morphology of other oxidants also changes depending on the pH, and by extension, the morphology suitable for destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. of the living body such as the microorganism to be extracted with nucleic acid.
Therefore, by selecting an oxidizing agent and adjusting the concentration and pH according to the difficulty of destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc., the same action and effect as in this embodiment can be obtained. It can be said that it can be done.
As such an oxidizing agent, any known oxidizing agent can be applied. For example, halogen-based
For example, for the purpose of destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope, etc. of a living body to improve the nucleic acid extraction rate, the oxidizing power is strong in an acidic solution such as iodic acid, and in a basic solution. Compared to oxidants that tend to have weak oxidative power, the oxidative power is stronger in neutral solution such as sodium hypochlorite, and the stronger the acidity and basicity, the lower the oxidative power in solution. It has been confirmed by the intent of the inventor that the application of the agent (oxidizing agent showing the tendency as shown in FIG. 4) is more preferable.
さらに、本実施形態では、水処理システムで処理した後の処理水中の微生物量を定量するために本開示の微生物の核酸抽出方法を用いるものとして説明を行った。さらに、実施例では、核酸抽出対象の微生物が硫黄酸化細菌として説明を行った。
これに対し、本開示の生体の核酸抽出方法、これを用いた水処理システムは、河川や湖沼、池、海域の水、その他、あらゆる任意の水の中に含まれる微生物などの生体の核酸を抽出するために適用可能である。すなわち、その用途等を限定する必要はない。
Further, in the present embodiment, it has been described that the nucleic acid extraction method of the microorganisms of the present disclosure is used to quantify the amount of microorganisms in the treated water after being treated by the water treatment system. Further, in the examples, the microorganism to be extracted with nucleic acid was described as a sulfur-oxidizing bacterium.
On the other hand, the method for extracting nucleic acid of a living body according to the present disclosure, and a water treatment system using the method, can use nucleic acid of a living body such as microorganisms contained in water of rivers, lakes, ponds, sea areas, and any other water. Applicable for extraction. That is, it is not necessary to limit its use and the like.
また、本実施形態及び実施例では、試料液に次亜塩素酸ナトリウムを添加して前処理を行い、この前処理を行った試料液に対し、従来周知の核酸抽出キットを用いて本工程の核酸抽出を行い、PCR法を用いて微生物量を定量するものとした。
ここで、試料液に対して添加する次亜塩素酸ナトリウムを予め具備した形で核酸抽出キットを構成してもよい。この場合には、従来と比較し、より一層効率的で、核酸抽出率を向上させることができ、信頼性の高い核酸抽出キットを実現、提供することが可能になる。
Further, in the present embodiment and the examples, sodium hypochlorite is added to the sample solution to perform pretreatment, and the sample solution subjected to this pretreatment is subjected to the present step using a conventionally known nucleic acid extraction kit. Nucleic acid extraction was performed and the amount of microorganisms was quantified using the PCR method.
Here, the nucleic acid extraction kit may be configured with sodium hypochlorite to be added to the sample solution in advance. In this case, it becomes possible to realize and provide a highly reliable nucleic acid extraction kit, which is more efficient than the conventional one and can improve the nucleic acid extraction rate.
最後に、実施形態に記載の内容は、例えば以下のように把握される。 Finally, the content described in the embodiment is grasped as follows, for example.
(1)本開示の一態様に係る生体の核酸抽出方法は、生体の核酸抽出が行われるための試料液(試料水、試料液W2’)に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び次亜塩素酸ナトリウムを添加した試料液から核酸抽出対象の生体の核酸を抽出する核酸抽出工程を備える。 (1) The method for extracting nucleic acid in a living body according to one aspect of the present disclosure is a concentration within a concentration range predetermined by a test with respect to a sample solution (sample water, sample solution W2') for extracting nucleic acid in a living body. It is provided with a sodium hypochlorite addition step of adding sodium hypochlorite and a nucleic acid extraction step of extracting a nucleic acid of a living body to be nucleic acid extracted from a sample solution to which sodium hypochlorite is added.
上記(1)の生体の核酸抽出方法においては、本願の発明者の鋭意研究の成果を用いることによって、すなわち、試料液に対し核酸抽出を行う微生物などの生体に応じた濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加することによって、従来よりも格段に優れた核酸抽出率(核酸回収率)で核酸を抽出できるという本願の発明者による格別顕著な知見、研究成果に基づき、核酸抽出対象の生体に対応した濃度になるように適量の次亜塩素酸ナトリウムを試料に添加するだけで、従来よりも格段に優れた核酸抽出を実現することが可能になる。 In the method for extracting nucleic acid of a living body according to (1) above, by using the result of the diligent research of the inventor of the present application, that is, the concentration is adjusted according to the living body such as a microorganism that extracts nucleic acid from a sample solution. Nucleic acid extraction target based on the exceptionally remarkable findings and research results by the inventor of the present application that nucleic acid can be extracted with a much better nucleic acid extraction rate (nucleic acid recovery rate) than before by adding sodium chlorite. By simply adding an appropriate amount of sodium hypochlorite to the sample so that the concentration corresponds to that of the living body, it becomes possible to realize much better nucleic acid extraction than before.
すなわち、例えば、細胞壁、細胞膜、細胞質、ウイルスの場合は、カプシッド、エンベロープなどの溶解(破壊)の困難性が異なる各種の核酸抽出の生体に対し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度を調整するだけで、好適に細胞壁、細胞膜、細胞質、カプシッド、エンベロープなどを破壊し、非常に優れた核酸抽出率で核酸を抽出することが可能になる。 That is, for example, in the case of cell walls, cell membranes, cytoplasms, and viruses, it is only necessary to adjust the concentration of sodium hypochlorite for living organisms that extract various nucleic acids with different difficulty in lysis (destruction) such as capsids and envelopes. It is possible to extract nucleic acid with a very excellent nucleic acid extraction rate by preferably destroying the cell wall, cell membrane, cytoplasm, capsid, envelope and the like.
したがって、従来のように煩雑な作業等を不要にし、容易で、効率的且つ効果的に微生物などの生体の核酸を抽出することが可能な画期的な微生物の核酸抽出方法を実現、提供することができる。 Therefore, it is possible to realize and provide an epoch-making method for extracting nucleic acid of a microorganism, which can easily, efficiently and effectively extract nucleic acid of a living body such as a microorganism without the need for complicated work as in the past. be able to.
(2)本開示の別の態様に係る生体の核酸抽出方法は、上記(1)の生体の核酸抽出方法であって、次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程を備え、次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における試験では、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液を用意し、定量的PCR法を用い、それぞれの試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、アンプリコン増幅曲線に基づいて次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定する。 (2) The method for extracting nucleic acid of a living body according to another aspect of the present disclosure is the method for extracting nucleic acid of a living body according to the above (1), and determines the concentration range of sodium hypochlorite. In the test in the step of determining the sodium hypochlorite concentration, multiple sample solutions with different sodium hypochlorite concentrations were prepared, and quantitative PCR method was used to amplify the amplicon for each sample solution. Create a curve and determine the sodium hypochlorite concentration range based on the amplicon amplification curve.
上記(2)の生体の核酸抽出方法においては、定量的PCR法を用いた試験を実施し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成することによって、核酸抽出対象の生体の核酸抽出に最適な次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲を決定することができる。
これにより、次亜塩素酸ナトリウム添加工程で、試験で決定した次亜塩素酸ナトリウムの濃度範囲となるように次亜塩素酸ナトリウムを試料液に添加することによって、核酸抽出率ひいては信頼性の高い核酸抽出を実現することが可能になる。すなわち、より確実に、容易で効率的且つ効果的に生体の核酸抽出を実現することが可能になる。
In the above-mentioned (2) method for extracting nucleic acid of a living body, a test using a quantitative PCR method is carried out, and an amplicon amplification curve is created for a plurality of sample solutions having different concentrations of sodium hypochlorite. , The optimum concentration range of sodium hypochlorite for nucleic acid extraction of a living body to be extracted with nucleic acid can be determined.
As a result, in the sodium hypochlorite addition step, by adding sodium hypochlorite to the sample solution so as to be within the concentration range of sodium hypochlorite determined in the test, the nucleic acid extraction rate and thus the reliability are high. It becomes possible to realize nucleic acid extraction. That is, it becomes possible to more reliably, easily, efficiently and effectively extract nucleic acid of a living body.
(3)本開示の別の態様に係る生体の核酸抽出方法は、上記(1)又は(2)の生体の核酸抽出方法であって、生体が微生物である。 (3) The method for extracting nucleic acid of a living body according to another aspect of the present disclosure is the method for extracting nucleic acid of a living body according to the above (1) or (2), wherein the living body is a microorganism.
上記(3)の生体の核酸抽出方法においては、本願の発明者によって行われた各種微生物の核酸抽出の試験の知見に基づき、試料液に次亜塩素酸ナトリウムを添加すれば、従来よりも優れた核酸抽出率で好適に各種微生物の核酸を抽出することが可能になる。 The method for extracting nucleic acid in a living body according to (3) above is superior to the conventional method if sodium hypochlorite is added to the sample solution based on the findings of the nucleic acid extraction test of various microorganisms conducted by the inventor of the present application. It is possible to preferably extract nucleic acids of various microorganisms with the nucleic acid extraction rate.
(4)本開示の一態様に係る水処理システムは、処理対象の水(排水W1)の水質を改善する水処理部(水処理部3)と、生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び次亜塩素酸ナトリウムを添加した試料液から核酸抽出対象の微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、水処理部で処理した後の処理水(処理水W2)から得た試料液に対して核酸抽出を行い、処理水の中の生体量を定量する生体定量部(微生物量定量部、微生物量決定部4)と、生体定量部で定量した生体量が予め設定した設定値以下の場合に処理水を排出するための排水部(排水部5)と、を備えた。 (4) The water treatment system according to one aspect of the present disclosure includes a water treatment unit (water treatment unit 3) for improving the water quality of the water to be treated (waste W1) and a sample liquid for extracting nucleic acid of a living body. In contrast, the sodium hypochlorite addition step in which sodium hypochlorite is added so that the concentration is within the concentration range determined in advance by the test, and the microorganism to be extracted from the sample solution to which sodium hypochlorite is added. Using a biological nucleic acid extraction method equipped with a nucleic acid extraction step for extracting the nucleic acid of the above, nucleic acid extraction is performed on the sample solution obtained from the treated water (treated water W2) after being treated in the water treatment unit, and the treated water is treated. A biometric unit (microbiological amount quantification unit, microbial amount determination unit 4) for quantifying the amount of biometric content in the water, and drainage for discharging treated water when the biometric amount quantified by the biometric amount is less than a preset set value. A unit (drainage unit 5) is provided.
上記(4)の水処理システムにおいては、次亜塩素酸ナトリウム添加工程及び核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、水処理部で処理した後の水の中の生体量を定量する生体定量部を備えることによって、上記(1)の生体の核酸抽出方法の作用効果を奏功することができる。これにより、信頼性の高い水処理を実現することができ、ひいては排水部から排出される水の信頼性を好適に確保することが可能になる。 In the water treatment system of (4) above, a nucleic acid extraction method of a living body including a sodium hypochlorite addition step and a nucleic acid extraction step is used to quantify the amount of living body in water after treatment in a water treatment unit. By providing the biometric unit, the action and effect of the nucleic acid extraction method for the living body according to (1) above can be achieved. As a result, highly reliable water treatment can be realized, and by extension, the reliability of the water discharged from the drainage portion can be suitably ensured.
(5)本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記(4)の水処理システムであって、水処理部は、水をろ過処理するろ過部(ろ過部3a)を含む。
(5) The water treatment system according to another aspect of the present disclosure is the water treatment system of the above (4), and the water treatment unit includes a filtration unit (
上記(5)の水処理システムにおいては、例えば、砂ろ過、MF膜、UF膜、RO膜などのろ過手段を単数又は複数組み合わせてろ過部が構成されている場合に、上記(1)乃至(3)の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要なろ過手段、ろ過手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 In the water treatment system of (5) above, for example, when the filtration unit is configured by using one or a plurality of filtration means such as sand filtration, MF membrane, UF membrane, RO membrane, etc., the above (1) to (1) to ( By efficiently and effectively detecting the biological amount of the treated water by using any of the biological nucleic acid extraction methods of 3), it is possible to easily select a necessary combination of filtration means and filtration means. This makes it possible to realize more efficient and reliable water treatment.
(6)本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記(4)の水処理システムであって、水処理部は、水を除菌処理する除菌部(除菌部3b)を含む。
(6) The water treatment system according to another aspect of the present disclosure is the water treatment system of (4) above, and the water treatment unit includes a sterilization unit (
上記(6)の水処理システムにおいては、例えば、UV照射殺菌、オゾン殺菌、次亜塩素酸殺菌などの殺菌手段を単数又は複数組み合わせて殺菌部が構成されている場合に、上記(1)乃至(3)の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出できることで、必要な殺菌手段、殺菌手段の組み合わせを容易に選別することができる。これにより、より効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 In the water treatment system of (6) above, for example, when the sterilization unit is composed of one or a plurality of sterilization means such as UV irradiation sterilization, ozone sterilization, and hypochlorite sterilization, the above (1) to (1) to By efficiently and effectively detecting the biological amount of the treated water by using any of the biological nucleic acid extraction methods of (3), it is possible to easily select a necessary combination of sterilizing means and sterilizing means. This makes it possible to realize more efficient and reliable water treatment.
(7)本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記(4)乃至(6)の何れかの水処理システムであって、生体定量部で生体量を定量する前の水を一時的に貯留する貯水部(貯水部2)と、生体定量部で定量した生体量が設定値を上回った場合に処理水を貯水部に戻す返送ライン(返送ライン6)と、をさらに備えた。 (7) The water treatment system according to another aspect of the present disclosure is the water treatment system according to any one of (4) to (6) above, and the water before the biometric amount is quantified by the biometric unit is temporarily used. It is further provided with a water storage unit (water storage unit 2) for storing in the water storage unit and a return line (return line 6) for returning the treated water to the water storage unit when the biological amount quantified by the biometric unit exceeds the set value.
上記(7)の水処理システムにおいては、上記(1)乃至(3)の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出し、処理水を排水部を通じて外部に排出できないと判断した場合に、返送ラインによって処理水を貯水部に戻すことができる。これにより、処理水の再処理を行うことができ、また、より高度な処理を施すことができ、さらに効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 In the water treatment system of the above (7), the biological amount of the treated water is efficiently and effectively detected by using the nucleic acid extraction method of the living body according to any one of the above (1) to (3), and the treated water is used. If it is determined that the water cannot be discharged to the outside through the drainage section, the treated water can be returned to the water storage section by the return line. As a result, the treated water can be reprocessed, more advanced treatment can be performed, and more efficient and reliable water treatment can be realized.
(8)本開示の別の態様に係る水処理システムは、上記(7)の水処理システムであって、生体定量部での生体量の定量結果に基づいて水を排水部又は貯水部に送るための送水装置(送水装置7)と、送水装置の駆動を制御する制御部(制御部8)と、をさらに備えた。 (8) The water treatment system according to another aspect of the present disclosure is the water treatment system of (7) above, and sends water to the drainage section or the water storage section based on the quantification result of the biological amount in the biometric section. A water supply device (water supply device 7) for this purpose and a control unit (control unit 8) for controlling the drive of the water supply device are further provided.
上記(8)の水処理システムにおいては、上記(1)乃至(3)の何れかの生体の核酸抽出方法を用いて、処理水の生体量を効率的且つ効果的に検出し、処理水を排水部を通じて外部に排出する可否判断結果に応じて、制御部が送水装置を駆動制御し、処理水を自動的に貯水部に戻したり、排水部に排出することが可能になる。これにより、より一層効率的で信頼性の高い水処理を実現することが可能になる。 In the water treatment system of the above (8), the biological amount of the treated water is efficiently and effectively detected by using the nucleic acid extraction method of the living body according to any one of the above (1) to (3), and the treated water is used. The control unit drives and controls the water supply device according to the result of determining whether or not the water can be discharged to the outside through the drainage unit, and the treated water can be automatically returned to the water storage unit or discharged to the drainage unit. This makes it possible to realize even more efficient and highly reliable water treatment.
1 水処理システム
2 貯水部
3 水処理部
3a ろ過部
3b 除菌部
4 微生物定量部、微生物量決定部(生体定量部、生体量決定部)
5 排水部
6 返送ライン
7 送水装置
8 制御部
W1 排水(水)
W2 処理水
W2’ 試料液(試料水)
1
5
W2 treated water W2'sample liquid (sample water)
Claims (8)
生体の核酸抽出方法。 Sodium hypochlorite addition step of adding sodium hypochlorite so that the concentration is within the concentration range predetermined by the test to the sample solution for nucleic acid extraction of the living body, and the above-mentioned hypochlorite. The present invention comprises a nucleic acid extraction step of extracting the nucleic acid of the microorganism to be extracted from the sample solution to which sodium is added.
Nucleic acid extraction method for living organisms.
前記次亜塩素酸ナトリウム濃度決定工程における前記試験では、前記次亜塩素酸ナトリウムの濃度が異なる複数の試料液を用意し、定量的PCR法を用い、それぞれの前記試料液に対してアンプリコン増幅曲線を作成し、前記アンプリコン増幅曲線に基づいて前記次亜塩素酸ナトリウムの前記濃度範囲を決定する、
請求項1に記載の生体の核酸抽出方法。 The sodium hypochlorite concentration determination step for determining the concentration range of the sodium hypochlorite is provided.
In the test in the step of determining the sodium hypochlorite concentration, a plurality of sample solutions having different concentrations of the sodium hypochlorite were prepared, and a quantitative PCR method was used to amplify the amplicon for each of the sample solutions. A curve is created and the concentration range of the sodium hypochlorite is determined based on the amplicon amplification curve.
The method for extracting nucleic acid of a living body according to claim 1.
請求項1又は2に記載の生体の核酸抽出方法。 The living body is a microorganism,
The method for extracting nucleic acid of a living body according to claim 1 or 2.
生体の核酸抽出が行われるための試料液に対し、試験によって予め決定した濃度範囲内の濃度となるように次亜塩素酸ナトリウムを添加する次亜塩素酸ナトリウム添加工程、及び前記次亜塩素酸ナトリウムを添加した前記試料液から核酸抽出対象の前記生体の核酸を抽出する核酸抽出工程を備えた生体の核酸抽出方法を用い、前記水を前記水処理部で処理した後の処理水から得た前記試料液に対して核酸抽出を行い、前記処理水の中の生体量を定量する生体定量部と、
前記生体定量部で定量した前記生体量が予め設定した設定値以下の場合に前記処理水を排出する排水部と、を備えた、
水処理システム。 A water treatment unit that improves the quality of the water to be treated,
A step of adding sodium hypochlorite to a sample solution for nucleic acid extraction of a living body so that the concentration is within a concentration range predetermined by a test, and the hypochlorite addition step. Using a living body nucleic acid extraction method comprising a nucleic acid extraction step of extracting the nucleic acid of the living body to be nucleic acid extracted from the sample solution to which sodium was added, the water was obtained from the treated water after being treated by the water treatment unit. A biometric unit that extracts nucleic acid from the sample solution and quantifies the amount of biometrics in the treated water.
A drainage unit for discharging the treated water when the biological amount quantified by the biometric unit is equal to or less than a preset set value is provided.
Water treatment system.
請求項4に記載の水処理システム。 The water treatment unit includes a filtration unit that filters the water.
The water treatment system according to claim 4.
請求項4に記載の水処理システム。 The water treatment unit includes a sterilization unit for sterilizing the water.
The water treatment system according to claim 4.
前記生体定量部で定量した前記生体量が前記設定値を上回った場合に前記処理水を前記貯水部に戻す返送ラインと、をさらに備えた、
請求項4乃至6の何れか1項に記載の水処理システム。 A water storage unit that temporarily stores the water before the biometric amount is quantified by the biometric unit, and a water storage unit.
Further provided with a return line for returning the treated water to the water storage unit when the biological amount quantified by the biometric unit exceeds the set value.
The water treatment system according to any one of claims 4 to 6.
前記送水装置の駆動を制御する制御部と、をさらに備えた、
請求項7に記載の水処理システム。 A water supply device for sending the treated water to the drainage section or the water storage section based on the quantification result of the biological amount in the biometric section.
A control unit that controls the drive of the water supply device is further provided.
The water treatment system according to claim 7.
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