JP2021523943A - Gene editing for autoimmune diseases - Google Patents
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Abstract
例えば、対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または当該対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法を提供する。当該対象において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させるため、および／または当該対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させるための方法も提供する。本方法に従って使用するための組成物および単離された細胞も提供する。【選択図】なしFor example, reducing the amount of one or more genetic variants associated with susceptibility to autoimmune disease in one or more cells of the subject and / or protecting against autoimmune disease in one or more cells of the subject. Provided are methods of treating a subject with an autoimmune disease, including increasing the amount of one or more gene variants. To reduce the number of cells having one or more gene variants associated with susceptibility to autoimmune disease in the subject and / or having one or more gene variants that are protective against autoimmune disease in the subject It also provides a method for increasing the number of cells. Compositions and isolated cells for use according to the method are also provided. [Selection diagram] None
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／７６２，７０８号の利益を主張し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(Cross-reference of related applications)
This application claims the interests of US Provisional Application No. 62 / 762,708 filed May 14, 2018, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名前はＭ１０７３８５＿１０１０ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１３６，５９６バイトである。
(Sequence list)
This application includes a sequence listing submitted in ASCII format via EFS-Web, which is incorporated herein by reference in its entirety. The name of the ASCII copy made on May 14, 2019 is M107385_1010WO_Sequence_Listing_ST25. It is txt and has a size of 136,596 bytes.
自己免疫疾患および免疫介在疾患は、健康な体組織の死滅を引き起こす体内に正常に存在する物質および組織に対する体の異常な免疫応答を特徴とする。従って自己免疫疾患は、体の免疫系が誤って健康な体組織を攻撃した際に生じる。多発性硬化症（「ＭＳ」）、関節リウマチ（「ＲＡ」）、１型糖尿病（「Ｔ１Ｄ」）、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）、クローン病（「ＣＤ」）、好酸球性食道炎、セリアック病、乾癬および狼瘡を含む８０種を超える自己免疫疾患が存在する。自己免疫疾患の正確な原因は完全には分かっていないが、多くは遺伝および環境要素の両方を有していると考えられている。自己免疫疾患の治療のための薬物開発の既存のパラダイムは特定のシグナル伝達経路を標的にする。しかしそのような疾患の複雑性によりこれらの経路をモデル化することが難しくなり、得られる治療は望まれているほど有効なものではない。そのため当該技術分野において自己免疫疾患の治療に関連する新しいパラダイムが必要とされている。 Autoimmune and immune-mediated diseases are characterized by an abnormal immune response of the body to substances and tissues normally present in the body that cause the death of healthy body tissues. Therefore, autoimmune disease occurs when the body's immune system accidentally attacks healthy body tissue. Polysclerosis (“MS”), rheumatoid arthritis (“RA”), type 1 diabetes (“T1D”), ulcerative colitis (“UC”), Crohn's disease (“CD”), eosinophilic esophagus There are more than 80 autoimmune diseases, including inflammation, celiac disease, psoriasis and ulcerative colitis. The exact cause of autoimmune disease is not completely known, but many are thought to have both genetic and environmental components. The existing paradigm of drug development for the treatment of autoimmune diseases targets specific signaling pathways. However, the complexity of such diseases makes it difficult to model these pathways, and the treatments obtained are not as effective as desired. Therefore, there is a need for new paradigms related to the treatment of autoimmune diseases in the art.
対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または当該対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、当該対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および当該対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において保護的遺伝子バリアントの量を増加させることを含む。 Reducing the amount of one or more gene variants associated with susceptibility to autoimmune disease in one or more cells of interest and / or being protective against autoimmune disease in one or more cells of interest Provided are methods of treating a subject with an autoimmune disease, including increasing the amount of one or more gene variants. In some embodiments, the method reduces the amount of susceptibility gene variants in one or more immune cells and / or one or more hematopoietic stem cells of the subject, and one or more immune cells of the subject and / Or include increasing the amount of protective gene variant in one or more hematopoietic stem cells.
対象において自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させること、および／または当該対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させることを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法も提供する。 Decrease the number of cells with one or more gene variants associated with susceptibility to autoimmune disease in a subject and / or cells with one or more gene variants that are protective against autoimmune disease in the subject Also provided are methods of treating subjects with autoimmune disorders, including increasing the number of.
いくつかの態様では、当該細胞は免疫細胞および／または造血幹細胞である。いくつかの態様では、当該免疫細胞は、白血球、食細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、自然リンパ球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞のうちの１つ以上を含む。 In some embodiments, the cells are immune cells and / or hematopoietic stem cells. In some embodiments, the immune cell is among leukocytes, phagocytic cells, macrophages, neutrophils, dendritic cells, innate lymphoid cells, eosinophils, basophils, natural killer cells, B cells and T cells. Includes one or more.
いくつかの態様は、保護的遺伝子バリアントを含む免疫細胞および／または造血幹細胞、および／または保護的遺伝子バリアントを含み、かつ感受性遺伝子バリアントを含んでいない免疫細胞および／または造血幹細胞を当該対象に投与することを含む。いくつかの態様では、当該対象（または当該対象の細胞または細胞集団）における保護的タンパク質バリアント：感受性タンパク質バリアントの割合を増加させる。すなわち、保護的タンパク質バリアントの量を感受性タンパク質バリアントの量に対して増加させる。 In some embodiments, immune cells and / or hematopoietic stem cells containing a protective gene variant, and / or immune cells and / or hematopoietic stem cells that include a protective gene variant and do not contain a susceptibility gene variant, are administered to the subject. Including doing. In some embodiments, the proportion of protective protein variants: sensitive protein variants in the subject (or cell or population of the subject) is increased. That is, the amount of protective protein variant is increased relative to the amount of sensitive protein variant.
いくつかの態様は、第１の対象から免疫細胞および／または造血幹細胞を得ること、得られた免疫細胞および／または造血幹細胞を変化させて感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させること、および変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞を治療を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの態様では、当該免疫細胞および／または造血幹細胞は当該対象の血液または骨髄から得る。いくつかの態様では、第１の対象は治療を必要とする対象である。いくつかの態様では、変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞は静脈投与または骨髄移植によって投与する。 In some embodiments, obtaining immune cells and / or hematopoietic stem cells from a first subject, altering the resulting immune cells and / or hematopoietic stem cells to reduce the amount of susceptibility gene variants, and / or protection. Includes increasing the amount of target gene variant and administering altered immune cells and / or hematopoietic stem cells to subjects in need of treatment. In some embodiments, the immune cells and / or hematopoietic stem cells are obtained from the blood or bone marrow of the subject. In some embodiments, the first subject is a subject in need of treatment. In some embodiments, altered immune cells and / or hematopoietic stem cells are administered by intravenous administration or bone marrow transplantation.
いくつかの態様は、免疫細胞および／または造血幹細胞の投与前に当該対象の造血幹細胞の少なくとも一部を除去することを含む。いくつかの態様では、除去することは、当該対象に化学療法薬または放射線を投与すること、当該対象に抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を投与すること、および／または当該対象にＣＤ４７遮断薬を投与することを含む。 Some embodiments include removing at least a portion of the subject's hematopoietic stem cells prior to administration of the immune cells and / or hematopoietic stem cells. In some embodiments, removal is the administration of a chemotherapeutic agent or radiation to the subject, administration of an anti-c-Kit monoclonal antibody to the subject, and / or administration of a CD47 blocker to the subject. Including that.
いくつかの態様は、当該対象に遺伝子改変剤を投与することを含み、この遺伝子改変剤は、（ａ）当該対象の１つ以上の細胞において感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）当該対象の１つ以上の細胞において保護的遺伝子バリアントの量を増加させる。いくつかの態様では、遺伝子改変剤はヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、当該ヌクレアーゼは、（１）クラス２のＣＲＩＳＰＲ（ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文反復））関連ヌクレアーゼ、（２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、（３）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または（４）メガヌクレアーゼである。例えばいくつかの態様では、当該ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３またはＣｓｆ４を含む。いくつかの態様では、当該ヌクレアーゼはＣａｓ９またはＣｐｆ１を含む。 Some embodiments include administering to the subject a genetic modifier, which (a) reduces the amount of susceptibility gene variant in one or more cells of the subject and / or ( b) Increase the amount of protective gene variant in one or more cells of interest. In some embodiments, the genetic modifier comprises a nuclease. In some embodiments, the nuclease is (1) a class 2 CRISPR (regularly-interspaced short palindromic repeat) -related nuclease, (2) a zinc finger nuclease (2) ZFN), (3) palindromic factor-like effector nuclease (TALEN), or (4) meganuclease. For example, in some embodiments, the nuclease is Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5. , Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, Csx1 Or it contains Csf4. In some embodiments, the nuclease comprises Cas9 or Cpf1.
（ａ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する抵抗性または（ｉｉ）自己免疫疾患に対する高い感受性に関連する当該対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する高い感度または（ｉｉ）自己免疫疾患に対して保護的な当該対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために対象の免疫細胞および／または造血幹細胞のＤＮＡを編集することを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法も提供する。 (A) (i) One or more species associated with the distribution of bacteria in the subject's intestine associated with resistance to a particular drug to treat an autoimmune disorder or (ii) high susceptibility to an autoimmune disorder In the intestine of the subject, which reduces the amount of genetic variants and / or (b) (i) is highly sensitive to specific drugs for treating autoimmunity or (ii) is protective against autoimmunity. Also provided are methods of treating subjects with autoimmunity disorders, including editing the DNA of the subject's immune cells and / or hematopoietic stem cells to increase the amount of one or more gene variants associated with the distribution of the bacteria in. do.
いくつかの態様では、当該遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアントまたはＬＹ７５バリアントである。いくつかの態様では自己免疫疾患は炎症性腸疾患を含み、ここでは保護的遺伝子バリアントは、ＩＬ２３Ｒタンパク質におけるＲ３８１Ｑ突然変異、Ｇ１４９Ｒ突然変異およびＶ３６２Ｉ突然変異のうちの１つ以上をコードする。いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアントは、ｒｓ１１２０９０２６におけるＧからＡへの突然変異を含む。 In some embodiments, the gene variant is IL23R variant, CARD9 variant, NOD1 / 2 variant, PTPN22 variant, NADPH oxidase complex gene variant, TTC7A variant, XIAP variant, IL-10 variant, IL-10RA variant, IL-. 10RB variant, RPL7 variant, CPAMD8 variant, PRG2 variant, PRG3 variant, HEATR3 variant, ATG16L1 variant, TNFsf15 variant, MHCII variant, ELF1 variant, HLA-DB1 * 01:03 variant, HLA-BTNL2 variant, ARPC2 variant, IL12B variant, STAT1 variant, IRGM variant, IRF8 variant, TYK2 variant, STAT3 variant, IFNGR2 variant, IFNGR1 variant, RIPK2 variant, LRRK2 variant, C13orf31 variant, ECM1 variant, NKX2-3 variant, TNF variant, JAK1 variant, JAK2 variant, JAK3 variant, JAK3 variant. TPMT variant, NUDT15 variant, LOC441108 variant, PRDM1 variant, IRGM variant, MAGI1 variant, CLCA2 variant, 2q24.1 variant or LY75 variant. In some embodiments, the autoimmune disease comprises inflammatory bowel disease, where the protective gene variant encodes one or more of the R381Q, G149R and V362I mutations in the IL23R protein. In some embodiments, the protective gene variant comprises a G to A mutation in rs11209026.
いくつかの態様では、感受性遺伝子バリアントおよび保護的遺伝子バリアントは、（ａ）１人以上の家族構成員の表現型、１人以上の家族構成員の遺伝子パネルのシークエンシング、１人以上の家族構成員の全エクソームシークエンシングおよび／または１人以上の家族構成員の全ゲノムシークエンシング、（ｂ）細胞シグナル伝達および／または免疫系応答のコンピューターシミュレーション、（ｃ）線形および／または非線形回帰モデルなどによる表現型に影響を与える突然変異の機械モデル化、ニューラルネットワーク、（ｄ）遺伝子発現および／または遺伝子シグナル伝達を記述しているデータ、ならびに（ｅ）動物モデル（例えばブタ）のうちの１つ以上に基づいて決定する。 In some embodiments, the susceptibility gene variant and the protective gene variant are (a) phenotypes of one or more family members, sequencing of the gene panel of one or more family members, and one or more family structures. Whole exome sequencing of members and / or whole genome sequencing of one or more family members, (b) computer simulation of cell signaling and / or immune system response, (c) linear and / or nonlinear regression models, etc. One of (d) data describing gene expression and / or gene signaling, and (e) animal models (eg, pigs), mechanical modeling of mutations that affect phenotype by Determine based on the above.
その細胞のＤＮＡが、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集によって改変されている、単離された免疫細胞または造血幹細胞も提供する。 The DNA of the cell reduces the amount of one or more gene variants associated with (a) susceptibility to autoimmune disease and / or (b) one or more gene variants that are protective against autoimmune disease. Also provided are isolated immune cells or hematopoietic stem cells that have been modified by gene editing to increase the amount of.
その集団中の細胞の少なくとも約１０％が、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集により改変されている、免疫細胞または造血幹細胞の集団も提供する。 At least about 10% of the cells in the population (a) reduce the amount of one or more gene variants associated with susceptibility to autoimmune disease and (b) one that is protective against autoimmune disease. Also provided is a population of immune cells or hematopoietic stem cells that have been modified by gene editing to increase the amount of these gene variants.
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む組成物も提供する。 (I) Nucleic acid encoding CRISPR / Cas nuclease, (ii) Nucleic acid encoding a guide RNA or a guide RNA thereof that hybridizes with a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding a gene variant associated with susceptibility to autoimmune disease. , And (iii) a composition comprising a DNA repair template encoding a gene variant that is not associated with susceptibility to autoimmune disease.
いくつかの態様では、本組成物は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）その標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む。 In some embodiments, the composition hybridizes with (i) a nucleic acid encoding CRISPR / Cas nuclease, and (ii) a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding an unprotected gene variant of an autoimmune disease. Includes a guide RNA or a nucleic acid encoding the guide RNA, and (iii) a DNA repair template encoding a protective genetic variant of autoimmune disease at the location of its target sequence.
いくつかの態様では、本組成物は、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）自己免疫疾患に対する感受性に関連していない遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレート、ならびに（ｂ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたはそのガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）その標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレートを含む。 In some embodiments, the composition comprises a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding (a) (i) a nucleic acid encoding CRISPR / Cas nuclease, (ii) a gene variant associated with susceptibility to autoimmune disease. A guide RNA that hybridizes with or a nucleic acid that encodes the guide RNA, and (iii) a DNA repair template that encodes a gene variant that is not associated with susceptibility to autoimmune disease, and (b) (i) CRISPR / Casnuclease. Encoding nucleic acid, (iii) a guide RNA encoding a guide RNA or a guide RNA thereof that hybridizes with a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding an unprotected gene variant of autoimmune disease, and (iii) the target sequence. Includes a DNA repair template encoding a protective genetic variant of autoimmune disease at the location.
いくつかの態様では、本組成物は２つ以上のガイドＲＮＡを含み、このガイドＲＮＡはまとめて２つ以上の標的配列とハイブリッド形成する。 In some embodiments, the composition comprises two or more guide RNAs, which collectively hybridize with two or more target sequences.
いくつかの態様では、本組成物は、ＩＬ２３Ｒバリアント、ＣＡＲＤ９バリアント、ＮＯＤ１／２バリアント、ＰＴＰＮ２２バリアント、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子バリアント、ＴＴＣ７Ａバリアント、ＸＩＡＰバリアント、ＩＬ−１０バリアント、ＩＬ−１０ＲＡバリアント、ＩＬ−１０ＲＢバリアント、ＲＰＬ７バリアント、ＣＰＡＭＤ８バリアント、ＰＲＧ２バリアント、ＰＲＧ３バリアント、ＨＥＡＴＲ３バリアント、ＡＴＧ１６Ｌ１バリアント、ＴＮＦｓｆ１５バリアント、ＭＨＣＩＩバリアント、ＥＬＦ１バリアント、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３バリアント、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２バリアント、ＡＲＰＣ２バリアント、ＩＬ１２Ｂバリアント、ＳＴＡＴ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＩＲＦ８バリアント、ＴＹＫ２バリアント、ＳＴＡＴ３バリアント、ＩＦＮＧＲ２バリアント、ＩＦＮＧＲ１バリアント、ＲＩＰＫ２バリアント、ＬＲＲＫ２バリアント、Ｃ１３ｏｒｆ３１バリアント、ＥＣＭ１バリアント、ＮＫＸ２−３バリアント、ＴＮＦバリアント、ＪＡＫ１バリアント、ＪＡＫ２バリアント、ＪＡＫ３バリアント、ＴＰＭＴバリアント、ＮＵＤＴ１５バリアント、ＬＯＣ４４１１０８バリアント、ＰＲＤＭ１バリアント、ＩＲＧＭバリアント、ＭＡＧＩ１バリアント、ＣＬＣＡ２バリアント、２ｑ２４．１バリアントまたはＬＹ７５バリアントのうちの１つ以上あるいは上記の組み合わせを標的にするための薬剤を含む。 In some embodiments, the composition comprises IL23R variant, CARD9 variant, NOD1 / 2 variant, PTPN22 variant, NADPH oxidase complex gene variant, TTC7A variant, XIAP variant, IL-10 variant, IL-10RA variant, IL-. 10RB variant, RPL7 variant, CPAMD8 variant, PRG2 variant, PRG3 variant, HEATR3 variant, ATG16L1 variant, TNFsf15 variant, MHCII variant, ELF1 variant, HLA-DB1 * 01:03 variant, HLA-BTNL2 variant, ARPC2 variant, IL12B variant, STAT1 variant, IRGM variant, IRF8 variant, TYK2 variant, STAT3 variant, IFNGR2 variant, IFNGR1 variant, RIPK2 variant, LRRK2 variant, C13orf31 variant, ECM1 variant, NKX2-3 variant, TNF variant, JAK1 variant, JAK2 variant, JAK3 variant, JAK3 variant. Includes agents for targeting one or more of the TPMT variant, NUDT15 variant, LOC441108 variant, PRDM1 variant, IRGM variant, MAGI1 variant, CLCA2 variant, 2q24.1 variant or LY75 variant or a combination of the above.
本明細書において引用または参照されている全ての文献（「本明細書において引用されている文献」）、および本明細書において引用されている文献において引用または参照されている全ての文献は、本明細書または参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献において言及されているあらゆる製品のための製造業者の説明書、記載、製品仕様および製品シートと共に参照により本明細書に組み込まれ、かつ本発明の実施において用いることができる。より具体的には、全ての参照されている文献は、各個々の文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。 All references cited or referenced herein (“references cited herein”) and all references cited or referred to herein are referred to in the present invention. Incorporated herein by reference and incorporated herein by reference along with the manufacturer's instructions, descriptions, product specifications and product sheets for any product referred to herein by reference or reference. Can be used in practice. More specifically, all referenced documents are incorporated herein by reference to the same extent that each individual document is specifically and individually indicated to be incorporated by reference.
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語および技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４版（２０１２）（ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９５５）（Ｃｏｌｏｗｉｃｋ編）；ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（２０１３）（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ（２００８），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｋｅｎｄｅｗら編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９５）（Ｍｅｙｅｒｓ編）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版（１９９４）（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ編），Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 第４版（１９９２）（Ｍａｒｃｈ編）；ならびにＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版（２０１１）（ＨｏｆｋｅｒおよびＤｅｕｒｓｅｎ編）のうちの１つ以上に記載されている。 Unless otherwise defined, the technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this disclosure belongs. General terms and definitions of techniques in molecular biology are defined as Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) (Sambrook, Fritsch and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (20). And Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (edited by FM Ausube et al.); Methods in Enzymology (1955) (Colowic); PCR2: A Plastic Ed. Culture (1987) (edited by RI Freshney); Benjamin Lewin, Genes IX (2008), The Encyclopedia of Molecular Biology (1994) (edited by Kendew et al.), Molecular Biology ed.); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second Edition (1994) (Sainsbury ed.), Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed. (1992) (March ed.); and Transgenic Mouse Methods and Protocols, the first It is described in one or more of the second edition (2011) (Hofker and Deursen edition).
本明細書で使用される単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（前記）（ｔｈｅ）」はその文脈が明らかに別の意を示していない限り単数および複数の指示対象の両方を含む。 As used herein, the singular forms "one (a)", "one (an)" and "that (above) (the)" are singular unless the context clearly indicates otherwise. And includes both multiple referents.
「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載されている事象、状況および置換基が生じても生じなくてもよく、かつその記載はその事象または状況が生じる場合およびそれらが生じない場合を含むことを意味する。 The term "arbitrary" or "arbitrarily" may or may not result in the events, situations and substituents described thereafter, and the description is given when and when the event or situation occurs. Means to include the case not.
端点による数値範囲の記載は、全ての数およびそれぞれの範囲内の包含される分数ならびに記載されている端点を含む。 The description of the numerical range by endpoint includes all numbers and the contained fractions within each range as well as the endpoints listed.
パラメータ、量および一時的な持続期間などの測定可能な値を参照する場合に本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、開示されている発明において実施する上でそのようなばらつきが適当である限り、指定されている値からの＋／−１０％以下、＋１〜５％以下、＋／−１％以下、および＋／−０．１％以下のばらつきなどの、指定されている値からのばらつきを包含することが意図されている。当然のことながら、修飾語の「約」または「およそ」が指している値はそれ自体も具体的かつ好ましくは開示されている。 The terms "about" or "approximately" as used herein when referring to measurable values such as parameters, quantities and temporary duration are such in practice in the disclosed inventions. Designation, such as +/- 10% or less, + 1-5% or less, +/- 1% or less, and +/- 0.1% or less variation from the specified value, as long as the variation is appropriate. It is intended to include variability from the values being given. Not surprisingly, the value pointed to by the modifier "about" or "approximately" is itself specifically and preferably disclosed.
本明細書で使用される「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」または「造血骨髄幹細胞」という用語は、リンパ球系、赤血球系もしくは骨髄系細胞系統の造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化するかさらなる分化の開始を伴わずに幹細胞集団として増殖することができる多能性幹細胞または多分化能性幹細胞またはリンパ球系もしくは骨髄系（骨髄由来の）細胞である造血細胞を指す。ＨＳＣは例えば骨髄、末梢血、臍帯血、羊水または胎盤血または胚性幹細胞から得ることができる。ＨＳＣは自己複製し、かつ造血プロセスを通して成熟した血液細胞、例えば赤血球、血小板、顆粒球（好中球、好塩基球および好酸球など）、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞に分化するかそれらになるための経路を開始することができる。「造血幹細胞」という用語は、「原始造血幹細胞」すなわち長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ）および多分化能性前駆細胞（ＭＰＰ）を包含する。 As used herein, the terms "hematopoietic stem cell" or "HSC" or "hematopoietic bone marrow stem cell" differentiate into or further differentiate into hematopoietic precursor cells (HPCs) of lymphoid, erythroid or myeloid cell lineage. It refers to a hematopoietic cell that is a pluripotent stem cell or a pluripotent stem cell or a lymphocytic or myeloid (myelody-derived) cell that can proliferate as a stem cell population without initiation. HSCs can be obtained, for example, from bone marrow, peripheral blood, cord blood, amniotic fluid or placental blood or embryonic stem cells. HSCs are self-replicating and mature blood cells through the hematopoietic process, such as red blood cells, platelets, granulocytes (such as neutrophils, basophils and eosinophils), macrophages, B lymphocytes, T lymphocytes and natural killer cells. You can initiate a pathway to differentiate into or become them. The term "hematopoietic stem cells" includes "primitive hematopoietic stem cells" or long-term hematopoietic stem cells (LT-HSC), short-term hematopoietic stem cells (ST-HSC) and pluripotent progenitor cells (MPP).
本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は一般に、免疫応答に関与する造血幹細胞由来のあらゆる細胞を包含する。免疫細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞およびＢ細胞などのリンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球または好中球ならびにそのような細胞のあらゆる前駆細胞が挙げられる。特定の好ましい態様では、当該免疫細胞はＴ細胞であってもよい。本明細書で使用される「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、胸腺細胞、未成熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞などを含むＴ細胞系統内の全ての細胞を含むことが意図されている。「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７細胞ならびにＴ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞を含んでもよい。 As used herein, the term "immune cell" generally includes any cell derived from hematopoietic stem cells involved in the immune response. Immune cells include, but are not limited to, lymphocytes such as T cells and B cells, antigen presenting cells (APC), dendritic cells, monospheres, macrophages, natural killer (NK) cells, mast cells, and the like. Included are basal cells, eosinophils or neutrophils and any precursor cells of such cells. In certain preferred embodiments, the immune cell may be a T cell. As used herein, the term "T cell" (ie, T lymphocyte) is intended to include all cells within the T cell lineage, including thymocytes, immature T cells, mature T cells, and the like. There is. The term "T cell" includes CD4 + and / or CD8 + T cells, T helper ( Th ) cells such as Th 1, Th 2 and Th 17 cells and T regulatory ( Treg ) cells. But it may be.
本明細書で使用される「改変された」という用語は、免疫細胞またはＨＳＣが人工の分子もしくは細胞生物学プロセスなどの人工のプロセスに供されているかそれによって操作され、当該細胞の少なくとも１つ特性の改変が得られることを広く意味する。そのような人工のプロセスは、例えばインビトロまたはインビボで行うことができる。 The term "modified" as used herein refers to at least one of an immune cell or HSC that has been subjected to or manipulated by an artificial molecule or artificial process such as a cell biology process. It broadly means that the properties can be modified. Such artificial processes can be performed, for example, in vitro or in vivo.
「発現変化」という用語は、免疫細胞またはＨＳＣの改変により、記載されている遺伝子またはポリペプチドの発現が変化、すなわち変更または調節されていることを意味する。「発現変化」という用語は前記変化のあらゆる方向およびあらゆる程度を包含する。故に「発現変化」は発現の定性的および／または定量的変化を反映していてもよく、かつ具体的には発現の増加（例えば活性化または刺激）あるいは減少（例えば阻害）の両方を包含する。 The term "expression change" means that the expression of a gene or polypeptide described is altered, ie altered or regulated, by modification of an immune cell or HSC. The term "expression change" includes all directions and all degrees of said change. Thus, "expression changes" may reflect qualitative and / or quantitative changes in expression, and specifically include both increased (eg activation or stimulation) or decreased (eg inhibition) of expression. ..
本明細書で使用される「増加された」または「増加する」あるいは「上方制御された」または「上方制御する」という用語は一般に、統計学的に有意な量の増加を意味する。疑義を避けるために付言すると、「増加された」は、参照レベルと比較した場合に少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上の増加、例えば少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍またはそれ以上の増加などの、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の統計的に有意な増加を包含する。 As used herein, the terms "increased" or "increased" or "upwardly controlled" or "upwardly controlled" generally mean a statistically significant amount of increase. To avoid doubt, "increased" is at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% when compared to reference levels. At least 10 when compared to reference levels, such as an increase of at least 90%, at least 100% or more, such as an increase of at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 10-fold or more. Includes a statistically significant increase in%.
本明細書で使用される「減少された」または「減少する」あるいは「低下する」または「低下された」あるいは「下方制御する」または「下方制御された」という用語は一般に、参照に対して統計的に有意な量の減少を意味する。疑義を避けるために付言すると、「減少された」は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の統計的に有意な減少、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の減少、最大で１００％の減少（１００％を含む）（すなわち参照試料と比較した場合に存在しないレベル）、または参照レベルと比較した場合に１０〜１００％のあらゆる減少を包含する。「消失する」または「消失された」という用語は、特に１００％の減少、すなわち参照試料と比較した場合に存在しないレベルを指してもよい。 The terms "decreased" or "decreased" or "decreased" or "decreased" or "downwardly controlled" or "downwardly controlled" as used herein are generally referred to. Means a statistically significant amount of reduction. To avoid doubt, "reduced" is a statistically significant reduction of at least 10% when compared to reference levels, such as at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%. At least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or more reduction, up to 100% reduction (including 100%) (ie levels that do not exist when compared to the reference sample), or reference level Includes any reduction of 10-100% when compared to. The term "disappeared" or "disappeared" may refer to a reduction of 100%, that is, a level that is not present when compared to the reference sample.
「量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）」、「量（ａｍｏｕｎｔ）」および「レベル」という用語は同義であり、一般に当該技術分野においてよく理解されている。これらの用語は特に、被験対象（例えば、細胞、細胞集団、組織、臓器または生物の中または表面、例えば対象の生体試料中）のマーカーの絶対的定量化、あるいは被験対象のマーカーの相対的定量化、すなわち参照値などの別の値または当該マーカーのベースラインを示すある範囲の値に対する定量化を指してもよい。例えばベースラインまたは参照値は、自己免疫疾患を有するか自己免疫疾患を有していない対象（または当該対象からの細胞もしくは細胞集団）、あるいは自己免疫疾患を発症するリスクがあるか自己免疫疾患を発症するリスクがない対象（または当該対象からの細胞もしくは細胞集団）における遺伝子バリアントの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベルまたは量（ａｍｏｕｎｔ）の決定に基づいて得ることができる。そのような値または範囲は従来から知られているとおりに得てもよい。場合によっては、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、量（ａｍｏｕｎｔ）またはレベルは測定された濃度である。量はＰＣＲ、ＵＶ吸収、熱量測定、蛍光に基づく測定、ジフェニルアミン反応法およびそれ以外などの公知の技術を用いて定量化することができる。例えば、Ｌｉ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５１：１８−２４（２０１４）；Ｆｉｇｕｅｒｏａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３（６）：３９８２−８８（２０１７）；Ｐｓｉｆｉｄｉ，ＰＬＯＳＥ ＯＮＥ，１０（１）：ｅ０１１５９６０（１８頁）（２０１５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）（Ｃｏｌｉｇａｎら編）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）（Ａｕｓｕｂｅｌら編）を参照されたい。 The terms "quantity", "amount" and "level" are synonymous and are generally well understood in the art. These terms are, in particular, the absolute quantification of markers in a test subject (eg, in or on the surface of a cell, cell population, tissue, organ or organism, eg, in a biological sample of subject), or the relative quantification of markers in a test subject. It may also refer to the quantification of another value, such as a reference value, or a range of values that indicate the baseline of the marker. For example, the baseline or reference value indicates a subject with or without an autoimmune disorder (or a cell or cell population from that subject), or a risk of developing an autoimmune disorder or an autoimmune disorder. It can be obtained based on determination of the quantity, level or amount of a gene variant in a subject (or cell or cell population from that subject) at no risk of developing it. Such values or ranges may be obtained as previously known. In some cases, the quantity, quantity or level is the measured concentration. The amount can be quantified using known techniques such as PCR, UV absorption, calorific value measurement, fluorescence based measurement, diphenylamine reaction method and others. For example, Li, Analytical Biochemistry, 451: 18-24 (2014); Figueroa-Gonzarez, Oncol. Lett. , 13 (6): 3982-88 (2017); Psifidi, PLOSE ONE, 10 (1): e0115960 (page 18) (2015); See Molecular Biology (2003) (edited by Ausubel et al.).
所与の遺伝子またはポリペプチドの発現に関与するいくつかの連続的分子機序のいずれか１つ以上を免疫細胞またはＨＳＣの改変によって標的にしてもよい。限定されるものではないがこれらは、遺伝子配列を標的にすること（例えば遺伝子配列のポリペプチドコード、非コードもしくは調節部分を標的にすること）、遺伝子のＲＮＡへの転写、ポリアデニル化および該当する場合はＲＮＡのスプライシングおよび／またはｍＲＮＡへの他の転写後修飾、ｍＲＮＡの細胞質内への局在化、該当する場合はｍＲＮＡの他の転写後修飾、ｍＲＮＡのポリペプチド鎖への翻訳、該当する場合はポリペプチドの翻訳後修飾および／またはポリペプチド鎖のポリペプチドの成熟した立体構造への折り畳みを含んでもよい。分泌型ポリペプチドおよび膜貫通ポリペプチドなどの区画化されたポリペプチドの場合、これはポリペプチドの輸送、すなわちポリペプチドを適当な細胞下区画または細胞小器官、膜、例えば血漿膜または細胞外に輸送する細胞機構を標的にすることをさらに含んでもよい。 One or more of several successive molecular mechanisms involved in the expression of a given gene or polypeptide may be targeted by modification of immune cells or HSCs. These include, but are not limited to, targeting the gene sequence (eg, targeting the polypeptide code, non-coding or regulatory portion of the gene sequence), transcription of the gene into RNA, polyadenylation and applicable. Splicing RNA and / or other post-transcriptional modifications to mRNA, localization of mRNA into the cytoplasm, other post-transcriptional modifications of mRNA, if applicable, translation of mRNA into polypeptide chains, applicable The case may include post-translational modification of the polypeptide and / or folding of the polypeptide chain into the mature conformation of the polypeptide. In the case of compartmentalized polypeptides such as secretory and transmembrane polypeptides, this transports the polypeptide, i.e. the polypeptide to the appropriate subcellular compartment or organelle, membrane, eg plasma membrane or extracellular. It may further include targeting the transporting cellular machinery.
故に「発現変化」は、改変された免疫細胞またはＨＳＣによる記載されている遺伝子産物の産生変化を特に意味してもよい。本明細書で使用される「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）または遺伝子によってコードされたかＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含む。 Thus, "change in expression" may specifically mean a change in the production of the described gene product by a modified immune cell or HSC. As used herein, the term "gene product" includes RNA transcribed from a gene (eg, mRNA) or polypeptide encoded by or translated from RNA.
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、エクソンおよび（任意に）イントロン配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を指す。「遺伝子」は、遺伝子産物の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域、イントロンおよびプロモーターを含む遺伝子産物のコード配列ならびに遺伝子産物の非コード領域を指す。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列またはｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であってもよい。また遺伝子はそこに結合された５’もしくは３’非翻訳配列を任意に含むコード領域（例えばエクソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸は単鎖分子または分子を含む特定の配列の１つ以上の相補的な鎖すなわち「相補鎖」を含む二本鎖分子を包含してもよい。本明細書で使用される「単鎖核酸」は接頭辞「ｓｓ」によって、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって示されている場合がある。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを指してもよく、これはコード領域の前後の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロンおよび非翻訳配列、例えば５’および３’非翻訳配列ならびに調節配列）を含む。また遺伝子はコード領域の全てもしくは一部および／またはそこに結合された５’もしくは３’非翻訳配列を含むインビトロで産生された増幅された核酸分子であってもよい。「遺伝子バリアント」という用語は、野生型、突然変異型または単一ヌクレオチド多型などの遺伝子の型を指すために使用される。いくつかの遺伝子バリアントは自己免疫疾患に対する感受性の増加に関連していてもよい。いくつかの遺伝子バリアントは自己免疫疾患に対して保護的であってもよい。 As used herein, the term "gene" refers to a nucleic acid that contains an open reading frame that encodes a polypeptide that contains both exons and (optionally) intron sequences. "Gene" refers to the 5'UTR and 3'UTR regions of a gene product, the coding sequence of a gene product including an intron and a promoter, and the non-coding region of the gene product. The coding region of the gene may be an amino acid sequence or a nucleotide sequence encoding a functional RNA such as tRNA, rRNA, catalytic RNA, siRNA, miRNA and antisense RNA. The gene may also be an mRNA or cDNA corresponding to a coding region (eg, exon and miRNA) optionally containing a 5'or 3'untranslated sequence attached thereto. The nucleic acid may include a single-stranded molecule or a double-stranded molecule containing one or more complementary strands or "complementary strands" of a particular sequence containing the molecule. As used herein, "single-stranded nucleic acid" may be indicated by the prefix "ss" and double-stranded nucleic acid may be indicated by the prefix "ds". The term "gene" may refer to a segment of DNA that is involved in producing a polypeptide chain, which is the intervening sequences (introns and non-introns) between the regions before and after the coding region as well as the individual coding segments (exons). Includes translated sequences, such as 5'and 3'untranslated sequences and regulatory sequences). The gene may also be an in vitro produced amplified nucleic acid molecule containing all or part of the coding region and / or 5'or 3'untranslated sequences attached thereto. The term "genotype" is used to refer to a genotype such as wild-type, mutant or single nucleotide polymorphism. Some genetic variants may be associated with increased susceptibility to autoimmune diseases. Some genetic variants may be protective against autoimmune diseases.
本明細書で使用される「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子内でヌクレオチド残基を結合しているリン酸ジエステル結合を切断することができる物質、例えばタンパク質または小分子を広く指す。いくつかの態様ではヌクレアーゼは、核酸分子に結合し、かつ核酸分子内でヌクレオチド残基を結合しているリン酸ジエステル結合を切断することができるタンパク質、例えば酵素であってもよい。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でリン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。好ましくは、当該ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼである。好ましくはヌクレアーゼは、「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」または「標的部位」と呼ぶことができる特異的ヌクレオチド配列内の特異的リン酸ジエステル結合に結合し、かつ／またはそれを切断する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは単鎖標的部位を認識することができ、他の態様ではヌクレアーゼは二本鎖標的部位、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識することができる。いくつかのエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸標的部位を対称的に切断し、すなわちその末端が塩基対ヌクレオチド（鈍端としても知られている）を含むように両方の鎖を同じ位置で切断する。他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸標的部位を非対称的に切断し、すなわちその末端が不対ヌクレオチドを含むように各鎖を異なる位置で切断する。二本鎖ＤＮＡ分子の末端にある不対ヌクレオチドは「オーバーハング」ともいい、例えば不対ヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’もしくは５’末端のどちらを形成しているかに応じて「５’オーバーハング」または「３’オーバーハング」ともいう。 As used herein, the term "nuclease" broadly refers to a substance that can cleave a phosphodiester bond that binds a nucleotide residue within a nucleic acid molecule, such as a protein or small molecule. In some embodiments, the nuclease may be a protein, such as an enzyme, capable of cleaving a phosphodiester bond that binds to a nucleic acid molecule and that binds a nucleotide residue within the nucleic acid molecule. The nuclease may be an endonuclease that cleaves the phosphodiester bond within the polynucleotide chain, or an exonuclease that cleaves the phosphodiester bond at the end of the polynucleotide chain. Preferably, the nuclease is an endonuclease. Preferably, the nuclease is site-specific that binds to and / or cleaves a specific phosphodiester bond within a specific nucleotide sequence that can be referred to as a "recognition sequence," "nuclease target site," or "target site." Nuclease. In some embodiments, the nuclease can recognize a single-stranded target site, and in other embodiments, the nuclease can recognize a double-stranded target site, such as a double-stranded DNA target site. Some endonucleases cleave the double-stranded nucleic acid target site symmetrically, i.e. cleave both strands at the same position so that their ends contain base pair nucleotides (also known as blunt ends). Other endonucleases asymmetrically cleave the double-stranded nucleic acid target site, i.e., cleave each strand at different positions so that its ends contain unpaired nucleotides. Unpaired nucleotides at the ends of double-stranded DNA molecules are also called "overhangs," for example, "5'over" depending on whether the unpaired nucleotides form the 5'or 5'end of each DNA strand. Also called "hang" or "3'overhang".
標的集団
対象における自己免疫疾患を治療または予防するための方法および組成物を提供する。いくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患であると診断されている。いくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患を発症するリスクがある。いくつかの態様は、そのリスクまたは症状が、保護的突然変異を追加するため、および／または感受性突然変異を除去するために当該疾患を引き起こすプロセスに関与する関連する組織を編集することによって減少するあらゆる疾患の治療のための方法および組成物に関する。そのような疾患としては、限定されるものではないが、好酸球性食道炎（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４８（６）：１１４３−５７（２０１５）を参照）、セリアック病（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ａｃｈｕｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４７（６）：５７７−７８（２０１５）を参照）、乾癬（Ｔｓｏｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：論文１５３８２（８頁）（２０１７）を参照）、１型糖尿病（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏ，Ａｃｔａ Ｄｉａｂｅｔｏｌ．５１（３）：４０３−１１（２０１４）を参照）、関節リウマチ（Ｅｙｒｅｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４４（１２）：１３３６−１３４０（２０１２）を参照）、および炎症性腸疾患（Ｈｕａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，５４７：１７３−１７８（２０１７）を参照）が挙げられる。列挙されている参考文献は、上記表現型のための感受性または保護に関連する遺伝子の非限定的なセットについて記述している。
Target Populations Provide methods and compositions for treating or preventing autoimmune diseases in a subject. In some embodiments, the subject has been diagnosed with an autoimmune disorder. In some embodiments, the subject is at risk of developing an autoimmune disease. In some embodiments, the risk or symptom is reduced by editing the relevant tissues involved in the process causing the disease to add protective mutations and / or to eliminate susceptible mutations. With respect to methods and compositions for the treatment of any disease. Such diseases include, but are not limited to, eosinophilic esophagitis (see Rothemberg, Gastroenterology, 148 (6): 1143-57 (2015)), celiac disease (Gutierrez-Achury, Nature Genetics). , 47 (6): see 577-78 (2015)), psoriasis (Tsoi, Nature Communications, 8: see Article 15382 (page 8) (2017)), type 1 diabetes (Bonifacio, Acta Diabetol. 51 (3) ): 403-11 (2014)), rheumatoid arthritis (see Eyrel, Nat. Genet., 44 (12): 1336-1340 (2012)), and inflammatory bowel disease (Hang, Nature, 547: 173). -178 (see 2017)). The references listed describe a non-limiting set of genes associated with susceptibility or protection for the above phenotypes.
いくつかの態様では、自己免疫疾患は炎症性腸疾患である。炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎およびクローン病を含むように広く分類されている。潰瘍性大腸炎は大腸を冒し、かつ主に粘膜を侵して糜爛および潰瘍を頻繁に引き起こす未知の病因のびまん性かつ非特異的な炎症である。通常この疾患は、血性下痢および様々な程度の一般症状を示す。一般にこの疾患は、症状の広がり（汎大腸炎、左側大腸炎、直腸炎または右側もしくは区域性大腸炎）、疾患段階（活動期または寛解期など）、重症度（軽度、中度、重度）または臨床経過（再発寛解型、慢性持続型、急性劇症型または初回発作型）に従って分類される。他方、クローン病は潰瘍形成および線維形成を伴う肉芽腫性病変が口腔から肛門まで消化管を通して不連続的に生じる疾患である。病変の部位および範囲に従って異なるが症状としては熱、栄養障害および貧血が挙げられ、関節炎、虹彩炎または肝臓疾患などの全身合併症が生じる可能性もある。一般に、この疾患は例えば病変の位置（小腸型、小腸−大腸型、直腸型または胃十二指腸型）あるいは疾患段階（活動期または非活動期など）に従って分類される。さらに、潰瘍性大腸炎およびクローン病は未知の原因を有し、根本的な治療法が存在せず、かつ完全な治癒を達成するのは難しい。従って再発および寛解を繰り返し、それにより当該対象の生活の質はかなり損われる。 In some embodiments, the autoimmune disease is inflammatory bowel disease. Inflammatory bowel disease is broadly classified to include ulcerative colitis and Crohn's disease. Ulcerative colitis is a diffuse and non-specific inflammation of unknown etiology that affects the large intestine and primarily affects the mucous membranes, causing erosions and ulcers frequently. The disease usually presents with bloody diarrhea and varying degrees of general symptoms. Generally, the disease is spread (pan-colitis, left-sided colitis, proctitis or right-sided or segmental colitis), disease stage (active or remission, etc.), severity (mild, moderate, severe) or Classified according to clinical course (relapsing-remitting, chronic persistent, acute fulminant or first-episode). Crohn's disease, on the other hand, is a disorder in which granulomatous lesions with ulceration and fibrosis occur discontinuously through the gastrointestinal tract from the oral cavity to the anus. Symptoms include fever, malnutrition and anemia, depending on the location and extent of the lesion, and may result in systemic complications such as arthritis, iritis or liver disease. Generally, the disease is classified according to, for example, the location of the lesion (small intestine, small intestine-colon, rectal or gastroduodenal) or stage of the disease (active or inactive, etc.). In addition, ulcerative colitis and Crohn's disease have unknown causes, there is no radical cure, and complete cure is difficult to achieve. Therefore, relapses and remissions are repeated, which significantly impairs the subject's quality of life.
いくつかの態様では、当該対象は炎症性腸疾患などの自己免疫疾患に遺伝的に罹患しやすい。例えばいくつかの態様では、当該対象は自己免疫疾患を有するか発症する高いリスクに関連する１つ以上の対立遺伝子（すなわち感受性遺伝子バリアント）を有する。自己免疫疾患に対するそのような高い感受性が原因で、自己免疫疾患を有したりそれを発症する高いリスクを有したりしない対象と比較した場合に、当該対象は自己免疫疾患に関連する多量の１種以上のタンパク質バリアント（すなわち感受性タンパク質バリアント）を有している可能性がある。 In some embodiments, the subject is genetically susceptible to an autoimmune disease such as inflammatory bowel disease. For example, in some embodiments, the subject has one or more alleles (ie, susceptibility gene variants) associated with or at high risk of developing an autoimmune disease. Due to such high susceptibility to autoimmune disease, the subject has a large amount of 1 associated with the autoimmune disease when compared to a subject who does not have or have a high risk of developing it. It may have more than a species of protein variant (ie, a sensitive protein variant).
感受性遺伝子は自己免疫疾患の発症に直接影響を与える遺伝子に限定されない。例えばいくつかの態様では、感受性遺伝子は特定の治療法に対する当該対象の応答に関連している。いくつかの態様では、感受性遺伝子は当該対象の微生物叢（例えば腸内微生物叢）に関連しており、微生物叢は理論によって縛られるものではないが、自己免疫疾患の発症および進行に影響を与えると考えられている。 Sensitivity genes are not limited to genes that directly affect the development of autoimmune diseases. For example, in some embodiments, the susceptibility gene is associated with the subject's response to a particular treatment. In some embodiments, the susceptibility gene is associated with the microbial flora of the subject (eg, the intestinal microbial flora), which is not theoretically bound but affects the onset and progression of autoimmune disorders. It is believed that.
感受性遺伝子は、当該技術分野で知られている手段などのあらゆる手段によって同定することができる。例えばいくつかの態様では、感受性遺伝子は自己免疫疾患に直接または間接的に関連していることが当該技術分野で知られている。いくつかの態様では感受性遺伝子は、特定の表現型を示すかそれによって冒されている親類を含む家系図に基づいて同定される。いくつかの態様では感受性遺伝子は、１人以上の家族構成員の全エクソームもしくは全ゲノムシークエンシングによって同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は細胞シグナル伝達のコンピューターシミュレーションおよび／または免疫系応答のコンピューターシミュレーションによって同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は、ニューラルネットワークまたは他の線形および非線形回帰モデルなどを用いる機械モデル化および／または特定の突然変異が遺伝子シグナル伝達を乱すことが分かっている遺伝子シグナル伝達ネットワークを用いて同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子は動物モデル（例えばブタまたはマウス）を用いて同定される。いくつかの態様では、感受性遺伝子を同定する様々な方法（例えば、公知の感受性遺伝子を同定すること、家系図を参照して特定の表現型を同定すること、および全エクソームもしくは全ゲノム解析のうちの１つ以上）を組み合わせて治療を必要とする個人を特定する。すなわちいくつかの態様では、自己免疫疾患（例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病などの特定の自己免疫疾患）を有する家族構成員に共通する遺伝子は感受性遺伝子であると決定される。 The susceptibility gene can be identified by any means, such as those known in the art. For example, in some embodiments, the susceptibility gene is known in the art to be directly or indirectly associated with an autoimmune disease. In some embodiments, the susceptibility gene is identified based on a family tree that includes a relative that exhibits or is affected by a particular phenotype. In some embodiments, the susceptibility gene is identified by whole exome or whole genome sequencing of one or more family members. In some embodiments, the susceptibility gene is identified by computer simulation of cell signaling and / or immune system response. In some embodiments, the susceptibility gene is mechanically modeled using a neural network or other linear and non-linear regression model and / or using a gene signaling network in which certain mutations are known to disrupt gene signaling. Is identified. In some embodiments, the susceptibility gene is identified using an animal model (eg, pig or mouse). In some embodiments, various methods of identifying susceptibility genes (eg, identifying known susceptibility genes, identifying specific phenotypes with reference to pedigree, and out of whole exome or whole genome analysis). One or more) in combination to identify individuals in need of treatment. That is, in some embodiments, a gene common to family members with an autoimmune disease (eg, a particular autoimmune disease such as ulcerative colitis or Crohn's disease) is determined to be a susceptibility gene.
非限定的な感受性遺伝子としては、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合体遺伝子（例えば、ＮＣＦ２、アネキシンＡ１）、ＴＴＣ７Ａ、ＸＩＡＰ、ＮＯＤ１／２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０ＲＡ、ＩＬ−１０ＲＢ、アシュケナージ系ユダヤ人遺伝子（ＲＰＬ７、ＣＰＡＭＤ８、ＰＲＧ２、ＰＲＧ３、ＨＥＡＴＲ３）、ＡＴＧ１６Ｌ１（例えば、Ｔ３００Ａは微生物叢における変化に関連している）、アジア人の感受性遺伝子（ＴＮＦｓｆ１５、ＭＨＣＩＩ）、ＥＬＦ１、ＨＬＡ−ＤＢ１＊０１：０３、ＨＬＡ−ＢＴＮＬ２、ＡＲＰＣ２、ＩＬ１２Ｂ、ＳＴＡＴ１、ＩＲＧＭ、ＩＲＦ８、ＴＹＫ２、ＳＴＡＴ３、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＲＩＰＫ２、ＬＲＲＫ２、ＩＬ２３Ｒ、Ｃ１３ｏｒｆ３１、ＥＣＭ１、ＮＫＸ２−３、ＴＮＦ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＣＡＲＤ９、ＮＯＤ１／２、ＰＴＰＮ２２、ＴＰＭＴ、ＮＵＤＴ１５、ＬＯＣ４４１１０８、ＰＲＤＭ１、ＩＲＧＭ、ＭＡＧＩ１、ＣＬＣＡ２、２ｑ２４．１およびＬＹ７５のうちの１つ以上のバリアントを挙げることができる。 Non-limiting susceptibility genes include NADPH oxidase complex genes (eg, NCF2, annexin A1), TTC7A, XIAP, NOD1 / 2, IL-10, IL-10RA, IL-10RB, Ashkenazy Jewish genes (RPL7). , CPAMD8, PRG2, PRG3, HEATR3), ATG16L1 (eg, T300A is associated with changes in the microflora), Asian susceptibility genes (TNFsf15, MHCII), ELF1, HLA-DB1 * 01: 03, HLA- BTNL2, ARPC2, IL12B, STAT1, IRGM, IRF8, TYK2, STAT3, IFNGR2, IFNGR1, RIPK2, LRRK2, IL23R, C13orf31, ECM1, NKX2-3, TNF, JAK1, JAK2, JAK2, JAK2 One or more variants of TPMT, NUDT15, LOC441108, PRDM1, IRGM, MAGI1, CLCA2, 2q24.1 and LY75 can be mentioned.
いくつかの態様では、遺伝子間相互作用は自己免疫疾患に対する対象の感受性に影響を与える。例示的な相互作用としては、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＲＩＴ１／ＵＢＱＬＮ４、ＩＦＮＧ／ＩＬ２６／ＩＬ２２が挙げられる。さらなる例として小児科のＣＤ患者は、ＴＬＲ４、ＰＳＭＧ１、ＴＮＦＲｓｆ６ＢおよびＩＲＧＭを含む相加的な遺伝子間相互作用を有する。 In some embodiments, the intergenic interaction affects the subject's susceptibility to autoimmune disease. Exemplary interactions include HLA-DQA1, RIT1 / UBQLN4, IFNG / IL26 / IL22. As a further example, pediatric CD patients have additive intergenic interactions including TLR4, PSMG1, TNFRsf6B and IRGM.
いくつかの感受性遺伝子は環境的影響という観点から同定することができる。例えば、ＣＹＰ２Ａ６のＳＮＰは喫煙者の中でＣＤの発生を増加させる場合がある。他方、ＧＳＴＰ１遺伝子のＳＮＰは元喫煙者におけるＵＣの高いリスクに関連している。 Some susceptibility genes can be identified in terms of environmental impact. For example, SNPs of CYP2A6 may increase the incidence of CD in smokers. On the other hand, the SNP of the GSTP1 gene is associated with a high risk of UC in ex-smokers.
いくつかの態様では、感受性遺伝子は薬物への対象の応答に影響を与える。例えば白血球減少症は、チオプリンを服用しているＩＢＤ患者にとっては命にかかわる病気になる場合があり、これは少なくとも部分的に、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼをコードするＴＰＭＴにおける遺伝的変異に起因している。低頻度のＴＰＭＴ突然変異を有する患者集団（アジア人）において、ＮＵＤＴ１５のＳＮＰはチオプリン関連の白血球減少症に関連している。なおさらに、ＩＬ−１０Ｒ欠損を有する早期発症型ＩＢＤ患者は同種異系の幹細胞移植により恩恵を得ることができる。 In some embodiments, the susceptibility gene affects the subject's response to the drug. Leukopenia, for example, can be a life-threatening illness for IBD patients taking thiopurine, at least in part, due to a genetic variation in the TPMT that encodes the thiopurine S-methyltransferase. There is. In a population of patients (Asians) with low frequency TPMT mutations, NUDT15 SNPs are associated with thiopurine-related leukopenia. Furthermore, early-onset IBD patients with IL-10R deficiency can benefit from allogeneic stem cell transplantation.
いくつかの態様では、感受性遺伝子はＩＢＤの管理に影響を与える。例えばＮＯＤ２遺伝子における感受性遺伝子座は、回腸位置、狭窄および瘻孔挙動ならびに外科手術の必要性に関連している。同様にＣＤでは、瘻孔を伴う疾患はＩＬ２３Ｒ、ＬＯＣ４４１１０８、ＰＲＤＭ１、ＮＯＤ２に関連しており、外科手術の必要性はＩＲＧＭ、ＴＮＦＳＦ１５、Ｃ１３ＯＲＦ３１およびＮＯＤ２に関連している。狭窄表現型はＮＯＤ２、ＪＡＫ２およびＡＴＧ１６Ｌ１に関連している。ＭＡＧＩ１バリアント（腸管上皮密着結合に関与するタンパク質をコードする）は複雑な構造化表現型に関連しており、ＣＬＣＡ２、２ｑ２４．１およびＬＹ７５遺伝子座におけるバリアントは回腸病変、軽度疾患経過および結節性紅斑の存在に関連している。ＵＣでは、４６種のＳＮＰを含むＳＮＰベースのリスクスコアリングシステムにより医学的に難治性のＵＣを有する患者を医学的に非難治性の患者と識別することができ、従って外科手術の必要性を予測することができる。さらにＭＨＣは重度ＵＣのための遺伝的決定因子であるとも考えられている。 In some embodiments, the susceptibility gene affects the management of IBD. For example, the susceptibility locus in the NOD2 gene is associated with ileal location, stenosis and fistula behavior, and the need for surgery. Similarly, on CD, diseases with fistulas are associated with IL23R, LOC441108, PRDM1, NOD2, and the need for surgery is associated with IRGM, TNFSF15, C13ORF31 and NOD2. The stenosis phenotype is associated with NOD2, JAK2 and ATG16L1. The MAGI1 variant (encoding the protein involved in intestinal epithelial tight junctions) is associated with a complex structured phenotype, and the variants at the CLCA2, 2q24.1 and LY75 loci are ileal lesions, mild disease course and erythema nodosum. Is related to the existence of. At UC, an SNP-based risk scoring system that includes 46 SNPs can identify patients with medically refractory UC from medically refractory patients, thus addressing the need for surgery. Can be predicted. In addition, MHC is also considered to be a genetic determinant for severe UC.
治療方法
いくつかの態様は、潰瘍性大腸炎および／またはクローン病などの炎症性腸疾患を含む自己免疫疾患を治療するためのパラダイムを変える方法および組成物を含む。いくつかの態様は、炎症性免疫応答を引き起こす免疫細胞または造血により免疫細胞を産生する組織の遺伝子を編集するための遺伝子編集の使用を含む。原因となっている遺伝子を変化させてリスク対立遺伝子を除去すること、および／または保護的対立遺伝子を作り出すことにより、自己免疫表現型の重症度を排除または低減するために複雑な遺伝子シグナル伝達経路を正確に理解する必要はない。
Therapeutic Methods Some embodiments include methods and compositions that alter the paradigm for treating autoimmune diseases, including inflammatory bowel disease such as ulcerative colitis and / or Crohn's disease. Some embodiments include the use of gene editing to edit the genes of immune cells that provoke an inflammatory immune response or tissues that produce immune cells by hematopoiesis. Complex gene signaling pathways to eliminate or reduce the severity of the autoimmune phenotype by altering the causative gene to eliminate risk alleles and / or creating protective alleles You don't have to understand exactly.
いくつかの態様では、当該対象に自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上のタンパク質バリアントの量を減少させる治療薬を投与する。そのような減少は対象または当該対象の１つ以上の細胞において行うことができる。いくつかの態様では、当該対象において１種以上の感受性遺伝子バリアントを有する細胞の数を減少させる。例えばいくつかの態様では、インビボで遺伝子バリアントを改変し、かつ／または感受性タンパク質バリアントの発現を減少させる治療薬（例えば遺伝子改変剤）を当該対象に投与する。いくつかの態様では当該治療薬は、例えば遺伝子編集または遺伝子サイレンシング技術により感受性遺伝子を標的にする。いくつかの態様は、感受性遺伝子（限定されるものではないが環境的に媒介される感受性遺伝子、薬物応答に影響を与える感受性遺伝子、および自己免疫疾患の管理に影響を与える感受性遺伝子が挙げられる）および感受性遺伝子と相互作用する遺伝子のうちの１つ以上を標的にすることを含む。 In some embodiments, the subject is administered a therapeutic agent that reduces the amount of one or more protein variants associated with susceptibility to autoimmune disease. Such reduction can be made in the subject or in one or more cells of the subject. In some embodiments, the number of cells carrying one or more susceptibility gene variants in the subject is reduced. For example, in some embodiments, the subject is administered a therapeutic agent (eg, a genetic modifier) that modifies the gene variant and / or reduces the expression of the susceptible protein variant in vivo. In some embodiments, the therapeutic agent targets a susceptible gene, for example by gene editing or gene silencing techniques. Some embodiments include susceptibility genes, including, but not limited to, environmentally mediated susceptibility genes, susceptibility genes that affect drug response, and susceptibility genes that affect the management of autoimmune diseases. And targeting one or more of the genes that interact with the susceptibility gene.
いくつかの態様では、本方法は自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させることを含む。そのような増加は対象または当該対象の１つ以上の細胞において行うことができる。いくつかの態様では、当該対象において１種以上の保護的遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させる。例えばいくつかの態様では、当該対象において保護的タンパク質バリアントの発現の割合を増加させる。いくつかの態様では、感受性遺伝子を遺伝子改変剤により野生型バリアントに突然変異させる。いくつかの態様では、感受性遺伝子を自己免疫疾患に対して保護的な遺伝子（すなわち保護的遺伝子）に突然変異させる。いくつかの態様では、非保護的遺伝子バリアント（例えば、非保護的野生型遺伝子バリアント）を自己免疫疾患に対して保護的な遺伝子に突然変異させる。 In some embodiments, the method comprises increasing the amount of one or more gene variants that are protective against autoimmune disease. Such an increase can be made in the subject or in one or more cells of the subject. In some embodiments, the number of cells carrying one or more protective genetic variants in the subject is increased. For example, in some embodiments, the rate of expression of the protective protein variant is increased in the subject. In some embodiments, the susceptibility gene is mutated to a wild-type variant with a genetic modifier. In some embodiments, the susceptibility gene is mutated to a gene that is protective against autoimmune disease (ie, a protective gene). In some embodiments, a non-protective gene variant (eg, a non-protective wild-type gene variant) is mutated into a gene that is protective against an autoimmune disease.
いくつかの態様では、感受性遺伝子および保護的遺伝子は同じタンパク質のバリアントをコードする。いくつかの態様では、感受性遺伝子および保護的遺伝子は異なるタンパク質のバリアントをコードする。 In some embodiments, the susceptible and protective genes encode variants of the same protein. In some embodiments, the susceptible and protective genes encode different protein variants.
いくつかの態様は、遺伝子における保護的バリアントを同定することを含む。保護的遺伝子バリアントは、感受性遺伝子バリアントを同定することに関して上で考察されている同じ技術を用いて同定することができる。いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアントはＩＬ２３Ｒ遺伝子内のｒｓ１１２０９０２６におけるＧ→Ａ突然変異を含む。理論によって縛られるものではないが、そのような保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異はＣＤおよびＵＣではおよそ１／３のオッズ比を有し、かつＩＢＤの症状を除去または改善させるのに十分な程に免疫応答を減少させると考えられている。例えば、Ｄｕｅｒｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４（５８０４）：１４６１−６３（２００６）を参照されたく、Ｓｉｖａｎｅｓａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９１（１６）：８６７３−８６８５（２０１６）も参照されたい。いくつかの態様では保護的遺伝子バリアントは、野生型ＩＬ２３Ｒに対する以下の突然変異：Ｒ３８１Ｑ（例えば、ｒｓ１１２０９０２６、ｃ．１１４２Ｇ＞Ａに対応する）、Ｇ１４９ＲおよびＶ３６２Ｉのうちの１つ以上を有するＩＬ２３Ｒバリアントをコードする。代わりまたは追加として、いくつかの態様では、保護的突然変異（例えばＩＢＤのため）は、ＣＡＲＤ９、ＮＯＤ２、ＰＴＰＮ２２およびＳＬＣ１１Ａ１のうちの１つ以上において行う。理論によって縛られるものではないが、ＮＯＤ２およびＰＴＰＮ２２は、ＵＣには保護的であるがクローン病には感受性遺伝子であると考えられている。これも理論によって縛られるものではないが、ＰＴＰＮ２２では、Ｒ６２０Ｗ機能獲得バリアントはＣＤに関連しているが、Ｒ２６３Ｑ機能喪失バリアントはＵＣに関連していると考えられている。ＳＬＣ１１Ａ１では、ＳＮＰ ｒｓ７５７３０６５における−２３７Ｃ／Ｔ多型は、炎症性腸疾患ではおよそ２／３のオッズ比を有する。例えば、Ａｒｃｈｅｒ，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６（４）：２７５−２８３（２０１５）を参照されたい。いくつかの態様では、当該保護的バリアントは、対立遺伝子Ｐ１１０４Ａ（ｒｓ３４５３６４４３、ＯＲ＝０．６６）、Ａ９２８Ｖ（ｒｓ３５０１８８００、ＯＲ＝０．５３）、およびＩ６８４Ｓ（ｒｓ１２７２０３５６、ＯＲ＝０．８６、Ｐ＝４．６×１０−７）を含む関節リウマチのために保護的であるＴＹＫ２（チロシンキナーゼ２）バリアントをコードする。例えば、Ｄｉｏｇｏ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１２２２７１（２１頁）（２０１５）を参照されたい。別の例として、いくつかの態様では、当該保護的バリアントは、Ｅ６２７Ｘなどの対立遺伝子を含む０．５１〜０．７４の範囲のオッズ比を有する１型糖尿病のために保護的であるＩＦＩＨ１バリアントをコードする。例えば、Ｎｅｊｅｎｔｓｅｖ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４（５９２５）：３８７−８９（２００９）を参照されたい。ＨＳＣに対する遺伝子改変によって改善させることができるいくつかの疾患にまたがる保護的バリアントのさらに多くの例が存在する。例えば、Ｈａｒｐｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６（１２）：６８９−７０１（２０１５）を参照されたい。 Some embodiments include identifying protective variants in the gene. Protective gene variants can be identified using the same techniques discussed above for identifying susceptible gene variants. In some embodiments, the protective gene variant comprises a G → A mutation in rs11209026 within the IL23R gene. Although not bound by theory, such protective IL23R mutations have an odds ratio of approximately 1/3 in CD and UC and an immune response sufficient to eliminate or ameliorate the symptoms of IBD. Is believed to reduce. See, for example, Duer, Science, 314 (5804): 461-63 (2006), Sivanesan, J. et al. Biol. Chem. , 291 (16): 8673-8685 (2016). In some embodiments, the protective gene variant is an IL23R variant having one or more of the following mutations to wild-type IL23R: R381Q (eg, corresponding to rs11209026, c.1142G> A), G149R and V362I. Code. Alternatively or additionally, in some embodiments, protective mutations (eg, for IBD) are performed in one or more of CARD9, NOD2, PTPN22 and SLC11A1. Although not bound by theory, NOD2 and PTPN22 are considered to be protective genes for UC but susceptible to Crohn's disease. Again, not bound by theory, in PTPN22 it is believed that the R620W gain-of-function variant is associated with CD, while the R263Q gain-of-function variant is associated with UC. In SLC11A1, the -237C / T polymorphism in SNP rs7573065 has an odds ratio of approximately 2/3 in inflammatory bowel disease. See, for example, Archer, Genes and Efficiency, 16 (4): 275-283 (2015). In some embodiments, the protective variant contains the allelic genes P1104A (rs34536443, OR = 0.66), A928V (rs35018800, OR = 0.53), and I684S (rs12720356, OR = 0.86, P = 4). It encodes a TYK2 (tyrosine kinase 2) variant that is protective for rheumatoid arthritis, including .6 × 10-7). See, for example, Diogo, PLos ONE 10 (4): e01222271 (page 21) (2015). As another example, in some embodiments, the protective variant is an IFIH1 variant that is protective for type 1 diabetes with an odds ratio in the range of 0.51 to 0.74 containing an allele such as E627X. To code. See, for example, Geneticsev, Science, 324 (5925): 387-89 (2009). There are many more examples of protective variants across several diseases that can be ameliorated by genetic modification to HSC. For example, Harper, Nat. Rev. See Genetics, 16 (12): 689-701 (2015).
いくつかの態様では、免疫細胞および／または造血骨髄幹細胞中の１種以上の感受性遺伝子バリアントおよび／または１種以上の保護的遺伝子バリアントを標的にする薬剤を当該対象に投与する。いくつかの態様では、遺伝子改変剤を当該対象に投与して、当該対象における感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または当該対象における保護的タンパク質バリアントの量を増加させる。いくつかの態様では、改変された免疫細胞および／またはＨＳＣを当該対象に投与して、感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させる。 In some embodiments, the subject is administered an agent that targets one or more susceptibility gene variants and / or one or more protective gene variants in immune cells and / or hematopoietic bone marrow stem cells. In some embodiments, a genetic modifier is administered to the subject to reduce the amount of susceptible gene variants in the subject and / or increase the amount of protective protein variants in the subject. In some embodiments, modified immune cells and / or HSCs are administered to the subject to reduce the amount of susceptible gene variants and / or increase the amount of protective gene variants.
いくつかの態様では、保護的遺伝子バリアント：感受性遺伝子バリアントの割合を当該対象または当該対象の細胞もしくは細胞集団において増加させる。いくつかの態様では、保護的タンパク質バリアント：感受性タンパク質バリアントの比を当該対象または当該対象の細胞もしくは細胞集団において増加させる。 In some embodiments, the ratio of protective gene variant: susceptibility gene variant is increased in the subject or in the cell or population of the subject. In some embodiments, the ratio of protective protein variant: sensitive protein variant is increased in the subject or cell or population of the subject.
いくつかの態様では、ＨＳＣ細胞を血液または骨髄から採取し、次いで採取した細胞に対してエクスビボで遺伝子改変剤を使用する。いくつかの態様では、免疫磁気または免疫蛍光法を用いて血液試料からＣＤ３４＋細胞を単離する（ＣＤ３４タンパク質は、早期造血および血管関連組織上に発現される１回膜貫通シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーである）。それは細胞表面糖タンパク質であり、細胞間接着因子として機能し、かつ造血幹細胞が骨髄細胞外マトリックス（または直接に間質細胞）に接着するのを媒介することができる。ＣＤ３４＋はＨＳＣにユビキタスに関連づけられているが、他の細胞型にも存在する。例えば、Ｓｉｄｎｅｙ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．，３２（６）：１３８０−９（２０１４）を参照されたい。臨床的には、それは骨髄移植のために造血幹細胞を選択および濃縮するために使用することができる。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４に結合し、かつ磁気ビーズまたは蛍光マーカーに取り付けられてこの細胞のその後の単離およびその後の遺伝子編集を可能にする抗体を用いて血液から採取することができる。またこの細胞を遺伝子編集の前または後に培養してもよい。次いでこの細胞を輸血または注射によって当該対象に戻してもよい。いくつかの態様では、編集されたＨＳＣまたはＣＤ３４＋細胞を血液に戻す前に、当該対象を化学療法薬または放射線に供して対象の骨髄ＨＳＣのかなりの部分を除去するため、骨髄は編集されたＨＳＣのかなりの部分により再コロニー形成化される。いくつかの態様では、本出願は、（例えば、宿主ＨＳＣを枯渇させるがＨＳＣ集団全体を除去しないために）骨髄癌患者のために使用される致死的な線量よりも低線量の放射線または低用量の化学療法薬を使用する。いくつかの態様では、編集されたＨＳＣの注入前に、ＨＳＣの機能を乱し、かつ宿主ＨＳＣ枯渇を引き起こす抗体を宿主に投与する。例えばＨＳＣはｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、すなわちＨＳＣ機能に関与する二量体膜貫通受容体チロシンキナーゼを発現する。抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体は、ＨＳＣを骨髄ニッチから枯渇させるための免疫抑制と共に使用することができ、編集されたＨＳＣ生着を可能にする。いくつかの態様では宿主ＨＳＣの枯渇は、例えば他の抗体と共にＨＳＣ機能を乱し、かつＨＳＣを枯渇させる抗体を投与して宿主ＨＳＣをより脆弱にさせることにより、放射線もしくは化学療法薬による免疫抑制を必要とすることなく達成することができる。例えば宿主ＨＳＣの排除はＦｃ媒介性抗体エフェクター機能に依存していること、およびＨＳＣは「死滅させるな」というシグナルを発生し、かつＳＩＲＰαに結合するＣＤ４７すなわち骨髄特異的免疫チェックポイントを発現することが分かっている。Ｃｈｈａｂｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（３５１）：３５１ｒａ１０５（１０頁）（２０１６）を参照されたい。従って、ＣＤ４７の遮断によりエフェクター活性を高めることは、抗ｃ−Ｋｉｔ調節を十分に免疫適格性の対象に広げる。ＣＤ４７抗体によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα軸の妨害と共にｃ−Ｋｉｔ抗体を用いる治療により、宿主ＨＳＣの＞９９％の除去およびＨＳＣ移植後のロバストな多系列の血液再構成が得られる。従って、いくつかの態様では、ＣＤ４７の遮断と共に抗ｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を使用して、編集されたＨＳＣの注入前に対象のＨＳＣを排除する。 In some embodiments, HSC cells are harvested from blood or bone marrow, and then the harvested cells are used with a gene modifier at Exvivo. In some embodiments, CD34 + cells are isolated from blood samples using immunomagnetism or immunofluorescence (CD34 proteins are members of the single transmembrane sialomtin protein family expressed on premature hematopoiesis and vascular-related tissues. Is). It is a cell surface glycoprotein that functions as an intercellular adhesion factor and can mediate the adhesion of hematopoietic stem cells to the extracellular matrix (or directly to stromal cells). CD34 + is associated with HSC ubiquitous, but is also present in other cell types. For example, Sideney, Stem Cells. , 32 (6): 1380-9 (2014). Clinically, it can be used to select and concentrate hematopoietic stem cells for bone marrow transplantation. CD34 + cells can be harvested from blood with antibodies that bind to CD34 and are attached to magnetic beads or fluorescent markers to allow subsequent isolation and subsequent gene editing of the cells. The cells may also be cultured before or after gene editing. The cells may then be returned to the subject by blood transfusion or injection. In some embodiments, the bone marrow is edited to remove a significant portion of the subject's bone marrow HSC by subjecting the subject to chemotherapeutic agents or radiation prior to returning the edited HSC or CD34 + cells to blood. Re-colonization by a significant portion of. In some embodiments, the application applies lower doses of radiation or lower doses than the lethal doses used for patients with bone marrow cancer (eg, to deplete the host HSC but not eliminate the entire HSC population). Use chemotherapeutic drugs. In some embodiments, the host is administered with an antibody that disrupts HSC function and causes host HSC depletion prior to injection of the edited HSC. For example, HSC expresses c-Kit (CD117), a dimeric transmembrane receptor tyrosine kinase involved in HSC function. Anti-c-Kit monoclonal antibodies can be used with immunosuppression to deplete HSCs from the bone marrow niche, allowing edited HSC engraftment. In some embodiments, host HSC depletion is immunosuppression by radiation or chemotherapeutic agents, for example by administering an antibody that disrupts HSC function with other antibodies and depletes HSC to make the host HSC more vulnerable. Can be achieved without the need for. For example, elimination of host HSCs depends on Fc-mediated antibody effector function, and HSCs generate a "don't kill" signal and express CD47 or bone marrow-specific immune checkpoints that bind SIRPα. I know. See Chabra, Science Transitional Medicine, 8 (351): 351ra105 (page 10) (2016). Therefore, enhancing effector activity by blocking CD47 broadens anti-c-Kit regulation to fully immunoeligible subjects. Treatment with the c-Kit antibody along with obstruction of the CD47-SIRPα axis by the CD47 antibody results in the removal of> 99% of the host HSC and a robust multilineage blood rearrangement after HSC transplantation. Therefore, in some embodiments, an anti-c-Kit monoclonal antibody is used with blocking of CD47 to eliminate the HSC of interest prior to injection of the edited HSC.
いくつかの態様では、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞）、単球および／または樹状細胞などの体の免疫応答に直接に関与する細胞を血液から採取する。血液から採取したら、これらの免疫細胞をインビトロで編集し、任意に培養し、かつ次いで当該対象の血流に戻してもよい。理論によって縛られるものではないが、多くのそのような細胞はおよそ１年の半減期を有すると考えられている。製造業者の説明書に従ってこれらの細胞を単離するためのいくつかの方法としては、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のヘパリンナトリウムを含む細胞調製チューブ（ＣＰＴ：ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（密度：１．０７７ｇ／ｍＬ）、およびＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＳｅｐＭａｔｅチューブを用いるＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐが挙げられる。細胞単離効率および細胞生存度に関する異なる手法の長所および短所については、例えばＧｒｉｅｖｉｎｋ，Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｂａｎｋｉｎｇ，１４（５）：４１０−４１５（２０１６）を参照されたい。 In some embodiments, cells directly involved in the body's immune response, such as lymphocytes (eg, B cells, T cells and / or natural killer cells), monocytes and / or dendritic cells, are harvested from the blood. .. Once taken from blood, these immune cells may be edited in vitro, optionally cultured, and then returned to the bloodstream of the subject. Although not bound by theory, many such cells are believed to have a half-life of approximately one year. Some methods for isolating these cells according to the manufacturer's instructions include, for example, a cell preparation tube (CPT) containing sodium heparin manufactured by Becton Dickinson, a FilePakue Premium manufactured by GE Healthcare. (Density: 1.077 g / mL), and Lymphoprep using a SepMate tube manufactured by STEMCELL Technologies. See, for example, Grievink, Biopreservation and Biobanking, 14 (5): 410-415 (2016) for the advantages and disadvantages of different approaches to cell isolation efficiency and cell viability.
保護的遺伝子バリアントをコードし、かつ／または感受性遺伝子バリアントをコードしない細胞は、任意の公知の方法によって（例えば静脈投与または移植によって）当該対象に投与することができる。 Cells encoding a protective gene variant and / or not a susceptibility gene variant can be administered to the subject by any known method (eg, by intravenous administration or transplantation).
いくつかの態様は、血液細胞を造る骨髄幹細胞の編集を含む。いくつかの態様では、遺伝子改変剤を骨髄の中に送達させる。いくつかの態様では、この送達としては、中性の電荷および好適なサイズ（例えば約１５０ｎｍ）のポリマーを介した受動的標的化、マクロファージによる選択的取込みにより骨髄の中への分布を増加させ、かつ肝臓および脾臓における分布を大きく減少させるためにアニオン性グルタミン酸により表面改質されたリポソーム、および／または骨形成表面に特異的に結合するビスフォスフォネートなどの分子が挙げられる。例えば、Ｃｈａｏ−Ｆｅｎｇ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５５：１９１−２０２（２０１７）を参照されたい。例えばポリマーラッパーを含んでいてもよいこれらの送達機序を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または他の遺伝子編集複合体を骨髄に送達することができる。 Some aspects include editing bone marrow stem cells that make blood cells. In some embodiments, the gene modifier is delivered into the bone marrow. In some embodiments, this delivery increases distribution into the bone marrow by passive targeting via a neutral charge and a suitable size (eg, about 150 nm) polymer, selective uptake by macrophages. And molecules such as liposomes surface-modified with anionic glutamate to significantly reduce distribution in the liver and spleen, and / or bisphosphonates that specifically bind to the bone-forming surface. See, for example, Chao-Feng, Biomaterials, 155: 191-202 (2017). These delivery mechanisms, which may include, for example, polymer wrappers, can be used to deliver CRISPR / Cas9 or other gene editing complexes to the bone marrow.
いくつかの態様は、元の生殖系列対立遺伝子を含む骨髄幹細胞集団を減少させるために放射線を用いて／用いずに編集された幹細胞により骨髄内に直接幹細胞移植を行うことを含む。いくつかの態様は、骨髄幹細胞を患者の血流内に配置する（例えば、当該細胞が骨髄に再び辿り着くのを可能にする）方法を含む。 Some embodiments include performing stem cell transplantation directly into the bone marrow with stem cells edited with / without radiation to reduce the bone marrow stem cell population containing the original germline allele. Some embodiments include a method of placing bone marrow stem cells in the patient's bloodstream (eg, allowing the cells to reach the bone marrow again).
いくつかの態様では、当該対象から得た後、感受性遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または保護的遺伝子バリアントの量を増加させるように遺伝子改変した細胞を、治療を必要とする対象に投与する。いくつかの態様では、別個の対象から得た細胞（例えば、遺伝子改変したか所望の遺伝子バリアントを自然にコードする別個の対象からの細胞）を、治療を必要とする対象に投与する。 In some embodiments, cells obtained from the subject and then genetically modified to reduce the amount of susceptibility gene variant and / or increase the amount of protective gene variant are administered to the subject in need of treatment. do. In some embodiments, cells from a separate subject (eg, cells from a separate subject that are genetically modified or naturally encode a desired genetic variant) are administered to the subject in need of treatment.
遺伝子改変剤
例えば遺伝子改変剤を使用して所望の遺伝子改変を行うために使用することができる方法および組成物を提供する。遺伝子改変剤は、ＣＲＩＳＰＲシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼまたはＲＮＡｉシステムなどのヌクレアーゼを含んでもよい。
Gene Modification Agents Provide methods and compositions that can be used to make the desired gene modification using, for example, a gene modification agent. Gene modifiers may include nucleases such as the CRISPR system, zinc finger nuclease system, TALEN, meganuclease or RNAi system.
ＣＲＩＳＰＲシステム
いくつかの態様では、遺伝子改変剤はＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲシステムであり、これは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直接反復配列」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復配列を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサ」ともいう）、または「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするためのＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡおよびトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたは単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））あるいはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物などの、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかその活性を導く転写物および他のエレメントをまとめて指す。一般にＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサともいう）を特徴とする。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０（３）：３８５−９７（２０１５）；Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：Ｐ７５９−７７１（２０１５）；国際公開第２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号）を参照されたい。
CRISPR system In some embodiments, the gene modifier is a CRISPR-Cas or CRISPR system, which is a sequence encoding the Cas gene, a tracr (trans-activated CRISPR) sequence (eg, tracrRNA or active partial tracrRNA). , Tracr mate sequences (including "direct repeat sequences" in the context of endogenous CRISPR systems and partially direct repeat sequences treated with tracrRNA), guide sequences (also referred to as "spacers" in the context of endogenous CRISPR systems), or "RNA" (eg, RNA for guiding Cas such as Cas9, such as CRISPR RNA and trans-activated (tracr) RNA or single guide RNA (sgRNA) (chimeric RNA)) or other from the CRISPR locus Collectively refers to transcripts and other elements that are involved in or direct the activity of CRISPR-related (“Cas”) genes, such as sequences and transcripts. Generally, CRISPR systems feature elements that promote the formation of CRISPR complexes at the site of the target sequence (also referred to as protospacers in the context of endogenous CRISPR systems). For example, Shmakov, Molecular Cell, 60 (3): 385-97 (2015); Zetsche, Cell, 163 (3): P759-771 (2015); International Publication No. 2014/093622 (PCT / US Patent Application Publication No. Please refer to 2013/074667).
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」はそれに対してガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列とのハイブリッド形成はＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様では、標的配列は細胞の核内に位置している。いくつかの態様では、標的配列は細胞の細胞質内に位置している。 In the context of CRISPR complex formation, "target sequence" refers to a sequence in which the guide sequence is designed to be complementary to it, where hybrid formation of the target sequence with the guide sequence refers to the CRISPR complex. Promotes formation. The target sequence may include a DNA polynucleotide or an RNA polynucleotide. In some embodiments, the target sequence is located within the nucleus of the cell. In some embodiments, the target sequence is located within the cytoplasm of the cell.
特定の例示的態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子を用いて送達してもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子は有利にはコドン最適化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質（例えば真核生物、例えばヒト（すなわちヒトにおける発現のために最適化されている）または別の真核生物、動物または哺乳類における発現のために最適化されている配列）であってもよい。例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１３／０７４６６７号）を参照されたい。 In certain exemplary embodiments, the CRISPR effector protein may be delivered using a nucleic acid molecule that encodes the CRISPR effector protein. The nucleic acid molecule encoding the CRISPR effector protein is advantageously codon-optimized CRISPR effector protein (eg, eukaryote, eg, human (ie, optimized for expression in human)) or another eukaryote, animal or mammal. It may be a sequence optimized for expression in. See, for example, International Publication No. 2014/03622 (PCT / US Patent Application Publication No. 2013/074667).
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌおよびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの改変体が挙げられる。Ｃａｓ９は最も広く使用されているＣａｓタンパク質であるが、他の複合体を使用してＣａｓ９と比較して恐らく改良されている方法でＤＮＡを編集することもできる。例えばＣｐｆ１は、ＤＮＡの１つの鎖上により特異的なＤＮＡ再構築を可能にするオーバーハングが存在する標的ＤＮＡにおいて互い違いの切断を行う。さらに、Ｃｐｆ１は標的化のために１つのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を必要とし、Ｃａｓ９はｃｒＲＮＡおよびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の両方を必要とする。より小さいｃｒＲＮＡは、それらのうちのより多くを単一のベクターにパッケージングすることができるので、多重ゲノム編集を可能にする。さらに、Ｃａｓ９は３ヌクレオチド塩基上流で標的ＤＮＡを切断するが、Ｃｐｆ１は標的部位から１８〜２３塩基下流で標的ＤＮＡを切断し、標的領域をインタクトなままにするのを可能にし、かつ標的遺伝子座における複数回の切断を可能にして特定の編集の機会を増加させる。本発明は、本明細書において考察されている全ての編集方法ならびにそれ以外を包含し、かつ使用される特定の編集方法に依存していない。 Non-limiting examples of Cas proteins include Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csnl and Csx12), Cas10, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csx14 Examples thereof include Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homologues thereof, or variants thereof. Cas9 is the most widely used Cas protein, but other complexes can also be used to edit DNA in a manner that is probably improved compared to Cas9. For example, Cpf1 makes alternate cuts in the target DNA where there is an overhang that allows for more specific DNA reconstruction on one strand of DNA. In addition, Cpf1 requires one CRISPR RNA (crRNA) for targeting, and Cas9 requires both crRNA and transactivated crRNA (tracrRNA). Smaller crRNAs allow multiple genome editing because more of them can be packaged in a single vector. In addition, Cas9 cleaves the target DNA 3 nucleotides upstream, while Cpf1 cleaves the target DNA 18-23 bases downstream from the target site, allowing the target region to remain intact and at the target locus. Allows multiple disconnects in and increases specific editing opportunities. The present invention includes all editing methods discussed herein, as well as others, and is independent of the particular editing method used.
いくつかの態様は、例えばＣａｓおよび／またはＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることができるＲＮＡ（すなわちガイドＲＮＡ）を細胞内に送達または導入するためだけでなく、これらの構成要素を伝播させるためのものでもあるベクターを含む。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移動を可能または容易にするツールである。ベクターは、挿入されたセグメントの複製をもたらすためにその中に別のＤＮＡセグメントを挿入することができるプラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。一般にベクターは、適切な調節エレメントに結合されている場合に複製が可能である。一般に「ベクター」という用語はそこに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターとしては、限定されるものではないが、単鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む、遊離末端を含まない（例えば環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を含む核酸分子；および当該技術分野で知られている他の変種のポリヌクレオチドが挙げられる。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは標準的な分子クローニング技術などによりさらなるＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、ここではウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））の中にパッケージングするためのウイルス由来のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは宿主細胞内へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞の中に導入されると宿主細胞のゲノムの中に組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。 Some embodiments are, for example, for delivering or introducing RNA that can guide Cas and / or Cas to a target locus (ie, a guide RNA) into the cell, as well as for propagating these components. Contains vectors that are also things. As used herein, a "vector" is a tool that allows or facilitates the movement of an entity from one environment to another. A vector is a replicon, such as a plasmid, phage or cosmid, into which another DNA segment can be inserted to result in replication of the inserted segment. In general, the vector can be replicated if it is bound to the appropriate regulatory element. Generally, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid linked therein. Vectors include, but are not limited to, single-stranded, double-stranded or partially double-stranded nucleic acid molecules; free-ended (eg, cyclic) nucleic acid molecules containing one or more free ends. Nucleic acid molecules containing DNA, RNA or both; and other variants of polynucleotides known in the art. One type of vector is a "plasmid", which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be inserted, such as by standard molecular cloning techniques. Another type of vector is a viral vector, here derived from a virus for packaging into a virus (eg, retrovirus, replication-deficient retrovirus, adenovirus, replication-deficient adenovirus and adeno-associated virus (AAV)). DNA or RNA sequence is present in the vector. Viral vectors also include polynucleotides carried by the virus for transfection into host cells. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (eg, non-episome mammalian vectors) are integrated into the host cell's genome when introduced into the host cell, thereby replicating with the host genome. Furthermore, specific vectors can guide the expression of genes to which they are functionally linked. Such a vector is referred to herein as an "expression vector". Common expression vectors useful in recombinant DNA technology are often in the form of plasmids.
組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に好適な形態の核酸を含むことができ、これは組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択することができる１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。組換え発現ベクター内で「機能的に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えばインビトロ転写／翻訳システム、またはベクターが宿主細胞の中に導入されている場合は宿主細胞において）目的のヌクレオチド配列が調節エレメントに連結されていることを意味するものである。 The recombinant expression vector can contain a form of nucleic acid suitable for expression of the nucleic acid in the host cell, which is used for expression in which the recombinant expression vector is functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed. It is meant to contain one or more regulatory elements that can be selected based on the host cell being produced. By "functionally linked" within a recombinant expression vector is meant to allow expression of the nucleotide sequence (eg, an in vitro transcription / translation system, or host if the vector has been introduced into a host cell). It means that the nucleotide sequence of interest (in the cell) is linked to the regulatory element.
このベクターは調節エレメント、例えばプロモーターを含むことができる。このベクターはＣａｓコード化配列および／または単一のガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）コード化配列を含むことができる（但し場合により、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜８、３〜１６、３〜３０、３〜３２、３〜４８、３〜５０個のＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）などの少なくとも３または８または１６または３２または４８または５０個のガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ））コード化配列を含むことができる）。単一のベクターでは、有利には最大約１６個のＲＮＡが存在する場合には各ＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）のためにプロモーターが存在することができ、かつ単一のベクターが１６超のＲＮＡを提供する場合には、１つ以上のプロモーターが２つ以上のＲＮＡの発現をドライブすることができ、例えば３２個のＲＮＡが存在する場合には、各プロモーターは２つのＲＮＡの発現をドライブすることができ、４８個のＲＮＡが存在する場合には、各プロモーターは３つのＲＮＡの発現をドライブすることができる。 The vector can include regulatory elements such as promoters. This vector can contain a Cas-encoding sequence and / or a single guide RNA (eg, sgRNA) -encoding sequence (provided that 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 3– 6, 3 to 7, 3 to 8, 3 to 9, 3 to 10, 3 to 8, 3 to 16, 3 to 30, 3 to 32, 3 to 48, 3 to 50 RNAs (for example, sgRNA), etc. It can contain at least 3 or 8 or 16 or 32 or 48 or 50 guide RNA (eg, sgRNA)) coding sequences). A single vector can advantageously have a promoter for each RNA (eg, sgRNA) if there are up to about 16 RNAs, and a single vector provides more than 16 RNAs. In this case, one or more promoters can drive the expression of two or more RNAs, for example, in the presence of 32 RNAs, each promoter can drive the expression of two RNAs. Yes, each promoter can drive the expression of 3 RNAs in the presence of 48 RNAs.
ガイド分子
「ガイド配列」および「ガイド分子」という用語は、標的核酸配列とハイブリッド形成し、かつ核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有するあらゆるポリヌクレオチド配列を包含する。本明細書に開示されている方法を用いて調製されたガイド配列は、完全長ガイド配列、切断型ガイド配列、完全長ｓｇＲＮＡ配列、切断型ｓｇＲＮＡ配列、またはＥ＋Ｆ ｓｇＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの態様では、所与の標的配列へのガイド配列の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントされている場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれ以上あるいは約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％超である。特定の例示的態様では、ガイド分子は、ガイド配列と標的配列との間にＲＮＡ二本鎖が形成されるように、標的配列との少なくとも１つのミスマッチを有するように設計することができるガイド配列を含む。いくつかの態様ではガイド配列は、ガイド配列全体に対する相補性の程度をさらに低下させるために２つ以上の隣接するマッチしていないヌクレオチドのストレッチを有するように設計されている。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするためのあらゆる好適なアルゴリズムの使用により決定してもよく、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＳＯＡＰおよびＭａｑが挙げられる。核酸標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くためのガイド配列（核酸標的ガイドＲＮＡ内）の能力は、任意の好適なアッセイによって評価してもよい。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的複合体を形成するのに十分な核酸標的ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、核酸標的複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションなどによって対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供してもよく、次いで本明細書に記載されているようにＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどによって標的核酸配列内での優先的標的化（例えば切断）の評価を行ってもよい。同様に、標的核酸配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列などの核酸標的複合体の構成要素を提供し、かつ試験配列と対照ガイド配列との反応間で標的配列またはその近くでの結合または切断率を比較することにより、試験管の中で標的核酸配列（またはその近くの配列）の切断を評価してもよい。ガイド配列および故に核酸標的ガイドＲＮＡは、あらゆる標的核酸配列を標的にするように選択してもよい。
Guide molecules The terms "guide sequence" and "guide molecule" are complementary to a target nucleic acid sequence that hybridizes with the target nucleic acid sequence and is sufficient to guide a sequence-specific binding of the nucleic acid target complex to the target nucleic acid sequence. Includes any polynucleotide sequence of sex. The guide sequence prepared using the method disclosed herein may be a full-length guide sequence, a truncated guide sequence, a full-length sgRNA sequence, a truncated sgRNA sequence, or an E + F sgRNA sequence. In some embodiments, the degree of complementarity of the guide sequence to a given target sequence is approximately 50%, 60%, 75%, 80%, when optimally aligned using a suitable alignment algorithm. 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% or more or about 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, over 99% Is. In certain exemplary embodiments, the guide molecule can be designed to have at least one mismatch with the target sequence such that an RNA duplex is formed between the guide sequence and the target sequence. including. In some embodiments, the guide sequence is designed to have a stretch of two or more adjacent unmatched nucleotides to further reduce the degree of complementarity to the entire guide sequence. Optimal alignment may be determined by using any suitable algorithm for aligning the sequence, examples of which are non-limiting examples based on the Smith-Waterman algorithm, Needleman-Wunsch algorithm, and Burrows-Wheeler Transfer algorithm. (For example, Burrows Wheeler Algorithm), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies), ELAND (Illumina, San Diego, California), SOAP and Maq. The ability of the guide sequence (within the nucleic acid target guide RNA) to derive a sequence-specific binding of the nucleic acid target complex to the target nucleic acid sequence may be assessed by any suitable assay. For example, a component of a nucleic acid target CRISPR system sufficient to form a nucleic acid target complex containing a guide sequence to be tested is a corresponding target nucleic acid, such as by transfection with a vector encoding a component of the nucleic acid target complex. It may be provided to the host cell having the sequence, and then the evaluation of preferential targeting (eg, cleavage) within the target nucleic acid sequence may be performed, such as by the Surveyor assay as described herein. Similarly, components of a nucleic acid target complex such as a target nucleic acid sequence, a guide sequence to be tested and a control guide sequence different from the test guide sequence are provided, and the target sequence or between the reactions of the test sequence and the control guide sequence. Cleavage of the target nucleic acid sequence (or a sequence close thereto) may be evaluated in vitro by comparing the binding or cleavage rate in the vicinity thereof. The guide sequence and thus the nucleic acid target guide RNA may be selected to target any target nucleic acid sequence.
特定の態様では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサの長さは１５〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）である。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサの長さは少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の態様では、スペーサの長さは１５〜１７ｎｔ、例えば１５、１６または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば１７、１８、１９または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば２０、２１、２２、２３または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば２３、２４または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば２４、２５、２６または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば２７、２８、２９または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば３０、３１、３２、３３、３４または３５ｎｔまたは３５ｎｔ以上である。特定の例示的な態様では、ガイド配列は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｎｔである。 In certain embodiments, the guide sequence or spacer length of the guide molecule is 15-50 nucleotides (nt). In certain embodiments, the length of the guide RNA spacer is at least 15 nucleotides. In certain embodiments, the spacer length is 15-17 nt, eg 15, 16 or 17 nt, 17-20 nt, eg 17, 18, 19 or 20 nt, 20-24 nt, eg 20, 21, 22, 23 or 24 nt, 23. ~ 25nt, eg 23, 24 or 25nt, 24 ~ 27nt, eg 24, 25, 26 or 27nt, 27-30nt, eg 27, 28, 29 or 30nt, 30 ~ 35nt, eg 30, 31, 32, 33, 34 Or 35 nt or 35 nt or more. In certain exemplary embodiments, the guide sequences are 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34. , 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100 nt.
特定の態様では、ガイド分子は、直接反復配列がガイド配列の上流（すなわち５’）に位置するように、（１）標的遺伝子座とハイブリッド形成することができるガイド配列と、（２）ｔｒａｃｒメイトまたは直接反復配列とを含む。いくつかの態様では、ガイド配列のシード配列（すなわち、標的遺伝子座にある配列の認識および／またはそれとのハイブリッド形成に関与する配列）は、ガイド配列のおよそ最初の１０ヌクレオチド以内にある。 In certain embodiments, the guide molecule is composed of (1) a guide sequence that can be hybridized with a target locus and (2) a tracr mate such that the direct repeats are located upstream of the guide sequence (ie, 5'). Or it includes a direct repeat sequence. In some embodiments, the seed sequence of the guide sequence (ie, the sequence involved in the recognition and / or hybridization of the sequence at the target locus) is within approximately the first 10 nucleotides of the guide sequence.
特定の態様では、ガイド分子は直接反復配列に連結されているガイド配列を含み、ここでは直接反復配列は１つ以上のステムループまたは最適化二次構造を含む。特定の態様では、直接反復配列は１６ｎｔｓの最小長さおよび単一のステムループを有する。さらなる態様では、直接反復配列は１６ｎｔｓ超、好ましくは１７ｎｔｓ超の長さを有し、かつ２つ以上ステムループまたは最適化二次構造を有する。特定の態様では、ガイド分子は、天然の直接反復配列の全てまたは一部に連結されているガイド配列を含むかそれからなる。典型的なＶ型もしくはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓガイド分子は（３’→５’方向または５’→３’方向に）、ガイド配列、第１の相補ストレッチ（「反復配列」）、ループ（典型的には４もしくは５ヌクレオチド長である）、第２の相補ストレッチ（「抗反復配列」は反復配列に相補的である）、およびポリＡ（多くの場合、ＲＮＡ中のポリＵ）テール（ターミネーター）を含む。特定の態様では、直接反復配列はその天然構造を保持し、かつ単一のステムループを形成する。特定の態様では、例えば特徴の付加、削除または置換によってガイド構造の特定の側面を改変することができるが、ガイド構造の特定の他の側面は維持される。限定されるものではないが、挿入、欠失および置換などの操作されたガイド分子改変のための好ましい位置としては、ガイド末端と、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質および／または標的、例えば直接反復配列のステムループと複合体化された場合に露出されるガイド分子の領域とが挙げられる。 In certain embodiments, the guide molecule comprises a guide sequence linked directly to the repetitive sequence, where the direct repetitive sequence comprises one or more stem loops or optimized secondary structure. In certain embodiments, the direct repeats have a minimum length of 16 nts and a single stem-loop. In a further aspect, the direct repeats have a length of greater than 16 nts, preferably greater than 17 nts, and have two or more stem-loops or optimized secondary structures. In certain embodiments, the guide molecule comprises or consists of a guide sequence linked to all or part of the native direct repeats. Typical V- or VI-type CRISPR-cas guide molecules (3'→ 5'direction or 5'→ 3'direction) are guide sequences, first complementary stretches (“repeated sequences”), loops (typical). Is 4 or 5 nucleotides in length), a second complementary stretch (the "anti-repeat sequence" is complementary to the repeat), and a poly A (often poly U in RNA) tail (terminator). including. In certain embodiments, the direct repeats retain their natural structure and form a single stem-loop. In certain embodiments, certain aspects of the guide structure can be modified, for example by adding, removing or replacing features, but certain other aspects of the guide structure are maintained. Preferred positions for engineered guide molecule modifications, such as, but not limited to, insertions, deletions and substitutions, are the guide end and the stem loop of the CRISPR-Cas protein and / or target, eg, a direct repeat sequence. And the region of the guide molecule that is exposed when complexed with.
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質はＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質である。特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質は、ＲＮＡを標的にするＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）である。例示的なＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質としては、Ｃａｓ１３ｂおよびＣ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても知られている）が挙げられる。本明細書で使用される「Ｃａｓ１３」という用語は、ＲＮＡを標的にするあらゆるＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）を指す。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要とされない。Ｃ２ｃ２またはＣａｓ１３は、Ａｂｕｄａｙｙｅｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３−１−ａａｆ５５７３−９（２０１６）；Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０（３）：３８５−９７（２０１５）；およびＳｍａｒｇｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６５：６１８−３０（２０１７）に記載されている。 In some embodiments, the CRISPR system effector protein is an RNA-targeted effector protein. In certain embodiments, the CRISPR system effector protein is a VI-type CRISPR system that targets RNA (eg, Cas13a, Cas13b, Cas13c or Cas13d). Exemplary RNA-targeted effector proteins include Cas13b and C2c2 (also known as Cas13a). As used herein, the term "Cas13" refers to any VI-type CRISPR system that targets RNA (eg, Cas13a, Cas13b, Cas13c or Cas13d). If the CRISPR protein is a C2c2 protein, then tracrRNA is not required. C2c2 or Cas13, Abudayyeh et al., Science, 353 (6299): aaf5573-1-aaf5573-9 (2016); Shmakov, Molecular Cell, 60 (3): 385-97 (2015); and Margon, Molecular Cell. : 618-30 (2017).
いくつかの態様では、核酸標的システムの１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化システムを含む特定の生物に由来している。特定の例示的態様では、エフェクタータンパク質ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化システムは、少なくとも１つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の例示的態様では、エフェクタータンパク質は単一のＨＥＰＮドメインを含む。特定の他の例示的態様では、エフェクタータンパク質は２つのＨＥＰＮドメインを含む。 In some embodiments, one or more elements of the nucleic acid targeting system are derived from a particular organism, including the endogenous CRISPR RNA targeting system. In certain exemplary embodiments, the effector protein CRISPR RNA targeting system comprises at least one HEPN domain. In certain exemplary embodiments, the effector protein comprises a single HEPN domain. In certain other exemplary embodiments, the effector protein comprises two HEPN domains.
特定の他の例示的態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムエフェクタータンパク質はＣ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は２つのＨＥＰＮドメインの存在に依存していてもよい。これらはリボヌクレアーゼドメイン、すなわちＲＮＡを切断するヌクレアーゼ（特にエンドヌクレアーゼ）であることが分かっている。またＣ２ｃ２ ＨＥＰＮは標的ＤＮＡまたは潜在的にＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインはそれらの野生型の形態で少なくともＲＮＡに結合して切断することができるという前提で、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はリボヌクレアーゼ機能を有していることが好ましい。Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３−１−ａａｆ５５７３−９（２０１６）を参照されたい。 In certain other exemplary embodiments, the CRISPR system effector protein is a C2c2 nuclease. The activity of C2c2 may depend on the presence of two HEPN domains. These are known to be ribonuclease domains, nucleases that cleave RNA (particularly endonucleases). C2c2 HEPN may also be target DNA or potentially DNA and / or RNA. The C2c2 effector protein preferably has a ribonuclease function, provided that the HEPN domain of C2c2 can bind and cleave at least RNA in their wild-type form. See Abudayyeh, Science, 353 (6299): aaf5573-1-aaf5573-9 (2016).
ＴＡＬＥシステム
いくつかの態様では、遺伝子改変は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムにより行う。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は実際にあらゆる所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥＮシステムを用いるゲノム編集の例示的な方法は、例えば、Ｃｅｒｍａｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９（２１）：ｅ８２（２０１１）；Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：１４９−１５３（２０１１）ならびに米国特許第８，４５０，４７１号、第８，４４０，４３１号および第８，４４０，４３２号に記載されている。
TALE system In some embodiments, genetic modification is carried out by a transcriptional activator-like effector nuclease (TALEN) system. Transcription activator-like effectors (TALEs) can be engineered to bind virtually any desired DNA sequence. An exemplary method of genome editing using the TALEN system is described, for example, in Cermak, Nucleic Acids Res. , 39 (21): e82 (2011); Zhang, Nat. Biotechnol. , 29: 149-153 (2011) and US Pat. Nos. 8,450,471, 8,440,431 and 8,440,432.
いくつかの態様は、向上した効率および拡張された特異性を有する核酸配列の標的化を可能にする、それらの組織構造の一部としてＴＡＬＥモノマーを含む単離された天然に存在しない組換え、すなわち操作されたＤＮＡ結合タンパク質を使用することを含む。ＴＡＬＥの構造および機能は、例えば、Ｍｏｓｃｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：１５０１（２００９）；Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：１５０９−１５１２（２００９）；およびＺｈａｎｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９：１４９−１５３（２０１１）にさらに記載されている。 Some aspects are isolated, non-naturally occurring recombinations, which include TALE monomers as part of their tissue structure, allowing the targeting of nucleic acid sequences with improved efficiency and extended specificity. That is, it involves the use of engineered DNA binding proteins. The structure and function of TALE are described, for example, in Moscow, Science, 326: 1501 (2009); Boch, Science, 326: 1509-1512 (2009); and Zhang, Nat. Biotechnology, 29: 149-153 (2011).
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの態様では、遺伝子改変剤はジンクフィンガーシステムを含む。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインの１種は人工Ｚｎフィンガー（ＺＦ）技術によって提供され、これはゲノム内の新しいＤＮＡ結合部位を標的にするためのＺＦモジュールのアレイを含む。ＺＦアレイ内の各フィンガーモジュールは３つのＤＮＡ塩基を標的にする。個々のジンクフィンガードメインのカスタマイズされたアレイは、ＺＦタンパク質（ＺＦＰ）の中に組み立てられている。
Zn finger nuclease In some embodiments, the gene modifier comprises a zinc finger system. One type of programmable DNA binding domain is provided by artificial zinc finger (ZF) technology, which includes an array of ZF modules for targeting new DNA binding sites in the genome. Each finger module in the ZF array targets three DNA bases. A customized array of individual zinc finger domains is assembled within the ZF protein (ZFP).
ＺＦＰは機能性ドメインを含むことができる。最初の合成ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＺＦタンパク質をＩＩＳ型制限酵素Ｆｏｋｌの触媒ドメインに融合させることによって開発された（Ｋｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，８８３−８８７（１９９４）；Ｋｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，１１５６−１１６０（１９９６））。高い切断特異性は、それぞれが短いスペーサによって分離された異なるヌクレオチド配列を標的にする対のＺＦＮヘテロ二量体の使用により低下したオフターゲット活性により達成することができる（Ｄｏｙｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７４−７９（２０１１））。ＺＦＰは転写活性化因子およびリプレッサーとして設計することもでき、多種多様な生物の多くの遺伝子を標的にするために使用されている。ＺＦＮを用いたゲノム編集の例示的な方法は、例えば米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，７４６，８３８号、第６，７９４，１３６号、第６，８２４，９７８号、第６，８６６，９９７号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、第７，０３０，２１５号、第７，２２０，７１９号、第７，２４１，５７３号、第７，２４１，５７４号、第７，５８５，８４９号、第７，５９５，３７６号、第６，９０３，１８５号および第６，４７９，６２６号に記載されている。 The ZFP can include a functional domain. The first synthetic zinc finger nuclease (ZFN) was developed by fusing the ZF protein to the catalytic domain of the IIS type restriction enzyme Fokl (Kim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 883-887 (1994); Kim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1156-1160 (1996)). High cleavage specificity can be achieved by off-target activity reduced by the use of paired ZFN heterodimers, each targeting a different nucleotide sequence separated by a short spacer (Doyon, Nat. Methods, 8). : 74-79 (2011)). ZFPs can also be designed as transcriptional activators and repressors and are used to target many genes in a wide variety of organisms. Exemplary methods of genome editing using ZFNs include, for example, US Pat. Nos. 6,534,261, 6,607,882, 6,746,838, 6,794,136, 6. , 824,978, 6,866,997, 6,933,113, 6,979,539, 7,013,219, 7,030,215, 7,220 , 719, 7,241,573, 7,241,574, 7,585,849, 7,595,376, 6,903,185 and 6,479,626 It is described in the issue.
メガヌクレアーゼ
本明細書に開示されている「編集」は、大きい認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであるメガヌクレアーゼにより行うことができる。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、米国特許第８，１６３，５１４号、第８，１３３，６９７号、第８，０２１，８６７号、第８，１１９，３６１号、第８，１１９，３８１号、第８，１２４，３６９号および第８，１２９、１３４号に記載されている。
Meganucleases The "editing" disclosed herein can be performed by meganucleases, which are endodeoxyribonucleases characterized by large recognition sites (12-40 base pair double-stranded DNA sequences). Exemplary methods for using meganucleases are U.S. Pat. Nos. 8,163,514, 8,133,697, 8,021,867, 8,119,361, 8, 119,381, 8,124,369 and 8,129,134.
ＲＮＡｉ
特定の態様では、遺伝子改変剤はＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）である。ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性を参照して本明細書で使用される「遺伝子サイレンシング」または「サイレンシングされた遺伝子」は、ｍｉＲＮＡもしくはＲＮＡ干渉分子の非存在下で細胞中に認められるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の標的遺伝子の細胞中のｍＲＮＡレベルの減少を指す。好ましい一態様では、ｍＲＮＡレベルは少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％減少する。
RNAi
In certain embodiments, the gene modifier is RNAi (eg, shRNA). The "gene silencing" or "silented gene" used herein with reference to the activity of an RNAi molecule, such as siRNA or miRNA, is found in cells in the absence of miRNA or RNA interfering molecules. At least about 5%, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, about 99 of mRNA levels. %, About 100%, refers to a decrease in intracellular mRNA levels of the target gene. In a preferred embodiment, mRNA levels are reduced by at least about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, about 99%, about 100%.
本明細書で使用される「ＲＮＡｉ」という用語は、限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡおよび人工マイクロＲＮＡなどの任意の種類の干渉ＲＮＡを指す。例えばこの用語は、ＲＮＡの下流プロセシングの機序に関わらずｓｉＲＮＡとして以前に同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断をもたらすインビボプロセシングの特異的な方法を有すると考えられているが、そのような配列は本明細書に記載されているフランキング配列の文脈ではベクターの中に組み込むことができる）。また「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子および遺伝子の発現を活性化させるＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含むことができる。 As used herein, the term "RNAi" refers to any type of interfering RNA, such as, but not limited to, siRNAi, shRNA, endogenous microRNAs and artificial microRNAs. For example, the term includes sequences previously identified as siRNA regardless of the mechanism of downstream processing of RNA (ie, siRNA is believed to have a specific method of in vivo processing that results in cleavage of the mRNA. , Such sequences can be incorporated into vectors in the context of the flanking sequences described herein). The term "RNAi" can also include both gene silencing RNAi molecules and RNAi effector molecules that activate gene expression.
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞中に存在するかそこで発現される場合に遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させるか阻害する能力を有する。二本鎖ＲＮＡ ｓｉＲＮＡは相補鎖によって形成することができる。一態様では、ｓｉＲＮＡは二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができる核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は完全長の標的遺伝子またはその部分配列に対応することができる。典型的には、ｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的な配列は約１５〜５０ヌクレオチド長であり、かつ二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０塩基対長、好ましくは約１９〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である）。 As used herein, "siRNA" refers to a nucleic acid that forms a double-stranded RNA, where a double-stranded RNA is a gene or target gene if the siRNA is present or expressed in the same cell as the target gene. Has the ability to reduce or inhibit the expression of. Double-stranded RNA siRNA can be formed by complementary strands. In one aspect, siRNA refers to a nucleic acid capable of forming a double-stranded siRNA. The sequence of siRNA can correspond to a full-length target gene or a partial sequence thereof. Typically, siRNAs are at least about 15-50 nucleotides in length (eg, each complementary sequence of double-stranded siRNAs is about 15-50 nucleotides in length, and double-stranded siRNAs are about 15-50 base pairs. Paired length, preferably about 19-30 nucleotides in length, preferably about 20-25 nucleotides in length, such as 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides in length).
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも呼ぶ）はｓｉＲＮＡの１種である。一態様では、これらのｓｈＲＮＡは短い、例えば約１９〜約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖、その後の約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループおよび類似したセンス鎖からなる。あるいは、センス鎖はヌクレオチドループ構造の前にあってもよく、かつアンチセンス鎖がその後にあってもよい。 As used herein, "SHRNA" or "short hairpin RNA" (also referred to as stem-loop) is a type of siRNA. In one aspect, these shRNAs consist of a short, eg, about 19 to about 25 nucleotides of antisense strand, followed by a nucleotide loop of about 5 to about 9 nucleotides and a similar sense strand. Alternatively, the sense strand may precede the nucleotide loop structure and the antisense strand may follow.
「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書では内因性ＲＮＡと同義で使用されており、そのうちのいくつかは転写後レベルにおいてタンパク質コード遺伝子の発現を調節することが知られている。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができるゲノム中に天然に存在する短いＲＮＡである。「人工マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することができる内因性マイクロＲＮＡ以外の任意の種類のＲＮＡ配列を含む。マイクロＲＮＡ配列については、Ｌｉｍ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７：９９１−１００８（２００３）、Ｌｉｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０（２００３）、ＬｅｅおよびＡｍｂｒｏｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５８−８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：７３５−７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７（２００１）およびＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，ＲＮＡ，９：１７５−１７９（２００３）などの刊行物に記載されている。複数のマイクロＲＮＡを前駆体分子の中に組み込むこともできる。さらにｍｉＲＮＡ様ステムループは、ｍｉＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ経路により内因性遺伝子の発現を調節するために人工ｍｉＲＮＡおよび短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するための媒体として細胞において発現させることができる。 The terms "microRNA" or "miRNA" are used herein synonymously with endogenous RNA, some of which are known to regulate expression of protein-encoding genes at post-transcriptional levels. .. Endogenous microRNAs are short RNAs that are naturally occurring in the genome that can regulate the productive use of mRNA. The term "artificial microRNA" includes any type of RNA sequence other than endogenous microRNA that can regulate the productive use of mRNA. For microRNA sequences, Lim, Genes & Development, 17: 991-1008 (2003), Lim, Science, 299, 1540 (2003), Lee and Ambros, Science, 294,862 (2001), Lau, Science, 294,858. -861 (2001), Lagos-Quintana, Current Biology, 12: 735-739 (2002), Lagos Quintana, Science, 294,853-857 (2001) and Lagos-Quintana, RNA, 9: 175-179 (2003). It is described in publications such as. Multiple microRNAs can also be incorporated into the precursor molecule. In addition, miRNA-like stem-loops can be expressed in cells as a vehicle for delivering artificial miRNAs and short interfering RNAs (siRNAs) to regulate the expression of endogenous genes by the miRNA and / or RNAi pathway.
本明細書で使用される「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖からなるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子は、それ自身の上に折り返して二重鎖構造を形成する単一のＲＮＡ分子からなるものを含む。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡと呼ばれる（Ｂａｒｔｅｌ，．Ｃｅｌｌ，１１６（２）：２８１−２９７（２００４））そこから単鎖ｍｉＲＮＡが得られる前駆体分子のステムループ構造はｄｓＲＮＡ分子を含む。 As used herein, "double-stranded RNA" or "dsRNA" refers to a double-stranded RNA molecule. Double-stranded molecules include those consisting of a single RNA molecule that folds over itself to form a double-stranded structure. For example, the stem-loop structure of a precursor molecule from which a single-stranded miRNA is obtained, called a precursor miRNA (Bartel, .Cell, 116 (2): 281-297 (2004)), comprises a dsRNA molecule.
いくつかの態様は、改変または編集された遺伝子を含む真核細胞を産生する方法を含む。いくつかの態様では、本方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞の中に導入する工程であって、この１つ以上のベクターはＣａｓエフェクターモジュールおよび直接反復配列に連結されているガイド配列のうちの１つ以上の発現をドライブし、このＣａｓエフェクターモジュールは塩基編集を媒介する１つ以上のエフェクタードメインに会合する工程と、（ｂ）前記疾患遺伝子内で標的ポリヌクレオチドの塩基編集を行うためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合するのを可能にする工程であって、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターモジュール複合体は標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリッド形成されるガイド配列と複合体化されているＣａｓエフェクターモジュールを含む工程とを含む。 Some embodiments include methods of producing eukaryotic cells containing modified or edited genes. In some embodiments, the method is (a) the step of introducing one or more vectors into eukaryotic cells, the one or more vectors being linked directly to the Cas effector module and repetitive sequences. The Cas effector module drives the expression of one or more of the guide sequences that are present, and the Cas effector module associates with one or more effector domains that mediate base editing, and (b) the base of the target polynucleotide in the disease gene. A step that allows the CRISPR-Cas effector module complex to bind to a target polynucleotide for editing, the CRISPR-Cas effector module complex being hybridized with the target sequence within the target polynucleotide. Includes a guide sequence and a step involving a complexed Cas effector module.
さらなる態様は、本明細書に記載されている組成物または前記改変された細胞の子孫を含む、本明細書に記載されている方法により得られるか得ることが可能な単離された細胞に関する。特定の態様では、当該細胞は真核細胞、好ましくはヒトもしくは非ヒト動物細胞である。いくつかの態様では、当該細胞は免疫細胞である。いくつかの態様では、当該細胞はＨＳＣである。 A further aspect relates to isolated cells that can be obtained or obtained by the methods described herein, including the compositions described herein or the progeny of said modified cells. In certain embodiments, the cell is a eukaryotic cell, preferably a human or non-human animal cell. In some embodiments, the cell is an immune cell. In some embodiments, the cell is HSC.
いくつかの態様は、その細胞のＤＮＡが、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集によって改変されている、単離された免疫細胞または造血幹細胞を含む。いくつかの態様は、その集団中の細胞の少なくとも約１０％は、（ａ）自己免疫疾患に対する感受性に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を減少させ、かつ／または（ｂ）自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させるために遺伝子編集により改変されている免疫細胞または造血幹細胞の集団を含む。 In some embodiments, the DNA of the cell reduces the amount of one or more genetic variants associated with (a) susceptibility to autoimmune disease and / or (b) is protective against autoimmune disease. Includes isolated immune cells or hematopoietic stem cells that have been modified by gene editing to increase the amount of one or more gene variants. In some embodiments, at least about 10% of the cells in the population reduce the amount of one or more genetic variants associated with (a) susceptibility to autoimmune disease and / or (b) autoimmune disease. Includes a population of immune cells or hematopoietic stem cells that have been modified by gene editing to increase the amount of one or more gene variants that are protective against.
本発明はさらに、それを必要とする患者に本明細書に記載されている改変された細胞を投与することを含む細胞療法のための方法であって、改変された細胞の存在により患者における疾患を治療する方法に関する。 The present invention is a method for cell therapy comprising administering the modified cells described herein to a patient in need thereof, the presence of the modified cells causing a disease in the patient. Regarding how to treat.
以下の実施例は、本明細書に記載されている組成物および方法の例示として含められている。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定するものではない。他の態様は当業者に明らかであろう。 The following examples are included as illustrations of the compositions and methods described herein. These examples by no means limit the scope of the invention. Other aspects will be apparent to those skilled in the art.
実施例１：遺伝子編集による免疫疾患の対処
この実施例は、当該技術分野において理解されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用する。ＣＲＩＳＰＲは、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓの略である。ＣＲＩＳＰＲ配列は、細胞を攻撃したウイルスからのＤＮＡのセグメントを含み、同様のウイルスからのＤＮＡを検出し、かつＣａｓタンパク質と共にそれを破壊することができるＲＮＡを産生するために細胞によって使用される。ＣＡＳはＣＲＩＳＰＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）の略であり、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子は細胞のＤＮＡにおいてＣＲＩＳＰＲ配列の近くに認められる。合成的に改変され、かつガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と一体化されたＣａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡに対応する特定の標的ＤＮＡに結合して両鎖においてＤＮＡを切断することができる。この二本鎖切断は、標的ＤＮＡを置換ＤＮＡで置き換えるか細胞における相同な修復プロセスを開始し、そこでは相同な染色体またはテンプレートＤＮＡ内の対応するＤＮＡを複製して切断されたＤＮＡを修復する。
Example 1: Dealing with Immune Diseases by Gene Editing This example uses CRISPR / Cas9 gene editing as understood in the art. CRISPR is an abbreviation for Crusted Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. The CRISPR sequence contains a segment of DNA from the virus that attacked the cell and is used by the cell to detect DNA from a similar virus and to produce RNA that can destroy it with the Cas protein. CAS stands for CRISPR-Associated System, and the gene encoding the Cas protein is found near the CRISPR sequence in cellular DNA. The Cas9 protein, which is synthetically modified and integrated with a guide RNA (gRNA), can bind to a specific target DNA corresponding to the gRNA and cleave the DNA at both strands. This double-strand break replaces the target DNA with a replacement DNA or initiates a homologous repair process in the cell, where it replicates the corresponding DNA in the homologous chromosome or template DNA to repair the cut DNA.
さらにこの実施例は、ＩＢＤのそれらの症状を改善させることができることを実証するためにマウスのモデルに対して行った実験を説明する。マウスにおける結腸の炎症は化学的および／または遺伝的に誘発させる。特に、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）をエタノールと共に直腸内に投与し、オキサゾロンを直腸内に投与するか、あるいは硫酸化多糖であるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を飲料水を介して経口投与する。例えば、Ｗｉｒｔｚ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１２（７）：１２９５−１３０９（２０１７）を参照されたい。代わりまたは追加として、炎症性腸疾患を誘発するようにマウスを遺伝子改変する。例えばＮＯＤ１および／またはＮＯＤ２をノックアウト（ＫＯ）するようにマウスを遺伝子改変する。例えば、Ｎａｔｉｖｉｄａｄ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１８（８）：１４３４−４６（２０１２）；Ｚｅｎｅｗｉｃｚ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２９（６）：９４７−５７（２００８）を参照されたい。代わりまたは追加として、ＩＬ−１０ ＫＯ、ＩＬ−２ ＫＯ、ＴＣＲａ ＫＯ、ＴＧＦｂ ＫＯ、ＴＡＫ１ ＫＯ、ＷＡＳＰ ＫＯまたはＭＤＲ１Ａ ＫＯなどに関するモデルに基づいてマウスを遺伝子改変する。例えば、Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０５：２６３−３２０（２０１２）；Ｗｉｒｔｚ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５９（１１）：１０７３−８３（２００７）を参照されたい。 Further, this example describes an experiment performed on a mouse model to demonstrate that those symptoms of IBD can be ameliorated. Inflammation of the colon in mice is chemically and / or genetically induced. In particular, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) is administered intrarectally with ethanol and oxazolone is administered intrarectally, or the sulfated polysaccharide sodium dextran sulfate (DSS) is administered via drinking water. Orally administer. See, for example, Wirtz, Nature Protocols, 12 (7): 1295-1309 (2017). Alternatively or additionally, the mice are genetically modified to induce inflammatory bowel disease. For example, mice are genetically modified to knock out (KO) NOD1 and / or NOD2. See, for example, Natived, Inflammatory Bowel Diseases, 18 (8): 1434-46 (2012); Zenewiz, Immunity, 29 (6): 947-57 (2008). Alternatively or additionally, mice are genetically modified based on models for IL-10 KO, IL-2 KO, TCRa KO, TGFb KO, TAK1 KO, WASP KO or MDR1A KO. For example, Mizoguchi, Progress in Mol. Biol. Translation. Sci. , 105: 263-320 (2012); Wirtz, Adv. Drug Deliv. Rev. , 59 (11): 1073-83 (2007).
より詳細には、本発明者らは２種類の突然変異を検討する。１つ目はＩＢＤに対する感受性突然変異、例えば１１３Ｇｌｙ→Ａｒｇなどの例えばＩＬ−１０に対する機能喪失突然変異であり、これにより、理論によって縛られるものではないが、ＩＬ−１０がＳＴＡＴ３リン酸化を誘導すること、または末梢血単核細胞においてリポ多糖類（ＬＰＳ）媒介性ＴＮＦ放出を阻害することができなくなると考えられている。例えば、Ｇｌｏｃｋｅｒ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２４６：１０２−０７（２０１１）を参照されたい。２つ目は、上で考察したＩＬ２３Ｒに対するＩＢＤのための保護的突然変異（Ｒ３８１Ｑはｒｓ１１２０９０２６、ｃ．１１４２Ｇ＞Ａに対応する）である。 More specifically, we examine two types of mutations. The first is a susceptibility mutation to IBD, such as a loss-of-function mutation to IL-10, such as 113 Gly → Arg, which, although not bound by theory, induces STAT3 phosphorylation. It is believed that this, or peripheral blood mononuclear cells, is unable to inhibit lipopolysaccharide (LPS) -mediated TNF release. For example, Glocker, Ann. N. Y. Acad. Sci. , 1246: 102-07 (2011). The second is the protective mutation for IBD against IL23R discussed above (R381Q corresponds to rs11209026, c.1142G> A).
標準系統の胚を遺伝子編集することによって４つの異なる群のマウス、すなわちヘテロ接合型ＩＬ−１０感受性突然変異を有し、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有しないＡ群、ＩＬ１０および／またはＩＬ２３Ｒ突然変異のいずれも有しないＢ群、ＩＬ１０突然変異を有し、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有するＣ群、およびＩＬ１０突然変異を有さず、かつＩＬ２３Ｒ保護的突然変異を有するＤ群を使用する。 By genetically editing a standard line of embryo, four different groups of mice, namely group A, IL10 and / or IL23R mutations with heterozygous IL-10-sensitive mutations and no IL23R-protective mutations. Group B having none of the above, group C having an IL10 mutation and having an IL23R protective mutation, and group D having no IL10 mutation and having an IL23R protective mutation are used.
これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６などの一般的なマウス系統をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集することにより作成する。代わりに、マウスは例えばＮａｖ１．７ＫＯマウスなどの疼痛に対して感受性が低い系統から作成することもできる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３８（４７）：１０１８０−１０２０１（２０１８）を参照されたい。この実験はヒト化マウス、すなわち機能性のヒト免疫系が移植された免疫疾患マウスを用いる場合と概念的に類似していてもよい。例えば、Ｋｅｎｎｅｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１６（２）：３８９−９７（２０１６）を参照されたい。さらにこの実験は、例えばＩｌ１０座（近位のプロモーターおよびＵＴＲを含むエクソン１〜５）を削除するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子編集を用いて標準的なＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ系統から編集されたＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−Ｉｌ１０ｅｍ８Ｔａｃマウスモデルを用いるなどの特定の編集を必要としない既存のマウスモデルを用いる場合と概念的に類似しているであろう。 These mice are created by editing common mouse strains such as C57BL / 6 by CRISPR / Cas9. Alternatively, mice can be made from strains that are less sensitive to pain, such as Nav1.7KO mice. For example, Shiels, J Neuroscience. , 38 (47): 10180-10201 (2018). This experiment may be conceptually similar to using humanized mice, i.e., immune disease mice transplanted with a functional human immune system. For example, Kenney, Am. J. Transplant. , 16 (2): 389-97 (2016). In addition, this experiment was edited from the standard C57BL / 6NTac strain using CRISPR / Cas9 mediated gene editing, eg, to remove the Il10 locus (exons 1-5 containing proximal promoters and UTRs) from Taconic Biosciences. It would be conceptually similar to using an existing mouse model that does not require specific editing, such as using a C57BL / 6NTac-Il10 em8Tac mouse model manufactured by C57BL / 6NTac-Il10 em8Tac.
ＨＳＣが編集されているマウスにおいて、ＣＤ３４＋細胞を捕捉することによりＨＳＣを骨または血液から採取する（ＣＤ３４はほぼ全てのヒトのＨＳＣで発現されるが、マウスのＨＳＣのおよそ２０％で発現されることに留意されたい。Ｏｇａｗａ，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９３８：１３９−４５（２００１）を参照されたい。但し、ＣＤ３４を発現するマウスのＨＳＣの割合を変えるために、マウスの発現を刺激して回復させて採取することができる。Ｔａｊｉｍａ，Ｂｌｏｏｄ，９６（５）：１９８９−９３（２０００）を参照されたい。 In mice in which HSCs have been edited, HSCs are harvested from bone or blood by capturing CD34 + cells (CD34s are expressed in almost all human HSCs, but are expressed in approximately 20% of mouse HSCs. Note that Ogawa, Annuals of the New York Academy of Sciences, 938: 139-45 (2001), but to change the proportion of HSC in mice expressing CD34, the expression in mice. It can be stimulated to recover and harvest. See Tajima, Blood, 96 (5): 1989-93 (2000).
次いで、採取した細胞をエクスビボで編集し、それらの体内で生じたＨＳＣ集団を実質的に枯渇させたマウスの血流に戻す。これは、ＡＣＫ２などの抗ｃ−Ｋｉｔ抗体ならびにマウスＣＤ４７を標的にするためにヒトＣＤ４７を有効に標的にするＣＶ１から改変されたＣＶ１ｍｂなどの抗ＣＤ４７抗体を投与する非放射線すなわち非化学療法技術を用いて達成することができ、これは宿主ＨＳＣを実質的に枯渇させることが分かっており、骨における６０％超のドナー由来のＨＳＣキメラ現象ならびにドナー由来の骨髄系細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞のそれぞれにおける血中のおよそ６０％、４５％、６０％および３０％のキメラ現象を有するコンジェニックドナーマウスから注射によって送達されたＨＳＣのロバストな生着を達成する。Ｃｈｈａｂｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（３５１）：３５１ｒａ１０５（１０頁）（２０１６）を参照されたい。マウスは１日目に５００ｍｇのＡＣＫ２、１日目に開始して毎日５日間にわたって５００ｍｇのＣＶ１ｍｂの注射によって治療することができる。移植は３日間毎日およそ１００万個の編集されたＨＳＣを注射により移すことによる治療から６日後に開始することができる。移植からおよそ２４週間後に、宿主の元の細胞と比較して関連する編集を有するＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球および肥満細胞）の数を数えて、編集されたＨＳＣの生着が成功しているか否かを決定してもよい。 The collected cells are then edited with Exvivo and the HSC populations generated in their bodies are returned to the bloodstream of substantially depleted mice. This is a non-radiation or non-chemotherapeutic technique that administers anti-c-Kit antibodies such as ACK2 and anti-CD47 antibodies such as CV1mb modified from CV1 that effectively target human CD47s to target mouse CD47s. Can be achieved using, which has been shown to substantially deplete host HSCs, with over 60% donor-derived HSC chimeric phenomena in bone and donor-derived myeloid cells, B cells, NK cells and Robust engraftment of HSCs delivered by injection from congenic donor mice having a chimeric phenomenon of approximately 60%, 45%, 60% and 30% in blood in each of the T cells is achieved. See Chabra, Science Transitional Medicine, 8 (351): 351ra105 (page 10) (2016). Mice can be treated with 500 mg ACK2 on day 1 and injection of 500 mg CV1 mb daily for 5 days starting on day 1. Transplantation can be initiated 6 days after treatment by injecting approximately 1 million edited HSCs daily for 3 days. Approximately 24 weeks after transplantation, the number of B cells, T cells, NK cells, granulocytes (neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells) with relevant edits compared to the original cells of the host May be counted to determine if the edited HSC has been successfully engrafted.
この実験は、ＣＶ１、ＭＩＡＰ４１０またはＨｕ５Ｆ９Ｇ４などの他の抗ＣＤ４７抗体で置き換えるかそれにより増強した場合と概念的に類似していることに留意されたく、これは固体癌および血液癌に使用するために、ヒトにおいて現在臨床試験が行われている（臨床試験ＮＣＴ０２２１６４０９およびＮＣＴ０２３６７１９６）。さらにこの実験は、さらに多くの生着手順を行うか、あるいは抗ｃ−Ｋｉｔ抗体および抗ＣＤ４７抗体治療を放射線または化学療法薬により増強させた場合と概念的に類似している。 Note that this experiment is conceptually similar to replacing or enhancing with other anti-CD47 antibodies such as CV1, MIAP410 or Hu5F9G4, for use in solid and hematological malignancies. , Currently in clinical trials in humans (clinical trials NCT02216409 and NCT02367196). Moreover, this experiment is conceptually similar to performing more engraftment procedures or enhancing anti-c-Kit antibody and anti-CD47 antibody therapy with radiation or chemotherapeutic agents.
遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換え修復（ＨＤＲ：ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）によって達成することができ、ここでは未編集ＤＮＡの領域内の相同体に対応するが新しい配列を有するテンプレートＤＮＡを複製してその鎖が切断された後にＤＮＡを置き換える。特にＡ群中のマウスの４分の１（Ａ１群）を遺伝子編集に供してＩＬ１０感受性突然変異を除去し、Ａ群中のマウスの４分の１（Ａ２群）を遺伝子編集に供して保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異を追加し、Ａ群中のマウスの４分の１（Ａ３群）を遺伝子編集に供して保護的ＩＬ２３Ｒ突然変異を追加し、かつＩＬ１０突然変異を除去する。Ｂ群中のマウスの２分の１（Ｂ２群）を遺伝子編集に供してＩＬ２３Ｒ突然変異を追加する。Ｃ群中のマウスの２分の１（Ｃ２群）を遺伝子編集に供してＩＬ１０突然変異を除去する。Ａ群、Ｂ群およびＣ群中の残数をＡ１群、Ａ２群、Ａ３群、Ｂ２群、Ｃ２群、Ｄ群中の残数と同様にするために、本発明者らはＡ群、Ｂ群、Ｃ群およびＣ群のそれぞれにおいて４：２：２：１の比のマウス数を用いて開始することができる。 Gene editing can be accomplished by homologous recombination repair (HDR) via CRISPR / Cas9, where a template DNA that corresponds to a homologous within the region of unedited DNA but has a new sequence is replicated. Then the DNA is replaced after the strand is cleaved. In particular, a quarter of the mice in group A (group A1) were subjected to gene editing to eliminate IL10-sensitive mutations, and a quarter of the mice in group A (group A2) were subjected to gene editing for protection. The IL23R mutation is added, and a quarter of the mice in Group A (Group A3) are subjected to gene editing to add the protective IL23R mutation and eliminate the IL10 mutation. Half of the mice in group B (group B2) are subjected to gene editing to add the IL23R mutation. Half of the mice in group C (group C2) are subjected to gene editing to remove the IL10 mutation. In order to make the remaining number in the A group, the B group and the C group the same as the remaining number in the A1 group, the A2 group, the A3 group, the B2 group, the C2 group and the D group, the present inventors have made the remaining number in the A group and the B group. You can start with a 4: 2: 2: 1 ratio of mouse numbers in each of the groups, C and C groups.
編集されたＨＳＣが免疫細胞を産生するのを待った後（例えば約６ヶ月後）であって、編集された群における生着が成功しているとみなした後に、上記方法のうちの１つを用いてこれらのマウスを大腸炎になるように化学的に誘発する。次いでＡ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群、Ａ１群、Ａ２群、Ａ３群、Ｂ２群およびＣ２群の全てにわたって体重減少、出血および下痢に関する表現型の重症度を比較する。以下の表（表１）は、開始時の遺伝子状態、理論的に編集された遺伝子状態、および症状レベルの１つの可能な分類を示す。理論によって縛られるものではないが、ＨＳＣ編集が完全に効率的であれば、本発明者らは、Ａ３群とＢ２群とＣ２群とＤ群との間、Ａ２群とＣ群の間、ならびにＡ１群とＢ群との間でそれらの症状が類似することを期待する。ＩＬ２３Ｒバリアントの保護的効果がＩＬ１０バリアントの感受性効果よりも大きく上回っている場合、本発明者らはそれらの症状がＡからＤに向かって最悪から最低になるように順序づけられることを期待する。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して保護的突然変異を遺伝子ＩＬ２３Ｒに与える。より詳細には、ｇＲＮＡは、以下に記載されているＩＬ２３Ｒアミノ酸配列をコードするＤＮＡに付着するように設計されている。
ＭＮＱＶＴＩＱＷＤＡＶＩＡＬＹＩＬＦＳＷＣＨＧＧＩＴＮＩＮＣＳＧＨＩＷＶＥＰＡＴＩＦＫＭＧＭＮＩＳＩＹＣＱＡＡＩＫＮＣＱＰＲＫＬＨＦＹＫＮＧＩＫＥＲＦＱＩＴＲＩＮＫＴＴＡＲＬＷＹＫＮＦＬＥＰＨＡＳＭＹＣＴＡＥＣＰＫＨＦＱＥＴＬＩＣＧＫＤＩＳＳＧＹＰＰＤＩＰＤＥＶＴＣＶＩＹＥＹＳＧＮＭＴＣＴＷＮＡＧＫＬＴＹＩＤＴＫＹＶＶＨＶＫＳＬＥＴＥＥＥＱＱＹＬＴＳＳＹＩＮＩＳＴＤＳＬＱＧＧＫＫＹＬＶＷＶＱＡＡＮＡＬＧＭＥＥＳＫＱＬＱＩＨＬＤＤＩＶＩＰＳＡＡＶＩＳＲＡＥＴＩＮＡＴＶＰＫＴＩＩＹＷＤＳＱＴＴＩＥＫＶＳＣＥＭＲＹＫＡＴＴＮＱＴＷＮＶＫＥＦＤＴＮＦＴＹＶＱＱＳＥＦＹＬＥＰＮＩＫＹＶＦＱＶＲＣＱＥＴＧＫＲＹＷＱＰＷＳＳＬＦＦＨＫＴＰＥＴＶＰＱＶＴＳＫＡＦＱＨＤＴＷＮＳＧＬＴＶＡＳＩＳＴＧＨＬＴＳＤＮＲＧＤＩＧＬＬＬＧＭＩＶＦＡＶＭＬＳＩＬＳＬＩＧＩＦＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ（配列番号１）
対応するＤＮＡ配列は配列表の中の配列番号２に記載されている。
CRISPR-Cas9 is used with a guide RNA (gRNA) to confuse the gene IL23R with a protective mutation. More specifically, the gRNA is designed to attach to the DNA encoding the IL23R amino acid sequence described below.
MNQVTIQWDAVIALYILFSWCHGGITNINCSGHIWVEPATIFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHFYKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMTCTWNAGKLTYIDTKYVVHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGGKKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFDTNFTYVQQSEFYLEPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSLFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTGHLTSDNRGDIGLLLGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRRILLLIPKWLYEDIPNMKNSNVVKMLQENSELMNNNSSEQVLYVDPMITEIKEIFIPEHKPTDYKKENTGPLETRDYPQNSLFDNTTVVYIPDLNTGYKPQISNFLPEGSHLSNNNEITSLTLKPPVDSLDSGNNPRLQKHPNFAFSVSSVNSLSNTIFLGELSLILNQGECSSPDIQNSVEEETTMLLENDSPSETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQNILESHFNRISLLEK (SEQ ID NO: 1)
The corresponding DNA sequence is set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
Ｃｒｉｓｐｒ−ＣＡＳ９複合体は３８１位のＲの領域においてＤＮＡを切断するように設計されており、テンプレートＤＮＡは３８１位のＲをＱに変換させるか、あるいはヌクレオチド位置１１４２ＡのＧをＡに変換させるような相同な修復を達成するように設計されている。この目的を達成することができるテンプレートＤＮＡは参照ＤＮＡ（配列番号２）の１１４２位の周りのＤＮＡ配列に対応する。 The Crispr-CAS9 complex is designed to cleave DNA in the region of R at position 381, and template DNA either converts R at position 381 to Q or G at nucleotide position 1142A to A. Designed to achieve homologous repairs. Template DNA that can achieve this goal corresponds to the DNA sequence around position 1142 of the reference DNA (SEQ ID NO: 2).
ガイドＲＮＡテンプレートは、ＩＬ２３Ｒ遺伝子の特定の領域を標的にするように設計されている。 Guide RNA templates are designed to target specific regions of the IL23R gene.
ガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的なマウスのＩＬ２３Ｒ標的配列としては、
ＡＴＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＧＧＡＴＴ（配列番号３）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣ（配列番号４）
ＣＣＣＴＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡ（配列番号５）
ＴＧＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＣＴＣ（配列番号６）
ＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＴＡＡ（配列番号７）
ＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＣＴＧＣＡ（配列番号８）
が挙げられる。
As an exemplary mouse IL23R target sequence used to construct a guide RNA sequence,
ATAGAACAAACAGCTCGGATT (SEQ ID NO: 3)
ACAACAACTACACGTCCATC (SEQ ID NO: 4)
CCCTTAAGCACTGCCGACCA (SEQ ID NO: 5)
TGTGTCATTTATTGAATATCC (SEQ ID NO: 6)
ACCATCTGAAGAGCACATAA (SEQ ID NO: 7)
ATCTCCACTGACTCACTGCA (SEQ ID NO: 8)
Can be mentioned.
マウスのＩＬ２３Ｒを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＡＵＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＵＣＧＧＡＵＵ（配列番号９）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＧＵＣＣＡＵＣ（配列番号１０）
ＣＣＣＵＵＡＡＧＣＡＣＵＧＣＣＧＡＣＣＡ（配列番号１１）
ＵＧＵＧＵＣＡＵＵＵＡＵＧＡＡＵＡＣＵＣ（配列番号１２）
ＡＣＣＡＵＣＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＵＡＡ（配列番号１３）
ＡＵＣＵＣＣＡＣＵＧＡＣＵＣＡＣＵＧＣＡ（配列番号１４）
を含む。
An exemplary guide RNA sequence targeting mouse IL23R is
AUAGAACAACAGCUCGGAUU (SEQ ID NO: 9)
ACAACAACUACACGUCCAUC (SEQ ID NO: 10)
CCCUUAAGCACUGCCGACCA (SEQ ID NO: 11)
UGUGUCAUUAUGAAUACUC (SEQ ID NO: 12)
ACCAUCUGAGAGCACAUAA (SEQ ID NO: 13)
AUCUCCACUGACUCACUGCA (SEQ ID NO: 14)
including.
ガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的なヒトＩＬ２３Ｒ標的配列としては、
ＧＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＧ（配列番号１５）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣ（配列番号１６）
ＣＴＡＣＡＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣＧ（配列番号１７）
ＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＴＡＡ（配列番号１８）
ＣＣＣＴＴＴＡＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧＣ（配列番号１９）
ＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧ（配列番号２０）
が挙げられる。
As an exemplary human IL23R target sequence used to construct a guide RNA sequence,
GTGCAGTACATAGAAGCATG (SEQ ID NO: 15)
ACAACAACTACACGTCCATC (SEQ ID NO: 16)
CTACATAGACACAAAAATACG (SEQ ID NO: 17)
ACCAGCTGAAGAGTATGTAA (SEQ ID NO: 18)
CCCTTTACACTTCTCGC (SEQ ID NO: 19)
ACTTCATCAGGGAATTCTGG (SEQ ID NO: 20)
Can be mentioned.
ヒトＩＬ２３Ｒを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＧＵＧＣＡＧＵＡＣＡＵＡＧＡＡＧＣＡＵＧ（配列番号２１）
ＡＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＡＣＧＵＣＣＡＵＣ（配列番号２２）
ＣＵＡＣＡＵＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＵＡＣＧ（配列番号２３）
ＡＣＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＵＡＵＧＵＡＡ（配列番号２４）
ＣＣＣＵＵＵＡＣＡＵＡＣＵＣＵＵＣＡＧＣ（配列番号２５）
ＡＣＵＵＣＡＵＣＡＧＧＡＡＵＡＵＣＵＧＧ（配列番号２６）
を含む。
An exemplary guide RNA sequence targeting human IL23R is
GUGCAGUACAUAGAAGCAUG (SEQ ID NO: 21)
ACAACAACUACACGUCCAUC (SEQ ID NO: 22)
CUACAUAGACACAAAAAUACG (SEQ ID NO: 23)
ACCAGCUGAAGAGUAUGUAA (SEQ ID NO: 24)
CCCUUUACAUACUCUUCAGC (SEQ ID NO: 25)
ACUUCAUCAGGGAAUAUCUGG (SEQ ID NO: 26)
including.
ヒトＩＬ２３ＲにおけるＧ１１４２Ａを標的にするガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的な標的配列としては、
ＴＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴ（配列番号２７）
ＴＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣ（配列番号２８）
ＴＴＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＴ（配列番号２９）
ＣＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＡＣＴＧＧＧＴ（配列番号３０）
ＣＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＴ（配列番号３１）
が挙げられる。
As an exemplary target sequence used to construct a guide RNA sequence that targets G1142A in human IL23R,
TGTCAATTCTTTTCTTTGATT (SEQ ID NO: 27)
TTTAACAGATCATTCCGAAC (SEQ ID NO: 28)
TTAACAGATCATTCCGACT (SEQ ID NO: 29)
CAGATCATTCCGAACTGGGT (SEQ ID NO: 30)
CTGCAAAAAACCTACCCAGTT (SEQ ID NO: 31)
Can be mentioned.
ヒトＩＬ２３ＲにおけるＧ１１４２Ａを標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＵＧＵＣＡＡＵＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＡＵＵ（配列番号３２）
ＵＵＵＡＡＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣ（配列番号３３）
ＵＵＡＡＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣＵ（配列番号３４）
ＣＡＧＡＵＣＡＵＵＣＣＧＡＡＣＵＧＧＧＵ（配列番号３５）
ＣＵＧＣＡＡＡＡＡＣＣＵＡＣＣＣＡＧＵＵ（配列番号３６）
を含む。
野生型のヒトＩＬ−１０配列が以下に記載されている。
ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号３７）
An exemplary guide RNA sequence targeting G1142A in human IL23R is
UGUCAAUUCUUUCUUGAUU (SEQ ID NO: 32)
UUUAACAGAUCAUUCGAAC (SEQ ID NO: 33)
UUAACAGAUCAUUCCACU (SEQ ID NO: 34)
CAGAUCAUUCCGACUGGGU (SEQ ID NO: 35)
CUGCAAAACCUACCCAGUU (SEQ ID NO: 36)
including.
Wild-type human IL-10 sequences are described below.
MHSSALLCCLVLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKGENLKRFLKRFLK
ヒトＩＬ１０を標的にするガイドＲＮＡ配列を構築するために使用される例示的な標的配列としては、
ＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡ（配列番号３８）
ＣＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣ（配列番号３９）
ＡＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴ（配列番号４０）
ＡＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧ（配列番号４１）
ＧＧＣＧＣＡＴＧＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号４２）
ＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣ（配列番号４３）
ＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣ（配列番号４４）
ＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣ（配列番号４５）
ＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号４６）
が挙げられる。
As an exemplary target sequence used to construct a guide RNA sequence that targets human IL10,
GAACCAAGACCCAGACATCA (SEQ ID NO: 38)
CAAGGCGGCATGTGAACTCCC (SEQ ID NO: 39)
AAGGCGGCATGTGAACTCCCT (SEQ ID NO: 40)
AGGCGCATGTGAACTCCCTG (SEQ ID NO: 41)
GGCGCATGTGAACTCCCTGG (SEQ ID NO: 42)
GGGAGAACCTGAAGACCCTC (SEQ ID NO: 43)
GCCTCAGCCTGAGGGTCTTC (SEQ ID NO: 44)
GGGTCTTCAGGTTCTCCCCC (SEQ ID NO: 45)
GGTCTTCAGGTTCTCCCCA (SEQ ID NO: 46)
Can be mentioned.
ヒトＩＬ−１０におけるＧ１１３Ｒアミノ酸突然変異を標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列は、
ＧＡＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＵＣＡ（配列番号４７）
ＣＡＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣ（配列番号４８）
ＡＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵ（配列番号４９）
ＡＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵＧ（配列番号５０）
ＧＧＣＧＣＡＵＧＵＧＡＡＣＵＣＣＣＵＧＧ（配列番号５１）
ＧＧＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＡＧＡＣＣＣＵＣ（配列番号５２）
ＧＣＣＵＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＵＣＵＵＣ（配列番号５３）
ＧＧＧＵＣＵＵＣＡＧＧＵＵＣＵＣＣＣＣＣ（配列番号５４）
ＧＧＵＣＵＵＣＡＧＧＵＵＣＵＣＣＣＣＣＡ（配列番号５５）
を含む。
An exemplary guide RNA sequence targeting a G113R amino acid mutation in human IL-10 is
GAACCAAGACCCAGACAUCA (SEQ ID NO: 47)
CAAGGCGCAUGUGAACUCCC (SEQ ID NO: 48)
AAGGCGCAUGUGAACUCCCU (SEQ ID NO: 49)
AGGCGCAUGUGAACUCCCUG (SEQ ID NO: 50)
GGCGCAUGUGAACUCCCUGG (SEQ ID NO: 51)
GGGAGAACCUGAAGACCCCUC (SEQ ID NO: 52)
GCCUCAGCCUGAGGGUCUUC (SEQ ID NO: 53)
GGGUCUUCAGGUUCCCCCC (SEQ ID NO: 54)
GGUCUCACAGGUUCUCCCCA (SEQ ID NO: 55)
including.
実施例２：編集のために遺伝子突然変異を選択する機械学習手法
どの遺伝子またはバリアントを編集するべきかを決定するために、機械学習技術を使用して遺伝子突然変異に基づく表現型を発症する確率を説明する。そのような技術としては、例えば線形回帰モデル、ロジスティック回帰モデル、遺伝子もしくは遺伝子バリアント相互作用を含む非線形回帰モデル、多すぎる可能な遺伝子または少なすぎる患者データにより劣決定されるかノイズが多い場合に主成分分析または回帰問題に対する制約を多くするために制約関数を用いる回帰モデルが挙げられる。回帰パラメータに対する制約関数は、リッジ回帰で使用されるＬ２正則化またはラッソ回帰で使用されるＬ１正則化を含むことができる。独立した遺伝子変数を論理的または数学的に組み合わせて線形モデルで使用される新しい変数を作り出すことにより、回帰パラメータにおいてモデル線形をなお維持しながら当該遺伝子の中での非線形相互作用を捉えることができる。非線形相互作用は、ディープラーニングニューラルネットワークまたはサポートベクターマシンを含むニューラルネットワークなどのパラメータにおいて非線形であるモデルを用いて捉えることもできる。これらの方法のいくつかは、例えばＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２２：５４１−５４９（２００６）に記載されている。線形モデルにとって特に単純な回帰パラメータの大きさを見ること、あるいは異なるデータをシミュレートし、かつそれを非線形モデルに与えることにより、疾患表現型または疾患表現型のリスクに対して最も大きい影響を有する遺伝子または遺伝子突然変異を決定する。どのバリアントが疾患に関連しているかを同定するための他の技術としては、遺伝子機能および遺伝子シグナル伝達経路データを使用して、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）から表現型を引き起こす可能性が最も高いリスク遺伝子座の近くの遺伝子を同定するツールが挙げられる。例えば、Ｐｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６，論文５８９０（９頁）（２０１５）を参照されたい。
Example 2: Machine Learning Techniques for Selecting Gene Mutations for Editing Probability of Developing Gene Mutation-Based Phenotypes Using Machine Learning Techniques to Determine Which Gene or Variant Should Be Edited Will be explained. Such techniques are predominantly under-determined or noisy by, for example, linear regression models, logistic regression models, non-linear regression models involving gene or gene variant interactions, too many possible genes or too few patient data. Regression models that use constraint functions to increase constraints on component analysis or regression problems can be mentioned. Constraint functions on regression parameters can include L 2 regularization used in ridge regression or L 1 regularization used in lasso regression. By logically or mathematically combining independent gene variables to create new variables used in a linear model, it is possible to capture non-linear interactions within the gene while still maintaining the model alignment in the regression parameters. .. Non-linear interactions can also be captured using models that are non-linear in parameters such as deep learning neural networks or neural networks including support vector machines. Some of these methods are described, for example, in Rabinowitz, Bioinformatics, 22: 541-549 (2006). Having the greatest impact on disease phenotype or disease phenotype risk by looking at the magnitude of regression parameters, which is particularly simple for a linear model, or by simulating different data and feeding it to a nonlinear model. Determine a gene or gene mutation. As another technique for identifying which variants are associated with the disease, gene function and gene signaling pathway data are most likely to cause phenotypes from genome-wide association studies (GWAS). Tools can be mentioned to identify genes near the risk locus. See, for example, Pers, Nature Communications, 6, Article 5890 (page 9) (2015).
既に言及した参考文献に加えて、以下の参考文献：Ｓａｎｄｓ，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．，２３（１）：９７−１０６（２０１７）；Ｊｉｎｅｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６−８２１（２０１２）；Ｓａｌｅｒｎｏ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５（１２）：ｅ１２４０８５７−１−ｅ１２４０８５７−１４（２０１６）；Ｓｉｖａｎｅｓａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９１：８６７３−８５（２０１６）；Ｐｉｄａｓｈｅｖａ，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，６（１０）：ｅ２５０３８（２０１１）；ＳＮＰｅｄｉａ，ｒｓ１１２０９０２６；ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｄｐＳＮＰ：ｒｓ１１２０９０２６；Ｄｕｅｒｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１４（５８０４）：１４６１−６３（２００６）；Ｈａｚｌｅｔｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：２８２−８７（２０１２）；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，論文ＩＤ５３９４６１（１２頁）（２０１０）；Ｍｕ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１５５：１９１−２０２（２０１８）；Ａｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：２８３−８９（２０１２）；Ｇｏｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，１４：２０１７０３２０（１３頁）（２０１７）；Ｌｕ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，１５（６）：５６５−７２（２０１４）；Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２５（３）：４５４−６５（２００６）も有名である。 In addition to the references already mentioned, the following references: Sands, Inflamm. Bowel Dis. , 23 (1): 97-106 (2017); Jinek, Science, 337: 816-821 (2012); Salerno, OncoImmunology, 5 (12): e1240857-1-e1240857-14 (2016); Sivanesan, J. et al. Biol. Chem. , 291: 8673-85 (2016); Pidasheva, PLOS ONE, 6 (10): e25038 (2011); SNPdia, rs11209026; US National Library of Medicine, dpSNP: rs11209026; Duer, Science 63 (2006); Hazlett, Genes & Immunity, 13: 282-87 (2012); Ferguson, Gastroenterology Research and Practice, Article ID 539461 (page 12) (2010); Mu, Biomaterials, 155: 192- Nature Methods, 9: 283-89 (2012); Gong, J. et al. R. Soc. Interface, 14: 20170320 (page 13) (2017); Lu, Curr. Drug Targets, 15 (6): 565-72 (2014); Bassaganya-Riera, Clin. Nutr. , 25 (3): 454-65 (2006) is also famous.
Claims (30)
（ｂ）前記対象の１つ以上の細胞において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアント（「保護的遺伝子バリアント」）の量を増加させること
を含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。 (A) reducing the amount of one or more gene variants (“susceptibility gene variants”) associated with susceptibility to autoimmune disease in one or more cells of the subject and / or (b) one of the subjects. A method of treating a subject having an autoimmune disorder, comprising increasing the amount of one or more gene variants (“protective gene variants”) that are protective against the autoimmune disorder in the cells.
前記対象の１つ以上の免疫細胞および／または１つ以上の造血幹細胞において前記保護的遺伝子バリアントの量を増加させること
を含む、請求項１に記載の方法。 Reducing the amount of the susceptibility gene variant in one or more immune cells and / or one or more hematopoietic stem cells of the subject, and in one or more immune cells and / or one or more hematopoietic stem cells of the subject. The method of claim 1, comprising increasing the amount of the protective gene variant.
（ｂ）前記対象において自己免疫疾患に対して保護的な１種以上の遺伝子バリアントを有する細胞の数を増加させること
を含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。 (A) Reducing the number of cells carrying one or more gene variants associated with susceptibility to autoimmune disease in the subject and / or (b) Protective species against autoimmunity disease in the subject. A method of treating a subject with an autoimmune disease, comprising increasing the number of cells carrying the above gene variants.
前記保護的遺伝子バリアントを含み、かつ前記感受性遺伝子バリアントを含んでいない免疫細胞および／または造血幹細胞
を前記対象に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 Immune cells and / or hematopoietic stem cells containing the protective gene variant and / or immune cells and / or hematopoietic stem cells containing the protective gene variant and not containing the susceptibility gene variant are administered to the subject. The method according to any one of claims 1 to 5, which includes.
前記得られた免疫細胞および／または造血幹細胞を変化させて前記感受性遺伝子バリアントの量を減少させること、および／または前記保護的遺伝子バリアントの量を増加させること、および
前記変化させた免疫細胞および／または造血幹細胞を治療を必要とする前記対象に投与すること
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 Obtaining immune cells and / or hematopoietic stem cells from the first subject,
Altering the resulting immune cells and / or hematopoietic stem cells to reduce the amount of the susceptible gene variant and / or increasing the amount of the protective gene variant, and altering the altered immune cell and / The method according to any one of claims 1 to 7, further comprising administering hematopoietic stem cells to the subject in need of treatment.
（ｂ）（ｉ）自己免疫疾患を治療するための特定の薬物に対する高い感度または（ｉｉ）自己免疫疾患に対して保護的な前記対象の腸内での細菌の分布に関連する１種以上の遺伝子バリアントの量を増加させる
ために前記対象の免疫細胞および／または造血幹細胞のＤＮＡを編集することを含む、自己免疫疾患を有する対象を治療する方法。 (A) (i) One or more species associated with the distribution of bacteria in the subject's intestine associated with resistance to a particular drug to treat an autoimmune disorder or (ii) high susceptibility to an autoimmune disorder In the intestine of the subject, which reduces the amount of genetic variants and / or (b) (i) high sensitivity to specific drugs for treating autoimmunity or (ii) protection against autoimmunity. A method of treating a subject having an autoimmune disorder, comprising editing the DNA of the immune cells and / or hematopoietic stem cells of the subject to increase the amount of one or more gene variants associated with the distribution of the bacteria in the subject.
（ａ）１人以上の家族構成員の表現型、１人以上の家族構成員の遺伝子パネルのシークエンシング、１人以上の家族構成員の全エクソームシークエンシング、および／または１人以上の家族構成員の全ゲノムシークエンシング、
（ｂ）細胞シグナル伝達および／または免疫系応答のコンピューターシミュレーション、
（ｃ）線形および／または非線形回帰モデルなどによる表現型に影響を与える突然変異の機械モデル化、ニューラルネットワーク、
（ｄ）遺伝子発現および／または遺伝子シグナル伝達を記述しているデータ、および
（ｅ）動物モデル（例えばブタ）
のうちの１つ以上に基づいて決定する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。 The susceptibility gene variant and the protective gene variant
(A) Phenotype of one or more family members, sequencing of genetic panels of one or more family members, whole exome sequencing of one or more family members, and / or one or more families Whole genome sequencing of members,
(B) Computer simulation of cell signaling and / or immune system response,
(C) Mechanical modeling of mutations affecting phenotypes, such as linear and / or non-linear regression models, neural networks,
Data describing gene expression and / or gene signaling, and (e) animal models (eg, pigs).
The method according to any one of claims 1 to 22, which is determined based on one or more of the above.
（ｂ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）自己免疫疾患の非保護的遺伝子バリアントをコードする細胞のゲノムＤＮＡ内の標的配列とハイブリッド形成するガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、および（ｉｉｉ）前記標的配列の位置において自己免疫疾患の保護的遺伝子バリアントをコードするＤＮＡ修復テンプレート
を含む組成物。 A guide RNA or said guide RNA that hybridizes with a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding (a) (i) a nucleic acid encoding CRISPR / Cas nuclease, (ii) a gene variant associated with susceptibility to autoimmune disease. Of the nucleic acids encoding, and (iii) DNA repair templates encoding gene variants not associated with susceptibility to autoimmune disorders, and (b) (i) nucleic acids encoding CRISPR / Casnuclease, (ii) autoimmune disorders. A guide RNA encoding a guide RNA or a nucleic acid encoding the guide RNA that hybridizes with a target sequence in the genomic DNA of a cell encoding a non-protective gene variant, and (iii) a protective gene variant of autoimmune disease at the location of the target sequence. A composition comprising a encoding DNA repair template.
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