JP2021523115A - 炎症性疾患または障害を治療するための方法および組成物 - Google Patents

炎症性疾患または障害を治療するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本明細書では、炎症性疾患を治療する方法および組成物が記載される。本発明の局面は、対象にRSK1を阻害する剤を投与することに関する。本発明の別の局面は、STAT1リン酸化を投与することに関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2018年5月4日に出願された米国特許仮出願第62/666,787号の国際出願であって、米国特許法第119条(e)の下でこの仮出願に基づく恩典を主張するものであり、参照によりこの仮出願の全文が本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明の分野は、炎症性疾患または障害の治療に関する。
背景
マクロファージの炎症促進性活性化は、多くのヒト疾患の発病において重要な役割を果たす。マクロファージは、異種集団である。トランスクリプトミクス研究では、インターフェロン-γ（IFN-γ）およびLPSなどの刺激によりマクロファージが炎症促進性表現型のサブセットへと方向付けられることが実証されており、刺激物質条件にしたがって、たとえばM（IFN-γ）マクロファージおよびM（LPS）マクロファージなどに極性化状態が分類される。同様に、インターロイキン-4（IL-4）およびIL-13といった抗炎症性刺激は、マクロファージの表現型を、たとえばM（IL-4）およびM（IL-13）など、炎症反応を消散させるもう一方の活性化サブセットにシフトさせる（5、7〜10）。それでもなお、M（IFN-γ）およびM（LPS）マクロファージは通常、CCL2/MCP-1などの炎症促進性ケモカインを高レベルに発現して炎症部位に免疫細胞を動員し、両刺激物質が炎症促進性シグナリング事象全般の誘発因子として用いられるのを許容する。マクロファージの異種性は従来のM1/M2極性化パラダイムよりも多次元的である、というセオリーを示唆する証拠が浮上しているが、具体的な因果関係が既知であるM（IFN-γ）などの各表現型のインビトロモデルの使用は、新たな分子機構を突き止めるのに役立つ。
ヤヌスキナーゼ-シグナル伝達兼転写活性化因子（JAK-STAT）経路などの細胞内シグナリング機構は、IFN-γが引き起こす炎症促進性細胞応答を媒介する。IFN-γ刺激により、細胞質でJAK1およびJAK2によりSTAT1がTyr701においてリン酸化され（ホスホ-STAT1-Tyr701）、ホスホ-STAT1-Tyr701の核移行が促進される。そして核内でホスホ-STAT1-Tyr701がSer727においてリン酸化され（ホスホ-STAT1-Tyr701/Ser727）、STAT1標的遺伝子のトランス活性化が生じて、マクロファージ内でケモカインが産生される。こうした証拠は、核へと移行する分子がマクロファージの炎症促進性活性化を制御する、という概念を裏付けている。しかし、マクロファージの炎症促進性活性化におけるそのような潜在的制御因子の核移行の機構および役割の理解は、まだ不十分である。
概要
本明細書に記載される本発明は、IFN-γ刺激の結果、JAKシグナリングを介してRSK1がSer380においてリン酸化され、それによってRSK1がマクロファージの核内に移行する、という知見に一部基づく。マクロファージの核内で、核内RSK1はSTAT1をSer727においてリン酸化し、マクロファージを活性化させる。重要なのは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1の阻害により、IFN-γが誘発する炎症促進性ケモカインの分泌が妨害されることである。したがって、本明細書に記載される一局面は、炎症性疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に有効量のリボソームS6キナーゼ-1（RSK1）を阻害する剤を投与する工程を含む。
いずれかの局面の一態様では、RSK1の阻害は、RSK1リン酸化の阻害である。一態様では、RSK1リン酸化は、セリン380においてである。
いずれかの局面の一態様では、RSK1の阻害は、RSK1核移行の阻害である。
いずれかの局面の一態様では、RSK1の阻害は、RSK1キナーゼ活性の阻害である。いずれかの局面の一態様では、RSK1キナーゼ活性の阻害は、シグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）のリン酸化を阻害する。いずれかの局面の一態様では、STAT1のリン酸化は、セリン727においてである。
いずれかの局面の一態様では、RSK1の阻害は、炎症反応を阻害する。
いずれかの局面の一態様では、RSK1を阻害する剤は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される。いずれかの局面の一態様では、RNAiは、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである。いずれかの局面の一態様では、抗体は、ヒト化抗体である。
いずれかの局面の一態様では、小分子は、MK-1775、マニュマイシン-a、セルレニン、タネスピマイシン、サレルミド、またはトセドスタットである。
いずれかの局面の一態様では、RSK1を阻害することは、RSK1の発現レベルおよび／または活性を阻害することである。いずれかの局面の一態様では、RSK1の発現レベルおよび／または活性は、適切な対照と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される。
いずれかの局面の一態様では、RSK1の阻害は、初代マクロファージにおいてIFN-γ誘発性ケモカインを抑制する。
いずれかの局面の一態様では、IFN-γ誘発性ケモカインは、適切な対照と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上抑制される。
本明細書に記載される別の局面は、炎症性疾患または障害を治療する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に有効量のシグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む。
いずれかの局面の一態様では、STAT1リン酸化は、セリン727においてである。
いずれかの局面の一態様では、STAT1リン酸化の阻害は、炎症反応を阻害する。
いずれかの局面の一態様では、STAT1リン酸化を阻害する剤は、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される。いずれかの局面の一態様では、RNAiは、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである。いずれかの局面の一態様では、抗体は、ヒト化抗体である。
いずれかの局面の一態様では、リン酸化は、適切な対照と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される。
いずれかの局面の一態様では、方法は、投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む。
いずれかの局面の一態様では、方法は、投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む。
いずれかの局面の一態様では、方法は、炎症性疾患または障害のための少なくとも第2の治療を施す工程をさらに含む。
いずれかの局面の一態様では、対象は、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがない。いずれかの局面の一態様では、対象は、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがある。
いずれかの局面の一態様では、炎症性疾患または障害は、限定ではないが、マクロファージ活性化症候群、潰瘍性大腸炎、II型糖尿病、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、高安病、大動脈弁狭窄症、コフィン・ローリー症候群、肺高血圧、ゴーシェ病、全身性エリテマトーデス、バージャー病、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢動脈疾患、静脈グラフト病、ステント内再狭窄、動静脈瘻疾患、動脈石灰化、石灰化大動脈弁疾患、クローン病、血管炎症候群、強皮症、リウマチ性心疾患、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、急性腎損傷、卒中、神経炎症、および脂肪肝からなる群より選択される。
本明細書に提供される別の局面は、マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のRSK1を阻害する剤を投与する工程を含む。
本明細書に提供される別の局面は、マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む。
本明細書に提供される別の局面は、RSK1を阻害する剤を含む組成物である。
本明細書に提供される別の局面は、STAT1リン酸化を阻害する剤を含む組成物である。
いずれかの局面の一態様では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
定義
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の請求項に用いるいくつかの用語および語句の意味を以下に記す。特に断らないかぎり、または文脈から暗に意味されないかぎり、以下の用語および語句は、以下に記す意味を含む。これらの定義は、特定の態様の記述を助けるために提供され、また、特許請求の技術の範囲を限定するのは請求項のみであるため、当該技術を限定するものではない。別途定義しないかぎり、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、この技術が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味をもつ。当技術分野における用語の使用と、本明細書に提供されるその定義とに明白な違いがある場合、本明細書に提供される定義が優先される。
本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「寛解」という用語は、炎症性疾患または障害と関連した状態の進行または重度を逆転させる、緩和する、寛解させる、阻害する、緩慢化させる、または止めることを目的とする、治療処置を指す。「治療すること」という用語は、炎症性疾患または障害（たとえば、皮疹、疲労、関節痛等）の少なくとも1つの有害作用または症状の低減または緩和を含む。治療は一般に、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減すると、「有効」である。あるいは、治療は、疾患の進行が低減または停止すると、「有効」である。つまり、「治療」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、治療をしなかった場合に考えられるものと比べての症状の進行または悪化の停止または少なくとも緩慢化も含む。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定ではないが、検出の可否にかかわらず、1つもしくは複数の症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患進行の遅延もしくは緩慢化、疾患状態の寛解もしくは軽減、（部分的・全体的にかかわらず）緩解、および／または死亡率低下が挙げられる。疾患の「治療」という用語はまた、疾患の症状または副作用を和らげること（緩和治療を含む）を含む。
本明細書で使用する場合、「予防すること」または「予防」は、その方法（たとえば、本明細書に記載されるRSK1もしくはSTAT1リン酸化を阻害する剤または組成物の投与）の作用のおかげで、疾患状態または障害（たとえば、炎症性疾患または障害）が生じない、あらゆる方法を指す。一局面では、予防は、無処置の対照で生じるほどは疾患が確立されないことも意味し得ることが理解される。たとえば、疾患頻度の確立は、無処置の対照に対し相対的に5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、または100%低減し得る。したがって、疾患の予防は、対象が疾患を発症する確率が、無処置の対象（たとえば本明細書に記載される組成物で治療されない対象）に対し相対的に低下することを包含する。
本明細書で使用する場合、「投与すること」という用語は、対象の体内に、本明細書に開示される治療組成物（たとえば、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤）または薬学的組成物を、該対象への該剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法またはルートによって、配置すること指す。本明細書に開示される剤を含む薬学的組成物は、対象において有効治療をもたらす任意の適切なルートにより投与することができる。
本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜、または猟獣などの脊椎動物である。霊長類としては、たとえば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、たとえばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類としては、たとえば、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。家畜および猟獣としては、たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、たとえばイエネコ、イヌ種、たとえばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、たとえばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、たとえばマス、ナマズ、およびサケが挙げられる。いくつかの態様では、対象は哺乳類、たとえば霊長類、たとえばヒトである。「個人」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。
好ましくは、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類が、疾患たとえば炎症性疾患または障害の動物モデルを代表する対象として、有利に用いられ得る。対象は男性でも女性でもよい。対象は子ども（たとえば18歳未満）でもよいし、成人（たとえば18歳以上）でもよい。
対象は、治療を必要とする疾患もしくは障害（たとえば、炎症性疾患または障害）、またはそのような疾患もしくは障害に関連する1つもしくは複数の合併症（たとえば、心筋梗塞、静脈グラフト不全）に罹患しているかそれを有すると、過去に診断または特定されたことがある、そして任意で、該疾患もしくは障害または該疾患もしくは障害に関連する1つもしくは複数の合併症の治療（たとえば、スタチン療法）を既に受けている、対象であり得る。あるいは、対象は、そのような疾患もしくは障害（たとえば、炎症性疾患または障害）または関連の合併症（たとえば、心筋梗塞、静脈グラフト不全）を有すると過去に診断されたことがない対象であってもよい。たとえば、対象は、該疾患もしくは障害または該疾患もしくは障害関連の1つもしくは複数の合併症の1つまたは複数のリスク要因を示している対象であってもよいし、リスク要因を示していない対象であってもよい。炎症性疾患または障害のリスク要因としては、限定ではないが、加齢、肥満、脂質異常、高血圧、糖尿病、慢性腎疾患、高飽和脂肪の食事、性ホルモン（たとえば、テストステロンまたはエストロゲン）減退、喫煙、および睡眠障害（たとえば、睡眠時無呼吸およびナルコレプシー）を有すること、が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「剤」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を阻害する、あるいは該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する、その刺激を部分的もしくは完全にブロックする、その活性化を減少させ、妨げ、遅らせ、不活化し、脱感作する、またはその活性を下向き調節する、たとえば分子、タンパク質、ペプチド、抗体、または核酸を指す。RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、たとえば、ポリペプチドの発現、たとえば翻訳、翻訳後プロセシング、安定性、分解、または核内もしくは細胞質内局在化を、またはポリヌクレオチドの転写、転写後プロセシング、安定性、もしくは分解を阻害し、あるいはポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合し、刺激、DNA結合、転写因子活性もしくは酵素活性を部分的もしくは完全にブロックし、活性化を減少させ、妨げ、遅らせ、不活化し、脱感作し、または活性を下向き調節する。剤は、直接または間接的に作用し得る。
「剤」という用語は、本明細書で使用する場合、限定ではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物または物質を意味する。「剤」は、あらゆる化学的要素または部分であってもよく、限定ではないが、合成および天然のタンパク質性および非タンパク質性の要素も含まれる。いくつかの態様では、剤は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または糖質であり、限定ではないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAzyme、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマー、ならびにそれらの修飾および組み合わせ等が挙げられる。特定の態様では、剤は、化学部分を有する小分子である。たとえば、化学部分には、マクロライド、レプトマイシン、および関連の天然産物、またはそれらのアナログなどの、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロ環部分が含まれた。化合物は、所望の活性および／または特性を有することが既知であってもよいし、多様な化合物のライブラリーから選択してもよい。
剤は、1つまたは複数の化学分類の分子、たとえば有機分子の場合があり、有機金属分子、無機分子、遺伝子配列等を含むことがある。剤はまた、1つもしくは複数のタンパク質の融合タンパク質、キメラタンパク質（たとえば、関連のまたは異なる分子の機能的に意味のある領域のドメイン交換または相同組換え）、合成タンパク質、または置換、欠失、挿入、および他のバリアントを含む他のタンパク質バリエーションであり得る。
本明細書で使用する場合、「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約1万グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物（たとえば、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、約5,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約1,000グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、約500グラム／モル未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を、限定ではなく含み得る、化学剤を指す。
「RNAi」という用語は、本明細書で使用する場合、干渉RNAまたはRNA干渉を指す。RNAiは、mRNAに結合してそのプロセシングを阻害する、たとえばmRNAの翻訳を阻害するかmRNAの分解をもたらす分子による、特定のmRNAの破壊による、選択的転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。本明細書で使用する場合、「RNAi」という用語は、限定ではないが、siRNA、shRNA、内因性マイクロRNA、および人工的マイクロRNAなどの、任意のタイプの干渉RNAを指す。たとえば、この用語は、RNAの下流プロセシングの機構に関係なく、過去にsiRNAと同定された配列を含む（すなわち、siRNAは、mRNAの切断をもたらす特定のインビボプロセシングの方法をもつと考えられるが、そのような配列を本明細書に記載される隣接配列の文脈でベクターに組み込むことができる）。
本明細書に記載される方法および組成物は、RSK1のレベルおよび／または活性が阻害されることを必要とする。本明細書で使用する場合、「リボソームタンパク質S6 A1（RSK1）」は、HU-1、RSK、p90RSK、およびMAPKAPK1Aとしても知られ、細胞増殖および分化の制御に関わるとされているキナーゼを指す。RSK1キナーゼの基質としては、MAPKシグナリング経路のメンバーが挙げられる。たとえばヒトRSK1（NCBI遺伝子ID:6195）ポリペプチド（たとえば、NCBI Ref Seq NP_001006666.1）およびmRNA（たとえば、NCBI Ref Seq NM_001006665.1）など、いくつかの種のRSK1配列が知られている。RSK1はヒトRSK1を指す場合があり、その天然のバリアント、分子、およびアレルも含まれる。RSK1は、たとえばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳類のRSK1を指す。核配列（nucleic sequence）SEQ ID NO:1が、RSK1をコードする核配列を含む。
本明細書に記載される方法および組成物は、リン酸化STAT1のレベルおよび／または活性が阻害されることを必要とする。本明細書で使用する場合、「シグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）)」は、CANDF7;IMD31A;IMD31B;IMD31C;ISGF-3;およびSTAT91としても知られ、リン酸化に応答してホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成して細胞核に移行し、そこで転写アクチベーターとして作用する、タンパク質を指す。たとえばヒトSTAT1（NCBI遺伝子ID:6772）ポリペプチド（たとえば、NCBI Ref Seq NP_009330.1）およびmRNA（たとえば、NCBI Ref Seq NM_007315.3）など、いくつかの種のSTAT1配列が知られている。STAT1はヒトSTAT1を指す場合があり、その天然のバリアント、分子、およびアレルも含まれる。STAT1は、たとえばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の哺乳類のSTAT1を指す。核配列SEQ ID NO:3が、STAT1をコードする核配列を含む。
「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書では、統計学的に有意な量だけの減少を意味するのに用いられる。いくつかの態様では、「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」は、典型的には、適切な対照（たとえば所与の治療の不存在）と比べて少なくとも10%の減少を意味し、たとえば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書で使用する場合、「低下」または「阻害」は、リファレンスレベルと比べて完全な阻害または低下は包含しない。「完全な阻害」は、適切な対照と比べて100%の阻害である。
「増加する」、「増大する」、または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では、再現可能な統計学的に有意な量だけの増加を意味するのに用いられる。いくつかの態様では、「増加する」、「増大する」、または「活性化する」という用語は、リファレンスレベルと比べて少なくとも10%の増加、たとえば少なくとも約20%、少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加、もしくは最大で100%の増加、またはリファレンスレベルと比べて10〜100%の任意の増加、あるいは適切な対照と比べて少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、20倍の増加、30倍の増加、40倍の増加、50倍の増加、6倍の増加、75倍の増加、100倍等の増加、または2倍〜10倍もしくはそれ以上の任意の増加を意味し得る。マーカーの文脈では、「増加」は、そのようなレベルの再現可能な統計学的に有意な増加である。
本明細書で使用する場合、「リファレンスレベル」は、正常な、別途影響を受けていない細胞集団または組織を指す（たとえば、健常な対象から採取した生物学的試料、または前の時点で対象から採取した生物学的試料、たとえば炎症性疾患または障害と診断される前に患者から採取した生物学的試料、または本明細書に開示される剤もしくはその組成物と接触したことのない生物学的試料）。
本明細書で使用する場合、「適切な対照」は、無処置であること以外は同一の細胞または集団を指す（たとえば、非対照細胞と比べて、本明細書に開示される剤もしくはその組成物を投与されていない、または本明細書に記載される剤の一部しか投与されていない患者）。
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的有意差を指し、一般に2標準偏差（2SD）以上の差を意味する。
本明細書で使用する場合、「を含む（comprising）」または「を含む（comprises）」という用語は、組成物、方法、および方法または組成物にとって必須である各構成要素に関して用いられるが、必須であってもなくても記述されていない要素の包含を排除しない。
単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という用語は、文脈に明示されないかぎり、複数形も含む。同様に、「または」という単語は、文脈に明示されないかぎり、「および」も含むものとする。本開示の実施または試験では、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定例を示すのに用いられる。したがって、略語「たとえば（e.g.）」は、「たとえば（for example）」という用語と同義である。
図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1A）タンデム質量タグ（TMT）およびLC-MS/MSを用いて核移行酵素を特定するプロテオミクスのワークフロー。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1B）3つの公開データベースの核タンパク質の集積率。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1C）Uniprot.orgのタンパク質区画局在化のより詳しい分布。「他の局在化」は、細胞内局在化のこのアノテーションが、核または核オルガネラを含まないことを示す。「核シャトリング」は、細胞内局在化のこのアノテーションが、核または核オルガネラ、および他の細胞内オルガネラを含むことを示す。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1D）全核プロテオミクスデータの平均トレースと比べた、IFN-γ刺激時間の間のSTAT1およびRSK1タンパク質のリファレンス正規化トレース。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1E）ヒトPBMC由来マクロファージの細胞ライセートを、抗RSK1、抗RSK2、抗RSK3、抗RSK4、および抗チューブリンを用いた免疫ブロット分析に供した。組換えRSK1、RSK2、RSK3、およびRSK4タンパク質を免疫ブロッティングの陽性対照として用いた。組換えタンパク質の等量をクーマシーブルー染色により確認した。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1Fおよび図1G）ヒトPBMC由来マクロファージをIFN-γで30分刺激した。細胞を固定し、抗RSK1で染色した。核を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1Fおよび図1G）ヒトPBMC由来マクロファージをIFN-γで30分刺激した。細胞を固定し、抗RSK1で染色した。核を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色した。 図1A〜1Hは、ヒト初代マクロファージにおける、IFN-γに応答してのRSK1の核移行の特定を示す。（図1H）ヒトPBMC由来マクロファージをIFN-γで刺激した。核ライセートを、抗RSK1、抗STAT1、または抗ラミンA/C、抗チューブリンを用いた免疫ブロッティングに供した。全細胞ライセート（WCL）を、抗チューブリンを用いたブロッティングの対照として用いた。 図2は、ネットワーク解析がRSK1を炎症性疾患と結び付けることを示す。インタラクトームにおいてRSK1、RSK2、RSK3、およびRSK4の各第1隣接モジュールに有意に近い共有疾患（経験的p値<0.05）を示す概略図。同数の無作為選択遺伝子から疾患遺伝子までの平均最短距離を実現値N=250で計算して、平均最短距離値を確率期待値と比較した。経験的p値は、第1隣接ネットワークの100次数保持無作為化に基づき計算した。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3A）PBMC由来マクロファージを、DMSOまたは10 μMの汎JAK阻害剤ピリドン-6で2時間前処理してから、血清飢餓下、IFN-γで表示の時間刺激した。細胞ライセートを通常のIgGまたは抗RSK1を用いた免疫沈降に供し、次いで表示の抗体を用いた免疫ブロット分析を行った。WCL、全細胞ライセート。N=ドナー3名。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3B）対照siRNAまたはRSK1 siRNAをトランスフェクトしてから、血清飢餓下、IFN-γで表示の時間刺激した、マクロファージの細胞ライセートの免疫ブロット。N=ドナー2名。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3C）DMSOまたはBI-D1870で2時間前処理してから、血清飢餓下、無刺激で放置した、またはIFN-γで1時間刺激した、マクロファージの細胞ライセートの免疫ブロット。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3D）パネルのSTAT1-pSer727（図3C）プラス追加の3名のドナーの濃度測定に基づく定量化（ImageJ Software）。DMSOで前処理してから刺激した細胞のリン酸化レベルを1.0とした。データは平均±SE。N=ドナー6名。**P<0.01は、ダネットの比較検定による、対照（DMSOおよびIFN-γでの処理）と比べたリン酸化レベルの有意差を示す。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3E）マクロファージを、DMSOまたはBI-d1870で2時間処理してから、血清飢餓下、IFN-γで刺激した。細胞ライセートを、通常のIgGまたは抗STAT1-pSer727を用いた免疫沈降に供してから、SYPRO ruby染色または表示の抗体を用いた免疫ブロット分析を行った。並列反応モニタリング（PRM）質量分析のために、ゲル中の免疫沈降物（赤い四角）をゲル内消化させた。 図3A〜3Fは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAKシグナリングを通して活性化されること、そしてその阻害がSTAT1のSer727リン酸化を抑制することを示す。（図3F）パネルの消化産物から生成したSer727リン酸化（および酸化メチオニン、m）を有する表示のSTAT1ペプチドのPRMイオン（MS/MSイオン）の定量化（図3F）。 図4A〜Dは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性ケモカインを抑制することを示す。（図4Aおよび図4B）ヒトPBMC由来マクロファージを、対照siRNAまたはRSK1 siRNAで処理してから、IFN-γで表示の時間処理した。全RNA試料を、表示のプローブおよびプライマーを用いたリアルタイムPCR分析に供した。正規化にはGAPDHを用いた。（図4A）ドナー1名の代表的な結果。データは平均±SD。（図4B）パネルのリアルタイムPCRデータの曲線下面積（AUC）プロットの定量化（図4A）。データは平均±SE。N=ドナー3名。*P<0.05および**P<0.01は、対応のあるスチューデント検定によるmRNAレベルのAUCの有意差を示す。 図4A〜Dは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性ケモカインを抑制することを示す。（図4Aおよび図4B）ヒトPBMC由来マクロファージを、対照siRNAまたはRSK1 siRNAで処理してから、IFN-γで表示の時間処理した。全RNA試料を、表示のプローブおよびプライマーを用いたリアルタイムPCR分析に供した。正規化にはGAPDHを用いた。（図4A）ドナー1名の代表的な結果。データは平均±SD。（図4B）パネルのリアルタイムPCRデータの曲線下面積（AUC）プロットの定量化（図4A）。データは平均±SE。N=ドナー3名。*P<0.05および**P<0.01は、対応のあるスチューデント検定によるmRNAレベルのAUCの有意差を示す。 図4A〜Dは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性ケモカインを抑制することを示す。（図4C）マクロファージを、DMSOまたはBI-D1870（1または10 μM）で2時間処理してから、IFN-γで8時間刺激した。全RNA試料を、表示のプローブおよびプライマーを用いたリアルタイムPCR分析に供した。正規化にはGAPDHを用いた。データは平均±SE。N=ドナー3〜4名。*P<0.05および**P<0.01は、ダネットの比較検定による、対照（DMSOおよびIFN-γでの処理）と比べたmRNAレベルの有意差を示す。 図4A〜Dは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性ケモカインを抑制することを示す。（図4D）マクロファージに対照siRNAおよびRSK1 siRNAをトランスフェクトしてから、IFN-γで24時間処理した。分泌されたケモカインレベルをELISAにより測定した。データは平均±SE。N=ドナー3名。*P<0.05および**P<0.01は、対応のあるスチューデント検定による、ケモカイン分泌の有意差を示す。 図5A〜5Dは、腹膜炎モデルにおいて、RSK活性がマクロファージの炎症促進性活性化に主要な役割を果たすことを示す。（図5A）モデル概要−マウスにビヒクルまたは30 mg/kg BI-D1870を腹腔内注射した。注射から24時間後、マウスにビヒクルまたは30 mg/kg BI-D1870に加えて4% チオグリコラートを腹腔内注射した。1回目の注射から48時間後、腹腔内細胞を回収した。 図5A〜5Dは、腹膜炎モデルにおいて、RSK活性がマクロファージの炎症促進性活性化に主要な役割を果たすことを示す。（図5B）フローサイトメトリーの代表的な結果。腹腔内細胞をAPC-Cy7-抗CD45、FITC-抗F4/80、APC-抗CD11b、およびPE-Cy7-抗CD86とともにインキュベートしてから、フローサイトメトリー分析を行った。 図5A〜5Dは、腹膜炎モデルにおいて、RSK活性がマクロファージの炎症促進性活性化に主要な役割を果たすことを示す。（図5C）腹腔内マクロファージにおけるCD86陽性細胞の比率。データは平均±SE。N=10マウス。*P<0.05は、対応のないスチューデントの検定による、対照（ビヒクル）と比べた有意差を示す。 図5A〜5Dは、腹膜炎モデルにおいて、RSK活性がマクロファージの炎症促進性活性化に主要な役割を果たすことを示す。（図5D）腹腔内CD86陽性マクロファージの細胞数。データは平均±SE。N=10マウス。*P<0.05は、対応のないスチューデントの検定による有意差を示す。 図6A〜6Cは、ホスホプロテオミクスにより特定したヒトPBMC由来マクロファージにおけるRSK基質を示す。（図6A）ホスホプロテオミクスの概略図。ヒトPBMC由来マクロファージを、DMSOまたはBI-D1870で2時間処理してから、IFN-γで刺激し、続いてタンパク質分解および抗RXXpS/T抗体ストラテジーによるホスホペプチドの集積を行った。 図6A〜6Cは、ホスホプロテオミクスにより特定したヒトPBMC由来マクロファージにおけるRSK基質を示す。（図6B）細胞ライセートを、抗RPS6-pSer235/236、抗RPS6、抗PRAS40-pThr246、抗PRAS40、または抗チューブリンを用いた免疫ブロット分析に供した。N=ドナー2名。 図6A〜6Cは、ホスホプロテオミクスにより特定したヒトPBMC由来マクロファージにおけるRSK基質を示す。（図6C）インタラクトームにおいてRSK基質モジュールに有意に近い共有疾患（経験的p値<0.05）を示す概略図。同数の無作為選択遺伝子から疾患遺伝子までの平均最短距離を実現値N=250で計算して、平均最短距離値を確率期待値と比較した。経験的p値は、第1隣接ネットワークの100次数保持無作為化に基づき計算した。 図7A〜7Bは、核移行タンパク質のスクリーニングを示す。（図7A）高次クラスター解析により、データセットの早期増加パターンおよび後期増加パターンを明らかにした。本発明者らは、11のクラスター（赤色のトレース）を早期増加パターンとして、9のクラスター（青色のトレース）を後期増加パターンとして選択した。 図7A〜7Bは、核移行タンパク質のスクリーニングを示す。（図7B）核移行酵素のスクリーニングのフローチャート。本発明者らは、核へ移行してマクロファージを炎症促進性活性化させる酵素候補として、RPS6KA1（RSK1）を選択した。 図8は、RSK酵素ファミリーを示す。このRSK酵素ファミリーの概略図は、たとえば、Y. Romeo, X. Zhang, P. P. Roux, Regulation and function of the RSK family of protein kinases. Biochem J 441, 553-569 (2012)に基づく。 図9は、RSKアイソフォームと疾患モジュールとのネットワーク近接性のヒートマップを示す。RSK1、RSK2、RSK3、およびRSK4の各第1隣接モジュールの、心血管、自己免疫、代謝性、および悪性疾患を含む44のヒト障害に対するネットワーク近接性の有意差のヒートマップ。同数の無作為選択遺伝子から疾患遺伝子までの平均最短距離を実現値N=250で計算して、平均最短距離値を確率期待値と比較した。経験的p値は、第1隣接ネットワークの100次数保持無作為化に基づき計算した。 図10Aおよび10Bは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAK1/2シグナリングにより活性化されることを示す。（図10A）ヒトPBMC由来マクロファージを、血清飢餓下、IFN-γで表示の時間刺激した。細胞ライセートを通常のIgGまたは抗RSK1を用いた免疫沈降に供してから、抗pSer380-RSK1、抗pSer221-RSK1、抗pSer732-RSK1、抗pThr573-RSK1、抗pThr359-RSK1、または抗RSK1を用いた免疫ブロット分析を行った。細胞ライセートを、抗pSer727-STAT1、抗STAT1、抗RSK1、または抗チューブリンを用いた免疫ブロット分析に供した。 図10Aおよび10Bは、ヒト初代マクロファージにおいて、RSK1がIFN-γに応答してJAK1/2シグナリングにより活性化されることを示す。（図10B）ヒトPBMC由来マクロファージを、血清飢餓下、IFN-γで表示の時間刺激した。細胞を固定し、抗RSK1で染色した。核を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールで染色した。N=ドナー2名。 図11は、RSK1が媒介するSTAT1のSer727におけるリン酸化を示す。pSer727含有ペプチドのアノテーション付きスペクトル。スペクトルは、活性化法としてEThCDを用いた並列反応モニタリング、PRMを用いて取得した。 図11Aの説明を参照のこと。 図12は、ヒト初代マクロファージにおいてRSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性転写に及ぼす効果を示す。ヒトPBMC由来マクロファージを対照siRNAまたはRSK1 siRNAで処理してから、IFN-γで表示の時間処理した。全RNA試料を、表示のプローブおよびプライマーを用いたリアルタイムPCR分析に供した。正規化にはGAPDHを用いた。データは各ドナーの三連実験の平均±SDである。 図12-1の説明を参照のこと。 図13は、ヒトマクロファージにおいてRSK阻害がIFN-γ誘発性ケモカイン産生に及ぼす効果を示す。ヒトPBMC由来マクロファージを、DMSOまたはBI-D1870（1または10 μM）で2時間処理してから、IFN-γで8時間刺激した。全RNA試料を、表示のプローブおよびプライマーを用いたリアルタイムPCR分析に供した。正規化にはGAPDHを用いた。データは各ドナーの三連実験の平均±SDである。 図14は、ヒトマクロファージにおいてRSK1のサイレンシングがケモカインのIFN-γ誘発性産生に及ぼす効果を示す。ヒトPBMC由来マクロファージを対照siRNAまたはRSK1 siRNAで処理してから、IFN-γで24時間処理した。培養培地を回収してから、CCL2/MCP-1、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、またはCXCL11/I-TACについてELISAに供した。データは1名のドナーの三連の平均±SDである。NDは「不検出」を表す。N=ドナー3名。 図15A〜15Cは、ヒトIFN-γ刺激マクロファージのRXXpS/Tパターンを示す。（図15A）ヒトPBBMC由来マクロファージをDMSOまたは10 μM BI-D1870で2時間処理してから、IFN-γで1時間刺激した。細胞ライセートを、抗RXXpS/T抗体を用いた免疫ブロット分析に供した。 図15A〜15Cは、ヒトIFN-γ刺激マクロファージのRXXpS/Tパターンを示す。（図15B）各試料の検出ホスホペプチド数を示す四長円のベン図。 図15A〜15Cは、ヒトIFN-γ刺激マクロファージのRXXpS/Tパターンを示す。（図15C）ヒトマクロファージにおけるRSK基質のスクリーニングのフローチャート。本発明者らは、RPS6およびAKT1S1/PRAS40を含む24候補をRSK基質として特定した。 図16は、RSK基質と疾患モジュールとのネットワーク近接性のヒートマップを示す。RSK基質モジュールの、心血管、自己免疫、代謝性、および悪性疾患を含む44のヒト障害に対するネットワーク近接性の有意差のヒートマップ。同数の無作為選択遺伝子から疾患遺伝子までの平均最短距離を実現値N=250で計算して、平均最短距離値を確率期待値と比較した。経験的p値は、第1隣接ネットワークの100次数保持無作為化に基づき計算した。 図17は、RSK1が媒介するマクロファージ活性化のモデルを示す。IFN-γ刺激マクロファージにおいて、RSK1は、JAK1/2シグナリングによりSer380リン酸化を通して活性化し、核移行する。他方でJAK1/2はSTAT1をTyr701においてリン酸化するが、これは核移行にとって必須である。STAT1の核移行後、RSK1は核内でSTAT1をSer727においてリン酸化し、ケモカイン産生を促進する。 図18は、MK-1775が、単球／マクロファージ様癌細胞株U937においてRSK1遺伝子転写を減少させると予測されるトップの攪乱因子（小分子）であることを示す。本図のデータは、ワールド・ワイド・ウェブ上のhttps://amp.pharm.mssm.edu/L1000CDS2/#/indexのウェブ・アプリから出力しており、これは1万以上の攪乱因子に応答する遺伝子発現データを提供する。RSK1は、これらの攪乱因子に対する応答性を直接観察される1000（つまりL1000）遺伝子として含まれる。本発明者らはこのデータベースに照会して、RSK1遺伝子発現を特異的に阻害するが、>1万2000の遺伝子プロファイルにはほとんど影響しないと思われる攪乱因子を見つけた（遺伝子プロファイルは、直接測定が1000、類推が約1万1000であった）。 図19は、ヒトPBMC-MφがMK-1775に6時間曝露されたことを示す。 図20は、さまざまな条件下のMK-1775のRSK1発現効果を示す。MK-1775は、U937特異的効果を有し得る。 図21は、New L1000分析ストラテジーを示す。 図22は、候補化合物のRSK1特異性を増加させる工程を示す。本発明者らはワークフローを開発して、RSK1に対しては特異的であるが、その他の3つの遺伝子ファミリーメンバー、RSK2、3、および4には効果のない化合物を見つけた。 図23は、候補化合物のRSK1特異性を増加させる工程を示す。本発明者らはワークフローを開発して、RSK1に対しては特異的であるが、その他の3つの遺伝子ファミリーメンバー、RSK2、3、および4には効果のない化合物を見つけた。 図24は、「分析物中心」コンピューターアプローチを示す。このアプローチは、所与の「分析物」（すなわち、RSK1を一例とする、所与のタンパク質のリン酸化部位）に注目し、その分析物のリン酸化に大きな変化をもたらす「攪乱因子」（すなわち小分子）を決定する。各分析物について、全1,713の攪乱因子（それぞれ、6つの細胞株、90の小分子（すなわち薬物）、および3つのレプリケートからなる）を抽出して、そのリン酸化部位に有意な変化をもたらす薬物を特定した。 図25は、RSK1（S230p）リン酸化部位についての「zスコアコンセンサス」の結果を示す。縦軸上にあるのは攪乱因子（薬物）である。各サブ図は、異なる細胞株であり、所与の薬物の各レプリケートがドットとして示されている。左側のグレーの線（-2のzスコアを表す）の左にあるドットは、RSK1（S230p）を有意に下向き調節する薬物を表し、右側のグレーの線（2のzスコアを表す）の右にあるドットは、RSK1（S230p）を有意に上向き調節する薬物を表す。所与の薬物のこれらのドットが、|z|=2の印のどちらかの側に2つ以上あれば、RSK1のS230残基リン酸化の有意なモジュレーターとしてカウントされる。 図25-1の説明を参照のこと。 図26は、各細胞株について、P100データセットから導き出されたリン酸化部位-薬物ネットワークを示す。RSK1-S230pがそのネットワークの大きな連結コンポーネントの一部である場合、緑色の丸で印をしている。RSK1-230pから発生するリンクを調べて、その部位のリン酸化を有意に調節する薬物を決定することができる。たとえばMCF7細胞株では、RSK1-S230pはスタウロスポリンによって調節される。略語-A375:ヒト皮膚悪性メラノーマ;A549:非小細胞肺癌;MCF7:乳腺癌;NPC:神経前駆細胞;PC3:前立腺癌;YAPC:膵臓癌。 図27は、各細胞株について、P100データセットから導き出されたリン酸化部位-薬物ネットワークを示す。RSK1-S230pがそのネットワークの大きな連結コンポーネントの一部である場合、緑色の丸で印をしている。RSK1-230pから発生するリンクを調べて、その部位のリン酸化を有意に調節する薬物を決定することができる。たとえばPC3細胞株では、RSK1-S230pはUNC-1215化合物によって調節され、YAPC細胞株では、RSK1-S230pはオカダ酸、ボリノスタット、および化合物CHIR-99021によって調節される。略語-A375:ヒト皮膚悪性メラノーマ;A549:非小細胞肺癌;MCF7:乳腺癌;NPC:神経前駆細胞;PC3:前立腺癌;YAPC:膵臓癌。
発明の詳細な説明
マクロファージの炎症促進性活性化は、さまざまな炎症性障害を促進する。マクロファージ活性化の根底にある分子機構は、特に核移行の文脈では、まだ明らかになっていない。本明細書に提供されるデータは、インターフェロンγ（IFN-γ）が誘発するヒト初代マクロファージの核へのタンパク質移行を、定量的プロテオミクスを用いて観察して、炎症促進性マクロファージ活性化の新規な主要制御因子を探る、システムアプローチを示している。この不偏的バイオインフォマティクスは、リボソームタンパク質キナーゼであるRSK1を含めて、いくつかの候補を特定した。ネットワーク解析により、RSK1が、さまざまな炎症性障害のヒト遺伝子モジュールに結び付けられた。
本明細書に提供される研究は、IFN-γ刺激が、JAKシグナリングを介してRSK1のSer380におけるリン酸化を促進し、その結果としてマクロファージの核内でSTAT1がSer727においてリン酸化されることを示す。RSK1のサイレンシングは、ヒト初代マクロファージにおいて、IFN-γが誘発する炎症促進性ケモカインの分泌を妨害する。さらに、腹膜炎のマウスモデルでは、化合物が媒介するRSKアイソフォームの阻害により、マクロファージの動員および活性化が抑制された。これらのデータは、RSK1がマクロファージの炎症促進性活性化を媒介する主要な核シャトリング酵素である証拠を提供している。
炎症性疾患または障害の治療または予防
本発明の一局面は、それを必要とする対象にRSK1を阻害する剤を投与することにより、炎症性疾患または障害を治療する方法である。一態様では、RSK1はマクロファージ内で阻害される。
本発明の別の局面は、それを必要とする対象にSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与することにより、炎症性疾患または障害を治療する方法である。
RSK1およびSTAT1リン酸化は、直接または間接的に阻害され得る。RSK1およびSTAT1リン酸化を標的とする剤を、本明細書において以下に特定する。
一態様では、RSK1の阻害はRSK1リン酸化の阻害である。たとえば、阻害は、RSK1のセリン380のリン酸化を防止する。剤がRSK1のリン酸化の阻害に有効かどうかを判定する方法は、当技術分野で公知であり、リン酸化型のRSK1タンパク質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施することができる。さらに、SDS-PAGEゲル上でRSK1のバンドが上方にシフトしたかどうかを査定することもできる。SDS-PAGEゲル上のタンパク質バンドの（たとえば上方または下方への）移動性のシフトが、たとえばリン酸化型のタンパク質を示すことは、当技術分野では公知である。さらに、質量分析を用いて、剤がRSK1のセリン380のリン酸化を阻害したかどうかを判定することができる。一態様では、RSK1リン酸化のレベルは、RSK1を阻害する剤の投与後、無処置対照集団のリン酸化レベルと比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。
一態様では、RSK1の阻害は、細胞質ゾルから核内へのRSK1の核内翻訳の阻害である。RSK1はリン酸化すると核内へ移行し、そこでその基質に作用する（たとえばその基質をリン酸化する）ことができる。当業者であれば、顕微鏡を用いて、たとえばDAPI染色により核を、およびたとえば抗RSK1抗体またはRSK1の生体レポーターによりRSK1を、たとえばRSK1の蛍光融合を、両方観測して、剤がRSK1の核移行を防止したかどうかを判定することができる。一態様では、核内RSK1を有する細胞のパーセンテージは、RSK1を阻害する剤の投与後、無処置対照集団の核内RSK1を有する細胞のパーセンテージと比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。
一態様では、RSK1の阻害は、RSK1キナーゼ活性の阻害である。RSK1キナーゼ活性は、RSK1の既知の基質、たとえばSTAT1がリン酸化されるかどうかを判定することにより、査定することができる。STAT1がリン酸化されるかどうかを判定する方法は、当技術分野で公知であり、リン酸化型のSTAT1タンパク質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施することができる。リン酸化を査定する他の方法は本明細書で上述している。さらに、キナーゼ活性アッセイが当技術分野で公知であり、たとえばBrabek, J. and Hanks, SK, Methods Mol Biol, 2004にさらに記載されており、参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。一態様では、RSK1キナーゼ活性のレベルは、RSK1を阻害する剤の投与後、無処置対照集団のRSK1キナーゼ活性のレベルと比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。
一態様では、RSK1の阻害は、RSK1の発現レベルおよび／または活性の阻害である。RSK1キナーゼ活性は、RSK1の既知の基質、たとえばSTAT1がリン酸化されるかどうかを判定することにより、査定することができる。RSK1 mRNAまたはタンパク質発現のレベルを判定する方法としては、たとえばPCRベースのアッセイおよびウエスタンブロッティングがそれぞれ挙げられる。RSK1活性を判定するアッセイとしては、本明細書で上述したようなキナーゼ活性アッセイ、および本明細書で上述したようにRSK1基質がリン酸化されるかどうかを査定すること、が挙げられる。一態様では、RSK1のレベルおよび／または活性は、RSK1を阻害する剤の投与後、無処置対照集団のRSK1のレベルおよび／または活性と比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。
一態様では、RSK1の阻害は、STAT1リン酸化の阻害である。一態様では、STAT1のリン酸化は、セリン727においてである。一態様では、STAT1リン酸化のレベルは、RSK1を阻害する剤の投与後、無処置対照集団のSTAT1リン酸化のレベルと比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。
さまざまな態様では、RSK1および／またはSTAT1リン酸化の阻害は、炎症反応を阻害する。さまざまな態様では、RSK1および／またはSTAT1リン酸化の阻害は、初代マクロファージにおいてIFN-γ誘発性炎症促進性ケモカインを抑制する。当業者であれば、炎症反応が生じたかどうか、または阻害されたかどうかを、たとえば炎症促進性サイトカインおよび／またはケモカインを標準的な検出法を用いてアッセイすることによって、判定することができる。炎症促進性サイトカインおよび炎症メディエーターとしては、限定ではないが、IL-1-アルファ、IL-1-ベータ、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、TNF-アルファ、白血球阻害因子（LIF）、IFN-ガンマ、オンコスタチンM（OSM）、毛様体神経栄養因子（CNTF）、TGF-ベータ、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、および炎症性細胞を化学誘引するケモカインが挙げられる。一態様では、炎症反応は、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤の投与後、無処置対照集団の炎症反応と比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上低下する。一態様では、初代マクロファージにおいて抑制されたIFN-γ誘発性炎症促進性ケモカインのパーセンテージは、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤の投与後、無処置対照集団の初代マクロファージにおいて抑制されたIFN-γ誘発性炎症促進性ケモカインのパーセンテージと比べて、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上増加する。
一態様では、方法は、投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む。一態様では、方法は、投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む。
炎症性疾患または障害、たとえば状態は、炎症組織（たとえば、リンパ球、好中球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および樹状細胞などの白血球の浸潤）、または疾患状態の異常な臨床的および組織学的特徴を引き起こすかそれに寄与する炎症性プロセスを特徴とする任意の疾患状態である。炎症状態としては、限定ではないが、皮膚の炎症状態、肺の炎症状態、関節の炎症状態、腸の炎症状態、眼の炎症状態、内分泌系の炎症状態、心血管系の炎症状態、腎臓の炎症状態、肝臓の炎症状態、中枢神経系の炎症状態、または敗血症関連状態が挙げられる。
本明細書に記載される方法を用いて治療され得る例示的な炎症性疾患または障害としては、限定ではないが、マクロファージ活性化症候群、潰瘍性大腸炎、II型糖尿病、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、高安病、大動脈弁狭窄症、コフィン・ローリー症候群、肺高血圧、ゴーシェ病、全身性エリテマトーデス、バージャー病、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢動脈疾患、静脈グラフト病、ステント内再狭窄、動静脈瘻疾患、動脈石灰化、石灰化大動脈弁疾患、クローン病、血管炎症候群、強皮症、リウマチ性心疾患、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、急性腎損傷、卒中、神経炎症、および脂肪肝が挙げられる。
非限定例として、炎症状態は、喘息、気管支炎、慢性気管支炎、細気管支炎、肺炎、副鼻腔炎、肺気腫、成人呼吸促拍症候群、肺炎症、肺線維症、および嚢胞性線維症などの肺の炎症状態であり得る（それに加えて、あるいはその代わりに、消化管または他の組織を伴う場合もある）。非限定例として、炎症状態は、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、若年性特発性関節炎、変形性関節症、痛風関節炎、感染性関節炎、乾癬性関節炎、および他の関節炎状態などの関節の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および遠位直腸炎などの腸（gut）または腸（bowel）の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、ドライアイ症候群、ぶどう膜炎（虹彩炎も含む）、結膜炎、強膜炎、および乾性角結膜炎などの眼の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、自己免疫甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病、I型糖尿病、ならびに副腎皮質の急性および慢性炎症などの内分泌系の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、冠血管梗塞障害、末梢血管疾患、心筋炎、血管炎、II型糖尿病関連の狭窄、動脈硬化（artherosclerosis）、および血管疾患の血行再建などの心血管系の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、糸球体腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、ウェゲナー病に伴う腎炎、急性腎炎に伴う急性腎不全、閉塞後症候群、および尿細管虚血などの腎臓の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、肝炎（ウイルス感染、自己免疫応答、薬物治療、毒物、環境要因から、または原発性障害の二次的結果として生じる）、胆道閉鎖症、原発性胆汁性肝硬変、および原発性硬化性胆管炎などの肝臓の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、多発性硬化症および神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病またはHIV感染関連認知症などの中枢神経系の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、MS；全種の脳炎および髄膜炎；急性散在性脳脊髄炎；急性横断性脊髄炎；視神経脊髄炎；局所脱髄症候群（たとえばBalo's同心円硬化症およびMSのマーブルクバリアント）；進行性多巣性白質脳症；亜急性硬化性全脳炎；急性出血性白質脳炎（ハースト病）；ヒトTリンパ球向性ウイルス1型関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺症；デビック病；ヒト免疫不全ウイルス脳症；ヒト免疫不全ウイルス空胞性脊髄症；脱髄性末梢神経障害；ギラン・バレー症候群、および他の免疫媒介性神経障害；ならびに重症筋無力症などの中枢神経系の炎症状態であり得る。非限定例として、炎症状態は、全身性炎症反応症候群（SIRS）、敗血症性ショック、または多臓器障害（MODS）などの敗血症関連状態の炎症状態であり得る。炎症状態のさらなる非限定例としては、エンドトキシンショック、歯周病、多発性軟骨炎；関節周囲障害；膵炎；全身性エリテマトーデス；シェーグレン症候群；血管炎サルコイドーシスアミローシス；アレルギー；アナフィラキシー；全身性肥満細胞症；骨盤内炎症性疾患；多発性硬化症；多発性硬化症（MS）；セリアック病、ギラン・バレー症候群、硬化性胆管炎、自己免疫肝炎、レイノー現象、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症候群（CFS）、自己免疫アジソン病、強直性脊椎炎、急性散在性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、視神経炎、Ord's甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌ多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、線維筋痛症（FM）、自己炎症性PAPA症候群、家族性地中海熱、リウマチ性多発筋痛症、結節性多発動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群；線維性肺胞炎、過敏性肺炎、アレルギー性アスペルギルス症、原因不明肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎性器質化肺炎；蕁麻疹；ルポイド肝炎；家族性寒冷自己炎症性症候群、マックル・ウェルズ症候群、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、グラフト拒絶（同種グラフト拒絶およびグラフト-v-宿主疾患も含む）、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、慢性前立腺炎、再灌流傷害、珪肺症、炎症性筋疾患、過敏症、および片頭痛が挙げられる。いくつかの態様では、炎症状態は、感染、たとえばウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、またはプリオン感染と関連がある。いくつかの態様では、炎症状態は、アレルギー反応と関連がある。いくつかの態様では、炎症状態は、汚染物質（たとえば石綿肺、珪肺症、またはベリリウム肺）と関連がある。
対象は、医師によって、炎症性疾患または障害を有するかまたは有するリスクがあると特定され得る。対象が所与の炎症性疾患または障害を有すると特定するのに有用な診断検査は、当技術分野で公知であり、本明細書においても以下にさらに記載される。
本明細書に提供される他の局面は、マクロファージ活性化を阻害する方法であって、該方法は、それを必要とする対象に有効量のRSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む。当業者であれば、マクロファージ活性化が生じたかどうかを、標準的な技法を用いて査定することができる。たとえば、活性化したマクロファージ上に見られる受容体（たとえば、TLR受容体、スカベンジャー受容体、またはFcもしくは補体受容体）、または活性化したマクロファージから分泌されるサイトカイン（たとえば、IFNγ、TNFα、IL-1、IL-6、IL-15、IL-18、およびIL-23）の存在を査定することによる。一態様では、マクロファージ活性化は、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤の投与後、無処置対照集団におけるマクロファージ活性化と比べて少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99%、またはそれ以上減少する。
剤
さまざまな局面では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤が、炎症性疾患または障害を有するか、有するリスクのある対象に投与される。さまざまな他の局面では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤が、マクロファージ活性化を阻害するために対象に投与される。一態様では、RSK1またはSTAT1を阻害する剤は、小分子、抗体もしくは抗体断片、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ゲノム編集系、またはRNAiである。
剤は、たとえば細胞内でRSK1の転写または翻訳を阻害することができる。剤は、細胞内でRSK1の活性（たとえばRSK1の発現）を阻害するか活性を変える（たとえば、もう活性化しないように、または低率で活性化するようにする）ことができる。剤は、タンパク質（たとえばRSK1またはSTAT1）の翻訳後修飾、たとえばリン酸化を阻害することができ、該タンパク質の野生型機能に干渉することができる。
剤は、それが投与される形態のまま機能する場合がある。あるいは、剤は、細胞内で修飾を受けるか活用されて、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害するものを生じることができ、たとえば核酸配列を細胞に導入し、その転写の結果、RSK1またはSTAT1リン酸化の核酸および／またはタンパク質阻害剤が生じる。いくつかの態様では、剤は、任意の化学的要素または部分であり、限定ではないが、合成および天然の非タンパク質性要素も含まれる。特定の態様では、剤は、化学部分を有する小分子である。たとえば、化学部分には、マクロライド、レプトマイシン、および関連の天然産物、またはそれらのアナログなどの、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロ環部分が含まれた。剤は、所望の活性および／または特性を有することが既知であってもよいし、多様な化合物のライブラリーから選択してもよい。
さまざまな態様では、剤は、RSK1を阻害する小分子である。小分子をスクリーニングする方法は当技術分野で公知であり、たとえば、所望の標的（たとえばRSK1）について、マクロファージ活性化を減少させるのに有効な小分子を特定するのに用いることができる。
一態様では、RSK1を阻害する剤は、表1から選択される。
（表１）RSK1発現を変化させる剤
Figure 2021523115
表1では、「cp」は小分子を指し、「sh」はshRNAを指し、「ctl_vector」は対照ベクターを指す。対照ベクターは、たとえばRSK1を標的とするようには設計されておらず、ベクターのオフターゲット効果を査定するのに用いることができる。
一態様では、RSK1を阻害する小分子は、表2から選択される。
（表２）RSK1発現を阻害する小分子
Figure 2021523115
表2では、MOAすなわち「作用機構」は、被験小分子の分類または種類を示す。本明細書では、当技術分野で公知の同一または類似のMOAを有する別の小分子を、それがRSK1を標的とするならば、炎症性疾患または障害の治療に用いることができることが、具体的に想定される。したがって、一態様では、RSK1を阻害する小分子は、脂肪酸シンターゼ阻害剤である。別の態様では、RSK1を阻害する小分子は、HSP阻害剤である。また別の態様では、RSK1を阻害する小分子は、ペプチダーゼ阻害剤である。表2に挙げた作用機構は、限定的なものではなく、表2に挙げた以外の小分子の作用機構も当技術分野では公知であり、本明細書において具体的に想定される。
別の態様では、小分子はMK-1775である。MK-1775は、チロシン阻害剤クラスに属し、チロシンWEE1を特異的に阻害する。したがって、一態様では、RSK1を阻害する小分子は、チロシン阻害剤である。
MK-1775は、化学物質C27H32N8O2、および構造：
Figure 2021523115
を有する。
マニュマイシン-aは、N-[(1S,5S,6R)-5-ヒドロキシ-5-[(1E,3E,5E)-7-[(2-ヒドロキシ-5-オキソ-1-シクロペンテン-1-イル)アミノ]-7-オキソ-1,3,5--ヘパトリエン-1-イル]-2-オキソ-7-オキサビシクロ[4.1.0]ヘプタ-3-エン-3-イル]-2E,4E,6R-トリメチル,2,4-デカジエンアミドとしても当技術分野で公知であり、構造：
Figure 2021523115
を有する。
セルレニンは、(2R,3S)-3-[(4E,7E)-1-オキソ-4,7-ノナジエン-1-イル]-2-オキシランカルボキサミドとしても当技術分野で公知であり、構造：
Figure 2021523115
を有する。
タネスピマイシンは、17-N-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシンまたは17-AAGとしても当技術分野で公知であり、構造：
Figure 2021523115
を有する。
サレルミドは、N-[3-[[(2-ヒドロキシ-1-ナフタレニル)メチレン]アミノ]フェニル]-a-メチル-ベンゼンアセトアミドとしても当技術分野で公知であり、構造：
Figure 2021523115
を有する。
トセドスタットは、αS-[[(2R)-2-[(1S)-1-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシアミノ)-2-オキソエチル]-4-メチル-1-オキソペンチル]アミノ]-ベンゼン酢酸、シクロペンチルエステルとしても当技術分野で公知であり、構造：
Figure 2021523115
を有する。
一態様では、小分子はリン酸化阻害剤である。具体的には、小分子は、セリンまたはセリン／スレオニンリン酸化の阻害剤である。別の態様では、剤はホスファターゼである。ホスファターゼは、ホスホセリン、ホスホスレオニン、またはホスホチロシンのリン酸エステル結合を加水分解して、タンパク質のリン酸化を除去する。例示的なホスファターゼとしては、限定ではないが、プロテインホスファターゼ1（PP1）、プロテインホスファターゼ2A（PP2A）、プロテインホスファターゼ2B（PP2B）、プロテインホスファターゼ2C（PP2C）、プロテインホスファターゼ4（PP4）、プロテインホスファターゼ5（PP5）、プロテインホスファターゼ6（PP6）、およびプロテインホスファターゼ7（PP7）が挙げられる。一態様では、ホスファターゼは、ホスファターゼをコードする核酸、またはホスファターゼをコードするポリペプチドである。ホスファターゼは、ベクターに含まれて、細胞内で発現することができる。
リン酸化阻害剤またはホスファターゼを、本明細書に記載される方法に用いて、RSK1のリン酸化、および／またはSTAT1リン酸化を阻害することができる。
さらに、一態様では、小分子は、本明細書に記載される小分子のいずれかの派生物である。一態様では、小分子は、本明細書に記載される小分子のいずれかのバリアントまたはアナログである。たとえば、RSK1を阻害する小分子は、MK-1775、マニュマイシン-a、セルレニン、タネスピマイシン、サレルミド、およびトセドスタットの派生物である。ある分子が別の分子の「派生物」と言われるのは、通常は別の分子の一部ではない追加の化学部分を含有する場合、および／またはそれが化学修飾されている場合である。そのような部分は、その分子の発現レベル、酵素活性、可溶性、吸光度、生物学的半減期等を改善し得る。あるいはその部分は、その分子の毒性を低減すること、その分子の何らかの望ましくない副作用を減衰させること等が可能である。そのような効果を媒介できる部分は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (l990)に開示されている。分子の「バリアント」は、該分子全体またはその断片と、構造および機能が実質的に同じ分子を指すものとする。ある分子が別の分子と「実質的に同じ」と言われるのは、両分子が実質的に同じ構造を有し、かつ／または両分子が同じ生物学的活性をもつ場合である。したがって、2つの分子が同じ活性をもつならば、それらはバリアントとみなされるが、それはこの用語が、一方の分子の構造が他方の分子に見られなくても、あるいは構造が同一でなくても使用されるからである。分子の「アナログ」は、該分子全体またはその断片と、機能が実質的に同じ分子を指すものとする。
さまざまな態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、RSK1またはSTAT1リン酸化部位、たとえばSTAT1のセリン727に特異的な、抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗体試薬である。本明細書で使用する場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合する、ポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含む場合がある。いずれかの局面のいくつかの態様では、抗体試薬は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合性ドメインを含むポリペプチドを含む場合がある。たとえば、抗体は、1つの重（H）鎖可変領域（本明細書ではVHと略す）および1つの軽（L）鎖可変領域（本明細書ではVLと略す）を含み得る。別の例では、抗体は、2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、完全抗体の他にも抗体の抗原結合性断片を包含する（たとえば、単鎖抗体、FabおよびsFab断片、F(ab')2、Fd断片、Fv断片、scFv、CDR、およびドメイン抗体（dAb）断片（たとえばde Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26(3):629-39を参照;参照により全文が本明細書に組み入れられる））。抗体は、IgA、IgG、IgE、IgD、またはIgM（ならびにそれらのサブタイプおよび組み合わせ）の構造特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、および霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類）、および霊長類化抗体を含む、あらゆるソースに由来し得る。抗体としては、ミディボディ（midibody）、ナノボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体等も挙げられる。
一態様では、抗体の結合が、RSK1のセリン380におけるリン酸化を阻害する。一態様では、抗体の結合が、STAT1のセリン727におけるリン酸化を阻害する。
一態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、ヒト化されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体試薬である。本明細書で使用する場合、「ヒト化」は、ヒトで天然に生産される抗体バリアントとの類似性が増加するようにタンパク質配列が修飾されている、非ヒト種（たとえば、マウス、ラット、ヒツジ等）由来の抗体を指す。一態様では、ヒト化抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。一態様では、ヒト化抗体は、ヒト化ポリクローナル抗体である。一態様では、ヒト化抗体は、治療に使用される。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知である。
例示的な抗体、たとえばRSK1および／またはSTAT1リン酸化の阻害に有用な抗体（たとえば抗RSK1抗体）は、本明細書において以下の実施例にさらに記載される。これらの抗体を、さらにヒト化して、本明細書で特許請求される方法および組成物に用いることができる。
一態様では、抗体または抗体試薬は、RSK1をコードするアミノ酸配列（SEQ ID NO:2）に対応するアミノ酸配列に結合する。
Figure 2021523115
別の態様では、抗RSK1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、SEQ ID NO:2の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様では、抗RSK1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の全配列を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様では、抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:2の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、ここで断片はその標的、たとえばRSK1に結合するのに十分であり、そしてたとえばマクロファージ活性化を減少させる。
一態様では、抗体または抗体試薬は、STAT1をコードするアミノ酸配列（SEQ ID NO:4）に対応するアミノ酸配列に結合する。
Figure 2021523115
別の態様では、抗STAT1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:4の配列を含むアミノ酸配列に結合するか、SEQ ID NO:4の配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上の配列同一性を有する配列を含むアミノ酸配列に結合する。一態様では、抗STAT1抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:4の全配列を含むアミノ酸配列に結合する。別の態様では、抗体または抗体試薬は、SEQ ID NO:4の配列の断片を含むアミノ酸配列に結合し、ここで断片はその標的、たとえばSTAT1に結合するのに十分であり、そしてたとえばマクロファージ活性化を減少させる。
一態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、DNAまたはmRNA配列に対し相補的な、たとえばマイクロRNAの、合成核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、DNAまたはRNA標的に結合して、転写、翻訳、またはスプライシングのレベルで発現を停止させることにより、該標的の発現をブロックするように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で遺伝子、たとえばRSK1、またはSTAT1リン酸化とハイブリダイズするように設計されている、相補的核酸配列である。したがって、オリゴヌクレオチドは、標的に対し十分に相補的であるように、すなわち細胞環境の文脈で、十分に良好に、かつ十分な特異性をもってハイブリダイズして、所望の効果を与えるように選ばれる。たとえば、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトRSK1遺伝子（たとえば、SEQ ID NO:1）またはSTAT1遺伝子（たとえば、SEQ ID NO:3）のコード配列の一部分に対し相補的な、少なくとも5つ、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、またはそれ以上の塩基を含む場合がある。
SEQ ID NO:1は、RSK1をコードするヌクレオチド配列である。
Figure 2021523115
SEQ ID NO:3は、STAT1をコードするヌクレオチド配列である。
Figure 2021523115
一態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を、限定ではないが、Znフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、メガヌクレアーゼ、およびCRISPR/Cas系などの任意のゲノム編集系を用いて、細胞のゲノムから枯渇させる。一態様では、1つまたは複数のガイドRNAをコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むのに用いられるゲノム編集系は、CRISPR/Cas系ではなく、したがって、少量のCas酵素／タンパク質を保持する細胞の望ましくない細胞死を防止することができる。本明細書では、Cas酵素またはsgRNAがそれぞれ別の誘導性プロモーターの制御下で発現し、そうすることでそれぞれの一時的な発現が可能になって、そのような干渉が防止されることも、想定されている。
1つまたは複数のsgRNAをコードする核酸と、RNA誘導エンドヌクレアーゼをコードする核酸とを、どちらも投与する必要がある場合、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）の使用が具体的に想定される。ゲノム編集／断片化系の両構成要素（たとえば、sgRNA、RNA誘導エンドヌクレアーゼ）に核酸を同時送達する他のベクターとしては、エプスタイン・バー、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、および肝炎Bウイルス（HBV）などのレンチウイルスベクターが挙げられる。RNA誘導ゲノム編集系（たとえば、sgRNAおよびエンドヌクレアーゼ）の各構成要素は、当技術分野で公知の、または本明細書に記載される別個のベクターで送達することができる。
一態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、RNA阻害を介して阻害する。所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であり得る。いずれかの局面のいくつかの態様では、阻害性核酸は阻害性RNA（iRNA）である。RNAiは一本鎖でも二本鎖でもよい。
iRNAは、siRNA、shRNA、内因性マイクロRNA（miRNA）、または人工miRNAであり得る。一態様では、本明細書に記載されるiRNAは、標的の阻害、たとえばRSK1またはSTAT1リン酸化の発現および／または活性の阻害をもたらす。いずれかの局面のいくつかの態様では、剤は、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害するsiRNAである。いずれかの局面のいくつかの態様では、剤は、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害するshRNAである。
当業者であれば、たとえば公開されている設計ツールを用いて、RSK1またはSTAT1リン酸化を標的とするsiRNA、shRNA、またはmiRNAを設計できよう。siRNA、shRNA、またはmiRNAは、Dharmacon（コロラド州ラファイエット）またはSigma Aldrich（ミズーリ州セントルイス）などの企業によって広く製造されている。
いずれかの局面のいくつかの態様では、iRNAはdsRNAであり得る。dsRNAは、該dsRNAが用いられる条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分相補的な、2本のRNA鎖を含む。dsRNAの1本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的な、そして一般的には完全に相補的な、相補性領域を含む。標的配列は、標的発現時に形成されるmRNAの配列に由来し得る。もう1本の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対し相補的な領域を含むので、好適な条件下で組み合わせると、2本の鎖はハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する。
iRNAのRNAを化学修飾して、安定性または他の有益な特徴を増大させることができる。本発明で扱う核酸は、当技術分野で十分に確立された、たとえば“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような方法によって、合成および／または修飾することができる。
一態様では、剤は、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害するmiRNAである。マイクロRNAは、小さな非コードRNAであり、平均長は22ヌクレオチドである。これらの分子は、mRNA分子内で、通常3’非翻訳（3’UTR）領域において、相補的配列に結合し、それによって標的mRNAの分解およびmRNA翻訳の阻害を促進することにより作用する。マイクロRNAとmRNAとの相互作用は、「シード配列」として知られるマイクロRNAの6〜8ヌクレオチド領域により媒介され、これが不完全なワトソン・クリック塩基対形成を通じてmRNAへの配列特異的な結合を導く。900を超えるマイクロRNAが、哺乳類で発現することがわかっている。これらの多くをそのシード配列に基づきファミリーにグループ分けすることができ、そうすることで類似のマイクロRNAの「クラスター」が特定される。miRNAは、細胞内で、たとえばネイキッドDNAとして発現する場合がある。miRNAは、細胞内でたとえばネイキッドDNAとして発現する核酸によりコードされる場合もあるし、ベクター内に含まれる核酸によりコードされる場合もある。
剤は、RNAi分子（たとえばsiRNAまたはmiRNA）などにより、標的遺伝子(たとえばRSK1またはSTAT1リン酸化)の遺伝子サイレンシングをもたらし得る。このことは、細胞内の標的のmRNAレベルの、剤の存在がない場合に細胞内で見られるmRNAレベルの少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%の減少を伴う。ある好ましい態様では、mRNAレベルは、少なくとも約70%、約80%、約90%、約95%、約99%、約100%減少する。当業者であれば、siRNA、shRNA、またはmiRNAが、たとえばRSK1またはSTAT1リン酸化の下向き調節を有効に標的としたかどうかを、たとえばsiRNA、shRNA、またはmiRNAを細胞にトランスフェクトし、そして細胞内の遺伝子もしくは遺伝子産物および／または翻訳後修飾（たとえば、RSK1、またはTAT1リン酸化）のレベルを、PCRベースのアッセイまたはウエスタンブロッティングによりそれぞれ検出することで、容易に査定できる。
剤はベクターに含有されている場合もあるので、剤としてベクターをさらに挙げることができる。外来性遺伝子を標的哺乳類細胞に移入するのに有用な多くのベクターが入手可能である。ベクターは、エピソーム、たとえばプラスミド、ウイルス由来ベクター、たとえばサイトメガロウイルス、アデノウイルス等であってもよく、あるいは相同組換えまたは無作為組込みによって標的細胞ゲノムに組み込まれていてもよく、たとえばMMLV、HIV-1、ALV等のレトロウイルス由来ベクターであってもよい。いくつかの態様では、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株との組み合わせも使用され得、その場合はカプシドタンパク質が機能して標的細胞を感染させる。通常、細胞とウイルスとを少なくとも約24時間培養培地でインキュベートする。そして分析の前に、用途によっては細胞を培養培地で短期間、たとえば24〜73時間、または少なくとも2週間増殖させ、また5週間以上増殖させる場合もある。一般に用いられるレトロウイルスベクターは、「不完全」であり、すなわち増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を生産することができない。ベクターの複製には、パッケージング細胞株内での増殖が必要である。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞への送達または異なる宿主細胞間の移送のために設計された核酸コンストラクトを指す。本明細書で使用する場合、ベクターは、ウイルス性でも非ウイルス性でもよい。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと結合すると複製することができる、そして遺伝子配列を細胞に移送することができる、任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターとしては、限定ではないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工的染色体、ウイルス、ビリオン等を挙げることができる。
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」という用語は、該ベクターに含有され該ベクター上で転写制御配列と連結した核酸配列からのRNAまたはポリペプチド（たとえばRSK1またはSTAT1リン酸化阻害剤）の発現を指令するベクターを指す。発現する配列は、必ずしもというわけではないが、その細胞とは異種であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことがあり、たとえば発現ベクターは、2つの複製系を有する場合があり、したがって2つの生物内で維持されることができ、たとえばヒト細胞で発現し、原核生物宿主でクローニングおよび増幅することができる。「発現」という用語は、RNAおよびタンパク質の産生、そして適宜タンパク質の分泌に関与する、たとえば該当する場合、限定ではないが、転写、転写物プロセシング、翻訳、ならびにタンパク質の折り畳み、修飾、およびプロセシングなどの、細胞プロセスを指す。「発現産物」としては、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳により得られるポリペプチドが挙げられる。「遺伝子」という用語は、適切な制御配列に機能的に連結されていればインビトロまたはインビボでRNAに転写される、核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、たとえば5’非翻訳（5’UTR）または「リーダー」配列、および3’UTRまたは「トレイラー」配列を、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでいてもいなくてもよい。
組込みベクターは、それらが送達したRNA/DNAを宿主細胞の染色体に恒久的に組み込ませる。非組込みベクターは、エピソームのままであり、つまり、それが含有する核酸は、宿主細胞の染色体に決して組み込まれない。組込みベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
非組込みベクターの一例は、非組込みウイルスベクターである。非組込みウイルスベクターは、そのゲノムを宿主DNAに組み込まないので、組込みレトロウイルスがもたらすリスクが取り除かれる。一例はエプスタイン・バーoriP／核抗原-1（「EBNA1」）ベクターであり、これは限定的な自己複製が可能であり、哺乳類細胞で機能することがわかっている。エプスタイン・バーウイルス由来の2つのエレメント、oriPおよびEBNA1を含有するので、EBNA1タンパク質がウイルスレプリコン領域のoriPに結合すると、哺乳類細胞においてプラスミドのエピソームの比較的長期の存在が維持される。このoriP/EBNA1ベクターの特殊な特徴のおかげで、該ベクターは、組み込みなしのiPSCの生成にとって理想的である。別の非組込みウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。
別の非組込みウイルスベクターは、RNAセンダイウイルスベクターであり、これは感染細胞の核内に入らずにタンパク質を生産することができる。F欠損センダイウイルスベクターは、2〜3代にわたり感染細胞の細胞質にとどまるが、すぐに弱められてしまい、数代（たとえば10代）後には完全に消えてしまう。
非組込みベクターの別の例は、小円ベクターである。小円ベクターは円形のベクターであって、内部でプラスミド骨格が遊離してしまい、真核生物プロモーターおよび発現させるcDNAだけが残っている。
本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」という用語は、少なくとも1つのウイルス起源エレメントを含み、かつウイルスベクター粒子にパッケージされることができる、核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有することができる。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボで、核酸を細胞に移入するために用いることができる。ウイルスベクターの数々の形態が、当技術分野で公知である。
一態様では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本明細書で使用する場合、組成物、担体、希釈剤、および試薬に言及する場合の「薬学的に許容される」という用語およびその文法的変化形は交換可能に用いられ、そうした物質が、吐き気、眩暈、胃の不調等などの望ましくない生理作用を生じさせることなく哺乳類に、または哺乳類に対し投与できることを表す。各担体は、製剤の他の成分と両立可能という意味でも「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体は、所望でないかぎり、それが混合される剤に対する免疫反応が生じるのを促進しない。中に溶解または分散している活性成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野ではよく理解されており、製剤に基づいて制限する必要はない。薬学的製剤は、本発明の化合物を、1つまたは複数の薬学的に許容される成分と組み合わせて含有している。担体は、固体、半固体、もしくは液体希釈剤、クリーム、またはカプセルの形態であり得る。典型的には、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁液の注射剤として調製されるが、液中で溶液または懸濁液とするのに適した使用前は固体の形態も調製され得る。調製物は、乳化されるか、リポソーム組成物として調製される場合もある。活性成分は、薬学的に許容され、かつ該活性成分と両立でき、かつ本明細書に記載される治療方法での使用に好適な量の、賦形剤と混合してもよい。好適な賦形剤は、たとえば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組み合わせである。また、所望により、組成物は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤等の、活性成分の有効性を高める少量の補助物質を含有することができる。本発明の治療組成物は、その構成要素の薬学的に許容される塩を含んでもよい。薬学的に許容される塩としては、たとえば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩も、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から派生することができる。生理的に許容される担体は、当技術分野では周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水以外の材料を含有しない、または生理pH値のリン酸ナトリウムなどのバッファー、生理食塩水、もしくは両方、たとえばリン酸緩衝食塩水を含有する、滅菌水溶液である。さらに、水性担体が、2つ以上のバッファー塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有し得る。液体組成物は、水に加えて、そして水を除外するほどの、液相を含有する場合もある。そのような追加の液相の例示は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油エマルションである。特定の障害または状態の治療に有効な、本発明に用いられる活性剤の量は、障害または状態の特性により、また標準的な臨床的技法により、決定され得る。「薬学的に許容される担体または希釈剤」という語句は、ある器官、または体の一部から、別の器官、または体の一部への対象剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質などの、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。
本明細書に記載される組成物は、本明細書に以下記載される任意の投与ルート用に製剤化することができる。組成物を所望の投与用に製剤化する方法を、以下にさらに論じる。
投与
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、炎症性疾患または障害を有するか、有すると診断された対象を治療することに関し、本明細書に記載されるRSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与することを含む。炎症疾患または障害を有する対象は、医師が、状態を診断する現行の方法（すなわち身体症状、血液検査等の査定）を用いて特定することができる。こうした疾患を特徴付け、かつ診断に役立つ炎症の症状および／または合併症は、当技術分野で周知であり、限定ではないが、関節痛、皮疹、疲労、および関節硬直が挙げられる。たとえば炎症性疾患または障害の診断に役立ち得る検査としては、限定ではないが、赤血球沈降速度（ESR）、C反応性タンパク質（CRP）、および血漿粘度（PV）血液検査が挙げられる。たとえば炎症性疾患または障害の家族歴も、対象がその状態を有し得るかどうかを判断するのに、または炎症性疾患もしくは障害の診断を下すのに役立つ。
本明細書に記載される剤（たとえば、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤）は、炎症性疾患または障害を有するか、有すると診断された対象に投与することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法は、有効量の剤を対象に投与して、たとえば炎症性疾患または障害の少なくとも1つの症状を緩和することを含む。本明細書で使用する場合、「炎症性疾患または障害の少なくとも1つの症状を緩和すること」は、たとえば炎症性疾患または障害と関連する任意の状態または症状（たとえば、関節痛および／もしくは硬直、疲労、ならびに／または皮疹）を寛解させることである。同等の無処置の対照と比べて、そのような低下は、任意の標準的な技法により測定すると、少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、99%、またはそれ以上である。本明細書に記載される剤を対象に投与するさまざまな手段が、当業者には公知である。一態様では、剤は、全身的にまたは局所的に（たとえば罹患器官に対し）投与される。一態様では、剤は静脈内投与される。一態様では、剤は間隔を空けて継続的に、または散発的に投与される。剤の投与ルートは、送達される剤の種類（たとえば、抗体、小分子、RNAi）によって最適化され、それは医師が決定することができる。
一態様では、剤、または剤を含む組成物は、吸入により投与される。したがって、一態様では、本明細書に記載される剤を含む組成物は、エアロゾル送達用に製剤化される。
「有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、たとえば炎症性疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状の緩和を必要とする、炎症性疾患または障害を有するか、有すると診断された対象に投与してもよい剤（たとえば、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤）の量を指す。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与された時に、たとえば特定の抗炎症性効果を提供するのに十分な、剤の量を指す。有効量は、本明細書で使用する場合、さまざまな文脈において、たとえば炎症性疾患または障害の症状の発生を遅らせるのに、たとえば炎症性疾患または障害の症状の進行を変える（たとえば、関節硬直および／もしくは痛みの進行、または皮疹の発症を緩慢化する)のに、あるいはたとえば症状を逆転させる（たとえば、関節硬直および／もしくは痛みを緩和し、または皮疹を消退させる）のに十分な、剤の量も含む。したがって、厳密な「有効量」を特定することは、一般に実現可能ではない。しかし、任意の所与の事例で、適切な「有効量」は、当業者によりルーチンの実験のみで決定することができる。
一態様では、剤は、（たとえば、ある期間にわたり一定のレベルで）継続的に投与される。剤の継続的投与は、たとえば上皮パッチ、継続的放出剤、または体表面インジェクターにより、実現可能である。
本明細書に記載される剤は、少なくとも1日、1週、3週おき、1カ月、2カ月おき、3カ月おき、4カ月おき、5カ月おき、6カ月おき、7カ月おき、8カ月おき、9カ月おき、10カ月おき、11カ月おき、1年、またはそれ以上に、1回投与され得る。
有効量、毒性、および治療有効性は、細胞培養または実験動物の標準的な薬学的手順により評価され得る。用量は、使用される剤形、および利用される投与ルートにより変わり得る。毒性効果と治療効果の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50比率として表すことができる。大きい治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイにより推定することができる。また、用量を動物モデルで策定し、細胞培養または適切な動物モデルで決定されるIC50（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する剤の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を取得してもよい。血漿中レベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。任意の具体的な用量の効果は、好適なバイオアッセイにより、たとえばとりわけマクロファージ活性化の測定または血液検査により、観察することができる。用量は、医師が決定し、観測された治療効果に合わせて、必要に応じて調節してもよい。
用量
「単位剤形」という用語は、本明細書で用いられる場合、好適な1回の投与の用量を指す。例として、単位剤形は、送達デバイス、たとえばシリンジまたは静脈点滴バッグに入れられる治療量であり得る。一態様では、単位剤形は、1回の投与で投与される。別の態様では、2つ以上の単位剤形が同時に投与される場合がある。
本明細書に記載される剤の用量は、医師が決定し、観測された治療効果に合わせて、必要に応じて調節してもよい。治療の期間および頻度については、典型的には医師が対象を観察して、その治療がいつ治療効果を提供しているかを判定し、そしてさらに細胞を投与するかどうか、治療を中止するかどうか、治療を再開するかどうか、または他の選択肢を治療レジメンに加えるかどうかを決定する。用量は、サイトカイン放出症候群などの有害な副作用をもたらすほど高くてはいけない。一般に、用量は患者の年齢、状態、および性別によってさまざまであり、当業者が決定することができる。用量は、何らかの合併症が生じた場合は、個々の医師が調節する場合もある。
併用療法
一態様では、本明細書に記載される剤は、単剤療法として用いられる。一態様では、本明細書に記載される剤は、他の公知の炎症性疾患または障害用の剤および療法と併用で用いられる場合もある。本明細書で使用する場合、「併用（組み合わせ）」で投与されるとは、対象が障害に罹患している間、2つ（以上）の異なる治療が対象に送達されることを意味し、たとえば、対象が障害または疾患（たとえば、炎症性疾患または障害）と診断された後、そして障害が治るかなくなる前に、または他の理由で治療をやめる前に、2つ以上の治療が送達される。いくつかの態様では、1つの治療の送達は、第2の治療の送達が始まるときも行われており、したがって投与において重複がある。本明細書ではこれを「同時（simultaneous）」または「同時（concurrent）送達」と呼ぶことがある。他の態様では、一方の治療の送達は、もう一方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれの場合もいくつかの態様で、併用投与のおかげで治療がより有効になる。たとえば、第2の治療は、第1の治療の非存在下で第2の治療が投与された場合よりも有効であり、たとえば第2の治療がもっと少なくても同等の効果が見られたり、第2の治療が症状をもっと軽減させたりし、あるいは同様の状況が第1の治療でも見られる。いくつかの態様では、送達は、どちらかの非存在下でもう一方の治療が送達された場合に観測されるよりも、症状、または障害に関する他のパラメーターが、より軽減する送達となる。2種類の治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的以上であり得る。送達は、送達済みの第1の治療の効果が、第2の治療が送達されるときもまだ検出できるような送達であり得る。本明細書に記載される剤と、少なくとも1つの追加の療法とは、同一もしくは別々の組成物中で同時に、または連続的に、投与され得る。連続投与では、本明細書に記載される剤を最初に投与し、そして追加の剤を2番目に投与してもよいし、投与の順が逆であってもよい。剤および／もしくは他の治療剤、手順、またはモダリティーは、活動性障害の期間中、または緩解のもしくは低活性疾患の期間中に投与され得る。剤は、別の治療の前に、それと同時に、その後に、または障害の緩解中に投与され得る。炎症性疾患または障害の治療に用いられる治療は当技術分野で公知であり、医師が特定することができる。
併用投与される場合、剤、および少なくとも1つの追加の剤（たとえば、第2のまたは第3の剤）、または全部が、各剤がそれぞれ、たとえば単剤療法として用いられる量または用量よりも高い、低い、または同じ量または用量で投与され得る。特定の態様では、剤、および追加の剤（たとえば、第2のまたは第3の剤）、または全部が投与される量または用量は、各剤がそれぞれ用いられる量または用量よりも（たとえば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%だけ）低い。他の態様では、所望の効果（たとえば喘息の治療）をもたらす剤、追加の剤（たとえば、第2のまたは第3の剤）、または全部の量または用量は、同じ治療効果を得るのに各剤がそれぞれ必要な量または用量よりも低い（たとえば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%だけ低い）。
非経口剤形
本明細書に記載される剤の非経口剤形は、限定ではないが、皮下、静脈内（ボーラス注射も含む）、筋内、および動脈内などのさまざまなルートで対象に投与され得る。非経口剤形の投与は、典型的には汚染物質に対する患者の自然免疫を迂回するので、非経口剤形は、好ましくは滅菌されているか、患者への投与前に滅菌することができる。非経口剤形の例としては、限定ではないが、すぐに注射できる溶液、薬学的に許容されるビヒクルに容易に溶解または懸濁させて注射できる乾燥製品、すぐに注射できる懸濁液、制御放出非経口剤形、およびエマルションが挙げられる。
本開示の非経口剤形を提供するのに用いることができる好適なビヒクルは、当業者には周知である。例としては、限定ではないが、滅菌水；USP注射用の水；生理食塩水；グルコース溶液；水性ビヒクル、たとえば限定ではないが、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、および乳酸リンゲル注射液；水混和性ビヒクル、たとえば限定ではないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、たとえば限定ではないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルが挙げられる。
エアロゾル製剤
RSK1もしくはSTAT1リン酸化を阻害する剤、またはRSK1もしくはSTAT1リン酸化を阻害する剤を含む組成物は、対象の気道にエアロゾルの形態で、または吸入投与により、直接投与することができる。エアロゾルとしての使用のために、溶液または懸濁液中のRSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤を、与圧エアロゾル容器内に、好適な噴射剤、たとえばプロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴射剤と、一般的なアジュバントと一緒に詰めることができる。RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤は、ネブライザーまたはアトマイザーなどのように、非加圧式に投与してもよい。
「吸入投与」という用語は、当技術分野では、液体を細かいスプレーに変えることを含むことが周知である。好ましくは、そのような吸入投与により、均一なサイズの小液滴を、より体積の大きい液体から制御しながら生じさせる。したがって吸入投与は、今日知られている、かつ販売されている多くのネブライザーの使用を含め、任意の好適な手段により実現することができる。たとえば、イリノイ州ナイルズのInhalation Plastic, Inc.から入手可能なAEROMIST空気圧ネブライザー。活性成分をまとめてまたは個別にネブライザー投与するようにすると、単位用量デバイスか複数用量デバイスとしての、好適なpHまたは浸透圧の調節がされているかされていない、吸引投与される水性懸濁液または溶液の形態になり得る。
周知のように、吸入投与中に任意の好適なガスを用いて加圧することができ、現在のところ好ましいガスは、モジュレーターのRSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤に対し化学的に不活性なガスである。限定ではないが、例示的な窒素、アルゴン、またはヘリウムなどのガスを、極めて有利に用いることができる。
いくつかの態様では、RSK1またはSTAT1リン酸化を阻害する剤を乾燥粉末の形態で直接気道に投与することもできる。乾燥粉末として使用する場合、吸入器を使用してGHKトリペプチドを投与することができる。例示的な吸入器としては、計量吸入器および乾燥粉末吸入器が挙げられる。
呼吸器に送達するためのエアロゾルが、当技術分野で公知である。たとえば、Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)を参照、そしてペプチドおよびタンパク質の全身送達の可能性も有する(Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); and Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995);および Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)を参照。これら全部の内容は、参照により全文が本明細書に組み入れられる。
制御放出および遅延放出の剤形
本明細書に記載される局面のいくつかの態様では、剤は、制御放出および遅延放出手段により対象に投与される。理想的には、薬物治療における最適設計の制御放出調製物の使用は、病態を最低限の時間で治療または制御するのに用いられる最小限の薬物を特徴とする。制御放出製剤の利点としては、1）薬物活性の拡大；2）投与頻度の減少；3）患者コンプライアンスの上昇；4）総合的な薬物使用の減少；5）局所的または全身的な副作用の低減；6）薬物蓄積の最小限化；7）血中レベル変動の減少；8）治療有効性の改善；9）薬物活性の増強または喪失の低減；および10）疾患または状態の制御速度の改善が挙げられる（Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)）。制御放出製剤は、式（I）の化合物の作用の開始、作用の持続時間、治療枠内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御するために用いられ得る。具体的には、制御放出または徐放剤形または製剤は、薬物の過小投与（すなわち最小治療レベルを下回る）および薬物の毒性レベル超過の両方から生じ得る考えられる有害作用および安全性の懸念を最小限にしながらも、剤の最大限の有効性を確実に実現できるように用いることができる。
さまざまな公知の制御放出または徐放剤形、製剤、およびデバイスを、本明細書に記載される任意の剤とともに使用できるようにしてもよい。例としては、限定ではないが、米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5,674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185号に記載されるものが挙げられ、それぞれ参照により全文が本明細書に組み入れられる。これらの剤形を用いて、1つまたは複数の活性成分の緩徐なまたは制御された放出を提供することができ、たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透性膜、浸透系（たとえばOROS（登録商標）（米国カリフォルニア州マウンテンビューのAlza Corporation））、多層コーティング、マイクロ粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフィア、またはそれらの組み合わせを、さまざまな比率で用いて、所望の放出プロファイルを提供する。また、イオン交換材料を用いて、固定され吸着された塩の形態の開示の化合物を調製することができ、したがって制御された薬物送達をもたらすことができる。具体的なイオン交換体の例としては、限定ではないが、DUOLITE（登録商標）A568およびDUOLITE（登録商標）AP143（米国ペンシルバニア州スプリングハウスのRohm&Haas）が挙げられる。
有効性
たとえば炎症性疾患または障害の治療に関する、本明細書に記載される剤の有効性は、医師により決定され得る。しかし、治療は、本明細書においてこの用語が使用される場合、たとえば本明細書に記載される方法の治療後に少なくとも10%だけ、たとえば炎症性疾患または障害の1つまたは複数の兆候または症状が有益なほうに変わるか、他の臨床的に認められる症状が改善または寛解するか、所望の応答が誘発される場合、「有効治療」とみなされる。有効性は、たとえば、マーカー、指標、症状、および／または本明細書に記載される方法により治療される状態の発生率、あるいは任意の他の測定可能な適切なパラメーター、たとえば、関節痛の軽減、関節硬直の減少、または皮疹の出現の減少を測定することにより、査定することができる。有効性は、入院または医療介入の必要性により査定される、個人の不全の悪化（すなわち炎症の進行）により測定することもできる。こうした指標を測定する方法は、当業者には公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
有効性は、適宜、本明細書に記載される病態の動物モデルで、たとえば炎症性疾患または障害のマウスモデルまたは適切な動物モデルで査定することができる。実験動物モデルを用いる場合、治療の有効性は、統計学的に有意なマーカーの変化が観測された場合に証明される。
炎症性疾患または障害を阻害する剤の有効性はまた、本明細書に記載される方法を用いて査定することもできる。
明記している特許、特許出願、特許公報はすべて、たとえば本発明に関連して用いられ得るそのような公報に記載の方法の記述および開示のために、参照により明白に組み入れられる。こうした公報を提供するのは単に、それらの開示が本願の出願日に先立つからである。この点で、先行発明または何らかの他の理由から本発明者らがそのような開示に先行する資格がないと認める、との解釈は一切すべきではない。こうした文書の日付または内容に関するすべての記述または表示は、本出願人らが入手できる情報に基づくものであり、こうした文書の日付または内容の正確性を認めるものではない。
特許請求される本発明は、以下の番号の項目にさらに記載され得る。
1. 炎症性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のリボソームS6キナーゼ-1（RSK1）を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
2. RSK1の阻害がRSK1リン酸化の阻害である、項目1の方法。
3. RSK1リン酸化がセリン380においてである、項目2の方法。
4. RSK1の阻害がRSK1核移行の阻害である、上記項目のいずれかの方法。
5. RSK1の阻害がRSK1キナーゼ活性の阻害である、上記項目のいずれかの方法。
6. RSK1キナーゼ活性の阻害が、シグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）のリン酸化を阻害する、項目5の方法。
7. STAT1のリン酸化がセリン727においてである、項目6の方法。
8. RSK1の阻害が炎症反応を阻害する、上記項目のいずれかの方法。
9. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
10. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
11. 前記RSK1を阻害する剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、上記項目のいずれかの方法。
12. 前記小分子が、MK-1775、マニュマイシン-a、セルレニン、タネスピマイシン、サレルミド、およびトセドスタットからなる群より選択される、項目11の方法。
13. 前記RNAiが、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、項目11の方法。
14. 前記抗体がヒト化抗体である、項目11の方法。
15. RSK1を阻害することが、RSK1の発現レベルおよび／または活性を阻害することである、上記項目のいずれかの方法。
16. 前記RSK1の発現レベルおよび／または活性が、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される、項目15の方法。
17. RSK1の阻害が、初代マクロファージにおいてIFN-γ誘発性炎症促進性ケモカインを抑制する、上記項目のいずれかの方法。
18. 前記IFN-γ誘発性ケモカインが、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上抑制される、項目17の方法。
19. 炎症性疾患または障害のための少なくとも第2の治療を施す工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
20. 炎症性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のシグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
21. STAT1リン酸化がセリン727においてである、項目20の方法。
22. STAT1リン酸化の阻害が炎症反応を阻害する、上記項目のいずれかの方法。
23. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
24. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
25. STAT1リン酸化を阻害する剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、上記項目のいずれかの方法。
26. 前記RNAiが、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、項目25の方法。
27. 前記抗体がヒト化抗体である、項目25の方法。
28. 前記リン酸化が、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される、上記項目のいずれかの方法。
29. 炎症性疾患または障害のための少なくとも第2の治療を施す工程をさらに含む、上記項目のいずれかの方法。
30. 前記対象が、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがない、上記項目のいずれかの方法。
31. 前記対象が、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがある、上記項目のいずれかの方法。
32. 前記炎症性疾患または障害が、マクロファージ活性化症候群、潰瘍性大腸炎、II型糖尿病、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、高安病、大動脈弁狭窄症、コフィン・ローリー症候群、肺高血圧、ゴーシェ病、全身性エリテマトーデス、バージャー病、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢動脈疾患、静脈グラフト病、ステント内再狭窄、動静脈瘻疾患、動脈石灰化、石灰化大動脈弁疾患、クローン病、血管炎症候群、強皮症、リウマチ性心疾患、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、急性腎損傷、卒中、神経炎症、および脂肪肝からなる群より選択される、上記項目のいずれかの方法。
33. マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のRSK1を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
34. マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
35. RSK1を阻害する剤を含む、組成物。
36. STAT1リン酸化を阻害する剤を含む、組成物。
37. 薬学的に許容される担体をさらに含む、上記項目のいずれかの組成物。
実施例１
本明細書に示すデータでは、炎症促進性推進因子を代表するIFN-γを用いて、核内STAT1の転写活性化を通してマクロファージ活性化に寄与する新たな分子機構を特定した。マクロファージの研究の多くがヒト細胞株またはマウス細胞を用いているが、本発明者らの認識では、癌細胞と初代細胞とでは、また種間でも、刺激に対する応答は異なり得る。本研究では、末梢血単核球（PBMC）由来のヒト初代マクロファージを用いて、システムアプローチにより、マクロファージ活性化の主要制御因子のIFN-γ誘発性核移行を特定した。本発明者らのホリスティックな標的発見プラットフォームには、核移行のプロテオミクス、バイオインフォマティクスによるクラスタリング、およびネットワーク解析が含まれた。本発明者らは、RSK1が、IFN-γに応答して炎症促進性マクロファージを活性化させる核シャトリングキナーゼであることを発見した。IFN-γ誘発性RSK1リン酸化は核内でSTAT1のSer727におけるリン酸化を促進し、炎症反応を促進する。こうした新規な知見は、炎症性疾患の制御機構についての見識を提供する。
結果
定量的核プロテオミクスは、核特異的および核シャトリングタンパク質の集積を実証する。
IFN-γに応答してのホスホ-STAT1-Tyr701の核移行は、ケモカインなどの炎症促進性分子のSTAT1依存性発現へ向けての重要な工程である。この核シグナルの一過性の増加（主に免疫ブロッティングまたは免疫染色により測定される）は通常、IFN-γ処理後60分以内に生じる（14、15）。さらなるタンパク質も同様に核移行するかどうかを調査するために、本発明者らは、IFN-γで1時間誘発したヒトPBMC由来初代マクロファージを用いて、定量的核移行プロテオミクスを実施した。5つの時点（0、10、20、30、および60分）のIFN-γ刺激を受けた、3名の異なるPBMCドナー（ドナーA、B、およびC）由来の核ライセートを消化し、同重体タンデム質量タグ（TMT）で標識してから、質量分析を行った（図1A）。2名のドナーの時間経過実験を、各TMT 10-plex実験で組み合わせ、TMTバッチ効果による潜在的な技術的誤差を明らかにするためにドナーAは二連とした（図1A）。両方のTMT 10-plexセットから組み合わせたデータを検討して、全部で1086の異なるタンパク質を特定した。核の主要なタンパク質を集積したことを確認するために、対応する遺伝子識別子を3つの公開データセット:UniProt（16）、Uhlen et al.（17）、およびCOMPARTMENTS（18）に対し照会したところ、検出したタンパク質の50.1〜70.8%が核へと局在化することが公知であるか、核および他のオルガネラへと局在化するというアノテーションが付いていることが確認された（図1、1Bおよび1C）。この後者のアノテーションについて、本発明者らはこれらのタンパク質を核シャトリングタンパク質と呼ぶが、それはこれらが細胞の複数の区画に見られ、そしてIFN-γがこれらの核内蓄積を促進することができるためであり、このプロセスは動態実験によって観察することができる。
RSK1は、新規なIFN-γ誘発性核移行タンパク質である。
本発明者らの仮説は、IFN-γに応答して核移行するタンパク質は、ある時点（10、20、30、または60分）で明白なアバンダンスの増加を示し、60分に達する前に減少するか、そのまま持続する、というものである。タンパク質動態プロファイルを分類するために、本発明者らのチームが過去に発表した高次クラスター解析法（「方法」を参照）を実施した（19）。3名のドナーの動態データを組み合わせて単一のインプットとしてクラスタリングを行い（「方法」を参照）、41のクラスターを得た（図7A）。所与の時点のアバンダンスの増加そしてそれに続く減少により、またはアバンダンスの増加そしてそれに続いて60分まで持続するシグナルにより核移行を示すようなクラスターに着目した。たとえばSTAT1は、3名のドナーでわずかに異なる動態が観測されたため、3つの異なるクラスター（クラスター#8、#27、および#30）に出現した（図7A）。しかし、STAT1シグナルはドナーにかかわらず、10〜30分の間にピークとなった。したがって、STAT1対照に対する相対的なピークアバンダンスのタイミングによって、クラスターをグループA（10〜30分でピーク）とグループB（30〜60分でピーク）とに分けた（図7A）。
これら2つのクラスター群のタンパク質のリストから、3名のドナーすべてで動態傾向が似ているものをさらに精査し、増加した定量的観測値のプロファイルを含む、少なくとも5つのユニークな定量化されたタンパク質を選択し（20）、グループAからはSTAT1を含め11のタンパク質、そしてグループBは28のタンパク質とした（図7Aおよび7B）。次に、本発明者らはこれら39のタンパク質を、UniProtから抽出したアノテーションにより（図1C）、本発明者らが核シャトリングタンパク質として特徴決定したものについてクロスチェックした。この最終フィルタリング工程の結果、グループAからはRNAまたはDNA結合性タンパク質というアノテーションが付いたHNRNPK、HNRNPU、KHDRBS1、KHSRP、およびSTAT1の5つの候補タンパク質（図7Aおよび7B）、グループBからはEPS15L1、FAM98B、RPS6KA1、およびUSP48の4つのタンパク質をもたらし、これらはカドヘリン結合性（EPS15L1）、t-RNAプロセシング（FAM98B）、タンパク質キナーゼ活性（RPS6KA1）、およびユビキチンヒドロラーゼ活性（USP48）など、さまざまな分子機能を有するというアノテーションが付いている（図7Aおよび7B）。
本発明者らは、リボソームタンパク質S6キナーゼアルファ-1（RPS6KAI、RSK1としても知られる）（図1D）に特に興味をもったが、それは増殖因子刺激に応答してHeLa細胞の核に移行することがわかっているからである（21）。この移行が核内基質のリン酸化をもたらして、マイトジェン応答性遺伝子の転写が制御される（21、22）。本発明者らの核プロテオミクスによりIFN-γに応答してのRSK1の核移行が検出されたことを考えると、故にRSK1はマクロファージ活性化中に転写制御に関与するタンパク質もリン酸化する、という仮説を立てた。しかしRSK1は、その酵素ファミリー、RSK1、RSK2、RSK3、およびRSK4の4つのキナーゼのうちの一つにすぎず（図8）、このうちRSK2およびRSK3も増殖因子に応答して核移行することがわかっている（23、24）。RSK4は他のRSKアイソフォームと違って、主として細胞質ゾル性であり、かつ恒常的に活性である（25）。本発明者らはRSK1を本発明者らのプロテオミクスデータの中で検出しただけなので（図1D）、他の3つのキナーゼのアバンダンスが質量分析器では配列決定されないほど低かったことも考えられる。そこで、それらが実際にマクロファージ内で発現するかどうかを免疫ブロット分析を用いて調査した（図1E）。等しくロードした組換えRSK標準と比較して、無刺激マクロファージにおける4つの酵素の相対発現レベルを推定することができ、RSK3≒RSK2＜RSK1であり、RSK4はシグナルなしであった（図1E）。
RSK1核移行動態データの結果を確認するために（図1D）、ヒトPBMC由来マクロファージを用いて免疫蛍光染色を実施して、RSK1の核移行を視覚化した。RSK1シグナルは無刺激マクロファージでは細胞全体に拡散した（図1F）が、IFN-γ刺激の30分後、強いRSK1シグナルが核内で検出された（図1Fおよび1G）。ヒトマクロファージの核ライセートの抗RSK1免疫ブロット分析でも、1人のドナーは20〜30分で、2人目のドナーは10分までに、RSK1のIFN-γ誘発性核移行が確認された（図1H）。プロテオミクスおよび免疫ベースの多重検出法により、RSK1がIFN-γ刺激に応答して核移行することを確認した。この移行の厳密なタイミングはドナー間で異なり得るが、刺激から60分以内に生じることを一貫して観測している。
ネットワーク解析は、RSK1をヒト炎症性疾患と結び付ける。
プロテオミクスおよび免疫ブロット分析は、4つのRSK酵素のうちRSK1が、ヒト初代マクロファージにおいて優勢であることを示す（図1D）。そこで、RSK活性がマクロファージ活性化に寄与するとすれば、それは最もアバンダントなRSK1を通して生じるはず、という仮説を立てた。配列アラインメントによると、4つの酵素の配列同一性は79.7〜81.0%（>594配列同一性）であり、RSK2とRSK3とは互いに最も似ているが、RSK4は他の3酵素と比べて最も保存的でない（図8）。配列保存度の相違は機能の相違を示唆し、酵素活性そのものとは関係ないが（活性部位は保存されているため、図8）、シグナリング経路および分子相互作用と関係がある。この推測に基づき、各RSK酵素についてネットワーク解析を実施して、それらの可能性のある分子間相互作用因子、およびさまざまなヒト疾患との関与の可能性を決定した。
最近の証拠から、疾患関連タンパク質は、分子相互作用ネットワークつまりインタラクトーム内で局在化して、疾患モジュールと呼ばれる密に相互作用するサブネットワークを形成する傾向があることが示唆される（26）。さらに、インタラクトームでの疾患の位置は、他の疾患との病態生物学的関係を決定付ける（27、28）。本発明者らは、RSKファミリーのタンパク質と、さまざまなマクロファージ活性化関連疾患、たとえば心血管、自己免疫、および代謝性障害との関連を明らかにしようと考えた。RSK相互作用パートナーと疾患モジュールとのネットワーク近接性に基づき（「方法」を参照）、RSK1-第1隣接モジュールが、多くの自己免疫、心血管、および代謝性疾患と有意に近接していることを突き止めた（図2および図9）。さらに、RSK2モジュールおよびRSK3モジュールは、疾患関連性をRSK1と共有している（図2）。しかしRSK2およびRSK3は、関連するヒト疾患遺伝子モジュールがRSK1よりも少ない傾向がある。RSK4モジュールは、本発明者らが試験したどの疾患とも有意な関連を示さなかった（図2および図9）。これらの結果は、ヒト炎症性疾患に対し、RSKファミリーのタンパク質のなかでRSK1が最も大きい影響を有することを予測し得る。
RSK1は、IFN-γ刺激マクロファージにおいてJAKシグナリングにより活性化する。
過去の研究によれば、RSK1の酵素活性は、複数のリン酸化部位の状態により制御される（29）。上皮増殖因子（EGF）シグナリングにおけるRSK1活性化に関し、Ser221、Thr359、Ser380、Thr573、およびSer732という5つものリン酸化部位が報告されている（図8）。そこで、PMBC由来ヒト初代マクロファージにおいて、炎症促進性シグナリングがRSK1のリン酸化状態に影響するかどうかを調査した。ヒトマクロファージをIFN-γで30分および60分刺激してから、抗RSK1抗体を用いて免疫沈降させ、続いてこれらの5つのリン酸化部位の免疫ブロット分析を行った（図10A）。無刺激マクロファージと比べて、IFN-γ処理から30〜60分でホスホ-RSK1-Ser380のシグナルが増加したが、Ser221およびSer732のリン酸化は変化がなかった。Thr359およびThr573のリン酸化のシグナルは低すぎて、比較を実施できなかった（図10A）。これらのデータは、RSK1が、炎症促進性活性化マクロファージにおいて、Ser380リン酸化を通して活性化することを示している。さらに、免疫蛍光染色は、IFN-γに応答してマクロファージの細胞質でSer380リン酸化が主に増加したことを明らかにした（図10B）。RSK1活性化がJAKシグナリングにより制御されるかどうかをさらに明らかにするために、ヒトマクロファージをDMSOまたは汎JAK阻害剤ピリドン-6で処理してから、IFN-γで最高90分刺激した。IFN-γだけだと、ホスホ-RSK1-Ser380シグナルは早くも10分で増加したが、60分時点で最も劇的に増加した（図3A）。JAKシグナリングのピリドン-6媒介性の阻害は、ホスホ-RSK1-Ser380シグナルを顕著に抑制する結果となった（図3A）。ピリジン-6に対するこの応答は、対応する細胞ライセートで確認したホスホ-STAT-Ser727の応答と似ている（図3A）。これらの結果は、マクロファージにおいてJAKシグナリングがRSK1のIFN-γ誘発性活性化を媒介することを示している。
RSK1阻害は、IFN-γ刺激マクロファージにおいてSTAT1のSer727におけるリン酸化を低下させる。
これまで、本発明者らのデータは、RSK1が、STAT1と同様に、JAKシグナリングの下流標的であることを裏付けている（図3A）。核内でSTAT1のSer727においてリン酸化が生じ、そのことがその活性にとって重要であること（30）、そしてRSK1が核移行することを前提として、STAT1が核内RSK1の基質である、という仮説を立てた。組換えRSK1をSTAT1とともに、またはSTAT1なしで、ATPの存在下、1時間インキュベートした。免疫ブロット分析により、RSK1がインビトロでSTAT1をSer727においてリン酸化できることが確認された（図11A）。
RSK1が内因性STAT1のSer727におけるリン酸化を誘発するかどうかを査定するために、ヒトPBMC由来マクロファージに対照siRNAまたはRSK1 siRNAをトランスフェクトし、続いてIFN-γに曝露した。siRNA対照では、IFN-γ刺激から10分時点でホスホ-STAT1-Tyr701シグナルが観測され、そして60分時点で減少したが、基本のホスホ-STAT1-Ser727の増加は10分時点で観測され、そして60分時点でさらに増加し（図3B）、過去に報告されたSTAT1リン酸化の力学の2つの波と一致した（12）。RSK1のサイレンシングはホスホ-STAT1-Ser727シグナルを減衰させたが、ホスホ-STAT1-Tyr701シグナルは減衰せず（図3B）、RSK1がこのSTAT1リン酸化の2つ目の波に寄与していることが示された。
siRNAに加えてRSK阻害剤BI-D1870（31）も用いて、IFN-γ刺激から60分時点のSTAT1のTyr701およびSer727におけるリン酸化状態を観察した。ヒト初代マクロファージをDMSO（対照）またはBI-D1870で処理し、ホスホ-STAT1-Ser727のシグナルの減衰、およびホスホ-STAT-Tyr701のシグナルに変化がないことを確認した（図3Cおよび3D）。マクロファージにおけるRSK媒介性ホスホ-STAT1-Ser727をさらに立証するために、対照IgGまたは抗STAT1-pSer727を用いて細胞ライセートの免疫沈降を、続いて質量分析を、実施した（図3E）。抗チューブリンブロットにより、細胞ライセートタンパク質のインプットを抗体に等しくロードしたことを確認した（図3E）。免疫沈降後、BI-D1870条件でIFN-γのみ（プラスDMSO）よりも少ないSTAT1-pSer727を回収し、3つのEThcDフラグメントイオン（y122+、b8+、およびc12+）の並列反応モニタリング（PRM）によって、pSer727の部位特異的なシグナル減少を確認した（図3Fおよび図11b）。
このように、2つの独立した方法（RSK1 siRNAおよびBI-D1870）により、RSK1がホスホ-STAT1-Ser727のレベルに寄与することが裏付けられ、RSK1がマクロファージにおいてSTAT1リン酸化を通して炎症促進性シグナリング事象を誘発できることを示している。
RSK1は、マクロファージ活性化中に炎症性ケモカインの分泌を促進する。
RSK1がSTAT1シグナリングを通してマクロファージを活性化できることを実証するために、RSK1のサイレンシングがIFN-γ誘発性ケモカインmRNAの転写を減じるかどうかを調査した。ヒト初代マクロファージを対照siRNAまたはRSK1 siRNAで処理してから、IFN-γで最高24時間刺激した。曲線下面積グラフが示すように（図4B）、IFN-γは炎症促進性ケモカインCCL2/MCP-1、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、およびCXCL11/I-TACの発現を増加させ、そしてRSK1のサイレンシングは、IFN-γ刺激期間中、それらの全発現レベルを減少させた（図4Aおよび図12）。転写因子STAT1およびIRF1（32、33）；酵素GBP1、PARP14、およびPARP9（32〜34）、ならびに膜タンパク質TAP1およびFCGR1B（32）をコードするものなど、他の既知のIFN-γ誘導遺伝子の発現も観察した。しかしRSK1のサイレンシングはこれらのmRNAレベルのどれにも効果がなかった（図4Aおよび4Bならびに図12）。したがって、RSK1は、IFN-γ刺激に応答して特定の一組の分子の誘発を選択的に媒介し得る。
siRNAデータをさらに立証するために、ヒト初代マクロファージをBI-D1870で処理してから、IFN-γで刺激した。DMSO条件と比べて、BI-D1870は、CCL2/MCP-1などの炎症促進性ケモカインのmRNAレベルを減衰させた（図4Cおよび図13）。このmRNAの減少により、分泌されるケモカインも減少する結果となった。IFN-γはCCL2/MCP-1、CCL7/MCP-3、CCL8/MPC-2、CXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、およびCXCL11/I-TACのヒトマクロファージ培養培地への放出を誘発したが、RSK1のサイレンシングによってそれが阻害された（図4Dおよび図14）。まとめると、これらのデータは、IFN-γが引き起こすマクロファージ活性化において、RSK1がCCL2/MCP-1などの主要なケモカインの分泌の増加を媒介することを示している。
RSKは、マウスの腹膜炎において、マクロファージの活性化に主要な役割を果たす。
RSK1などのRSKアイソフォームがインビボでマクロファージ活性化を促進するかどうかを判定するために、本発明者らは、チオグリコラートで誘発した腹膜炎のマウスモデルおよびBI-D1870を用いた。マウスにビヒクルまたは30 mg/kg BI-D1870を腹腔内注射し、続いてチオグリコラートで腹膜炎を誘発した（図5A）。チオグリコラート注射の24時間後、マウスから腹腔内細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いて活性化マクロファージ集団（CD45+ CD11b+ F4/80+ CD86+ 細胞）を測定した（図5Aおよび5B）。BI-D1870は、全マクロファージに対する活性化マクロファージの比率および活性化マクロファージの腹腔内の蓄積を抑制した（図5Cおよび5D）。
ホスホプロテオミクスおよびネットワーク解析は、RSK媒介性リン酸化をヒト炎症性疾患と結び付ける。
RSKファミリーのキナーゼは、コンセンサスRXXS/Tモチーフのセリンまたはスレオニンのリン酸化を優先するが（図8）、これらのキナーゼはコンセンサスモチーフ以外の配列もリン酸化できる（たとえばSTAT1のLPMpS727（図3）、YB-1のYLRpS102、RRN3/TIF-1AのMQPpS649、およびATP4のPNRpS245（35））。炎症促進性活性化マクロファージにおける追加の候補RSK基質を介したリン酸化シグナリング事象を探るために、一般に記述されるRXXS/Tコンセンサスの全細胞内リン酸化状態の特徴を調べることに着目した（図6A）（35）。したがって、抗RXXpS/T抗体ベースの集積ストラテジーを用いてホスホプロテオミクスを実施した（36）。4名のドナーのヒトPBMC由来マクロファージをDMSOまたは汎RSK阻害剤BI-D1870で処理してから、IFN-γ処理を行った。ホスホペプチド集積のための最小限のタンパク質インプット（8.0 mg）を達成するために、4名のドナーのマクロファージ細胞ライセートのプールが必要であった。そこでまず、ドナーらがIFN-γ処理に応答して類似のリン酸化パターンを示したかどうかを検証した。抗RXXpS/Tを用いた免疫ブロット分析から、IFN-γに応答してのドナー同士の類似のバンド形成パターン（図15A）、およびBI-D1870処理に応答しての同様のシグナル強度の減少が明らかになった（図15A）。
組み合わせたドナー試料で、4つの免疫沈降（IP）実験を実施した：1および2の無刺激マクロファージは、IgGまたは抗RXXpS/Tを用いて免疫沈降；3および4のIFN-γ刺激マクロファージプラス／マイナスBI-D1870は、抗RXXpS/Tを用いて免疫沈降（図15B）。58のタンパク質に対応する高信頼度の98のホスホペプチドを特定し、そのうち54がRXXpS/Tモチーフを含有していた（図15Bおよび15C）。ホスホペプチドのおよそ半分（53%）が、3つの抗RXXpS/T IPすべてに共通していた（図15B）。フィルタリングストラテジーを用いて、IgG対照により決定される非特異的ヒットを除去し、BI-DI1870処理により減少した24のIFN-γ誘発性ホスホタンパク質を特定し、これには既知のRSK1-基質、たとえばRPS6（リボソームタンパク質S6）（37）、およびEIF4B（真核生物翻訳開始因子4B）（38）が含まれた（図15Cおよび表3）。また、キナーゼ相互作用タンパク質（AKT1S1/PRAS40（AKT1基質-1）；AKAP13（A-キナーゼアンカータンパク質13）；STK11IP（セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ11相互作用タンパク質））に由来するホスホペプチドもBI-D1870処理によって減少しており（図15Cおよび表3）、マクロファージの炎症促進性活性化におけるRSKキナーゼと他のキナーゼ（たとえばPKA／タンパク質キナーゼAとAKT／タンパク質キナーゼB）のシグナル経路のクロストークが示唆される。IFN-γとRSK阻害条件とのリン酸化状態の変化を立証するために、もとのリン酸プロテオミクス実験の4名のドナーのうち2名を用いて、RPS6-pSer235/236、およびたとえばPRAS40-pThr246の免疫ブロット分析を実施し、質量分析によって、検出された変化を確認した（図6B）。
RSK1第1隣接モジュールとヒト疾患モジュールとのネットワーク近接性（図2）に加えて、RSK基質モジュールとヒト疾患モジュールとのネットワーク近接性をさらに測定して、RSK関連障害を選別した。RSK基質が、自己免疫疾患および心血管疾患を含む試験したいくつかの炎症性疾患と有意に近いことを突き止めた（図6Cおよび図16）。これらの結果は、炎症促進性活性化マクロファージにおける基質のRSK媒介性リン酸化が、ヒト炎症性疾患と結び付くことを示す。
考察
この研究は、RSK1がヒトマクロファージのIFN-γ誘発性の炎症促進性活性化を媒介する主要な核シャトリング酵素であることを、以下の新規な知見に基づき実証している:1）RSK1は、ヒト初代マクロファージ核プロテオミクスにより特定した9つの核移行タンパク質候補に含まれる；2）タンパク質-タンパク質相互作用データベースを用いたネットワーク解析の予測では、RSK1は、複数のヒト炎症性疾患と密接に関連している；3）ヒト初代マクロファージにおいて、IFN-γ刺激は、JAKシグナリングを介してホスホ-RSK1 Ser380を増加させる；4）IFN-γによるRSK1リン酸化は、STAT1のSer727におけるリン酸化をもたらす；6）RSK1は、マクロファージによるCCL2/MCP-1などの炎症促進性ケモカインのIFN-γ誘発性の産生を媒介する；7）阻害剤BI-D1870によるRSKの抑制は、マウスにおいて腹腔内マクロファージの活性化を抑制する；および8）ホスホプロテオミクスにより、IFN-γ刺激マクロファージにおける新規なRSK基質の候補として22のタンパク質が特定された。こうした証拠は、RSK1がJAK-STAT経路に媒介される炎症促進性M（IFN-γ）マクロファージ活性化の主要キナーゼとして機能するという新セオリーを示している（図S17の概略図を参照）。
本発明者らは、核細胞質間を往復するタンパク質が核内でさまざまな細胞応答を制御することを裏付ける数通りの証拠（39〜43）に基づき、IFN-γ誘発性の制御因子の核移行が、マクロファージをM（IFN-γ）表現型へと方向付ける主要な役割を果たす、と仮定した。しかし、炎症促進性マクロファージ活性化に関わる核シャトリングタンパク質はほとんど知られていない。本研究では、M（IFN-γ）マクロファージ活性化に関する主要な核シャトリング酵素の特定を目指した。そのために、ヒト初代マクロファージの核ライセートを用いた質量分析ベースのプロテオミクスアプローチを採用した。それは、炎症促進性活性化中のマクロファージの核内の変化を観察するのに、定量的プロテオミクスが適しているためである。スクリーニングの結果、RSK1をM（IFN-γ）マクロファージ活性化の主要核シャトリング酵素として特定した。
RSKセリン／スレオニンキナーゼファミリーは、RSK1、RSK2、RSK3、およびRSK4の4つのアイソフォームからなり、転写、翻訳、細胞周期制御、および細胞生存などのさまざまな細胞プロセスを制御する（29、35、44）。RSKアイソフォームは高度な配列相同性を示すが、益々多くの証拠が、RSKアイソフォーム同士の特に癌細胞における機能的相違を裏付けている（35、45）。RSK1、RSK2、およびRSK3の3つのRSKアイソフォームは、マイトジェン刺激に応答して細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）シグナリングの下流エフェクターとして機能するが、RSK4はその恒常的活性化のゆえに、血清飢餓細胞においてもERKシグナリングに影響されない（25、37、46）。数種の腫瘍細胞では、RSK1およびRSK2は、腫瘍の悪化、浸潤、および遊走に寄与する（47〜49）。したがって、RSK1およびRSK2は、癌療法の有望な分子標的候補と考えられる（44、50）。これに対し、RSK3およびRSK4は、腫瘍抑制因子として作用することがわかっている（51〜53）。RSKアイソフォームの生物学的重要性にもかかわらず、RSKが媒介するさらなる生物学的プロセスに着目した研究はほとんどない。また、RSKファミリーメンバーの機能性は、細胞種および細胞環境に依存し得る。本発明者らの知見は、炎症促進性マクロファージ活性化におけるRSK1の新たな役割に光を当てるものである。
IFN-γ刺激と同様に、EGFへの曝露によっても、細胞質でRSK1の活性化が、続いて核移行が生じる（35）。RSK1のSer221におけるリン酸化は、EGF刺激による核指向の誘発に必須である（54）。一方本発明者らは、ヒト初代マクロファージにおいて、特に刺激がなくてもSer221が強力にリン酸化されることを示した（図10A）。この知見を前提として、RSK1のIFN-γ誘発性の核移行は、他の翻訳後修飾を含めた種々の分子機構により引き起こされると考えられるが、それはまだ明らかではない。したがって、この問題に取り組むさらなる研究が必要である。
本発明者らの知見はまた、RSK1が、ヒト初代マクロファージにおいてIFN-γ誘発性のSTAT1のSer727におけるリン酸化を担っていることを示している。Ser727リン酸化は、STAT1の最大限の活性化に必須であり、IFN-γ誘発性マクロファージ活性化に寄与する（30、55）。Ser727がAlaに変異しているS727A変異体は、STAT1標的遺伝子に及ぼす影響が異なり、Ser727リン酸化もSTAT1トランス活性化の選択性を制御していることが示される（55、56）。この文脈で、Ser727キナーゼは、IFN-γに応答してSTAT1活性化を誘発する他、STAT1標的遺伝子を別途促進することができた。この概念と一致して、RSK1のサイレンシングは、炎症促進性ケモカインなどのSTAT1標的遺伝子、たとえばCCL2の特定の部分を抑制し、ヒトマクロファージにおいてRSK1が媒介するSer727のリン酸化が、STAT1標的遺伝子のトランス活性化を選択的に誘発することを示した（図4、図13）。また、IFN-γ誘発性のSer727リン酸化にはSTAT1の核移行が必要であり（12）、Ser727キナーゼがSTAT1を核内でリン酸化することを示している。RSK1がIFN-γに応答して核移行するという本発明者らの知見に関して、RSK1は、炎症促進性活性化マクロファージにおいて核移行した後にSTAT1をSer727においてリン酸化するようである。
まとめると、本発明者らは、RSK1が核移行してヒト初代マクロファージを炎症促進性表現型へとシフトさせる主要キナーゼの役割を果たすことを実証している。本発明者らはまた、RSK1がSer727リン酸化を通してSTAT1の転写活性および標的選択性を制御して、IFN-γ刺激マクロファージにおける炎症促進性ケモカインの分泌を促進する、新規な機構を提示している。この研究は、RSK1が媒介するマクロファージの炎症促進性活性化の分子的基盤についての新たな見識を提供しており、それはマクロファージ媒介性炎症性疾患をもつ患者の有効療法を設計するための最初のステップである。
実施例2
材料および方法
ヒトPBMC由来初代マクロファージの細胞培養。リンパ球分離培地（MP Biomedicals）をメーカーの指示どおりに用いて、バフィーコートからヒトPBMCを単離した。PBMCを、RPMI-1640中、血清なしで1時間インキュベートし、Hanks' Balanced Salt Solutionで洗浄し、そして5% ヒト血清（Gemini Bio-Products）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むRPMI-1640中で培養した。10日間分化させた後、細胞をヒトPBMC由来マクロファージとして用いた。細胞は、5% CO2中37℃で維持した。細胞をIFN-γ（R&D Systems）、DMSO（Sigma-Aldrich）、BI-D1870（RSK阻害剤II; EMD Millipore）、またはピリドン-6（JAK阻害剤I; EMD Millipore）で処理した。
細胞成分分画。ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit（EMD Millipore）をメーカーの指示どおりに用いて、ヒトマクロファージの核ライセートを得た。画分の純度は、免疫ブロット分析により観察した（以下を参照）。
タンデム質量タグ（TMT）試料の調製。3名のドナー（ドナーA、#44383；ドナーB、#44442；ドナーC、#44400）から得たヒトPBMC由来マクロファージを、IFN-γで0、10、20、30、または60分刺激した。各条件の核画分をProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit（EMD Millipore）を用いて単離し、以前に詳述されている溶液中尿素ストラテジー（34）を用いてタンパク質分解した（Lys-C、Wako Chemicals）。ペプチドをTMT 10-plex試薬（Pierce）で標識した。以下のように、2組の実行にレポーターイオンチャネルを付与した：1回目の実行は、126（IFN-γ0分、ドナーA）、127N（IFN-γ10分、ドナーA）、128N（IFN-γ20分、ドナーA）、129N（IFN-γ30分、ドナーA）、130N（IFN-γ60分、ドナーA）、127C（IFN-γ60分、ドナーB）、128C（IFN-γ30分、ドナーB）、129C（IFN-γ20分、ドナーB）、130C（IFN-γ10分、ドナーB）、および131（IFN-γ0分、ドナーB）；2回目の実行は、126（IFN-γ0分、ドナーA）、127N（IFN-γ10分、ドナーA）、128N（IFN-γ20分、ドナーA）、129N（IFN-γ30分、ドナーA）、130N（IFN-γ60分、ドナーA）、127C（IFN-γ60分、ドナーC）、128C（IFN-γ30分、ドナーC）、129C（IFN-γ20分、ドナーC）、130C（IFN-γ10分、ドナーC）、および131（IFN-γ0分、ドナーC）。標識されたペプチドを組み合わせ、Oasis Hlb 1 ccカラム（Waters）を用いて脱塩した。次いでこれらのペプチドを、それぞれの等電点電気泳動ポイント（pHは3〜10の範囲）に基づき、OFF-gelシステム（Agilent）を用いて24画分へと分画した。これらの画分を卓上高速減圧器を用いて乾燥させ、Oasisカラムで洗浄し、40 μlの5% アセトニトリルおよび0.5% ギ酸に再懸濁し、続いて液体クロマトグラフィー／質量分析（LC/MS）を行った。
ホスホプロテオミクス。以前の記載（36）に軽微な変更を加えて、細胞ライセートからホスホペプチドの免疫親和性精製を実施した。ヒトPBMC由来マクロファージをDMSOまたはBI-D1870で前処理してから、IFN-γで刺激した。細胞ライセート（8.0 mg）を、以前に詳述されている溶液中尿素ストラテジー（34）を用いてタンパク質分解した（Lys-C、Wako Chemicals）。タンパク質消化物にトリフルオロ酢酸（TFA）を終濃度1%となるよう添加し、沈殿物を遠心法により除去し、消化物をSep-Pak C18カラム（Waters）にロードし、0.1% TFAで平衡化した。カラムを0.1% TFAおよび洗浄バッファー（0.1% TFA、5% アセトニトリル）で洗浄した。溶離バッファー（0.1% TFA、40% アセトニトリル）での溶出によりペプチド画分を得た。このペプチド溶出液を一晩かけて凍結し、凍結ペプチド溶液を2日かけて凍結乾燥させた。ペプチドを1.4 mLのIAPバッファー（Cell signaling Technology）に溶解させた。不溶性物質を遠心法により除去した。PBS洗浄したホスホ-Akt基質（RXXS*/T*）（110B7E）ウサギmAb（Sepharose Bead Conjugate）（#9646;Cell Signaling Technology）をペプチド溶液に添加し、4℃で2時間インキュベートした。固定された抗体ビーズを1 ml IAPバッファーで3回、そして1 ml 水で3回、すべて4℃で洗浄した。ペプチドを、55 μlの0.15% TFAとともに室温で10分間インキュベートしてビーズから溶出し（溶出液1）、続いて50 μlの0.15% TFAでビーズを1回洗浄した（溶出液2）。両方の溶出液を組み合わせた。このペプチド溶液を、Oasis Hlb 1 ccカラム（Waters）を用いて脱塩し、SpeedVacで乾燥させ、トリプシン溶液に再懸濁して、一晩消化した。Oasis Hlb 1 ccカラムを用いての脱塩後、ペプチドをSpeedVacで乾燥させ、40 μlの5% アセトニトリルおよび0.5% ギ酸に再懸濁し、続いて液体クロマトグラフィー／質量分析（LC/MS）を行った。RXXS*/T*モチーフ内にリン酸化を有するRSK基質を特定するために、4つの基準に基づきフィルタリングした：（1）検出されるリン酸化部位がモチーフ内で見つかること、（2）対照IgGを用いたIPのシグナル強度に対する抗RXXS*/T*モチーフを用いたIPのシグナル強度の比が1.00よりも高いこと、（3）無刺激細胞のシグナル強度に対するIFN-γ刺激細胞のシグナル強度の比が1.00よりも高いこと、（4）IFN-γマイナスBI-D1870のシグナル強度に対するIFN-γプラスBI-D1870のシグナル強度の比が1.00よりも高いこと。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）。TMT研究 - 高分解能／高確度のQ Exactive質量分析器の前面にNanospray FLEXイオン源を取り付け、Easy-nLC1000 HPLCポンプ（Thermo Scientific）に連結して、TMTペプチド試料の分析に用いた。分析グラジエントは、300 nl/分で、5〜18%の溶媒B（アセトニトリル／0.1% ギ酸）を120分とし、続いて95%の溶媒Bを5分とした。溶媒Aは0.1%ギ酸であった。プリカーサースキャンを分解能140 Kに設定し、上位10個のプリカーサーイオン（スキャン範囲380〜2000 m/z以内）を高エネルギー（higher energy）衝突誘起解離（HCD、衝突エネルギー30%、単離幅3.0 m/z、ダイナミックエクスクルージョンを有効にし、開始時m/zを120 m/zに固定し、分解能を35 Kに設定）に供して、ペプチド配列決定（MS/MS）を行った。
ホスホプロテオミクス - ホスホペプチドを、（Easy-Sprayイオン源およびEasy-nLC1000 HPLCポンプを備えた）Orbitrap Fusion Lumosで、電子移動／高エネルギー衝突解離（EThcD）により分析し、ホスホペプチドの配列を決定した。グラジエント流量は、300 nl/分で、5〜21%の溶媒B（アセトニトリル／0.1%ギ酸）を80分、21〜30%の溶媒Bを10分とし、続いて95%の溶媒Bを5分とした。溶媒Aは0.1% ギ酸であった。各ペプチド試料を4回分析した：フルスキャン範囲350〜1800 m/z、およびホスホペプチドシグナルを増加させるため350〜500 m/z、500〜700 m/z、700〜1200 m/zの3気相分離スキャン。MS/MSは、較正電荷依存ETDパラメーターを有効にし、HCD衝突エネルギー30%、分解能を60 Kに設定して、取得した。MS/MSは、電荷状態がより高く、m/zがより低いペプチドを優先した。
抗STAT1-pSer727 IP - Ser727リン酸化を有するSTAT1ペプチドをOrbitrap Fusion Lumosで検出した。グラジエント流量を、300 nL/分で、5〜21%の溶媒B（アセトニトリル／0.1% ギ酸）を80分、21〜30%の溶媒Bを10分とし、続いて95%の溶媒Bを5分とした。溶媒Aは0.1% ギ酸であった。標的のリン酸化STAT1ペプチドLQTTDNLLPmsPEEFDEVSR（m10-酸化、s11-リン酸化、806.3575 m/z、z=3）をEThcD（較正電荷依存ETDパラメーターを有効にし、HCD衝突エネルギー30%、分解能を500 kに設定）に供してMS/MSを行った。
LC-MS/MSデータ分析。TMT研究 - MS/MSデータを、Proteome Discoverer version 2.1 （PD2.1、Thermo Scientific）により、SEQUEST検索アルゴリズムを用いて、MS1検索空間の10 ppmのトレランスウィンドウ、およびHCDの0.02 Daのフラグメント・トレランスウィンドウを用いて、ヒトUniProtデータベース（2014年8月1日にダウンロード）に対し照会した。メチオニン酸化を可変修飾として設定し、システイン残基のカルバミドメチル化および10-plex TMTタグ（Thermo Scientific）を固定修飾として設定した。ペプチド偽発見率（FDR）を、PDが提供するパーコレーターで計算し、逆、デコイヒトデータベースに対し検索した場合のMS/MSスペクトルのヒット数に基づき決定した。ペプチドを、1% FDRに基づきフィルタリングした。所与のタンパク質群に割り当てられた、かつ他のどのタンパク質群にも存在しないペプチドを、ユニークとみなした。したがって、各タンパク質群は、1つのマスタータンパク質に代表される（PD Grouping特徴）。2つ以上のユニークペプチドを有するマスタータンパク質を、TMTレポーター比の定量化に用いた。正規化されたレポーターイオンの強度をPD2.1からエクスポートした。分析は以下のとおりである。
ホスホプロテオミクスおよびキナーゼアッセイ。MS/MSデータを、上記のようにして、MS1検索空間の10 ppmのトレランスウィンドウ、およびEThcDまたはHCDの0.02 Daのフラグメント・トレランスウィンドウを用いて照会した。メチオニン酸化ならびにセリンおよびスレオニンのリン酸化を可変修飾として設定し、システイン残基のカルバミドメチル化を固定修飾として設定した。高信頼度で割り当てられたホスホペプチドを、プリカーサーイオン曲線下面積（AUC）定量化に用いた。IgG条件で検出されたペプチドは、非特異的シグナルとみなされ、除外された。正規化されたプリカーサーイオン強度をPD2.1からエクスポートした。
抗STAT1-pSer727 IP - SEQUESTによりアノテーションを付された標的ペプチド（LQTTDNLLPmsPEEFDEVSR（SEQ ID NO:5）- m10-酸化、s11-リン酸化、806.3575 m/z、z = 3）の3つの最もアバンダントなフラグメントイオン（PD2.1）を定量化に用いた：y122+, 759.79455 m/z; c12+, 1424.64911 m/z; b8+, 899.48327 m/z。各フラグメントのAUCを、Skylineソフトウェア（https://skyline.gs.washington.edu）を用いて計算した。
多重クラスター解析。本発明者らが発表したソフトウェア、XINA（19）を用いて、正規化したTMTイオン強度の高次元クラスタリングを行った。本発明者らの方法は標準的なクラスタリング法と一線を画し、複数のデータセット（たとえば2つのTMT 10-plex実験）から取得した動態データを、複数の実験にわたるソースおよび変動範囲（IFN-γに対する応答）は類似しており、3名のドナーの動態は類似している、という想定で、1つのインプットファイルにまとめてクラスタリングする（19）。この多重アプローチの価値としては、1組のクラスターの簡略化されたアウトプット、および1つのタンパク質のさまざまな条件でのふるまい（この場合は3名のドナーのIFN-γに対する核内応答）を観察できること、が挙げられる。この研究では、3つの独立した核移行データセット：ドナーA（2つのTMT 10-plex反復データの平均）、ドナーB、およびドナーCの5つの時点の動態を組み合わせ、続いてクラスタリングを行った。本発明者らは、‘mclust’ R packageを用いるモデルベースのクラスタリング解析を実行し、組み合わせたデータの多様性（ドナーおよびIFN-γ応答）を説明する41クラスターを得た（図7A）。
免疫ブロット分析および免疫沈降。細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファー（20 mM Tris-HCl、pH 7.5;150 mM NaCl；1 mM Na2EDTA；1 mM EGTA；1% Triton；2.5 mM ピロリン酸ナトリウム；1 mM ベータ-グリセロホスファート；1 mM Na3VO4；1 μg/ml ロイペプチン）（Roche）に懸濁した。遠心機にかけた後、上清を単離し、全細胞ライセートとして用いた。免疫沈降のために、細胞ライセートを通常のIgGまたは抗RSK1とともに2時間インキュベートしてから、プロテインAアガロースビーズ（Cell Signal Technology）とともに4℃で1時間インキュベートした。ビーズを溶解バッファーで洗浄し、溶解バッファーに再懸濁した。全細胞ライセートおよび細胞内画分、ならびに免疫沈降タンパク質を試料バッファーとともに5分間煮沸し、SDS-PAGEにより分離させ、ニトロセルロース膜に移した。膜を0.05% Tween 20含有TBS（TBS-T）中2.5% 脱脂乳でブロックし、抗RSK1（#sc-231; Santa Cruz Biotechnology）、抗RSK1（#8408; Cell Signal Technology）、抗RSK2（#sc-9986; Santa Cruz Biotechnology）、抗RSK3（#sc-1431; Santa Cruz Biotechnology）、抗RSK4（sc-100424; Santa Cruz Biotechnology）、抗STAT1（#610115; BD Biosciences）、抗ラミンA/C（#39287、Active Motif）、抗ホスホ-RSK1-Ser221（#AF892; R&D systems）、抗ホスホ-RSK1-Thr359（#8753; Cell Signaling Technology）、抗ホスホ-RSK1-Ser380（#11989; Cell Signaling Technology）、抗ホスホ-RSK1-Thr573（#9346; Cell Signaling Technology）、抗ホスホ-RSK1-Ser732（#600-401-B30S; Rockland）、抗ホスホ-STAT1-Ser727（#8826; Cell Signaling Technology）、抗ホスホ-STAT1-Tyr701（#9167; Cell Signaling Technology）、抗チューブリン（#T5168; Sigma-Ardrich）、抗ホスホ-RPS6-Ser235/236（#A300-584A; Bethyl Laboratories）、抗RPS6（#A300-556A; Bethyl Laboratories）、抗ホスホ-PRAS40-Thr246（#13175; Cell Signaling Technology）、または抗PRAS40（#2691; Cell Signaling Technology）とともにインキュベートした。次いで膜をTBS-Tで洗浄し、ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗ウサギIgG（Fisher Scientific）またはペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗マウスIgG（Fisher Scientific）とともにインキュベートし、TBS-Tで洗浄した。免疫複合体をSuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Thermo Fisher Scientific）を用いて可視化した。ImageQuant Las 4000（GE Healthcare）でデジタル画像データを取得した。
SYPRO Ruby染色およびゲル内タンパク質分解。SYPRO Ruby Protein Gel Stain（Thermo Fisher Science）をメーカーの指示どおりに用いて、ゲル染色を実施した。SDS-PAGE後、ゲルを固定液（50% メタノール、7% 酢酸）中に30分、2回置いた。ゲルをSYPRO Ruby Gel Stainで一晩かけて染色した。ゲルを洗浄液（10% メタノール、7% 酢酸）とともに30分インキュベートしてから、水で3回、5分すすいだ。ImageQuant Las 4000で、染色されたゲルのデジタル画像を取得した。STAT1の予想分子量に対応する顕著なバンドをゲル内トリプシン化のために切り取った（57）。ペプチドを試料ローディングバッファー（0.1% ギ酸、5% アセトニトリル）に溶解させ、続いて質量分析を行った。
免疫蛍光アッセイ。チャンバースライドで培養した細胞を、4% パラホルムアルデヒド中15分固定し、0.5% Triton X-100中15分かけて透過性とし、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、PBS食塩水中10% ヤギ血清を用いて30分ブロックした。PBSで洗浄後、細胞を抗RSK1（#sc-231; Santa Cruz）を用いて免疫染色してから、Alexa Fluor 498-コンジュゲート二次抗体と反応させた。核を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（Vector Laboratories）で染色した。Eclipse 80i蛍光顕微鏡（Nikon）で画像を取得した。
ネットワーク解析。RSKファミリーのタンパク質とヒト疾患との関連を代理するものとして、RSKモジュールと疾患関連タンパク質との平均最短ネットワーク距離を測定した。ここでネットワーク距離は、2つのノード間の辺の数として測定される非ユークリッド距離と定義される。RSKモジュールは、RSKファミリー遺伝子とその第1隣接、すなわちインタラクトーム上の直接相互作用パートナーとからなるサブグラフと定義される。あるRSKモジュールから諸疾患遺伝子までの平均最短距離Dは、各RSKモジュール遺伝子sからある疾患のすべての遺伝子tまでの最短距離を計算し、そしてすべてのRSKモジュール遺伝子sで平均して、st間の最短距離とすることで測定され、SおよびTはそれぞれRSK第1隣接モジュールの遺伝子セットおよび疾患遺伝子である。平均最短距離の値を確率期待値と比較するために、同数の無作為に選択した遺伝子から疾患遺伝子までの平均最短距離を実現値N=100で計算した。次数（すなわち、ある遺伝子の連結の数）をコントロールするために、次数を保持して無作為選択を行い、すべての遺伝子をそれらの次数に応じてビンに分け、それらの対応する次数ビンからランダム遺伝子を均一に無作為選択した。経験的p値は、無作為化インスタンスの平均最短距離の場所によって計算した。RSKモジュールおよび疾患遺伝子が配置されたインタラクトームは、実験的裏付けを有する、キュレートされた物理的なタンパク質-タンパク質相互作用からなり、バイナリ相互作用、タンパク質複合体、酵素共役反応、シグナリング相互作用、キナーゼ-基質対、制御性相互作用、および先述の文献から手作業でキュレートされた相互作用（28）が挙げられる。疾患遺伝子は、（Genome-Wide Association Studies（GWAS）およびOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）（ワールド・ワイド・ウェブ上のwww.omim.org/で利用可能）のエビデンスのエントリーを用いて）DiseaseConnect（ワールド・ワイド・ウェブ上のhttp://disease-connect.orgで利用可能）（18）、およびMalaCards（ワールド・ワイド・ウェブ上のwww.malacards.org/で利用可能）（58）データベースから入手した。タンパク質の核内局在化を、Uniprotデータベース（2018年2月20日にアクセス）を用いて、Subcellular Locationアノテーションを使って査定した。核タンパク質の特定では「染色体、セントロメア、キネトコア」、「核」および「核」スペックルを核内の場所とした。
細胞トランスフェクション。マクロファージのsiRNAトランスフェクションを、SilenceMag（BOCA Scientific）をメーカーの指示どおりに用いて実施した。siRNAの標的配列は以下のとおりであった。
非標的指向性対照プールについて:
Figure 2021523115
。
ヒトRSK1/RPS6KA1プールについて:
Figure 2021523115
。
リアルタイムPCR。細胞の全RNAを、TRIzol（Thermo Fisher Scientific）をメーカーの指示どおりに用いて単離した。qScript cDNA Synthesis Kit（QuantaBio）を用いて逆転写を実行した。mRNAレベルは、TaqManベースのリアルタイムPCR反応（Thermo Fisher Scientific）により決定した。以下のTaqManプローブを用いた：ヒトRSK1/RPS6KA1（Hs01546654_m1）、ヒトRSK2/RPS6KA3（Hs00177936_m1）、ヒトRSK3/RPS6KA2（Hs00179731_m1）、ヒトCCL2（Hs00234140_m1）、ヒトCCL7（Hs00171147_m1）、ヒトCCL8（Hs04187715_m1）、ヒトCXCL9（Hs00171065_m1）、ヒトCXCL10（Hs01124251_g1）、ヒトCXCL11（Hs04187682_g1）、ヒトSTAT1（Hs01013996_m1）、ヒトIRF1（Hs00971960_m1）、ヒトPARP14（Hs00981511_m1）、ヒトPARP9（Hs00967084_m1）、ヒトGBP1（Hs00977005_m1）、ヒトTAP1（Hs00388677_m1）、ヒトFCGR1B（Hs00417598_m1）、ヒトGAPDH（Hs02758991_g1）。データをヒトGAPDHにより正規化してから、delta-delta Ct法を用いて計算した。
ELISA。培養培地中のヒトCCL2/MCP-1、ヒトCCL7/MCP-3、ヒトCCL8/MCP-2、ヒトCXCL9/MIG、ヒトCXCL10/IP-10、およびヒトCXCL11/I-TACタンパク質の量を、DUOSET ELISAキット（R&D Systems）をメーカーの指示どおりに用いて測定した。
マウス腹膜炎モデル。Jackson LaboratoryからC57BL/6J野生型マウス（12週齢、雄）を購入した。ビヒクル（30% PEG400、0.5% Tween80、5% プロピレングリコール）または30 mg/kg BI-D1870（Selleck Chemicals）を腹腔内注射した。24時間後、ビヒクルまたは30 mg/kg BI-D1870に加えて、0.5 mlの4% チオグリコラート（Fisher Scientific）を腹腔内注射した。チオグリコラート注射の24時間後、腹腔から腹腔内細胞を回収した。この研究で用いたすべての動物処置は、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センターの動物実験委員会の承認を受け、同委員会に従い実施した。
フローサイトメトリー。マウス由来の腹腔内細胞を抗CD16/CD32（#101319、BioLegend）とともにインキュベートしてFc受容体をブロックした。次に細胞を抗CD45-アロフィコシアニン（APC）/Cy7（#103116、BioLegend）、抗CD11b-APC（#101212、BioLegend）、抗Ly-6G-フィコエリトリン（PE）（#127608、BioLegend）、抗CD86-PE/Cy7（#105116、BioLegend）、抗F4/80-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（#122606、BioLegend）で、EasySep バッファー（STEMCELL Technologies）中にて30分染色した。細胞をEasySepバッファーで洗浄した後、染色された細胞をBD FACSAria II（BD Bioscience）およびFlowJoソフトウェア（FlowJo LLC）で分析した。
参照文献
Figure 2021523115
Figure 2021523115
Figure 2021523115
Figure 2021523115
（表３）BI-DI1870処理により減少したIFN-γ誘発性ホスホタンパク質
Figure 2021523115
Figure 2021523115

Claims (37)

  1. 炎症性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のリボソームS6キナーゼ-1（RSK1）を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
  2. RSK1の阻害がRSK1リン酸化の阻害である、請求項1記載の方法。
  3. RSK1リン酸化がセリン380においてである、請求項2記載の方法。
  4. RSK1の阻害がRSK1核移行の阻害である、請求項1記載の方法。
  5. RSK1の阻害がRSK1キナーゼ活性の阻害である、請求項1記載の方法。
  6. RSK1キナーゼ活性の阻害が、シグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）のリン酸化を阻害する、請求項5記載の方法。
  7. STAT1のリン酸化がセリン727においてである、請求項6記載の方法。
  8. RSK1の阻害が炎症反応を阻害する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  10. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  11. 前記RSK1を阻害する剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  12. 前記小分子が、MK-1775、マニュマイシン-a、セルレニン、タネスピマイシン、サレルミド、およびトセドスタットからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
  13. 前記RNAiが、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項11記載の方法。
  14. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項11記載の方法。
  15. RSK1を阻害することが、RSK1の発現レベルおよび／または活性を阻害することである、請求項1記載の方法。
  16. 前記RSK1の発現レベルおよび／または活性が、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される、請求項15記載の方法。
  17. RSK1の阻害が、初代マクロファージにおいてIFN-γ誘発性炎症促進性ケモカインを抑制する、請求項1記載の方法。
  18. 前記IFN-γ誘発性ケモカインが、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上抑制される、請求項17記載の方法。
  19. 炎症性疾患または障害のための少なくとも第2の治療を施す工程をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
  20. 炎症性疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のシグナル伝達兼転写活性化因子1（STAT1）リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
  21. STAT1リン酸化がセリン727においてである、請求項20記載の方法。
  22. STAT1リン酸化の阻害が炎症反応を阻害する、請求項20〜21のいずれか一項記載の方法。
  23. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると診断する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
  24. 投与前に、対象が炎症性疾患または障害を有すると特定する結果を受領する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
  25. STAT1リン酸化を阻害する剤が、小分子、抗体、ペプチド、ゲノム編集系、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびRNAiからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
  26. 前記RNAiが、マイクロRNA、siRNA、またはshRNAである、請求項25記載の方法。
  27. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項25記載の方法。
  28. 前記リン酸化が、適切な対照と比べて少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、またはそれ以上阻害される、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
  29. 炎症性疾患または障害のための少なくとも第2の治療を施す工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
  30. 前記対象が、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがない、請求項1および20記載の方法。
  31. 前記対象が、炎症性疾患または障害を有すると過去に診断または特定されたことがある、請求項1および20記載の方法。
  32. 前記炎症性疾患または障害が、マクロファージ活性化症候群、潰瘍性大腸炎、II型糖尿病、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、高安病、大動脈弁狭窄症、コフィン・ローリー症候群、肺高血圧、ゴーシェ病、全身性エリテマトーデス、バージャー病、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、末梢動脈疾患、静脈グラフト病、ステント内再狭窄、動静脈瘻疾患、動脈石灰化、石灰化大動脈弁疾患、クローン病、血管炎症候群、強皮症、リウマチ性心疾患、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、急性腎損傷、卒中、神経炎症、および脂肪肝からなる群より選択される、請求項1または20記載の方法。
  33. マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のRSK1を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
  34. マクロファージ活性化を阻害する方法であって、それを必要とする対象に有効量のSTAT1リン酸化を阻害する剤を投与する工程を含む、方法。
  35. RSK1を阻害する剤を含む、組成物。
  36. STAT1リン酸化を阻害する剤を含む、組成物。
  37. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項35および36記載の組成物。
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