JP2021519283A - Ｐｔｅｎ阻害剤を含む小胞およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した、エキソソームと呼ばれるものを含む細胞外小胞を含む膜小胞を含む薬学的組成物を提供する。この細胞外小胞を使用して神経学的疾患、障害または状態を治療する方法を提供する。外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した、単離した細胞外小胞も提供する。

Description

本発明は、ＰＴＥＮ阻害剤を担持した膜小胞、その小胞を含む薬学的組成物、および神経学的障害の治療におけるそれらの使用、より詳細には、外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持した細胞由来細胞外小胞、それらを含む薬学的組成物および脊髄損傷の治療のためのそれらの使用に関する。

脊髄の傷害は、自律神経機能障害、感覚消失、または運動機能の喪失を引き起こす可能性がある。このような脊髄損傷（ＳＣＩ）は、外傷、腫瘍、虚血、発達障害、神経変性疾患、脱髄性疾患、横断性骨髄炎、血管奇形、またはその他の原因によって引き起こされる。ＳＣＩの結果は、損傷の特定の性質と脊髄に沿ったその場所に依存する。さらに、ＳＣＩは動的プロセスであるため、すべての急性脊髄症候群では、損傷の全容が最初に明らかになるとは限らない。不完全な脊髄病変は、より完全な病変に発展する可能性がある。より一般的には、損傷レベルは、最初の事象後の数時間から数日の間、１つまたは２つの脊髄レベルを上げる。病態生理学的イベントの複雑なカスケードがこの臨床的悪化の原因となっている。

多くの場合、ＳＣＩの心理的および社会的影響は壊滅的である。ＳＣＩに関連する一般的な障害状態には、四肢の永久麻痺、慢性的な痛み、筋萎縮、膀胱と腸の自発的コントロールの喪失、性機能障害、不妊症がある。

神経科学の最近の進歩により、ＳＣＩの研究にかなりの注意が向けられ、著しく良くなっている治療とリハビリテーションのオプションが利用可能になった。例えば、機能的電気刺激（ＦＥＳ）は、神経再生を強化し、ＳＣＩ後の機能的容量の回復と改善を大幅に改善する可能性を示している。ただし、脊髄損傷のすべての患者がＦＥＳの対象となるわけではなく（脊髄の完全な病変が存在する必要がある）、患者は神経学的に安定した状態でなければならず、末梢神経は外因性の電気刺激に反応するために無傷でなければならない。

ＳＣＩ後の軸索再生は、成長する成熟したニューロンの本質的に非常に限定された能力、および時間の経過とともに成熟するグリア性瘢痕や阻害分子などの外因性の要因により、制限される。外因性の要因を改変する試みがなされてきたが、成功は限定的である。例えば、細胞外阻害分子の除去、神経栄養因子の送達、または許容的基質移植では、損傷した皮質脊髄路の強力な再生を引き出すことができなかった。

ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、高度に保存された二重特異性タンパク質チロシンホスファターゼである。このタンパク質は、脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸［ＰＩ（３，４，５）Ｐ３］およびホスファチジルイノシトール３，４−二リン酸［ＰＩ（３，４）Ｐ２］を脱リン酸化して、それぞれ、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸［ＰＩ（４，５）Ｐ２］およびホスファチジルイノシトール４−リン酸［ＰＩ（４）Ｐ］を生成する。この独特の活性により、ＰＴＥＮは主要な恒常性調節因子および腫瘍抑制タンパク質となり、体細胞の変化の結果として、さまざまな種類の腫瘍において機能が欠如または欠損する。細胞の成長、再生、生存におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路の重要な役割は、ＰＴＥＮの治療標的化のための理論的根拠を裏付けている。提案されたＰＴＥＮ阻害ベースの治療標的には、損傷または傷害後の神経成長および再生、心臓虚血／再灌流および関連疾患の治療、創傷修復、不妊症がある（Ｐｕｌｉｄｏ，２０１８，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３，２８５によるレビューを参照）。興味深いことに、癌へのＰＴＥＮの関与の主なパラダイムは癌抑制因子であり、ＰＴＥＮ阻害は脳転移で発生する可能性があることが示されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２７，１００−１０４）。

ＰＴＥＮは、成人脳のニューロンで優先的に発現し、哺乳動物標的のラパマイシン（ｍＴＯＲ）活動のダウンレギュレーションを介して皮質脊髄ニューロンの再生を制御する上で重要な役割を果たす。ｍＴＯＲ活動は、軸索切断された成体ニューロンでは大いに抑制されており、持続的な軸索再生に必要な新しいタンパク質合成を制限している。いくつかの出版物は、神経再生の抑制におけるＰＴＥＮの関与に言及しており、他の出版物は、軸索損傷または障害に関連する状態に対するＰＴＥＮ枯渇のプラスの影響を示した。ＰＴＥＮの効果的な阻害は、ｍＴＯＲを増加させ、それにより神経再生を促進するための候補となるであろう。

ＷＯ２００９／１１７３８９は、神経変性疾患を治療するためのＰＴＥＮの阻害剤の治療的使用を記載している。ＷＯ２０１５／０６６７０１は、損傷した神経またはその近くにＰＴＥＮ阻害ペプチドを投与することにより、神経の再生または神経の変性を弱める方法を記載している。ＷＯ２０１１／０４４７０１は、特定のＰＴＥＮ阻害ペプチド、および中枢神経系の疾患および損傷を含む細胞毒性ストレスに関連する疾患の治療におけるそれらの使用を記載している。

とりわけ、リポソーム、タンパク質粒子、ミセル、脂質粒子などのｓｉＲＮＡ分子を送達するために有用であると提案されている膨大な数のビヒクルがある。Ｒｕｎｇｔａら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１３，２，ｅ１３６）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中のｓｉＲＮＡがニューロン遺伝子発現を効率的に停止させ得ることを示した。

細胞外膜小胞（ＥＶ）は、さまざまな種類の細胞から分泌される膜小胞である。ＥＶは通常の生理的条件下の血液循環に存在し、そのレベルを糖尿病や関連する血管合併症、心血管疾患、血液悪性腫瘍などのさまざまな疾患ならびに固形腫瘍において増加する。

ＥＶは３つの亜集団に分けることができる：エキソソーム：エンドソームコンパートメント内およびそれに由来する３０〜１００ｎｍの直径を有するもの、（ＩＩ）微小胞：「小胞形成」を介して細胞表面から放出される１００ｎｍ〜１μｍの直径を有するもの、（ＩＩＩ）アポトーシス小体：直径１〜５μｍを有し、アポトーシス細胞から放出される。ＥＶは、タンパク質、ＤＮＡフラグメント、マイクロＲＮＡ、およびｍＲＮＡが含まれる、親細胞のいくつかの要素を含有する。

ＥＰ２２５４５８６は、間葉系幹細胞から単離されたエキソソームを対象とし、前記エキソソームは間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的特性を含む。さらに、エキソソームは、小分子および非コードＲＮＡを含むさまざまな薬物の担体として提案された（例えば、ＵＳ２０１７／０２４７７０８およびＨａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ ２０１６；６（４）：２８７−２９６）。典型的には、ｓｉＲＮＡはエレクトロポレーションによりエキソソームに導入される。

本出願の発明者の一部に対するＷＯ２０１８／０３３９１１は、神経障害の治療のための間葉系幹細胞由来のエキソソームを教示している。

一般的なニューロン傷害、特に脊髄損傷（ＳＣＩ）には、損傷自体に続く二次的事象の長く複雑なカスケードが含まれる。カスケードの複雑さは提案された治療の効率に影響を与える可能性があり、ＳＣＩを治療するための追加の安全で効率的で便利な方法を開発する満たされていない要求が残っている。

一態様によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供する。

別の態様によれば、本発明は、神経学的疾患、障害または状態の治療に使用するための、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供する。

本発明のさらなる態様によれば、治療を必要とする対象の神経学的疾患、障害または状態を治療する方法であって、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した膜粒子の治療有効量を対象に投与することを含み、それにより神経学的疾患または状態を治療する、方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、膜粒子は、細胞に由来する細胞外小胞である。

さらに別の態様によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した単離した細胞外小胞を提供する。

上記の態様のいずれか１つによれば、細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソームおよびエキソベシクルからなる群から選択される。記載された実施形態でのさらなる特徴によれば、粒子はエキソソームを含む。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソームと微小胞の組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、エキソソームなどの細胞外小胞は、間葉系マーカーを発現する接着細胞に由来する。いくつかの実施形態によれば、間葉系マーカーを発現する接着性細胞は、間葉系幹細胞、口腔粘膜幹細胞または嗅上皮細胞から選択される。他の実施形態によれば、エキソソームなどの細胞外小胞は、神経堤細胞からのマーカーを発現する接着細胞に由来する。一実施形態によれば、神経堤細胞は頭部神経堤細胞を含む。記載される実施形態におけるさらなる特徴によれば、頭部神経堤細胞は、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖乳頭幹細胞（ａｐｉｃａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＳＣＡＰ）および歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）からなる群から選択される。上記の態様および実施形態のいずれか１つによれば、細胞外小胞は、単離した細胞外小胞である。いくつかの態様および実施形態によれば、本発明の薬学的組成物は無細胞組成物である。

上記の態様および実施形態のいずれか１つによれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド阻害剤を含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドは、ＰＴＥＮに向けられたｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ヒトＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド阻害剤は、疎水性部分を含む。特定の実施形態によれば、疎水性部分は、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、ペプチド、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、疎水性部分はステロールである。いくつかの実施形態によれば、ステロールはコレステロールを含む。

記載される態様または実施形態のいずれか１つのさらなる特徴によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ペプチド阻害剤を含む。

上記のいくつかの態様および実施形態によれば、神経学的疾患は神経変性疾患である。他の態様および実施形態によれば、神経学的状態は脊髄損傷である。上記のいくつかの態様および実施形態によれば、脊髄損傷の治療は、薬学的組成物または単離した細胞外小胞を、治療を必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、投与は鼻腔内投与を含む。いくつかの実施形態によれば、治療はさらに、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはそれをコードするポリヌクレオチドの治療有効量を対象に投与することを含む。

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に説明する。矛盾する場合は、定義を含む特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図するものではない。

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、例としてのみ本明細書で説明される。ここで、図面を詳しく具体的に参照すると、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的な説明のためのものであることが強調されている。この点で、図面とともに行われる説明は、本発明の実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。

ＭＳＣ−ＥｘｏをクライオＴＥＭで可視化したものである。 負傷したラット（上パネル）と健康なラット（下パネル）でのすべてのＣＮＳ組織のマイクロＣＴスキャンを示す。図は、エキソソームが血液脳関門を通過し、脊髄病変に到達することを示す。 ＦＡＡＳを使用した、健康なラットおよび負傷したラットでの、ＣＮＳ（左パネル）および主要臓器（右パネル）の誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）評価を用いるＧＮＰエキソソームの鼻腔内投与時の金ナノ粒子（ＧＮＰ）の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 無傷ラットおよび負傷ラットでの、ＰＫＨ２６標識エキソソーム（ＰＫＨ２６−Ｅｘｏ）を用いる、Ｔ１０脊髄分節におけるＰＫＨ２６平均シグナル強度の定量化を示す。＊＊ｐ＜０．０１。 ニューロン、アストロサイト、活性化ミクログリアと共存したＰＫＨ２６−Ｅｘｏシグナルの定量化を示す（ｐ＜０．０１） エキソソームとインキュベートしたＣｙ３タグ付き自己送達性（ｓｅｌｆ−ｄｅｌｉｖｅｒａｂｌｅ）ＭＡＰＫ−ｓｉＲＮＡのＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析を示す。図は、非蛍光エキソソーム（灰色）とＣｙ３エキソソーム（黒）の粒度分布を示す。 対照（培地）（図７Ａ）、非標的化対照ｓｉＲＮＡ（図７Ｂ）、ＭＳＣ−Ｅｘｏ（図７Ｃ）、ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（図７Ｄ）またはＥｘｏＰＴＥＮ（図７Ｅ）、で治療した後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの代表的な免疫蛍光染色画像を示す。スケールバー、１００μｍ。 すべての群の分岐レベルに対する分岐点の数を示す。ＩＭＡＲＩＳソフトウェアで定量化された中央値分岐レベルの分岐点の数を群間で比較した。中央値分岐レベルでは、ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ−エキソソームは、他のすべての群よりも有意に多くの神経突起分岐点を促進した。 全神経突起の長さ（図９Ａ）、神経突起数（図９Ｂ）、分岐点の数（図９Ｃ）、最大分岐レベル（図９Ｄ）をすべての群で測定して比較したものである。 ＥｘｏＰＴＥＮの鼻腔内投与時のＳＣＩ部位と肝臓でのタンパク質とｍＲＮＡの発現を示す。図１０ＡおよびＢは、未治療のＳＣＩラットと比較した、エキソソーム（ＩＮ）治療およびＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）治療の脊髄および肝臓でのＰＴＥＮタンパク質発現をそれぞれ示す。図１０ＣおよびＤは、ＧＡＰＤＨを内部対照として用いた、未治療、エキソソーム（ＩＮ）治療およびＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）治療ＳＣＩラットにおける脊髄および肝臓でのＰＴＥＮ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。データはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較による平均±ＳＥＭとして提示される。ＩＬ：病巣内、ＩＮ：鼻腔内。 鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮ治療が、自発運動、感覚および膀胱の回復を誘発することを示す。図１１Ａは、ＳＣＩラットの毎週のＢａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動スコアを示している：未治療（ｎ＝１５、黒）、またはＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（ＩＬ）（ｎ＝３）、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＬ）（ｎ＝４）、エキソソーム（ＩＮ）（ｎ＝１０）、またはＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）（ｎ＝７）で治療、ＩＬ：病巣内、ＩＮ：鼻腔内。二元配置分散分析とその後のチューキーの多重比較検定（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、離断対照とＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）間）。^＃ｐ＜０．０５、^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１、エキソソーム（ＩＮ）とＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）間。図１１Ｂは、８週間中の群ごとのＢＢＢ運動スコアの分布を示す。各群の各ラットが達成した最高スコアが表示される。所定のスコアを持つラットの数と各群のラットの総数の比率が表される。図１１Ｃは、離断対照、またはＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（ＩＬ）、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＬ）、エキソソーム（ＩＮ）、またはＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）で治療されたラットの毎週の平均体重（±ＳＥＭ）を示す。二元配置分散分析とそれに続くチューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、離断対照とＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）の間。^＃ｐ＜０．０５、^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１、エキソソーム（ＩＮ）とＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）間。図１１Ｄは、８週目の群ごとのＢＢＢスコアと体重の関係を示す。Ｒ^２として示されるピアソンの相関係数が計算され、すべての群についてＢＢＢスコアと体重の間に高い相関が示された。図１１Ｅは、治療後０、４、８週での感覚回復の割合を示す。図１１Ｆは、治療開始から自然排尿反射を達成するまでの時間（日数）として反映された膀胱機能を示す。図１１Ｇは、術後３日目から８週目までの離断後のラットの画像を示している：未治療（上パネル）、エキソソーム治療（中央パネル）、およびＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡエキソソーム治療（下パネル）。 治療したラットと未治療のラットの病変領域におけるＭＲＩと電気生理学的パラメータの測定を示す：図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ損傷発生箇所から吻側と尾側に４ｍｍの断面積を示し、図１２Ｃは、病変内の平均異方性度（ＦＡ）値を示し、図１２Ｄおよび図１２Ｅは、エキソソーム（ＩＮ）、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）または健康なラットにおける運動誘発電位の振幅（図１２Ｄ）および潜時（図１２Ｅ）を示している。 未治療、エキソソーム治療、ＥｘｏＰＴＥＮ治療の３群のラットにおける免疫蛍光マーカーの定量化と比較を示す。マーカーは、β−ＩＩＩ−チューブリン（図１３Ａ）、ＣＤ１１ｂ（図１３Ｂ）、ＧＦＡＰ（図１３Ｃ）、およびＣＤ３１（図１３Ｄ）である。データは平均±ＳＥＭ、および一元配置分散分析、それに続くチューキーの多重比較検定として表示される（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 未治療（上部パネル、ｎ＝３）、エキソソーム治療（中央パネル、ｎ＝３）、ＥｘｏＰＴＥＮ治療（下部パネル、ｎ＝２）ＳＣＩラットにおけるＢＤＡトレースした皮質脊髄路軸索の代表的な画像を示す。スケールバー、５００μｍ。ボックスは、選択した領域の拡大率を示している。白い矢印は発生箇所の尾側にあるＢＤＡ陽性線維を示す。スケールバー、１００μｍ。鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮ治療後（上部パネル）には、離断対照やエキソソーム治療と比較して、はるかに多くの軸索成長が観察された。

本発明は、そのいくつかの実施形態では、神経障害の治療のために外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持した小胞、より詳細には、これに限定するものではないが、脊髄損傷の治療のためにＰＴＥＮ阻害剤を担持した細胞由来の小胞に関する。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、または実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行することができる。

具体的には、本発明者らは、コレステロールをコンジュゲートしたｓｉＲＮＡをエキソソームに効率的に担持することができることを実証した（図６）。実施例に示すように、エキソソームの３分の１以上で、検出可能な量のｓｉＲＮＡが観察された。さらに、ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを担持したエキソソームは、インビトロで後根神経節ニューロンの強力な軸索再生を促進した（図７）。インビボ研究に移ると、中枢神経系全体の組織学的およびマイクロＣＴイメージングにより、鼻腔内投与されたエキソソームが血液脳関門を通過し、脊髄病変に帰着し、病変内のニューロンによって内在化されたことが確認された（図２）。さらに驚くべきことに、鼻腔内ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを担持したエキソソームは、アストログリオーシスとミクログリオーシスの減少を伴って、強力に軸索再生と血管新生を促進した（図１３）。さらに、鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮ治療は部分的に電気生理学的および構造的完全性を回復し、最も重要なことに、顕著な機能的自発運動の回復を可能にした。（図１１）。

本発明の教示によれば、ＰＴＥＮの発現および／または活性をダウンレギュレートすることができる薬剤を担持したエキソソームは、一般的な他の神経学的疾患または状態を、より具体的には、状態の神経変性疾患を治療するのに有用である。特に、病変の部位における活性の阻害、特にＰＴＥＮの発現の阻害が脊髄損傷を効果的に治療したことが、本発明から明らかである。

本発明の一態様によれば、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した粒子を含む薬学的組成物が提供される。

「ホスファターゼおよびテンシンホモログ」「ＰＴＥＮ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅ ＩＤ：５７２８の生成物であり、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ６０４８４に対応するアミノ酸配列組成を有し得る、ヒトホスファターゼおよびテンシンホモログ酵素を指す。他の非ヒトホモログは、既知の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ検索を使用して容易に同定され、そして本発明の範囲内であると見なされる。ＰＴＥＮタンパク質は、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３またはＰＩＰ３）を脱リン酸化するホスファターゼとして機能する。ＰＴＥＮは、ＰＩＰ３のイノシトール環の３’リン酸の脱リン酸化を特異的に触媒し、二リン酸生成物ＰＩＰ２（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）を生成する。この脱リン酸化は、ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害を引き起こすため、重要である。代表的なＰＴＥＮアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。

「粒子」および「小胞」という用語は、本明細書で交換可能に使用されるとおりであり、活性剤の送達に使用される個別の実体を指す。「活性剤」および「活性部分」という用語は、本明細書では互換的に使用され、生物学的活性、薬理学的効果および／または治療的有用性を有する薬剤を指す。活性剤の非限定的な例は、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチドおよびタンパク質である。いくつかの実施形態によれば、活性剤は非内因性活性剤であり、すなわち生細胞に天然には存在しない。一実施形態では、非内因性は、活性剤が人体および／またはヒト細胞に存在しないことを意味する。

粒子は、脂質二重層によって制限された小胞または扁平な球を含み得る。粒子は、４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。粒子は、エンドソーム膜の内向きの出芽によって形成され得る。粒子は、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し得、スクロース勾配で浮遊してもよい。粒子は、コレステロールとスフィンゴミエリン、およびＧＭ１、ＧＭ３、フロチリン、ｓｒｃプロテインキナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富んでいてよい。粒子は、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＳＣ−ＣＭ）に存在する１つ以上のタンパク質、例えばＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに特徴的または特異的なタンパク質を含むことができる。それらは、ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡを含み得る。

いくつかの実施形態によれば、粒子は膜小胞である。本明細書で使用される「膜小胞」という用語は、脂質二重層によって囲まれた液体を含む任意の小胞構造を指す。したがって、いくつかの実施形態によれば、粒子は脂質二重層リン脂質膜小胞である。いくつかの実施形態によれば、膜小胞は、細胞外小胞、リポソーム、エクトソーム、およびトランスファーソームから選択される。いくつかの実施形態によれば、膜小胞は合成膜小胞である。他の実施形態によれば、膜小胞は細胞由来の粒子である。いくつかの実施形態によれば、細胞は真核細胞である。一実施形態によれば、膜小胞はリポソームである。

一実施形態によれば、膜小胞は細胞外小胞である。いくつかの実施形態によれば、本発明の薬学的組成物は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含み、細胞外小胞は細胞に由来する。

「細胞外小胞」および「ＥＶ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。一般に、細胞外小胞は、直径が３０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であり、内部空間内で、細胞外小胞の外表面に表示されるか、および／または膜にまたがるさまざまな高分子カーゴを含み得る。前記カーゴは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、および／またはそれらの組み合わせを含み得る。細胞外小胞という用語は、「エキソソーム」および「微小胞」という用語を含む。「エキソソーム」および「ナノ小胞」という用語は本明細書では互換的に使用され、直径３０〜１００ｎｍのサイズを有するＥＶを指す。典型的には、特定の理論に限定されることなく、エキソソームは細胞内で形成され、多胞体（ＭＶＢ）と原形質膜との融合時に細胞から放出される。あるいは、エキソソームは原形質膜から直接放出される。本明細書で使用される「微小胞」という用語は、直径が１００〜１０００ｎｍのサイズを有するＥＶを指す。「エクトソーム」という用語は、原形質膜から直接出芽する様々なサイズ（例えば、直径０．１〜１ｍｍ）の小胞を指す。

いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、エキソベシクルおよびこれらの組み合わせから選択される。

一実施形態によれば、ＥＶはエキソソームである。エキソソームは、以下の特性の少なくとも１つを有することができる：（ａ）電子顕微鏡で測定した場合のサイズ５０ｎｍ〜１００ｎｍを有する、（ｂ）＜１００ｋＤａのタンパク質を含み＞１００ｋＤａの分子量の複合体を含む、（ｃ）＜３００ｋＤａのタンパク質を含み、＞３００ｋＤａの分子量の複合体を含む、（ｄ）＞１０００ｋＤａの分子量の複合体を含む、または（ｅ）レーザー回折または動的光散乱によって決定される、１００ｎｍ未満の流体力学的半径。一実施形態によれば、エキソソームは、５０〜１００ｎｍの直径を有する。

別の実施形態によれば、細胞外小胞は微小胞である。一実施形態によれば、ＥＶは微小胞である。一実施形態によれば、微小胞は、１００〜１０００ｎｍ、１２０〜８００ｎｍ、１５０〜６００ｎｍ、または２００〜４００ｎｍの直径を有する。別の実施形態によれば、微小胞は、１００〜３００ｎｍまたは１５０〜２５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、３０〜２５０ｎｍまたは５０〜２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、７０〜１７０ｎｍまたは８０〜１５０ｎｍの直径を有する。

ＥＶは２ｎｍを超えるサイズを有し得る。ＥＶは、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍまたは５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。ＥＶは、１５０ｎｍを超えるなど、１００ｎｍを超えるサイズを有し得る。ＥＶは、実質的に２００ｎｍ以上のサイズを有し得る。

ＥＶは、２ｎｍ〜２０ｎｍ、２ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜１００ｎｍ、２ｎｍ〜１５０ｎｍ、または２ｎｍ〜２００ｎｍなどのサイズの範囲を有し得る。ＥＶは、２０ｎｍ〜５０ｎｍ、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または２０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。ＥＶは、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または５０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。ＥＶは、１００ｎｍ〜１５０ｎｍまたは１００ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。ＥＶは、１５０ｎｍ〜２００ｎｍのサイズを有し得る。ＥＶは、１００〜６００ｎｍ、１５０〜５００ｎｍ、または２００〜４００ｎｍのサイズを有し得る。

サイズは、様々な手段によって決定され得る。原則として、サイズは、サイズ分画と、適切なサイズのカットオフがある膜を通過するろ過によって決定される。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して成分タンパク質の分離を追跡することによって、または生物学的アッセイによって、粒度を決定できる。

サイズは、流体力学的半径を含み得る。ＥＶの流体力学的半径は１００ｎｍ未満であり得る。それは、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍであり得る。流体力学的半径は、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、例えば約４５ｎｍ〜約５５ｎｍであり得る。流体力学的半径は、約５０ｎｍであり得る。ＥＶの流体力学的半径は、任意の適切な手段、例えば、レーザー回折または動的光散乱によって決定され得る。

さらなる実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソームと微小胞の組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、単離した細胞外小胞である。さらに別の実施形態によれば、ＥＶは外小胞またはエクトソームである。

上記のように、細胞外小胞は細胞に由来する。「に由来する」および「を起源とする」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特定の細胞、細胞型、または細胞集団内で、それら内で、それらによって、またはそれらから産生される小胞を指す。本明細書で使用される場合、「親細胞」、「プロデューサー細胞」および「元の細胞」という用語は、細胞外小胞が由来および単離される任意の細胞を含む。この用語には、細胞外小胞のタンパク質、脂質、糖、または核酸成分を共有する細胞も含まれる。例えば、「親細胞」または「プロデューサー細胞」は、細胞外小胞の供給源として機能する細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、細胞は真核細胞である。

細胞外小胞（ＥＶ）は、任意のいくつかの手段によって、例えば、生体細胞からの分泌、出芽、または分散によって、生体細胞から得ることができる。ＥＶは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経堤細胞（ＮＣＣ）、間葉系幹細胞培養上清（ＭＳＣ−ＣＭ）または神経堤細胞培養上清から単離可能なものである。ＥＶは、少なくともＭＳＣ、ＮＣＣ、ＮＣＣ−ＣＭまたはＭＳＣ−ＣＭなどの親細胞の活性を担うか、またはそれらを有することができる。ＥＶは、ＭＳＣ、ＮＣＣ、ＮＣＣ−ＣＭまたはＭＳＣ−ＣＭなどの親細胞の活性の機能のほとんどまたはすべてを担い、実行することができる。例えば、ＥＶは、ＭＳＣ、ＮＣＣ、ＮＣＣ−ＣＭまたはＭＳＣ−ＣＭの代替物（または生物学的代替物）であり得る。例えば、細胞外小胞は、生体細胞から生成、滲出、放出、または発散され得る。生体細胞が細胞培養中にある場合、粒子は細胞培地中に分泌され得る。

ＥＶが由来し得る生体細胞の例には、間葉系幹細胞、口腔粘膜幹細胞または嗅神経鞘細胞、アストロサイト、および神経堤細胞などの間葉系マーカーを発現する接着細胞が含まれる。したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明は、外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持する細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供し、細胞外小胞は、間葉系マーカーを発現する接着細胞に由来する。一実施形態によれば、間葉系マーカーを発現する接着細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、口腔粘膜幹細胞および嗅神経鞘細胞から選択される。一実施形態によれば、細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。

「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞（骨細胞）、コンドロサイト（軟骨細胞）、ミオサイト（筋細胞）および含脂肪細胞（脂肪細胞）を含む、当技術分野でよく知られた、様々な細胞型に分化することができる、多能性間質細胞を指す。

それらの多能性状態では、間葉系幹細胞は通常、次のマーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３３は発現しない。

間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄、口腔粘膜、末梢血および羊水を含むがこれらに限定されない様々な組織から単離することができる。一実施形態によれば、間葉系幹細胞は骨髄から単離される。一実施形態によれば、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、口腔粘膜、末梢血および羊水から選択される部位を起源とする。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、骨髄起源のＭＳＣに由来する。他の実施形態によれば、ＥＶは、脂肪組織起源のＭＳＣに由来する。このようないくつかの実施形態によれば、ＥＶは、エキソソーム、微小胞およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３マーカーを発現する。さらなる実施形態によれば、細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３３を発現しない。いくつかの実施形態によれば、細胞は、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖乳頭幹細胞（ＳＣＡＰ）および歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）から選択される。

ＥＶは、特定の細胞型、例えば、間葉幹細胞または神経堤細胞によって分泌される１つ以上のタンパク質、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含み得る。ＥＶは、間葉系幹細胞培養上清（ＭＳＣ−ＣＭ）に存在する１つ以上のタンパク質またはポリヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、ＥＶは、ＭＳＣまたは神経堤細胞に由来するｍｉＲＮＡを含み得る。

例えば、ＥＶは、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または７０％以上のこれらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含み得る。ＥＶは、これらのタンパク質および／またはポリヌクレオチドの実質的に約７５％を含み得る。タンパク質は、タンパク質のリストまたは遺伝子のリストの遺伝子産物を参照することによって定義することができる。

ＥＶは、間葉系幹細胞の少なくとも１つの特性を有し得る。粒子は、生物学的活性などの生物学的特性を有し得る。粒子は、ＭＳＣの生物学的活性のいずれかを持つことができる。粒子は、例えば、ＭＳＣの治療または回復活性を有し得る。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、精製し、増大させる方法は当技術分野で知られており、例えば、ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによる米国特許第５，４８６，３５９号、およびＪｏｎｅｓ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６（１２）：３３４９−６０に開示されている方法が含まれる。

間葉系幹細胞培養は、ＢＭ吸引液（通常２０ｍｌ）を等量のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、ニューヨーク州グランドアイランド）で希釈し、この希釈した細胞を、約１０ｍｌのフィコールカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国、ニュージャージー州ピスカタウェイ）へ積層することで生成できる。２，５００×ｇで３０分間遠心分離した後、単核細胞層を界面から取り出し、ＨＢＳＳに懸濁する。次に、細胞を１，５００×ｇで１５分間遠心分離し、完全培地（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないＭＥＭ、α培地、ＧＩＢＣＯ）、ＭＳＣの急速な成長のために選択されたロットに由来する２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ジョージア州、ノークロス）、１００単位／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁する。再懸濁した細胞を、１０ｃｍ培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ、ニューヨーク州、コーニング）の培地約２５ｍｌに播種し、３７℃、５％加湿ＣＯ_２でインキュベートする。培養２４時間後、非接着細胞を捨て、接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回完全に洗浄する。培地を、約１４日間、３日または４日ごとに新しい完全培地と交換する。次に、接着細胞を０．２５％トリプシンと１ｍＭ ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ）で３７℃で５分間収集し、６ｃｍプレートに再播種して、さらに１４日間培養する。次に、細胞をトリプシン処理し、例えば血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フィラデルフィア州、ホーシャム）などの細胞計数装置を使用して計数する。培養細胞を遠心分離により回収し、１ｍｌあたり１〜２×１０^６細胞の濃度で５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳに再懸濁する。それぞれ約１ｍｌのアリコートをゆっくりと凍結し、液体窒素で保管する。

間葉系幹細胞画分を増大させるために、凍結細胞を３７℃で解凍し、完全培地で希釈し、遠心分離により回収してＤＭＳＯを除去する。細胞を完全培地に再懸濁し、約５，０００細胞／ｃｍ^２の濃度で播種する。培養２４時間後、非接着細胞を除去し、接着細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを使用して収集し、狭窄パスツールピペットを通過させることにより解離させ、好ましくは約１．５〜約３．０細胞／ｃｍ^２の密度で再播種する。これらの条件下では、ＭＳＣ培養物は約５０回の集団倍加に増殖し、約２０００倍に増大させることができる［Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ．，ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：３２１３−３２１８，２０００］。

本発明のいくつかの実施形態によって利用されるＭＳＣ培養物は、それらの形態学的特徴によって定義される３つの細胞群を含む：小さい無顆粒細胞（以下、ＲＳ−１と呼ぶ）、小さい顆粒細胞（以下本明細書ではＲＳ−２と呼ぶ）および大きい中程度に顆粒細胞（以下本明細書では、成熟ＭＳＣと呼ぶ）。培養中のそのような細胞の存在および濃度は、例えば、免疫蛍光、インサイチュハイブリダイゼーション、および活性アッセイを使用することにより、様々な細胞表面マーカーの存在または不在を同定することによりアッセイすることができる。

いくつかの実施形態によれば、ＥＶはアストロサイトに由来しない。したがって、本発明は、粒子がアストロサイト由来のエキソソームではないという条件で、ＰＴＥＮ阻害剤を担持した粒子を含む組成物を企図する。

特定の実施形態によれば、細胞外小胞は、神経堤細胞からのマーカーを発現する細胞に由来する。特定の実施形態によれば、ＥＶは神経堤細胞に由来する。別の実施形態によれば、神経堤細胞は頭部神経堤細胞である。いくつかの実施形態によれば、頭部神経堤細胞には、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖乳頭幹細胞（ＳＣＡＰ）および歯小胞前駆細胞（ＤＦＰＣ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、そのような細胞は、上で定義したように、間葉系マーカーを発現する。

ＥＶは、さまざまな方法で製造または単離できる。このような方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または神経堤細胞（ＮＣＣ）からＥＶを単離することを含み得る。

したがって、本発明のＥＶは、単離したＥＶである。したがって、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した、単離した細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供し、細胞外小胞は細胞から単離される。いくつかの実施形態によれば、細胞はヒト細胞である。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、細胞外小胞は、単離した細胞外小胞である。本明細書で使用する場合、「精製する」、「精製した」、「精製すること」、「単離する」、「単離した」、および「単離すること」という用語は互換的に使用され、１つ以上の精製プロセス、例えば、所望の細胞外小胞の選択、または代替として、残存する生物学的産物の除去または低減を受けた細胞外小胞の集団（例えば、複数の既知または未知の量および／または濃度）の状態を指す。一実施形態によれば、残存親細胞に対するＥＶの比は、少なくとも２、３、４、５、６、８または１０倍高く、または特定の有利な実施形態では、最初の材料よりも少なくとも５０倍、１００倍または１０００倍高い。いくつかの有利な実施形態では、「単離した」という用語は、実質的に無細胞または無細胞の意味を有し、そのことによって置換されてもよい。したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明による薬学的組成物は、ＰＴＥＮ阻害剤を担持した単離した細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は無細胞組成物であり、すなわち、検出可能な量の細胞を含まない。

言及したように、脂質二重層リン脂質膜小胞、例えば細胞外小胞には、外因性のＰＴＥＮ阻害剤を担持する。

本明細書で使用される「外因性」という用語は、細胞外小胞などの所与の膜小胞の外側に由来し、小胞に天然には存在しない、分子または物質（例えば、化合物、核酸またはタンパク質）を指す。細胞外小胞に関して、この用語は、小胞に天然には存在せず、細胞外小胞が由来する細胞にも存在しない分子または物質を指す。いくつかの実施形態によれば、「外因性」という用語は、合成非天然分子を指す。いくつかの実施形態によれば、物質は、細胞外小胞または細胞外小胞が由来する細胞に人工的に担持される。ペプチド、タンパク質、および核酸に関し、この用語は、化合物が細胞外小胞または小胞が由来する細胞に人工的に担持されるか、または小胞が由来する細胞内で人工的に発現されるが、この化合物は親細胞内で自然に発現されないことを意味する。

「担持された」という用語は、粒子、すなわち膜小胞が、阻害剤で人工的に補充されるかまたは満たされることを意味する。膜小胞に対する阻害剤の位置に関し、この用語は以下の意味を有する：小胞の内部に捕捉されていること、小胞の膜（外側または内側またはその間に）組み込まれた小胞の表面（内面および／または外面）に露出することまたはそれに存在すること。一実施形態によれば、阻害剤は、小胞の外膜内に捕捉される。別の実施形態によれば、阻害剤は、小胞の内膜内に捕捉される。さらなる実施形態によれば、阻害剤は、小胞の液相内に捕捉される。

一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ活性を阻害またはダウンレギュレートする。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現を阻害またはダウンレギュレートする。

一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤はタンパク質またはペプチドである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は小分子である。タンパク質ベースのＰＴＥＮ阻害剤の例には、これらに限定されないが、米国特許出願第２０１６／００７４４７２号および第２０１６／０３１１８５７号に開示されているものが含まれ、両者の内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態によれば、タンパク質ベースのＰＴＥＮ阻害剤は、ＷＯ２０１１／０４４７０１に記載されている配列１、２、５、６から選択される配列を有するペプチドおよびＷＯ２０１５／１０５９５７に記載されている配列１〜５を有するペプチドを含む。

本発明のタンパク質ベースの阻害剤は、例えば、標準的な固相法を使用することによって、生化学的に合成され得る。これらの方法には、排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成が含まれる。固相ポリペプチド合成手順は、当技術分野でよく知られている。合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィで精製でき、その組成はアミノ酸配列決定で確認できる。

組換え技術を使用して、本発明のタンパク質ベースの阻害剤を生成することもできる。組換え技術を用いて本発明のポリペプチド阻害剤を製造するために、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞における本発明のポリペプチドの構成的、組織特異的または誘導性転写を指示するのに適したシス制御配列（例えばプロモータ）の転写制御下にあるポリヌクレオチド配列を含む核酸発現ベクターに連結する。発現ベクターについては、本明細書の以下でさらに説明する。

宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のペプチドはまた、インビトロ発現系を使用して合成され得る。これらの方法は当技術分野で周知であり、系の構成要素は市販されている。

特定の実施形態によれば、タンパク質ベースの阻害剤は、ＥＶが由来する細胞で発現される。したがって、例えば、本発明は、ＭＳＣの集団においてタンパク質阻害剤を発現させ、次いで遺伝子改変されたＭＳＣからＥＶを得ることを企図する。

いくつかの実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の阻害剤は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。別の実施形態によれば、阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドである。一実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、１５０を超えるヌクレオチドを含む長い核酸を指す。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体などの核酸の一本鎖または二本鎖の短い配列を指し、前記核酸は通常１５０ヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、２〜１５０、１０〜１００、または１５〜５０のヌクレオチドを含む。他の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、１５〜４０、１７〜３５、または１８〜３０の核酸を含む。

一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤は、ＲＮＡサイレンシング剤である。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」を引き起こすＲＮＡ分子によって媒介される、一群の調節機構（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および翻訳抑制）を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、真菌を含む多くの種類の生物で観察されている。

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡサイレンシング剤」、「ＲＮＡサイレンシング分子」および「ＲＮＡサイレンシングオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、標的遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」できるＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムを介して、ｍＲＮＡ分子の完全なプロセッシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を防止することができる。ＲＮＡサイレンシング剤には、非コードＲＮＡ分子、例えば対鎖を含むＲＮＡ二本鎖、ならびにそのような小さな非コードＲＮＡを生成することができる前駆体ＲＮＡが含まれる。例示的なＲＮＡサイレンシング物質には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが含まれる。一実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘発することができる。別の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。

ＲＮＡ干渉とは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。植物における対応するプロセスは、一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌のクエリングとも呼ばれる。転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために使用される進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており、一般に多様な微生物叢（ｆｌｏｒａ）や門（ｐｈｙｌｕｍ）によって共有されている。外来遺伝子発現からのこのような保護は、宿主ゲノム内での、ウイルス感染からまたはトランスポゾン要素のランダムな統合から誘導された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して、相同の一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、進化した可能性がある。

細胞内に長いｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られているｄｓＲＮＡの短い断片にプロセッシングすることに関与している。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を持つ一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で行われる。

したがって、本発明は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレートするためのｄｓＲＮＡの使用を企図する。一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐより大きい。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡ）の使用は、これらの二本鎖ＲＮＡのより長い領域がインターフェロンおよびＰＫＲ応答の誘導をもたらすと考えられているため、非常に制限されている。ただし、長いｄｓＲＮＡを使用すると、多数のｓｉＲＮＡをテストする必要が軽減される、細胞が最適なサイレンシングシーケンスを選択できるという点で多くの利点が得られ、長いｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに必要なものよりも複雑さを抑えたライブラリーのサイレンシングを可能にし、そして、おそらく最も重要なこととして、長いｄｓＲＮＡは、治療法として使用される場合、ウイルスのエスケープ変異を防ぐことができる。

さまざまな研究により、長いｄｓＲＮＡを使用して、ストレス応答を引き起こしたり、有意なオフターゲット効果を引き起こしたりすることなく、遺伝子発現を抑制することができることが示されている。

特に、本発明はまた、インターフェロン経路が活性化されていない細胞（例えば、胚細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いｄｓＲＮＡ（３０塩基を超える転写産物）の導入を企図する。

本発明はまた、遺伝子発現をダウンレギュレートするためのインターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘発しないように特別に設計された長いｄｓＲＮＡの導入を企図する。例えば、Ｓｈｉｎａｇｗａ ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ ［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５，２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモータから長い二本鎖ＲＮＡを発現させるために、ｐＤＥＣＡＰという名前のベクターを開発している。ｐＤＥＣＡＰからの転写産物には、細胞質へのｄｓ−ＲＮＡエクスポートを容易にする５’−ｃａｐ構造と３’−ｐｏｌｙ（Ａ）テールの両方がないため、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓ−ＲＮＡはインターフェロン応答を誘発しない。

哺乳動物系でインターフェロン経路とＰＫＲ経路を回避する別の方法は、トランスフェクションまたは内因性発現のいずれかを介した小分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入である。

「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する小分子阻害ＲＮＡ二本鎖（一般に１８〜３０塩基対の間）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央に１９ｂｐの二重鎖領域と末端に対称的な２塩基の３’オーバーハングを備える２１ｍｅｒとして化学的に合成されるが、２５−３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖は、同じ場所にある２１ｍｅｒと比較して、効力が１００倍に増加し得ることが最近報告されている。ＲＮＡｉをトリガーする際に長いＲＮＡを使用して得られた観察された増加した効力は、生成物（２１ｍｅｒ）の代わりに基質（２７ｍｅｒ）をダイサーに提供することから生じると理論化されており、これにより、ＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡ二重鎖の侵入の速度または効率が向上する。

３’−オーバーハングの位置はｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖に３’−オーバーハングを有する非対称二重鎖は、一般的にセンス鎖に３’−オーバーハングを有するものよりも強力であることが見出された。アンチセンス転写産物を標的とする場合、反対の効力パターンが観察されるため、これはＲＩＳＣに担持している非対称鎖に起因する可能性がある。

ＰＴＥＮの阻害が企図される例示的なｓｉＲＮＡ配列には、５’−ＧＵＵＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＣＡＡ−３’（配列番号２、センス）、５’−ＵＵＧＡＵＡＵＣＵＣＣＵＵＵＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＡＡＣ−３’（配列番号３、アンチセンス）、または５’−ＣＡＧＣＣＧＵＵＣＧＧＡＧＧＡＵＵＡＵＵＣＧＵＣＵＴＴ−３’（配列番号４、センス）、５’−ＡＧＡＣＧＡＡＵＡＡＵＣＣ ＵＣＣＧＡＡＣＧＧＣＵＧＴＴ−３’（配列番号５、アンチセンス）が含まれる。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現を阻害するｓｉＲＮＡは、核酸配列５’−ＧＡＧＵＵＣＵＵＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１０、センス）を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現を阻害するｓｉＲＮＡは、核酸配列５’−ＵＵＣＵＧＵＵＵＧＵＧＧＡＡＧＡＡＣＵＣ−３’（配列番号１１、アンチセンス）を含む。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０および１１を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。

ＰＴＥＮｓｉＲＮＡが標的化され得る１つの例示的な配列は、配列番号６（５’−ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡ−３’）に示される。ＰＴＥＮｓｉＲＮＡが標的化され得る別の例示的な配列は、配列番号７（５’−ＧＴＡＴＡＧＡＧＣＧＴＧＣＡＧＡＴＡＡ−３’）に示される。

したがって、一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤はｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、小胞または細胞の膜への侵入を改善する複数の修飾を有し得る。

一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号２および／または３の配列を有するｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号４および／または５の配列を有するｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６を標的とする核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号７を標的とする核酸配列を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０の配列を有するｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１１の配列を有するｓｉＲＮＡである。さらなる実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０および１１の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。

別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列の変異体であるｓｉＲＮＡである。一実施形態によれば、変異体は、元の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する。別の実施形態によれば、変異体は、元の配列と少なくとも８０％、８５％または９０％の配列同一性を有する。一実施形態によれば、変異体は元の配列の活性を有する。

「ホモログ」、「変異体」、「ＤＮＡ変異体」、「配列変異体」および「ポリヌクレオチド変異体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、元の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを指す。変異体は、突然変異がオープンリーディングフレームを変更せず、ポリヌクレオチドが、親ポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはタンパク質として実質的に類似の構造および機能を有するペプチドまたはタンパク質をコードするように、欠失、付加または置換などの突然変異を含み得る。いくつかの実施形態によれば、変異体は保存的変異体である。本明細書で使用される「保存的変異体」という用語は、所与のコドン位置における１つ以上のヌクレオチドの変化が、その位置でコードされるアミノ酸の変更をもたらさない変異体を指す。したがって、保存的変異体によってコードされるペプチドまたはタンパク質は、親ポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはタンパク質と１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態によれば、変異体は、親ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質のペプチドの保存的類似体であるペプチドまたはタンパク質をコードする非保存的変異体である。いくつかの実施形態によれば、変異体は、元の配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。

別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮをコードする配列に相補的であり、その発現および／または翻訳を阻害するｓｉＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６および７から選択される配列に相補的である。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含む。一実施形態によれば、そのようなｓｉＲＮＡは、前記配列と８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％または１００％の相補性を有する。

標的遺伝子をダウンレギュレートするために２つ以上のｓｉＲＮＡ剤を使用できることが理解されるであろう。したがって、例えば、本発明は、ＰＴＥＮを標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡの使用を企図する。

「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の意味を包含し得、これらの用語によって置換され得る。

二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、接続されてヘアピンまたはステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成し得る。したがって、言及したように、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。

本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、相補配列の第１および第２の領域を含むステムループ構造を有するＲＮＡ剤を指し、相補性の程度および領域の配向は、塩基対形成が領域間で起こり、第１および第２の領域がループ領域によって結合され、ループがこのループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如に起因するのに十分である。ループ内のヌクレオチドの数は、３〜２３、または５〜１５、または７〜１３、または４〜９、または９〜１１の間の数であり、これらを含む。ループ内の一部のヌクレオチドは、ループ内の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与できる。ループを形成するために使用できるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号８）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（配列番号９）が含まれる。得られる一本鎖オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループまたはヘアピン構造を形成することは、当業者によって認識されるであろう。いくつかの実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号２の核酸を含む。他の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号４の核酸を含む。一実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号２および３の核酸を含む。別の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号４および５の核酸を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号１０または１１の核酸を含む。他の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号１０および１１の核酸を含む。

別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤はｍｉＲＮＡであってよい。ｍｉＲＮＡは、さまざまなサイズの一次転写産物をコードする遺伝子から作られた小型ＲＮＡである。それらは動物と植物の両方で確認されている。一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）は、より短い前駆体ｍｉＲＮＡ、または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」へ、さまざまな核酸分解ステップを通じて処理される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは折りたたまれた形で存在するため、最終的な（成熟した）ｍｉＲＮＡは二重鎖で存在し、２本鎖はｍｉＲＮＡ（最終的に標的と塩基対を形成する鎖）と呼ばれるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二重鎖を除去する一種のダイサーの基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖をＲＩＳＣ複合体に取り込むことができる。一次形態全体よりも、前駆体形態の発現を通じて、ｍｉＲＮＡを遺伝子組換えで発現させ、効果を発揮できることが実証されている。

ｓｉＲＮＡとは異なり、ｍｉＲＮＡは部分的な相補性のみで転写配列に結合し、定常状態のＲＮＡレベルに影響を与えることなく翻訳を抑制する。ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡの両方がダイサーによって処理され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体の構成要素と関連付けられる。ｍｉＲＮＡ経路とｓｉＲＮＡ経路を介した遺伝子調節は、標的転写産物に対する相補性の程度によってのみ決定されるという仮説が立てられた。ｍＲＮＡ標的との同一性が部分的にしかないｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分解を引き起こすのではなく、ｍｉＲＮＡと同様に翻訳抑制において機能すると推測されている。

本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含することが理解されるであろう。

ＰＴＥＮをダウンレギュレートできる追加の薬剤には、リボザイム、ＤＮＡザイム、およびＣＲＩＳＰＲ系の薬剤（例：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）が含まれる。

リボザイムは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害にますます使用されている。いずれか特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計する可能性により、リボザイムは基礎研究および治療用途の両方で貴重なツールとなった。治療領域では、リボザイムは感染症のウイルスＲＮＡ、癌の優性癌遺伝子および遺伝性疾患の特定の体細胞変異を標的とするために利用されている。最も注目すべきは、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルがすでに第１相試験にある。最近では、リボザイムはトランスジェニック動物の研究、遺伝子標的の検証、経路の解明に使用されている。いくつかのリボザイムは臨床試験のさまざまな段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）は、ヒトの臨床試験で研究された最初の化学合成リボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）は、血管新生経路の主要な構成要素であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．および他の企業は、動物モデルにおける抗血管新生療法の重要性を実証している。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（登録商標）は、細胞培養アッセイでＣ型肝炎ウイルスＲＮＡの減少に効果的であることが判明した（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。

ＰＴＥＮをダウンレギュレートできる別の薬剤は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）技術、例えばＣＲＩＳＰＲシステムである。

細胞内のＰＴＥＮ遺伝子の発現を調節する追加の方法は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）によるものである。研究により、配列特異的な方法で二重らせんＤＮＡのポリプリン／ポリピリミジン領域を認識して結合できるＴＦＯを設計できることが示されている。インターカレーターおよび骨格置換の導入などのオリゴヌクレオチドの修飾、および結合条件の最適化（ｐＨおよびカチオン濃度）は、電荷反発や不安定性などのＴＦＯ活性に関する固有の障害を克服するのに役立っており、合成オリゴヌクレオチドが特定の配列を標的にすることができることが最近示された。

したがって、ＰＴＥＮの任意の所与の配列について、三重鎖形成配列を考案することができる。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０以上のヌクレオチド長で、最大５０または１００ｂｐである。

述べたように、本発明の細胞外小胞には、ＰＴＥＮ発現を直接阻害するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤を担持することができる。

膜小胞（例えば、エキソソーム）の担持を容易にするために、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドカーゴは、１つ以上の疎水性修飾を含み得る。疎水性修飾は、天然の（非修飾の）ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドカーゴの疎水性を高める。特定の実施形態では、疎水性修飾は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの疎水性を、天然の（非修飾の）ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して少なくとも２桁（例えば、少なくとも３桁、４桁、５桁、６桁、７桁、８桁、９桁、１０桁またはそれ以上の桁）増加させる。他の実施形態では、疎水性修飾は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの疎水性を、天然の（非修飾の）ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して少なくとも１０桁増加させる。他の実施形態において、疎水性修飾は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの疎水性を、未修飾のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと比較して少なくとも２桁（例えば、少なくとも３桁、４桁、５桁、６桁、７桁、８桁、９桁、１０桁またはそれ以上の桁）増加させる。他の実施形態では、疎水性修飾は、未修飾のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと比較して、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの疎水性を少なくとも１０桁増加させる。疎水性の増加は、適切な方法で評価できる。例えば、疎水性は、オクタノールなどの有機溶媒への溶解度の割合を、水などの水性溶媒への溶解度と比較して測定することによって決定することができる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドカーゴの疎水性は、疎水的に修飾されている、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子内のヌクレオチドの割合を増加させることによって増加させることができる。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの２０％以上が疎水的に修飾されており、例えばオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上などが疎水的に修飾されている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの１００％が疎水的に修飾されている。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの３０％以上が疎水性修飾を含む。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド分子における疎水的に修飾されたヌクレオチドの割合を増加させることは、例えば、疎水性修飾が弱い疎水性、例えば、２’Ｏ−メチル修飾である場合に有用であり得る。強力な疎水性修飾、例えばステロール、脂質などが使用される実施形態では、単一の疎水性修飾で、エキソソーム担持を十分に促進することができる。

いくつかの実施形態では、疎水性修飾は共有結合修飾である。核酸分子の疎水性修飾には、例えば、骨格修飾、糖修飾、塩基修飾および／またはコンジュゲート修飾、ならびにこれらの組み合わせが含まれ得る。

骨格修飾には、核酸分子のリン酸エステル結合の変更が含まれる。適切な骨格修飾の例としては、ホスホロチオエート修飾、ホスホロジチオエート修飾、ｐ−エトキシ修飾、メチルホスホネート修飾、メチルホスホロチオエート修飾、アルキル−およびアリール−ホスフェート（荷電したホスホン酸酸素がアルキル基またはアリール基で置換されている）、アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分がアルキル化されている）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）骨格修飾などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、互いに組み合わせて、および／またはホスホジエステル骨格結合と組み合わせて使用することができる。

一実施形態では、疎水性修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾であり、非架橋リン酸酸素原子の１つが硫黄で置き換えられて、ＰＳ基を与える。この修飾により、ヌクレアーゼの分解に対する大幅な耐性が得られ、好ましい薬物動態特性が得られる。ＰＳ結合は、固相オリゴヌクレオチド合成などの標準的な手法を使用して、オリゴヌクレオチド分子に容易に組み込むことができる。

別の実施形態では、疎水性修飾は、ホスホネート修飾であり、この場合、１つの非架橋酸素がアルキル基で置換されている。他の実施形態では、疎水性修飾は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾である。ＰＮＡは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡの高電荷の糖リン酸骨格と比較して、中性の電荷を持つペプチド骨格を有するオリゴヌクレオチド模倣体である（例えば、参照されたい。他の実施形態では、疎水的に修飾された核酸分子は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である。

他の実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴ分子は、糖部分（例えば、リボース、デオキシリボースなど）で疎水的に修飾され得る。糖修飾は、しばしば、糖環の２’位で起こり、例えば、２’部分は、ハロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、アルキル、アジドまたはアミノ基などの疎水性部分で修飾または置換することができる。非限定的な例では、糖修飾は、Ｏ−メチル、Ｆ、メトキシ−エチル、および２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）を含むことができる。他の２’修飾には、例えば、２’Ｏ−アリル、２’Ｏ−エチルアミン、および２’Ｏ−シアノエチル修飾が含まれる。さらに、糖の４’位を含む他の部位で修飾を行うことができる。

他の実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴ分子は、疎水性塩基修飾を含み得る。例示的な実施形態では、これらの修飾には、フェニル、ナフチル、およびイソブチルが含まれる。他の実施形態は、Ｃ−５プロピニル修飾塩基、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、およびヒポキサンチンを含む。

オリゴヌクレオチドカーゴの疎水性を高めることに加えて、前述の骨格、糖、および塩基修飾は、粒子（例えば、エキソソーム）の存在下でのオリゴヌクレオチドの安定性を高め、担持中に発生する分解を最小限に抑える。

いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドは、疎水性部分を含む。疎水性部分はまた、オリゴヌクレオチドに化学的にコンジュゲートして、その疎水性を増強することができる。したがって、一実施形態では、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドは、疎水性部分とコンジュゲートする。一実施形態によれば、前記疎水性部分は、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、ペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドは、ステロールとコンジュゲートする。例示的な実施形態では、この部分はステロールコレステロール分子であり、したがって、そのような実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはコレステロールとコンジュゲートする。いくつかの実施形態によれば、二本鎖ＲＮＡｉの鎖の１つは、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートする。他の実施形態によれば、二本鎖ＲＮＡｉの２本の鎖は、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートする。他の実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドは、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）、脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせから選択される分子とコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、この部分は脂質である。例えば、特定の実施形態では、この部分はパルミトイルである。いくつかの実施形態では、この部分はステロール、例えばコレステロールである。追加の疎水性部分には、例えば、リン脂質、ビタミンＤ、ビタミンＥ、スクアレン、および脂肪酸が含まれる。別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴは、ミリスチン酸またはその誘導体とコンジュゲートする（例えば、ミリストイル化オリゴヌクレオチドカーゴ）。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、オリゴヌクレオチドカーゴの末端でコンジュゲートする（すなわち、「末端修飾」）。他の実施形態では、疎水性部分は、オリゴヌクレオチド分子の他の部分にコンジュゲートする。

いくつかの特定の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０、１１、２、３、４、および５から選択される核酸配列を含み、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６および７から選択される核酸配列を標的とし、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートした核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６および７から選択される核酸配列を標的とし、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートした核酸配列を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、コレステロールとコンジュゲートした配列番号１０の配列を有するｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１１とともにコレステロールとコンジュゲートした配列番号１０の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害し、ｓｉＲＮＡの配列の少なくとも１つは、コレステロールなどの疎水性分子とコンジュゲートする。一実施形態によれば、ＰＴＥＮタンパク質は、配列番号１を含む。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるような１つ以上の骨格修飾、糖修飾、および／または塩基修飾の組み込みによって安定化され、さらに疎水性部分とコンジュゲートする。例えば、特定の実施形態におけるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％以上の１つ以上の骨格修飾、糖修飾、および／または塩基修飾を含むことができ、さらに本明細書に記載されるような疎水性部分とコンジュゲートし、例えば、ステロール、ＧＭ１、脂質、ビタミン、小分子、もしくはペプチド、またはそれらの組み合わせとコンジュゲートする。例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴは、ステロール、例えばコレステロールとコンジュゲートする。別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴは、ＧＭ１とコンジュゲートする。別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドカーゴは、ミリスチン酸またはその誘導体とコンジュゲートする。

いくつかの実施形態では、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。例示的な標識には、蛍光標識および／または放射性標識が含まれる。疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドが蛍光標識される実施形態では、検出可能な標識は、例えば、Ｃｙ３であり得る。検出可能な標識を疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドに追加することは、エキソソームを標識し、それらの生体分布を追跡する方法として使用できる。他の実施形態では、検出可能な標識は、例えば、エキソソーム脂質および／またはエキソソームペプチドを標識することによって、エキソソームに直接付着させることができる。

核酸は、当技術分野で知られている様々な手順を使用して合成することができる。この目的のために、多くの自動核酸合成装置が市販されている。いくつかの実施形態では、核酸カーゴは合成オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、核酸は、例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼを使用して調製することができる。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、本発明による薬学的組成物は、コンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼをさらに含む。

コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（ＥＣ４．２．２．４、コンドロイチナーゼ、コンドロイチンＡＢＣエリミナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ）は、コンドロイチンＡＢＣリアーゼという系統名の酵素である。この酵素は次の化学反応を触媒する：
１，４−β−Ｄ−ヘキソサミニル基と１，３−β−Ｄ−グルクロノシル基または１，３−α−Ｌ−イドロノシル結合を有する多糖類の、４−デオキシ−β−Ｄ−グルカ−４−エンウロノシル基を有する二糖類への除去的分解（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｖｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）。一実施形態では、コンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼは、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）に由来する。

コンドロイチナーゼＡＢＣは、それ自体タンパク質として、または担体、例えば、（本明細書で上記に記載されているように）粒子中に提供され得る。一実施形態によれば、薬学的組成物は、外因性ＰＴＥＮ阻害剤およびタンパク質としてコンドロイチナーゼＡＢＣを担持した細胞外小胞を含む。別の実施形態によれば、薬学的組成物は、同じタイプの細胞外小胞（例えば、間葉系幹細胞由来のエキソソーム）内に、外因性ＰＴＥＮ阻害剤およびコンドロイチナーゼＡＢＣを担持した細胞外小胞を含む。さらなる実施形態によれば、薬学的組成物は、外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持した細胞外小胞およびコンドロイチナーゼＡＢＣを担持した他の異なる細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態によれば、異なる細胞外小胞は、同じタイプ（例えば、間葉系幹細胞由来のエキソソーム）または異なるタイプ（異なる細胞源に由来する細胞外小胞、例えば、ＰＴＥＮ阻害剤は間葉系幹細胞由来のエキソソームに含まれ、コンドロイチナーゼＡＢＣは歯髄由来のエキソソームを含む、またはその逆）であり得る。

いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、神経障害の治療に有用な追加の治療薬をさらに含む。そのような活性剤の非限定的な例は、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子、および代謝拮抗剤小分子薬剤、Ｌ−ＤＯＰＡなどの神経伝達物質分子の前駆体およびである。さらに、またはあるいは、追加の治療剤は、神経学的疾患の少なくとも１つの症状を緩和することができる細胞である。

本明細書で使用される「薬学的組成物」という用語は、外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持した膜小胞、特に１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化されたエキソソームなどの細胞外小胞を含む組成物を指す。

薬学的組成物の製剤化は、用途に応じて調整することができる。特に、薬学的組成物は、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速、連続または遅延放出を提供するように、当技術分野で公知の方法を使用して製剤化され得る。例えば、製剤は、プラスター、顆粒剤、ローション剤、リニメント剤、リモナーゼ剤、芳香水剤、粉末剤、シロップ剤、眼科用軟膏剤、液剤（Ｌｉｑｕｉｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、エアロゾル剤、スプレー剤、エキス剤、エリキシル剤、軟膏剤、流エキス剤、乳剤、懸濁剤、煎じ薬、輸液剤、点眼剤、錠剤、坐剤、注射剤、酒精剤、カプセル剤、クリーム剤、トローチ剤、チンキ剤、糊剤、丸剤、軟または硬ゼラチンカプセル剤の中から選択された任意の製剤であってよい。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、防腐剤、抗酸化剤、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、希釈剤、潤滑剤、滑剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、エンハンサ、湿潤剤、可溶化剤、界面活性剤、抗酸化剤などを指す。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野でよく知られている。組成物は、補足的、追加的、または強化された治療機能を提供する他の活性化合物固体担体または賦形剤、例えば、ラクトース、デンプンもしくはタルカン、または液体担体、例えば、水、脂肪油または液体パラフィンを含んでもよい。担体の他の例には、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ、フリーラジカルを除去し、ｐＨ緩衝、膠質浸透／浸透圧支持、エネルギー基質、および低温での細胞内状態のバランスを保つイオン濃度を提供する構成要素を含む低体温保存培地、ならびに有機溶媒と水との混合物、などの培地が含まれる。

賦形剤の例には、限定されないが、アルブミン、血漿、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはレスベラトロールなどの抗酸化剤が含まれる。典型的には、薬学的担体は、組成物中の粒子の数およびＰＴＥＮ阻害剤の活性を少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、またはさらに少なくとも９６時間保存する（例えば、量が９０％を超えて減少しない）。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、薬学的組成物は、鼻腔内、病変内、くも膜下腔内、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、経口、および脳内投与経路から選択される投与経路を介して投与するために製剤化される。一実施形態によれば、薬学的組成物は、鼻腔内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態によれば、そのような薬学的組成物は、液体溶液、点鼻薬、スプレー、計測された浮遊（ｍｅａｓｕｒｅｄ ｓｔｒａｙ）の形態である。他の実施形態によれば、薬学的組成物は、注射用、例えば病変内、くも膜下腔内または静脈内注射用に製剤化される。そのような実施形態によれば、薬学的組成物は無菌注射液の形態である。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含み、細胞外小胞が細胞に由来する薬学的組成物を提供する。一実施形態によれば、ＥＶは、エキソソーム、微小胞およびそれらの組み合わせから選択される。別の実施形態によれば、細胞外小胞はエキソソームである。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、ＭＳＣに由来する。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の阻害剤はｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の阻害剤はｓｈＲＮＡであるいくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０の核酸を含むｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０および配列番号１１の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６を標的とする核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号７を標的とする核酸配列を含む。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡはコレステロールとコンジュゲートする。いくつかの実施形態によれば、本発明は、エキソソーム、微小胞またはそれらの組み合わせから選択され、ＰＴＥＮ発現を阻害できる、コレステロールとコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ分子を担持する細胞外小胞を含む、薬学的組成物を提供する。そのような実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号２および３の核酸配列を有する。他のそのような実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号４および５の核酸配列を有する。別のそのような実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０および配列番号１１の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６を標的とする核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号７を標的とする核酸配列を含む。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、鼻腔内投与で製剤化される。別の実施形態によれば、薬学的組成物は病変内投与で製剤化される。さらに別の実施形態によれば、薬剤は経口投与で製剤化される。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物はコンドロイチナーゼＡＢＣと同時投与される。

一実施形態によれば、本発明は、エキソソーム、微小胞およびこれらの組み合わせから選択される細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供し、前記細胞外小胞には、ＰＴＥＮ発現を阻害できるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが担持され、薬学的組成物は鼻腔内またはくも膜下腔内投与用に製剤化される。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、コレステロールとコンジュゲートする。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、任意選択的にコレステロールとコンジュゲートした配列番号１０の配列および配列番号１１またはそれらの変異体（複数可）を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号２および／または３の核酸配列またはそれらの変異体を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号４および／または３の核酸配列またはそれらの変異体を含む。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、本発明の薬学的組成物は、神経学的疾患、障害、損傷または状態を治療するために有用である。一実施形態によれば、神経学的状態は脊髄損傷である。

一実施形態によれば、膜小胞はリポソームである。したがって、一実施形態によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持したリポソームを含む薬学的組成物を提供する。「リポソーム」という用語は、脂質二重層によって囲まれた内相を有する微視的な閉じた小胞を指す。リポソームは、小単層小胞（ＳＵＶ）などの小単一膜リポソーム、大単層小胞（ＬＵＶ）などの大単一膜リポソーム、巨大単層小胞（ＧＵＶ）などのさらに大きい単一膜リポソーム、多重膜小胞（ＭＬＶ）などの複数の同心膜を有する多層リポソーム、または多胞体小胞（ＭＶＶ）などの不規則で同心ではない複数の膜を有するリポソームであってよい。一実施形態によれば、リポソームはＳＵＶである。他の実施形態によれば、リポソームはＭＬＶである。

一実施形態によれば、リポソームはＳＵＶである。他の実施形態によれば、リポソームはＭＬＶである。一実施形態によれば、リポソームは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、スフィンゴリン脂質、ジステアロイル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるリポソーム形成脂質を含む。別の実施形態によれば、リポソーム形成脂質はホスファチジルコリンである。一実施形態によれば、ホスファチジルコリンは水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態によれば、ホスファチジルエタノールアミンは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であり、前記ジステアロイルは、ジステアロイルグリコール（ＤＳＧ）またはオキシカルボニル−３−アミノ−１，２−プロパンジオールジステアロイルエステル（ＤＳ）である。別の実施形態によれば、リポソームは、ポリアルキルエーテル、ポリシアル酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸などの安定化ポリマー分子を含む。一実施形態によれば、リポソームはＰＥＧを含む。いくつかの実施形態によれば、リポソームはコレステロールをさらに含む。

一実施形態によれば、リポソームにはＰＴＥＮ阻害剤が担持されている。本明細書では、ＰＴＥＮ阻害剤に関連するすべての用語および実施形態が適用される。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドである。一実施形態によれば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡから選択される。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６を標的とする核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号７を標的とする核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、疎水性部分とコンジュゲートする。さらに別の実施形態によれば、疎水性部分は、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、疎水性ペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、コレステロールとコンジュゲートする。

本発明の教示によれば、本発明の薬学的組成物は、対象の神経学的疾患、障害または状態の治療に使用するためのものである。したがって、いくつかの実施形態によれば、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した粒子を含む薬学的組成物は、治療を必要とする対象の神経学的疾患、障害または状態を治療するために使用するものである。いくつかの実施形態によれば、粒子は膜小胞である。いくつかの好ましい実施形態によれば、膜小胞は細胞外小胞である。

したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含む薬学的組成物を、治療を必要とする対象の神経学的疾患、障害または状態の治療をするのに使用するために提供する。

「神経学的疾患、障害または状態」という用語は、脳、脊椎および／またはそれらを接続する神経の疾患、障害または状態を指す。

特定の実施形態によれば、状態は損傷によるものである。一実施形態によれば、損傷は脊髄、すなわち脊髄損傷（ＳＣＩ）に対するものである。他の実施形態によれば、神経学的な疾患、障害または状態は、ニューロン損傷である。

「脊髄損傷」および「ＳＣＩ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、脊髄への損傷を指す。一実施形態によれば、損傷は外傷の結果である。別の実施形態によれば、損傷または傷害は、変性または疾患の結果である。脊髄と神経根が損傷している場所に応じて、症状は大きく異なり、例えば、痛みから麻痺、失禁までであり得る。脊髄損傷は、「不完全」のさまざまなレベルで説明され、これは、患者に影響を与えないものから、機能の完全な喪失を意味する「完全な」損傷までさまざまであり得る。脊髄損傷には多くの原因があるが、通常は自動車事故、転倒、スポーツ外傷、暴力による主な外傷に関連している。したがって、一実施形態によれば、ＳＣＩは、完全および不完全なＳＣＩから選択される。いくつかの実施形態によれば、脊髄損傷は、急性または慢性のＳＣＩから選択される。脊髄損傷は、グリア性瘢痕、ミエリン阻害、脱髄、細胞死、神経栄養サポートの欠如、虚血、フリーラジカル形成、および興奮毒性を含むがこれらに限定されない二次組織損傷の影響を受けやすい可能性がある。

脊髄の疾患には、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）、炎症性疾患（例えば、くも膜炎）、神経変性疾患、ポリオ、二分脊椎、および脊髄腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の教示に従って治療することができる対象には、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌおよびネコなどの哺乳動物対象が含まれる。一実施形態では、対象はヒト対象である。

状態または患者を「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための措置をとることを指す。有益なまたは望ましい臨床結果には、これらに限定されないが、また、疾患、状態または障害の進行の改善抑止、実質的な阻害、遅延または逆転、状態の臨床的または審美的症状の実質的な改善または緩和、疾患、状態、または障害の臨床的または審美的症状の出現を実質的に防止し、および有害または煩わしい症状からの保護、が含まれる。さらに治療するとは、以下の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を軽減する、（ｂ）治療されている障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限する、（ｃ）治療される障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を制限する、（ｄ）以前に障害（複数可）があった患者の障害（複数可）の再発を制限する、および／または（ｅ）以前に障害（複数可）の無症候性であった患者の症状の再発を制限する。いくつかの実施形態によれば、「治療する」という用語は、損傷部位での神経再生、軸索増殖、アストログリオーシスおよびミクログリオーシスの減少を含む。他の実施形態によれば、この用語は、疾患または状態に関連する症状の改善を包含する。一実施形態によれば、「治療する」という用語は、運動パラメータの改善を含む。一実施形態によれば、運動パラメータの改善は、未治療の対象と比較して、運動パラメータの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の改善を含む。いくつかの実施形態によれば、治療は、損傷部位でのアストログリオーシスおよび／またはミクログリオーシスを低減することを含む。一実施形態によれば、アストログリオーシスおよび／またはミクログリオーシスの低減は、未治療の対象と比較して、アストログリオーシスおよび／またはミクログリオーシスの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の低減を含む。

本発明の薬学的組成物は、任意の既知の方法を使用して投与することができる。対象への物質、化合物または薬剤の「投与する」または「投与」という用語は、当業者に知られている様々な方法の１つを使用して実施することができる。例えば、化合物または薬剤は、鼻腔内（例えば、吸入による）、くも膜下腔内（脊柱管内、またはくも膜下腔内）、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼内、舌下、経口的（摂取による）、脳内、および経皮的（吸収による、例えば皮膚の管を介する）に投与できる。化合物または薬剤はまた、再装填可能または生分解性ポリマーデバイスまたは他のデバイスによって、例えば、パッチまたはポンプ、または化合物または薬剤の長期にわたる放出、徐放または制御放出を提供する製剤によって適切に導入することもできる。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１回以上の長期間にわたって実施され得る。いくつかの実施形態によれば、組成物は、１日に１回、２回、３回、４回、５回または６回投与される。他の実施形態によれば、組成物は、１月に１回、２回、３回、４回、５回または６回投与される。いくつかの実施形態では、投与は、自己投与を含む直接投与、および薬物を処方する行為を含む間接投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用する場合、患者に薬物を自己投与するように、または他の人に薬物を投与させるように指示し、かつ／または患者に薬物の処方箋を提供する医師が、その薬物を患者に投与する。一実施形態によれば、本発明の薬学的組成物は鼻腔内に投与される。別の実施形態によれば、本発明の薬学的組成物は病変内に投与される。一実施形態によれば、薬学的組成物は経口投与される。

特定の実施形態によれば、神経学的疾患は神経系の変性疾患である。一実施形態によれば、神経系の変性疾患は、パーキンソン病、本態性振戦症、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳおよび器質性精神病から選択される。一実施形態によれば、疾患は記憶疾患である。一実施形態では、疾患は、自閉症または統合失調症などの神経発達障害である。別の実施形態によれば、疾患は、統合失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、トゥレット症候群、強迫性障害、ならびに神経行動学的関連症状などの行動性疾患である。特定の実施形態によれば、神経学的疾患は自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、本発明は、対象のニューロン損傷または傷害の治療に使用するための、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した膜小胞を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、ニューロン損傷は脊髄損傷である。別の実施形態によれば、傷害は脳の神経細胞に対するものである。一実施形態によれば、損傷は脳損傷である。別の実施形態によれば、傷害は神経変性疾患が原因である。別の実施形態によれば、神経変性は、パーキンソン病、本態性振戦症、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳおよび器質性精神病から選択される。

したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明は、対象におけるニューロン損傷または傷害の治療に使用するための、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供し、細胞外小胞は細胞に由来する。

一実施形態によれば、細胞外小胞はエキソソームである。別の実施形態によれば、ＥＶは微小胞である。一実施形態によれば、ＥＶは、エキソソーム、微小胞およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、ＭＳＣに由来する。一実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含む。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６および７から選択される配列に対して相補的または標的化する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害する。一実施形態によれば、ＰＴＥＮは、配列番号１を含む。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、核酸配列１０を含むｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０および配列番号１１の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。さらなる実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含むｓｈＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号６および７から選択される配列を標的とするか、または相補的である。いくつかの特定の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡはコレステロールとコンジュゲートする。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、脊髄損傷の治療に使用するための、コレステロールとコンジュゲートした、ＰＴＥＮ発現を阻害することができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを担持したエキソソーム、微小胞またはそれらの組み合わせから選択されるＥＶを含む薬学的組成物を提供する。そのような実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を有する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０および配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、鼻腔内に投与される。別の実施形態によれば、薬学的組成物は病変内に投与される。さらに別の実施形態によれば、薬学的組成物は経口投与される。

上記実施形態のいずれか１つによれば、治療することは、本発明の薬学的組成物をコンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼと同時投与することを含む。

一実施形態では、コンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼをコードするポリヌクレオチドが患者に（すなわち、遺伝子治療を介して）提供される。コンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼを発現するための発現構築物は、本明細書の以下でさらに説明される。コンドロイチナーゼＡＢＣリアーゼをコードするポリヌクレオチドを粒子にアップロードすることができる。別の実施形態では、酵素自体が患者に提供される。

特定の実施形態では、ＰＴＥＮ阻害剤およびコンドロイチナーゼＡＢＣの両方が同じ粒子中に同時に製剤化される。別の実施形態では、ＰＴＥＮ阻害剤およびコンドロイチナーゼＡＢＣは、同じ粒子タイプ（例えば、間葉系幹細胞由来のエキソソーム）に担持されるが、同じ粒子自体には担持されない。さらに別の実施形態では、ＰＴＥＮ阻害剤およびコンドロイチナーゼＡＢＣは、異なる粒子タイプ（例えば、ＰＴＥＮ阻害剤は間葉系幹細胞由来のエキソソームに含まれ、コンドロイチナーゼＡＢＣは歯髄由来のエキソソームに含まれる、またはその逆）に担持される。

いくつかの実施形態によれば、使用はさらに、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、毒素、神経突起促進分子、および代謝拮抗剤小分子薬剤、Ｌ−ＤＯＰＡなどの神経伝達物質分子の前駆体などの神経学的障害の治療に有用な治療薬との、あるいは神経学的疾患の少なくとも１つの症状を緩和することができる細胞との、同時投与を含む。

いくつかの実施形態によれば、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した粒子は、上記で定義されるように、リポソームである。したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明は、それを必要とする対象の神経学的疾患、障害または状態の治療に使用するための、ＰＴＥＮ阻害剤を担持したエキソソームを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、状態は脊髄損傷である。

本発明の別の態様によれば、治療を必要とする対象のニューロン損傷、傷害疾患、または障害を治療する方法であって、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した膜小胞の治療有効量を対象に投与することを含み、それにより損傷、傷害疾患または障害を治療する、方法が提供される。上記の実施形態および態様のすべての用語がここでも当てはまる。いくつかの実施形態によれば、膜小胞は、上記のように細胞外小胞である。

本発明の膜小胞は、その性質が移植部位に依存する移植アプローチを含む、上記で定義された様々な投与経路を使用して、治療された個体に投与することができる。

「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」、「細胞置換」または「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」注射という用語または語句は、本明細書では互換的に使用され、脳、灰白質などの標的組織への本発明の粒子の導入を指す。そこから粒子が得られる間葉系幹細胞は、レシピエント（同種異系）または非同種異系または異種ドナーに由来し得る。

膜小胞は、脊髄に直接（くも膜下腔内に）、静脈内に、脳に直接、または脳に到達するようにそれらの組み合わせに移植できる。一実施形態では、粒子は非侵襲的に、例えば鼻腔内に送達される。全身投与などの他の投与方法も考えられる。

治療ごとに（例えば鼻腔内に）投与することができる膜小胞（エキソソーム）の例示的な用量は、７０Ｋｇのヒトに対し１×１０^６〜１×１０^２０および／または１×１０^９〜１×１０^１５の間であってよい。

対象に投与された場合の「治療有効量」の膜小胞という用語は、意図された治療効果、例えば、ＳＣＩなどのニューロン損傷の治療、を有するものである。完全な治療効果は、必ずしも１回用量の投与で起こるとは限らず、一連の用量投与後のみに起こり得る。したがって、治療有効量は、１回以上の投与で投与され得るものである。対象に必要な正確な有効量は、例えば、対象のサイズ、健康状態および年齢、認知障害の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療法または治療法の組み合わせ、および投与様式に依存する。当業者は、日常的な実験法により、所与の状況に対する有効量を容易に決定することができる。

いくつかの実施形態によれば、ＥＶなどの膜小胞は、鼻腔内、病変内、非経口、局所、全身または経口投与される。

本明細書に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物におけるインビトロでの標準的な製薬手順によって決定することができる。

これらのインビトロおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な投与量を処方する際に使用することができる。更なる情報は臨床研究から得ることができ−例えば、Ｓａｌｅｍ ＨＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１０；２８：５８５−９６；ａｎｄ Ｕｃｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；１０：６４９−５６を参照されたい）。

投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて異なり得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。

注射の場合、薬学的組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性のある緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的塩緩衝液、および本明細書で上述した追加の薬剤中に処方することができる。

投与量および投与間隔は、神経学的障害を効果的に治療するのに十分な有効成分のレベルに個別に調整することができる。所望の効果を達成するために必要な投与量は、個々の特性および投与経路に依存するであろう。

治療される状態の重症度および応答性に応じて、粒子の用量は、単回または複数回の投与であり得、疾患状態の減少が達成される時期に応じて、治療コースは数日から数週間または数ヶ月にわたる。

投与される粒子の量は、もちろん、治療される個人、苦痛の重症度、投与の方法、処方する医師の判断などに依存するであろう。投与の用量およびタイミングは、個々の変化する状態を注意深く継続的に監視に対応する。

投与後、標的部位に粒子が確実に到達するように粒子を追跡することができる。これは、例えば、金ナノ粒子を使用して実行してもよい−ＷＯ２０１３／１８６７３５ Ａ３を参照されたい。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を、治療を必要とする対象の神経学的疾患、障害または状態の治療に使用するための薬剤の調製に使用するために提供する。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、単離した細胞外小胞である。一実施形態によれば、神経学的状態は脊髄損傷である。

別の態様によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した脂質二重層リン脂質膜小胞を提供する。いくつかの実施形態によれば、膜小胞は、単離した細胞外小胞である。

したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を提供し、この細胞外小胞は細胞に由来する。一実施形態によれば、細胞外小胞は、細胞外小胞、リポソーム、エクトソーム、およびトランスファーソームから選択される。一実施形態によれば、細胞外小胞は、エキソソーム、微小胞およびそれらの組み合わせから選択される。一実施形態によれば、ＥＶはエキソソームである。一実施形態によれば、ＥＶは微小胞である。一実施形態によれば、微小胞は、１００〜１０００ｎｍ、１２０〜８００ｎｍ、１５０〜６００ｎｍ ２００〜４００ｎｍの直径を有する。別の実施形態によれば、微小胞は、１００〜３００ｎｍまたは１５０〜２５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、３０〜２５０ｎｍまたは５０〜２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、７０〜１７０ｎｍまたは８０〜１５０ｎｍの直径を有する。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、ＥＶは細胞に由来する。一実施形態によれば、ＥＶ、例えばエキソソームは、間葉系マーカーを発現する細胞に由来する。一実施形態によれば、細胞は接着細胞である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、間葉系幹細胞、口腔粘膜幹細胞および嗅覚鞘細胞から選択される。いくつかの実施形態によれば、細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。一実施形態によれば、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、臍帯、歯髄、口腔粘膜、末梢血および羊水から選択される部位を起源とする。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、骨髄起源のＭＳＣに由来する。他の実施形態によれば、ＥＶは、脂肪組織起源のＭＳＣに由来する。このようないくつかの実施形態によれば、ＥＶは、エキソソーム、微小胞およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３マーカーを発現する。さらなる実施形態によれば、細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３３を発現しない。いくつかの実施形態によれば、細胞は、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖乳頭幹細胞（ＳＣＡＰ）および歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）から選択される。

ＥＶは、間葉系幹細胞の少なくとも１つの特性を有し得る。粒子は、生物学的活性などの生物学的特性を有し得る。粒子は、ＭＳＣの生物学的活性のいずれかを持つことができる。粒子は、例えば、ＭＳＣの治療または回復活性を有し得る。

いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、神経堤細胞（ＮＣＣ）からのマーカーを発現する細胞に由来する。一実施形態によれば、細胞は神経堤細胞である。いくつかの実施形態によれば、神経堤細胞は頭部神経堤細胞である。一実施形態によれば、頭部神経堤細胞は、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖乳頭幹細胞（ＳＣＡＰ）および歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）から選択される。別の実施形態によれば、細胞は、上で定義されたように、間葉系マーカーを発現する。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、ＥＶは細胞から単離される。したがって、いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、単離したＥＶ、例えば単離したエキソソームおよび／または単離した微小胞である。一実施形態によれば、残存親細胞に対するＥＶの比は、少なくとも２、３、４、５、６、８または１０倍高く、または特定の有利な実施形態では、最初の材料よりも少なくとも５０倍 １００倍または１０００倍高い。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは無細胞ＥＶである。

ＥＶは、さまざまな方法で製造または単離できる。このような方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または神経堤細胞（ＮＣＣ）からＥＶを単離することを含み得る。いくつかの実施形態によれば、単離した細胞外小胞は無細胞である。

上記の実施形態のいずれか１つによれば、細胞外小胞は、上記の態様および実施形態のいずれか１つで定義されるように、ＰＴＥＮ阻害剤を含む。一実施形態によれば、細胞外小胞は、ＰＴＥＮ阻害剤を担持する。一実施形態によれば、単離した細胞外小胞は、前記ＰＴＥＮ阻害剤を担持する。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ活性を阻害またはダウンレギュレートする。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現を阻害またはダウンレギュレートする。

一実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は、タンパク質またはペプチドである。別の実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は小分子である。いくつかの実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ発現の外因性阻害剤は、ポリヌクレオチド剤またはオリゴヌクレオチド剤である。別の実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドである。一実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤はｓｉＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を有する。一実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０の配列を有するｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤は、配列番号１０および配列番号１１の配列を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含む。したがって、一実施形態によれば、細胞外小胞は、配列番号２および３または配列番号４および５の核酸配列を有するｓｉＲＮＡを担持する。特定の実施形態によれば、単離された細胞外小胞は、配列番号１０および１１の核酸配列を有するｓｉＲＮＡを担持する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列の変異体であり、元の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態によれば、単離した細胞外小胞は、配列番号１０および１１からの核酸配列を含むｓｈＲＮＡを担持する。一実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号２および３の核酸配列を含む。別の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号４および５の核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６または７の配列に相補的な核酸を含む。さらに別の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号８および９から選択される配列を含む。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド阻害剤、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、疎水性部分を含む。いくつかの実施形態によれば、疎水性部分は、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、ペプチド、またはこれらの組み合わせである。一実施形態によれば、ステロールはコレステロールである。

特定の一実施形態によれば、本発明は、ＰＴＥＮ発現を阻害するｓｉＲＮＡ分子を担持した間葉系幹細胞に由来する単離したエキソソームを提供する。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、コレステロール部分を含み、例えば、それとコンジュゲートする。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含み、コレステロールとコンジュゲートする。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０および１１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６を標的とし、コレステロールとコンジュゲートした核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号７を標的とし、コレステロールとコンジュゲートした核酸配列を含む。

いくつかの実施形態によれば、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した単離した細胞外小胞は、神経学的疾患、障害、損傷または状態を治療するために有用である。一実施形態によれば、神経学的状態は脊髄損傷である。したがって、一実施形態によれば、本発明は、脊髄損傷の治療に使用するための細胞外小胞を提供し、前記膜小胞は、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持する。特定の実施形態によれば、神経学的疾患は神経系の変性疾患である。一実施形態によれば、神経系の変性疾患は、パーキンソン病、本態性振戦症、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳおよび器質性精神病から選択される。一実施形態によれば、疾患は記憶疾患である。一実施形態では、疾患は、自閉症または統合失調症などの神経発達障害である。別の実施形態によれば、疾患は、統合失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、トゥレット症候群、強迫性障害、ならびに神経行動学的関連症状などの行動性疾患である。

いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞は、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態によれば、ＰＴＥＮ阻害剤を担持したＥＶは、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つによる単離した細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、神経学的疾患、障害、損傷または状態を治療に使用するためのものである。一実施形態によれば、薬学的組成物は、脊髄損傷の治療に使用するためのものである。

いくつかの実施形態によれば、膜小胞はリポソームである。一実施形態によれば、リポソームはＳＵＶである。他の実施形態によれば、リポソームはＭＬＶである。一実施形態によれば、リポソームは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、スフィンゴリン脂質、ジステアロイル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるリポソーム形成脂質を含む。別の実施形態によれば、リポソーム形成脂質はホスファチジルコリンである。一実施形態によれば、ホスファチジルコリンは水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。他の実施形態によれば、ホスファチジルエタノールアミンは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であり、前記ジステアロイルは、ジステアロイルグリコール（ＤＳＧ）またはオキシカルボニル−３−アミノ−１，２−プロパンジオールジステアロイルエステル（ＤＳ）である。別の実施形態によれば、リポソームは、ポリアルキルエーテル、ポリシアル酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸などの安定化ポリマー分子を含む。一実施形態によれば、リポソームはＰＥＧを含む。いくつかの実施形態によれば、リポソームはコレステロールをさらに含む。

別の態様によれば、本発明は、本発明の外因性ＰＴＥＮ阻害剤を担持した細胞外小胞の調製方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、細胞外小胞はエキソソームである。別の実施形態によれば、ＥＶは微小胞である。さらなる実施形態によれば、ＥＶは、微小胞およびエキソソームの組み合わせである。エキソソームおよび微小胞は、上記の実施形態および態様のいずれか１つで定義されたとおりである。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは、間葉系マーカーを発現する細胞に由来する。一実施形態によれば、間葉系マーカーを発現する細胞は、間葉系幹細胞、口腔粘膜幹細胞および嗅覚鞘細胞から選択される。別の実施形態によれば、ＥＶは、例えば頭部神経堤細胞からの神経堤細胞に由来する。一実施形態によれば、エキソソームなどのＥＶは、間葉系幹細胞に由来する。いくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、歯髄、口腔粘膜、末梢血および羊水から選択される組織から単離される。いくつかの実施形態によれば、間葉系幹細胞は通常、以下のマーカーを発現する：ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、ＣＤ９０、およびＣＤ７３、ならびに、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３３を発現しない。

この方法は、間葉系幹細胞培養上清（ＭＳＣ−ＣＭ）から、または神経堤細胞培養上清（ＮＣＣ−ＣＭ）から、ＥＶを単離することを含み得る。ＥＶは、例えば、ＥＶの任意の特性に基づいて、関連付けられていない構成要素から分離されることによって分離され得る。例えば、ＥＶは、分子量、サイズ、形状、組成または生物学的活性に基づいて単離され得る。

培養上清は、分離中、分離前、または分離後の両方において、ろ過または濃縮され得る。例えば、それは、例えばサイズまたは分子量カットオフを有する膜などの膜を通してろ過されてもよい。タンジェントフォースろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または限外ろ過に供されてもよい。

例えば、この文書の他の場所にある分子量のアッセイに記載されているように、適切な分子量またはサイズカットオフの膜によるろ過を使用することができる。

任意選択的にろ過または濃縮された、あるいはその両方の培養上清は、カラムクロマトグラフィなどのさらなる分離手段に供されてもよい。例えば、様々なカラムを備えた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用することができる。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムである。

粒子の１つ以上の特性または生物活性を使用して、細胞培養上清の分画中にその活性を追跡することができる。一例として、光散乱、屈折率、動的光散乱または紫外可視検出器を使用して、粒子を追跡することができる。例えば、心臓保護活性などの治療活性を使用して、分画中の活性を追跡することができる。

以下の段落では、エキソソームなどの間葉系幹細胞ＥＶを取得する方法の具体的な非限定的な例を示す。

間葉系幹細胞ＥＶは、間葉系幹細胞を培地で培養して調整することで製造できる。培地は、ＤＭＥＭを含み得る。ＤＭＥＭは、フェノールレッドを含まないものであってもよい。培地には、インスリン、トランスフェリン、またはセレノプロテイン（ＩＴＳ）、またはこれらの任意の組み合わせを補充することができる。それは、ＦＧＦ２を含み得る。それは、ＰＤＧＦ ＡＢを含み得る。ＦＧＦ２の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２であってよい。ＰＤＧＦ ＡＢの濃度は約５ｎｇ／ｍｌであってよい。培地は、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンまたは−メルカプトエタノール、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。

細胞は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日以上、例えば３日間培養することができる。培養上清は、細胞を培地から分離することによって得ることができる。培養上清は、例えば５００ｇで遠心分離されてもよい。それは膜を通したろ過によって濃縮されてもよい。膜は、＞１０００ｋＤａの膜を含み得る。培養上清は、約５０倍以上濃縮され得る。

培養上清は、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィに供することができる。培養上清は、サイズ排除により分離され得る。セファロースなどのサイズ排除マトリックスを使用できる。例として、ＴＳＫ ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍまたはＴＳＫゲルＧ４０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍを使用できる。溶離液緩衝液は、生理食塩水などの任意の生理学的媒体を含み得る。それは、ｐＨ７．２で１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液を含み得る。クロマトグラフィシステムは、０．５ｍｌ／分の流速で平衡化することができる。溶出モードはアイソクラチックであってよい。２２０ｎｍのＵＶ吸光度を使用して、溶出の進行を追跡できる。画分は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）について調べることができる。

動的光散乱を示すことが判明している画分は保持することができる。例えば、上記のような一般的な方法によって生成され、１１〜１３分、例えば１２分の保持時間で溶出する画分は、動的光散乱を示すことが見出されている。このピークの粒子のｒ_ｈは約４５〜５５ｎｍである。このような画分は、エキソソームなどの間葉系幹細胞ＥＶを含む。

一実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である。一実施形態によれば、外因性ＰＴＥＮは、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドである。一実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。別の実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、疎水性部分とコンジュゲートする。一実施形態によれば、疎水性部分は、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、ペプチド、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドはコレステロールとコンジュゲートする。したがって、１つの態様において、ＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡはコレステロールとコンジュゲートする。

ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドもまた、ＥＶに直接担持され得ることが理解される。一実施形態では、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのＥＶへの直接担持は、エレクトロポレーションによって、および／またはトランスフェクション剤を使用して行われる。代替の実施形態では、担持は、エレクトロポレーションの非存在下および／またはトランスフェクション剤の非存在下で行われる。

一実施形態によれば、ＥＶを、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害剤とともに、核酸ベースの阻害剤を粒子に担持させるのに十分な時間インキュベートする。核酸ベースの阻害剤カーゴをＥＶに担持させるのに十分な時間は、特定のタイプのカーゴに対して最適化することができ、疎水性修飾を含むように修飾されている場合は、そのタイプの修飾に対して最適化することができる。一般に、核酸カーゴを粒子に効率的に担持させるには約１時間以下のインキュベーションで十分である。多くの場合、疎水的に修飾されたカーゴは、非常に短時間で、たとえば５分以内に効率的にエキソソームに担持される。したがって、いくつかの実施形態では、効率的な担持は、５分以下、例えば、１〜５分間のインキュベーション中に行われる。例示的な実施形態では、効率的な担持は、５分、１０分、１５分、２０分、３０分間などのインキュベーション中に行われる。他の実施形態では、効率的な担持は、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内などで行われ得る。

ＥＶへのオリゴヌクレオチドの担持は、温度に大きく依存しない。例示的な実施形態では、エキソソームは、３７℃でまたは約３７℃で担持する。他の実施形態では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、室温またはおよそ室温で担持し得る。他の実施形態では、エキソソームは、４℃でまたは約４℃で担持することができる。

いくつかの実施形態によれば、ＥＶは超遠心分離を使用せずに担持することができる。他の実施形態によれば、担持するにはさらに超遠心分離を含む。いくつかの実施形態によれば、調製方法は、担持されたＥＶの精製または単離のステップをさらに含む。一実施形態によれば、単離は、遠心分離、超遠心分離によって行われる。別の実施形態によれば、単離はろ過を介して行われる。一実施形態によれば、精製後の残存親細胞に対するＥＶの比は、少なくとも２、３、４、５、６、８または１０倍高く、または特定の有利な実施形態では、最初の材料よりも少なくとも５０倍、１００倍または１０００倍高い。いくつかの実施形態によれば、ＥＶは無細胞ＥＶである。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、ＥＶ、例えばエキソソームの調製方法を提供し、この方法は、ＥＶを２５〜４２℃の温度で０．５〜５時間、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのコレステロールコンジュゲートしたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドとインキュベートすることを含む。

一実施形態によれば、この方法は、遠心分離、超遠心分離を使用する、担持したＥＶの単離のステップをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、コレステロールの代わりに別の疎水性部分を使用することができる。一実施形態によれば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号２の核酸配列を含む。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号３の核酸配列を含む。特定の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号４の核酸配列を含む。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０の核酸配列を含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号１１の核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６の核酸配列に相補的である。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、配列番号６の核酸配列を標的とする。いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはｓｈＲＮＡである。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号２および３の核酸配列を含む。別の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号４および５の核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、配列番号１０および１１の核酸配列を含む。さらなる実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号６または７に注釈（ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ）のある核酸配列を含む。さらに別の実施形態によれば、ｓｈＲＮＡは、配列番号８および９から選択される配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＰＴＥＮタンパク質をコードする核酸のフラグメントに相補的な配列を含み、その発現を阻害する。一実施形態によれば、ＰＴＥＮは、配列番号１のアミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴの５０％超がエキソソームに担持される。したがって、いくつかの実施形態では、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴは、５〜４０％の効率でエキソソームに担持される。したがって、一実施形態では、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴは、１０〜３５％、１５〜３０％、または２０〜２５％の効率でエキソソームに担持される。たとえば、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴは、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、または５０％以上の効率でエキソソームに担持される。本明細書に記載される方法は、処理されるエキソソームの全てまたはほとんど全てへの疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドの組み込みをもたらす。例えば、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドとインキュベートされたエキソソームの少なくとも８０％には、オリゴヌクレオチドが担持される。いくつかの実施形態では、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴは、オリゴヌクレオチドとインキュベートされたエキソソームの少なくとも９０％に組み込まれる。したがって、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％以上のエキソソームにオリゴヌクレオチドカーゴが担持されている、エキソソームの集団を容易に得ることができる。一実施形態では、エキソソームの少なくとも９９％に、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドが担持される。

ＥＶ（例えばエキソソーム）には、粒子（例えばエキソソーム）あたり５００を超えるオリゴヌクレオチド分子を担持でき、例えばエキソソームあたり、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００以上のオリゴヌクレオチドを担持できる。一実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり平均約５００〜３０００のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり平均約５００〜１０００のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり平均約１０００〜１５００のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり平均約１０００〜２０００のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり平均約１０００〜３０００のオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、エキソソームは、エキソソームあたり最大約３０００のオリゴヌクレオチドを含む。エキソソームに担持できる疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴの量は、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドカーゴがエキソソーム膜のかなりの割合を占める、エキソソームの生成を可能にする。例えば、オリゴヌクレオチドカーゴが粒子の表面積の約１〜１０％を占める、例えば、粒子の表面積の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％を占めるＥＶ（例えば、エキソソーム）を生成することができる。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドカーゴは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。他の実施形態によれば、疎水的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、疎水性部分、例えばコレステロール部分とコンジュゲートしたＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。

いくつかの実施形態によれば、脂質二重層リン脂質膜小胞はリポソームである。そのような実施形態によれば、リポソームは、ＥＶについて記載されたものと同じ方法で担持される。

他の実施形態によれば、ＰＴＥＮ ＲＮＡｉ阻害剤を担持したＥＶは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドまたは細胞内で前記ＲＮＡｉ阻害剤をコードし、発現または生成することができるポリヌクレオチドで人工的に担持された細胞から得ることができる。この場合、ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチド剤は、構成的または誘導可能な様式で剤の発現を指示することができるシス作用調節エレメント（例えばプロモータ）の制御下で核酸構築物に連結される。

核酸剤は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入など）を使用して送達され得る。任意選択的に、適切な発現系が使用される。適切な構築物の例には、おのおのがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．から入手可能な、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏが含まれるが、これらに限定されない。

発現構築物はウイルスであってもよい。ウイルス構築物の例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

レトロウイルス構築物などのウイルス構築物には、少なくとも１つの転写プロモータ／エンハンサまたは遺伝子座定義要素（複数可）、または選択的スプライシング、核ＲＮＡ外輸送、メッセンジャーの転写後修飾など、他の手段によって遺伝子発現を制御する他の要素が含まれる。そのようなベクター構築物はまた、パッケージングシグナル、長い末端反復（ＬＴＲ）またはその一部、およびウイルス構築物中にすでに存在しない限り、使用されるウイルスに適切なプラスおよびマイナス鎖プライマー結合部位を含む。さらに、そのような構築物は、典型的には、それが置かれる宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列または本発明のペプチド変異体のシグナル配列である。必要に応じて、構築物はまた、ポリアデニル化を指示するシグナル、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。

好ましくは、感染のウイルス用量は、少なくとも１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５以上のｐｆｕまたはウイルス粒子である。

二本鎖ＲＮＡは、遺伝子セグメントの末端に２つの対向するプロモータを付加することにより合成することができ、一方のプロモータは遺伝子の５’の直近に配置され、反対のプロモータは遺伝子セグメントの３’の直近に配置される。次に、ｄｓＲＮＡを適切なポリメラーゼで転写することができる。

別の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド剤を培養中の細胞とインキュベートして、細胞による核酸の効率的な取り込みをもたらすことができる。そのような実施形態の場合、好ましくは、本明細書の以下でさらに説明するように、核酸剤は疎水的に修飾される。

本明細書に記載の核酸剤を粒子に担持させるために使用される方法に関係なく、次に細胞は、ＥＶ、例えばエキソソームの産生に十分な時間インキュベートされる。培地から単離されたエキソソームは、細胞によって取り込まれ、産生され、または発現される核酸分子を担持したエキソソームを含む。したがって、一実施形態では、ＥＶにオリゴヌクレオチドカーゴを担持させる方法であって、ＥＶ産生（例えば、エキソソーム産生）が可能な細胞をオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドが細胞によって内在化されるのに十分な時間、インキュベートすることと、細胞をエキソソーム分泌に十分な時間培養することと、培地からオリゴヌクレオチドを担持したエキソソームを単離することと、を含む、方法が提供される。

いくつかの実施形態によれば、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つに従って調製された単離した細胞外小胞を提供する。別の実施形態によれば、本発明は、上記の実施形態のいずれか１つに従って調製された細胞外小胞を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、そのような単離した細胞外小胞および薬学的組成物は、脊髄損傷などの神経学的疾患または状態の治療に有用である。

本発明の粒子または薬学的組成物は、少なくともいくつかの実施形態では、すぐに使用できるシリンジ内の単位剤形に事前包装されてもよい。シリンジは、粒子の名前とその供給源のラベル付けができる。ラベル付けはまた、粒子の機能に関連する情報を含み得る。シリンジは、粒子に関する情報もラベル付けされたパッケージに包装されてもよい。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語は、本明細書では互換的に使用され、「少なくとも部分的に構成される」という意味を有する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が含まれる本明細書の各記載を解釈するとき、それ以外の特徴またはこの用語で始まる特徴も存在する可能性がある。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの関連用語も同様に解釈される。「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の意味を包含し得、これらの用語によって置換され得る。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、具体的に説明または列挙されていない構成要素、ステップ、または手順を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物または構成要素が追加の成分を含み得るが、追加の成分が請求項に係る組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変更しない場合のみを意味する。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、特定した値から＋／−１０％、または＋／−５％、＋／−１％あるいは＋／−０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を指示しない限り、複数形の言及を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲とその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示された部分範囲、およびその範囲内の個々の数１、２、３、４、５、６などがあると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の表示する数と第２の表示する数の「間の範囲／範囲」および第１の表示する数「から」第２の表示する数「への範囲／範囲」という表現は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の表示する数ならびにそれらの間のすべての分数と整数を含むことを意味する。

本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所与の課題を達成するための方法、手段、技法および手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の技術の実務医による既知の方法、手段、技法および手順、あるいは既知の方法、手段、技法および手順から容易に開発された方法、手段、技法および手順を含むがこれらに限定されない。

明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態に組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、本発明の様々な特徴は、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明されているが、本発明の他の説明された実施形態では、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで、または適切に、提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの構成要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。

上記で描写され、以下の特許請求の範囲で請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的支持が見出される。

本発明の別の態様によれば、脊髄損傷の治療に使用するための神経堤細胞に由来するエキソソームが提供された。

ここで、以下の実施例を参照するが、これは、上記の説明とともに、本発明のいくつかの実施形態を非限定的な方法で示している。

一般に、本明細書で使用される命名法および本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。

材料および方法
間葉系幹細胞の調製
骨髄由来のヒトＭＳＣはＬｏｎｚａ（スイス、バーゼル）から購入した。前述のように細胞を培養し、増大させた。エキソソームを収集する前に、細胞をエキソソームを含まない血小板で培養し、３日後に培地を収集した。ＭＳＣ−ｅｘｏを、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で５分間標識し、超遠心分離法（１００，０００ｇ、２時間、４℃）を使用して洗浄した。ペレットを２００μｌのＰＢＳで再懸濁した。

エキソソーム精製プロトコル
ヒトＭＳＣはＬｏｎｚａ（バーゼル、スイス）から購入した。細胞を培養し、増大させた。細胞をエキソソームを含まない血小板溶解液（Ｒａｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、イスラエル）で培養し、３日後に培地を収集した。エキソソームを、標準的な分画遠心プロトコルを使用して精製し、これには、培養液を分離し、３００ｇで１０分間遠心分離することが含まれていた。上清を回収し、２，０００ｇで１０分間遠心分離した後、１０，０００ｇで３０分間再遠心した。次に上澄みを０．２２μｍフィルターに通し、１００，０００ｇで７０分間遠心分離した。エキソソームとタンパク質を含むペレットをＰＢＳで洗浄し、１００，０００ｇで７０分間遠心分離した。ペレットを２００μｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁した。すべての遠心分離は４℃で行った。エキソソームを、ＮａｎｏＳｉｇｈｔテクノロジー、電子顕微鏡および、陰性マーカーとしてカルネキシン、陽性マーカーとしてＣＤ９およびＣＤ８１のウエスタンブロット法を用いて特徴付けした。

間葉系幹細胞エキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）蛍光標識
ＭＳＣ−ＥｘｏをＰＫＨ２６／ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ）で５分間標識し、超遠心分離法（１００，０００ｇ、２時間、４℃）を使用してＰＢＳで洗浄した。ペレットを２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ＰＴＸ実験では、ＭＳＣ−Ｅｘｏを５μｌのＰＴＸで３７℃で１０分間懸濁し、ＰＫＨ２６で標識し、１００，０００ｇで２時間遠心分離した。ＭＳＣ−Ｅｘｏ＋ＰＫＨ６７およびＭＳＣ−Ｅｘｏ＋ＰＴＸ＋ＰＫＨ２６を同じラットに一緒に投与した（ｎ＝３）。

金ナノ粒子（ＧＮＰ）の合成とコンジュゲーション
３．７５ｍｌのリノール酸（１８％）、オレイン酸（６５％）、パルミチン酸（１６％）およびエタノール（１％）の混合物、２００ｍｇのＮａＯＨおよび１５ｍｌのエタノールを３０ｍｌのＤＤＷに加えた。溶液を５分間撹拌した。次に、５０ミリグラムのＨＡｕＣｌ_４を撹拌しながら加え、続いて５ｍｌのアスコルビン酸（０．０５Ｍ）を加え、さらに１分間撹拌した。次に、ＰＥＧ７溶液（２．２６×１０^−３ｇ）をＧＮＰ溶液に加え、混合物を１時間撹拌した。次に、ＮａＯＨを使用してｐＨを９に調整し、溶液をさらに１時間撹拌した。８０ｍｌのｎ−ヘキサンを加えた後、溶液を１時間撹拌した。次に、ＨＣｌ溶液（３７％）を使用して得られた混合物のｐＨを７に調整した。混合物を相分離のために漏斗に入れた（有機および水性）。真空を使用して水相を蒸発させた。次に、過剰のカルボジイミド（１．８７×１０^−３ｇ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、イリノイ州、ロックフォード）（２．１２×１０^−３ｇ）を溶液に加え、続いて２ＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．）（１．７５×１０^−３ｇ）を加えた。合計２．８×１０^１０エキソソーム（１ｍｌ生理食塩水中の２００μｌエキソソーム）を３７℃で３時間、グルコース被覆ＧＮＰ（３５ｍｇ／ｍＬ、１００μｌ）とインキュベートした。次に、エキソソームを２時間遠心分離した（１００，０００ｇ、４℃）。

ＧＮＰの特性評価
透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１４００、ＪＥＯＬ）を使用して、ＧＮＰのサイズと形状を測定し、これらを、紫外可視分光法（ＵＶ−１６５０ ＰＣ、島津製作所、日本、京都）、ζ−ポテンシャル（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ３０００ＨＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国、マルバーン）、および動的光散乱法を使用してさらに特徴付けした。

ＧＮＰの定量化
フレーム原子吸光分析（ＳｐｅｃｔｒＡＡ １４０、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して、いくつかの主要な臓器（心臓、肺、肺、腎臓、脾臓）の金の量を測定した。解剖した組織を１ｍｌの王水の酸（硝酸と塩酸の１：３混合物）で溶解させ、それを蒸発させてから、総容量４ｍｌに希釈した。０．４５ｎｍシリンジフィルターでサンプルをろ過した後、既知の金濃度の溶液を使用して作成した検量線を使用して金濃度を決定した。誘導結合プラズマ分光分析法（ＩＣＰ）を使用して、脳と脊髄病変の金の量を測定した。組織を新たに抽出し、５５０℃で５時間燃焼した。次に、融解した組織に５ｍｌの１％ＨＮＯ_３を加え、０．４５μｍフィルターでろ過した。試料中の金濃度を、金標準曲線との相関関係で決定した。

エキソソームへの担持
ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）チューブ中でエキソソーム（４０μｌ、約１０^１０個のエキソソーム）に０．１ｎｍｏｌのｃｙ３−ＭＡＰＫ−ｓｉＲＮＡ（Ａｄｖｉｒｎａ Ｃｏｍｐａｎｙ）を担持させ、３７℃で１〜３時間インキュベートした。次に、懸濁液をＮａｎｏｓｉｇｈｔ分析にかけた。蛍光対非蛍光エキソソームの濃度比を、担持効率として定義した。

インビボ実験では、４０μｌエキソソームに０．１ｎｍｏｌ ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（Ａｄｖｉｒｎａ Ｃｏｍｐａｎｙ）を３７℃で２〜３時間担持させた後、ＳＣＩラットに鼻腔内投与した。ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡを担持したエキソソームを、ＥｘｏＰＴＥＮと呼ぶ。

後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの軸索伸長
成体のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００−２５０ｇ）からの胸部および腰部レベルの後根神経節を解剖し、氷冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に浸した。ＤＲＧをＨＢＳＳで洗浄し、２．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）４ｍｌを含有している小皿に移し、外科用ブレードを使用して小片に解体し、３７℃で４０分間インキュベートした。溶液を２００ｇで、３分間遠心分離してコラゲナーゼを除去し、Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ、１１７６５）、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル、ベイト−ヘメク）、１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する２ｍｌの培地に、１ｍｌピペットチップで約２０回粉砕することにより再懸濁した。細胞を、１２ウェルプレート内でラミニン（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２０２０）でプレコートされた１５ｍｍカバースリップごとに、ウェルあたり５×１０^４の密度で５時間播種した。次に、ＤＲＧ培地を、通常のＤＲＧ培地、４０μｌエキソソーム、０．１ｎｍｏｌ非標的化対照（Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＮＴＣ）ｓｉＲＮＡ、０．１ｎｍｏｌ ＰＴＥＮ ｓｉＲＮＡ、または４０μｌエキソソームに担持した０．１ｎｍｏｌ ＰＴＥＮ ｓｉＲＮＡ、を含有するものと交換した。

ｓｉＲＮＡで標的化されたＰＴＥＮの配列は、配列番号６（５’−ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡ−３’）に示されるとおりである。コレステロールとコンジュゲートとした核酸配列５’−ＧＡＧＵＵＣＵＵＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１０）を含む一本鎖と核酸配列５’−ＵＵＣＵＧＵＵＵＧＵＧＧＡＡＧＡＡＣＵＣ−３’（配列番号１１）を含む二本鎖ｓｉＲＮＡを使用して、ＰＴＥＮ発現を阻害した。

播種２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定し、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１０分間透過処理し、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、５％ウシ血清で２時間ブロックし、４℃で５％ウシ血清中のマウス抗チューブリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、１：５００）で一晩インキュベートした。次に、試料をロバ抗マウスＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：８００）およびＤＡＰＩ（１：１０００）と３時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、試料をマウントし、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００）で観察した。ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（バージョン８．２０）を使用して画像を処理し、神経突起の分岐レベル、最大分岐レベル、神経突起の数、神経突起の全長を定量化した。パラメータは次のように設定され、すべての画像に適用された：最大直径６０μｍ、最細直径０．６μｍ、開始点の閾値１０μｍ〜６０μｍ、シード点（ｓｅｅｄ ｐｏｉｎｔ）の閾値１０μｍ、球状領域の直径２４μｍの開始点の周りのシード点を削除、最大ギャップ長を６０μｍとすることを許容する。

脳と脊髄のエクスビボＣＴスキャン：
脳と脊髄の試料を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに３日間固定してから、異なった灰白質と白質を区別するために、７．５％パラホルムアルデヒドで希釈した１５０ｍｇ／ｍＬの非イオン性ヨウ素化造影剤（ロパミドール、Ｂａｙｅｒ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａ、日本）に４℃で７日間浸漬した。ＣＴイメージングの前に、試料を溶液から取り出し、吸い取り乾燥して、イメージング用の試料ホルダーに入れた。脱水を防ぐために、試料ホルダーをプラスチックフィルムで密封した。試料のエクスビボマイクロＣＴスキャンは、公称分解能３５μｍ、０．２ｍｍアルミニウムフィルター、管電圧４５ｋＶを備えるマイクロＣＴスキャナー（Ｓｋｙｓｃａｎ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ １１７６）を使用して実行された。再構成は、ＧＰＵによって加速されたＳｋｙＳｃａｎＮＲｅｃｏｎソフトウェアを使用して、修正Ｆｅｌｄｋａｍｐアルゴリズムで行われた。リングアーチファクトの低減、ガウス平滑化（３％）、およびビームハードニング補正（２５％）が適用された。ボリュームレンダリングした３次元（３Ｄ）画像は、ＳｋｙＳｃａｎ ＣＴ−Ｖｏｌｕｍｅ（「ＣＴＶｏｌ」）ソフトウェアおよびＳｋｙＳｃａｎ ＣＴ−Ｖｏｘｅｌ（「ＣＴＶｏｘ」）ソフトウェアのＲＧＢＡ伝達関数を使用して生成された。

免疫蛍光分析
脊髄を解剖し、４％ＰＦＡで一晩固定し、３０％ショ糖溶液で一晩凍結保護し、最適な切断温度コンパウンド（ＯＣＴ）に包埋し、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０、ドイツ）を使用して縦方向に切断（２０μｍ）した。切片を０．５％Ｔｗｅｅｎ溶液で透過処理し、５％ウシ血清でブロックしてから、ウサギ抗チューブリン（Ａｂｃａｍ、１：５００）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＣＤ１１ｂ（１：５００、ＢｉｏＲａｄ、）またはマウス抗ＣＤ３１（１：５０、ＢＤ）抗体と、４℃で一晩インキュベートした。次に、切片をヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：８００）、およびＤＡＰＩ（１：１０００）で３時間インキュベートし、カバースリップを取り付け、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００）を使用して画像化した。

脊髄損傷モデル
すべての動物実験は、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって承認されたプロトコルに厳密に準拠して行われた。動物の無作為化は、治療について知らされていない実験者によって行われた。メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ成体ラットは、手術中、キシラジン（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（６０〜９０ｍｇ／ｋｇ）の混合物と、維持用量の１〜２％のイソフルラン（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）で麻酔した。９〜１１番目の胸椎レベルで椎弓切除術を行った後、マイクロシザー（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、脊髄をＴ１０レベルで完全に離断した。吻側および尾側の断端を持ち上げて完全に離断し、フック（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を生成されたギャップの内側に円形に通して、脊柱管の下部に線維が残っていないことを確認した。この研究で評価された群は、離断対照（ｎ＝１５）、鼻腔内エキソソーム対照（ｎ＝１０）、鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮ（ｎ＝７）、病変内ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（ｎ＝３）および病変内ＥｘｏＰＴＥＮ（ｎ＝４）として指定された。次に筋層と皮膚を縫合し、ラットを温度制御されたインキュベーションチャンバーに入れた。鼻腔内治療では、ラットに４０μｌの生理食塩水、４０μｌのエキソソーム、または４０μｌのＥｘｏＰＴＥＮを術後２〜３時間、２４時間ごとに５日間鼻腔内投与した。病変内治療では、脊髄損傷が生じたときに、ラットに４０μｌのＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（０．１ｎｍｏｌ）または４０μｌのＥｘｏＰＴＥＮを１回だけ投与した。膀胱機能が回復するまで膀胱マッサージを１日２回行った。抗生物質（セファゾリン、２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回）を１週間、毎日注射した。ブプレノルフィン（Ｂａｙｅｒ）を、手術前と手術後３日目に０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で投与された。シクロスポリン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を１週間、すべてのラットに投与した。

行動分析
運動回復を評価し、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動スケール法を使用して盲検の実験者によって評価およびスコア化された。測定は、移植後２〜３日、その後７日に１回行われた。概日変動を避けるために、すべての測定は同じ時刻に行われた。ベースラインＢＢＢは、手術後の最初の試験で記録された値として定義された。週間スコアは、各暦週に得られた最低のスコアであった。感覚回復は、フォンフライフィラメント試験を使用して評価された。曲げ力の勾配を有するフィラメント（Ｂｉｏｓｅｂ）を足に適用して、侵害受容反応（刺激からの足の素早い逃避（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ））を誘発した。逃避閾値は、３回の試行のうち少なくとも２回で、試行間隔の少なくとも３０秒間に、肯定的な反応を誘発する最小の力として定義される。

ＭＲＩ
ＭＲＩは、シグナル励起用の円筒形ボリュームコイル（内径８６ｍｍ）とシグナル受信用のシングルチャネルの表面コイル（直径２０ｍｍ）を使用して、９．４Ｔボアスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃ、ドイツ、エットリンゲン）で、実行した。動物は麻酔下にあり（０．５〜１．５％イソフルラン）、酸素（０．５Ｌ／分）を補給した。イメージング中に呼吸を監視し（Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州、ニューヨーク、ストーニーブルック）、サーモスタットで調整された循環温水を使用して体温を維持した。ＤＴＩイメージングの前に、ＲＡＲＥシーケンスを使用して矢状および軸方向のＴ２強調解剖学的スキャンを取得し、ＤＴＩスキャンスライスジオメトリを決定した。ＲＡＲＥ取得パラメータは以下の通りであった：厚さ０．８ｍｍ、ＦＯＶ＝３×３ｃｍ、マトリックス寸法＝１９２×１９２、（空間分解能＝１５６×１５６μｍ^２）、繰り返し／エコー時間（ＴＲ／ＴＥ）＝１２００／１６．２２ミリ秒、４つの平均。ＤＴＩイメージングは、ＥＰＩ−ＤＴＩシーケンスを使用して次のパラメータで取得した：３０の非コリニア（ｎｏｎ−ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）勾配方向、３Ａ_０画像、ｂ＝１０００秒／ｍｍ^２、差分持続時間（δ）＝２．６、差分分離（Δ）＝１１、２つの平均、厚さ０．８ｍｍ、ＦＯＶ＝３×３センチメートル、マトリックス寸法＝１９２×１９２、（空間分解能＝１５６×１５６μｍ^２）。ＤＴＩ計算と線維追跡は、ＥｘｐｌｏｒｅＤＴＩソフトウェアを使用して実行された（Ｌｅｅｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。得られたテンソルは、それらの固有成分にスペクトル分解された。固有値を使用して、異方性度（ＦＡ）マップを計算した。脊髄の関心領域（ＲＯＩ）（白質および灰白質）を手動で各スライスに分割した。トラクトグラフィは決定論的（ストリームライン）線維追跡を使用して適用され、ＦＡが０．２未満のボクセルで終了するか、３０°（Ｂａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００）を超えるトラクトの方向の変化に続いて、０．０７８ｍｍのステップサイズ、０．２〜１００ｍｍの線維長で終了した。手動で選択したＲＯＩを通過した線維は、ストリームラインとしてプロットされた。

電気生理学
８週目に、病変を通る神経シグナルの伝播を記録するために電気生理学が行われた。ケタミン／キシラジン麻酔後、ラットを定位固定装置に入れ、頭皮に正中切開を行った。頭蓋を露出させ、正中線の右２ｍｍ、ブレグマの前方および後方にそれぞれ−１．０ｍｍおよび＋４．０ｍｍの位置に、２つの電気刺激スクリュー電極を埋め込んだ。スクリュー電極を刺激装置の出力端子に接続した。脚後部の坐骨神経を露出させ、２つの銀線フック電極を挿入した。別のワイヤが脚の足蹠に挿入され、接地電極として機能した。増幅されたシグナルは、０．１〜３ｋＨｚのバンドパスフィルター処理され（７ＤＡドライバーアンプを備えた７Ｐ５１１ ＡＣ広帯域プリアンプ、Ｇｒａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロードアイランド州ワーウィック）、デジタル化され（ＮＩ ＵＳＢ−６３４１アナログデジタルコンバータ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））、１０ｋＨｚで取得され、ＷｉｎＷＣＰソフトウェアパッケージを実行しているパーソナルコンピューターに保存された（英国、ストラスクライド大学のＪｏｈｎ Ｄｅｍｐｓｔｅｒ博士の厚意による）。刺激強度は、最初の動物の後肢の収縮と信頼できる坐骨神経複合活動電位（ＣＡＰ）の出現に応じて選択され、実験全体を通して維持された。

ウエスタンブロッティング
病変した脊髄セグメントと肝臓を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１００ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌロイペプチン、５０ｍＭオルタバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭアプロチニン、Ｓｉｇｍａ）を含む、ＲＩＰＡ溶液（（１％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）（Ｓｉｇｍａ）、１％１００ｘ−Ｔｒｉｔｏｎ（Ｂｉｏｌａｂ）、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ））に入れた。組織をホモジナイズし、２０μｇの総タンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロースメンブレンに９０分間転写した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中の２％ＢＳＡで３時間ブロッキングした後、膜をＴＢＳＴの２％ＢＳＡ中、抗ＰＴＥＮ、１：１０００（マウスモノクローナル、カタログ番号９５５６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または抗β−アクチン、１：１０００（ウサギモノクローナル、カタログ番号８４５７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をローディングコントロールとして、一晩インキュベートした。翌日、ＴＢＳＴで３回すすいだ後、膜を抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００、ＮＡ９３４Ｖ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００、ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で２時間インキュベートした。シグナルは、ブロットを強化された化学発光試薬（カタログ番号１７０５０６１、ＢｉｏＲａｄ）に曝露し、続いてＬＡＳ−３０００イメージングシステム（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）に曝露することにより現像した。

ＲＴ−ｑＰＣＲ
損傷した脊髄組織および肝臓からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して抽出し、第１鎖ＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造元の指示に従って合成された。リアルタイム定量ＰＣＲをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムで実行した。プライマーには、ＰＴＥＮ（（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、アッセイＩＤ：Ｒｎ００４７７２０８）またはＧＡＰＤＨ（（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、アッセイＩＤ：Ｒｎ０１７７５７６３−ｇ１）が含まれていた。増幅反応条件は、９５℃で２０秒間、続いて４０サイクルの９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間を、１０μｌ反応で３回繰り返したものである。相対的な発現レベルは、目的の遺伝子がＧＡＰＤＨ発現に標準化されたΔΔＣｔ法を使用して決定された。

神経解剖学的追跡
皮質脊髄軸索を追跡するために、６週目にビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）で順行性追跡をラットに行った。上記のケタミンおよびキシラジン麻酔下で、ラットを定位固定フレームに配置した。頭皮の毛を剃り、その領域をエタノールで拭き取り、感覚運動皮質の上の頭蓋骨に小さな穴を開けた。引っ張られたガラス製マイクロピペットを備えたハミルトンマイクロシリンジを使用して、以下の座標を使用して、１μｌの１０％ＢＤＡ（ＭＷ １０，０００、Ｄ１９５６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１部位あたり２分かけて、注射の間隔を２分間隔で、半球あたり８部位に注入した：ＡＰ＋１．０，ＭＬ±２．０；ＡＰ ０，ＭＬ±１．５；ＡＰ−１．０，ＭＬ±１．５；ＡＰ −２．０，ＭＬ±１．５；ＤＶ １．５ｍｍ。すべての注射が完了した後、頭皮を縫合し、ラットが回復するまで回復チャンバーに置いた。８週目に、ラットをケタミンとキシラジンで深く麻酔し、４％ＰＦＡを経心臓的に灌流した。病変を含む脊髄の切片を採取し、３０％ショ糖で凍結保護し、ＯＣＴに包埋し、縦方向に２０μｍの厚さのスライスに切断した。切片をＰＢＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４結合ストレプトアビジン（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ３２３５６）とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、マウントしてカバースリップで覆った。

統計分析
統計分析は、ＭＡＴＬＡＢ／Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＵＳＡ）を使用して行った。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用して、２つの群を比較した。特に明記しない限り、残りのデータは一元配置または二元配置分散分析を使用して、事後のチューキーの多重比較で分析された。群化されたすべてのデータは、平均±ＳＥＭとして表される。有意水準：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

実施例１−鼻腔内ＭＳＣ−ＥｘｏはＢＢＢを通過し、脊髄に移行する
間葉系幹細胞のエキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）から単離されたエキソソームは、平均サイズが１１１±６４ｎｍ、濃度が４０．４３×１０^８粒子／ｍｌであった（図Ｓ１Ｄ−Ｅ）。Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで可視化されたＭＳＣ−Ｅｘｏは、典型的な球の形状を示した。ＭＳＣ−ＥｘｏがＢＢＢを通過できるかどうかを調べるために、（Ｂｅｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１，１０８８３−１０８９３）に記載されているように、ＭＳＣ−Ｅｘｏを金ナノ粒子（ＧＮＰ）で標識した。ＧＮＰを担持したＭＳＣ−ＥｘｏのＣｒｙｏ−ＴＥＭイメージングは、ＧＮＰがエキソソームに取り込まれることを示した（図１）。鼻腔内（ＩＮ）投与後にＭＳＣ−Ｅｘｏが血液脳関門を通過できるかどうかを調べるために、ＧＮＰを担持したＭＳＣ−Ｅｘｏを脊髄の完全切除後３時間でＩＮ投与した。投与２４時間後のマイクロＣＴスキャンでは、脊髄病変領域に有意なＧＮＰ蓄積が見られたが、脳には見られなかった（図２、上パネル）。対照的に、健康な対照では、ＧＮＰは主に脳と嗅球に局在していた（図２、下のパネル）。誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）の評価により、Ｔ１０脊髄分節領域のＧＮＰの量は、健常対照と比較して負傷したラットで有意に高かったことが確認された（図３Ａ、一元配置分散分析Ｆ（３，８）＝２７．５、ｐ＜０．００１、チューキー）。同様に、健康なラットと比較して、損傷したＴ１０脊髄分節領域に蓄積したＩＮ投与ＰＫＨ２６（赤色の親油性色素）標識されたエキソソームの量が、有意に高かった（図４、ｔ（１４）＝３．２１、ｐ＜０．０１）。ＣＮＳの定性的マイクロＣＴスキャンと定量的ＩＣＰ試験は、脊髄病変の免疫蛍光染色とともに、ＭＳＣ−Ｅｘｏが血液脳関門を透過し、脊髄病変に帰巣することを示した。意外なことに、ＭＳＣ−Ｅｘｏは脊髄損傷のラットでは、損傷した領域で有意により多く見られたが、健康なラットでは脳で多く見られた。

鼻腔内投与後のＭＳＣ−Ｅｘｏの生体内分布を調べるために、フレーム原子吸光分光法（ＦＡＡＳ）を導入して、投与後２４時間の主要臓器（肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓）のＧＮＰを定量化した。肺、心臓および脾臓において健康なラットと負傷したラットのＭＳＣ−Ｅｘｏレベルの間に有意差は見られなかった。ただし、健康なラットの肝臓と腎臓では、負傷したラットと比較してより高いレベルが見られ、無傷のラットではＭＳＣ−Ｅｘｏの***がより迅速であることを示した（図４、右パネル、一元配置分散分析Ｆ（９，１０）＝１２．９２、ｐ＜０．００１、サイダックの多重比較検定）。

さらに、ＰＫＨ２６（赤）で標識されたエキソソームのケモカイン受容体を百日咳毒素でブロックすると、ＭＳＣ−Ｅｘｏの病変に移行する能力を劇的に低下させることを示した。特定の細胞型によるＭＳＣ−Ｅｘｏの優先的な取り込みが脊髄病変に存在するかどうかを判断するために、損傷後２〜３時間のラットにＰＫＨ２６−ＥｘｏをＩＮ投与してから２４時間後に損傷したセグメントのニューロン、アストロサイト、およびミクログリアを免疫染色した。ＭＳＣ−Ｅｘｏは主にニューロンに共局在し、アストロサイトと活性化ミクログリアにはそれほど局在しないことがわかった（図５、一元配置分散分析、Ｆ（２，１３）＝１１．５９、ｐ＞０．０１、チューキー）。

実施例２．ＭＳＣ−Ｅｘｏに担持されたＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡは、インビトロで強力にＤＲＧニューロンの伸長を促進する
ＭＳＣ−Ｅｘｏには、材料と方法で説明されているように、コレステロールをコンジュゲートした非コーディングｃｙ３−ＭＡＰＫ−ｓｉＲＮＡを担持させた。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ分析は、効率的なｃｙ３−ＭＡＰＫ−ｓｉＲＮＡの担持を示した（３３．６４％）（図６）。

ｓｉＲＮＡを含むＭＳＣ−Ｅｘｏによって送達されるＰＴＥＮ阻害が軸索の成長を調節できるかどうかを試験するために、次に自己送達可能なＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡをＭＳＣ−Ｅｘｏに担持させ（以下、ＥｘｏＰＴＥＮと呼ぶ）、培養中の後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達した。ＥｘｏＰＴＥＮ治療の１日後、ＤＲＧニューロンは、培地のみ、非標的化対照ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ−ｓｉＲＮＡ）、ＭＳＣ−Ｅｘｏ、またはＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡのみで治療されたニューロンと比較して、より複雑な分岐および伸長した形態を特徴とした（図７）。分岐レベルの中央値では、ＥｘｏＰＴＥＮ治療ニューロンは有意に高い分岐点数を示した（図８、一元配置分散分析、ｐ＜０．００１、チューキー）。神経突起の全長、神経突起数、分岐点、最大分岐レベルはすべて、ＥｘｏＰＴＥＮで治療されたニューロンで有意に高かった。より具体的には、何も治療していないニューロンよりもそれぞれ６．６倍、６．６倍、６．８倍、２．３倍高くなった（図９、一元配置分散分析、すべてｐ＜０．００１、チューキー）。ＭＳＣ−ＥｘｏとＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡの両方が単独でＤＲＧニューロンの伸長を同程度に誘発したが、ＥｘｏＰＴＥＮ治療ほど劇的ではなかった。

実施例３．鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮは脊髄病変におけるＰＴＥＮ発現を抑制する
インビボでのＥｘｏＰＴＥＮのサイレンシング効果を確認するために、ＥｘｏＰＴＥＮを、完全に脊髄離断した日から開始して５日間連続して鼻腔内投与した。８週目における、ＳＣＩ領域から抽出されたタンパク質のウエスタンブロット分析は、ＥｘｏＰＴＥＮ治療したＳＣＩラットでは未治療のＳＣＩラットと比較して、ＰＴＥＮタンパク質レベルの５９％減少を示した（図１０Ａ、クラスカル・ワリス検定、ｐ＝０．０６２７）。群間で肝組織のタンパク質レベルに有意な変化は見られなかった（図１０Ｂ、ｐ＝０．８６４３）。並行して、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析では、ＥｘｏＰＴＥＮ治療したＳＣＩラットのＰＴＥＮ遺伝子発現が未治療のＳＣＩラットと比較して３２％減少したが（図１０Ｃ、ｐ＝０．１５２０）、肝臓では遺伝子発現は同等であったことが示された（図１０Ｄ、ｐ＞０．９９９９）。

実施例４．鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮは、完全なＳＣＩラットにおける有意な機能回復を可能にする
ＥｘｏＰＴＥＮ治療の神経保護の可能性を評価するために、完全なＳＣＩのラットを５つの群に分けた：（１）未治療、（２）病変内（ＩＬ）ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ治療、（３）病変内ＥｘｏＰＴＥＮ単回投与、（４）５日間連続でエキソソームをＩＮ投与、（５）５日間連続でＥｘｏＰＴＥＮをＩＮ投与（損傷の日から開始する）。ラットは、８週間、毎週ＢＢＢ運動スコアリングを受けた。５日間のＩＮ ＥｘｏＰＴＥＮ投与は、他のすべての治療群と比較して、有意な自発運動回復をもたらした（それぞれ、Ｆ（４，３００）＝３５．７２、ｐ＜０．０００１、Ｆ（８，３００）＝２．９３１、ｐ＜０．００１）。より具体的には、８週目に、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）群の平均ＢＢＢ運動スコア（図１１Ａ）は７．７５±２．１４に達し、未治療の離断ラットの平均０．３９±０．１４スコアとは対照的であった（ｐ＜０．００１）。ＥｘｏＰＴＥＮで鼻腔内治療された群と空のエキソソームで鼻腔内治療された群の間には、統計的に有意な差が観察された（図１１Ａ）。ＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（ＩＬ）、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＬ）、およびエキソソーム（ＩＮ）の群において、わずかであるが、統計的に有意ではない（すべてｐ＞０．０５）改善が８週目に測定され、ＢＢＢ運動スコアはそれぞれ、２．１７±１．４８、２．５０±１．２１、２．００±１．２３であった（図１１Ａ）。８週間を通して、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）治療ラットの２８．６％が、一貫した足底ステッピング、トウクリアランス（ｔｏｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、一貫した前肢−後肢の協調を反映してＢＢＢ運動スコア≧１４を示したが、他の治療群ではこの運動改善のレベルを達成できなかった（図１１Ｂ）。ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）で治療したラットも、他の群よりも早く体重が増加し、５週目に横ばい状態になった（図１１Ｃ）。さらに、８週目に、ラットの体重とＢＢＢ運動スコアの間に正の相関が認められた（図１１Ｄ、ピアソンの係数相関＝０．６８１９、ｐ＜０．０００１）。曲げ力の勾配（６、８、１０、１５、２６、６０、１００、１８０、３００ｇ）を使用したフォンフライフィラメントテストを後肢に適用し、感覚回復の指標として足の逃避閾値を決定した。健康なラットで足の逃避を誘発するためのカットオフ閾値を６０ｇに設定し、それ以下では逃避反応を異痛症と見なした。ＳＣＩ後、３００ｇのフィラメントヘアに反応したラットはなく、感覚機能の完全な廃止を示した。正常な感覚反応は、４週目にＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＬ）およびＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）における動物のそれぞれ２５％および３３．３％に達し、８週目も同じままであった。さらに、エキソソーム（ＩＮ）群のラットの２５％は、８週目に感覚回復を達成した。対照的に、未治療群とＰＴＥＮ−ｓｉＲＮＡ（ＩＬ）群では、８週間以内に感覚の回復を示さなかった（図１１Ｅ）。膀胱機能を反映する尿反射反応までの時間は、ＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）動物（７．０±０．７日）が最も早く回復し、その後、未治療のラット（８．９±０．７日）がそれに続いた（図１１Ｆ、一元配置分散分析、ｐ＝０．４０７９、チューキー）。図１１Ｇは、対照、エキソソームおよびＥｘｏＰＴＥＮで治療された病変後８週間のラットの回復の違いを示している。

実施例５．鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮは構造組織化と電気生理学的伝導を誘発する
脊髄の構造的完全性を評価するために、未治療のＳＣＩ動物、エキソソーム（ＩＮ）またはＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）で治療されたＳＣＩ動物、および無傷のラットで、９．４Ｔの従来のＭＲＩおよび拡散テンソルイメージング（ＤＴＩ）を実行した。損傷発生箇所から４ｍｍ尾側に重度の脊髄萎縮が離断対照で観察されたが、そのような変性はエキソソームとＥｘｏＰＴＥＮ群ではそれほど明白ではなかった。損傷発生箇所から４ｍｍ吻側で定量化された断面積は、ＳＣＩ群間で有意差はなかったが（図１２Ａ、一元配置分散分析、Ｆ（３，１１）＝０．６１２０、ｐ＝０．６２１２）、ＥｘｏＰＴＥＮ治療群と比較した離断対照では、発生箇所から４ｍｍ尾側で劇的に減少した（図１２Ｂ、２．５±０．５ｍｍ^２対４．２±０．３ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）。拡散テンソルイメージング（ＤＴＩ）トラクトグラフィは、離断群の吻側および尾側断端の完全な切断、エキソソーム群の部分的なブリッジング、およびＥｘｏＰＴＥＮ群の最も顕著なブリッジングを示した。損傷部位の吻側および尾側の異方性度（ＦＡ）記録は、ＥｘｏＰＴＥＮ治療ラットではエキソソームまたは未治療のＳＣＩ群と比較して高かったが、無傷のラットよりも依然として低かった（切断対照、エキソソーム、ＥｘｏＰＴＥＮおよび無傷のラットにおける病変内の平均ＦＡ値は、それぞれ０．２８５６、０．２９３８、０．３２９３、０．５０５５であった（図１２Ｃ））。平均拡散率（ＭＤ）記録では、未治療群、エキソソーム群、ＥｘｏＰＴＥＮ ＳＣＩ群間の違いは示されなかった。さらに、ＥｘｏＰＴＥＮで治療されたラットの運動皮質から病変を通って坐骨神経に伝播する高振幅の運動誘発電位（ＭＥＰ）が観察されたが、エキソソーム群では低振幅のシグナルが測定された（図１２Ｄ、それぞれ１．２８３±０．０８５ｍＶ対０．６６２±０．１６２ｍＶ、ｐ＝０．０２７３）。ＥｘｏＰＴＥＮ治療群におけるＭＥＰの潜時は、エキソソーム治療群よりも短かった（図１２Ｅ、３１．０３±３．０５ミリ秒対３８．４９±６．７８ミリ秒、ｐ＝０．３７２６）。脊髄病変の吻側の再離断後、すべてのシグナルが廃止された。

実施例６．鼻腔内投与ＥｘｏＰＴＥＮは病変微小環境を改善し、皮質脊髄軸索を再生する
自発運動回復の根底にある細胞メカニズムを特定するために、未治療、エキソソーム（ＩＮ）治療、およびＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）治療された動物の脊髄病変を、β−ＩＩＩ−チューブリン、ＣＤ１１ｂ、ＧＦＡＰおよびＣＤ３１で染色して、軸索再生、ミクログリオーシス、アストログリオーシスおよび血管新生を、それぞれ検出した。β−ＩＩＩ−チューブリンの発現は、ＥｘｏＰＴＥＮ治療されたラットの方がエキソソーム治療されたラットよりも有意に高かったが、未治療のＳＣＩラットではほとんど検出されなかった（図１３Ａ、ｐ＜０．０００１）。ＣＤ１１ｂ陽性のミクログリア細胞は、未治療の離断群で最も豊富な細胞型であり、エキソソームおよびＥｘｏＰＴＥＮ群でははるかに少なく（Ｆ（２，２４）＝２５．１８、ｐ＜０．０００１）、２つの間に有意差はなかった（図１３Ｂ、パネル２、ｐ＝０．９８１８）。同様の発現プロファイルがＧＦＡＰ^＋アストロサイトで観察された（図１３Ｃ）。我々は、ＣＤ３１^＋細胞によって測定される最低レベルの血管新生が、未治療の離断ラットで測定されたことを見出した（図１３Ｄ）。

皮質脊髄路（ＣＳＴ）は、体と後肢の自発的な運動制御を担っている。鼻腔内ＥｘｏＰＴＥＮ治療がこの特定の管を再生できるかどうかを調べるために、未治療、エキソソーム（ＩＮ）、またはＥｘｏＰＴＥＮ（ＩＮ）で治療したＳＣＩラットの体性運動皮質に注入されたビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）を使用して、その軌跡を追跡した。未治療のＳＣＩ群では、ＢＤＡ陽性線維が病変に浸透できなかった（図１４、上のパネル）のに対し、エキソソーム治療群では、病変内にＢＤＡ陽性線維が見られたが、尾側断端には伸びなかった（図１４、中央パネル）ことがわかった。対照的に、ＥｘｏＰＴＥＮ群では、ＢＤＡ陽性線維が病変を超えて貫通して伸びていることがはっきりと確認された（図１４、下のパネル）。

本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内にあるそのようなすべての代替、修正、および変形を包含することが意図されている。本発明は、その好ましい実施形態として本明細書で上述してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神および性質から逸脱することなく、それを変更することができる。

Claims (41)

1. 外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞を含む薬学的組成物。
2. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、エキソベシクルおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
3. 前記細胞外小胞が、エキソソームである、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
4. 前記細胞外小胞が、間葉系マーカーを発現する接着細胞に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
5. 前記間葉系マーカーを発現する接着細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および嗅神経鞘細胞から選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
6. 前記接着細胞が、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯周靭帯幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、根尖歯乳頭幹細胞（ａｐｉｃａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）（ＳＣＡＰ）および歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）からなる群から選択される、請求項４または５に記載の薬学的組成物。
7. 前記接着細胞が、神経堤細胞のマーカーを発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
8. 前記神経堤細胞が、頭部神経堤細胞である、請求項７に記載の薬学的組成物。
9. 前記外因性ＰＴＥＮ阻害剤が、ＰＴＥＮ発現の阻害剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
10. 前記ＰＴＥＮ発現の外因性阻害剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の薬学的組成物。
11. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡから選択される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
12. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号６および７から選択される核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）元の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する（ｉ）および（ｉｉ）の核酸変異体を含むｓｉＲＮＡ、から選択される、請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、疎水性部分をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
14. 前記疎水性部分が、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、疎水性ペプチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
15. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
16. 前記細胞外小胞が、単離された細胞外小胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
17. コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＢＣを含む細胞外小胞をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
18. 鼻腔内、病変内（ｉｎｔｒａ−ｌｅｓｉｏｎ）、くも膜下腔内、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、経口、および脳内投与経路から選択される投与経路を介して投与するために製剤化される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
19. 対象のニューロン損傷または傷害の治療に使用するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
20. 前記ニューロン損傷または傷害が、脊髄損傷（ＳＣＩ）である、請求項１９に記載の使用のための薬学的組成物。
21. 前記細胞外小胞が、ＭＳＣに由来するエキソソームであり、ＰＴＥＮ発現を阻害するｓｉＲＮＡを担持する、請求項２０に記載の使用のための薬学的組成物。
22. 前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含む、請求項２１に記載の使用のための薬学的組成物。
23. 前記ｓｉＲＮＡが、コレステロール部分とコンジュゲートしている、請求項２２に記載の使用のための薬学的組成物。
24. 前記使用が、前記組成物の鼻腔内投与を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組成物。
25. 前記使用が、コンドロイチナーゼＡＢＣの投与をさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組成物。
26. 外因性ＰＴＥＮ阻害剤およびコンドロイチナーゼＡＢＣを担持した前記細胞外小胞が、単一の薬学的組成物でまたは異なる薬学的組成物で投与される、請求項２５に記載の使用のための薬学的組成物。
27. 外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した単離した細胞外小胞であって、前記細胞外小胞が、細胞に由来する、単離した細胞外小胞。
28. 前記細胞外小胞が、エキソソーム、微小胞およびこれらの組み合わせから選択される、請求項２７に記載の単離した細胞外小胞。
29. 前記細胞外小胞が、間葉系マーカーを発現する接着細胞に由来する、請求項２７または２８に記載の単離した細胞外小胞。
30. 前記間葉系マーカーを発現する接着細胞が、間葉系幹細胞および嗅神経鞘細胞から選択される、請求項２９に記載の単離した細胞外小胞。
31. 前記細胞外小胞が、神経堤細胞からのマーカーを発現する接着細胞に由来する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の単離した細胞外小胞。
32. 前記外因性ＰＴＥＮ阻害剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドである、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の単離した細胞外小胞。
33. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡから選択される、請求項３２に記載の単離した細胞外小胞。
34. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、（ｉ）配列番号１０、１１、２、３、４および５から選択される核酸配列を含むｓｉＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号６および７から選択される核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）元の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する（ｉ）および（ｉｉ）の核酸変異体を含むｓｉＲＮＡ、から選択される、請求項３３に記載の単離した細胞外小胞。
35. 前記ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが、疎水性部分を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の単離した細胞外小胞。
36. 前記疎水性部分が、ステロール、ガングリオシド、脂質、ビタミン、脂肪酸、ペプチド、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項３５に記載の単離した細胞外小胞。
37. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項３６に記載の単離した細胞外小胞。
38. 前記小胞が、ＰＴＥＮ発現を阻害するコレステロールにコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ分子を担持したエキソソームであり、前記エキソソームが、間葉系幹細胞に由来する、請求項２７に記載の単離した細胞外小胞。
39. 前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０、１１、２および４から選択される核酸配列を含む、請求項３８に記載の単離したエキソソーム。
40. コンドロイチナーゼＡＢＣまたはそれをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載の単離したエキソソーム。
41. ニューロン損傷または傷害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法であって、外因性ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害剤を担持した細胞外小胞の治療有効量を前記対象に投与し、それにより前記損傷または傷害を治療することを含み、前記細胞外小胞は細胞に由来する、方法。
    
    

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