JP2021514936A - Glp−1ペプチドの可溶性 - Google Patents
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- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
Abstract
Description
当該有機溶媒がDMFである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも20分の期間、(i)5.0未満のpHで、5〜28%(重量/重量)、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われるか、あるいは
当該有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも2分の期間、(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、(ii)3.5未満のpHで、14%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、または(iii)当該温度が少なくとも50℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる。
本発明の方法で使用される有機溶媒は、アセトニトリル、DMF、およびそれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態において、有機溶媒は、アセトニトリルである。一部の実施形態において、有機溶媒は、DMFである。本明細書で使用されるとき、「DMF」という用語は、ジメチルホルムアミドを指し得る。
一部の実施形態において、ステップ(b)から得られる組成物は、溶液の形態である。一部の実施形態において、ステップ(b)から得られる組成物は、懸濁液の形態である。一部の実施形態において、本発明の方法のステップ(b)から得られる組成物中の未溶解GLP−1ペプチドは、例えば、濾過によって当該組成物から除去される。一部の実施形態において、ステップ(b)から得られる組成物中の有機溶媒の濃度は、例えば、希釈、クロマトグラフィー、またはUF/DF濾過によって減少される。
GLP−1ペプチドを含む組成物は、水を含み、溶液または懸濁液の形態であってもよい。一部の実施形態において、GLP−1ペプチドを含む溶液または懸濁液は、例えば、本明細書に記載されるアッセイ(I)の方法2によって調製される、沈殿物または粉末などの固体形態のGLP−1ペプチドから調製され得る。粉末は、溶液または懸濁液からの溶媒の蒸発によって形成され得、例えば、本明細書に記載されるアッセイ(I)の方法1によって調製される。懸濁液は、固体形態のGLP−1ペプチドを含み得る。一部の実施形態において、懸濁液は、不溶性であるGLP−1ペプチドを含む。
リラグルチド
一部の実施形態において、本発明の方法は、表1a、1b、および2に定義される可溶性基準を有する方程式(Eq.)1〜92のいずれか1つに記載のリラグルチドを含む組成物のインキュベーションを含む。これらの方程式はまた、単純に本明細書では、「表1a、1b、および2で定義される方程式」として、または特定の方程式、例えば、これらの表におけるEq.1の「方程式1」を参照して言及され得る。
一部の実施形態において、有機溶媒がDMFである場合、インキュベートするステップ(b)は、少なくとも20分の期間、(i)5.0未満のpHで、5〜28%(重量/重量)、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度である。一部の実施形態において、本発明は、(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒DMFを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、(b)当該第1の組成物を少なくとも20分の期間、2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法に関し、インキュベーションは、5.0未満のpHで、(i)5〜28%(重量/重量)の範囲、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われる。ステップ(b)(i)において、当該pHは、4未満、任意に少なくとも1であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、3.8未満、例えば、3.7未満または3.6未満であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度は、7〜23%(重量/重量)の範囲または8〜26%(重量/重量)の範囲であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度は、9〜25%(重量/重量)の範囲または10〜23%(重量/重量)の範囲であり得る。ステップ(b)(i)において、当該温度は、5〜50℃の範囲または10〜40℃の範囲であり得る。ステップ(b)(i)において、当該温度は、15〜30℃の範囲または21〜25℃の範囲であり得る。ステップ(b)(i)において、当該期間は、1〜48時間の範囲または8〜40時間の範囲であり得る。ステップ(b)(i)において、当該期間は、12〜36時間の範囲または18〜32時間の範囲であり得る。先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法において、当該有機溶媒は、DMFであり得、ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度は、7〜23%(重量/重量)の範囲であり得る。先行する実施形態に記載の方法において、当該期間は、少なくとも1時間であり得る。先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法において、当該有機溶媒は、DMFであり得、ステップ(b)(i)において、a.当該pHは、3.8未満であり得、b.当該DMFの濃度は、9〜25%(重量/重量)の範囲であり得、c.当該期間は、少なくとも8時間であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度は、少なくとも8%(重量/重量)または少なくとも10%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度は、最大22%(重量/重量)、最大21%(重量/重量)、または最大20%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)(i)において、pHは、1.0〜5.0未満の範囲であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、少なくとも2.0、少なくとも2.5、または少なくとも3.0であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、4.8未満または4.9未満であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、4.8〜6.0の範囲であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、少なくとも4.8または少なくとも4.9であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、最大5.8、最大5.7、または最大5.6であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHは、最大6.0または最大5.9であり得る。ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度は、少なくとも1%(重量/重量)、少なくとも2%(重量/重量)、または少なくとも3%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度は、少なくとも1%(重量/重量)、少なくとも4%(重量/重量)、または少なくとも5%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度は、最大37%(重量/重量)、最大32%(重量/重量)、または最大30%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、8時間未満であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、6時間未満であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、5時間未満であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、30分〜8時間未満の範囲であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、少なくとも1時間であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間は、少なくとも1.5時間であり得る。ステップ(b)において、インキュベーション時間が少なくとも8時間である場合、インキュベーションは、(i)5.0未満のpHで、2〜40%(重量/重量)の範囲、または(ii)5.0〜6.0の範囲のpHで、0〜40重量%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われ得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFは、少なくとも3%(重量/重量)、少なくとも4%(重量/重量)、または少なくとも5%(重量/重量)の濃度であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFは、最大35%(重量/重量)、最大30%(重量/重量)、または最大28%(重量/重量)の濃度であり得る。ステップ(b)(i)において、当該DMFは、最大27%(重量/重量)、最大26%(重量/重量)、または最大25%(重量/重量)の濃度であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、4.5未満、4.4未満、または4.3未満であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、4.2未満、4.1未満、または4.0未満であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、3.9未満、3.8未満、または3.7未満であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、少なくとも1.0、少なくとも1.5、または少なくとも2.0であり得る。ステップ(b)(i)において、当該pHは、少なくとも2.5、または少なくとも3.0であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHが5.5未満であり得る場合、当該DMFの濃度は、0〜20%(重量/重量)の範囲であり得る。ステップ(b)(ii)において、pHが5.4未満または5.3未満であり得る場合、当該DMFの濃度は、0〜20%(重量/重量)の範囲であり得る。ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度は、最大20%(重量/重量)または最大19%(重量/重量)であり得る。ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度は、最大18%(重量/重量)または最大17%(重量/重量)であり得る。
一部の実施形態において、方法は、アセトニトリルまたはDMFを実質的に含まない組成物を得るステップを含む。
本明細書で使用される「GLP−1ペプチド」という用語は、ペプチドを含む化合物を指し、これは、活性である場合、ヒトGLP−1受容体を完全または部分的に活性化する。一部の実施形態において、GLP−1ペプチドは、任意に1つの置換基を含む、GLP−1類似体である。GLP−1ペプチド(以下「ペプチド」)を参照して本明細書で使用される「類似体」という用語は、ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されている、および/または少なくとも1つのアミノ酸残基が、ペプチドから欠失している、および/または少なくとも1つのアミノ酸残基が、ペプチドに付加されている、および/またはペプチドの少なくとも1つのアミノ酸残基が、修飾されている、ペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような付加または欠失は、ペプチドのN末端および/またはペプチドのC末端に発生し得る。一部の実施形態において、GLP−1ペプチドを記載するために単純な用語体系が使用され、例えば、[Aib8]GLP−1(7−37)は、GLP−1(7−37)の類似体を示し、8位の天然発生Alaは、Aibで置換されている。一部の実施形態において、GLP−1ペプチドは、例えば、GLP−1(7−37)と比較して、例えば、置換、欠失、挿入、および/または修飾によって変更された、12個の最大値、例えば、10、8、または6個の最大値のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、類似体は、例えば、GLP−1(7−37)と比較して、最大10個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、例えば、最大9個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、最大8個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、最大7個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、最大6個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、最大5個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、最大4個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入、または最大3個の置換、欠失、付加、および/もしくは挿入を含む。別段記述されない限り、GLP−1は、L−アミノ酸のみを含む。
本発明の方法から得られる生成物は、医薬組成物または医薬組成物の製造に使用される中間組成物であり得る。医薬組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。「賦形剤」という語は、活性治療成分(複数可)以外の任意の成分を広く指す。賦形剤は、不活性物質、非活性物質、および/または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤などの様々な目的を果たし、ならびに/あるいは活性物質の投与および/または吸収を改善するように機能し得る。様々な賦形剤を伴った薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野で既知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)、および任意のそれ以降の版)を参照されたい。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤、および安定剤である。医薬組成物は、7.0〜10.0、例えば、7.4〜9.0または7.8〜8.4の範囲のpHを有し得る。一部の実施形態において、当該医薬組成物のpHは、8.0〜8.3の範囲、例えば、8.15である。一部の実施形態において、当該賦形剤は、等張剤(例えば、プロピレングリコール)、緩衝液(例えば、リン酸二ナトリウム二水和物などのリン酸緩衝液)、および防腐剤(例えば、フェノール)からなる群から選択される1つ以上である。
本発明の方法によって得られる医薬組成物は、医学における使用のためのものであり得る。本発明の医薬組成物は、2型糖尿病または肥満の治療および/または予防における使用のためのものであり得る。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、糖尿病合併症、例えば、血管障害、末梢神経障害を含む神経障害、腎症、および/または網膜症の予防および/または治療における使用のためのものである。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、1つ以上の心血管疾患の予防および/または治療における使用のためのものである。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、睡眠時無呼吸の予防および/または治療における使用のためのものである。
1.(a)未溶解および/または不溶性GLP−1ペプチドならびにアセトニトリルおよびDMFからなる群から選択される1つ以上の有機溶媒を含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該第1の組成物(例えば、溶液)を少なくとも2分の期間、2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
ただし、GLP−1ペプチドがリラグルチドであり、有機溶媒がフェノールである場合、当該有機溶媒の濃度が、少なくとも1%(重量/重量)であり、
当該方法が、溶解および/または不溶性GLP−1ペプチドの量を増加させる、方法。
2.(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはDMFを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該第1の組成物を2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
当該有機溶媒がDMFである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも20分の期間、(i)5.0未満のpHで、7〜23%(重量/重量)、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われるか、あるいは
有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることが、少なくとも2分の期間、(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、(ii)3.5未満のpHで、14%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、または(iii)当該温度が少なくとも50℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる、方法。
3.(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはDMFを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該第1の組成物を2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
当該有機溶媒がDMFである場合、当該インキュベートすることは、少なくとも20分の期間、(i)5.0未満のpHで、7〜23%(重量/重量)、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われるか、あるいは
当該有機溶媒がアセトニトリルである場合、当該インキュベートすることが、少なくとも2分の期間、(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、(ii)3.5未満のpHで、14%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、または(iii)当該温度が少なくとも50℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる、方法。
4.有機溶媒が、アセトニトリルであり、当該インキュベートするステップ(b)が、
(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、
(ii)3.5未満のpHで、少なくとも14%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、または
(iii)当該温度が少なくとも40℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
5.(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該第1の組成物を少なくとも2分の期間、2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、インキュベーションが、
(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、
(ii)3.5未満のpHで、少なくとも14%(重量/重量)の当該アセトニトリルの濃度で、または
(iii)当該温度が少なくとも40℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満の当該アセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる、方法。
6.ステップ(b)(i)において、当該pHが、少なくとも3.5である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
7.ステップ(b)(i)において、当該アセトニトリルの濃度が、30〜100%(重量/重量)の範囲または少なくとも40%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
8.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも18%(重量/重量)または少なくとも20%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
9.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも30%(重量/重量)、例えば、少なくとも33%(重量/重量)または少なくとも35%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
10.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも44%(重量/重量)、例えば、少なくとも45%(重量/重量)または少なくとも46%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
11.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも55%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
12.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、最大98%(重量/重量)、例えば、最大95%(重量/重量)または最大90%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
13.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、最大80%(重量/重量)、例えば、最大70%(重量/重量)または最大60%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
14.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、最大60%(重量/重量)、例えば、最大40%(重量/重量)または最大22%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
15.ステップ(b)(ii)において、当該アセトニトリルの濃度が、30〜100%(重量/重量)または少なくとも40%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
16.ステップ(b)(ii)において、当該pHが、3.4未満、3.3未満、または3.2未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
17.ステップ(b)(ii)において、当該pHが、少なくとも1.0、少なくとも1.5、または少なくとも2.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
18.ステップ(b)(ii)において、当該pHが、少なくとも2.5、または少なくとも3.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
19.ステップ(b)(i)での当該インキュベーションの温度が、2〜40℃、40〜85℃、または10〜50℃からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
20.ステップ(b)(i)において、当該温度が、5〜50℃の範囲または10〜40℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
21.ステップ(b)(i)において、当該温度が、15〜30℃の範囲または21〜25℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
22.ステップ(b)(i)において、当該期間が、5分〜2時間の範囲、例えば、5〜30分の範囲、または2〜6時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
23.ステップ(b)(i)において、当該期間が、1〜48時間の範囲または8〜40時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
24.ステップ(b)(i)において、当該期間が、12〜36時間の範囲または18〜32時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
25.ステップ(b)(iii)(2)において、当該アセトニトリルの濃度が、0〜20%(重量/重量)または少なくとも28%(重量/重量)、例えば、30〜100%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
26.ステップ(b)(iii)(2)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも40%(重量/重量)または少なくとも42%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
27.ステップ(b)(iii)(2)において、当該アセトニトリルの濃度が、少なくとも45%(重量/重量)または少なくとも50%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
28.ステップ(b)(iii)(2)において、当該アセトニトリルの濃度が、1〜18%(重量/重量)または2〜16%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
29.ステップ(b)(ii)において、当該温度が、2〜40℃、例えば、少なくとも5〜30℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
30.ステップ(b)(ii)において、アセトニトリルの当該濃度が、15〜100%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
31.ステップ(b)(ii)において、アセトニトリルの当該濃度が、少なくとも15%(重量/重量)、例えば、少なくとも18%(重量/重量)または少なくとも20%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
32.ステップ(b)(ii)において、アセトニトリルの当該濃度が、99%(重量/重量)以下、例えば、98%(重量/重量)以下または95%(重量/重量)以下である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
33.ステップ(b)(ii)において、アセトニトリルの当該濃度が、55%(重量/重量)以下、例えば、40%(重量/重量)以下または22%(重量/重量)以下である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
34.ステップ(b)(ii)において、当該pHが、1〜3.5の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
35.ステップ(b)(ii)において、またはステップ(b)(iii)(2)において、当該pHが、3.4未満または3.3未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
36.ステップ(b)(ii)において、またはステップ(b)(iii)(2)において、当該pHが、3.2未満、例えば、3.1未満または3.0未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
37.ステップ(b)(i)またはステップ(b)(iii)、例えば、ステップ(b)(iii)(1)またはステップ(b)(iii)(2)において、当該温度が、少なくとも40℃、例えば、少なくとも50℃または少なくとも60℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
38.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式32、33、34によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
39.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式35、36、37によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
40.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式65、66、67によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
41.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式68、69、または70によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
42.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式71、72、または73によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
43.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式74、75、または76によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
44.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式77、78、または79によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
45.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式80、81、82、または83によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
46.有機溶媒が、DMFであり、当該インキュベートするステップ(b)が、少なくとも20分の期間、
(i)5.0未満のpHで、5〜28%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度、または
または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
47.(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒DMFを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該第1の組成物を少なくとも20分の期間、2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、インキュベーションが、
(i)5.0未満のpHで、5〜28%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度、または
(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われる、方法。
48.ステップ(b)(i)において、当該pHが、4未満、任意に少なくとも1である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
49.ステップ(b)(i)において、当該pHが、3.8未満、例えば、3.7未満または3.6未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
50.ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度が、7〜23%(重量/重量)の範囲または8〜26%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
51.ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度が、9〜25%(重量/重量)の範囲または10〜23%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
52.ステップ(b)(i)において、当該温度が、5〜50℃の範囲または10〜40℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
53.ステップ(b)(i)において、当該温度が、15〜30℃の範囲または21〜25℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
54.ステップ(b)(i)において、当該期間が、1〜48時間の範囲または8〜40時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
55.ステップ(b)(i)において、当該期間が、12〜36時間の範囲または18〜32時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
56.当該有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度が、7〜23%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
57.当該期間が、少なくとも1時間である、先行する実施形態に記載の方法。
58.当該有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)(i)において、
a.当該pHが、3.8未満であり、
b.当該DMFの濃度が、9〜25%(重量/重量)の範囲であり、
c.当該期間が、少なくとも8時間である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
59.ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度が、少なくとも8%(重量/重量)または少なくとも10%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
60.ステップ(b)(i)において、当該DMFの濃度が、最大22%(重量/重量)、最大21%(重量/重量)、または最大20%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
61.ステップ(b)(i)において、pHが、1.0〜5.0未満の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
62.ステップ(b)(ii)において、pHが、少なくとも2.0、少なくとも2.5、または少なくとも3.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
63.ステップ(b)(ii)において、pHが、4.8未満または4.9未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
64.ステップ(b)(ii)において、pHが、4.8〜6.0の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
65.ステップ(b)(ii)において、pHが、少なくとも4.8または少なくとも4.9である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
66.ステップ(b)(ii)において、pHが、最大5.8、最大5.7、または最大5.6である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
67.ステップ(b)(ii)において、pHが、最大6.0または最大5.9である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
68.ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度が、少なくとも1%(重量/重量)、少なくとも2%(重量/重量)、または少なくとも3%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
69.ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度が、少なくとも1%(重量/重量)、少なくとも4%(重量/重量)、または少なくとも5%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
70.ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度が、最大37%(重量/重量)、最大32%(重量/重量)、または最大30%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
71.当該有機溶媒の当該pHおよび濃度が、本明細書で定義される方程式84、85、86、または87によって定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
72.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、8時間未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
73.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、6時間未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
74.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、5時間未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
75.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、30分〜8時間未満の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
76.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、少なくとも1時間である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
77.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、少なくとも1.5時間である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
78.ステップ(b)において、インキュベーション時間が少なくとも8時間である場合、インキュベーションが、
(i)5.0未満のpHで、2〜40%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度、または
(ii)5.0〜6.0の範囲のpHで、0〜40%(重量/重量)の範囲の当該DMFの濃度で行われる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
79.ステップ(b)(i)において、当該DMFが、少なくとも3%(重量/重量)、少なくとも4%(重量/重量)、または少なくとも5%(重量/重量)の濃度である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
80.ステップ(b)(i)において、当該DMFが、最大35%(重量/重量)、最大30%(重量/重量)、または最大28%(重量/重量)の濃度である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
81.ステップ(b)(i)において、当該DMFが、最大27%(重量/重量)、最大26%(重量/重量)、または最大25%(重量/重量)の濃度である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
82.ステップ(b)(i)において、当該pHが、4.5未満、4.4未満、または4.3未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
83.ステップ(b)(i)において、当該pHが、4.2未満、4.1未満、または4.0未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
84.ステップ(b)(i)において、当該pHが、3.9未満、3.8未満、または3.7未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
85.ステップ(b)(i)において、当該pHが、少なくとも1.0、少なくとも1.5、または少なくとも2.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
86.ステップ(b)(i)において、当該pHが、少なくとも2.5、または少なくとも3.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
87.ステップ(b)(ii)において、pHが5.5未満である場合、当該DMFの濃度が、0〜20%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
88.ステップ(b)(ii)において、pHが5.4未満または5.3未満である場合、当該DMFの濃度が、0〜20%(重量/重量)の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
89.ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度が、最大20%(重量/重量)または最大19%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
90.ステップ(b)(ii)において、当該DMFの濃度が、最大18%(重量/重量)または最大17%(重量/重量)である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
91.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、少なくとも12時間、少なくとも16時間、または少なくとも20時間である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
92.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、8〜48時間の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
93.ステップ(b)において、インキュベーション時間が、36時間未満または28時間未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
94.ステップ(b)において、当該pHが、5.0未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
95.ステップ(b)において、当該pHが、4.5未満または4.0未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
96.ステップ(b)において、当該pHが、3.5未満または3.0未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
97.ステップ(b)において、当該pHが、少なくとも1.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
98.当該温度が、10〜50℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
99.当該温度が、15〜40℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
100.温度が、20〜30℃または21〜25℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
101.当該温度が、10〜50℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
102.(a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびにDMFを含む第1の組成物を得るステップであって、当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)当該溶液を少なくとも5分間、50℃未満の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、(i)インキュベーション温度が少なくとも15℃である場合、インキュベーションが、(1)pH6.5超で行われるか、もしくは(2)インキュベーションが4時間を超えて行われる場合、当該溶液のpH(pH)に関連した当該有機溶媒の濃度が、c(有機溶媒)〜80%(重量/重量)の範囲であり、式中、c(有機溶媒)≧−13.3*pH+123であり、または(ii)インキュベーション温度が15℃未満である場合、インキュベーションが、pH7.0超で行われ、ただし、インキュベーション時間が30分未満である場合、当該有機溶媒の濃度が、25%(重量/重量)未満であり、ただし、有機溶媒がフェノールである場合、当該有機溶媒の濃度が、少なくとも1%(重量/重量)であり、当該方法が、溶解リラグルチドの量を増加させる、方法。
103.ステップ(b)(i)(2)において、溶液のpH(pH)に関する当該有機溶媒の濃度が、c(有機溶媒)〜80%(重量/重量)の範囲であり、c(有機溶媒)≧−40*pH+310である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
104.ステップ(i)(2)において、溶液のpH(pH)に関する当該有機溶媒の濃度が、c(有機溶媒)〜80%(重量/重量)の範囲であり、c(有機溶媒)≧−40*pH+310である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
105.ステップ(ii)において、当該有機溶媒の濃度が、23%(重量/重量)未満、例えば、22%(重量/重量)未満または21%(重量/重量)未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
106.ステップ(ii)において、当該有機溶媒の濃度が、20%(重量/重量)未満、例えば、19%(重量/重量)未満または18%(重量/重量)未満である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
107.ステップ(b)の当該pHが、6.5〜12.5または7.0〜12.5の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
108.ステップ(b)の当該pHが、少なくとも6.7、例えば、少なくとも6.8、少なくとも6.9、または少なくとも7.0である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
109.ステップ(b)の当該温度が、2℃〜50℃、例えば、4℃〜40℃、または5〜30℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
110.ステップ(b)の当該温度が、40℃未満、例えば、40℃未満、30℃未満、または25℃未満である、実施形態7に記載の方法。
111.ステップ(b)の当該温度が、少なくとも4℃、例えば、少なくとも10℃、少なくとも15℃、または少なくとも20℃である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
112.当該方法が、以下の追加ステップ:
(c)ステップ(b)に供される第1の組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させ、任意にリラグルチドを単離することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
113.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.5mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
114.ステップ(a)の当該第1の組成物が、(i)沈殿粉末の形態であるか、または(ii)懸濁液もしくは溶液に未溶解および/もしくは不溶性である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
115.ステップ(a)の第1の組成物のpHが、pH1〜13の範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
116.ステップ(b)での当該インキュベーションの温度が、
(A)当該1つ以上の有機溶媒を含む第1の組成物の凝固点と沸点との間の温度であるか、
(B)当該インキュベーションに供される溶液の凝固点を上回り、50℃を下回るか、
(C)50〜85℃の範囲である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
117.当該有機溶媒が、エタノール、2−プロパノール、アセトニトリル、フェノール、およびDMSOからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
118.ステップ(a)の第1の組成物が、0.01〜80%(重量/重量)の範囲の当該有機溶媒の濃度を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
119.当該第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
120.当該ステップ(a)前に、当該未溶解および/または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも0.1%(重量/重量)の未溶解および/または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
121.当該ステップ(a)前に、当該未溶解および/または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも1%(重量/重量)または少なくとも5%(重量/重量)の未溶解および/または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
122.当該ステップ(a)前に、当該未溶解および/または不溶性リラグルチドが、初期組成物中に存在し、当該初期組成物が、少なくとも10%(重量/重量)または少なくとも50%(重量/重量)の未溶解および/または不溶性リラグルチドを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
123.当該インキュベーションが、本明細書において表1および2の方程式で定義される通りである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
124.当該方法が、ステップ(b)に続いて、さらなるステップ(c)を含み、当該ステップ(c)が、任意の順序で、
(1)当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
(2)pHを中和させることと、
(3)温度を低下させることと、
(4)当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
(5)任意にリラグルチドを単離することと、からなる群から選択される1つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
125.ステップ(b)後、当該方法が、ステップ(b)から得られる組成物を用いて、任意の順序で、以下の追加ステップ:
(c1)ステップ(b)からの当該組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させることと、
(c2)ステップ(b)からの当該組成物のpHを中和させることと、
(c3)ステップ(b)からの当該組成物の温度を低下させることと、
(c4)リラグルチドを単離することと、のうちの1つ以上を含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
126.ステップ(b)後、当該方法が、以下の追加ステップ:
(c)ステップ(b)から得られる組成物中の当該有機溶媒の濃度を減少させ、任意にリラグルチドを単離することを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
127.当該中和することが、7.0〜10.0の範囲のpHへである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
128.当該中和することが、7.4〜9.0または7.8〜8.4の範囲のpHへである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
129.当該温度を低下させることが、2〜40℃、例えば、4〜35℃または5〜30℃の範囲の温度へである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
130.ステップ(b)から得られる組成物が、第2の組成物と呼ばれる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
131.当該方法が、溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの量を増加させる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
132.当該方法が、少なくとも10%(重量/重量)、例えば、少なくとも20%(重量/重量)または少なくとも30%(重量/重量)の溶解GLP−1ペプチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
133.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.2mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
134.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に0.2〜1.0mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
135.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.3mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
136.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.4mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
137.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.5mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
138.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.6mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
139.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.7mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
140.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.8mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
141.当該方法が、任意に本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.5mg/mlの溶解GLP−1ペプチド、例えば、リラグルチドの増加を提供する、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
142.溶解GLP−1ペプチドの濃度が、本明細書においてアッセイ(I)で記載されるように、および任意に3時間のインキュベーション期間後に決定される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
143.当該GLP−1ペプチドが、リラグルチドである、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
144.ステップ(a)の当該組成物が、(i)沈殿物の形態、(ii)粉末の形態であるか、または(iii)懸濁液もしくは溶液に未溶解および/もしくは不溶性である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
145.ステップ(a)の当該組成物が、懸濁液または溶液中の未溶解および/または不溶性リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
146.ステップ(a)の当該組成物が、懸濁液または溶液中の未溶解リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
147.ステップ(a)の当該組成物が、懸濁液または溶液中の不溶性リラグルチドを含む初期組成物から調製される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
148.当該第1の組成物が、懸濁液の形態である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
149.当該第1の組成物が、溶液の形態である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
150.ステップ(b)での当該インキュベーションに供される組成物のpHが、pH1〜13の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
151.ステップ(b)での当該インキュベーションに供される溶液のpHが、pH1〜13の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
152.ステップ(b)での当該インキュベーションに供される組成物のpHが、pH3〜11の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
153.当該インキュベーションが、当該1つ以上の有機溶媒を含む溶液の凝固点と沸点との間の温度で行われる、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
154.ステップ(b)での当該インキュベーションの温度が、当該インキュベーションに供される溶液の凝固点を上回り、50℃を下回る、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
155.ステップ(b)での当該インキュベーションの温度が、2〜40℃、40〜85℃、または10〜50℃からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
156.ステップ(b)での当該インキュベーションの温度が、50〜85℃の範囲である、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
157.溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、5℃で1年間または2年間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも90%(重量/重量)を指す、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
158.溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、室温で2ヶ月間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも90%(重量/重量)を指す、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
159.溶液中のリラグルチドの貯蔵安定性の当該増加が、5℃で24時間または1週間の貯蔵後に溶液中に残る当該リラグルチドの少なくとも90%(重量/重量)を指す、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
160.当該リラグルチドの少なくとも95%(重量/重量)が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
161.当該リラグルチドの少なくとも97%(重量/重量)が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
162.当該リラグルチドの少なくとも99%(重量/重量)が、貯蔵後に溶液中に残る、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
163.当該方法が、アセトニトリルまたはDMFを実質的に含まない組成物を得るステップを含む、先行する実施形態のいずれか1つに記載の方法。
164.先行する実施形態のいずれか1つにおいて定義される方法によって得られるGLP−1ペプチドを含む安定な医薬組成物であって、当該医薬組成物が、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
CAPS: N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸
DMSO: ジメチルスルホキシド
EtOH: エタノール
HEPES: 2−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]エタンスルホン酸
MeCN: アセトニトリル
MES: 2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸
ISOP: イソプロパノール
アッセイ(I):可溶性の決定
96ウェルプレート調製
固体形態の標的ペプチドを含有する96ウェルプレートを、2つの方法のうちの1つで調製した。
方法1(蒸発):4〜6mg/mlの濃度の当該ペプチドの100μlストック溶液の、96ウェルハーフエリアプレート(150μlウェルサイズ)の各ウェルへの添加。その後、溶媒が完全に除去されるまで、真空を適用することによって、溶媒を蒸発させた。
方法2(沈殿):特定の体積の当該ペプチド含有のストック溶液の96ウェルハーフエリアプレートの各ウェルへの添加に続いて、4.6のpHを得るために特定の体積の濃縮リン酸を添加し、続いて20%体積/体積の最終エタノール濃度をもたらす特定の体積のエタノールを添加した。その後、プレートを4℃で1時間貯蔵し、次いで4,000rpmで20分間遠心分離した。最終的に上清を除去した。ストック溶液の濃度は、上清除去後のペプチドの最終量がウェルあたり>0.4mgであるように選択された。
異なるpHおよび有機溶媒濃度で標的ペプチドの可溶性を決定するために、2つの異なる緩衝液系を独立した実験で使用して、pH3.0〜pH11.0の全範囲をカバーした。緩衝液系1は、pH3.0〜7.5をカバーし、緩衝液系2はpH7.5〜11.0をカバーする。各緩衝液系について、96個の異なる溶媒組成物を、以下の方法で予め混合した。
1.(pH3.0またはpH7.5のいずれかに調節された)低pH緩衝液および(pH7.5またはpH11.0のいずれかに調節された)高pH緩衝液を、8つの異なる比で混合して、それぞれ、pH3.0〜pH7.5またはpH7.5〜pH11.0の値を得た。混合後の総体積は、300μlであった。
2.次いで、これらの緩衝液に12の異なる量の有機溶媒を加えて、0〜70%重量/重量の有機溶媒(例えば、エタノール)濃度を得た。
3.水を加えて、各ウェルにおいて1.0gの溶媒の総重量を得た。
この例の目的は、インビトロでGLP−1ペプチドの、効力とも呼ばれる、活性を試験することである。インビトロ効力は、全細胞アッセイにおけるヒトGLP−1受容体活性化の尺度である。
原理:インビトロ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトGLP−1受容体の応答を測定することによって決定される。アッセイは、ヒトGLP−1受容体を発現し、プロモーターに結合したcAMP応答エレメント(CRE)のDNAおよびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)の遺伝子を含有する安定にトランスフェクトされたBHK細胞株において行われる。ヒトGLP−1受容体が活性化される場合、cAMPの生成をもたらし、これは順に、ルシフェラーゼタンパク質の発現をもたらす。アッセイインキュベーションが完了した時に、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を追加し、酵素がルシフェリンをオキシルシフェリンに変換して、生物発光を生じる。発光はアッセイの読み取り値として測定される。
細胞培養および調製:このアッセイで使用される細胞(例えば、クローンFCW467−12A/KZ10−1)は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞である。細胞は、ヒトGLP−1受容体を発現するクローン(例えば、FCW467−12A)由来であり、CREルシフェラーゼでのさらなるトランスフェクションによって確立し、現在のクローンを得る。細胞は、5%CO2で細胞培養培地において培養する。それらを、アリコートし、液体窒素中で貯蔵する。各アッセイ前に、アリコートは、PBS中で吸収され、2回洗浄された後、アッセイ特異的緩衝液中の所望濃度で懸濁される。96ウェルプレートについて、懸濁液は、5×103細胞/ウェルの最終濃度をもたらすように作製される。
材料:アッセイでは以下の化学物質が使用され得る。プルロニックF−68(10%)(Gibco 2404)、オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッドを含まないDMEM(Gibco 11880−028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax 100×(Gibco 35050)、およびステディーライトプラス(PerkinElmer 6016757)。
緩衝液:細胞培養培地は、10%FBS(ウシ胎児血清、Invitrogen 16140−071)、1mg/mlのG418(Invitrogen 15140−122)、240nMのMTX(メトトレキサート、Sigma M9929)、および1%pen/strep(ペニシリン/ストレプトマイシン、Invitrogen 15140−122)を有するDMEM培地からなる。アッセイ培地は、フェノールレッドを含まないDMEM、10mMのHepes、および1x Glutamaxからなる。アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の2%オボアルブミンおよび0.2%プルロニックF−68からなる。
手順:1)細胞ストックを37℃水浴で解凍する。2)細胞をPBSで3回洗浄する。3)細胞を計数し、アッセイ培地中の5×103細胞/50μl(1×105細胞/ml)に調節し、細胞の50μlアリコートをアッセイプレートにおける各ウェルに移す。4)試験化合物(およびもしあれば参照化合物)のストックを、アッセイ緩衝液中の0.2μMの濃度に希釈し、化合物を10倍希釈して、以下の濃度:2×10−7M、2×10−8M、2×10−9M、2×10−10M、2×10−11M、2×10−12M、2×10−13M、および2×10−14Mを得る。5)化合物またはブランクの50μlアリコートを、希釈プレートからアッセイプレートへ移し、化合物を以下の最終濃度:1×10−7M、1×10−8M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、1×10−12M、1×10−13M、および1×10−14Mで試験する。6)アッセイプレートを5%CO2インキュベーターにおいて37℃で3時間インキュベートする。7)アッセイプレートを、インキュベーターから取り出し、15分間室温で放置する。8)ステディーライトプラス試薬の100μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに加える(試薬は感光性であった)。9)各アッセイプレートを、アルミホイルで覆って光から保護し、室温で30分間振盪する。10)各アッセイプレートを、プレート読み取り機器、例えば、Packard ToPcount NXTで読み取る。
計算および結果:プレート読み取り機器からのデータをソフトウェア(例えば、GraphPad Prism)に移し、これは非線形回帰(ログ(アゴニスト)対応答)を行い、pMで報告され得るEC50値を計算する。最低2つのレプリケートを各試料について測定する。報告される値は、レプリケートの平均である。
リラグルチドの可溶性を、本明細書に記載されるアッセイ(I)を使用して決定した。サブセクション「96ウェルプレート調製」に記載されるように、方法1(蒸発)または方法2(沈殿)を使用してリラグルチドを調製した。結果および使用される特定のパラメータを表3aおよび表3bに示す。
Claims (15)
- (a)未溶解および/または不溶性リラグルチドならびに有機溶媒アセトニトリルまたはDMFを含む第1の組成物を得るステップであって、前記第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、ステップと、
(b)前記第1の組成物を2〜85℃の範囲の温度でインキュベートするステップと、を含む、方法であって、
前記有機溶媒がDMFである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも20分の期間、(i)5.0未満のpHで、5〜28%(重量/重量)の範囲のDMFの濃度で、または(ii)5.0〜5.5の範囲のpHで、0〜35%(重量/重量)の範囲のDMFの濃度で行われるか、あるいは
前記有機溶媒がアセトニトリルである場合、前記インキュベートすることが、少なくとも2分の期間、(i)6.0未満のpHで、少なくとも30%(重量/重量)のアセトニトリルの濃度で、(ii)3.5未満のpHで、少なくとも14%(重量/重量)のアセトニトリルの濃度で、または(iii)前記温度が少なくとも50℃である場合、(1)5.5〜6.0の範囲のpHで、10%(重量/重量)未満のアセトニトリルの濃度で、もしくは(2)3.5未満のpHで行われる、方法。 - 前記方法が、場合によっては本明細書のアッセイ(I)で記載されるように決定される、3時間のインキュベーション期間後に少なくとも0.5mg/mlの溶解リラグルチドの増加を提供する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)での前記インキュベーションの温度が、2〜40℃、40〜85℃、または10〜50℃からなる群から選択される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の組成物が、溶液または懸濁液の形態である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)(i)において、前記DMFの濃度が、7〜23%(重量/重量)の範囲である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、少なくとも1時間である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)(i)において、
a.前記pHが、3.8未満であり、
b.前記DMFの濃度が、9〜25%(重量/重量)の範囲であり、
c.前記期間が、少なくとも8時間である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)において、前記インキュベーション時間が少なくとも8時間である場合、前記インキュベーションが、(i)5.0未満のpHで、2〜40%(重量/重量)の範囲のDMFの濃度で、または(ii)5.0〜6.0の範囲のpHで、0〜40重量%(重量/重量)の範囲のDMFの濃度で行われる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、DMFであり、ステップ(b)(ii)において、前記DMFの濃度が、最大20%(重量/重量)または最大19%(重量/重量)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ(b)(ii)において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも20%(重量/重量)または少なくとも55%(重量/重量)である、請求項1に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ(b)(ii)において、前記pHが、3.4未満または3.2未満である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ(b)(ii)において、前記期間が、最大16時間、または5分〜20時間の範囲である、請求項1または10〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ(b)(iii)(2)において、前記アセトニトリルの濃度が、少なくとも40%(重量/重量)または少なくとも45%(重量/重量)である、請求項1または10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、アセトニトリルであり、ステップ(b)(ii)またはステップ(b)(iii)(2)において、前記pHが、3.4未満または3.3未満である、請求項1または10〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、アセトニトリルまたはDMFを実質的に含まない組成物を得るステップを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
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