JP2021513326A - Recombinant Adeno-Associated Virus Preparation Methods, Systems and Recombinant Bakumid - Google Patents

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Abstract

【課題】【解決手段】 本発明は組換え型アデノ随伴ウイルス（rAAV）の調製方法、システム及び組換え型バクミドを開示する。前記の方法は次の手順を含む。（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。（2）異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントをrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。（3）前記の組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。前記のシステムはシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含む。前記の組換え型バクミドは少なくともrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスの1種を含む。本発明は柔軟性、互換性及び更に高い継代安定性があるものである。【選択図】図１The present invention discloses a method, a system, and a recombinant bacmid for preparing a recombinant adeno-associated virus (rAAV). The method comprises the following procedure. (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively. (2) Containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV by aligning the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment with the expression box of other functional protein components required for rAAV production. Obtain recombinant bacmid. (3) The recombinant Bakumid is transfected into a host cell line and cultured. The system includes a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The recombinant bacmid contains at least one expression box of functional protein components required for rAAV production. The present invention has flexibility, compatibility and even higher passage stability. [Selection diagram] Fig. 1

Description

本発明は遺伝子治療分野、更に具体的に、組換え型アデノ随伴ウイルス（rAAV）の調製方法、システム及び組換え型バクミドに関する。 The present invention relates to the field of gene therapy, and more specifically to recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparation methods, systems and recombinant bacmid.

組換え型アデノ随伴ウイルス(rAAV)は安全性が高く、免疫原性が低く、宿主範囲が広く、仲介として外来遺伝子が動物体で長期にわたって安定に発現するようにすることができ、遺伝子治療分野で最も応用の見込みがあるキャリアの一種である。 Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is highly safe, has low immunogenicity, has a wide host range, and can allow foreign genes to be stably expressed in animals for a long period of time as a mediator. It is one of the most promising carriers in Japan.

従来、バキュロウイルス発現システムにより大規模でrAAVを調製する方法は主に2バキュロウイルスシステム (Two Bac system)、パッケージング細胞系に依頼する1バキュロウイルスシステム（One Bac system）及びパッケージング細胞系に依頼しなく、シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステム（One Bac system）がある。2バキュロウイルスシステムの主なプロセスとして、シャトルプラスミドに仲介されるTn7組換えによりAAVのRep遺伝子とCap遺伝子を同一のバキュロウイルスのゲノムに整合し、シャトルプラスミドに仲介されるTn7組換えにより中核的な発現コンポーネントを他のバキュロウイルスのゲノムに整合する。そして、前記の組換え型バキュロウイルスBEVの2種に共にホスト細胞に感染させてrAAVが産生するようにする（Smithら、2009,Mol.Ther. 17:1888-1896）。パッケージング細胞系に依頼する1バキュロウイルスシステムの主なプロセスとして、先ず誘導発現Rep遺伝子とCap遺伝子のパッケージング細胞系を構築する。この様なパッケージング細胞系はRep遺伝子とCap遺伝子発現コンポーネントを整合したものであり、Rep遺伝子とCap遺伝子が各々バキュロウイルス後期遺伝子発現強プロモーターのPH調節にコントロールされるようにし、PHプロモーターの上流にhr2エンハンサー配列及びAAVのRepタンパク質結合配列を入れた。外来目的遺伝子（GOI）を携帯するITRの中核的な発現コンポーネントを整合した組換え型バキュロウイルスBEV-(ITR-GOI) に感染されてから、パッケージング細胞系中のRep遺伝子とCap遺伝子誘導、発現されてrAAVが産生する（Aslanidiら、2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、206: 5059-5064）。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムの主なプロセスとして、AAVのCap遺伝子、Rep遺伝子及びITRの中核的な発現コンポーネントを共にシャトルプラスミドに構築し、Tn7トランスポゾンに仲介される組換えによりシャトルプラスミドが携帯するrAAVパッケージングコンポーネントをバキュロウイルスのゲノムに整合する。そして、この組換え型バキュロウイルスBEV分野にホスト細胞に感染させてrAAVが産生するようにする（Yangら、2018,Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4;10:38-47.）。 Conventionally, the method of preparing rAAV on a large scale by the baculovirus expression system is mainly 2 baculovirus system (Two Bac system), 1 baculovirus system (One Bac system) to request the packaging cell system, and the packaging cell system. There is one Bac system based on the shuttle plasmid without request. 2 As the main process of the baculovirus system, the shuttle plasmid-mediated Tn7 recombination aligns the AAV Rep and Cap genes with the same baculovirus genome, and the shuttle plasmid-mediated Tn7 recombination is core. Matches expression components to the genomes of other plasmids. Then, both of the above-mentioned recombinant baculovirus BEVs are infected with host cells so that rAAV is produced (Smith et al., 2009, Mol.Ther. 17: 1888-1896). Requesting a packaging cell line 1 As the main process of the baculovirus system, we first construct a packaging cell line for the induced expression Rep gene and Cap gene. Such a packaging cell line is a matching Rep gene and Cap gene expression component, so that the Rep gene and Cap gene are each controlled by the PH regulation of the late baculovirus gene expression strong promoter, and upstream of the PH promoter. The hr2 enhancer sequence and the AAV Rep protein binding sequence were placed in. After being infected with recombinant baculovirus BEV- (ITR-GOI), which has the core expression components of ITR carrying the foreign target gene (GOI), the Rep gene and Cap gene induction in the packaging cell line, It is expressed and produced by rAAV (Aslanidi et al., 2009, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 206: 5059-5064). As the main process of a 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the AAV Cap gene, Rep gene and ITR core expression components are all constructed into the shuttle plasmid, and the shuttle plasmid is carried by recombination mediated by the Tn7 transposon. Align the rAAV packaging component with the plasmid of the plasmid. Then, this recombinant baculovirus BEV field is infected with host cells so that rAAV is produced (Yang et al., 2018, Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4; 10: 38-47.).

然しながら、前者の場合、2種のバキュロウイルス共に細胞に感染する効率が低く、充分に各細胞の生産能力を利用できなく、そして感染がランダムな過程であるので、核酸を含まない空の欠陥rAAV顆粒が産生しやすく、調製のプロセス条件の最適化が複雑であり、rAAVの品質が調製のロットに応じて安定ではない。後者の場合、誘導発現Rep遺伝子とCap遺伝子に依頼するパッケージング細胞系を構築する過程が複雑であり、良質のパッケージング細胞系をスクリーニングしがたいので、異なる血清形のrAAVを調製すると、相応しい血清形Cap遺伝子を発現するパッケージング細胞系を構築しなければいけなく、柔軟性でも汎用性でも弱く、普及しがたい。第三種方法は難しさが主にシャトルプラスミドの構築にあり、rAAVの中核的な発現コンポーネントを含む異なる血清形のrAAVを調製すると、相応しい血清形のシャトルプラスミドを調製しなければいけない上、同時にCap遺伝子、Rep遺伝子及びITRの中核的な発現コンポーネントを持ったシャトルプラスミドを構築しがたく、遺伝子治療薬として用いられる場合、遺伝子治療フラグメント毎に応じて多種血清形のシャトルプラスミドを構築しなければいけなく、合成コストが高過ぎ、実際の応用が制限されている。更に重要なものとして、rAAVパッケージングコンポーネントが単なるシャトルプラスミドに構築されてTn7トランスポゾンにより集のに多面体(Polyhedron、polh)遺伝子座に整合されるので、産生したBEVは継代安定性が影響を受け、Two BacシステムのBEVウイルスより弱いことさえもあるので、安定性に関する要求の高い量産及び応用に適しない。一方、このシステムは互換性があまり高くないので、遺伝子治療キャリア薬の生産に用いられると、改善に対する需要が相変わらずとても大きなものである。 However, in the former case, the efficiency of infecting cells with both of the two baculoviruses is low, the production capacity of each cell cannot be fully utilized, and the infection is a random process, so an empty defect rAAV containing no nucleic acid. Granules are easy to produce, the optimization of the process conditions of preparation is complicated, and the quality of rAAV is not stable depending on the lot of preparation. In the latter case, the process of constructing a packaging cell line that relies on the induced expression Rep gene and Cap gene is complicated, and it is difficult to screen a good quality packaging cell line, so it is appropriate to prepare rAAV with different serotypes. A packaging cell line that expresses the serotype Cap gene must be constructed, and its flexibility and versatility are weak, making it difficult to spread. The difficulty of the third method is mainly in the construction of the shuttle plasmid, and when rAAV of different serum forms containing the core expression component of rAAV is prepared, the shuttle plasmid of the appropriate serum form must be prepared and at the same time. It is difficult to construct a shuttle plasmid with the core expression components of the Cap gene, Rep gene and ITR, and when used as a gene therapy drug, it is necessary to construct a shuttle plasmid of various serum forms according to each gene therapy fragment. Don't, the synthesis cost is too high and the actual application is limited. More importantly, the produced BEV is affected by passage stability because the rAAV packaging component is constructed into a mere shuttle plasmid and matched to the polyhedron (polh) locus by the Tn7 transposon. It may even be weaker than the BEV virus in the Two Bac system, making it unsuitable for mass production and applications with high stability requirements. On the other hand, the system is not very compatible, so when used in the production of gene therapy carrier drugs, the demand for improvement remains very high.

従来の技術の前記の欠陥または改善上の需要に応じて、本発明は組換え型アデノ随伴ウイルス（rAAV）の調製方法、システム及び組換え型バクミドを提供し、異種機能的遺伝子フラグメントを携帯するrAAV ITRの中核的な発現コンポーネントをシャトルプラスミドに含ませ、rAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスを各々シャトルプラスミド及びバキュロウイルスのゲノムに含ませてシャトルプラスミドの構築を容易にし、遺伝子治療キャリア調製システムの全体の安定性、互換性及び柔軟性を向上させて従来の組換え型アデノ随伴ウイルスのバキュロウイルス調製システムのシャトルプラスミドの構築しがたい、システムの柔軟性及び汎用性が弱い、ウイルス安定性が弱い、普及しがたいという課題を解決することを目的にする。 In response to the above-mentioned deficiencies or remedial needs of prior art, the present invention provides methods, systems and recombinant plasmids for the preparation of recombinant adeno-associated virus (rAAV) and carries heterologous functional gene fragments. The core expression component of rAAV ITR is included in the shuttle plasmid, and the expression boxes of the functional protein components required for rAAV production are included in the shuttle plasmid and baculovirus genomes, respectively, to facilitate the construction of the shuttle plasmid and gene therapy. Difficult to construct a shuttle plasmid for the conventional recombinant adeno-associated virus baculovirus preparation system by improving the overall stability, compatibility and flexibility of the carrier preparation system, the system is less flexible and versatile, The purpose is to solve the problems of weak virus stability and difficulty in spreading.

一方、前記の目的に達成するために、本発明は下記のステップを含むrAAVの調製方法を提供する。 On the other hand, in order to achieve the above object, the present invention provides a method for preparing rAAV including the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを含む。 The shuttle plasmid contains at least the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment.

前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドは組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。 The recombinant bacmid containing the baculovirus genome comprises an expression box for other functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントをrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) Other functional protein components required for rAAV production to provide the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment by the shuttle plasmid obtained in step (1) and a recombinant bacmid containing the genome of baculovirus as appropriate. Consistent with the expression box of, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、ステップ（1）に記載のシャトルプラスミドに相応しい組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia遺伝子及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスのゲノムである。 Preferably, as the method for preparing the rAAV described above, the recombinant bacmid suitable for the shuttle plasmid described in step (1) is a baculovirus genome lacking the non-essential genes Chia gene and / or Cath gene.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia(105,353bp-107,008bp)、Cath (107,054bp-108,025bp)、Ac124(103,864bp-104,607bp)、p10(118,911bp-119,915bp)、p26(118,116bp-118,838bp)、p74(119,207bp- 121,144bp)、ctx(2085bp-2246bp)、egt(11,427bp-12,947bp)、39k(29,371bp-30,198bp)、orf51(43,312bp- 44,268bp)、gp37(51,417bp- 52,325bp)、iap2(61,150bp-61,899bp)及びodv-e56(129,080bp-130,210bp)遺伝子座から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 Preferably, as the method for preparing the rAAV, the expression box of the other functional protein component required for the production of the rAAV is such that the recombinant bacmid is a non-essential gene Chia (105,353 bp-107,008 bp), Cath (107,054). bp-108,025bp), Ac124 (103,864bp-104,607bp), p10 (118,911bp-119,915bp), p26 (118,116bp-118,838bp), p74 (119,207bp-121,144bp), ctx (2085bp-2246bp), egt (11,427bp-12,947bp), 39k (29,371bp-30,198bp), orf51 (43,312bp-44,268bp), gp37 (51,417bp-52,325bp), iap2 (61,150bp-61,899bp) and odv-e56 (129,080bp) -130,210bp) Inserted into one or more loci selected from loci.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, as a method for preparing the rAAV, an expression box for other functional protein components required for the production of the rAAV is inserted into a locus selected from the non-essential genes Chia and / or Cath by the recombinant Bakumid. Will be done.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、ステップ（1）に記載のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドが下記の方法により調製される。 Preferably, as the above-mentioned method for preparing rAAV, a recombinant bacmid containing the baculovirus genome according to step (1) is prepared by the following method.

Red組換えにより前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを前記の非必須遺伝子の遺伝子座に挿入する。 Red recombination inserts an expression box for other functional protein components required for rAAV production into the locus of the non-essential gene.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、AAVのRep遺伝子またはCap遺伝子の発現ボックスを含む。 Preferably, as the method for preparing the rAAV, the shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual and contains an expression box for the Rep gene or Cap gene of the AAV.

好ましくは、前記のrAAVの調製方法として、前記の組換え型バクミドがバキュロウイルスAcMNPVのゲノムからのものであり、少なくともrAAV産生に必要なAAV Cap遺伝子及び/またはRep遺伝子の発現ボックスを含み、アデノ随伴ウイルスに必要な機能的タンパク質成分が産生する発現ボックスがP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節される。 Preferably, as the method for preparing the rAAV, the recombinant bacmid is from the genome of the baculovirus AcMNPV and comprises at least an expression box for the AAV Cap gene and / or the Rep gene required for rAAV production. The expression box produced by the functional protein components required by the associated virus is downstream of the P10 or PH promoter and is regulated thereby.

もう一方、本発明はシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システムを提供する。 On the other hand, the present invention provides a preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome.

前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを含む。 The shuttle plasmid contains at least the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment.

前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドはrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。 The recombinant bacmid containing the baculovirus genome contains an expression box for other functional protein components required for rAAV production.

好ましくは、前記のrAAVの調製システムは前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドがChia及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスのゲノムである。 Preferably, the rAAV preparation system is a baculovirus genome in which the recombinant bacmid containing the baculovirus genome is deficient in the Chia and / or Cath genes.

好ましくは、前記のrAAVの調製システム、前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 Preferably, the rAAV preparation system, the expression box for other functional protein components required for rAAV production, is the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx. , Egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and locus odv-e56 are inserted into one or more of the selected loci.

好ましくは、前記のrAAVの調製システムは前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, the rAAV preparation system is such that the expression box for other functional protein components required for rAAV production is inserted into the locus where the recombinant bacmid is selected from the non-essential genes Chia and / or Cath. To.

好ましくは、前記のrAAVの調製システムは前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、AAVのRep遺伝子またはCap遺伝子の発現ボックスを含む。 Preferably, the rAAV preparation system is such that the shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual and contains an expression box for the Rep or Cap gene of AAV.

好ましくは、前記のrAAVの調製システムは前記の組換え型バクミドがバキュロウイルスAcMNPVのゲノムからのものであり、少なくともrAAV産生に必要なAAV Cap遺伝子及び/またはRep遺伝子の発現ボックスを含み、アデノ随伴ウイルスに必要な機能的タンパク質成分が産生する発現ボックスがP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節される。 Preferably, the rAAV preparation system is such that the recombinant bacmid is from the genome of the baculovirus AcMNPV and contains at least an expression box for the AAV Cap and / or Rep genes required for rAAV production, accompanied by adeno-associated virus. The expression box produced by the functional protein components required by the virus is downstream of the P10 or PH promoter and is regulated thereby.

もう一方、本発明はrAAVを調製するための組換え型バクミドを提供する。前記の組換え型バクミドは少なくともrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスの1種を含み、前記のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 On the other hand, the present invention provides recombinant bacmid for preparing rAAV. The recombinant bacmid contains at least one expression box for the functional protein component required for rAAV production, and the expression box for the functional protein component required for rAAV production is the non-essential gene Chia for the baculovirus. , Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and locus odv-e56 is inserted into one or more of the selected loci.

好ましくは、前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドはChia及び/またはCath遺伝子が欠けている。 Preferably, the recombinant bacmid for preparing the rAAV described above lacks the Chia and / or Cath genes.

好ましくは、前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドはrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスが非必須遺伝子Chia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, the recombinant bacmid for preparing the rAAV is inserted into a locus in which the expression box of the functional protein component required for rAAV production is selected from the non-essential genes Chia and / or Cath by the baculovirus. To.

好ましくは、前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドはバキュロウイルスAcMNPVのゲノムからのものである。 Preferably, the recombinant bacmid for preparing the rAAV described above is from the genome of the baculovirus AcMNPV.

好ましくは、前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドはrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスがP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節される。 Preferably, the recombinant bacmid for preparing the rAAV described above has an expression box of the functional protein component required for rAAV production downstream of the P10 or PH promoter, thereby regulating it.

全体的に、従来の技術と比べて見ると、本発明による前記の技術案は次の有益的な効果がある。 Overall, the above-mentioned technical proposal according to the present invention has the following beneficial effects when compared with the prior art.

本発明によるrAAVの調製方法及びシステムはシャトルプラスミド及びバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドに各々rAAVの中核的な発現コンポーネント及びrAAVが産生するための他の機能的タンパク質発現ボックスを搭載することにより、本発明が柔軟性及び互換性を持つようにし、即ち、異なる異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVを調製する場合、相応しくITRの中核的な発現コンポーネントを含むシャトルプラスミドだけを構築し、新たに多種のシャトルプラスミドを構築しないので、前記のrAAVの機能的コンポーネントのすべてを生産する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含むBEVの継代安定性を向上させると同時に、従来のrAAVのバキュロウイルス調製システムに対する互換性が良好である。 The method and system for preparing rAAV according to the present invention is to mount a core expression component of rAAV and another functional protein expression box for rAAV production on a recombinant plasmid containing a shuttle plasmid and a baculovirus genome, respectively. This allows the present invention to be flexible and compatible, i.e., when preparing rAAVs with different heterologous functional gene fragments, construct only shuttle plasmids that appropriately contain the core expression components of ITR and add new variety. Because it does not construct the shuttle plasmid of the above, it improves the passage stability of BEV containing the genome of recombinant baculovirus that produces all of the functional components of rAAV mentioned above, while at the same time as opposed to the conventional rAAV baculovirus preparation system. Good compatibility.

本発明によりrAAVを調製するためのバキュロウイルスシステム策略及び相応しいコンポーネントの図。その中、A. rAAVパッケージングコンポーネントがpFBDシャトルプラスミドとAcMNPV組換え型バクミドで分配される原理図、B. rAAVの主なパッケージングコンポーネントの構築策略、C.pFBDシャトルプラスミド図、D. AcMNPV組換え型バクミド及びその主な非必須遺伝子座の図、その中、バキュロウイルスAcMNPVゲノムは二本鎖環状DNA、全長が133,966bp bpであり、配列及びマッピングについて(Maghodiaら、2014,Genome Announc. 、2(6):e01202-14.)、AcMNPV Bacmid (bMON14272)の構成について(Luckowら、J Virol,1993. 67(8): 4566-79.)を参考にすること。Diagram of baculovirus system schemes and suitable components for preparing rAAV according to the present invention. Among them, the principle diagram in which the A. rAAV packaging component is distributed by the pFBD shuttle plasmid and AcMNPV recombinant Bakumid, the construction strategy of the main packaging component of B. rAAV, the C.pFBD shuttle plasmid diagram, and the D. AcMNPV group. Diagram of recombinant plasmid and its major non-essential loci, in which the baculovirus AcMNPV genome is a double-stranded circular DNA with a total length of 133,966 bp bp and for sequence and mapping (Maghodia et al., 2014, Genome Announc., 2 (6): e01202-14.), Regarding the configuration of AcMNPV Bacmid (bMON14272) (Luckow et al., J Virol, 1993. 67 (8): 4566-79.). 実施例1で組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-RepがSf9細胞に感染してrAAVを調製する結果。その中、A.組換え型バクミドBac-Tn7- (ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-Repの構築図、B. BEVがSf9細胞に感染し、活性検出を行う。C.精製されたrAAVを調製し、rAAVでHEK293細胞に感染し、活性検出を行う。D.精製されたrAAVウイルス粒子を調製し、電子顕微鏡で検出する。Results of recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Cap-Δ (Chia-Cath) -Rep infecting Sf9 cells to prepare rAAV in Example 1. Among them, A. Recombinant Bacmid Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Cap-Δ (Chia-Cath) -Rep construction diagram, B. BEV infects Sf9 cells and detects their activity. C. Prepare purified rAAV, infect HEK293 cells with rAAV, and detect activity. D. Prepare purified rAAV virus particles and detect with an electron microscope. 実施例2で組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-Cap感染Sf9細胞rAAVを調製した結果。その中、A. 組換え型バクミドBac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-Capの構築図、B. BEVがSf9細胞に感染し、活性検出を行う。C.精製されたrAAVでHEK293細胞に感染し、活性検出を行う。D.rAAVウイルス粒子を精製して電子顕微鏡で検出する。Results of preparing recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Rep-Δ (Chia-Cath) -Cap-infected Sf9 cells rAAV in Example 2. Among them, A. Recombinant Bacmid Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Rep-Δ (Chia-Cath) -Cap construction diagram, B. BEV infects Sf9 cells and detects their activity. C. Infect HEK293 cells with purified rAAV and detect activity. D.rAAV virus particles are purified and detected with an electron microscope. 実施例3で組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-CapでSf9細胞に感染してrAAVを調製した結果。その中、A. 組換え型バクミドBac-Tn7-(ITR-GOI)- Δ(Chia-Cath)-Rep-Capの構築図、B. BEVがSf9細胞に感染し、活性検出を行う。C. 精製されたrAAVを調製し、rAAVでHEK293細胞に感染し、活性検出を行う。D. 精製されたrAAVウイルス粒子を調製し、電子顕微鏡で検出する。Results of rAAV prepared by infecting Sf9 cells with recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-Cap in Example 3. Among them, A. Recombinant Bacmid Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-Cap construction diagram, B. BEV infects Sf9 cells and detects their activity. C. Prepare purified rAAV, infect HEK293 cells with rAAV, and detect activity. D. Purified rAAV virus particles are prepared and detected with an electron microscope. 実施例4で組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-CapでSf9細胞に感染してrAAVを調製した結果。その中、A. 組換え型バクミドBac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-Capの構築図、B.BEVがSf9細胞に感染し、活性検出を行う。C. 精製されたrAAVを調製し、rAAVでHEK293細胞に感染し、活性検出を行う。D. 精製されたrAAVウイルス粒子を調製し、電子顕微鏡で検出する。Results of preparing rAAV by infecting Sf9 cells with recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-ΔAc124-Cap in Example 4. Among them, A. Recombinant Bacmid Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-ΔAc124-Cap construction diagram, B.BEV infects Sf9 cells and detects their activity. C. Prepare purified rAAV, infect HEK293 cells with rAAV, and detect activity. D. Purified rAAV virus particles are prepared and detected with an electron microscope. 実施例5で組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-RepでSf9細胞に感染してrAAVを調製した結果。A. 組換え型バクミドBac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-Repの構築図、B. BEVがSf9細胞に感染し、活性検出を行う。C. 精製されたrAAVを調製し、rAAVでHEK293細胞に感染し、活性検出を行う。D. 精製されたrAAVウイルス粒子を調製し、電子顕微鏡で検出する。Results of rAAV prepared by infecting Sf9 cells with recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Cap-ΔAc124-Rep in Example 5. A. Recombinant Bacmid Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Cap-ΔAc124-Rep construction diagram, B. BEV infects Sf9 cells and detects activity. C. Prepare purified rAAV, infect HEK293 cells with rAAV, and detect activity. D. Purified rAAV virus particles are prepared and detected with an electron microscope. 実施例1〜5で相応しい組換え型バキュロウイルスBEVがSf9細胞に感染してrAAVを調製した産出率を示し、単位がVG/cellである。各グループで組換えの3つに関する実験を行い、標準偏差についてエラーバーで表す。The yield rate of recombinant baculovirus BEV suitable for Examples 1 to 5 infecting Sf9 cells to prepare rAAV is shown, and the unit is VG / cell. Experiments on three types of recombination were performed in each group, and the standard deviation is indicated by error bars. 実施例1〜5で相応しい組換え型バキュロウイルスBEVの安定性分析図。各実施例で相応しいP1〜P8世帯のBEVがMOI=3でSf9細胞に感染してからウエスタンブロットで感染されたSf9細胞でAAVのRep及びCapタンパクの発現レベルを検出する。その中、A.シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムの組換え型バキュロウイルスBEV-Tn7-(ITR-GOI)- Cap2-Rep2の安定性分析図（Yangら、2018,Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4;10:38-47を参考にすること）、B.実施例1のBEVの安定性分析図、C. 実施例2のBEVの安定性分析図。D. 実施例3のBEVの安定性分析図、E. 実施例4のBEVの安定性分析図、F. 実施例5のBEVの安定性分析図。Stability analysis diagram of recombinant baculovirus BEV suitable for Examples 1-5. In each example, BEVs from P1 to P8 households were infected with Sf9 cells at MOI = 3, and then Western blot-infected Sf9 cells were used to detect AAV Rep and Cap protein expression levels. Among them, the stability analysis diagram of recombinant baculovirus BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Cap2-Rep2 of 1 baculovirus system based on A. shuttle plasmid (Yang et al., 2018, Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4; 10: 38-47), B. BEV stability analysis diagram of Example 1, C. BEV stability analysis diagram of Example 2. D. BEV stability analysis diagram of Example 3, E. BEV stability analysis diagram of Example 4, F. BEV stability analysis diagram of Example 5.

本発明の目的、技術案及び長所を更にはっきりと理解できるために、次に付図及び実施例と結び合わせて本発明について詳細に説明する。言うまでもなく、ここで述べた具体的な実施例は本発明を説明するためのものだけであり、本発明を限定するものではない。なお、次に述べた本発明の各実施方式に関わる技術特徴は矛盾しない限り相互に組み合うことができる。 The present invention will be described in detail below in combination with the following figures and examples so that the object, technical proposal and advantages of the present invention can be understood more clearly. Needless to say, the specific examples described here are for explaining the present invention only, and do not limit the present invention. The technical features related to each of the embodiments of the present invention described below can be combined with each other as long as there is no contradiction.

本発明による組換え型アデノ随伴ウイルス(rAAV)の調製方法は下記のステップを含む。 The method for preparing recombinant adeno-associated virus (rAAV) according to the present invention includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを含む。 The shuttle plasmid contains at least the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment.

前記のシャトルプラスミドは好ましくpFBDプラスミドであり、それに含まれる前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを含むが、rAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスの一部を含むこともできる。機能的タンパク質成分の発現ボックスはAAV機能的タンパク質成分の発現ボックスでも他の機能的タンパク質成分の発現ボックスでもいい。 The shuttle plasmid is preferably a pFBD plasmid, which contains at least the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment, but in the expression box of the functional protein component required for rAAV production. It can also include some. The expression box for a functional protein component may be an expression box for an AAV functional protein component or an expression box for another functional protein component.

前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドはrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。 The recombinant bacmid containing the baculovirus genome contains an expression box for other functional protein components required for rAAV production.

アデノ随伴ウイルス機能的タンパク質成分の発現ボックス（Rep遺伝子とCap遺伝子を含む）はは前記のバキュロウイルスの組換え型バクミドゲノムに含まれてもいい。よって、前記のシャトルプラスミドは異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントしか含まない。異なる異種機能的遺伝子フラグメントをシャトルプラスミドに構築して相応しいバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドと協力する。そして、相応しい組換え型バクミドはタイプがAAV機能的タンパク質成分のタイプにしか関わらない。一方、本発明による1バキュロウイルスシステム（One Bac system）はパッケージング細胞系に依頼する1バキュロウイルスシステムと違い、パッケージング細胞系に依頼しなく、シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、汎用性及び互換性が強い上、シャトルプラスミドの負荷が大いに低下するので、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性が大いに向上するものである。 The expression box for the adeno-associated virus functional protein component (including the Rep and Cap genes) may be included in the recombinant baculovirus recombinant baculovirus genome. Thus, the shuttle plasmid contains only the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment. Different heterologous functional gene fragments are constructed into shuttle plasmids to work with recombinant bacmid containing the appropriate baculovirus genome. And suitable recombinant bacmids are only related to the type of AAV functional protein component. On the other hand, the one baculovirus system according to the present invention is different from the one baculovirus system that requests the packaging cell system, and is compared with the one baculovirus system that is based on the shuttle plasmid without requesting the packaging cell system. In addition to being highly versatile and compatible, the load on the shuttle plasmid is greatly reduced, so that the stability of the recombinant baculovirus BEV is greatly improved.

従来のrAAVを調製するバキュロウイルスシステムの大多数で、外来遺伝子（AAVのRep遺伝子、Cap遺伝子またはITRの中核的な発現コンポーネント）を携帯する組換え型バキュロウイルスでバキュロウイルスに差し込まれた非必須遺伝子多面体遺伝子(Polyhedron 、polh)座にするので、とても高い発現レベルを取得できる。便利に組換え型バキュロウイルスを構築するために、普通の場合に事業化のBac-to-Bacシステムを利用する。Bac-to-Bacシステムは原理が次の通りである。外来遺伝子をシャトルプラスミドに構築してから組換え型シャトルプラスミドを組換え型バクミドを含む大腸菌に転化し、Tn7トランスポゾンに仲介される細菌の水平組換えにより組換え型シャトルプラスミドが携帯する外来遺伝子を組換え型バクミドに整合する。そして、前記の大腸菌から抽出した組換え型バクミドDNAに昆虫細胞をトランスフェクトさせてから外来遺伝子を携帯する組換え型バキュロウイルスBEVを救い出す。このシステムで、この様な大腸菌で複製増殖できる上、昆虫細胞で複製し、組換え型バキュロウイルスをパッケージングすることができる高分子環状DNAは「バクミド（Bacmid）」と呼ばれる。バクミドが細菌複製起点、抗生物質耐性遺伝子、組換え型バキュロウイルスのゲノム及びTn7組換え型クローニングサイトを携帯するので、このシステムの最も早期の開発者のLuckowらは多面体遺伝子(polh)座をTn7組換え型クローニングサイトにしたものである（Luckowら、1993,J.Virol.67 (8):4566-4579）。 A non-essential recombinant baculovirus that carries a foreign gene (AAV Rep gene, Cap gene or core expression component of ITR) in the majority of conventional baculovirus systems that prepare rAAV. Since the gene is in the polyhedron (polh) locus, a very high expression level can be obtained. In order to conveniently construct a recombinant baculovirus, the commercialized Bac-to-Bac system is usually used. The principle of the Bac-to-Bac system is as follows. After constructing a foreign gene into a shuttle plasmid, the recombinant shuttle plasmid is converted to Escherichia coli containing recombinant Bakumid, and the foreign gene carried by the recombinant shuttle plasmid is transferred by horizontal recombination of bacteria mediated by the Tn7 transposon. Consistent with recombinant plasmid. Then, after transfecting insect cells into the recombinant baculomid DNA extracted from the above-mentioned Escherichia coli, the recombinant baculovirus BEV carrying a foreign gene is rescued. In this system, high molecular weight circular DNA that can replicate and proliferate in such E. coli, replicate in insect cells, and package recombinant baculovirus is called "Bacmid". Since Bakumid carries the bacterial origin of replication, antibiotic resistance genes, recombinant baculovirus genomes and Tn7 recombinant cloning sites, Luckow et al., The earliest developer of this system, set the polyhedron gene (polh) locus to Tn7. It is a recombinant cloning site (Luckow et al., 1993, J.Virol.67 (8): 4566-4579).

多種の外来遺伝子配列が同時に単一遺伝子座に挿入されることもできるが、不安定なウイルスゲノムにつながり、挿入される外来遺伝子の種類にも数量にも顕著に制限因子がある。よって、rAAVパッケージングコンポーネント負荷に適する他の座について検討しなければいけない。 Although many foreign gene sequences can be inserted into a single locus at the same time, they lead to an unstable viral genome, and there are significant limiting factors in the type and quantity of foreign genes inserted. Therefore, other seats suitable for rAAV packaging component loads must be considered.

バキュロウイルスのゲノムで異種遺伝子の高発現を認める他の非必須遺伝子の遺伝子座の多種が発見された。例えば、Noadらは非必須遺伝子座ctx、egt、39k、orf51,pg37、iap2,odv-e56を発見した（Noadら、2009,BMC Molecular Biology10:87）。 A variety of loci of other non-essential genes with high expression of heterologous genes in the baculovirus genome have been discovered. For example, Noad et al. Discovered the non-essential loci ctx, egt, 39k, orf51, pg37, iap2, odv-e56 (Noad et al., 2009, BMC Molecular Biology 10:87).

Kabaらの研究によると、キチナーゼ (Chitinase、Chia)遺伝子及びカテプシン(Cathepsin、Cath)遺伝子のノックアウトに細胞内及び分泌型組換え型タンパクの安定性に対する強化効果がある（kabaら、2004,Journal of Virological Methods、122,113-118）。Hitchmanらの研究によると、Chitinase、Cathepsin、P10,P26及びP74遺伝子の欠如が外来タンパク質の発現レベルを向上できる（Hitchmanら、2009,Cell Biol Toxicol、26:57-68）。Liangらの研究によると、Ac124遺伝子のノックアウトはAcMNPVの増殖に対する顕著な影響がない（Liangら、2015,Arch Virol,160(1):275-84.）。 According to a study by Kaba et al., Knockout of the chitinase (Chitinase, Chia) gene and cathepsin (Cath) gene has an enhancing effect on the stability of intracellular and secretory recombinant proteins (kaba et al., 2004, Journal of Virological Methods, 122,113-118). According to a study by Hitchman et al., Lack of the Chitinase, Cathepsin, P10, P26 and P74 genes can improve the expression level of foreign proteins (Hitchman et al., 2009, Cell Biol Toxicol, 26: 57-68). According to a study by Liang et al., Knockout of the Ac124 gene has no significant effect on the proliferation of AcMNPV (Liang et al., 2015, Arch Virol, 160 (1): 275-84.).

然しながら、前記の研究でこれらのバキュロウイルスの非必須遺伝子座の欠如または交換がポリタンパク質複合体、rAAVまたは他の組換え型ウイルスキャリアの調製に対する効果の有無が指摘されていないが、これらの遺伝子座がAAVの機能的タンパク質成分の発現ボックスを負荷できるかということについて、rAAVの複雑性及び調製に様々な困難があるので、より一歩の実験による検証が必要である。 However, although the above studies did not indicate whether the lack or exchange of non-essential loci of these baculoviruses had an effect on the preparation of polyprotein complexes, rAAV or other recombinant virus carriers, these genes Whether the locus can load the expression box of the functional protein component of AAV has various difficulties in the complexity and preparation of rAAV, and further experimental verification is needed.

本発明の実験によると、非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56はrAAV産生に必要なAAV Rep及びCap遺伝子発現ボックスを成功して負荷したり、正常に発現したりすることができる。即ち、好ましい案として、rAAV産生に必要なAAV Rep及びCap遺伝子発現ボックスは同時に前記の組換え型バクミドに整合され、その発現ボックスが前記のバキュロウイルスが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。この案では、前記の組換え型バクミドに基いてTn7トランスポゾンに仲介されてrAAV ITRの中核的な発現コンポーネントを携帯するシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を組換えるだけでrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バキュロウイルスのゲノムを取得できる。その長所として、従来のThree Bac、Two Bac及びSf9/Rep-Capパッケージング細胞系に依頼するOneBacシステムと互換できる。即ち、それにより構築した汎用シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)は直接にAAVのRep及びCap遺伝子発現ボックスを整合した組換え型バクミドと組換えてrAAVを調製するための新規組換え型バキュロウイルスを取得できる。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステム（One Bac system）と比べて見ると、この案はシャトルプラスミドの構築を容易にし、ITRの中核的な発現コンポーネントとRep及びCap遺伝子発現ボックスとの空間的間隔を大きくし、新しい組換え型バキュロウイルスBEVの安定性が向上し、新しいシステムの安定性が全体的に向上した。 According to the experiments of the present invention, the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and the locus odv-e56 are the AAV Rep and Cap genes required for rAAV production. The expression box can be successfully loaded or expressed normally. That is, preferably, the AAV Rep and Cap gene expression boxes required for rAAV production are simultaneously matched with the recombinant bacmid, and the expression box is such that the baculovirus is a non-essential gene Chia, Cath, Ac124, p10, It is inserted into one or more loci selected from p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and locus odv-e56. In this proposal, all of the rAAV packaging components are simply recombined with the shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI), which is mediated by the Tn7 transposon and carries the core expression component of rAAV ITR based on the recombinant baculomid. The genome of the recombinant baculovirus matched with the above can be obtained. Its advantage is that it is compatible with traditional Three Bac, Two Bac and One Bac systems that rely on Sf9 / Rep-Cap packaging cell lines. That is, the general-purpose shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) constructed thereby is a novel recombinant baculovirus for preparing rAAV by directly recombining the Rep and Cap gene expression boxes of AAV with recombinant bacmid. Can be obtained. Compared to the One Bac system, which is based on the shuttle plasmid, this proposal facilitates the construction of the shuttle plasmid and provides the spatial spacing between the core expression components of the ITR and the Rep and Cap gene expression boxes. Increased, improved stability of the new recombinant plasmid BEV, and overall improved stability of the new system.

更に好ましくは、前記のシャトルプラスミドに相応しい組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia遺伝子及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスのゲノムである。前記の他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 More preferably, the recombinant bacmid suitable for the shuttle plasmid is a baculovirus genome lacking the non-essential genes Chia and / or Cath genes. The expression box of the functional protein component required for the production of the other rAAV is the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2. And is inserted into one or more loci selected from locus odv-e56.

好ましくは、前記の他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスが非必須遺伝子Chia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, the expression box for the functional protein component required for the other rAAV production is inserted at the locus selected by the baculovirus from the non-essential genes Chia and / or Cath.

実験によると、遺伝子Chia、Cathが欠如してからrAAVの機能的タンパク質の安定性を強化し、遺伝子Chia、Cathがタンパク質酵素遺伝子であり、Sf9細胞でのAcMNPVの複製及びウイルスの産生に役に立つのは非必須遺伝子である。本研究によると、これらの遺伝子の2つはrAAVウイルスの産出量に関するマイナスの影響がない。 Experiments have shown that the lack of the genes Chia and Cath enhances the stability of rAAV's functional proteins, and the genes Chia and Cath are protein enzyme genes that help Sf9 cells replicate AcMNPV and produce viruses. Is a non-essential gene. According to this study, two of these genes have no negative effect on rAAV virus production.

同時に、Chia遺伝子及びCath遺伝子座は密に隣接するものである。操作で好ましく相同組換えによりAAV Rep及び/またはCap発現ボックスを挿入する同時にCath及びChia遺伝子が欠如するようにすることができる。よって、Cath、Chia遺伝子座自身が挿入するために用いられることができ、好ましくCath、Chia遺伝子座を挿入座にする。 At the same time, the Chia and Cath loci are closely adjacent. The Cath and Chia genes can be deficient at the same time that the AAV Rep and / or Cap expression box is inserted, preferably by homologous recombination. Therefore, the Cath and Chia loci themselves can be used for insertion, preferably the Cath and Chia loci are inserted.

よって、前記の案で採用される組換え型バキュロウイルスは好ましく下記の方法により調製する。 Therefore, the recombinant baculovirus adopted in the above plan is preferably prepared by the following method.

Red組換えにより非必須遺伝子座の遺伝子フラグメントを前記の他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスに交換する。 Red recombination replaces the gene fragment of the non-essential locus with an expression box of the functional protein component required for the other rAAV production described above.

Tn7トランスポゾンに仲介される組換えに対する利用は快速に、高い効率で外来遺伝子を組換え型バキュロウイルスのゲノムに構築する方法であるが、とても大きな局限性がある。組換え型バキュロウイルスのゲノムにTn7トランスポゾン認識配列を導入しなければいけないと同時に、同時に、または数回に複数の異なる座で組換えを行うことに適しない。従来、組換え型バキュロウイルスのゲノムに対する効率の高い改造は相変わらず繁雑である。 Utilization for Tn7 transposon-mediated recombination is a rapid and highly efficient method for constructing a foreign gene in the genome of a recombinant baculovirus, but it has a very large limitation. The Tn7 transposon recognition sequence must be introduced into the genome of the recombinant baculovirus and is not suitable for recombination at multiple different loci at the same time or several times. Traditionally, efficient modifications of recombinant baculovirus to the genome remain complicated.

Red組換えはλファージRed組換え型酵素（タンパク質Exo、Beta及びGamからなるものである）で細胞に導入された直鎖状DNAフラグメントをゲノムの特定の標の配列と相同組換えを行って目的遺伝子の交換に達するものであり（Doubletら、2008、J Microbiol Methods.、75(2):359-61を参考にすること）、細菌レベルでの効率の高い組換え方法であり、決まった程度で快速に組換え型バキュロウイルスのゲノムを改造できる。 Red recombination involves homologous recombination of a linear DNA fragment introduced into a cell by a λ phage Red recombination enzyme (consisting of proteins Exo, Beta and Gam) with a specific target sequence in the genome. It reached the exchange of the gene of interest (see Doublet et al., 2008, J Microbiol Methods., 75 (2): 359-61) and was determined to be a highly efficient recombination method at the bacterial level. The genome of recombinant baculovirus can be remodeled quickly.

好ましくは、前記の組換え型バクミドはAcMNPV E2 (ゲノム配列の例：Genbank accession No. KM667940.1)、AcMNPV Bacmid (bMON14272)の構成について(Luckowら、J Virol、1993. 67(8): 4566-79.を参照すること) からのものであり、rAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスがP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節される。 Preferably, the recombinant protein described above is for the composition of AcMNPV E2 (genome sequence example: Genbank accession No. KM667940.1), AcMNPV Bacmid (bMON14272) (Luckow et al., J Virol, 1993. 67 (8): 4566). -79.), The expression box of the functional protein component required for rAAV production is downstream of the P10 or PH promoter and is regulated thereby.

rAAVのパッケージングは主にrAAVのゲノム、即ちITRの中核的な発現コンポーネント、AAVのRep機能的遺伝子及びAAVのCap機能的遺伝子が必要である。またパッケージング効率の向上に対して決まった促進効果があるAAPなどの他の機能的タンパク質成分も必要である。 Packaging of rAAV primarily requires the genome of rAAV, the core expression component of ITR, the Rep functional gene of AAV and the Cap functional gene of AAV. There is also a need for other functional protein components such as AAP, which have a fixed facilitative effect on improving packaging efficiency.

本発明によるrAAVの調製方法として、異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを（ITR-GOI）及びrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを各々シャトルプラスミド及び組換え型バクミドに設置して異種遺伝子フラグメントを携帯するシャトルプラスミドの負荷を分担し、組換え型バキュロウイルスの安定性及び当該システムの互換性と柔軟性を向上させる。 As a method for preparing rAAV according to the present invention, a shuttle plasmid and recombination of the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment (ITR-GOI) and the expression box of other functional protein components required for rAAV production, respectively. It shares the load of the shuttle plasmid that is placed in the type bacmid and carries the heterologous gene fragment, improving the stability of the recombinant baculovirus and the compatibility and flexibility of the system.

特に負荷の機能的タンパク質成分の発現ボックスは多種の異なる血清形があるCap遺伝子である場合、効果的にシャトルプラスミド及び相応しいバキュロウイルスの複雑さの降下に達成できる。例えば、rAAVを調製する場合、rAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスはRep遺伝子発現ボックス及びCap遺伝子発現ボックスを含む。普通、異なる血清形のrAAVを調製する場合、タイプ2のRep遺伝子を利用できるが、AAV感染範囲及びターゲット特異性を決めるCap遺伝子にとって、特定血清形のCap遺伝子を利用しなければいけない。そして、特定血清形のCap遺伝子の種類がAAV血清形に応じ、今までAAV血清形及び突然変異形の100種以上が開発された。従来のシャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムがシャトルプラスミドで同時にRep遺伝子及びCap遺伝子を含むので、特定の異種機能的遺伝子フラグメント、異なる種類のAAV血清形の組換え型バキュロウイルスを調製するには、多種の異なるシャトルプラスミドを調製しなければいけないので、非常に構築しがたいと同時に、シャトルプラスミドは自身のゲノムが小さいので、同時にRep遺伝子、Cap遺伝子及びITRの中核的な発現コンポーネントを収容すると、安定性が弱い。研究データによると、前記の高度に整合された組換え型バキュロウイルスBEVは安定に4世代にしか継代できなく、第5世代になってからBEVでrAAV調製する産出率が顕著に降下する（Yangら、2018,Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4;10:38-47を参考にすること）。 Especially when the expression box of the functional protein component of the load is a Cap gene with a wide variety of different serotypes, a reduction in the complexity of shuttle plasmids and suitable baculoviruses can be effectively achieved. For example, when preparing rAAV, the expression boxes for the functional protein components required for rAAV production include the Rep gene expression box and the Cap gene expression box. Normally, when preparing rAAV with different serotypes, the Type 2 Rep gene can be used, but for the Cap gene that determines the AAV infection range and target specificity, the Cap gene with a specific serotype must be used. So far, more than 100 types of AAV serotypes and mutants have been developed, depending on the type of Cap gene of the specific serotype depending on the AAV serotype. Since one baculovirus system based on a conventional shuttle plasmid contains the Rep and Cap genes simultaneously in the shuttle plasmid, to prepare specific heterologous functional gene fragments, recombinant baculoviruses of different types of AAV serum forms, It is very difficult to construct because many different shuttle plasmids have to be prepared, and at the same time, the shuttle plasmid has a small genome, so that it simultaneously contains the Rep gene, Cap gene and the core expression component of ITR. Poor stability. According to research data, the highly matched recombinant baculovirus BEV can only be stably passaged to the 4th generation, and the yield rate of rAAV preparation with BEV is significantly reduced after the 5th generation (5th generation). Yang et al., 2018, Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Jul 4; 10: 38-47).

好ましい案の一として、シャトルプラスミドがITR-GOIを含む同時にCap遺伝子発現ボックスpFBD-Cap-(ITR-GOI)も含み、相応しい組換え型バクミドの場合にRep遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分発現ボックスを整合しなければならない。この場合、様々なITR-GOI及び血清形Cap遺伝子は必要に応じて柔軟にpFBDシャトルプラスミドに組み合うことができる。そして、Rep2遺伝子発現ボックスを整合した組換え型バクミドだけで様々な異なる血清形及び異なる異種機能的遺伝子フラグメントを携帯するrAAVの調製に達成でき、シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステム（One Bac system）の柔軟性が保たれ、決まった程度でシャトルプラスミドを構築しやすく、ITR-GOI中核的な発現コンポーネントとRep遺伝子発現ボックスとの空間的間隔を大きくし、新しい組換え型バキュロウイルスの安定性が向上し、新しいシステムの安定性が決まった程度で向上した。 As a preferred option, the shuttle plasmid contains the ITR-GOI and simultaneously contains the Cap gene expression box pFBD-Cap- (ITR-GOI), and in the case of suitable recombinant bacmid, the Rep gene expression box and other functional protein components. The expression box must be matched. In this case, the various ITR-GOI and serotype Cap genes can be flexibly combined with the pFBD shuttle plasmid as needed. Then, the preparation of rAAV carrying various different serum forms and different heterologous functional gene fragments can be achieved only by recombinant Bacmid matched with the Rep2 gene expression box, and one Bac system based on the shuttle plasmid. The flexibility is maintained, the shuttle plasmid can be easily constructed to a certain extent, the spatial spacing between the ITR-GOI core expression component and the Rep gene expression box is increased, and the stability of the new recombinant baculovirus is increased. It has improved and the stability of the new system has improved to a certain extent.

好ましい案の二として、シャトルプラスミドにITR-GOIを含む同時にRep遺伝子発現ボックスpFBD-Rep-(ITR-GOI)も含む場合、相応しい組換え型バクミドはCap遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分発現ボックスを整合しなければいけない。この場合、相応しく異なる血清形 Cap遺伝子発現ボックスを整合した多種の組換え型バクミドを構築しなければ異なる異種機能的遺伝子フラグメントの携帯及び様々な異なる血清形rAAVの調製に満たすことができないので、シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステム（One Bac system）と比べて見ると、決まった程度でシャトルプラスミドを構築しやすく、ITR-GOI中核的な発現コンポーネントとCap遺伝子発現ボックスとの空間的間隔を大きくし、新しい組換え型バキュロウイルスの安定性が向上し、新しいシステムの安定性が決まった程度で向上したが、システムの柔軟性が決まった程度で降下した。 As a second preferred option, if the shuttle plasmid contains ITR-GOI and at the same time contains the Rep gene expression box pFBD-Rep- (ITR-GOI), a suitable recombinant bacmid will express the Cap gene expression box and other functional protein components. The boxes must be aligned. In this case, the shuttle will not be able to meet the carrying of different heterologous functional gene fragments and the preparation of various different plasmid rAAVs without constructing a variety of recombinant bacmids consistent with appropriately different plasmid Cap gene expression boxes. Compared to the One Bac system, which is based on a plasmid, it is easier to construct a shuttle plasmid to a certain extent, and the spatial spacing between the ITR-GOI core expression component and the Cap gene expression box is increased. , The stability of the new recombinant plasmid was improved and the stability of the new system was improved to a certain extent, but the flexibility of the system was reduced to a certain extent.

好ましい案の三として、シャトルプラスミドにITR-GOIだけを含み、相応しい組換え型バクミドはRep遺伝子発現ボックス、Cap遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分発現ボックスを整合しなければいけない。この場合、Rep2遺伝子発現ボックス及び相応しい多種の異なる血清形 Cap遺伝子発現ボックスを整合した組換え型バクミドを構築しなければ異なる異種機能的遺伝子フラグメントの携帯及び様々な異なる血清形のrAAVの調製に満たすことができないので、シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステム（One Bac system）と比べて見ると、最大な程度でシャトルプラスミドを構築しやすく、ITR-GOI中核的な発現コンポーネントとRep及びCap遺伝子発現ボックスとの空間的間隔を大きくし、新しい組換え型バキュロウイルスの安定性が向上し、新しいシステムの安定性が全体的に向上した上、今までの多種のBacシステムのシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)と見事に互換できる。 As a third preferred option, the shuttle plasmid should contain only ITR-GOI and the appropriate recombinant bacmid should be matched with the Rep gene expression box, Cap gene expression box and other functional protein component expression boxes. In this case, the Rep2 gene expression box and a variety of suitable different plasmid Cap gene expression boxes must be matched to construct a recombinant bacmid to satisfy the carrying of different heterologous functional gene fragments and the preparation of rAAV of various different plasmid forms. Compared to the One Bac system, which is based on the shuttle plasmid, it is easier to construct the shuttle plasmid to the maximum extent, and the ITR-GOI core expression component and Rep and Cap gene expression boxes. Increased spatial spacing with, improved stability of the new recombinant baculovirus, improved overall stability of the new system, and shuttle plasmid pFBD- (ITR-) for many previous Bac systems. Excellent compatibility with GOI).

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種機能的遺伝子フラグメントのrAAVの中核的な発現コンポーネントrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) Core expression component of rAAV of heterologous functional gene fragment by the shuttle plasmid obtained in step (1) and recombinant Bakumid containing the genome of baculovirus, and other functional protein components required for rAAV production. Consistent with the expression box, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

具体的に、シャトルプラスミドが携帯するTn7トランスポゾンと組換え型バクミドの特定座との組換えを行って異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVを携帯する中核的な発現コンポーネントを整合する。 Specifically, the Tn7 transposon carried by the shuttle plasmid is recombined with a specific locus of recombinant bacmid to match the core expression component carrying rAAV with a heterologous functional gene fragment.

シャトルプラスミドはITRの中核的な発現コンポーネントをバキュロウイルスのゲノムに整合でき、多面体遺伝子(polh)座が好ましいが、シャトルプラスミド自身のゲノムが小さく、外来遺伝子フラグメントを携帯できる大さが限られる。従来、1種の組換え型バキュロウイルスだけで普通昆虫の細胞系に感染してrAAVを調製できるように、AAVのRep遺伝子とCap遺伝子及びITRの中核的な発現コンポーネントを共にシャトルプラスミドに挿入したが、シャトルプラスミドを構築し難く、整合された組換え型バクミドが単一座で大量の外来性遺伝子フラグメントを負荷したので、安定性が弱い。 Shuttle plasmids can align the core expression components of ITR to the baculovirus genome, preferably at the polyhedral gene (polh) locus, but the shuttle plasmid itself has a small genome and is limited in its size to carry foreign gene fragments. Conventionally, the Rep gene and Cap gene of AAV and the core expression component of ITR were both inserted into the shuttle plasmid so that rAAV can be prepared by infecting the cell line of ordinary insects with only one recombinant baculovirus. However, the stability is weak because it is difficult to construct a shuttle plasmid and the matched recombinant bacmid loaded a large amount of exogenous gene fragments at a single locus.

本発明による前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドはITRの中核的な発現コンポーネント、Rep遺伝子及びCap遺伝子が各々異なる座に負荷されるので、組換え型バクミド及び調製した組換え型バキュロウイルスBEVの安定性が顕著に向上した。特にRep遺伝子及び/またはCap遺伝子がChia及び/またはCath遺伝子座に挿入された場合、安定性が全体的に顕著に向上した。 Recombinant baculovirus containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV according to the present invention is loaded with the core expression components of ITR, the Rep gene and the Cap gene at different loci. And the stability of the prepared recombinant baculovirus BEV was significantly improved. Overall stability was significantly improved, especially when the Rep and / or Cap genes were inserted at the Chia and / or Cath loci.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

具体的に、ステップ（2）で取得した組換え型バクミドを相応しいホスト細胞系にトランスフェクトしてから前記のrAAVを調製する（下記の方式を含むがそれに限るものではない）。 Specifically, the recombinant bacmid obtained in step (2) is transfected into a suitable host cell line, and then the above-mentioned rAAV is prepared (including, but not limited to, the following method).

抽出・トランスフェクト：含まれる前記の組換え型バクミドDNAを大腸菌から抽出して精製し、ホスト細胞系にトランスフェクトする。 Extraction / Transfection: The recombinant Bakumid DNA contained therein is extracted from Escherichia coli, purified, and transfected into a host cell line.

直接感染：含まれる前記の組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトしてから組換え型バキュロウイルスBEVを取得し、BEVが直接に相応しいホスト細胞系に感染する。 Direct infection: Transfect the contained recombinant bacmid into a host cell line and then obtain the recombinant baculovirus BEV, which directly infects the appropriate host cell line.

抽出及びトランスフェクトにより毒素が速く産生し、BEVウイルスシードバンクの早期調製に適し、直接感染による感染効率が高く、rAAVの大量調製用BEVウイルスの大量拡張に適する。 It produces toxins quickly by extraction and transfection, is suitable for early preparation of BEV virus seed banks, has high infection efficiency by direct infection, and is suitable for mass expansion of BEV virus for mass preparation of rAAV.

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含む本発明による組換え型アデノ随伴ウイルスの調製システム。 A system for preparing recombinant adeno-associated virus according to the invention, comprising a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome.

前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付きrAAVの中核的な発現コンポーネントを含む。前記のシャトルプラスミドは好ましくプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものである。本発明の好ましい案として、前記のシャトルプラスミドはAAVのRep遺伝子またはCap遺伝子の発現ボックスを含む。 The shuttle plasmid contains at least the core expression component of rAAV with a heterologous functional gene fragment. The shuttle plasmid is preferably based on the plasmid pfast.Bac.Dual. As a preferred idea of the present invention, the shuttle plasmid comprises an expression box for the Rep or Cap gene of AAV.

前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドはrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドはChia遺伝子及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスである。前記のrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 The recombinant bacmid containing the baculovirus genome contains an expression box for other functional protein components required for rAAV production. The recombinant bacmid containing the baculovirus genome is a baculovirus lacking the Chia gene and / or the Cath gene. The expression box for other functional protein components required for rAAV production is the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2. And is inserted into one or more loci selected from locus odv-e56.

好ましい案として、前記のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の他の発現ボックスが前記のバキュロウイルスがChia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, another expression box of the functional protein component required for rAAV production is inserted at the locus selected by the baculovirus from Chia and / or Cath.

前記のChia及び/またはCath遺伝子の欠如により、rAAV機能的タンパク質の安定性が強化し、Cath及びChia遺伝子が隣り合う遺伝子座であり、負荷力が強く、操作に便利である。 The lack of the Chia and / or Cath gene enhances the stability of the rAAV functional protein, and the Cath and Chia genes are adjacent loci, which are burdensome and convenient to operate.

少なくともrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスの1種を含む本発明によるrAAVを調製するための組換え型バクミド。前記の他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスがChia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入される。 Recombinant Bakumid for preparing rAAV according to the invention, which comprises at least one of the expression boxes of functional protein components required for rAAV production. The expression box of the functional protein component required for the production of the other rAAV is that the baculovirus is Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and the locus odv- It is inserted into one or more loci selected from e56.

好ましい案として、前記のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスがChia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入される。 Preferably, an expression box for the functional protein component required for rAAV production is inserted at the locus selected by the baculovirus from Chia and / or Cath.

好ましくは、前記のバキュロウイルスのゲノムはAcMNPVからのものであり、少なくともrAAV産生に必要なAAV Cap遺伝子及び/またはRep遺伝子の発現ボックスを含み、rAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスがP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節される。 Preferably, the baculovirus genome is from AcMNPV and contains at least an expression box for the AAV Cap and / or Rep genes required for rAAV production, and an expression box for functional protein components required for rAAV production. It is downstream of the P10 or PH promoter and is regulated thereby.

DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Cap-Δ(Chia-Cath)-RepによりrAAVを調製する。 Prepare rAAV by DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Cap-Δ (Chia-Cath) -Rep.

シャトルプラスミドpFBDがrAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOI及びAAVのCap遺伝子発現ボックスを含む場合、相応しい組換え型バクミドはAAVのRep遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分発現ボックスを整合したものである（図2A）。 If the shuttle plasmid pFBD contains the core expression components of rAAV, the ITR-GOI and AAV Cap gene expression boxes, then the appropriate recombinant bacmid is a match for the AAV Rep gene expression box and other functional protein component expression boxes. (Fig. 2A).

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システム。前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、マルチクローニングサイトにITR-GOI配列及びCap遺伝子が挿入されていて、Cap遺伝子がP10プロモーターの下流に設置されている。前記のバキュロウイルスのゲノムの組換え型バクミドは非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子が欠けているAcMNPV E2であり、遺伝子配列がGenbank accession No. KM667940.1のようなものであり、その（座の範囲105,353bp-108,025bp）内にChia及びCath遺伝子が欠如し、Chia及びCath遺伝子座にRep遺伝子発現ボックスが挿入されている。 A preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual, with the ITR-GOI sequence and Cap gene inserted at the multicloning site, with the Cap gene located downstream of the P10 promoter. The recombinant bacmid of the baculovirus genome is AcMNPV E2, which lacks the non-essential genes Chia and Cath genes, and has a gene sequence similar to that of Genbank accession No. KM667940.1. The Chia and Cath genes are absent within 105,353bp-108,025bp), and the Rep gene expression box is inserted at the Chia and Cath loci.

rAAVの調製方法が下記のステップを含む本実施例によるrAAVの調製システム。 The rAAV preparation system according to this embodiment in which the rAAV preparation method includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

1.1 rAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOI及びAAVを含むCap遺伝子発現ボックスシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)-Capを構築する。先ず、バキュロウイルス発現システムBac-to-BacのpFast.Bac.Dual (pFBD)シャトルプラスミドを利用する。実例で、タイプ2のAAVに基くCap遺伝子に対してリボソームリークスキャニング原理によりコドンの最適化を行い（Smithら、2009,Mol.Ther.17:1888-1896を参考にすること）、Cap遺伝子がP10プロモーターにコントロールされるようにし、VP1,VP2,VP3というキャプシドタンパク質の3種に達成して自然な割合(1:1:10)の機能的発現に近寄せるようにする。ITRの中核的な発現コンポーネントについて、実例でITRについてタイプ2のAAVのITR核酸配列、ITRの中核的な発現コンポーネントについて緑色蛍光タンパク質(GFP)発現ボックスを利用し、CMVプロモーターによりGFPの発現をコントロールし、rAAVの活性検出に便利である。ITRの中核的な発現コンポーネントは5’末端連結核酸フラグメント及び3’末端連結核酸フラグメントによりCap遺伝子の発現ボックスまたはキャリア枠組みと連結する（相応しいCap遺伝子、ITR及びその連結フラグメントの配列について中国特許CN 106916793Aを参考にすること）。 1.1 Construct the Cap gene expression box shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) -Cap containing the core expression components ITR-GOI and AAV of rAAV. First, the pFast.Bac.Dual (pFBD) shuttle plasmid of the baculovirus expression system Bac-to-Bac is used. In an example, a type 2 AAV-based Cap gene was codon-optimized by the ribosome leak scanning principle (see Smith et al., 2009, Mol.Ther. 17: 1888-1896) to obtain the Cap gene. It should be controlled by the P10 promoter to reach three capsid proteins, VP1, VP2, and VP3, to approach the functional expression of the natural ratio (1: 1:10). Regarding the core expression component of ITR, the ITR nucleic acid sequence of type 2 AAV is used for the example, and the green fluorescent protein (GFP) expression box is used for the core expression component of ITR, and the expression of GFP is controlled by the CMV promoter. However, it is convenient for detecting the activity of rAAV. The core expression component of ITR is linked to the Cap gene expression box or carrier framework by 5'end-linked nucleic acid fragments and 3'end-linked nucleic acid fragments (Chinese patent CN 106916793A for sequences of suitable Cap genes, ITRs and their linkage fragments Please refer to).

1.2 相応しい欠如非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子を構築する同時に、Chia及びCath遺伝子座にAAV Rep遺伝子発現ボックスの組換え型バクミドを挿入する。 1.2 Appropriate deficiency Non-essential genes Chia and Cath genes are constructed. At the same time, recombinant bacmid of the AAV Rep gene expression box is inserted at the Chia and Cath loci.

野生型AcMNPVバクミドのChia及びCath遺伝子が隣り合い、本実施例でChia及びCath遺伝子が同時に欠如する好ましい案を利用する。組換え型クローニング操作を便利にするために、Red組換え型技術及び転化されたpKD46プラスミドがあり、AcMNPVバクミドを含む大腸菌DH10Bacの菌株を利用し、相同アーム遺伝子組換えによりバクミドゲノムを改造する。pKD46プラスミドは温度感受性低複製プラスミドであり、20〜25℃でアラビノースを入れると、Exo、Beta及びGamという3種のタンパク質（即ちRed組換え型酵素）の発現を誘導でき、相同アームを携帯する外来遺伝子を細菌のバクミドゲノムと高い効率の特異性組換えを行うことができる（Doubletら、2008,J Microbiol Methods. ,75(2):359-61を参考にすること）。組み換え型のスクリーニングを便利にするために、両側にFrt配列のあるクロラムフェニコール（Chloromycetin、Chlo）抵抗性遺伝子を導入し（プライマー Frt-Chlo-F（配列番号9）及びFrt-Chlo-R（配列番号10）によりPKD3プラスミドからフラグメントP1-FRT-Chlo-P2を拡張しる）、次にFlp組換え型酵素の働きによりこの抵抗性遺伝子を除去すると、バクミドゲノムで連続して数回にChlo抵抗性遺伝子により一連の遺伝子の欠如または挿入に用いられることができる。Invitrogen社製 Bac-to-BacシステムのpFBDシャトルプラスミドにより枠組みを構築した。pFBDプラスミドのBsrGI酵素制限サイトに上流相同アームChia-up及びクロラムフェニコール抵抗性遺伝子フラグメントP1-FRT-Chlo-P2,pFBDプラスミドのAvrII酵素制限サイトに下流相同アームCath-Downを導入し、pFBDプラスミドのPHプロモーター及び/またはP10プロモーター下流にRep遺伝子及び/または Cap遺伝子を挿入してRep遺伝子及び/または Cap遺伝子の発現ボックスを構成する。 The preferred scheme is utilized in which the Chia and Cath genes of the wild-type AcMNPV bacmid are adjacent and the Chia and Cath genes are simultaneously absent in this example. For convenience of recombinant cloning operations, there is a Red recombinant technique and a converted pKD46 plasmid, which utilizes a strain of Escherichia coli DH10Bac containing AcMNPV bacmid to remodel the bacmid genome by homologous arm gene recombination. The pKD46 plasmid is a temperature-sensitive low-replication plasmid that can induce the expression of three proteins (ie, Red recombinant enzymes), Exo, Beta, and Gam, when arabinose is added at 20 to 25 ° C, and carries a homologous arm. Highly efficient specific recombination of foreign genes with bacterial plasmid genomes can be performed (see Doublet et al., 2008, J Microbiol Methods., 75 (2): 359-61). To facilitate recombinant screening, a chloramphenicol (Chlo) resistance gene with a Frt sequence on both sides was introduced (primer Frt-Chlo-F (SEQ ID NO: 9) and Frt-Chlo-R). The fragment P1-FRT-Chlo-P2 is extended from the PKD3 plasmid by (SEQ ID NO: 10)), and then the resistance gene is removed by the action of Flp recombinant enzyme, resulting in several consecutive times in the bacmid genome. The Chlo resistance gene can be used for the absence or insertion of a series of genes. The framework was constructed with the pFBD shuttle plasmid of the Invitrogen Bac-to-Bac system. Upstream homologous arm Chia-up and chloramphenicol resistance gene fragment P1-FRT-Chlo-P2 at the BsrGI enzyme restriction site of the pFBD plasmid, downstream homologous arm Cath-Down introduced at the AvrII enzyme restriction site of the pFBD plasmid, and pFBD The Rep gene and / or Cap gene is inserted downstream of the PH promoter and / or P10 promoter of the plasmid to form an expression box for the Rep gene and / or Cap gene.

本実例でタイプ2のAAVに基くRep遺伝子に対してリボソームリークスキャニング原理によりコドンの最適化を行い（Smithら、2009,Mol.Ther.17:1888-1896を参考にすること）、Rep遺伝子がPHプロモーターにコントロールされるようにし、Rep72,Rep52複製タンパク質の機能的発現に達成する（相応しいRep遺伝子配列について中国特許CN 106916793Aを参考にすること）。 In this example, codons were optimized for the Type 2 AAV-based Rep gene by the ribosome leak scanning principle (see Smith et al., 2009, Mol. Ther. 17: 1888-1896), and the Rep gene was obtained. It is controlled by the PH promoter to achieve functional expression of Rep72, Rep52 replication proteins (see Chinese patent CN 106916793A for suitable Rep gene sequences).

下記の方法により前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドを調製する。先ず下記のステップによりプラスミドpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Downを構築する。 Recombinant Bakumid for preparing the above rAAV is prepared by the following method. First, the plasmid pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down is constructed by the following steps.

先ず、野生型AcMNPVバクミドDNAをテンプレートにし、プライマーChia-up-F（配列番号1）及びChia-up-R（配列番号2）により上流相同アームChia-upフラグメント、プライマーCath-down-F（配列番号3）及びCath-down- R（配列番号4）により下流相同アームCath-Downフラグメントを拡張する。 First, using wild-type AcMNPV bacmid DNA as a template, the upstream homologous arm Chia-up fragment and the primer Cath-down-F (sequence number 2) were used with the primers Chia-up-F (SEQ ID NO: 1) and Chia-up-R (SEQ ID NO: 2). Extend the downstream homologous arm Cath-Down fragment by number 3) and Cath-down-R (SEQ ID NO: 4).

相同組換えにより上流相同アームChia-upフラグメント及びクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むDNAフラグメント P1-FRT-Chlo-P2をpsimple-Tプラスミドにクローニングしてpsimple-T1-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2プラスミドを構築する。 By homologous recombination, the upstream homologous arm Chia-up fragment and the DNA fragment P1-FRT-Chlo-P2 containing the chloramphenicol resistance gene were cloned into the psimple-T plasmid and psimple-T1-Chia-up-P1-FRT. -Construct the Chlo-P2 plasmid.

次に、相同組換えにより下流相同アームCath-DownフラグメントをpFBDプラスミドのAvrII酵素制限サイトに挿入してpFBD-Cath-Downプラスミドを構築し、フラグメント Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2をpFBD-Cath-DownプラスミドのBsrG酵素制限サイトに挿入してpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Downプラスミドを構築する。次に、Rep遺伝子をpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-DownプラスミドのBamH1とXba1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがPHプロモーターにコントロールされるようにし、最終にpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Downプラスミドを取得する。 Next, by homologous recombination, the downstream homologous arm Cath-Down fragment was inserted into the AvrII enzyme restriction site of the pFBD plasmid to construct the pFBD-Cath-Down plasmid, and the fragment Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2 was pFBD. -Insert into the BsrG enzyme restriction site of the Cath-Down plasmid to construct the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid. The Rep gene was then inserted between the BamH1 and Xba1 enzyme restriction sites of the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid so that it was controlled by the PH promoter and finally Obtain the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down plasmid.

BsrGI及びAvrIIによりpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Downプラスミドを切断し、電気泳動でChia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down核酸フラグメントを回収する。そして、このDNAフラグメントをDH10Bac/pKD46コンピテントセルに電気変換し、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールという3種の抵抗性のあるLBプレートに塗る。電気変換を行って48時間にわたってから青斑振とう菌を選出する。ミニプレップバクミドDNAに関するPCR鑑定を行い、ポジティブをスクリーニングしてクローニングを行い、シーケンスを測定し、検証を行う。スクリーニングによるポジティブ菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2に命名する。 The pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down plasmid was cleaved by BsrGI and AvrII, and the Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cath-Down nucleic acid fragment was electrophoresed. To collect. The DNA fragment is then electroconverted into DH10Bac / pKD46 competent cells and applied to three resistant LB plates: kanamycin, tetracycline and chloramphenicol. After 48 hours of electrical conversion, blue spot-shaking bacteria are selected. Perform PCR testing on miniprep bactide DNA, screen for positives, perform cloning, measure sequences, and verify. The positive strain by screening is named DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種治療性遺伝子フラグメントのあるrAAVの中核的な発現コンポーネントをrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) Other functional proteins required for rAAV production with the core expression component of rAAV with heterologous therapeutic gene fragments by the shuttle plasmid obtained in step (1) and the recombinant bacmid containing the baculovirus genome as appropriate. Consistent with the expression box of the component, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

Bac-to-Bacシステムの操作方法によりBEVを調製し、組換え型シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)-Cap2 から転化し、相応しい組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2をTn7トランスポザーゼに仲介される相同組換えを行ってrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Cap2-Δ(Chia-Cath)-Rep2を取得する。 E. coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath)-, which is prepared by operating the Bac-to-Bac system, converted from the recombinant shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) -Cap2, and contains the appropriate recombinant Bactido. Escherichia coli DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Cap2-Δ (Chia-Cath) -Rep2 containing recombinant Bacmid in which Rep2 was homologously recombined to Tn7 transposase and all of the rAAV packaging components were matched. To get.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

この組換え型バクミドDNAを抽出してSf9昆虫細胞をトランスフェクトし、組換え型バキュロウイルスBEV及びrAAVを調製する。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞に成功してBEVが産生し、大量で増殖したBEVを複製してより一歩の感染により、Sf9細胞に顕著な病変現象（CPE）が発生し、蛍光顕微鏡で顕著な緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現（図2B）を観察できる。CPEが発生した大量のBEVを含むSf9細胞培養上澄みを収集し、第1世帯のBEV (P1)にし、同時に大量のrAAVを含むSf9細胞を収集する。調製して取得したBEV (P1)で感染複数(MOI＝3)でサスペンション培養によるSf9細胞を感染してから72時間後に細胞培養液を3000rpmで5min遠心し、各々培養上澄み及び細胞沈殿物を収集する。細胞培養の上澄みを第2世帯のBEV (P2)にする。 This recombinant bacmid DNA is extracted and transfected with Sf9 insect cells to prepare recombinant baculovirus BEV and rAAV. Successful transfection of Sf9 insect cells produced by BEV, replicating a large number of proliferated BEVs and taking a step further infection causes prominent lesions (CPE) in Sf9 cells, prominent under fluorescence microscopy The expression of green fluorescent protein (GFP) (Fig. 2B) can be observed. Sf9 cell culture supernatant containing a large amount of CPE-generated BEV is collected into the BEV (P1) of the first household, and at the same time, Sf9 cells containing a large amount of rAAV are collected. Infected with BEV (P1) prepared and obtained 72 hours after infecting Sf9 cells by suspension culture with multiple cells (MOI = 3), the cell culture medium was centrifuged at 3000 rpm for 5 min, and the culture supernatant and cell precipitate were collected respectively. To do. Use the BEV (P2) of the second household as the supernatant of the cell culture.

このシステムで産生したrAAVの精製とウイルス特性の検出 Purification of rAAV produced by this system and detection of viral properties

BEVで感染してから収集したSf9細胞(約1×108cells)を10ml溶解バッファー(50mM Tris-Cl、150mM NaCl、2mM MgCl2、pH 8.0)に入れ、凍結、溶解を3回繰り返し、5000rpmで10min遠心して上澄みを収集し、上澄みに核酸酵素(Benzonase) を入れ、60min にわたって37℃のウォーターバストリートメントをしてから5000rpmで10min遠心する。イオジキサノール密度勾配遠心分離により収集した上澄みを精製する（方法についてAslanidiら、2009,Proc.Natl Acad.Sci.USA、206:5059-5064を参考にすること）。リアルタイムPCRによりrAAVの力価を測定し、力価の単位をVG/ml(VG、virus genomes)にする。実験結果によると、本実例で取得したBEVがSf9細胞に感染してから単なるSf9細胞rAAVの産出量は2.40×105VGに達することができる（図7）。 Sf9 cells (about 1 x 108 cells) collected after infection with BEV were placed in a 10 ml lysis buffer (50 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8.0), frozen and lysed three times, and at 5000 rpm for 10 min. Collect the supernatant carefully, add the nucleic acid enzyme (Benzonase) to the supernatant, perform a water bath treatment at 37 ° C for 60 minutes, and then centrifuge at 5000 rpm for 10 min. Purify the supernatant collected by iodixanol density gradient centrifugation (see Aslanidi et al., 2009, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 206: 5059-5064 for the method). The titer of rAAV is measured by real-time PCR, and the unit of titer is VG / ml (VG, virus genomes). According to the experimental results, the yield of mere Sf9 cell rAAV can reach 2.40 × 10 5 VG after the BEV obtained in this example infects Sf9 cells (Fig. 7).

精製されたrAAVの勾配希釈を行って96オリフィスプレートで培養したHEK293細胞に2日に感染してから蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観測する。実験結果によると、このシステムで調製したrAAVに高い体外感染活性がある（図2C）。 Gradient dilution of purified rAAV is performed to infect HEK293 cells cultured in 96 orifice plates for 2 days, and then the expression of green fluorescent protein (GFP) is observed under a fluorescence microscope. According to the experimental results, rAAV prepared by this system has high in vitro infectious activity (Fig. 2C).

精製されたrAAVについて透過型電子顕微鏡でウイルス顆粒の形態を観察する。完全な固体のrAAV顆粒は六角形の均一した顆粒であるが、中空核酸無し欠陥rAAV顆粒は中央がディープカラーに染色された。電子顕微鏡写真による統計結果によると、rAAV顆粒は完全率がとても高い（図2D）。 Observe the morphology of virus granules on the purified rAAV with a transmission electron microscope. Completely solid rAAV granules were hexagonal uniform granules, whereas hollow nucleic acid-free defective rAAV granules were stained deep in the center. According to the statistical results of electron micrographs, rAAV granules have a very high completeness rate (Fig. 2D).

本実施例で調製したBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Cap2-Δ(Chia-Cath)-Rep2は連続して継代してからSf9細胞に感染する。ウエスタンブロット実験によりRep及びCapタンパク質の発現を検出し、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性を試験する。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、P1〜P5世代でRep及びCapタンパク質の発現レベルが高く、P5世代からだんだんに低下し、BEVの安定性がP5世代からだんだんに顕著に低下する（図8A）。本実施例で調製したBEVはP1〜P8世代Capタンパク質での発現レベルがP1-P4で安定であり、P5世代から顕著に低下するが、Repタンパク質の発現レベルがP1〜P8世代で共に安定である（図8B）。まとめて言うと、本実施例で構築したBEVは安定性が決まった程度で向上したものである。 BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Cap2-Δ (Chia-Cath) -Rep2 prepared in this example is continuously passaged before infecting Sf9 cells. The expression of Rep and Cap proteins will be detected by Western blot experiments, and the stability of recombinant baculovirus BEV will be tested. Compared to the 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the expression levels of Rep and Cap proteins are high in the P1 to P5 generations, gradually decrease from the P5 generation, and the stability of BEV gradually decreases from the P5 generation. (Fig. 8A). The BEV prepared in this example has a stable expression level in P1 to P8 generation Cap proteins and is markedly decreased from the P5 generation, but the expression level of Rep protein is stable in both P1 to P8 generations. Yes (Fig. 8B). In summary, the BEV constructed in this example has improved to a certain degree of stability.

DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep-Δ(Chia-Cath)-CapによりrAAVを調製する。 Prepare rAAV by DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Rep-Δ (Chia-Cath) -Cap.

シャトルプラスミドpFBDがrAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOI及びAAVのRep遺伝子発現ボックスを含む場合、相応しい組換え型バクミドにAAVのCap遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを整合したことが必要である（図3A）。 When the shuttle plasmid pFBD contained the core expression components ITR-GOI of rAAV and the Rep gene expression box of AAV, the appropriate recombinant bacmid was matched with the Cap gene expression box of AAV and the expression box of other functional protein components. It is necessary (Fig. 3A).

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システム。前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、マルチクローニングサイトにITR-GOI配列及びRep遺伝子が挿入されていて、Rep遺伝子がPHプロモーターの下流にある。前記のバキュロウイルスのゲノムの組換え型バクミドは非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子が欠けているAcMNPV E2であり、遺伝子配列がGenbank accession No. KM667940.1のようなものであり、その（座の範囲105,353bp-108,025bp）内でChia及びCath遺伝子が欠如し、Chia及びCath遺伝子座にCap遺伝子発現ボックスが挿入されている。 A preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual, with the ITR-GOI sequence and Rep gene inserted at the multicloning site, with the Rep gene downstream of the PH promoter. The recombinant bacmid of the baculovirus genome is AcMNPV E2, which lacks the non-essential genes Chia and Cath genes, and has a gene sequence similar to that of Genbank accession No. KM667940.1. Within 105,353bp-108,025bp), the Chia and Cath genes are absent, and the Cap gene expression box is inserted at the Chia and Cath loci.

本実施例によるrAAVの調製システムでrAAVを調製する方法は下記のステップを含む。 The method of preparing rAAV with the rAAV preparation system according to this example includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

1.1 rAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOI及びAAVを含むRep遺伝子発現ボックスのシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)-Repを構築する。先ず、バキュロウイルス発現システムBac-to-BacのpFast.Bac.Dual (pFBD)シャトルプラスミドを利用する。本実例でタイプ2のAAVに基くRep遺伝子に対してリボソームリークスキャニング原理によりコドンの最適化を行い（Smithら、2009,Mol.Ther.17:1888-1896を参考にすること）、Rep遺伝子がPHプロモーターにコントロールされるようにし、Rep72,Rep52複製タンパク質の機能的発現に達成する。ITRの中核的な発現コンポーネント。実例でITRについてタイプ2のAAVのITR核酸配列を利用し、ITRの中核的な発現コンポーネントに緑色蛍光タンパク質(GFP)発現ボックスを採用し、CMVプロモーターによりGFPの発現をコントロールし、rAAVの活性検出に便利である。ITRの中核的な発現コンポーネントは5’末端連結核酸フラグメント及び3’末端連結核酸フラグメントによりRep遺伝子の発現ボックスまたはキャリア枠組みと連結する（相応しいRep遺伝子、ITR及びその連結フラグメントの配列については実施例1を参考にすること）。 1.1 Construct a shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) -Rep for the Rep gene expression box containing ITR-GOI and AAV, the core expression components of rAAV. First, the pFast.Bac.Dual (pFBD) shuttle plasmid of the baculovirus expression system Bac-to-Bac is used. In this example, codons were optimized for the Type 2 AAV-based Rep gene by the ribosome leak scanning principle (see Smith et al., 2009, Mol. Ther. 17: 1888-1896), and the Rep gene was found. It is controlled by the PH promoter to achieve functional expression of Rep72, Rep52 replication proteins. The core expression component of ITR. In the example, ITR uses the ITR nucleic acid sequence of type 2 AAV, adopts the green fluorescent protein (GFP) expression box as the core expression component of ITR, controls the expression of GFP by the CMV promoter, and detects the activity of rAAV. It is convenient for. The core expression component of ITR is linked to the expression box or carrier framework of the Rep gene by a 5'end-linked nucleic acid fragment and a 3'end-linked nucleic acid fragment (for sequences of suitable Rep genes, ITRs and their linking fragments, Example 1). Please refer to).

1.2相応しい欠如非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子を構築する同時に、Chia及びCath遺伝子座にAAV Cap遺伝子発現ボックスの組換え型バクミドを挿入する。 1.2 Appropriate deficiency Construct the non-essential genes Chia and Cath genes At the same time, insert the recombinant Bakumid of the AAV Cap gene expression box into the Chia and Cath loci.

野生型AcMNPVバクミドのChia及びCath遺伝子が隣り合い、本実施例でChia及びCath遺伝子が同時に欠如する好ましい案を採用する（実施例1を参考にしてChia及びCath遺伝子座が欠けている操作を行う）。本実例でタイプ2のAAVに基くCap遺伝子配列については実施例1を参考にすること。 In this example, the preferred method is adopted in which the Chia and Cath genes of the wild-type AcMNPV bacmid are adjacent to each other and the Chia and Cath genes are simultaneously absent (the operation in which the Chia and Cath loci are absent is performed with reference to Example 1). ). Refer to Example 1 for the Cap gene sequence based on Type 2 AAV in this example.

下記の方法により前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドを調製する。 Recombinant Bakumid for preparing the above rAAV is prepared by the following method.

先ず、次の通りにプラスミドpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Downを構築する。 First, the plasmid pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down is constructed as follows.

pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Downプラスミドの構築（実施例1の方法を参考にすること）。そして、Cap遺伝子をpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-DownプラスミドのSma1とNhe1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがP10プロモーターにコントロールされるようにし、最終に pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Downプラスミドを取得する。 Construction of the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid (refer to the method in Example 1). The Cap gene was then inserted between the Sma1 and Nhe1 enzyme restriction sites of the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid so that it was controlled by the P10 promoter and finally. Obtain the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down plasmid.

BsrGI及びAvrII二重酵素によりpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Downプラスミドを切断し、電気泳動でChia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down核酸フラグメントを回収する。そして、このDNAフラグメントをDH10Bac/pKD46コンピテントセルに電気転化し、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールという3種の抵抗性のあるLBプレートに塗る。電気変換を行って48時間にわたってから青斑振とう菌を選出する。ミニプレップバクミドDNAに関するPCR鑑定を行い、スクリーニングポジティブクローニング、シーケンスを測定し、検証を行う。スクリーニングによるポジティブ菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2に命名する。 The pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down plasmid was cleaved with BsrGI and AvrII dual enzymes and electrophoresed with Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath- Collect the Down nucleic acid fragment. The DNA fragment is then electroconverted into DH10Bac / pKD46 competent cells and applied to three resistant LB plates: kanamycin, tetracycline and chloramphenicol. After 48 hours of electrical conversion, blue spot-shaking bacteria are selected. Perform PCR analysis on miniprep bactide DNA, screen positive cloning, measure sequence, and verify. The positive strain by screening is named DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種治療性遺伝子フラグメントのあるrAAVの中核的な発現コンポーネントをrAAV産生に必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) Other functional proteins required for rAAV production with the core expression component of rAAV with heterologous therapeutic gene fragments by the shuttle plasmid obtained in step (1) and the recombinant bacmid containing the baculovirus genome as appropriate. Consistent with the expression box of the component, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

Bac-to-Bacシステムの操作方法によりBEVを調製し、組換え型シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)-Rep2 を相応しい組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2,Tn7に転化し、トランスポザーゼに仲介される相同組換えを行ってrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Rep2-Δ(Chia-Cath)-Cap2を取得する。 BEV was prepared by the operation method of the Bac-to-Bac system, and the recombinant shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) -Rep2 was added to Escherichia coli DH10 Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2, Tn7 containing the appropriate recombinant Bactido. Escherichia coli DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI)-Rep2-Δ (Chia-Cath)-contains recombinant Bacmid that has been converted to and subjected to transposase-mediated homologous recombination to match all of the rAAV packaging components. Get Cap2.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

この組換え型バクミドDNAを抽出してSf9昆虫細胞をトランスフェクトし、組換え型バキュロウイルスBEV及びrAAVを調製する。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞に成功してBEVが産生し、大量で増殖したBEVを複製してより一歩の感染により、Sf9細胞に顕著な病変現象（CPE）が発生し、蛍光顕微鏡で顕著な緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観察できる（図3B）。CPEが発生した大量のBEVを含むSf9細胞培養上澄みを収集し、第1世帯のBEV (P1)にし、同時に大量のrAAVを含むSf9細胞を収集する。継代でBEV（P2）を調製する方法については実施例1を参考にすること。 This recombinant bacmid DNA is extracted and transfected with Sf9 insect cells to prepare recombinant baculovirus BEV and rAAV. Successful transfection of Sf9 insect cells produced by BEV, replicating a large number of proliferated BEVs and taking a step further infection causes prominent lesions (CPE) in Sf9 cells, prominent under fluorescence microscopy Expression of green fluorescent protein (GFP) can be observed (Fig. 3B). Sf9 cell culture supernatant containing a large amount of CPE-generated BEV is collected into the BEV (P1) of the first household, and at the same time, Sf9 cells containing a large amount of rAAV are collected. Refer to Example 1 for the method of preparing BEV (P2) by subculture.

このシステムで産生したrAAVの精製とウイルス特性の検出 Purification of rAAV produced by this system and detection of viral properties

BEVが感染したSf9細胞で調製したrAAVを精製する（実施例1の方法とステップを参照すること）。実験結果によると、本実例で取得したBEVがSf9細胞に感染してから単なるSf9細胞rAAVは産出量が1.85×105VGに達することができる（図7）。 Purify rAAV prepared with BEV-infected Sf9 cells (see Methods and Steps in Example 1). According to the experimental results, the output of mere Sf9 cell rAAV can reach 1.85 × 10 5 VG after the BEV obtained in this example infects Sf9 cells (Fig. 7).

精製されたrAAVの勾配希釈を行って96オリフィスプレートで培養したHEK293細胞に2日に感染してから蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観測する。実験結果によると、このシステムで調製したrAAVに高い体外感染活性がある（図3C）。 Gradient dilution of purified rAAV is performed to infect HEK293 cells cultured in 96 orifice plates for 2 days, and then the expression of green fluorescent protein (GFP) is observed under a fluorescence microscope. According to the experimental results, rAAV prepared by this system has high in vitro infectious activity (Fig. 3C).

精製されたrAAVについて透過型電子顕微鏡でウイルス顆粒の形態を観察する。完全な固体のrAAV顆粒は六角形の均一した顆粒であるが、中空核酸無し欠陥rAAV顆粒は中央がディープカラーに染色された。電子顕微鏡写真の統計結果によると、rAAV顆粒は完全率がとても高い（図3D）。 Observe the morphology of virus granules on the purified rAAV with a transmission electron microscope. Completely solid rAAV granules were hexagonal uniform granules, whereas hollow nucleic acid-free defective rAAV granules were stained deep in the center. According to the statistical results of electron micrographs, rAAV granules have a very high completeness rate (Fig. 3D).

本実施例で調製したTn7-(ITR-GOI)-Rep2-Δ(Chia-Cath)-Cap2は連続して継代してからSf9細胞に感染する。ウエスタンブロット実験によりRep及びCapタンパク質の発現を検出し、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性を試験する。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、P1〜P5世代でRep及びCapタンパク質の発現レベルが高く、P5世代からだんだんに低下し、BEVの安定性がP5世代からだんだんに顕著に低下する（図8A）。本実施例で調製したBEVはP1〜P8世代Repタンパク質の発現レベルがP1-P4で安定であり、P5世代から顕著に低下するが、Repタンパク質の発現レベルがP1〜P8世代で顕著に低下しなかった（図8C）。まとめて言うと、本実施例で構築したBEVは安定性が決まった程度で向上したものである。 The Tn7- (ITR-GOI) -Rep2-Δ (Chia-Cath) -Cap2 prepared in this example is continuously passaged before infecting Sf9 cells. The expression of Rep and Cap proteins will be detected by Western blot experiments, and the stability of recombinant baculovirus BEV will be tested. Compared to the 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the expression levels of Rep and Cap proteins are high in the P1 to P5 generations, gradually decrease from the P5 generation, and the stability of BEV gradually decreases from the P5 generation. (Fig. 8A). In the BEV prepared in this example, the expression level of the P1 to P8 generation Rep protein is stable at P1-P4 and significantly decreases from the P5 generation, but the expression level of the Rep protein decreases significantly in the P1 to P8 generation. There was no (Fig. 8C). In summary, the BEV constructed in this example has improved to a certain degree of stability.

DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-CapによりrAAVを調製する。 Prepare rAAV by DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-Cap.

シャトルプラスミドpFBDにrAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOIしかない場合、相応しい組換え型バクミドがAAVのRep遺伝子発現ボックス、Cap遺伝子発現ボックス及び他の機能的タンパク質成分発現ボックスを整合したものである（図4A）。 If the shuttle plasmid pFBD has only rAAV's core expression component, ITR-GOI, then the appropriate recombinant bacmid is a match for the AAV's Rep gene expression box, Cap gene expression box, and other functional protein component expression boxes. (Fig. 4A).

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システム。前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、マルチクローニングサイトにITR-GOI配列が挿入されていて、前記のバキュロウイルスのゲノムの組換え型バクミドは非必須遺伝子Cath遺伝子及びChia遺伝子が欠けているAcMNPV E2,遺伝子配列がGenbank accession No. KM667940.1のようなものであり、その（座の範囲105,353bp-108,025bp）内にChia及びCath遺伝子が欠如し、Cap遺伝子及びRep遺伝子発現ボックスがChia及びCath遺伝子座に挿入されている。 A preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual, the ITR-GOI sequence is inserted at the multicloning site, and the recombinant bacmid of the baculovirus genome is the non-essential genes Cath gene and Chia. Gene missing AcMNPV E2, the gene sequence is similar to Genbank accession No. KM667940.1, within which the Chia and Cath genes are missing, the Cap gene and Rep A gene expression box has been inserted at the Chia and Cath loci.

本実施例によるrAAVの調製システムによりrAAVを調製する方法は下記のステップを含む。 The method of preparing rAAV by the rAAV preparation system according to this example includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

1.1 rAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOIを含むシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を構築する。先ず、バキュロウイルス発現システムのBac-to-BacのpFast.Bac.Dual (pFBD)シャトルキャリアを利用する。実例でITRについてタイプ2のAAVのITR核酸配列を利用し、ITRの中核的な発現コンポーネントについて緑色蛍光タンパク質(GFP)発現ボックスを採用し、CMVプロモーターによりGFPの発現をコントロールし、rAAVの活性検出に便利である。ITRの中核的な発現コンポーネントは5’末端連結核酸フラグメント及び3’末端連結核酸フラグメントによりキャリア枠組み連結と連結する（相応しいITR及びその連結フラグメントの配列については実施例1を参考にすること）。 1.1 Construct a shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) containing the core expression component ITR-GOI of rAAV. First, the Bac-to-Bac pFast.Bac.Dual (pFBD) shuttle carrier of the baculovirus expression system is used. In the example, ITR uses the ITR nucleic acid sequence of type 2 AAV, adopts the green fluorescent protein (GFP) expression box for the core expression component of ITR, controls the expression of GFP by the CMV promoter, and detects the activity of rAAV. It is convenient for. The core expression component of the ITR is linked to the carrier framework linkage by a 5'-terminally linked nucleic acid fragment and a 3'-terminally linked nucleic acid fragment (see Example 1 for the appropriate ITR and sequence of the linked fragment).

1.2 相応しい欠如非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子を構築する同時に、Chia及びCath遺伝子座にAAV Rep遺伝子発現ボックス及びCap遺伝子発現ボックスの組換え型バクミドを挿入する。 1.2 Appropriate deficiency Construct the non-essential genes Chia and Cath genes At the same time, insert recombinant bacmids of the AAV Rep gene expression box and Cap gene expression box at the Chia and Cath loci.

野生型AcMNPVバクミドのChia及びCath遺伝子が隣り合い、本実施例でChia及びCath遺伝子が同時に欠如する好ましい案を採用する（実施例1を参考にしてChia及びCath遺伝子座が欠けている操作を行う）。本実例でタイプ2のAAVに基くRep遺伝子とタイプ2のAAVに基くCap遺伝子配列は実施例1を参考にする。 In this example, the preferred method is adopted in which the Chia and Cath genes of the wild-type AcMNPV bacmid are adjacent to each other and the Chia and Cath genes are simultaneously absent (the operation in which the Chia and Cath loci are absent is performed with reference to Example 1). ). In this example, the Rep gene based on type 2 AAV and the Cap gene sequence based on type 2 AAV are referred to Example 1.

下記の方法により前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドを調製する。 Recombinant Bakumid for preparing the above rAAV is prepared by the following method.

先ず、次の通りにプラスミドpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Downを構築する。 First, the plasmid pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down is constructed as follows.

pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Downプラスミドを構築する（実施例1の方法を参考にすること）。そして、Rep遺伝子をpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-DownプラスミドのBamH1とXba1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがPHプロモーターにコントロールされるようにし、Cap遺伝子をpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-DownプラスミドのSma1とNhe1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがP10プロモーターにコントロールされるようにし、最終にpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Downプラスミドを取得する。 Construct the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid (see the method in Example 1). Then, the Rep gene was inserted between the BamH1 and Xba1 enzyme restriction sites of the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid so that it was controlled by the PH promoter, and the Cap gene was inserted. Was inserted between the Sma1 and Nhe1 enzyme restriction sites of the pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cath-Down plasmid so that it was controlled by the P10 promoter and finally pFBD-Chia- Obtain the up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Down plasmid.

BsrGI及びAvrII二重酵素によりpFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Downプラスミドを切断し、電気泳動でChia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Cath-Down核酸フラグメントを回収する。そして、このDNAフラグメントをDH10Bac/pKD46コンピテントセルに電気転化し、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールという3種の抵抗性のあるLBプレートに塗る。電気変換を行って48時間にわたってから青斑振とう菌を選出する。ミニプレップバクミドDNAに関するPCR鑑定を行い、スクリーニングポジティブクローニング、シーケンスを測定し、検証を行う。スクリーニングによるポジティブ菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)- Rep2-Cap2に命名する。 The pFBD-Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Cap2-Cath-Down plasmid was cleaved with BsrGI and AvrII dual enzymes and electrophoresed with Chia-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2- Recover the Cath-Down nucleic acid fragment. The DNA fragment is then electroconverted into DH10Bac / pKD46 competent cells and applied to three resistant LB plates: kanamycin, tetracycline and chloramphenicol. After 48 hours of electrical conversion, blue spot-shaking bacteria are selected. Perform PCR analysis on miniprep bactide DNA, screen positive cloning, measure sequence, and verify. The positive strain by screening is named DH10 Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-Cap2.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種治療性遺伝子フラグメントのあるrAAVの中核的な発現コンポーネントを他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合し、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) A functional protein required for the production of other rAAVs, which is a core expression component of rAAV with a heterologous therapeutic gene fragment by the shuttle plasmid obtained in step (1) and a recombinant bacmid containing the genome of baculovirus. Consistent with the expression box of the component, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

Bac-to-Bacシステムの操作方法によりBEVを調製し、組換え型シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を相応しい組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2に転化し、Tn7トランスポザーゼに仲介される相同組換えを行ってrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2を取得する。 BEV was prepared by the operation method of the Bac-to-Bac system, and the recombinant shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) was converted to Escherichia coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-Cap2 containing a suitable recombinant Bactido. Escherichia coli DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep2-Cap2 containing recombinant Bacmid, which was homologously recombined by Tn7 transposase and matched all of the rAAV packaging components. To get.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

この組換え型バクミドDNAを抽出してSf9昆虫細胞をトランスフェクトし、組換え型バキュロウイルスBEV及びrAAVを調製する。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞に成功してBEVが産生し、大量で増殖したBEVを複製してより一歩の感染により、Sf9細胞に顕著な病変現象（CPE）が発生し、蛍光顕微鏡で顕著な緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観察できる（図4B）。CPEが発生した大量のBEVを含むSf9細胞培養上澄みを収集し、第1世帯のBEV (P1)にし、同時に大量のrAAVを含むSf9細胞を収集する。継代でBEV（P2）を調製する方法については実施例1を参考にすること。 This recombinant bacmid DNA is extracted and transfected with Sf9 insect cells to prepare recombinant baculovirus BEV and rAAV. Successful transfection of Sf9 insect cells produced by BEV, replicating a large number of proliferated BEVs and taking a step further infection causes prominent lesions (CPE) in Sf9 cells, prominent under fluorescence microscopy Expression of green fluorescent protein (GFP) can be observed (Fig. 4B). Sf9 cell culture supernatant containing a large amount of CPE-generated BEV is collected into the BEV (P1) of the first household, and at the same time, Sf9 cells containing a large amount of rAAV are collected. Refer to Example 1 for the method of preparing BEV (P2) by subculture.

このシステムで産生したrAAVの精製とウイルス特性の検出 Purification of rAAV produced by this system and detection of viral properties

BEVが感染したSf9細胞で調製したrAAVを精製する（実施例1の方法とステップを参照すること）。実験結果によると、本実例で取得したBEVがSf9細胞に感染してから単なるSf9細胞rAAVは産出量が3.60×105VGに達することができる（図7）。 Purify rAAV prepared with BEV-infected Sf9 cells (see Methods and Steps in Example 1). According to the experimental results, the output of mere Sf9 cell rAAV can reach 3.60 × 10 5 VG after the BEV obtained in this example infects Sf9 cells (Fig. 7).

精製されたrAAVの勾配希釈を行って96オリフィスプレートで培養したHEK293細胞に2日に感染してから蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観測する。実験結果によると、このシステムで調製したrAAVに高い体外感染活性がある（図4C）。 Gradient dilution of purified rAAV is performed to infect HEK293 cells cultured in 96 orifice plates for 2 days, and then the expression of green fluorescent protein (GFP) is observed under a fluorescence microscope. According to the experimental results, rAAV prepared by this system has high in vitro infectious activity (Fig. 4C).

精製されたrAAVについて透過型電子顕微鏡でウイルス顆粒の形態を観察する。完全な固体のrAAV顆粒は六角形の均一した顆粒であるが、中空核酸無し欠陥rAAV顆粒は中央がディープカラーに染色された。電子顕微鏡写真による統計結果によると、rAAV顆粒は完全率がとても高い（図4D）。 Observe the morphology of virus granules on the purified rAAV with a transmission electron microscope. Completely solid rAAV granules were hexagonal uniform granules, whereas hollow nucleic acid-free defective rAAV granules were stained deep in the center. According to the statistical results of electron micrographs, rAAV granules have a very high completeness rate (Fig. 4D).

本実施例で調製したBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-Cap2は連続して継代してからSf9細胞に感染する。ウエスタンブロット実験によりRep及びCapタンパク質の発現を検出し、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性を試験する。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、P1〜P5世代でRep及びCapタンパク質の発現レベルが高く、P5世代からだんだんに低下し、BEVの安定性がP5世代からだんだんに顕著に低下する（図8A）。本実施例で調製したBEVはP1〜P8世代Rep及びCapタンパク質での発現レベルが共に安定である（図8D）。まとめて言うと、本実施例で構築したBEVは安定性がとても大きな程度で向上したものである。 BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep2-Cap2 prepared in this example is continuously passaged before infecting Sf9 cells. The expression of Rep and Cap proteins will be detected by Western blot experiments, and the stability of recombinant baculovirus BEV will be tested. Compared to the 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the expression levels of Rep and Cap proteins are high in the P1 to P5 generations, gradually decrease from the P5 generation, and the stability of BEV gradually decreases from the P5 generation. (Fig. 8A). The BEVs prepared in this example have stable expression levels in both P1-P8 generation Rep and Cap proteins (Fig. 8D). In summary, the BEV constructed in this example has improved stability to a very large extent.

DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep-ΔAc124-CapによりrAAVを調製する。 Prepare rAAV with DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep-ΔAc124-Cap.

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システム。前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、マルチクローニングサイトにITR-GOI配列が挿入されていて、前記のバキュロウイルスのゲノムの組換え型バクミドは非必須遺伝子遺伝子Chia、Cath及びAc124遺伝子が欠けているAcMNPV E2,遺伝子配列がGenbank accession No. KM667940.1のようなものであり、その（座の範囲105,353bp-108,025bp）にChia及びCath遺伝子、その（座の範囲103,864bp-104,607bp)にAc124遺伝子が欠如し、Chia及びCath遺伝子座にRep遺伝子発現ボックスが挿入されていて、Ac124ゲノムにCap遺伝子発現ボックスが挿入されている（図5A）。 A preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual, the ITR-GOI sequence is inserted at the multicloning site, and the recombinant bacmid of the baculovirus genome is a non-essential gene gene Chia, Cath. And AcMNPV E2 lacking the Ac124 gene, the gene sequence is similar to Genbank accession No. KM667940.1, with the Chia and Cath genes in its (locus range 105,353bp-108,025bp) and its (locus range 103,864). The Ac124 gene is absent in bp-104,607bp), the Rep gene expression box is inserted at the Chia and Cath loci, and the Cap gene expression box is inserted in the Ac124 genome (Fig. 5A).

本実施例で実施例1の組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2菌株に基いて他の非必須遺伝子座によりCap遺伝子発現ボックスを挿入する。本実施例で非必須遺伝子Ac-124が好ましい（Liang ら、2015、Arch Virol、160(1):275-84を参考にすること）。 In this example, a Cap gene expression box is inserted at another non-essential locus based on the Escherichia coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2 strain containing the recombinant Bakumid of Example 1. The non-essential gene Ac-124 is preferred in this example (see Liang et al., 2015, Arch Virol, 160 (1): 275-84).

本実施例によるrAAVの調製システムによりrAAVを調製する方法は下記のステップを含む。 The method of preparing rAAV by the rAAV preparation system according to this example includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

1.1 rAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOIを含むシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を構築する（実施例3の案を参考にすること）。 1.1 Construct a shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) containing the core expression component ITR-GOI of rAAV (see the proposal in Example 3).

1.2 相応しい欠如非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子を構築する同時に、Chia及びCath遺伝子座にAAV Rep遺伝子発現ボックス及び欠如非必須遺伝子Ac-124遺伝子、Ac-124遺伝子座にAAV Cap遺伝子発現ボックスの組換え型バクミドを挿入する。 1.2 Reform the AAV Rep gene expression box and the missing non-essential gene Ac-124 gene at the Chia and Cath loci and the AAV Cap gene expression box at the Ac-124 locus at the same time to construct the appropriate missing non-essential genes Chia and Cath genes. Insert the mold Bakumid.

非必須遺伝子Ac-124遺伝子座から新たにRed組換えを行うように、実施例1の大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2の組換え型バクミドゲノムのクロラムフェニコール（Chloromycetin、Chlo）抵抗性遺伝子を除去しなければいけない。pCP20プラスミドは温度敏感誘導発現FLP組換え型酵素のプラスミドである（Doubletら、2008,J Microbiol Methods.、75(2): 359-61を参考にすること）。先ず、pCP20プラスミドをDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep菌に転化し、カナマイシン、テトラサイクリン及びアンピシリン耐性LBプレートを塗り、30℃で48時間培養してからコロニーを選出してFLPプライマーに関するPCRにより鑑定及びスクリーニングを行い、ポジティブ菌をスクリーニングする。そして、転化されたpCP20プラスミドのDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2菌をカナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン耐性の液体LB培養基で42℃で8時間培養してFLP組換え型酵素遺伝子発現を誘導し、FrtコンポーネントのChlo遺伝子を切断して除去する。クロラムフェニコール耐性がなくなった菌を選出してPCR鑑定を行う。この菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChloに命名する。 Chloramphenicol (Chloromycetin, Chlo) of the recombinant Bakumid genome of Escherichia coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2 of Example 1 so as to newly perform Red recombination from the non-essential gene Ac-124 locus. The resistance gene must be removed. The pCP20 plasmid is a plasmid of temperature-sensitive induced expression FLP recombinant enzyme (see Doublet et al., 2008, J Microbiol Methods., 75 (2): 359-61). First, the pCP20 plasmid was converted to DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep bacteria, coated with kanamycin, tetracycline and ampicillin-resistant LB plates, cultured at 30 ° C for 48 hours, and then colonies were selected by PCR for FLP primers. Perform assessment and screening to screen for positive bacteria. Then, the converted pCP20 plasmid DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2 bacterium was cultured in a liquid LB culture medium resistant to kanamycin, tetracycline, and ampicillin at 42 ° C. for 8 hours to induce FLP recombinant enzyme gene expression. The Chlo gene of the Frt component is cleaved and removed. Bacteria that are no longer resistant to chloramphenicol are selected and subjected to PCR. This strain is named DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-ΔChlo.

組換え型クローニング操作を便利にするために、Red組換え型技術、pKD46プラスミドが添加されたDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChlo菌株及び相同アーム遺伝子組換えによりバクミドゲノムを改造する（原理及び方法については実施例1を参考にすること）。 To facilitate recombinant cloning procedures, the Bakumid genome is remodeled by Red recombinant technology, DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-ΔChlo strains supplemented with the pKD46 plasmid, and homologous arm gene recombination ( Refer to Example 1 for the principle and method).

pFBDプラスミドのBsrGI酵素制限サイトに上流相同アームAc124-up及びクロラムフェニコール抵抗性遺伝子フラグメントP1-FRT-Chlo-P2,pFBDプラスミドのAvrII酵素制限サイトに下流相同アームAc124-Downを導入し、pFBDプラスミドのPHプロモーター及び/またはP10プロモーター下流にRep遺伝子及び/またはCap遺伝子を挿入してRep遺伝子及び/またはCap遺伝子の発現ボックスを構成する。本実例でタイプ2のAAVに基くCap遺伝子配列については実施例1を参考にすること。 The upstream homologous arm Ac124-up and the chloramphenicol resistance gene fragment P1-FRT-Chlo-P2 at the BsrGI enzyme restriction site of the pFBD plasmid, and the downstream homologous arm Ac124-Down were introduced at the AvrII enzyme restriction site of the pFBD plasmid. The Rep gene and / or Cap gene is inserted downstream of the PH promoter and / or P10 promoter of the plasmid to form an expression box for the Rep gene and / or Cap gene. Refer to Example 1 for the Cap gene sequence based on Type 2 AAV in this example.

下記の方法により前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドを調製する。 Recombinant Bakumid for preparing the above rAAV is prepared by the following method.

先ず、次の通りにプラスミドpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124 -Downを構築する。 First, the plasmid pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124 -Down is constructed as follows.

先ず、野生型AcMNPVバクミドDNAをテンプレートにし、プライマーAc124-up-F（配列番号5）及びAc124-up-R（配列番号6）により上流相同アームAc124-upフラグメント、プライマーAc124-down-F（配列番号7）及びAc124-down-R（配列番号8）により下流相同アームAc124-Downフラグメントを拡張する。 First, using wild-type AcMNPV bacmid DNA as a template, the upstream homologous arm Ac124-up fragment and primer Ac124-down-F (sequence number 6) were used with primers Ac124-up-F (SEQ ID NO: 5) and Ac124-up-R (SEQ ID NO: 6). The downstream homology arm Ac124-Down fragment is extended by No. 7) and Ac124-down-R (SEQ ID NO: 8).

相同組換えにより上流相同アームAc124-upフラグメント及びクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むDNAフラグメント P1-FRT-Chlo-P2をpsimple-Tプラスミドにクローニングしてpsimple-T- Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2プラスミドを構築する。 By homologous recombination, the upstream homologous arm Ac124-up fragment and the DNA fragment P1-FRT-Chlo-P2 containing the chloramphenicol resistance gene were cloned into the psimple-T plasmid and psimple-T- Ac124-up-P1-FRT. -Construct the Chlo-P2 plasmid.

次に、相同組換えにより下流相同アームAc124-DownフラグメントをpFBDプラスミドのAvrII酵素制限サイトに挿入してpFBD-Ac124-Downプラスミドを構築してから相同組換えによりフラグメントAc124-up-P1-FRT-Chlo-P2をpFBD-Ac124-DownプラスミドのBsrGI酵素制限サイトに挿入してpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Downプラスミドを構築する。 Next, the downstream homologous arm Ac124-Down fragment was inserted into the AvrII enzyme restriction site of the pFBD plasmid by homologous recombination to construct the pFBD-Ac124-Down plasmid, and then the fragment Ac124-up-P1-FRT- by homologous recombination. Chlo-P2 is inserted into the BsrGI enzyme restriction site of the pFBD-Ac124-Down plasmid to construct the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down plasmid.

次に、Cap遺伝子をpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-DownプラスミドのSma1とNhe1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがP10プロモーターにコントロールされるようにし、最終にpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2- Cap2-Ac124-Downプラスミドを取得する。 The Cap gene was then inserted between the Sma1 and Nhe1 enzyme restriction sites of the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down plasmid so that it was controlled by the P10 promoter and finally. Obtain the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2- Cap2-Ac124-Down plasmid.

BsrGI及びAvrII二重酵素によりpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Downプラスミドを切断し、電気泳動でAc124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down核酸フラグメントを回収する。次に、このDNAフラグメントを電気転化DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔChlo/ pKD46コンピテントセル、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールという3種の抵抗性のあるLBプレートに塗る。 The pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124-Down plasmid was cleaved with BsrGI and AvrII dual enzymes and electrophoresed to Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Cap2-Ac124- Collect the Down nucleic acid fragment. This DNA fragment is then applied to three resistant LB plates: electroconversion DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-ΔChlo / pKD46 competent cells, kanamycin, tetracycline and chloramphenicol.

電気変換を行って48時間にわたってから青斑振とう菌を選出する。ミニプレップバクミドDNAに関するPCR鑑定を行い、スクリーニングポジティブクローニング、シーケンスを測定し、検証を行う。スクリーニングによるポジティブ菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2に命名する。 After 48 hours of electrical conversion, blue spot-shaking bacteria are selected. Perform PCR analysis on miniprep bactide DNA, screen positive cloning, measure sequence, and verify. The positive strain by screening is named DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Rep2-ΔAc124-Cap2.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種治療性遺伝子フラグメントのあるrAAVの中核的な発現コンポーネントを他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合し、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) A functional protein required for the production of other rAAVs, which is a core expression component of rAAV with a heterologous therapeutic gene fragment by the shuttle plasmid obtained in step (1) and a recombinant bacmid containing the genome of baculovirus. Consistent with the expression box of the component, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

Bac-to-Bacシステムの操作方法によりBEVを調製し、実施例4で構築した組換え型シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を相応しい組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2に転化し、Tn7トランスポザーゼに仲介される相同組換えを行ってrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2を取得する。 Escherichia coli DH10 Bac-Δ (Chia-Cath) containing recombinant Bactide suitable for the recombinant shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) constructed in Example 4 after preparing BEV by the operation method of the Bac-to-Bac system. -Rep2-ΔAc124-Cap2 E. coli DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (converted to Tn7 transposase-mediated homologous recombination to match all rAAV packaging components. Chia-Cath)-Obtain Rep2-ΔAc124-Cap2.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

この組換え型バクミドDNAを抽出してSf9昆虫細胞をトランスフェクトし、組換え型バキュロウイルスBEV及びrAAVを調製する。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞に成功してBEVが産生し、大量で増殖したBEVを複製してより一歩の感染により、Sf9細胞に顕著な病変現象（CPE）が発生し、蛍光顕微鏡で顕著な緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観察できる（図5B）。CPEが発生した大量のBEVを含むSf9細胞培養上澄みを収集し、第1世帯のBEV (P1)にし、同時に大量のrAAVを含むSf9細胞を収集する。継代でBEV（P2）を調製する方法については実施例1を参考にすること。 This recombinant bacmid DNA is extracted and transfected with Sf9 insect cells to prepare recombinant baculovirus BEV and rAAV. Successful transfection of Sf9 insect cells produced by BEV, replicating a large number of proliferated BEVs and taking a step further infection causes prominent lesions (CPE) in Sf9 cells, prominent under fluorescence microscopy Expression of green fluorescent protein (GFP) can be observed (Fig. 5B). Sf9 cell culture supernatant containing a large amount of CPE-generated BEV is collected into the BEV (P1) of the first household, and at the same time, Sf9 cells containing a large amount of rAAV are collected. Refer to Example 1 for the method of preparing BEV (P2) by subculture.

このシステムで産生したrAAVの精製とウイルス特性の検出 Purification of rAAV produced by this system and detection of viral properties

BEVが感染したSf9細胞で調製したrAAVを精製する（実施例1の方法とステップを参照すること）。実験結果によると、本実例で取得したBEVがSf9細胞に感染してから単なるSf9細胞rAAVは産出量が2.27×105VGに達することができる（図7）。 Purify rAAV prepared with BEV-infected Sf9 cells (see Methods and Steps in Example 1). According to the experimental results, the output of mere Sf9 cell rAAV can reach 2.27 × 10 5 VG after the BEV obtained in this example infects Sf9 cells (Fig. 7).

精製されたrAAVの勾配希釈を行って96オリフィスプレートで培養したHEK293細胞に2日に感染してから蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観測する。 Gradient dilution of purified rAAV is performed to infect HEK293 cells cultured in 96 orifice plates for 2 days, and then the expression of green fluorescent protein (GFP) is observed under a fluorescence microscope.

実験結果によると、このシステムで調製したrAAVに高い体外感染活性がある（図5C）。 According to the experimental results, rAAV prepared by this system has high in vitro infectious activity (Fig. 5C).

精製されたrAAVについて透過型電子顕微鏡でウイルス顆粒の形態を観察する。完全な固体のrAAV顆粒は六角形の均一した顆粒であるが、中空核酸無し欠陥rAAV顆粒は中央がディープカラーに染色された。電子顕微鏡写真による統計結果によると、rAAV顆粒は完全率がとても高い（図5D）。 Observe the morphology of virus granules on the purified rAAV with a transmission electron microscope. Completely solid rAAV granules were hexagonal uniform granules, whereas hollow nucleic acid-free defective rAAV granules were stained deep in the center. According to the statistical results of electron micrographs, rAAV granules have a very high completeness rate (Fig. 5D).

本実施例で調製したBEVは連続して継代してから本実施例で調製したBEV-Tn7-(ITR-GOI)- Δ(Chia-Cath)-Rep2-ΔAc124-Cap2に感染し、連続して継代してからSf9細胞に感染する。ウエスタンブロット実験によりRep及びCapタンパク質の発現を検出し、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性を試験する。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、P1〜P5世代でRep及びCapタンパク質の発現レベルが高く、P5世代からだんだんに低下し、BEVの安定性がP5世代からだんだんに顕著に低下する（図8A）。本実施例で調製したBEVはP1〜P8世代Rep及びCapタンパク質での発現レベルが共に安定である（図8E）。まとめて言うと、本実施例で構築したBEVは安定性がとても大きな程度で向上したものである。 The BEVs prepared in this example were continuously subcultured and then infected with BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Rep2-ΔAc124-Cap2 prepared in this example. After passage, it infects Sf9 cells. The expression of Rep and Cap proteins will be detected by Western blot experiments, and the stability of recombinant baculovirus BEV will be tested. Compared to the 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the expression levels of Rep and Cap proteins are high in the P1 to P5 generations, gradually decrease from the P5 generation, and the stability of BEV gradually decreases from the P5 generation. (Fig. 8A). The BEV prepared in this example has stable expression levels in both P1 to P8 generation Rep and Cap proteins (Fig. 8E). In summary, the BEV constructed in this example has improved stability to a very large extent.

DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap-ΔAc124-RepによりrAAVを調製する。 Prepare rAAV by DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Cap-ΔAc124-Rep.

シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むrAAVの調製システム。前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、マルチクローニングサイトにITR-GOI配列が挿入されていて、前記のバキュロウイルスのゲノムの組換え型バクミドは非必須遺伝子遺伝子Chia、Cath及びAc124遺伝子が欠けているAcMNPV E2,遺伝子配列がGenbank accession No. KM667940.1のようなものであり、その（座の範囲105,353bp-108,025bp）にChia及びCath遺伝子、その（座の範囲103,864bp-104,607bp)にAc124遺伝子が欠如し、Chia及びCath遺伝子座にCap遺伝子発現ボックスが挿入されていて、Ac124ゲノムにRep遺伝子発現ボックスが挿入されている（図6A）。 A preparation system for rAAV containing a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome. The shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual, the ITR-GOI sequence is inserted at the multicloning site, and the recombinant bacmid of the baculovirus genome is a non-essential gene gene Chia, Cath. And AcMNPV E2 lacking the Ac124 gene, the gene sequence is similar to Genbank accession No. KM667940.1, with the Chia and Cath genes in its (locus range 105,353bp-108,025bp) and its (locus range 103,864). The Ac124 gene is absent in bp-104,607bp), the Cap gene expression box is inserted at the Chia and Cath loci, and the Rep gene expression box is inserted in the Ac124 genome (Fig. 6A).

本実施例で実施例2の組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2菌株に基いて、他の非必須遺伝子座によりRep遺伝子発現ボックスを挿入する。本実施例で非必須遺伝子Ac-124が好ましい（Liangら、2015、Arch Virol、160(1):275-84を参考にすること）。 In this example, a Rep gene expression box is inserted at another non-essential locus based on the Escherichia coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2 strain containing the recombinant Bakumid of Example 2. The non-essential gene Ac-124 is preferred in this example (see Liang et al., 2015, Arch Virol, 160 (1): 275-84).

本実施例によるrAAVの調製システムによりrAAVを調製する方法は下記のステップを含む。 The method of preparing rAAV by the rAAV preparation system according to this example includes the following steps.

（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。 (1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.

1.1 rAAVの中核的な発現コンポーネントITR-GOIを含むシャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を構築する （実施例3の案を参考にすること）。 1.1 Construct a shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) containing the core expression component ITR-GOI of rAAV (refer to the draft of Example 3).

1.2 相応しい欠如非必須遺伝子Chia及びCath遺伝子を構築する同時に、Chia及びCath遺伝子座にAAV Cap遺伝子発現ボックス及び欠如非必須遺伝子Ac-124遺伝子を挿入する同時に、Ac-124遺伝子座にAAV Rep遺伝子発現ボックスの組換え型バクミドを挿入する。 1.2 Construct the appropriate missing non-essential genes Chia and Cath genes At the same time, insert the AAV Cap gene expression box and the missing non-essential gene Ac-124 gene at the Chia and Cath loci, and at the same time, express the AAV Rep gene at the Ac-124 locus. Insert the recombinant Bakumid in the box.

非必須遺伝子Ac-124 遺伝子座から新たにRed組換えを行うように、実施例2の大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2ノ組換え型バクミドゲノムのクロラムフェニコール（Chloromycetin、Chlo）抵抗性遺伝子を除去しなければいけない。菌株DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChloの構築については実施例4の方法を参考にすること。 Chloramphenicol (Chloromycetin, Chlo) of the Escherichia coli DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2-norecombinant Bakumid genome of Example 2 so as to newly perform Red recombination from the non-essential gene Ac-124 locus. The resistance gene must be removed. For the construction of the strain DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2-ΔChlo, refer to the method of Example 4.

組換え型クローニング操作を便利にするために、Red組換え型技術、pKD46プラスミドが添加されたDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChlo菌株及び相同アーム遺伝子組換えによりバクミドゲノムを改造する（原理及び方法については実施例1を参考にすること）。 To facilitate recombinant cloning operations, the Bakumid genome is remodeled by Red recombinant technology, DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2-ΔChlo strain supplemented with pKD46 plasmid, and homologous arm gene recombination ( Refer to Example 1 for the principle and method).

フェニコール抵抗性遺伝子フラグメント（P1-FRT-Chlo-P2）、pFBDプラスミドのAvrII酵素制限サイトに下流相同アーム（Ac124-Down）を導入する。pFBDプラスミドのPHプロモーター及び/またはP10プロモーター下流にRep遺伝子及び/またはCap遺伝子を挿入してRep遺伝子及び/またはCap遺伝子の発現ボックスを構成する。本実例でタイプ2のAAVに基くRep遺伝子配列は実施例1を参考にすること。 A downstream homologous arm (Ac124-Down) is introduced into the AvrII enzyme restriction site of the phenicol resistance gene fragment (P1-FRT-Chlo-P2), pFBD plasmid. The Rep gene and / or Cap gene is inserted downstream of the PH promoter and / or P10 promoter of the pFBD plasmid to form an expression box for the Rep gene and / or Cap gene. Refer to Example 1 for the Rep gene sequence based on Type 2 AAV in this example.

下記の方法により前記のrAAVを調製するための組換え型バクミドを調製する。 Recombinant Bakumid for preparing the above rAAV is prepared by the following method.

先ず、次の通りにプラスミドpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Downを構築する。 First, the plasmid pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down is constructed as follows.

pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Downプラスミドを構築する（実施例4の方法を参考にすること）。次に、Rep遺伝子をpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124- DownプラスミドのBamH1とXba1酵素制限サイトとの間に挿入し、それがPHプロモーターにコントロールされるようにし、最終にpFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Downプラスミドを取得する。 Construct the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down plasmid (see the method in Example 4). The Rep gene was then inserted between the BamH1 and Xba1 enzyme restriction sites of the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Ac124-Down plasmid so that it was controlled by the PH promoter and finally Obtain the pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down plasmid.

BsrGI及びAvrII二重酵素により電気泳動でAc124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down核酸フラグメントを回収する。 Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down nucleic acid fragments are recovered by electrophoresis using BsrGI and AvrII dual enzymes.

pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Downプラスミドを切断する。次に、このDNAフラグメントをDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔChlo/pKD46コンピテントセルを電気転化し、カナマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールという3種の抵抗性のあるLBプレートに塗る。電気変換を行って48時間にわたってから青斑振とう菌を選出する。ミニプレップバクミドDNAに関するPCR鑑定を行い、スクリーニングポジティブクローニング、シーケンスを測定し、検証を行う。スクリーニングによるポジティブ菌株をDH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2に命名する。 The pFBD-Ac124-up-P1-FRT-Chlo-P2-Rep2-Ac124-Down plasmid is cleaved. This DNA fragment is then electroconversion of DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2-ΔChlo / pKD46 competent cells and applied to three resistant LB plates: kanamycin, tetracycline and chloramphenicol. After 48 hours of electrical conversion, blue spot-shaking bacteria are selected. Perform PCR analysis on miniprep bactide DNA, screen positive cloning, measure sequence, and verify. The positive strain by screening is named DH10Bac-Δ (Chia-Cath) -Cap2-ΔAc124-Rep2.

（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種治療性遺伝子フラグメントのあるrAAVの中核的な発現コンポーネントを他のrAAV産生に必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合し、前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。 (2) A functional protein required for the production of other rAAVs, which is a core expression component of rAAV with a heterologous therapeutic gene fragment by the shuttle plasmid obtained in step (1) and a recombinant bacmid containing the genome of baculovirus. Consistent with the expression box of the component, a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV is obtained.

Bac-to-Bacシステムの操作方法によりBEVを調製し、実施例5で構築した組換え型シャトルプラスミドpFBD-(ITR-GOI)を相応しい組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2に転化し、Tn7トランスポザーゼに仲介される相同組換えを行ってrAAVパッケージングコンポーネントのすべてを整合した組換え型バクミドを含む大腸菌DH10Bac-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath)-Cap2-ΔAc124-Rep2を取得する。 Escherichia coli DH10 Bac-Δ (Chia-Cath) containing recombinant Bactide suitable for the recombinant shuttle plasmid pFBD- (ITR-GOI) constructed in Example 5 after preparing BEV by the operation method of the Bac-to-Bac system. E. coli DH10Bac-Tn7- (ITR-GOI)-Δ (contains recombinant Bactide) converted to Cap2-ΔAc124-Rep2 and homologous recombination mediated by Tn7 transposase to match all rAAV packaging components Chia-Cath)-Acquire Cap2-ΔAc124-Rep2.

（3）ステップ（2）で取得した前記のrAAVが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 (3) The recombinant bacmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by rAAV obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured.

この組換え型バクミドDNAを抽出してSf9昆虫細胞をトランスフェクトし、組換え型バキュロウイルスBEV及びrAAVを調製する。トランスフェクトされたSf9昆虫細胞に成功してBEVが産生し、大量で増殖したBEVを複製してより一歩の感染により、Sf9細胞に顕著な病変現象（CPE）が発生し、蛍光顕微鏡で顕著な緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観察できる（図6B）。CPEが発生した大量のBEVを含むSf9細胞培養上澄みを収集し、第1世帯のBEV (P1)にし、同時に大量のrAAVを含むSf9細胞を収集する。継代でBEV（P2）を調製する方法については実施例1を参考にすること。 This recombinant bacmid DNA is extracted and transfected with Sf9 insect cells to prepare recombinant baculovirus BEV and rAAV. Successful transfection of Sf9 insect cells produced by BEV, replicating a large number of proliferated BEVs and taking a step further infection causes prominent lesions (CPE) in Sf9 cells, prominent under fluorescence microscopy Expression of green fluorescent protein (GFP) can be observed (Fig. 6B). Sf9 cell culture supernatant containing a large amount of CPE-generated BEV is collected into the BEV (P1) of the first household, and at the same time, Sf9 cells containing a large amount of rAAV are collected. Refer to Example 1 for the method of preparing BEV (P2) by subculture.

このシステムで産生したrAAVの精製とウイルス特性の検出 Purification of rAAV produced by this system and detection of viral properties

BEVが感染したSf9細胞で調製したrAAVを精製する（実施例1の方法とステップを参照すること）。実験結果によると、本実例で取得したBEVがSf9細胞に感染してから単なるSf9細胞rAAVは産出量が2.80×105VGに達することができる（図7）。 Purify rAAV prepared with BEV-infected Sf9 cells (see Methods and Steps in Example 1). According to the experimental results, the output of mere Sf9 cell rAAV can reach 2.80 × 10 5 VG after the BEV obtained in this example infects Sf9 cells (Fig. 7).

精製されたrAAVの勾配希釈を行って96オリフィスプレートで培養したHEK293細胞に2日に感染してから蛍光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を観測する。実験結果によると、このシステムで調製したrAAVに高い体外感染活性がある（図6C）。 Gradient dilution of purified rAAV is performed to infect HEK293 cells cultured in 96 orifice plates for 2 days, and then the expression of green fluorescent protein (GFP) is observed under a fluorescence microscope. According to the experimental results, rAAV prepared by this system has high in vitro infectious activity (Fig. 6C).

精製されたrAAVについて透過型電子顕微鏡でウイルス顆粒の形態を観察する。完全な固体のrAAV顆粒は六角形の均一した顆粒であるが、中空核酸無し欠陥rAAV顆粒は中央がディープカラーに染色された。電子顕微鏡写真による統計結果によると、rAAV顆粒は完全率がとても高い（図6D）。 Observe the morphology of virus granules on the purified rAAV with a transmission electron microscope. Completely solid rAAV granules were hexagonal uniform granules, whereas hollow nucleic acid-free defective rAAV granules were stained deep in the center. According to the statistical results of electron micrographs, rAAV granules have a very high completeness rate (Fig. 6D).

本実施例で調製したBEVは連続して継代してから感染本実施例で調製したBEV-Tn7-(ITR-GOI)-Δ(Chia-Cath) -Cap2-ΔAc124-Rep2は連続して継代してからSf9細胞に感染する。ウエスタンブロット実験によりRep及びCapタンパク質の発現を検出し、組換え型バキュロウイルスBEVの安定性を試験する。シャトルプラスミドに基く1バキュロウイルスシステムと比べて見ると、P1〜P5世代でRep及びCapタンパク質の発現レベルが高く、P5世代からだんだんに低下し、BEVの安定性がP5世代からだんだんに顕著に低下する（図8A）。本実施例で調製したBEVはP1〜P8世代Rep及びCapタンパク質での発現レベルが共に安定である（図8F）。まとめて言うと、本実施例で構築したBEVは安定性がとても大きな程度で向上したものである。 BEV prepared in this example is continuously passaged and then infected. BEV-Tn7- (ITR-GOI) -Δ (Chia-Cath) -Cap2-ΔAc124-Rep2 prepared in this example is continuously passaged. After that, it infects Sf9 cells. The expression of Rep and Cap proteins will be detected by Western blot experiments, and the stability of recombinant baculovirus BEV will be tested. Compared to the 1-baculovirus system based on the shuttle plasmid, the expression levels of Rep and Cap proteins are high in the P1 to P5 generations, gradually decrease from the P5 generation, and the stability of BEV gradually decreases from the P5 generation. (Fig. 8A). The BEV prepared in this example has stable expression levels in both P1 to P8 generation Rep and Cap proteins (Fig. 8F). In summary, the BEV constructed in this example has improved stability to a very large extent.

本分野の技術が容易に理解できるように、前記が本発明の好ましい実施例だけであり、本発明を制限するものではなく、本発明の精神と原則で行う一切の改訂、同等交換及び改善などが本発明の保護範囲にある。 To help the art in the art be easily understood, the above are only preferred embodiments of the invention and do not limit the invention, but any revisions, equivalent exchanges and improvements made in the spirit and principles of the invention, etc. Is within the scope of protection of the present invention.

Claims (10)

下記のステップを含むことを特徴とする組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。
（1）各々シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを調製する。
前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付き組換え型アデノ随伴ウイルスの中核的な発現コンポーネントを含む。
前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドは組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。
（2）ステップ（1）で取得したシャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドにより異種機能的遺伝子フラグメント付き組換え型アデノ随伴ウイルスの中核的な発現コンポーネントを組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスと整合して前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを取得する。
（3）ステップ（2）で取得した前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生する組換え型バキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドをホスト細胞系にトランスフェクトして培養する。 A method for preparing a recombinant adeno-associated virus, which comprises the following steps.
(1) Prepare a recombinant bacmid containing a shuttle plasmid and a suitable baculovirus genome, respectively.
The shuttle plasmid contains at least the core expression component of a recombinant adeno-associated virus with a heterologous functional gene fragment.
The recombinant bacmid containing the baculovirus genome comprises an expression box for other functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus.
(2) Recombinant adeno-associated virus with the core expression component of recombinant adeno-associated virus with heterologous functional gene fragments using the shuttle plasmid obtained in step (1) and recombinant bacmid containing the genome of baculovirus as appropriate. Obtain a recombinant plasmid containing the genome of the recombinant baculovirus produced by the recombinant adeno-associated virus, consistent with the expression box of other functional protein components required for production by.
(3) Recombinant bacmid containing the genome of recombinant baculovirus produced by the recombinant adeno-associated virus obtained in step (2) is transfected into a host cell line and cultured. ステップ（1）に記載のシャトルプラスミドに相応しい組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia遺伝子及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスのゲノムであることを特徴とする請求項1に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。 The recombinant type according to claim 1, wherein the recombinant bacmid suitable for the shuttle plasmid according to step (1) is a genome of a baculovirus lacking the non-essential genes Chia gene and / or Cath gene. Method for preparing adeno-associated virus. 前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入されることを特徴とする請求項2に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。 The expression box for other functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus is the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt. , 39k, orf51, gp37, iap2 and the method for preparing a recombinant adeno-associated virus according to claim 2, wherein the recombinant adeno-associated virus is inserted into one or more of the loci selected from the locus odv-e56. 前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記の組換え型バクミドが非必須遺伝子Chia及び/またはCathから選出した遺伝子座に挿入されることを特徴とする請求項3に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。 An expression box for other functional protein components required for production by the recombinant adeno-associated virus is inserted into a locus selected from the non-essential genes Chia and / or Cath by the recombinant Bakumid. 3. The method for preparing a recombinant adeno-associated virus according to claim 3. ステップ（1）に記載のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドが下記の方法により調製されることを特徴とする請求項3に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。
Red組換えにより前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを前記の非必須遺伝子の遺伝子座に挿入する。 The method for preparing a recombinant adeno-associated virus according to claim 3, wherein the recombinant bakumid containing the baculovirus genome according to step (1) is prepared by the following method.
An expression box for other functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus by Red recombination is inserted into the locus of the non-essential gene. 前記のシャトルプラスミドはプラスミドpfast.Bac.Dualに基くものであり、アデノ随伴ウイルスのRep遺伝子またはCap遺伝子の発現ボックスを含むことを特徴とする請求項1に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。 The preparation of the recombinant adeno-associated virus according to claim 1, wherein the shuttle plasmid is based on the plasmid pfast.Bac.Dual and contains an expression box for the Rep gene or Cap gene of the adeno-associated virus. Method. 前記の組換え型バクミドがバキュロウイルスAcMNPVのゲノムからのものであり、少なくとも組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要なアデノ随伴ウイルスのCap遺伝子及び/またはRep遺伝子の発現ボックスを含み、組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスがバキュロウイルスP10またはPHプロモーターの下流にあり、それにより調節されることを特徴とする請求項1に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製方法。 The recombinant bacmid is from the genome of the baculovirus AcMNPV and contains at least an expression box for the adeno-associated virus Cap and / or Rep genes required for the production of the recombinant adeno-associated virus. The recombinant according to claim 1, wherein the expression box of the functional protein component required for the production of the altered adeno-associated virus is downstream of the baculovirus P10 or PH promoter and is regulated thereby. Method for preparing adeno-associated virus. シャトルプラスミド及び相応しくバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドを含むことを特徴とする組換え型アデノ随伴ウイルスの調製システム。
前記のシャトルプラスミドは少なくとも異種機能的遺伝子フラグメント付き組換え型アデノ随伴ウイルスの中核的な発現コンポーネントを含む。
前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドは組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスを含む。 A recombinant adeno-associated virus preparation system comprising a shuttle plasmid and optionally recombinant bacmid containing the baculovirus genome.
The shuttle plasmid contains at least the core expression component of a recombinant adeno-associated virus with a heterologous functional gene fragment.
The recombinant bacmid containing the baculovirus genome comprises an expression box for other functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus. 前記のバキュロウイルスのゲノムを含む組換え型バクミドがChia遺伝子及び/またはCath遺伝子が欠けているバキュロウイルスのゲノムであることを特徴とする請求項8に記載の組換え型アデノ随伴ウイルスの調製システム。 The recombinant adeno-associated virus preparation system according to claim 8, wherein the recombinant bacmid containing the baculovirus genome is a baculovirus genome lacking the Chia gene and / or the Cath gene. .. 前記の組換え型バクミドは少なくとも組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な機能的タンパク質成分の発現ボックスの一種を含み、前記の組換え型アデノ随伴ウイルスが産生することに必要な他の機能的タンパク質成分の発現ボックスが前記のバキュロウイルスが非必須遺伝子Chia、Cath、Ac124、p10、p26、p74、ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2及び遺伝子座odv-e56から選出した遺伝子座の1つまたは複数に挿入されることを特徴とする組換え型アデノ随伴ウイルスを調製するための組換え型バクミド。 The recombinant adeno-associated virus contains at least one of the expression boxes of functional protein components required for the production of the recombinant adeno-associated virus, and the other recombinant adeno-associated virus required for the production. The expression box of the functional protein component is a gene locus selected from the non-essential genes Chia, Cath, Ac124, p10, p26, p74, ctx, egt, 39k, orf51, gp37, iap2 and loci odv-e56. Recombinant Bakumid for preparing recombinant adeno-associated virus characterized by being inserted into one or more of the.
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