JP2021512094A

JP2021512094A - 新規なクリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物

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Publication number: JP2021512094A
Application number: JP2020541647A
Authority: JP
Inventors: ソンイム、スン; ファンファン、スン; ギョンイ、ス; レチョ、グァン; ハンクォン、ジョン; ウハン、ジョン; ナムハン、ボク; ヨンイ、ジ; ヒパク、キョン; ギョンイ、ヒョン; ジサ、ユン; ヒョンイ、ジ
Original assignee: Frontbio Inc
Current assignee: Frontbio Inc
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2021-05-13
Also published as: KR20190093064A; EP3747435A1; US20210038562A1; KR102032739B1; WO2019151732A1; US20220105072A1; CN111655254A; EP3747435A4

Abstract

本発明は、クリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に関するものであり、より詳しくは、最終糖化産物（ＡＧＥ）の形成抑制効果を有して糖尿病合併症を予防または治療することができるクリシン誘導体化合物を有効成分として含む、糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に関するものである。【選択図】図１

Description

本発明は、新規なクリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に関するものであり、より詳しくは、優れた最終糖化産物（ＡＧＥ）の形成抑制効能を有して糖尿病合併症を予防または治療することができるクリシン誘導体化合物を有効成分として含む、糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に関するものである。

糖尿病（Diabetes Mellitus；ＤＭ）は、インスリン欠乏およびインスリン抵抗性又はこれらを両方とも特徴とし多くは肥満に関わる進行性疾患（progressive disease）である。空腹および食後の血糖上昇のため、失明、腎不全、心臓疾患、卒中（stroke）および切断（amputation）を引き起こす急性および慢性合併症（微細血管および大血管（micro- and macro-vascular））に患者がさらされる。血糖調節の改善がかかる糖尿病合併症の危険性を低めることが立証された。

このような疾患の進行的属性のため、血糖調節を維持するには進化した治療戦略が必要となる。２つの形態の糖尿病：第１型糖尿病、つまり小児糖尿病又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、および第２型糖尿病、つまり成人型糖尿病又はインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）がある。第１型糖尿病患者はインスリンを合成および分泌する膵臓β細胞の免疫学的破壊によりインスリンが絶対的に不足している。第２型糖尿病は病因がより複合的であり、相対的なインスリン欠乏、インスリン作用減少、およびインスリン抵抗性を特徴とする。早期発生ＮＩＤＤＭ又は若年発症成人型糖尿病（Maturity-Onset Diabetes of the Young；ＭＯＤＹ）は、中年に発病する最も一般的な形態のＮＩＤＤＭと多くの特性を共有する（Rotterら、1990）。明確なタイプの遺伝（常染色体優性）がＭＯＤＹで観察された。少なくとも、３つの全く相異なる突然変異がＭＯＤＹ家族から確認された（Bellら、1996）。

一方、糖尿病合併症は、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎臓病、糖尿病性心筋梗塞、糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障、糖尿病性血管合併症又は糖尿病性足部潰瘍を含み、主要原因はポリオール経路のアルドース還元酵素（aldose reductase）活性による過剰なソルビトール蓄積であると知られている。よって、アルドース還元酵素の抑制が糖尿病合併症の治療および予防において重要な役割を果たすことと知られている。今まで開発されたアルドース還元酵素抑制剤であるゾポルレスタット（zopolrestat）、ポナルレスタット（ponalrestat）、ソルビニル（sorbinil）、トルレスタット（tolrestat）、フィダレスタット（fidarestat）、ラニレスタット（ranireatat）及びエパルレスタット（epalrestat）等が様々な動物実験で糖尿病合併症を予防、遅延させると報告されている。

しかし、臨床でゾポルレスタット（zopolrestat）及びポナルレスタット（ponalrestat）の効能が低く、ソルビニル（sorbinil）の過敏反応、トルレスタット（tolrestat）の肝機能障害のような副作用により開発過程で中断された。現在日本と米国ではラニレスタット（ranireatat）及びフィダレスタット（fidarestat）の臨床実験が進んでいる。エパルレスタット（epalrestat）は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）には承認されていないが、日本では１９９２年に承認されて市販されている。

また、ソルビトール蓄積はソルビトール脱水素酵素によって果糖に転換され、高濃度の果糖がタンパク質と結合して結局は最終糖化産物（Advanced Glycation End products；ＡＧＥ）の形成を加速化する。ここで、最終糖化産物は、生体組織と細胞を攻撃して老化を促進するだけでなく、糖尿、心臓疾患、癌などを含めて様々な疾患を誘発するに関与すると知られている。また、最終糖化産物が形成されると、血管壁やリンパ球などの細胞膜に最終糖化産物と結合可能な受容体（ＲＡＧＥ；Receptor of AGEs）が作られるが、最終糖化産物が受容体に結合すると、炎症に関連する各種免疫因子が活性化して慢性疾患を誘発又は悪化するようになる。

一方、クリシン（Chrysin）は、ポプラ（Populus nigra L.）の若葉、姫子松（五葉松）（Pinus parviflora Sieb．et Zucc.）の芯材又は配糖体トリンギンとしてCormus Tschonoski Maxim．（バラ科）の樹皮その他に含まれる。クリシンは通常抗酸化効果を有すると知られており、鎮痛剤などに使われる。

しかし、従来開示された技術では、本発明の新規なクリシン誘導体化合物を糖尿病合併症の予防又は治療に用いたことについて報告されたことがない。

よって、本発明では糖尿病合併症の予防又は治療に有効な活性物質に対する研究を進めてきた。その結果、新規なクリシン誘導体化合物の場合に最終糖化産物の形成に対して抑制効果があることを確認した。従って、本発明の目的は、最終糖化産物の形成を抑制させることにより、糖尿病合併症の予防又は治療に使用可能な新規なクリシン誘導体化合物を含有する糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は下記化学式１のクリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物を提供する：

上記化学式１において、
Ｒ_１はＣ_１−４アルキル、Ｃ_１−６アルケニルおよび−ＣＯＲ_３からなる群より選ばれ；
Ｒ_２はＨ、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキルおよび−ＣＯＲ_４からなる群より選ばれ；
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立してＣ_１−４アルキルである。

本発明の他の具現例によると、上記の薬学組成物を含む薬学的製剤を提供する。

本発明で提供する新規なクリシン誘導体化合物は、最終糖化産物形成抑制効果を有し、糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に有用である。

本発明の一実施例であってＲＡＷ２６４．７細胞でクリシンとその誘導体がＮＯ生成（Ａ）と細胞生存（Ｂ）に及ぼす影響に関する結果である。

以下に列挙する定義は、本発明を記述するために用いられた様々な用語の定義である。これら定義は特に制限しない限り、個別的に又はこれらを含む用語の一部分として本明細書全体に適用される。

本明細書に用いられる用語「ハロゲン」は、他の言及がない限り、フッ素、塩素、臭素又はヨードを意味する。

本明細書に用いられる用語「アルキル」は、他の言及がない限り、Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１で表される飽和された、直鎖状又は分枝状の炭化水素基を示し、具体的にそれぞれ１乃至４つの炭素原子を含む飽和された、直鎖状又は分枝状の炭化水素基を示す。これらの基の例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基が挙げられるが、これらに限らない。例えば、本明細書に用いられる用語「Ｃ_１−４アルキル」は、他の言及がない限り、炭素数１乃至４の直鎖状又は分枝状の炭化水素基を意味する。その例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基などがあるが、これらに限らない。

本明細書に用いられる用語「アルケニル」は、他の言及がない限り、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和された、直鎖状又は分枝状の炭化水素残基（moiety）に由来する１価基を示し、具体的にそれぞれ２乃至６つの炭素原子を含む不飽和された、直鎖状又は分枝状の１価基を示す。これらの例にはエテニル基、プロペニル基、ブテニル基、１−メチル−２−ブテン−１−イル基が含まれるが、これらに限らない。

以下、本発明をより詳しく説明する。

本発明は、下記化学式１の新規なクリシン誘導体化合物およびその用途に関し、より詳しくは、クリシン誘導体化合物を活性成分として含有する糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物に関する。本発明の新規なクリシン誘導体化合物は、優れた血糖調節および最終糖化産物（ＡＧＥ）の形成抑制効果を有し、糖尿病合併症を予防又は治療することができる。

具体的に、本発明の一具現例によると、下記化学式１のクリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物を提供する：

本発明の他の具現例によると、上記化学式１で表される化合物においてＲ_１は−ＣＯＲ_３であり、Ｒ_２はＨ、−ＣＨ_３および−ＣＯＣＨ_３からなる群より選ばれ、Ｒ_３はＣ_１−４アルキルであることを特徴とする薬学組成物を提供する。

本発明のまた他の具現例によると、上記化学式１で表される化合物においてＲ_１は−ＣＯＣＨ_３であることを特徴とする薬学組成物を提供する。

本発明による上記化学式１の化合物の好ましい例は次の通りであるが、これに限るものではない：

７−Ｏ−アセチルクリシン；
５，７−ジ−Ｏ−アセチルクリシン；
７−Ｏ−プレニルクリシン；
７−Ｏ−メトキシクリシン；および
５，７−ジ−Ｏ−メトキシクリシン。

本発明の薬学組成物は、これに含まれる化学式１で表される化合物が最終糖化産物（ＡＧＥ）の形成を抑制することにより、これに関連する様々な疾患の予防又は治療にも有用である。

本発明の一具体例において、上記化合物が５，７−ジ−Ｏ−アセチルクリシンである場合、最終糖化産物の形成に対して優れた抑制効果を有する点で好ましいが、これに限るものではない。

本発明の一具体例において、上記糖尿病合併症は、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎臓病、糖尿病性心筋梗塞、糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障及び糖尿病性足部潰瘍からなる群より選ばれた１種以上であるが、これらに限らない。

本明細書で使われる用語「予防」とは、本発明の薬学組成物の投与によって糖尿病合併症を抑制したり発病を遅延させたりする行為のすべてを意味する。

本明細書で使われる用語「治療」とは、本発明の薬学組成物の投与によって糖尿病合併症による症状を好転又は改善させる行為のすべてを意味する。

本発明の薬学的製剤は、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、シロップまたはエマルジョンなどの様々な経口投与形態、または注射剤などの筋肉内、静脈内あるいは皮下投与のような非経口投与形態であってもよいが、好ましくは経口投与形態である。

また、上記薬学的製剤には、有効成分の他に通常の無毒性の薬学的に許容可能な添加剤として、具体的には担体、補強剤および賦形剤からなる群より選ばれた１種以上が添加され、通常の方法によって製剤化することができる。

本発明の薬学的製剤に使用可能な賦形剤としては、甘味剤、結合剤、溶解剤、溶解補助剤、湿潤剤、乳化剤、等張化剤、吸着剤、崩壊剤、酸化防止剤、防腐剤、滑沢剤、充填剤、芳香剤などが含まれるが、これらに限らない。例えば賦形剤として、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシン、シリカ、マグネシウムアルミノケイ酸塩、澱粉、ゼラチン、トラガカントゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム（Sodium alginate）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、オレンジエッセンス、ストロベリーエッセンス、バニラ香などが使用可能である。

本発明の薬学的製剤が経口投与形態である場合、使用される担体の例にはセルロース、ケイ酸カルシウム、トウモロコシ澱粉、ラクトース、スクロース、デキストロース、リン酸カルシウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ゼラチン、タルクなどが挙げられるが、これらに限らない。

本発明の薬学的製剤が注射剤形態である場合、上記担体としては、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、類似糖水溶液、アルコール、グリコール、エーテル、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセリドなどが挙げられるが、これらに限らない。

本発明による化合物を薬剤として使用するために、後者を製薬製剤の形態に製造し、これは経口又は非経口投与用活性成分以外に、適した製薬上有機または無機の不活性担体物質、例えば、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、澱粉、植物性オイル、ポリアルキレングリコールなどを含有する。製薬製剤は、固体状、例えば錠剤、糖衣錠、坐剤あるいはカプセル剤、または液体状、例えば液剤、懸濁剤あるいは乳剤として存在し得る。また、これらは任意に補助剤、例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤あるいは乳化剤；浸透圧変更用塩または緩衝剤を含有する。

非経口投与用としては、特に注射液剤または懸濁剤が好ましい。

担体システムとして、界面活性補助剤、例えば、胆汁酸塩又は動物あるいは植物リン脂質、又はこれらの混合物、およびリポソームやその成分を使用することができる。

経口投与用としては、特に滑石および／又は炭化水素ビヒクルあるいは結合剤、例えば、ラクトース、トウモロコシ又はジャガイモ澱粉を含有する錠剤、糖衣錠またはカプセル剤が好適である。また、液体状、例えば、甘味剤を加えたジュースを投与してもよい。

また、本発明による上記化学式１の化合物の人体投与用量は一般的に体重７０ｋｇの成人患者を基準とする場合、０．１ｍｇ／日乃至２，０００ｍｇ／日の範囲であるのが好ましい。本発明による化合物は１日１回から数回に分割投与できる。但し、上記の投与容量は患者の健康状態、年齢、体重および性別や、投与形態と疾患程度に応じて異なり、これゆえ本発明の範疇は上記提示した投与容量に限定するものではない。

以下、本発明を下記の製造例および実施例に基づいてより詳しく説明するが、これは本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

〔合成例１及び２〕７−Ｏ−アセチルクリシンおよび５，７−ジ−Ｏ−アセチルクリシンの合成
無水酢酸（１０ｍＭ）をピリジン５０ｍＬ及びクリシン（１０ｍＭ）を含む溶液に滴下した。室温で撹拌しながら２時間反応させた後、４０℃で溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。

残留物を塩化メチレン（ＭＣ）に溶解させ１ＭＨＣｌで３回洗浄した後、飽和重炭酸ナトリウム溶液および水で中和した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した上で真空で濃縮した。残留物をＭＣ／ＭｅＯＨ（１０：０乃至９．５：１．５、ｖ／ｖ）で溶出させて７−Ｏ−アセチルクリシン（７−ＯＡ）および５，７−ジ−Ｏ−アセチルクリシンを得た。

〔合成例３〕７−Ｏ−プレニルクリシンの合成
無水アセトン（７０ｍＬ）にクリシン（１０ｍＭ）、プレニルブロミド（２．２ｍＭ）および無水Ｋ_２ＣＯ_３（３．７ｍＭ）を添加した後、混合物を６５℃で８時間還流させた。

＊混合物溶媒をロータリーエバポレーターで４０℃で除去した。残留物をエチルアセテートに溶解させた後、ヘキサン／エチルアセテート（９：１：２：１、ｖ／ｖ）でシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して７−Ｏ−プレニルクリシンを得た。

〔合成例４及び５〕７−Ｏ−メトキシクリシンおよび５，７−ジ−Ｏ−メトキシクリシンの合成
８０ｍＬのＤＭＣ（Dimethyl Carbonate）中に２．５４ｇのクリシン（０．５ｍｍｏｌ）と１．８４ｇの１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン（1,8-Diazabicyclo（5.4.0）undec-7-ene）を混合し９０℃で１９時間反応を進めた。

反応物にメタノール（２４０ｍｌ）を入れて濃縮した後、その濃縮物にエチルアセテート（２００ｍｌ）と１ＮＨＣｌ（１００ｍｌ）を入れて分画を実施した。

有機分画層（Ethyl acetate）を濃縮してＮａＣｌで中和した上、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水してシリカゲルカラムを行い、７−Ｏ−メトキシクリシンと５，７−ジ−Ｏ−メトキシクリシンを分離した。

［実験例１］
（１）アマドリ化合物（amadori compound）形成に対するヘモグロビン−δ−グルコノラクトン分析（初期段階）
タンパク質糖化の初期段階の評価は、δ−グルコノラクトン分析法（Rahbar et al., 1999）によって決定された。簡単に言えば、３７℃で７日間滅菌された暗条件の下で０．２ｇ／ＬＮａＮ_３を含有するリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）で新しいヒト血液（５０ｍｇ／ｍＬ）をブドウ糖（１４４ｍｇ／ｍＬ）とともに培養した。

いくつかの実験で、指示されたサンプルを０．０１〜１ｍＭ濃度範囲でモデルシステムに添加した。サンプルの蛍光は３５５ｎｍおよび４６０ｎｍの励起および蛍光極大でそれぞれ測定された。アミノグアニジン（Aminoguanidine）は陽性対照群で公知の抑制剤として試験した。

（２）ＡＧＥ形成に対するウシ血清アルブミン−メチルグリオキサール分析（中間段階）
様々な濃度の化合物（対照群を含む）の存在下でウシ血清アルブミン（５０ｍｇ／ｍＬ）をリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中メチルグリオキサール（１００ｍＭ）とともに３７℃で２４時間恒温培養した。

サンプルを溶解させるために用いられたジメチルスルホキシドは反応に影響を及ぼさないことと判明された。全ての試薬およびサンプルを０．２ｍｍメンブレンフィルターを通してろ過し滅菌した。蛍光強度はルミネセンススペクトロメータ（Luminescence spectrometer）ＬＳ５０Ｂ（Perkin-Elmer Ltd., Buckinghamshire，England）（Wu & Yen，2005）を用いて３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの放出波長で測定した。アミノグアニジンは陽性対照群で試験した。５０％阻害活性（ＩＣ_５０）を示す各試験試料の濃度は、残留活性に対してプロットされた対数濃度の最小２乗回帰線から推定された。

（３）ＡＧＥｓ架橋結合に対するＮ−アセチル−グリシル−リシン−メチルエステルＤ−リボース検定（後期段階）
この試験はRahbar等（1999）によって記述された方法を用いてＤ−リボースの存在下でＧＫペプチドの架橋結合を阻害するサンプルの能力を評価するに使われた。ＧＫペプチド（２６．７ｍｇ／ｍＬ）をリン酸ナトリウム緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．４）中Ｄ−リボース（２００ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で２４時間無菌条件の下で培養した。合成された化合物を１０ｍＭおよび５０ｍＭで使われたアミノグアニジンを除いて１ｍＭの最終濃度でモデルシステムに添加した。培養期間の終期に、蛍光強度は３３５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの放出波長で測定された。

［実験例１の結果］
各段階におけるクリシン誘導体の最終糖化産物の形成抑制効果は［表２］の通りである。

（１）初期段階の結果：アマドリ化合物形成に対するクリシン誘導体の抑制効果
アマドリ化合物形成を抑制するためにクリシンとその誘導体の能力を比較した結果、合成例１と合成例５の初期抑制活性は陽性対照群に比べてそれぞれ４．６６倍、１３．９２倍高かった。合成例２はアマドリ化合物形成に対する最も強力な抑制活性を示したが、これはクリシンおよび陽性対照群よりも６６．９６倍および４２２．０７倍も高かった。合成例２は０．００２５〜０．０５μｇ／ｍＬで１．７６〜５５．１３％の容量依存的阻害率を示した。

（２）中間段階の結果：クリシン誘導体のＡＧＥ形成抑制効果
クリシンおよび誘導体の抑制活性をＡＧＥ形成に対して分析しその結果を表２に示した。ＡＧＥ抑制剤アミノグアニジン（ＩＣ_５０＝１３６．７９μＭ）を陽性対照群に用い、クリシンは陽性対照群より５．４８倍高い活性を示した。

試験化合物のうち合成例１、合成例２及び合成例５はＩＣ_５０値がそれぞれ２１．６１、０．９１及び４１．７８μＭの強い活性を示した。特に合成例２は０．０５〜０．５μｇ／ｍＬの低濃度で６．７９〜９３．４２％の阻害活性を示した。

（３）後期段階の結果：クリシン誘導体のＡＧＥ架橋結合抑制効果
表２に示されているように、合成例２および合成例５はＡＧＥ架橋結合に対して有意の抑制活性を示した。合成例２および合成例５はそれぞれ２２．３３および３９．８８μＭのＩＣ_５０値を示したが、陽性対照群は低いＩＣ_５０値（１９０２．６７μＭ）を示した。

同様に、合成例２および合成例５はＡＧＥ形成の３段階でＩＣ_５０値が低いために潜在的なＡＧＥ抑制剤としてみなされ得る。一方、クリシンは１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で抑制活性を示さなかった。

［実験例２：ＲＡＷ２６４．７細胞でＮＯ生成および細胞生存率の測定］
ＲＡＷ２６４．７細胞でクリシンおよび誘導体の細胞毒性をＭＴＳ分析キットを用いて調べた。細胞（１．６×１０^４／ウェル）を９６−ウェルプレートで培養し、サンプル（１０、２５および１００μＭ）を１２、２４、４８および７２時間処理した。培養後、ＭＴＳ溶液２０μＬ／ウェルを加湿５％ＣＯ_２大気で３７℃で９０分間培養した。ＥＬ−８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（Universal microplate reader）（Bio-Tek Instrument Inc., Winooski，USA）を用いて４９０ｎｍでの光学密度を３回測定した。治療されていないグループの細胞生存率は１００％と設定された。ＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０^５細胞／ウェルで１２−ウェルプレートに播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）および２４時間様々な濃度のサンプルに培養した。培地中の酸化窒素（ＮＯ）濃度は、製造者が記述したグリスト試薬システムを用いて測定した。ＥＬ−８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−ＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＩｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＵＳＡ）を用いて５７０ｎｍでＮＯの生成を測定し亜硝酸塩標準検量線［２１］と比較した。

［実験例２の結果］
ＲＡＷ２６４．７細胞に対するクリシン誘導体の抗炎症効果の結果は図１の通りである。

ＲＡＷ２６４．７細胞でＬＰＳ−誘導された炎症に対するクリシンおよびその誘導体の影響を調べ、細胞炎症の程度を示すバイオマーカーとしてＮＯ濃度を用いた。図１の（Ａ）はＬＰＳ−誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞でＮＯ生成に対する比較例１、合成例１、合成例２、合成例４および合成例５の効果を示す。また、合成例２の処理はＬＰＳ−誘発ＲＡＷ２６４．７細胞で濃度依存的にＮＯを抑制し、その効果は比較例１と類似していた。ＲＡＷ２６４．７細胞でのクリシンおよび誘導体の細胞生存力効果はＭＴＳ分析によって観察された。上層液でＮＯの濃度はＬＰＳ処理後に増加し２４時間後に２５−１００μＭ濃度で化合物が細胞毒性を示しなかった（図１（Ｂ））。

図１はＲＡＷ２６４．７細胞でクリシンとその誘導体がＮＯ生成（Ａ）と細胞生存（Ｂ）に及ぼす影響を示す。＊印はＬＰＳ群に比べて有意な差を見せた（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。提示されたデータは平均±標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝３）である。

［実験例３：溶解度分析］
クリシンおよび誘導体を蒸留水に溶解させ溶解度を最大化するために１時間超音波処理して３７℃で培養した。超音波処理後、遠心分離（７０００ｇ、３７℃、５分）で溶解されていないサンプルを除去した。上層液をメタノールで希釈し０．４５μｍ１回用シリンジフィルター（Advantec，Dublin，CA，USA）でろ過しＨＰＬＣ分析を通してサンプルの濃度を分析した。

［実験例３の結果］
クリシン誘導体の溶解度を比較すると［表３］の通りである。

水への溶解度は、合成例１及び合成例２がそれぞれ０．０８６および０．２６５で、比較例１より２．８７倍、８．８３倍高かった。

Claims

下記化学式１のクリシン誘導体化合物を有効成分として含む糖尿病合併症の予防または治療用薬学組成物：

上記化学式１において、
Ｒ_１はＣ_１−４アルキル、Ｃ_１−６アルケニルおよび−ＣＯＲ_３からなる群より選ばれ；
Ｒ_２はＨ、ハロゲン、Ｃ_１−４アルキルおよび−ＣＯＲ_４からなる群より選ばれ；
Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ独立してＣ_１−４アルキルである。
Ｒ_１は−ＣＯＲ_３であり、Ｒ_２はＨ、−ＣＨ_３および−ＣＯＣＨ_３からなる群より選ばれ、Ｒ_３はＣ_１−４アルキルであることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
Ｒ_１は−ＣＯＣＨ_３であることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
上記化学式１の化合物が、下記化合物からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物：
７−Ｏ−アセチルクリシン；
５，７−ジ−Ｏ−アセチルクリシン；
７−Ｏ−プレニルクリシン；
７−Ｏ−メトキシクリシン；および
５，７−ジ−Ｏ−メトキシクリシン。
上記薬学組成物が、最終糖化産物（Advanced Glycation End products；ＡＧＥ）の形成を抑制させることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
上記糖尿病合併症が、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎臓病、糖尿病性心筋梗塞、糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障及び糖尿病性足部潰瘍からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
請求項１に記載の薬学組成物を含む、薬学的製剤。
上記薬学的製剤が、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、シロップまたはエマルジョン状であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的製剤。
上記薬学的製剤が、薬学的に許容可能な担体、補強剤および賦形剤からなる群より選ばれる１種以上を更に含むことを特徴とする、請求項７に記載の薬学的製剤。