JP2021509020A - 細胞の細胞質に浸透して細胞内活性化されたｒａｓを抑制する抗体及びその用途 - Google Patents

細胞の細胞質に浸透して細胞内活性化されたｒａｓを抑制する抗体及びその用途 Download PDF

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Abstract

本開示による修飾された重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わされた腫瘍特異的サイトゾル内在化ＲＡＳ抗体は高い生産収率により治療薬への開発を促進し、サイトゾルへの腫瘍特異的な内在化により変異型ＲＡＳを効果的に抑制できる。従って、単独の薬剤、または既存の薬剤との組み合わせで、効果的な腫瘍抑制活性が期待される。【選択図】 図１７Ａ

Description

本発明は、完全なイムノグロブリン形態で腫瘍組織に過発現する細胞表面の膜タンパク質受容体に結合して内在化（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）された後にエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）能力によって細胞の細胞質に位置し、細胞質内のＧＴＰと結合した活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）に特異的に結合して腫瘍突然変異Ｒａｓの活性を抑制する抗体とその製造方法及び用途に関する。
具体的に、本発明は、完全なイムノグロブリン形態で細胞の細胞質に浸透して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを直接に抑制する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を改良してＲａｓ・ＧＴＰに高い親和度を示す重鎖可変領域（ＶＨ）及びこれを含む抗体とその製造方法及び用途に関する。
本発明の抗体は、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えるための軽鎖可変領域（ＶＬ）の改良技術を含む。
本発明は、前記腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えるために改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）及び親和度が改善された重鎖可変領域（ＶＨ）の組合せからなる完全なイムノグロブリン形態で細胞質に浸透して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを直接に抑制する抗体に関する。
本発明は、前記抗体の細胞内安定性、体内持続性及び腫瘍組織特異性を向上させるための重鎖改良技術を含む。
また、本発明は、前記抗体を用いて癌又は腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び癌又は腫瘍を治療する方法に関する。
また、本発明は、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合する重鎖可変領域の親和度改良のためのライブラリー構築方法とそのライブラリーに関する。
また、本発明は、前記ライブラリーを用いてＲａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域のスクリーニング方法に関する。
癌を含む様々な疾患において細胞内タンパク質−タンパク質相互作用（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＰＰＩ）に重要な役割を果たす酵素又は転写、信号伝達関連の様々なタンパク質の突然変異及び異常過発現の現象が発生する。このような腫瘍及び疾患関連タンパク質に対して小分子薬物が特異的結合をするためには、タンパク質の表面に疎水性ポケット（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐｏｃｋｅｔ）が必要であるが、細胞内部の疾患関連全物質の約１０％前後しか疎水性ポケットを有しないため、小分子薬物は大部分の細胞内部の腫瘍及び疾患関連タンパク質を特異的に標的することができない。疎水性ポケットがない腫瘍及び疾患関連タンパク質の代表例の一つであるＲａｓは、細胞表面の細胞膜受容体を通じて細胞外部の信号を細胞内信号伝達体系に伝達する分子的スイッチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ）の役目を担う。Ｒａｓタンパク質ファミリー（Ｒａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ）のうち、癌と関連しているタンパク質は、ＫＲａｓ、ＮＲａｓ、ＨＲａｓの３つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）タンパク質であり、ＫＲａｓは、ＫＲａｓ４Ａ及びＫＲａｓ４Ｂの２種のスプライシング変異体（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ）として発現し得る。前記Ｒａｓタンパク質は、細胞質に発現した後、小包体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）とゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を経てＣ−末端部位の脂質化反応によって細胞膜に位置するが、ＧＴＰａｓｅ活性を持つ部位は細胞質側に露出される。外部刺激がない場合、細胞内のＧＴＰ加水分解酵素活性化タンパク質（ＧＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＡＰ）によってＧＤＰと結合した不活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＤＰ）として存在し、外部刺激がある場合、細胞内のグアニンヌクレオチド交換因子（Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ，ＧＥＦ）によって、ＧＴＰと結合した活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）として存在する。Ｒａｓ・ＧＴＰは、細胞質内でＲａｆ、ＰＩ３Ｋ、ＲａｌＧＤＳなどのエフェクタータンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用によって下位Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔのような信号を活性化させ、細胞成長、死滅抑制、移動、分化などの様々な信号を伝達する。正常細胞ではＲａｓ・ＧＴＰが信号伝達後、直ちにＧＡＰによるリン酸解離過程によってＲａｓ・ＧＤＰに変わり、一時的にのみ信号を送る形式で信号伝達が調節される。しかし、発癌関連突然変異が起きたＲａｓタンパク質は、ＧＡＰによるリン酸解離過程が起こらず、Ｒａｓ・ＧＴＰ形態に維持されてエフェクタータンパク質と持続して相互作用することになり、これによって下位信号伝達が継続して発生し、正常細胞の癌化（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導する。最も頻繁なＲａｓタンパク質発癌突然変異は、１２番目残基突然変異（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｃなど）、１３番目残基突然変異（Ｇ１３Ｄなど）、及び６１番目残基突然変異（Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈなど）がある。かかる発癌関連Ｒａｓ突然変異は、全腫瘍の約３０％において、癌腫別には肺癌（約２５％）、大腸癌（約３０〜４０％）、膵癌（約９０％）の割合で起きることが証明された。このような発癌関連Ｒａｓ突然変異は、既存の抗癌治療に対する強い耐性を与えるものと知られている。
発癌関連Ｒａｓ突然変異腫瘍治療のために主に小分子薬物（Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）開発が試みられてきているが、主要戦略は、ＲａｓのＣ−末端脂質化に関連した酵素の活性を阻害することによって、Ｒａｓが細胞内膜に位置することを防ぐ戦略、Ｒａｓとエフェクタータンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害してＲａｓを直接に標的する方法などがある。ＲａｓのＣ−末端脂質化は、細胞質に発現したＲａｓが活性化されるために細胞内膜に位置するための過程であり、これに関連している酵素にはファルネシル転移酵素（ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＦＴａｓｅ）、Ｒａｓ変換酵素１（Ｒａｓ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ＣＡＡＸ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ１，ＲＣＥ１）、イソプレニルシステインカルボキシルメチル転移酵素（ｉｓｏｐｒｅｎｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＩＣＭＴ）などがある。これらの酵素を標的する小分子薬物が開発されてきたが、Ｒａｓ野生型の正常細胞株も細胞成長抑制及び細胞死滅させる副作用があり、また、Ｒａｓ突然変異のうち、最高頻度数のＫＲａｓ突然変異腫瘍では、ゲラニルゲラニル転移酵素１（ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，ＧＧＴａｓｅ１）による迂回経路によって薬物の効果がない限界点がある。他の戦略であるＲａｓを直接標的する小分子薬物には、活性化されたＲａｓに結合して下位エフェクタータンパク質であるＲａｆとの相互作用を抑制する機序を有するＫｏｂｅ００６５、Ｋｏｂｅ２６０２があるが、薬物の安定性（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が悪く、治療用に高容量の薬物が必要であるという限界がある。また、ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ突然変異に共有結合して下位エフェクタータンパク質であるＲａｆとの相互作用を抑制する機序のＡＲＳ８５３が開発されたが、ＫＲａｓ突然変異のうち、発見される頻度数の低いＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ突然変異に限る薬物であるという限界がある。そして、下位エフェクタータンパク質であるＲａｆ、ＰＩ３Ｋ、ＲａｌＧＤＳのＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合してＲａｓとの結合を抑制する機序のリゴセルチブ（ｒｉｇｏｓｅｒｔｉｂ）が開発されたが、治療用に高容量の薬物が必要であるという限界がある。
小分子薬物の他に、アルファ−らせん（α−ｈｅｌｉｘ）構造類似体として開発されているステープルペプチド（ｓｔａｐｌｅｄ ペプチド）は、隣接していない２単位体を炭化水素鎖で連結することによってペプチドの構造的安全性を高め、代謝的安定性、そして細胞透過性を高めることができるという長所から、細胞内部タンパク質標的治療物質として開発中である。このような特性を用いて、非活性状態であるＲａｓを活性化されたＲａｓに変換させるＲａｓグアニンヌクレオチド交換因子（ＲａｓＧＥＦ）のＲａｓと結合する部位をペプチドで模倣する戦略で細胞質浸透が可能なステープルペプチドが開発されてきたが、治療効果を出すために高容量のペプチドが必要であり、Ｒａｓ突然変異細胞株の他にＲａｓ野生型細胞株にも非特異的に効果を与えるという限界がある。
小分子薬物とステープルペプチドの技術的限界を克服するために、タンパク質−タンパク質相互作用を効果的に阻害できる抗体切片又は組換えタンパク質のような高分子物質に、生きている細胞内部への浸透能を与えるための様々な研究がなされてきた。中でも、塩基性アミノ酸配列及び疎水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）、両親媒性（Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）の特性を有するタンパク質透過ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ，ＰＴＤ）が、生きている細胞に対して細胞浸透能を有することが知られ、これを用いた細胞内部特定タンパク質を認識するために、タンパク質透過ドメインを遺伝工学的に様々な形態の抗体切片と融合する試みが多くなされてきた。しかし、ほとんど動物細胞で分泌されないか、ごく少量だけ上澄液に流出されるので、生産収率が低く、細胞内部への浸透効率が良くないという限界がある。このような発現問題を克服するために、細胞透過ドメインを化学的共有結合又はビオチン−ストレプトアビジン（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）などの結合などで融合する研究が進行されているが、当該タンパク質の構造に変形を招くという限界がある。
一般に、完全なイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体は、大きいサイズと親水性の特徴のため、生きている細胞内部に直接浸透することができない。しかし、完全なイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の細胞質浸透能を有する抗体である細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）は、細胞膜受容体であるＨＳＰＧｓ（Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ ＰｒｏｔｅｏＧｌｙｃａｎｓ）に結合してクラスリン媒介エンドサイトーシス（ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内部に流入した後、エンドソームから細胞質に脱出する機序によって細胞質に浸透できる機能を有する。細胞質浸透抗体の受容体であるＨＳＰＧは、一般に大部分の動物組織に全て発現しており、様々な受容体と成長因子及びサイトカイン結合の補助受容体として働くことによって、組織形成、傷治癒などの機能を果たし、一部は、細胞膜から切り出されて血液内でエフェクタータンパク質として作用することもある。このような特性によって、ＨＳＰＧに結合する部位を有する肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）は、血液内半減期が低いという特徴を有し、これを克服するために、ＨＳＰＧ結合部位を除去して血液内半減期を増加させた研究が報告されたことがある。
治療用イムノグロブリン抗体は小分子薬物に比べて開発期間が長く、患者に投与するために高農度に生産しなければならないので、開発の初期に抗体の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）及び水溶化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を含む治療用薬物への開発可能性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）を確認することが大きな課題となってきた。細胞質浸透抗体の場合、細胞外部受容体であるＨＳＰＧのＨＳ鎖の陰電荷と細胞質浸透抗体の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲｓ）の陽電荷を帯びるアミノ酸残基間の静電気的引力による結合によって細胞内部に流入する。このような、抗体のＣＤＲにおける陽電荷のアミノ酸残基は抗体安定性に悪影響を及ぼし、このような陽電荷のアミノ酸残基を疎水性残基又は陰電荷のアミノ酸に置換した場合、その物性が顕著に向上することが報告されたことがある。
イムノグロブリン抗体は体内の様々な病原菌に結合した後、病原菌によって共に細胞内部に浸透でき、細胞質内ＴＲＩＭ２１タンパク質と結合して細胞内部兔疫体系システムを起こすことができる。ＴＲＩＭ２１は、Ｅ３リガーゼファミリーに属する細胞質タンパク質であり、イムノグロブリンのＣＨ２−ＣＨ３領域に結合し、病原菌、イムノグロブリンと共に複合体を形成し、この複合体はユビキチン−プロテアソーム機序によって分解される。このような、イムノグロブリン抗体とＴＲＩＭ２１の結合が減少した場合、病原菌による免疫システムが作動しなく、イムノグロブリン抗体分解にＴＲＩＭ２１が重要な役目を果たしていると報告されたことがある。また、イムノグロブリン抗体は血液内免疫細胞のＦｃγレセプターとの結合によってＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を起こして腫瘍死滅を誘導する兔疫体系システムを有している。イムノグロブリンのサブクラス別にＦｃγレセプターへの結合親和度が異なり、具体的に、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４抗体はＦｃγレセプターとの親和度が非常に低いため、ＡＤＣＣ機能が欠乏している。Ｆｃγレセプターとの親和度の影響から、同一抗体では、ＩｇＧ１よりもＩｇＧ２、ＩｇＧ４抗体が体内半減期が高い傾向がある。
したがって、本発明者は、既存の細胞質浸透によって細胞内Ｒａｓ活性を直接抑制する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体（ＲＴ１１）に基づいて重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーを構築し、細胞質内Ｒａｓ・ＧＴＰに対して親和度が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）を選別し、これを、生きている細胞内部に浸透及び細胞質に分布する特徴を有するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖と同時発現させて完全なイムノグロブリン形態の抗体を構築することによって、Ｒａｓ突然変異特異的細胞成長抑制効果が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体を作製した。
また、本発明者は、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を有する完全なイムノグロブリン形態抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体を発掘するために、ＨＳＰＧに対する非特異的結合能を減少させ、腫瘍組織特異性を与えるためのペプチドが融合された後にも安定性及び生産性が改善された軽鎖可変領域（ＶＬ）の単一ドメインを開発し、これを含む軽鎖とＲａｓ・ＧＴＰに高特異的結合能を有する重鎖可変領域（ＶＨ）単一ドメインを含む重鎖を同時発現させて、高生産性の腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体を開発した。
また、本発明者は、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を有する完全なイムノグロブリン形態抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体の細胞内安定性、体内持続性及び組織特異性を向上させるために重鎖を改良することによって、Ｒａｓ突然変異特異的細胞成長抑制効果が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体を作製した。
また、本発明者は、前記腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体が様々なＲａｓ突然変異依存的癌細胞株の内部に浸透して、細胞質にあるＲａｓ・ＧＴＰ特異的結合能を示し、既存の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗体に比べて向上した細胞生長抑制効果を確認した。また、腫瘍組織特異性を与えるためにＨＳＰＧ結合能を減少させ、腫瘍組織に過発現するインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチドを融合した形態においても高いレベルの生産収率を示し、細胞質浸透及びＲａｓ・ＧＴＰ活性抑制に対する悪影響無しで、Ｒａｓ突然変異依存的腫瘍においてＲａｓ・ＧＴＰを特異的抑制させる活性を発揮することを確認し、本発明を完成するに至った。
韓国登録特許第１０−１６０２８７０号公報 韓国登録特許第１０−１６０２８７６号公報
本発明は、完全なイムノグロブリン形態で腫瘍組織に過発現する細胞表面の膜タンパク質受容体に結合して内在化された後、エンドソームから脱出して細胞質に位置した後、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに結合して腫瘍突然変異Ｒａｓ活性を直接抑制する抗体の機能を改良し製造する方法を提供する。
本発明は、具体的に、ＧＴＰが結合して活性化されたＲａｓに特異的に結合する重鎖可変領域のアミノ酸配列を提示する。
また、前記重鎖可変領域を含む完全な形態のイムノグロブリン抗体を提示する。
前記抗体は細胞質浸透能を有することができ、そのために特定の配列のアミノ酸を含むことができる。また、癌細胞標的能向上のために、癌細胞表面で発現する膜タンパク質ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、インテグリンαｖβ３（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ３）又はインテグリンαｖβ５（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ５）を標的するペプチドが軽鎖可変領域又は重鎖可変領域に融合するのに必要な特定のアミノ酸配列を含むことができる。
また、前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭからなる群から選ばれるヒト免疫グロブリンに由来した重鎖定常領域又は軽鎖定常領域を含むことを特徴とし得る。
また、癌細胞標的能向上のために、前記抗体の重鎖定常領域は、ＣＨ３領域のＮ４３４Ｄ、ＣＨ２領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ３２９Ｇのいずれか一つ以上の突然変異を含むことができる。（ただし、前記アミノ酸位置はＥＵ番号（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に従う。）
また、前記抗体は、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及びこれら抗体のエピトープ−結合断片からなる群から選ばれ得る。
また、前記抗体は二重特異抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｂ）であり得るが、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、毒素、酵素又は核酸からなる群から選ばれるいずれか一つ以上と融合し得る。
また、本発明は、前記細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上し、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を有する完全な形態のイムノグロブリン抗体の製造方法を提示する。
また、本発明は、前記抗体を含む、癌の予防又は治療用組成物を提示する。前記癌は、細胞内Ｒａｓが活性化された突然変異を有することを特徴とし得る。特に、前記Ｒａｓの突然変異は、Ｒａｓの１２番目、１３番目又は６１番目アミノ酸に突然変異が発生したことを特徴とし得る。
本発明で提示する前記癌の予防又は治療は、本発明で提示した抗体が、細胞質内でＢ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ又はＰＩ３Ｋと活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）との結合を抑制する機序を有することを特徴とし得る。
また、本発明は、前記抗体を含む腫瘍診断用組成物を提示する。
また、本発明は、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを提示する。
また、本発明は、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域ライブラリーとその構築方法を提示する。
また、本発明は、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域のスクリーニング方法を提示する。
上記の目的を達成するために本発明は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、一般式２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び一般式３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ＧＴＰが結合して活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）に特異的に結合する重鎖可変領域を提供する。
（一般式１） Ｄ−Ｘ１１−ＳＭＳ
前記一般式１で、Ｘ１１はＦ又はＹであり、
（一般式２） ＹＩＳＲＴＳＨＴ−Ｘ２１−Ｘ２２−ＹＡＤＳＶＫＧ
前記一般式２で、Ｘ２１はＴ、Ｉ又はＬであり、Ｘ２２はＹ、Ｃ、Ｓ、Ｌ又はＡであり、
（一般式３） Ｇ−Ｆ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｙ
前記一般式３で、Ｘ３１はＫ、Ｆ、Ｒ又はＮであり、Ｘ３２はＭ又はＬであり、Ｘ３３はＤ又はＮである。
また、生きている細胞に完全なイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態で腫瘍組織特異的細胞膜受容体による細胞内在化（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）及びエンドソーム脱出（Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）によって能動的に細胞質に浸透して、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰの活性を抑制する抗体の機能を改良し、これを製造する方法を提供する。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の前記方法は、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えた軽鎖可変領域（ＶＬ）と細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度を改良して高い結合能を示す重鎖可変領域（ＶＨ）を有する完全なイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を用いて、Ｒａｓ突然変異腫瘍特異的腫瘍抑制効率を高めることを可能にする。
すなわち、本発明は、腫瘍特異的細胞質浸透が可能であり、細胞質浸透後に高い親和度で細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに結合してＲａｓの活性を抑制する完全なイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を開発する。
前記抗体は、完全イムノグロブリン形態の抗体及びその切片であり得る。
前記抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化された抗体であり得る。
本発明に係る抗体の重鎖可変領域は、下記一般式１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、一般式２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び一般式３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３で構成される。
（一般式１） Ｄ−Ｘ１１−ＳＭＳ
前記一般式１で、Ｘ１１はＦ又はＹであり、
（一般式２） ＹＩＳＲＴＳＨＴ−Ｘ２１−Ｘ２２−ＹＡＤＳＶＫＧ
前記一般式２で、Ｘ２１はＴ、Ｉ又はＬであり、Ｘ２２はＹ、Ｃ、Ｓ、Ｌ又はＡであり、
（一般式３） Ｇ−Ｆ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｙ
前記一般式３で、Ｘ３１はＫ、Ｆ、Ｒ又はＮであり、Ｘ３２はＭ又はＬであり、Ｘ３３はＤ又はＮである。
具体的に、本発明の一態様において、前記重鎖可変領域に含まれたＣＤＲを規定する一般式１のＸ１１は、Ｆ又はＹであり、一般式２のＸ２１−Ｘ２２は、ＴＹ、ＩＹ、ＴＣ、ＴＳ、ＩＳ、ＬＣ、ＬＬ又はＩＡであり、一般式３のＸ３１−Ｘ３２−Ｘ３３は、ＫＭＤ、ＲＭＤ、ＦＭＮ、ＲＬＤ又はＮＬＤである。
具体的に、本発明の一態様において、前記細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上重鎖可変領域は、配列番号２０〜３２からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる配列である。
前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列情報は、下記の通りである。
Figure 2021509020
前記細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖可変領域は、ＣＤＲ１配列は配列番号２〜４のアミノ酸配列からなる群から選ばれ、前記ＣＤＲ２配列は配列番号５及び配列番号１０〜１６のアミノ酸配列からなる群から選ばれ、前記ＣＤＲ３配列は配列番号６〜９及び配列番号１７〜１８のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする。
前記ＣＤＲの配列情報は下記の通りである。
Figure 2021509020
ただし、本明細書で提供するＣＤＲを規定する一般式１、２及び３に含まれたＸ１１、Ｘ２１−Ｘ２２、Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３と重鎖定常領域以外の配列番号に明示された全てのアミノ酸番号はＫａｂａｔ番号を使用した（Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
また、本発明の一態様は、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与え、ＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域を提示し、これは、配列番号３４〜４３及び配列番号４４〜６０からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなり得る。
前記目的の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列情報は、下記の通りである。
Figure 2021509020
Figure 2021509020
また、本発明の一態様において、腫瘍組織標的能向上のために改良された重鎖可変領域は、配列番号６１〜６３からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる配列である。
前記重鎖可変領域（ＶＨ）の配列情報は、下記の通りである。
Figure 2021509020
また、本発明の一態様は、前記腫瘍組織特異的細胞質浸透抗体の細胞内安定性を向上させ、長い半減期を与えるための重鎖定常領域は、配列番号６５〜６９からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる配列である。
前記目的の重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）の配列情報は、下記の通りである。
Figure 2021509020
Figure 2021509020
また、本発明の一態様は、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合する重鎖可変領域の親和度改良のためのライブラリー構築方法を提供する。
前記方法は、
（１）ライブラリー鋳型であるＲＴ１１重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合に関与する３個の相補性結合部位（ＣＤＲ）のうち、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに結合する可能性が高いアミノ酸座位を選定する段階；
（２）前記選定したアミノ酸座位に、ライブラリーに含めようとするアミノ酸をコードできるデジェネレートコドン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｄｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）をデザインする段階；及び
（３）前記デザインした重鎖可変領域ライブラリーを酵母表面発現システムを用いてｓｃＦａｂ又はＦａｂの形態で発現させる段階を含む。
また、本発明の一態様は、次の段階を含む、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域のスクリーニング方法を提供する。
前記方法は、
（１）Ｒａｓ・ＧＴＰに結合できる重鎖可変領域ライブラリーを酵母表面発現システムを用いて発現させる段階；
（２）ビオチン化（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）時に変形を克服し、安定した形態でＧＴＰ類似体であるＧｐｐＮＨｐと結合した形態のＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ構築及び発現段階；
（３）ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄと前記ライブラリーを結合させる段階；及び
（４）前記ＧｐｐＮＨｐが結合されたＲａｓと前記ライブラリー結合の親和度を測定する段階を含む。
また、本発明の一態様は、前記抗体にタンパク質、ペプチド、小分子薬物、毒素、酵素、核酸又はナノ粒子からなる群から選ばれるいずれか一つ以上と融合された完全な形態のイムノグロブリン抗体を提供する。
前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、信号（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜横断（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（Ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（Ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体、又は化学的に改質されたタンパク質などであり得る。
本発明において小分子薬物は約１０００ダルトン未満の分子量を有し、疾病の治療剤として活性度を持つ有機化合物、無機化合物又は有機金属化合物を表すものであり、本願で広範囲に使用される。本願において小分子薬物は、オリゴペプチド及び約１０００ダルトン未満の分子量を持つその他のバイオ分子（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
本発明において、ナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、直径１〜１０００ｎｍサイズを有する物質からなる粒子を意味し、前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コア及び該コアを囲む金属シェルで構成される金属／金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コア及び該コアを囲む非金属シェルで構成される金属／非金属コアシェル、又は非金属ナノ粒子コア及び該コアを囲む金属シェルで構成される非金属／金属コアシェル複合体であり得る。一具体例によれば、前記金属は、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄及びその酸化物から選択されるものであり得るが、これに限定されず、前記非金属は、シリカ、ポリスチレン、ラテックス及びアクリレート系の物質から選択されるものであってもよいが、これに限定されない。
本発明において“融合”は、機能又は構造が異なるか同一である２分子を一体化することであり、前記タンパク質、小分子薬物、核酸、又はナノ粒子に前記腫瘍特異的細胞質浸透抗体が結合できる全ての物理、化学的又は生物学的方法による融合であり得る。前記融合は、好ましくは連結子ペプチドによることができ、この連結子ペプチドは本発明の抗体軽鎖可変領域、抗体、又はその切片の様々な位置で前記生体活性分子との融合を中継できる。
また、本発明は、前記抗体、又はこれに融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸及びナノ粒子からなる群から選ばれる生体活性分子を含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明に係る抗体、又はそれに融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸、ナノ粒子からなる群から選ばれる生体活性分子を用いて、ヒト抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の有する抗原高特異性及び高親和度に影響を与えることなく細胞内部に浸透して細胞質に残留する特性を与えることができ、これによって、現在、小分子薬物を用いた疾病治療において標的物質として分類されている細胞質内に存在しながら、タンパク質とタンパク質との間に広くて平たい表面を介して構造複合性相互作用をなす腫瘍及び疾患関連因子に対する治療及び診断への高い効果が期待できる。
本発明の一態様では、前記抗体を用いて癌又は腫瘍細胞の成長を抑制させる方法及び癌又は腫瘍を治療する方法を提供する。
前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚又は眼内黒色腫、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、膠芽腫、頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及び頭頸部癌からなる群から選ばれるものであり得る。
前記組成物が癌の予防又は治療用薬学的組成物として製造される場合、前記組成物は薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分の他にも、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
前記癌の予防又は治療用薬学的組成物は経口又は非経口で投与できる。非経口投与では、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与では、タンパク質又はペプチドが消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃での分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与され得る。
前記癌の予防又は治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、***速度及び反応感応性のような諸要因によって様々に処方され得る。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。用語“薬学的有効量”は、癌の予防又は治療に又は血管新生による疾患の予防又は治療に十分な量を意味する。
前記組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量形態で製造してもよく、多用量容器内に内入して製造してもよい。この時、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤として投与されてもよく、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与され得る。一方、前記組成物は抗体又は抗原結合断片を含むので、免疫リポソームとして剤形化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造され得る。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であり、逆相蒸発法によって製造され得る。例えば、抗体のＦａｂ’断片はジスルフィド−交替反応によってリポソームに接合され得る。ドキソルビシンのような化学治療剤がさらにリポソーム内に含まれ得る。
また、本発明は、前記抗体、又はそれに融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、核酸及びナノ粒子からなる群から選ばれる生体活性分子を含む癌の診断用組成物を提供する。
本明細書で使われた用語“診断”は、病態生理の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明における診断は、癌の発病有無及び経過を確認することである。
前記完全なイムノグロブリン形態の抗体及びその切片は、画像から癌を診断するために分子画像用蛍光体と結合し得る。
前記分子画像用蛍光体は、蛍光を発生させる全ての物質を指し、赤色や近赤外線（Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）の蛍光を発光することが好ましく、量子収率（Ｑｕａｎｔａｕｍ ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光体がより好ましいが、これに限定されない。
前記分子画像用蛍光体は、前記完全なイムノグロブリン形態の抗体及びその切片に特異的に結合する腫瘍侵透性ペプチドと結合できる蛍光体、蛍光タンパク質又はその他画像用物質が好ましいが、これに限定されない。
蛍光体は、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＹＰＹ）、テトラメチルローダミン（Ｔｒｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロフィコシアニン（Ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）又はそれらの誘導体が好ましいが、これに限定されない。
蛍光タンパク質はドロンパ（Ｄｒｏｎｐａ）タンパク質、蛍光発色遺伝子（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光プロテイン（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲＦＰ）、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５．５又はその他蛍光タンパク質が好ましいが、これに限定されない。
その他画像用物質は、酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいが、これに限定されず、ＭＲ、ＰＥＴのような画像装備に応用され得る。
また、本発明は、前記細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）及び前記腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えた軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
前記“ポリヌクレオチド（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）”は、一本鎖又は二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びこれから転写されるＲＮＡ配列を包括し、特に言及しない限り、天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
前記ポリヌクレオチドは、前記述べた細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）、前記腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えた軽鎖可変領域（ＶＬ）及び細胞内安定性及び長い半減期を与えるための重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−Ｃｈ３）をコードするヌクレオチド配列の他に、その配列に相補的な（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は、完璧に相補的な配列だけでなく、実質的に相補的な配列も含む。これは、当業界に公知された苛酷条件（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、例えば、配列番号２０〜６９のいずれか一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と混成化可能な配列を意味する。
また、前記ポリヌクレオチドは修飾されてもよい。前記修飾は、ヌクレオチドの追加、欠失又は非保存的置換又は保存的置換を含む。前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性又は少なくとも９５％の相同性を示す配列であり得る。
本発明の具体例において、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上の重鎖可変領域及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能付与の軽鎖可変領域を用いた、細胞内部に浸透して細胞質に分布する完全イムノグロブリン形態の抗体製造方法の例は、下記の通りである。
（１）前記ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）及びヒト重鎖定常領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた重鎖において重鎖可変領域（ＶＨ）が細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度の向上したヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）に置換された核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングしたエンドソーム脱出重鎖発現ベクターを製造する段階；
（２）前記ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）及びヒト軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖において軽鎖可変領域（ＶＬ）が細胞質に浸透するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能付与のヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）に置換された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングした細胞質浸透軽鎖発現ベクターを製造する段階；
（３）前記製造された重鎖、軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上したヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えたヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む完全なイムノグロブリン形態の抗体を発現させる段階；及び
（４）前記発現した完全なイムノグロブリン形態の抗体を精製及び回収する段階。
前記方法は、重鎖を発現させるベクターと軽鎖を発現させるベクターを発現させて、腫瘍組織特異的に細胞内部に浸透して細胞質に分布し、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを高い親和度で標的できる抗体を発現させることができる。ベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現させるベクターシステム、又はそれぞれ別のベクターで発現させるシステムのいずれであってもよい。後者の場合、２のベクターは同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）及び標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって宿主細胞に導入され得る。
前記組換えベクターにおいて、本発明で提供する軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）はプロモーターに作動的に連結され得る。用語“作動的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。したがって、これによって、前記調節配列は前記他のヌクレオチド配列の転写及び／又は解読を調節することができる。
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築され得る。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物又は微生物において外来のタンパク質を発現させるために用いられる通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知の様々な方法によって構築され得る。
前記組換えベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主にして構築できる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリポソーム結合座位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点及びＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されない。また、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられてもよく、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
本発明のさらに他の態様は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することができる。
宿主細胞は当業界に公知のいかなる宿主細胞も利用でき、原核細胞には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルスサブチリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラティフィムリウム、セラチアマルセッセンス及び様々なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株などが用いられ得る。
本発明のさらに他の態様は、前記宿主細胞を培養する段階を含む、腫瘍組織特異的に細胞内部に浸透し細胞質に分布して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを高い親和度で標的できる完全なイムノグロブリン形態の抗体製造方法を提供することができる。
前記組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界に広く知られた挿入方法を用いることができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法又は電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法及び遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を用いる場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）問題によってインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には適さないが、Ｆａｂ及びＦｖのような抗原結合断片の生産には使用可能である。
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当業界に広く知られた方法によって容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれた培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
図１は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上のためにＲＴ１１の重鎖可変領域に基づいて構築されたライブラリーの選別及び構築戦略を示す模式図である。
図２Ａは、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）とＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いた選別過程によってＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐへの特異的富化（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を確認するために各段階別ライブラリー発現酵母に対して１０ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１０００ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。 図２Ｂは、最終選別されたライブラリーのうち、それぞれ４７個の個別クローンを発現させる酵母に対して５ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐとの結合能を流細胞分析機で分析した結果である。
図３Ａは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＲＴ１１基盤Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｉ３）構築を説明した模式図である。 図３Ｂは、ＲＴ１１基盤親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれ１、１０、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ及び１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図３Ｃは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを１μＭ濃度で３７℃で１２時間処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
図４は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上のためにＲＴ２２の重鎖可変領域に基づいて構築されたライブラリーの選別及び構築戦略を示す模式図である。
図５Ａは、ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＶＨ）をインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）と組み合わせた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ精製後、還元性又は非還元性条件で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。 図５Ｂは、前記ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＲＴ３１ ＶＨ、ＲＴ３３ ＶＨ、ＲＴ３４ ＶＨ）とインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）を組み合わせた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれの抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂと１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図５Ｃは、前記ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＲＴ３１ ＶＨ、ＲＴ３６ ＶＨ、ＲＴ３７ ＶＨ）とインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれの抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂと１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
図６は、インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｉ３３、ＲＴ２２−ｅｐ３３）の構築を説明した模式図である。
図７は、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−３３（１μＭ）、ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ（０．５μＭ）、ＲＴ２２−ｅｐ３３ ＭＧ（１μＭ））及び対照群細胞質浸透抗体（ＣＴ−３３（１μＭ）、ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ（０．５μＭ）、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧ（１μＭ））を処理後に、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
図８Ａは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能及び細胞質浸透能が減少或いは除去されたかどうかを、抗体１μＭ濃度で３７℃で６時間ＨｅＬａ細胞に処理して共焦点顕微鏡で確認した結果及びＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。 図８Ｂは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、ＨＳＰＧを発現させるＨｅＬａ細胞株で非特異的細胞表面結合ＥＬＩＳＡを行った結果である。 図８Ｃは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、抗体５００ｎＭをＨｅＬａ細胞株で処理した後に流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
図９Ａは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３ ＭＧ〜ｈＴ４−ｉ３７ ＭＧ ＶＬ）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図９Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３８ ＭＧ〜ｈＴ４−ｉ３９ ＭＧ ＶＬ）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体の１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図９Ｃは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体を１μＭ濃度で３７℃で１２時間処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
図１０Ａは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びｈＴ４−３８とｈＴ４−３９基盤生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖（ｈＴ４−５８、ｈＴ４−５９）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体の１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図１０Ｂは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びｈＴ４−３８とｈＴ４−３９基盤生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖（ｈＴ４−５８，ｈＴ４−５９）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体を１μＭ濃度で３７℃で１２時間処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
図１１Ａは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能及び細胞質浸透能が減少或いは除去されたかどうかを、抗体１μＭを３７℃で６時間ＨｅＬａ細胞に処理して共焦点顕微鏡で確認した結果及びＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。 図１１Ｂは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、ＨＳＰＧを発現させるＨｅＬａ細胞株で非特異的細胞表面結合ＥＬＩＳＡを行った結果である。 図１１Ｃは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、抗体５００ｎＭをＨｅＬａ細胞株で処理した後に流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
図１２Ａは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０とＬｏＶｏそしてヒト血液癌細胞株Ｋ５６２とＫ５６２インテグリンανβ３発現細胞株においてインテグリンανβ３又はインテグリンανβ５の発現をＦＡＣＳで確認した実験結果である。 図１２Ｂは、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖（ＲＴ２２）を含むＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）と既存腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ１１−ｉ）の細胞表面インテグリンανβ３又はインテグリンανβ５への結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。 図１２Ｃは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０とＬｏＶｏそしてヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａにおいてＥｐＣＡＭの発現をＦＡＣＳで確認した実験結果である。 図１２Ｄは、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖（ＲＴ２２）を含むＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の細胞表面ＥｐＣＡＭへの結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
図１３Ａは、様々なＲａｓ突然変異及び野生型細胞株において、インテグリン標的原形ペプチド融合及び生産収率向上とＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ０．５μＭを３７℃で４８時間処理した後、細胞成長抑制能をＷＳＴアッセイで確認したグラフである。 図１３Ｂは、様々なＲａｓ突然変異及び野生型細胞株において、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及び生産収率向上とＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ １μＭを３７℃で４８時間処理した後、細胞成長抑制能をＷＳＴアッセイで確認したグラフである。
図１４Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏとＳＷ４８０を異種移植したネズミにおいて、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）と既存インテグリン標的原形ペプチドが融合された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ１１−ｉ）の腫瘍成長抑制効果を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射、２日間隔で総９回投与して比較した実験結果である。 図１４Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフである。 図１４Ｃは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
図１５Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏとＳＷ４８０を異種移植したネズミにおいてＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の腫瘍成長抑制効果を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射、２日間隔で総９回投与して比較した実験結果である。 図１５Ｂは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフである。 図１５Ｃは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
図１６Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏを異種移植したネズミにおいてインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）の投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。 図１６Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフである。 図１６Ｃは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
図１７Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏを異種移植したネズミにおいてＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。 図１７Ｂは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフである。 図１７Ｃは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
図１８Ａは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内分解減少を、改善された分割緑色蛍光タンパク質相補システムを用いて確認した結果である。 図１８Ｂは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能を、軟寒天コロニー形成（ｓｏｆｔ ａｇａｒ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法で確認した結果である。 図１８Ｃは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）方法で確認した結果である。 図１８Ｄは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト肺癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス方法で確認した結果である。
図１９Ａは、体内持続性を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰの精製後、還元性又は非還元性条件で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。 図１９Ｂは、体内持続性を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰの薬動学をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで確認した結果である。
図２０Ａは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの細胞表面ＥｐＣＡＭへの結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。 図２０Ｂは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。 図２０Ｃは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス方法により確認した結果である。 図２０Ｄは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの生体分布をマウスで確認し、腫瘍と身体全体の蛍光を定量してグラフで示す結果である。 図２０Ｅは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの生体分布をマウスで確認し、臓器を摘出して蛍光を定量してグラフで示す結果である。
図２１Ａは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の多量体有無をサイズ排除クロマトグラフィーで確認した結果である。 図２１Ｂは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の薬動学をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで確認した結果である。
図２２Ａは、腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の多量体有無をサイズ排除クロマトグラフィーで確認した結果である。 図２２Ｂは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬＳ１０３４を異種移植したネズミにおいて腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。 図２２Ｃは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＳＷ４０３を異種移植したネズミにおいて腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。しかし、それらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質の準備
ライブラリー選別に使用するためにＡｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）がＮ−ｔｅｒｍに融合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原を構築した。これは、ライブラリー選別時に抗原ビオチン化過程で問題になり得る構造的変性を最小化するための目的で構築された。
具体的には、ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質でＣ−末端部分高多様性部位（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を除く触媒（ｃａｔａｌｙｔｉｃ）Ｇドメイン（１番〜１６９番残基）とＮ−末端に８Ｘ ｈｉｓタグ及びＡｖｉタグをＧＳＧリンカーを用いて融合された形態のＤＮＡをＰＣＲ技法で構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現用ベクターであるｐＥＴ２３ベクターに制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングした。その後、構築されたｐＥＴ２３−８Ｘｈｉｓ−Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ（１〜１６９）ベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏビオチン化可能に、ビオチンリガーゼであるＢｉｒＡをコードするベクター（ｐＢｉｒＡｃｍ）と同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＥに電気穿孔法を用いて形質転換して１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールが含まれた選択培地で選別した。選別された大腸菌を５ｍＭ ＭｇＣｌ２が含まれた前記選択培地（ＬＢＣＡ）上で３７℃条件で６００ｎｍにおける吸光度０．６まで培養後、タンパク質発現のために０．５ｍＭ ＩＰＴＧとｉｎ ｖｉｖｏビオチン化のために５０μＭ ｄ−ビオチンを添加した後、３０℃で４時間さらに培養した。５０μＭ ｄ−ビオチン添加のための保存溶液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、１０ｍＭビシン（ｂｉｃｉｎ）、ｐＨ８．３バッファー１０ｍｌに１２ｍｇ ｄ−ビオチン添加によって作る。大腸菌培養後に遠心分離機を用いて、集めた大腸菌を２０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ β−ＭＥバッファーで再浮游し、超音波を用いて（ＳＯＮＩＣＳ）大腸菌を粉砕した。遠心分離機を用いて大腸菌粉砕物を除去した上澄液だけを得、Ｈｉｓタグが融合されたタンパク質を特異的に精製するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を洗浄するために洗浄バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２ｍＭ β−ＭＥ）で５０ｍｌ洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２ｍＭ β−ＭＥ）を用いてタンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質は透析方法を用いて貯蔵バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）にバッファーを替えた。精製されたタンパク質は２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を用いて定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって約９８％以上の純度を確認した。
ゲルシフト（Ｇｅｌ ｓｈｉｆｔ）分析法を用いて、精製されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質がｉｎ ｖｉｖｏビオチン化反応によって高い収率でＡｖｉタグとビオチンが結合したことを確認した。具体的に、Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１％ ＳＤＳ、１０％グリセロール、１７５ｍＭ β−ＭＥ）で希釈して１０分間反応及び１μｇのストレプトアビジンと３０分間常温で反応し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、ＨＲＰの融合されているａｎｔｉ−Ｈｉｓ抗体を用いて確認した。
Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質をＧＴＰ類似体（ＧｐｐＮＨｐ）又はＧＤＰと反応後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。具体的に、ＧＴＰ類似体（ＧｐｐＮＨＰ）とＲａｓタンパク質の複合体を形成するために、精製されたＲａｓタンパク質を基質交換バッファー（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０μＭ ＺｎＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ）に希釈し、Ｒａｓタンパク質に比して１０倍以上のモル数を有するＧｐｐＮＨｐとＲａｓタンパク質ｍｇ当たり２ユニットのビーズと融合されたアルカリホスファターゼを添加して１時間室温で反応させる。ＧＤＰとＲａｓタンパク質の複合体を形成するためには、Ｒａｓタンパク質に比して２０倍以上のモル数を有するＧＤＰと２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した条件で３０℃で３０分間反応させ、その後、６０ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加して４℃で３０分間維持して反応を止めた。前記方法によってＧｐｐＮＨｐ又はＧＤＰが結合されたＲａｓタンパク質を、ＰＤ１０ ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを用いて貯蔵バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２）に交換した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析する。長時間保管のために基質と結合されたＲａｓタンパク質は−８０℃で保管する。
前記方法によって準備されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質とＡｖｉタグのない状態のＨｉｓ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質とのＲＴ１１結合能を分析するためにＥＬＩＳＡを実施した。具体的に、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ）のそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１０分間３回洗浄する。４％ ＴＢＳＢ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１時間結合した後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。その後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質とＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質を４％ ＴＢＳＢで希釈して１００ｎＭの濃度で常温で１時間結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させ、４５０ｎｍ吸光度を定量した。
前記実験から、Ａｖｉタグが融合されたＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質がＲＴ１１親和度改良ライブラリー選別に使用可能であることを確認した。
実施例２．抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１基盤高多様性抗体ライブラリー構築及びＲａｓ・ＧＴＰに特異的な親和度が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）選別
既存特許（登録番号：１０−１６０２８７６）おいて抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の場合、Ｒａｓ・ＧＴＰに高特異的に結合し、様々なＲａｓ突然変異細胞株で生物学的活性を示すが、Ｒａｓ・ＧＴＰに対して約１２ｎＭレベルの親和度を示し、これは、ＩｇＧフォーマットの様々な抗体の親和度と比較した時、低い親和度である。また、Ｒａｓ・ＧＴＰとエフェクタータンパク質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）間の結合阻害によって生物学的活性を示す抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１の場合、Ｒａｓ・ＧＴＰとの親和度向上によって、向上した生物学的活性を誘導することができる。そこで、本発明者は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの治療効率を高めるために、組織特異性を与えるための軽鎖可変領域改良とは別に、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１のＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度をさらに高めようとした。
ＲＴ１１ベースの親和度が向上したＲａｓ・ＧＴＰ特異的重鎖可変領域を選別過程で使用した軽鎖可変領域は、エンドソーム脱出能が向上したｈＴ４−３軽鎖可変領域であり、これは、既存特許（登録番号：１０−１６０２８７６）で使用された細胞質浸透ｈＴ４軽鎖可変領域（ＶＬ）の９２〜９４番残基にＷＹＷ（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ）が位置するＣＤＲ３を導入し、ＷＹＷ導入によって疎水性残基が溶媒露出程度が高くなるに従って生産収率が低くなることを克服するために、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）のインターフェースに該当する軽鎖可変領域骨格部位（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）８７番残基をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した突然変異である（出願番号：１０−２０１６−００６５３６５）。
図１は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上のために、ＲＴ１１の重鎖可変領域に基づいて構築されたライブラリーの選別及び構築戦略を示す模式図である。
ホモロジーモデリング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）及びドッキング（ｄｏｃｋｉｎｇ）プログラムを用いてＲａｓ・ＧＴＰとＲＴ１１抗体間の結合構造を予測し、これによって、抗原結合に重要な役割を担うと予測されるＣＤＲ及び周辺地域に無作為的な突然変異を導入した。
具体的に、ＣＤＲ１（３１番〜３３番）及びＣＤＲ２（５２番〜５６番）の残基を、前記予測された結合構造において適切なアミノ酸配列を含み得るデジェネレートコドン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｄｏｎ）を使用し、それぞれ、デジェネレートコドンはＣＤＲ１（３１番〜３３番）から順次にＲＮＣ、ＴＨＣ、ＫＳＧを使用し、ＣＤＲ２（５２番〜５６番）は順次にＡＳＣ、ＭＲＡ、ＡＳＣ、ＡＳＣ、ＣＲＣ、ＷＭＣを使用した。ＣＤＲ３周辺骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）９４番残基はＣＤＲ構造に影響を与え得る位置の残基であるから、生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体配列にあるＡｒｇ、ＬｙｓをコードできるＡＲＧデジェネレートコドンを使用した。ＣＤＲ３（９５番〜９７番）の残基は、ＲＴ１１の配列を５０％確率で保存できるスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）オリゴマーを使用した。これは、それぞれ残基に対するアミノ酸をコードする３個ヌクレオチドにおいてそれぞれ野生型ヌクレオチドを７９％維持し、残りのヌクレオチド比率を７％にしてプライマをデザインすることによって、ＰＣＲ過程で野生型アミノ酸が５０％と維持されるようにする技術である。ＣＤＲ３（１００ａ番）残基は、ＶＨ／ＶＬ結合に重要な残基であり、ＲＴ１１抗体のＭｅｔを含めて生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体配列にあるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕを含み得るＷＴＫデジェネレートコドンを使用した。
具体的に、親和度改良ライブラリーに使用した軽鎖可変領域は、細胞質浸透能が向上したｈＴ４−３ＶＬを使用した。
具体的に、デザインされたライブラリーをコードするＤＮＡは、ＰＣＲ技法を用いて増幅後、エタノール沈殿法を用いて濃縮した。相同性接合（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のためのｃ−末端にａｇａ２タンパク質が発現する酵母表面発現ベクター（Ｃ−ａｇａ２）は、ＮｈｅＩとＭｌｕＩ制限酵素を処理してアガロースゲル抽出法を用いて精製、及びエタノール沈殿法を用いて濃縮した。それぞれライブラリーコードＤＮＡ１２μｇに対して制限酵素処理された５μｇベクターを酵母表面発現用酵母ＥＢＹ１００に電気穿孔法で形質転換し（Ｂａｅｋ Ｄ．Ｓ ａｎｄ Ｋｉｍ Ｙ．Ｓ，２０１４）、階段式希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって選択培地ＳＤ−ＣＡＡ（２０ｇ／Ｌグルコース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸）に育ったコロニーの数を測定してライブラリーサイズを確認した。
実施例３．ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄへの親和度が改良された重鎖可変領域（ＶＨ）の選別
ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄを抗原として用いて前記実施例２で構築されたＲＴ１１−３基盤親和度改良ライブラリーを選別した。
具体的に、１００ｎＭレベルの精製されたＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄを、ＳＧ−ＣＡＡ（２０ｇ／Ｌラクトース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸）培地を用いて細胞表面に単一鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）形態の重鎖可変領域ライブラリー発現を誘導した酵母と常温で１時間反応させた。その後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄと結合されたライブラリーを発現させる酵母をストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）ＭｉｃｒｏｂｅａｄＴＭ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と４℃で２０分間反応させた後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに高親和度を有する重鎖可変領域を発現させる酵母を富化した。選別されたライブラリーを発現させる酵母を選択培地で培養ＳＤ−ＣＡＡ（２０ｇ／Ｌグルコース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸）及びＳＧ−ＣＡＡ培地でライブラリー発現を誘導した後、１次ＦＡＣＳスクリーニングのためにＧｐｐＮＨＰが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとｉｎ ｖｉｖｉｏビオチン化されないＧＤＰが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原を１：１０比率で競合的にライブラリーが発現した酵母と１時間常温で反応させた後、ＰＥが接合されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＳＡ−ＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応してＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｅｒ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で富化した。その後、同一方法により、１０ｎＭのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原とｉｎ ｖｉｖｏビオチン化されなかったＧＤＰが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原の比率を１：１００にして２次ＦＡＣＳスクリーニングをし、その後、１ｎＭのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原とｉｎ ｖｉｖｏビオチン化されなかったＧＤＰが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原の比率１：１００条件で３次ＦＡＣＳスクリーニングを行った。
図２Ａは、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）とＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いた選別過程によってＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐに特異的富化（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を確認するために、各段階別ライブラリー発現酵母に対して１０ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１０００ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰと結合能を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。これは、超高速選別過程により、ＲＴ１１−３と比較して重鎖可変領域（ＶＨ）依存的にＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する高い親和度を有するクローンが選別されることを確認した。
図２Ｂは、最終選別されたライブラリーのうち、それぞれ４７個の個別クローンを発現させる酵母に対して５ｎＭ Ａｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐとの結合能を流細胞分析機で分析した結果である。
上記のような個別クローン結合能分析によって、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに高親和度及び特異性を有する６個のユニークなクローン（ＲＴ２１、ＲＴ２２、ＲＴ２３、ＲＴ２４、ＲＴ２５、ＲＴ２６）を選別した。
下記表１は、選別されたＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに高い結合能を示す６個の個別クローンの重鎖可変領域配列であり、表２は、表１の重鎖可変領域のＣＤＲ配列である。
Figure 2021509020
Figure 2021509020
実施例４．親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ抗原結合能分析
前記重鎖可変領域突然変異が導入された細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を構築するためにＲＴ１１ベースでＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度が改良された重鎖可変領域と重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた重鎖を動物発現ベクターにクローニングし、新生血管細胞及び様々な腫瘍で過発現するインテグリン（インテグリンαｖβ３及びαｖβ５）に特異性を有するＲＧＤ１０原形ペプチドを細胞質浸透ヒト化軽鎖ｈＴ４−３軽鎖のＮ−末端にＧＧＧＧＳの２個のリンカーを用いて遺伝工学的に融合して動物発現ベクターにクローニングした。ＲＧＤ１０原形ペプチドの場合、ＲＧＤ４Ｃ原形ペプチドと類似の親和度を有するが、２つのシステインによる１つの二硫化結合だけが存在し、遺伝工学的融合が可能であるという特徴がある。上のＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度が改良された重鎖発現ベクターとＲＧＤ１０原形ペプチドが融合された細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクター（ｈＴ４−ｉ３ＬＣ）をＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、親和度の改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ突然変異を発現させた。
具体的には、完全なイムノグロブリン形態の細胞質浸透抗体を生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合されたＲＴ１１に基づいて親和度が改良された前記重鎖可変領域突然変異が導入され、重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。前記重鎖発現ベクターと以前細胞質浸透抗体の軽鎖（出願番号：１０−２０１６−００６５３６５）を一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてタンパク質を発現及び精製し、収率を比較した。振蕩フラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で浮遊成長するＨＥＫ２９３Ｆ細胞をプラスミド及びポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）の混合物でトランスフェクションした。振蕩フラスコに２００ｍＬトランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種し、１２０ｒｐｍ、８％ ＣＯ２、３７℃で培養した。抗体を生産するために、適切な重鎖と軽鎖プラスミドを、１０ｍｌ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの総２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈及びフィルターし、ＰＥＩ ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合した後、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を、前に１００ｍｌで播種した細胞に入れて４時間１２０ｒｐｍ、８％ ＣＯ２で培養後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）に抗体を適用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いてｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１Ｍトリス緩衝液を用いてサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は透析方法によってＰＢＳ（ｐＨ６．５）に緩衝液を交換しつつ濃縮を進行した。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を用いて定量した。
図３Ａは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＲＴ１１基盤Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｉ３）構築を説明した模式図である。
図３Ｂは、ＲＴ１１基盤親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれ１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐと１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１−ｉとＲＧＤ原形ペプチドが融合された６種の親和度向上ｉＭａｂを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートのそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１０分間３回洗浄する。その後、４％ ＴＢＳＢ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質とＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質を４％ＴＢＳＢで希釈し、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度で常温で１時間結合させた後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
前記ＥＬＩＳＡ分析から、既存ＲＴ１１−ｉ３と比較して、選別された６種の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂがより高い抗原結合能を示すことを確認した。
図３Ｃは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
具体的に、２４ウェルプレートにＳＷ４８０細胞株をそれぞれウェル当たり２×１０４個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した後、ＴＭａｂ４−ｉ、ＲＴ１１−ｉと６種の親和度が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ １μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジ化ナトリウム、１％ ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。また、ＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するためにＰＢＳに２％ ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。各抗体は、Ａｌｅｘａ−４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、ＫＲａｓ標識抗体を染色（赤色蛍光）共焦点顕微鏡で観察した。ＴＭａｂ４−ｉ３以外の全ての抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、細胞内Ｒａｓと蛍光が重なることを確認した。
このうち、細胞内活性化されたＲａｓとの結合能を示し、ＥＬＩＳＡ実験進行時にＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐと最高の結合能を示すＲＴ２２−ｉ３ｉＭａｂに対して、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する結合力をより定量的に分析するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）をＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を用いて行った。
具体的には、ＲＴ２２−ｉ３を１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１８００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐ結合ＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ完全体に対して５０ｎＭで３．１２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して行った。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
表３は、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００）を用いてＧｐｐＮＨｐが結合された完全体形態のＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１−ｉとＲＴ２２−ｉ３の親和度分析結果を示す。
Figure 2021509020
実施例５．ＲＴ２２重鎖可変領域（ＶＨ）基盤追加親和度改良のためのライブラリー構築及び選別
Ｒａｓ・ＧＴＰに対する結合能が向上した重鎖可変領域（ＲＴ２２ＶＨ）が含まれた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｉ３）は、約１．４ｎＭレベルの高い親和度を示す。しかし、これは、細胞膜受容体であるＨＳＰＧと結合が維持されている軽鎖可変領域（ｈＴ４−３ＶＬ）との組合せによって選別された。ＨＳＰＧは大部分の組織に発現しているため、組織特異性を与えるためにＨＳＰＧとの結合を減少させるＣＤＲ１、ＣＤＲ２に生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）抗体配列を導入した軽鎖可変領域を構築し、この軽鎖可変領域を用いて構築された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂでＲＧＤ原形ペプチド融合時、深刻な生産収率減少を確認した。これによって、組織特異性がある軽鎖可変領域と結合した形態で重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲを改良して、親和度及び生産収率減少の問題を克服しようとした。
ＨＳＰＧとの結合が減少し、組織特異性が与えられた軽鎖可変領域の詳細は後述する。
図４は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＲａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上のためにＲＴ２２の重鎖可変領域に基づいて構築されたライブラリーの選別及び構築戦略を示す模式図である。
親和度を改良するためにＧａｌａｘｙモデリングを用いて３次元構造モデルを分析し、これに基づいて抗原結合に重要な影響を与えると考えられるＣＤＲ２（５５番〜５８番）とＣＤＲ３（９５番、９７番、１００ａ番）に突然変異をかけた。
具体的に、ＣＤＲ２の５５番残基には既存アミノ酸配列が１６．６７％確率で維持されながら、親水性を有するか、陰電荷を有するアミノ酸が来るようにデジェネレーションコドン（ＶＲＣ）を使用し、５７番残基には既存アミノ酸配列を２５％確率で維持しながら、側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）のサイズと方向を考慮したとき、抗原との親和度を高め得るようにデジェネレーションコドン（ＭＹＴ）を使用した。ＣＤＲ３の９５番残基の場合、既存アミノ酸配列が１６．６７％の確率で維持されながら、側鎖サイズ、方向を考慮して、Ｒａｓ・ＧＴＰと結合能を保存又は向上させ得るようにデジェネレーションコドン（ＶＳＴ）を使用したが、１００ａ残基の場合、疎水性のアミノ酸が来るようにデジェネレーションコドン（ＷＴＫ）を使用した。ＣＤＲ２の５６番、５８番残基とＣＤＲ３の９７番残基に対しては、前記実施例２で使用したのと同じスパイクされたオリゴマーを使用した。これは、既存野生型ＲＴ２２ＶＨ配列が５０％確率で維持されながら、全てのアミノ酸が適用され得る突然変異方法であり、アミノ酸をコードする３個ヌクレオチドにおいてそれぞれ野生型ヌクレオチドを７９％維持し、残りヌクレオチド比率を７％にしてプライマをデザインすることによって、ＰＣＲ過程で野生型アミノ酸が５０％と維持されるようにする技術である。
具体的には、初期ＲＴ２２に基づくライブラリーを表面に発現させる酵母とＨＳＰＧ結合能を除去した細胞質浸透軽鎖（ｈＴ４−３３ＶＬ）を分泌する酵母を酵母接合してＦａｂ形態で酵母表面に発現させた。
具体的に、重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーと接合させる細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４−３３ＶＬ）を分泌する酵母を構築するために、軽鎖可変領域酵母分泌ベクターであるｐＹＤＳ−Ｋに細胞質浸透能があり、ＨＳＰＧ結合能が減ったｈＴ４−３３ＶＬをコードするＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｉＷＩを用いてクローニングしたｐＹＤＳ−Ｋ−ｈＴ４−３３ＶＬを電気穿孔法により接合αタイプ（ｍａｔｉｎｇ α ｔｙｐｅ）の酵母接合菌株であるＹＶＨ１０菌株に形質転換して、選択培地ＳＤ−ＣＡＡ＋Ｔｒｐ（２０ｇ／Ｌグルコース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸、０．４ｍｇ／Ｌトリプトファン）（ＳＩＧＭＡ）で選別培養した酵母と酵母接合した。
具体的に酵母接合の場合、６００ｎｍで吸光度が１のとき、１Ｘ１０７の酵母がある。培養された酵母のうち、ＲＴ２２に基づく重鎖可変領域ライブラリーが発現した酵母とｈＴ４−３３ＶＬを含んでいる酵母をそれぞれ１．５Ｘ１０７ずつ混ぜ、ＹＰＤ（２０ｇ／Ｌデキストロース、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１４．７ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、４．２９ｇ／Ｌクエン酸、ｐＨ４．５）（ＳＩＧＭＡ）で３回洗浄後、ＹＰＤ１００μｌに再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）してＹＰＤプレート上に広がらないようにドロップした後に乾燥させ、６時間３０℃で培養する。その後、ＹＰＤ培地で乾燥した酵母塗抹部位を３回洗浄後、最終酵母濃度１×１０６以下になるように、選択培地ＳＤ−ＣＡＡ培地で３０℃、２４時間培養して接合された酵母だけを選別する。
実施例６．ＲＴ２２に基づいてＧＴＰが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに高特異的結合能を示す重鎖可変領域（ＶＨ）選別
前記実施例１と同じ方法でｉｎ ｖｉｖｏビオチン化させたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質にＧＴＰ類似体であるＧｐｐＮＨｐを結合させてライブラリー選別に使用した。１次ＭＡＣＳ選別のために、１００ｎＭ濃度の前記抗原を酵母表面に発現したＦａｂライブラリーと常温で１時間反応させた。その後、抗原と結合されたＦａｂライブラリーを発現させる酵母をストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）ＭｉｃｒｏｂｅａｄＴＭと４℃で２０分間反応させた後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄに高親和度を有する重鎖可変領域を発現させる酵母を富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）した。選別されたライブラリーを発現させる酵母を選択培地（ＳＤ−ＣＡＡ＋ＵＲＡ、２０ｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸、０．２ｍｇ／Ｌウラシル）で培養、及びＳＧ−ＣＡＡ＋ＵＲＡ（２０ｇ／Ｌラクトース、６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含酵母窒素原礎培地、５．４ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌカザミノ酸、０．２ｍｇ／Ｌウラシル）培地でライブラリー発現を誘導した後、１次から３次までＦＡＣＳ選別を進行した。
最終１次のＭＡＣＳと３次ＦＡＣＳ選別されたライブラリーを、前記実施例３と同じ方法でそれぞれ４７個の個別クローンを分析した結果、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄタンパク質に高親和度を有する７種の固有のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を選別した。
下記表４は、ＲＴ２２を鋳型にした前記親和度改良ライブラリーから選別された７種の固有のアミノ酸配列を有する個別クローンの重鎖可変領域（ＶＨ）配列である。
下記表５は、前記選別された重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１、２及び３の配列である。
Figure 2021509020
Figure 2021509020
実施例７．ＲＴ２２基盤親和度改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの発現、精製、及びＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄとの結合能分析
前記実施例４と同じ方法でＲＴ２２基盤ライブラリーから選別された重鎖可変領域を重鎖動物発現ベクターにクローニングし、細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクターとＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して個別クローンを発現させ、前記実施例４と同一に精製した。７種の親和度が改良された重鎖可変領域のうち、ＲＴ３２、ＲＴ３５クローンの場合、ＣＤＲ２配列にシステイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が含まれているため、ＩｇＧで精製時に単一体で存在できず、非自然的二硫化結合による二重体又はオリゴマーを形成する可能性があり、発現精製から除いた。
前記ＲＴ２２基盤親和度が向上した重鎖可変領域を、ＲＧＤ原形ペプチドが融合された形態のＨＳＰＧ結合能阻害及びＣＤＲ３にＷＹＷ突然変異導入によるエンドソーム脱出能が向上した軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３ＶＬ：配列番号３８）と組み合わせて発現させた。前記配列番号３８であるＨＳＰＧとの結合が減少し、組織特異性が与えられた軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３ＶＬ）の詳細は、後述する。
発現の結果、鋳型として使用したＲＴ２２−ｉ３３と同一に親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂも前記実施例３と同様に、Ｌ当たり１ｍｇレベルの低い生産収率を示した。
図５Ａは、ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＶＨ）をインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）と組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ精製後、還元性又は非還元性条件で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認したが、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量及び軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現精製された個別クローンが溶液状態で単一体として存在し、非自然的二硫化結合にて二重体又はオリゴマーを形成しないことを確認した。
図５Ｂは、前記ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＲＴ３１ ＶＨ、ＲＴ３３ＶＨ、ＲＴ３４ ＶＨ）とインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれの抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂと１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、実施例４と同じ方法により、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１とライブラリー鋳型として用いられたＲＴ２２−ｉ３３を対照群として使用し、ＲＧＤ原形ペプチドが融合された５種の親和度向上ｉＭａｂを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートのそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１０分間３回洗浄する。その後、４％ ＴＢＳＢ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１時間結合した後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度に、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度に４％ ＴＢＳＢで希釈して常温で１時間結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図５Ｃは、前記ＲＴ２２基盤親和度が改良された重鎖可変領域（ＲＴ３１ ＶＨ、ＲＴ３６ ＶＨ、ＲＴ３７ ＶＨ）とインテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３）が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄとの特異的結合を確認するために、それぞれの抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂと１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、実施例４と同じ方法により、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１とライブラリー鋳型として用いられたＲＴ２２−ｉ３３を対照群として使用し、ＲＧＤ原形ペプチドが融合された５種の親和度向上ｉＭａｂを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートのそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１０分間３回洗浄する。その後、４％ ＴＢＳＢ（１２ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で１時間結合した後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄する。ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度に、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度に４％ ＴＢＳＢで希釈して常温で１時間結合させた後、０．１％ ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
また、前記ＥＬＩＳＡを用いてＲＴ２２−ｉ３３よりも高い抗原結合能を示す親和度改良抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂに対して、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する定量的親和度を分析するために、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００機器を用いて分析した。
具体的には、実施例４と同じ方法により、対照群としてＲＴ２２−ｉ３３を使用し、ＲＴ３１−ｉ３３、ＲＴ３４−ｉ３３、ＲＴ３６−ｉ３３を１０ｍＭ Ｎａ−酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）に希釈して、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１６００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄを１００ｎＭから６．２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１．５分間流して施行された。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
下記表６は、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）機器を用いて、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する親和度が改良された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を分析した結果である。
Figure 2021509020
前記結果から、ＲＴ２２ＶＨ基盤親和度が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ３１−ｉ３３、ＲＴ３４−ｉ３３、ＲＴ３６−ｉ３３ともに、既存ＲＴ２２−ｉ３３に比べて高い親和度を示すことを確認した。
実施例８．腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透及びエンドソーム脱出能が向上した軽鎖可変領域（ＶＬ）開発論理
既存特許（登録番号：１０−１６０２８７０、１０−１６０２８７６）において細胞質浸透抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、既存細胞質浸透能を有する細胞質浸透抗体の重鎖可変領域を、Ｒａｓ・ＧＴＰに高特異的結合能を有する重鎖可変領域（ＶＨ）に置換して構築された。細胞質浸透抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）による細胞質浸透が可能な抗体であり、細胞表面のＨＳＰＧ（Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）との結合によって細胞浸透が始まる。しかし、ＨＳＰＧは、正常細胞においても多く発現している細胞表面タンパク質であるので、腫瘍組織特異的に細胞質浸透可能に改良するためにはＨＳＰＧ結合能を抑制する必要がある。
したがって、本研究陣は、細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）ｈＴ４ＶＬのうち、ＨＳＰＧ結合に寄与すると予想するＣＤＲ１とＣＤＲ２を、ヒト由来生殖系列配列のうち、アミノ酸個数が同一であり、細胞内在化を担当するＣＤＲ１の陽イオンパッチ配列が含まれていないアミノ酸配列を有するＣＤＲ配列に置換した。このとき、既存に軽鎖可変領域安定性に重要であると知らされたアミノ酸は保存した。
このような論理で開発された軽鎖可変領域は、ｈＴ４−０３である（出願番号：１０−２０１６−００６５３６５）。
さらにこの軽鎖可変領域のエンドソーム脱出能を向上させるために、軽鎖可変領域（ＶＬ）９２〜９４番残基にＷＹＷ（Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ）が位置するＣＤＲ３を導入し（出願番号：１０−２０１６−００６５３６５）、ＷＹＷ導入によって疎水性残基の溶媒露出程度が増加して生産収率が低くなることを克服するために、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）のインターフェースに該当する軽鎖可変領域骨格部位（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）８７番残基をフェニルアラニン（Ｐｈｅ）に置換した（出願番号：１０−２０１６−００６５３６５）。
これを、ｈＴ４−３３軽鎖可変領域（ＶＬ）と命名した。
表７は、重複型ＰＣＲ法を用いて構築した腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透及びエンドソーム脱出能が向上した軽鎖可変領域（ｈＴ４−３３ＶＬ）の配列及び名称である。
Figure 2021509020
実施例９．腫瘍組織特異的細胞表面タンパク質標的及び細胞内在化のための原形ペプチド選定
ｈＴ４ＶＬを使用した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ１１は、細胞内部に入って細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰと結合して腫瘍成長抑制能を示すが、ＨＳＰＧ結合能を有していて腫瘍組織特異性が低いという短所がある。これを克服するために、前記の実施例８でＨＳＰＧ結合能が減少した軽鎖を得、以上の実施例と同様に、インテグリン受容体を標的するためのＲＧＤ１０原形ペプチドがＮ−末端に融合された軽鎖可変領域が導入されたｉＭａｂ形態で実験した。
さらに、インテグリン標的原形ペプチドの他に、腫瘍組織特異性を与えるための様々な原形ペプチドも選定した。
ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）受容体は主に大腸癌細胞に過発現する受容体であり、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの腫瘍特異性を付与時に、適切な細胞膜に位置している標的である。そこで、ＥｐＣＡＭ受容体を標的できるＥｐ１３３原形ペプチド（ＥＨＬＨＣＬＧＳＬＣＷＰ）（出願番号：ＵＳ１４／４２８，０１７）がＮ−末端に融合された形態の軽鎖可変領域を構築した。
表８は、腫瘍組織特異的細胞表面タンパク質標的及び細胞内在化のための原形ペプチドの配列及び名称である。
Figure 2021509020
実施例１０．腫瘍組織特異的細胞質浸透のための標的原形ペプチドが融合された軽鎖可変領域（ＶＬ）導入抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの構築及び精製
図６は、インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｉ３３、ＲＴ２２−ｅｐ３３）の構築を説明した模式図である。
具体的には、原形ペプチドが融合されたｉＭａｂの動物細胞発現のために、軽鎖可変領域（ＶＬ）ｈＴ４−３３のＮ−末端にＧ４Ｓリンカー２個を用いて遺伝工学的に融合した。その後、原形ペプチド融合されたｈＴ４−３３軽鎖可変領域と軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡを、５’末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合されたｐｃＤＮＡ３．４ベクターにＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩでクローニングした。
前記実施例４と同じ方法により、ＧＴＰが結合したＲａｓと特異的結合能を示す重鎖可変領域（ＲＴ２２ＶＨ）と細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して個別クローンを発現させ、前記実施例４と同様に精製した。
表９は、腫瘍組織特異的原形ペプチドが遺伝工学的に融合された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいる抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体の生産収率を示す表である。
Figure 2021509020
インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの生産収率が１Ｌ当たり１ｍｇレベルであり、顕著に低い結果を確認した。
実施例１１．ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３３ ＭＧの細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰとの特異的結合確認
図７は、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合された腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む親和度が改良された完全なＩｇＧ形態の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−３３（１μＭ）、ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ（０．５μＭ）、ＲＴ２２−ｅｐ３３ ＭＧ（１μＭ））及び対照群細胞質浸透抗体（ＣＴ−３３（１μＭ）、ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ（０．５μＭ）、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧ（１μＭ））を処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
具体的に、実施例４と同一にＳＷ４８０細胞を準備し、ＲＴ２２−３３ １μＭ、ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ ０．５μＭ、ＲＴ２２−ｅｐ３３ ＭＧ １μＭ、ＣＴ−３３ １μＭ、ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ ０．５μＭ、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧ １μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。その後、前記実施例４と同じ条件で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。細胞内在化ができないＲＴ２２−３３を除くＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３３ ＭＧは、細胞内Ｒａｓと蛍光が重なることを確認した。また、細胞内Ｒａｓを標的しないＣＴ−３３、ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧの場合、細胞内Ｒａｓと蛍光が重ならないことを確認した。
実施例１２．腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの収率向上のための軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体デザイン
実施例１０で分析した結果の通り、既存ＨＳＰＧ結合能を示す軽鎖可変領域（ｈＴ４−３ＶＬ）に原形ペプチド融合時に生産収率が減少しなかったが、ＨＳＰＧとの結合能を減少させた軽鎖可変領域（ｈＴ４−３３ＶＬ）と原形ペプチド融合時に生産収率が減少する傾向を確認した。そこで、さらに腫瘍組織特異認識原形ペプチド（ＲＧＤ１０、Ｅｐ１３３）と融合時に生産収率を向上させるために、ＨＳＰＧ結合能に大きい影響を及ぼす軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２を改良した。
具体的に、ＨＳＰＧに対する低い結合能を維持するために、ｈＴ４ＶＬの軽鎖可変領域ＣＤＲ１のループ構造形成に影響を与えると考えられる２７ｃ番フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）残基を、ＨＳＰＧ結合能が減少した軽鎖可変領域で保存されているロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）に共通に突然変異させ、空間的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造上、ＣＤＲ１ループ構造の先端部分に位置して側鎖が露出されると予想される２７ｆ番〜３０番残基にそれぞれ突然変異を与えた。
具体的に、ｈＴ４−３４ＶＬの場合、ｈＴ４ＶＬを鋳型にして軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２のうち、ＣＤＲ１のループ構造形成に影響を与えると考えられる２７ｃ番残基だけに点突然変異を与えた。
具体的に、ｈＴ４−３５、ｈＴ４−３６、ｈＴ４−３７ＶＬは、ＨＳＰＧ結合能が大きく減少したｈＴ４−３３ＶＬを鋳型にしてそれぞれの戦略によって突然変異を導入した。ｈＴ４−３５ＶＬの場合、ＣＤＲ１の２７ｄ番、２７ｆ番のアスパルタート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基を、それぞれｈＴ４ＶＬで保存されているアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）とアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）に突然変異させた。ｈＴ４−３６ＶＬの場合、ＣＤＲ１の２７ｄ番アスパルタート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）と２９番グリシン（グリシン）残基を、それぞれアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）とアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）に突然変異させ、ｈＴ４−３７ＶＬは、ＣＤＲ１の２７ｄ番アスパルタート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）と３０番アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）を、それぞれアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）とリシン（Ｌｙｓｉｎｅ）に突然変異させた。前記残基番号はＫａｂａｔ番号に従う。
具体的に、ｈＴ４−３８ＶＬの場合、ｈＴ４ＶＬの配列を維持した時、収率が増加した２７ｆ番アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）と、３０番リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）を保存しながら、２９番アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）をｈＴ４−３３ＶＬ配列であるグリシン（グリシン）に突然変異させ、３１番アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）も、ｈＴ４−３３ＶＬ配列に存在するトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に突然変異させ、ＨＳＰＧ結合能を最小限にできるようにデザインした。ｈＴ４−３９ＶＬの場合、前記ｈＴ４−３８ＶＬと同様に、２７ｆ番アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）と、３０番リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）を保存しながら、２８番トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）をアスパルタート（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）に、２９番アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）をグリシン（グリシン）にし、ｈＴ４−３３ＶＬに保存されている配列を用いてＨＳＰＧ結合能を最小限にできるように構築した。
下記表１０は、腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透及び原形ペプチド融合時に生産収率増加のための突然変異が入っている軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列である。
Figure 2021509020
実施例１３．生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＨＳＰＧ結合能確認
前記実施例１２で構築した生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のための軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＨＳＰＧ結合能が、既存ｈＴ４軽鎖を使用している細胞質浸透抗体（ＴＭａｂ４）と比較してどのくらい減少したかを共焦点顕微鏡と細胞基盤ＥＬＩＳＡを用いて観察した。
図８Ａは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能及び細胞質浸透能が減少或いは除去されたかどうかを、抗体１μＭを３７℃で６時間ＨｅＬａ細胞に処理して共焦点顕微鏡で確認した結果及びＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。
具体的には、ＨＳＰＧを発現させているＨｅＬａ細胞株を、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０４個で１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れ、１２時間５％ ＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＲＴ２２−３３、ＲＴ２２−３４、ＲＴ２２−３５、ＲＴ２２−３６、ＲＴ２２−３７、ＲＴ２２−３８、ＲＴ２２−３９、ＣＴ−３３、ＣＴ−３８、ＣＴ−３９を、１μＭを３７℃で６時間培養した。前記実施例４と同一の方法によってＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。各抗体はＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体で染色した。そして、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。
前記結果から、ＨＳＰＧを通じて細胞質に位置する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、ＴＭａｂ４（１００％）、ＲＴ２２−３４（４０％）、ＲＴ２２−３６（２５％）、ＲＴ２２−３８（２６％）、ＲＴ２２−３９（１９％）、ＲＴ２２−３７（１５．５％）、ＲＴ２２−３５（１２．４％）、ＲＴ２２−３３（６．８％）の順に蛍光強度が観察された。
図８Ｂは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、ＨＳＰＧを発現させるＨｅＬａ細胞株で非特異的細胞表面結合ＥＬＩＳＡを行った結果である。
具体的には、９６ウェルプレートにウェル底全体に細胞が完全に満たされるようにＨｅＬａ（ＨＳＰＧ＋）細胞株を培養した後、洗浄バッファー（ＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で３回洗浄する。その後、ブロッキングバッファー（ＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＢＳＡ）にＴＭａｂ４、ＲＴ２２−３３、ＲＴ２２−３４、ＲＴ２２−３５、ＲＴ２２−３６、ＲＴ２２−３７、ＲＴ２２−３８、ＲＴ２２−３９、ＣＴ−３３、ＣＴ−３８、ＣＴ−３９を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈して４℃で２時間培養した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−ヒト抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図８Ａと同様の傾向で、ＴＭａｂ４、ＲＴ２２−３４、ＲＴ２２−３８、ＲＴ２２−３６、ＲＴ２２−３９、ＲＴ２２−３７、ＲＴ２２−３５、ＲＴ２２−３３の順に細胞表面結合能が測定された。
図８Ｃは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＨＳＰＧ結合能を確認するために、抗体５００ｎＭをＨｅＬａ細胞株で処理した後に流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＨｅＬａ（ＨＳＰＧ＋）細胞を準備する。細胞をＰＢＳＦ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、２％ ＢＳＡ）にＴＭａｂ４、ＲＴ２２−３３、ＲＴ２２−３４、ＲＴ２２−３５、ＲＴ２２−３６、ＲＴ２２−３７、ＲＴ２２−３８、ＲＴ２２−３９を５００ｎＭ入れ、４℃で１時間培養した。その後、各抗体は、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後に流細胞分析機で分析した結果、共焦点顕微鏡結果と同一の傾向で、ＴＭａｂ４、ＲＴ２２−３４、ＲＴ２２−３８、ＲＴ２２−３６、ＲＴ２２−３９、ＲＴ２２−３７、ＲＴ２２−３５、ＲＴ２２−３３の順に、細胞に結合する蛍光強度が測定された。
前記結果から、ＨＳＰＧ結合能が４０％残っているｈＴ４−３４軽鎖を用いた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、以降の生化学的同定実験で使用しなかった。
実施例１４．生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの発現及び精製
前記実施例１０と同一に腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透及び原形ペプチド融合時に生産収率増加のための突然変異が入っている軽鎖可変領域（ＶＬ）にＭＧリンカーを用いてＲＧＤ原形ペプチド又はＥｐ１３３原形ペプチドを遺伝工学的に結合させてクローニングした。
下記表１１は、インテグリン標的原形ペプチドが融合された、生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透の軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列である。
Figure 2021509020
下記表１２は、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチドが融合された、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のための突然変異が入っている軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列である。
Figure 2021509020
前記実施例４と同一にＲＴ２２重鎖動物発現ベクターと腫瘍組織特異性付与のためのインテグリン標的原形ペプチド融合及び生産収率向上のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異を含んでいる軽鎖可変領域を含む軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、その後、抗体の精製過程は、前記実施例４と同一に精製した。
また、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のための軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する定量的親和度を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００機器を用いて分析した。
具体的には、ＲＴ２２−ｉ３５ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３７ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３９ ＭＧを１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１８００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ完全体に対して５０ｎＭから３．１２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して施行された。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
下記表１３は、各ｈＴ４−ｉ３３、ｈＴ４−ｅｐ３３と生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異が導入された軽鎖（ｈＴ４−ｉ３４ ＭＧ〜ｈＴ４−ｉ３９ ＭＧ及びｈＴ４−ｅｐ３４ ＭＧ〜ｈＴ４−ｅｐ３９）及びＲＴ２２重鎖と組み合わせて共に発現させた時の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及びＴＭａｂ４重鎖と組み合わせて共に発現させた時の細胞質浸透抗体の生産収率、及びＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）機器を用いた腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を分析した結果である。
Figure 2021509020
生産収率向上のための軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する親和度が変わっていないことを確認した。
前記結果から、生産収率が増加していないｈＴ４−３６軽鎖を用いた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、以降の生化学的同定実験で使用しなかった。
実施例１５．生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する結合能分析
図９Ａは、インテグリン標的原形ペプチド融合及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３３ ＭＧ〜ｈＴ４−ｉ３７ ＭＧ ＶＬ）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異軽鎖による抗原結合能を比較するために、ＧｐｐＮＨｐと結合する重鎖可変領域はＲＴ２２ＶＨで固定してＲＴ１１、ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３４ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３５ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３６ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３７ ＭＧで行った。
具体的に、実施例４と同一の方法でＥＬＩＳＡを行ったが、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖を有する腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに固定後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度で、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度で結合させた後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
抗原結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果、ＣＤＲ１の陽イオンパッチをそのまま維持しているｈＴ４−ｉ３４ＶＬにおいて、既存ＲＴ２２−ｉ３３と比較した時、重鎖が同一である状態で軽鎖によるＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原との結合能が向上することを確認した。
図９Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｉ３８ ＭＧ〜ｈＴ４−ｉ３９ ＭＧ ＶＬ）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体の１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、実施例４と同一の方法でＥＬＩＳＡを行ったが、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖を有する腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに固定後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度で、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度で結合させた後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させた。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
抗原結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果、ｈＴ４−３８、ｈＴ４−３９軽鎖可変領域を使用した時、既存ＲＴ１１−ｉと比較してＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原との結合能が向上することを確認した。
図９Ｃは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０にインテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧに対する結合能が阻害された軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体を０．５μＭ濃度で３７℃で１２時間処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
具体的に、実施例４と同一の方法でＳＷ４８０細胞を準備し、ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ（＝ＴＭａｂ４−ｉ３３ ＭＧ）、ＣＴ−ｉ３８ ＭＧ、ＣＴ−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３４ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３５ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３６ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３８ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３９ ＭＧを１μＭ処理し、３７℃、１２時間培養した。その後、前記実施例４と同じ条件で染色して共焦点顕微鏡で観察した。ＣＴ−ｉ３３ ＭＧ、ＣＴ−ｉ３８ ＭＧ、ＣＴ−ｉ３９ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３３ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３８ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ３９ ＭＧを除いてＲＴ２２−ｉ３３ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３４ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３５ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３６ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３９ ＭＧは細胞内Ｒａｓと蛍光が重なることを確認した。
実施例１６．生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体の構築
前記実施例１２で構築された軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１突然変異体は、既存ｈＴ４−３３比べて腫瘍組織特異性付与のための原形ペプチドが結合された時に収率が増加したが、最も良好な生産収率を示すＥｐ１３３原形ペプチドが結合された抗体（ＲＴ２２−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ３９ ＭＧ）は、ＲＧＤ１０原形ペプチドが結合された抗体（ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）に比べて２倍程低い生産収率を示した。したがって、Ｅｐ１３３原形ペプチドが結合された抗体においてより安全性を高め、より高い収率を確保するために、更なる軽鎖可変領域（ＶＬ）抗体骨格部分の突然変異体を構築した。
具体的に、ヒト完全ＩｇＧ形態の抗体で使用される軽鎖の場合、抗体骨格部分である２番、３番配列がヒト由来生殖系列配列において多く存在しているイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）とグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）が大部分存在しているが、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂに使用されている軽鎖には、２番、３番配列がロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）とバリン（Ｖａｌｉｎｅ）として保存されている。この２番及び３番配列を、ヒト完全ＩｇＧ形態の抗体で主に存在しているイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）及びグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に突然変異させて安定性と収率を高め得るように軽鎖可変領域（ＶＬ）抗体骨格突然変異体を構築した。
下記表１４は、ｈＴ４−３８とｈＴ４−３９基盤生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）及びＥｐＣＡＭ標的原形ペプチドを融合した生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列情報である。
Figure 2021509020
実施例１７．生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの発現及び精製
前記実施例１０と同一の方法でＲＴ２２重鎖動物発現ベクターと腫瘍組織特異性付与のためのＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及び生産収率向上のための抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域を含む軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、抗体の精製過程は、前記実施例４と同一に精製した。
その後、生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する定量的親和度を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００機器を用いて分析した。
具体的には、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈し、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１８００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ完全体に対して５０ｎＭから３．１２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して施行された。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
下記表１５は、腫瘍組織特異性付与のためのＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及び生産収率向上のための抗体骨格部分の突然変異が導入された軽鎖（ｈＴ４−ｅｐ５８ ＭＧ、ｈＴ４−ｅｐ５９ ＭＧ）をＲＴ２２重鎖と組み合わせて共に発現させた時の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及びＴＭａｂ４重鎖と組み合わせて共に発現させた時の細胞質浸透抗体の生産収率、及びＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）機器を用いた腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を分析した結果である。
Figure 2021509020
生産収率向上のための軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ２２−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧと比較した時、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する親和度が変わっていないことを確認した。
図１０Ａは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及び生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ｈＴ４−ｅｐ５８ ＭＧ〜ｈＴ４−ｅｐ５９ ＭＧ ＶＬ）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、実施例４と同一の方法でＥＬＩＳＡを行ったが、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖を有する腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに固定後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの様々な濃度で、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度で結合させた後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
抗原結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果、ｈＴ４−５８、ｈＴ４−５９軽鎖可変領域を使用した時、既存ＲＴ１１−ｉと比較して、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄ抗原との結合能が向上することを確認した。
図１０Ｂは、ＫＲａｓ突然変異大腸癌細胞株ＳＷ４８０に、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びｈＴ４−３８とｈＴ４−３９基盤生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖（ｈＴ４−５８，ｈＴ４−５９）を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ（ＲＴ２２−ｅｐ５８，ＲＴ２２−ｅｐ５９）を１μＭ濃度で３７℃で１２時間処理後、細胞内活性化されたＲａｓとの重複有無を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
具体的に、２４ウェルプレートにＳＷ４８０細胞株をそれぞれウェル当たり２×１０４個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した後、ＣＴ−ｅｐ５８ ＭＧと親和度が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを１μＭ処理して３７℃、１２時間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジ化ナトリウム、１％ ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。また、ＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するために、ＰＢＳに２％ ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。各抗体は、Ａｌｅｘａ−４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、ＫＲａｓ標識抗体を染色（赤色蛍光）共焦点顕微鏡で観察した。ＣＴ−ｅｐ５９以外の全抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは細胞内Ｒａｓと蛍光が重なることを確認した。
実施例１８．生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＨＳＰＧ結合能確認
前記実施例１７で構築した生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体が導入された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能が、既存ｈＴ４軽鎖を使用している細胞質浸透抗体（ＴＭａｂ４）に比してどれくらい減少したかを、共焦点顕微鏡及び細胞基盤ＥＬＩＳＡを用いて観察した。
図１１Ａは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能及び細胞質浸透能が減少或いは除去されたかどうかを、抗体１μＭを３７℃で６時間ＨｅＬａ細胞に処理して共焦点顕微鏡で確認した結果及びＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。
具体的には、ＨＳＰＧを発現させているＨｅＬａ細胞株を２４ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０４個で、１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れ、１２時間５％ ＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、Ａｖａｓｔｉｎ、ＲＴ２２−５８、ＲＴ２２−５９、ＣＴ−５８、ＣＴ−５９を１μＭ、３７℃で６時間培養した。前記実施例４と同一の方法でＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。各抗体はＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体で染色した。そして、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。
前記結果から、ＨＳＰＧを通じて細胞質に位置する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、ＴＭａｂ４（１００％）、ＲＴ２２−５８（３０％）、ＣＴ−５８（２７％）、ＣＴ−５９、ＲＴ２２−５９（２０％）の順に蛍光強度が観察された。
図１１Ｂは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、ＨＳＰＧを発現させるＨｅＬａ細胞株で非特異的細胞表面結合ＥＬＩＳＡを行った結果である。
具体的には、９６ウェルプレートにウェル底全体に細胞が完全に満たされるようにＨｅＬａ（ＨＳＰＧ＋）細胞株を培養した後、洗浄バッファー（ＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で３回洗浄する。その後、ブロッキングバッファー（ＨＢＳＳ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％ ＢＳＡ）にＰＢＳ、ＴＭａｂ４、Ａｖａｓｔｉｎ、ＲＴ２２−５８、ＲＴ２２−５９、ＣＴ−５８、ＣＴ−５９を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ｎｇ／ｍｌ濃度に希釈し、４℃で２時間培養した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−ヒト抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図１１Ａと同様の傾向で、ＴＭａｂ４、ＲＴ２２−５８、ＣＴ−５８、ＣＴ−５９、ＲＴ２２−５９の順に細胞表面結合能が測定された。
図１１Ｃは、生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のためのＣＤＲ１、ＣＤＲ２突然変異が導入された軽鎖可変領域を含む抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ及び細胞質浸透抗体のＨＳＰＧ結合能を確認するために、抗体５００ｎＭをＨｅＬａ細胞株で処理した後、流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＨｅＬａ（ＨＳＰＧ＋）細胞を準備する。細胞を、ＰＢＳＦ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、２％ ＢＳＡ）にＴＭａｂ４、Ａｖａｓｔｉｎ、ＲＴ２２−５８、ＲＴ２２−５９、ＣＴ−５８、ＣＴ−５９を５００ｎＭ入れて４℃で１時間培養した。その後、各抗体は、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、流細胞分析機で分析した結果、共焦点顕微鏡結果と同様の傾向で、ＴＭａｂ４、ＲＴ２２−５８、ＣＴ−５８、ＣＴ−５９、ＲＴ２２−５９の順に細胞に結合する蛍光強度が測定された。
前記結果から、生産収率向上のために抗体骨格部分が改良された軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体もＨＳＰＧ結合能が除去されたことを確認した。
実施例１９．ＲＴ２２基盤親和度向上したＲａｓ・ＧＴＰ特異的重鎖可変領域（ＶＨ）と腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透及び生産収率向上させた軽鎖可変領域（ＶＬ）が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの発現及び精製
前記実施例１０と同一の方法でＲＴ３１、ＲＴ３６、ＲＴ３７重鎖動物発現ベクターと腫瘍組織特異性付与のためのインテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能阻害及び生産収率向上させた軽鎖可変領域を含む軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、抗体精製過程は、前記実施例４と同一に精製した。
また、ＲＴ３１、ＲＴ３６、ＲＴ３７重鎖動物発現ベクターと腫瘍組織特異性付与のためのインテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能阻害及び生産収率向上させた軽鎖可変領域が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄに対する定量的親和度を、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００機器を用いて分析した。
具体的には、ＲＴ３１−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ３１−ｅｐ３７ ＭＧ、ＲＴ３６−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ３６−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ３６−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ３６−ｅｐ３７ ＭＧ、ＲＴ３６−ｅｐ３８ ＭＧ、ＲＴ３６−ｅｐ３９ ＭＧを１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１８００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ完全体に対して５０ｎＭから３．１２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して施行された。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
下記表１６は、ＲＴ３１、ＲＴ３６、ＲＴ３７重鎖動物発現ベクターと腫瘍組織特異性付与のためのインテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能阻害及び生産収率向上させた軽鎖可変領域が導入された腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ生産収率及びＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ２０００）機器を用いて腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの親和度を分析した結果である。
Figure 2021509020
ＲＴ２２ベースで親和度改良されたＲＴ３１、ＲＴ３７重鎖と生産収率向上及びＨＳＰＧ結合能阻害のための軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体が導入された抗体（ＲＴ３１−ｉ３７ ＭＧ、ＲＴ３１−ｅｐ３７ ＭＧ、ＲＴ３７−ｉ３７ ＭＧ）の場合、生産収率が向上しない問題点を示し、ＲＴ３６と生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）突然変異体が導入された抗体（ＲＴ３６−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ３６−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ３６−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ３６−ｅｐ５９ ＭＧ）の場合、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧと比較した時、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が低くなる問題点が発生した。したがって、その後、生産収率が良く、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が高いＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを用いて実験を進行した。
実施例２０．インテグリン又はＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域を含む抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞表面インテグリン又はＥｐＣＡＭ結合能確認
図１２Ａは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０とＬｏＶｏそしてヒト血液癌細胞株Ｋ５６２とＫ５６２インテグリンανβ３発現細胞株においてインテグリンανβ３又はインテグリンανβ５の発現をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｋ５６２ ανβ３細胞を準備する。ＰＥが接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）された抗−インテグリンανβ３又はＰＥが接合された抗−インテグリンανβ５を１：１００に希釈して入れ、４℃で１時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、流細胞分析機で分析した結果、Ｋ５６２ ανβ３発現細胞株にανβ３抗体が結合し、ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ細胞にανβ５抗体が結合することを確認した。
図１２Ｂは、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度向上した重鎖（ＲＴ２２）を含むＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）と既存腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ１１−ｉ）の細胞表面インテグリンανβ３又はインテグリンανβ５への結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｋ５６２ ανβ３細胞を準備する。細胞を、ＰＢＳＦ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、２％ ＢＳＡ）にＲＴ１１−ｉ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＣＴ−ｉ３９ ＭＧを５００ｎＭを入れて４℃で１時間培養した。その後、各抗体はＡｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、流細胞分析機で分析した結果、ανβ３又はανβ５を発現させるＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２ ανβ３細胞にＲＴ１１−ｉ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＣＴ−ｉ３９ ＭＧ抗体が結合する蛍光強度が測定された。
図１２Ｃは、ヒト大腸癌細胞株ＳＷ４８０とＬｏＶｏそしてヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａでのＥｐＣＡＭの発現をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、Ｋ５６２、Ｋ５６２ ανβ３細胞を準備する。Ａｎｔｉ−ＥｐＣＡＭ抗体を１：２００に希釈して入れ、４℃で１時間培養した。その後、１次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたネズミＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、流細胞分析機で分析した結果、Ｋ５６２ ανβ３細胞にανβ３抗体が結合し、ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ細胞にανβ５抗体が結合する蛍光強度が測定された。
図１２Ｄは、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上した重鎖（ＲＴ２２）を含むＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の細胞表面ＥｐＣＡＭへの結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨｅＬａ細胞を準備する。細胞を、ＰＢＳＦ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、２％ ＢＳＡ）にＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧを５００ｎＭを入れて４℃で１時間培養した。その後、各抗体は、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、流細胞分析機で分析した結果、ＥｐＣＡＭを発現させるＳＷ４８０、ＬｏＶｏ細胞にＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ、ＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧ抗体が結合する蛍光強度が測定された。
実施例２１．生産収率向上及び腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）とＲａｓ・ＧＴＰに対して親和度が改良された重鎖可変領域が組み合わせられた腫瘍組織特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの付着性細胞成長抑制評価
図１３Ａは、様々なＲａｓ突然変異及び野生型細胞株において、インテグリン標的原形ペプチド融合及び生産収率向上と腫瘍組織細胞特異的細胞質浸透軽鎖可変領域が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ０．５μＭを、３７℃で４８時間処理した後、細胞成長抑制能をＷＳＴアッセイで確認したグラフである。
具体的には、９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０４個の前記細胞株をそれぞれ１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．２ｍｌに希釈して２４時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、０．５μＭのＴＭａｂ４−ｉ、ＲＴ１１−ｉ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧを４８時間処理した後、ＷＳＴ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ）１０μｌ入れて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図１３Ａに示すように、様々なＲａｓ突然変異細胞株においてＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧは、対照群として使用した改良前抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１−ｉに比べて有意の細胞成長抑制能を確認した。また、全ての抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂにおいて、野生型細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭでは、対照群として使用したＲａｓ抑制能のない細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）（ＴＭａｂ４−ｉ）と比較して相異がなかった。
図１３Ｂは、様々なＲａｓ突然変異及び野生型細胞株において、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチドが融合及び生産収率向上とＨＳＰＧ結合能が阻害された軽鎖可変領域が組み合わせられた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ １μＭを３７℃で４８時間処理した後、細胞成長抑制能をＷＳＴアッセイで確認したグラフである。
具体的には、９６ウェルプレートにウェル当たり５×１０３個の前記細胞株をそれぞれ１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．２ｍｌに希釈して２４時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、１μＭのＣＴ−ｅｐ５９、ＲＴ１１、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを３６時間処理した後、ＷＳＴ溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ）１０μｌを入れて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図１３Ｂに示すように、様々なＥｐＣＡＭが発現するＲａｓ突然変異細胞株において、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧは、対照群として使用した改良前抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１に比べて有意の細胞成長抑制能を確認した。また、全ての抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂは、野生型細胞株ＦａＤｕ、ＨＴ−２９では、対照群として使用したＲａｓ抑制能のない細胞質浸透抗体（細胞質浸透抗体、ＣＴ−ｅｐ５９）と比較して差異がなかった。
上の結果から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで既存抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ（ＲＴ１１、ＲＴ１１−ｉ）と比較した時、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧともに、Ｒａｓ突然変異細胞株特異的細胞成長抑制効果が向上したことを確認したが、その後、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルでもそれらの抗体の腫瘍成長を抑制する効果が向上したかを確認するための実験を進行した。
実施例２２．腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの向上した腫瘍成長阻害能確認
図１４Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏとＳＷ４８０を異種移植したネズミにおいて、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）と既存インテグリン標的原形ペプチドが融合された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ１１−ｉ）との腫瘍成長抑制効果を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射、２日間隔で総９回投与して比較した実験結果である。
図１４Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフ、及び摘出した腫瘍写真である。
図１４Ｃは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
具体的には、Ｉｎ ｖｉｖｏ上で既存の腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ１１−ｉと比較して、親和度向上及びＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧとＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧの向上した腫瘍成長阻害を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＫＲａｓＧ１２Ｖ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０はマウス当たり５×１０６個の細胞を、ＫＲａｓＧ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＬｏＶｏはマウス当たり２×１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約１０日後に腫瘍の体積が約５０〜８０ｍｍ３程度になったとき、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群ＣＴ−ｉ３９ ＭＧ（ＴＭａｂ４ ＶＨ）、実験群ＲＴ１１−ｉ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧを２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。２日間隔で総８回静脈注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて１６日間腫瘍体積を測定した。
図１４Ａに示すように、対照群であるＣＴ−ｉ３９ ＭＧに比べて、ＲＴ１１−ｉ、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧとＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧは、癌細胞成長が抑制されたことを確認したが、ＲＴ１１−ｉに比べてＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧとＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧがより効果的に腫瘍成長を抑制することを確認した。定量的な腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、ｖｅｈｉｃｌｅに対し、ＣＴ−ｉ３９（０％）、ＲＴ１１−ｉ（４６％）、ＲＴ２２−ｉ３８（５９．７％）、ＲＴ２２−ｉ３９（６９．８％）と確認された。
図１４Ｂでは、摘出された腫瘍の重さで腫瘍成長抑制率を求めた結果、ＣＴ−ｉ３９（０％）、ＲＴ１１−ｉ（３８．１％）、ＲＴ２２−ｉ３８（４７．１％）、ＲＴ２２−ｉ３９（６８．２％）と確認された。
また、図１４Ｄに示すように、ＲＴ２２−ｉ３８ ＭＧとＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ実験群マウスの体重に変化がないことを確認し、これによって、他の毒性はないことを確認した。
実施例２３．腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの腫瘍成長阻害能確認
図１５Ａは、ヒト大腸癌細胞株ＬｏＶｏとＳＷ４８０を異種移植したネズミにおいて、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の腫瘍成長抑制効果を、２０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射、２日間隔で総９回投与して比較した実験結果である。
図１５Ｂは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフ、及び摘出した腫瘍写真である。
図１５Ｃは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
具体的には、Ｉｎ ｖｉｖｏ上で腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧの腫瘍成長阻害を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＫＲａｓＧ１２Ｖ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０はマウス当たり５×１０６個の細胞を、ＫＲａｓＧ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＬｏＶｏはマウス当たり２×１０６個の細胞を皮下注射で注入し、約１０日後、腫瘍の体積が約５０〜８０ｍｍ３程度になった時、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群ＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧ、実験群ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧ、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。２日間隔で総９回静脈注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて１８日間腫瘍体積を測定した。
図１５Ａに示すように、対照群であるＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧに比べてＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧとＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧは癌細胞成長が抑制されたことを確認した。定量的な腫瘍成長抑制率はｖｅｈｉｃｌｅに対し、ＣＴ−ｅｐ５９（１６．２％）、ＲＴ２２−ｅｐ５８（４９．２％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９（７５．４％）と確認された。
図１５Ｂでは、摘出された腫瘍の重さで腫瘍成長抑制率を求めた結果、ＣＴ−ｅｐ５９（８．１％）、ＲＴ２２−ｅｐ５８（４７．３％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９（７０．２％）と確認された。
また、図１５Ｃに示すように、ＲＴ２２−ｅｐ５８ ＭＧとＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ実験群マウスの体重の変化がないことを確認し、これによって、他の毒性はないことを確認した。
実施例２４．腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長阻害能確認
図１６Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏを異種移植したネズミにおいて、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ）の投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
図１６Ｂは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフ、及び摘出した腫瘍写真である。
図１６Ｃは、インテグリン標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
具体的には、Ｉｎ ｖｉｖｏ上で親和度向上及びＨＳＰＧ結合能が除去された腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂであるＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧの投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
腫瘍成長阻害を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＫＲａｓＧ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＬｏＶｏ２×１０６個の細胞を各マウスに皮下注射で注入し、約１０日後腫瘍の体積が約５０〜８０ｍｍ３程度になった時、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群ＣＴ−ｉ３９ ＭＧ（ＴＭａｂ４ ＶＨ）、実験群ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧを、５、１０、２０ｍｇ／ｋｇで静脈又は腹腔注射した。２日間隔で総９回又は一週間に２回間隔で総６回注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて１８日間腫瘍体積を測定した。
図１６Ａに示すように、対照群であるＣＴ−ｉ３９ ＭＧに比べてＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧは癌細胞成長が抑制されたことを確認した。投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制率には大きな差異がなく、定量的な腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）はｖｅｈｉｃｌｅに対し、ＣＴ−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（−２．８％）、ＲＴ２２−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（６５．３％）、ＣＴ−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（−５．８％）、ＲＴ２２−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７０．４％）、ＲＴ２２−ｉ３９１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７２．４％）、ＲＴ２２−ｉ３９１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（６６．９％）、ＲＴ２２−ｉ３９５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（６４．３％）と確認された。
図１６Ｂでは、摘出された腫瘍の重さで腫瘍成長抑制率を求めた結果、ＣＴ−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（４．５％）、ＲＴ２２−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（６５．７％）、ＣＴ−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（１．２％）、ＲＴ２２−ｉ３９２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（６９．３％）、ＲＴ２２−ｉ３９１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７０％）、ＲＴ２２−ｉ３９１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（７２．５％）、ＲＴ２２−ｉ３９５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（７０．６％）と確認された。
また、図１６Ｃに示すように、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧ実験群マウスの体重の変化がないことを確認し、これによって、他の毒性はないことを確認した。
実施例２５．腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長阻害能確認
図１７Ａは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏを異種移植したネズミにおいてＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体（ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ）の投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
図１７Ｂは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の処理後に腫瘍を摘出して腫瘍の重さを測定したグラフ、及び摘出した腫瘍写真である。
図１７Ｃは、ＥｐＣＡＭ標的原形ペプチド融合及びＨＳＰＧ結合能が除去された抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の非特異的副作用を確認するためにネズミの体重を測定したグラフである。
具体的には、Ｉｎ ｖｉｖｏ上で腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧの投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長阻害を確認するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＫＲａｓＧ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＬｏＶｏ２×１０６個の細胞を各マウス当たり皮下注射で注入し、約１０日後、腫瘍の体積が約５０〜８０ｍｍ３程度になった時、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群ＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧ、実験群ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧを５、１０、２０ｍｇ／ｋｇで静脈又は腹腔注射した。２日間隔で総９回又は一週間に２番間隔で総６回注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて１８日間腫瘍体積を測定した。
図１７Ａに示すように、対照群であるＣＴ−ｅｐ５９ ＭＧに比べてＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧは癌細胞成長が抑制されたことを確認した。投与量、投与間隔、投与経路による腫瘍成長抑制率には大きな差異がなく、定量的な腫瘍成長抑制率（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）はｖｅｈｉｃｌｅに対し、ＣＴ−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（３．７％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（８０．６％）、ＣＴ−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（２．３％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７８．８％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ １０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７６％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ １０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（７５％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（７７．８％）と確認された。
図１７Ｂでは、摘出された腫瘍の重さで腫瘍成長抑制率を求めた結果、ｖｅｈｉｃｌｅに対し、ＣＴ−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（−３．６％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ ｂｉｗｅｅｋｌｙ（６７．３％）、ＣＴ−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（−１．６％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（７１．１％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ １０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ（６４．７％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ １０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（７０．１％）、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ（６１．３％）と確認された。
また、図１７Ｃに示すように、ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧ実験群マウスの体重の変化がないことを確認し、これによって、他の毒性はないことを確認した。
実施例２６．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内安定性、体内持続性及び腫瘍組織標的能を向上させるための重鎖改良変異体のデザイン及び発現・精製
細胞質内タンパク質は一般にユビキチン−プロテアソーム機序により分解される。同様に、細胞質内完全なイムノグロブリン形態の抗体はＴＲＩＭ２１ Ｅ３リガーゼに結合してユビキチン−プロテアソーム機序により分解され、ＴＲＩＭ２１と結合する抗体のＣＨ３領域Ｎ４３４アミノ酸に突然変異が導入された場合、抗体の分解が阻害される。したがって、完全なイムノグロブリン形態の抗体である抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内安定性を向上させるために、ＣＨ３領域にＮ４３４Ｄ突然変異が導入された変異体を構築した。具体的に、前記実施例４と同一の方式で細胞質内安定性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖発現ベクター（ＲＴ２２ＩｇＧ１ Ｎ４３４Ｄ）と細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクター（ｈＴ４−ｅｐ５９ ＭＧ ＬＣ）をＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、細胞質内安定性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ突然変異を発現させた。
また、イムノグロブリン形態の抗体は、体内免疫細胞のＦｃレセプターと結合してＡＤＣＣ機序によって除去され得るが、ＩｇＧ サブクラスのうち、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４の場合、Ｆｃガンマレセプターとの結合が弱いため、機能が阻害している。したがって、完全なイムノグロブリン形態のＩｇＧ１抗体である抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内安定性を向上させるために、ＩｇＧ４の重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）を導入した変異体を構築した。この時、体内でＩｇＧ４の特性であるＦａｂ−腕交換（Ｆａｂ− ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）が生じないようにヒンジ部位にＳ２２８Ｐ突然変異を共に導入した。具体的に、前記実施例４のような方式で体内持続性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖発現ベクター（ＲＴ２２ ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ）と細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクター（ｈＴ４−ｅｐ５９ ＭＧ ＬＣ）をＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、体内持続性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ突然変異を発現させた。
下記表１７は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内安定性及び体内持続性を向上させるために改良された重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ３）の配列情報である。
Figure 2021509020
また、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの腫瘍組織標的能を向上させるために、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ重鎖可変領域のＮ−末端にＥｐＣＡＭ標的能を有するｅｐ１３３ペプチドを結合させるクローンを構築して発現精製した。具体的に、前記実施例４と同一の方式により、腫瘍組織標的能が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖発現ベクター（ｅｐＲＴ２２ ＧＳ、ｅｐＲＴ２２ ＭＧ、ｅｐＲＴ２２（Ｇ４Ｓ）２）と細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクター（ｈＴ４−ｅｐ５９ ＭＧ ＬＣ）をＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、腫瘍組織標的能が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ突然変異を発現させた。
下記表１８は、腫瘍組織標的能が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖可変領域配列である。
Figure 2021509020
下記表１９は、細胞質内安定性、体内持続性及び腫瘍組織標的能が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの生産収率を示す表である。
Figure 2021509020
上の表１９で、既存ＲＴ２２−ｅｐ５９ ＭＧをｅｐＲａｓ０３ ＭＧと、ＲＴ２２−ｉ３９ ＭＧをｉｎＲａｓ０３と新しく命名し、これに基づいて重鎖定常領域変異体を命名した。
実施例２７．細胞質内安定性を向上させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内分解減少及び非付着細胞成長抑制の評価
実施例２５で構築した細胞質内安定性を向上させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内分解減少を確認するために、改善された分割緑色蛍光タンパク質相補システム（出願番号：１０−２０１５−０１４３２７８）を利用した。そのために、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ及びｅｐＲａｓ１３ ＭＧの重鎖Ｃ−末端にＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ペプチドが融合されたｅｐＲａｓ０３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧ及びｅｐＲａｓ１３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧを構築した。
図１８Ａは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの細胞質内分解減少を、改善された分割緑色蛍光タンパク質相補システムを用いて確認した結果である。
具体的には、黒９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０４個のＳＡ−ＧＦＰ１−１０を発現させるＳＷ４８０細胞株を、それぞれ１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．１ｍｌに希釈して２４時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、２μＭのｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ０３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧ、ｅｐＲａｓ１３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧを６時間処理した後、新しい培地に入れ替えた。その後、０、２、４、６時間培養した後、蛍光プレートリーダを用いて、励起（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）４８５ｎｍ、放射（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）５２８ｎｍ波長の緑色蛍光を定量した。
図１８Ａに示すように、細胞質分解を減少させたｅｐＲａｓ１３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧは、６時間後に６０％の緑色蛍光が残っていたが、対照群であるｅｐＲａｓ０３−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２ ＭＧは５％であり、ほとんど全ての抗体が分解されることを確認した。対照群であるｅｐＲａｓ０３ ＭＧは緑色蛍光がほとんど観察されなかった。これによって、ｅｐＲａｓ１３ ＭＧが細胞質内安定性が向上することを確認した。
図１８Ｂは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能を軟寒天コロニー形成方法で確認した結果である。
具体的には、２４ウェルプレートに１．２％アガロース溶液と２Ｘ ＲＰＭＩ＋２０％ ＦＢＳ培地を１：１の比率で混合し、０．２ｍｌ塗抹する。ボトムアガー（Ｂｏｔｔｏｍ ａｇａｒ）が固まった後、その上に、０．７％アガロース溶液と１×１０３個の細胞＋１μＭ又は４μＭの抗体が含まれた２Ｘ ＲＰＭＩ＋２０％ ＦＢＳ培地を１：１の比率で混合し、０．２ｍｌ塗抹する。トップアガー（Ｔｏｐ ａｇａｒ）が固まった後、０．２ｍｌの培地を入れた。その後、３日間隔で０．５μＭ又は２μＭの抗体が含まれた培地に入れ替える。２〜３週後にＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を用いてコロニーを染色した後、２００μｍ以上サイズのコロニー数を測定する。
図１８Ｂに示すように、Ｒａｓ突然変異細胞株ＳＷ４８０、ＬｏＶｏで細胞質安定性が向上したｅｐＲａｓ１３ ＭＧは、対照群として使用したｅｐＲａｓ０３ ＭＧに比べて細胞成長抑制能が向上したことを確認した。また、野生型細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭでは、対照群として使用したＲａｓ抑制能のない細胞質浸透抗体（ｅｐＣＴ０３ ＭＧ）と比較して差異がなかった。
図１８Ｃは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス方法で確認した結果である。
具体的には、超低接着（ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ａｔｔｃｈａｔｍｅｎｔ）９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０３個の前記細胞株をそれぞれ０％ ＦＢＳの培地０．１ｍｌに希釈した後、０．５、２μＭ濃度の抗体と共に４８時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、０．５、２μＭ濃度の抗体を追加処理して４８時間培養した。総９６時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌ入れて発光を定量した。
図１８Ｃに示すように、Ｒａｓ突然変異細胞株ＳＷ４８０、ＬｏＶｏで、細胞質安定性が向上したｅｐＲａｓ１３ ＭＧは対照群として使用したｅｐＲａｓ０３ ＭＧに比べて細胞成長抑制能が向上したことを確認した。また、野生型細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭでは、対照群として使用したＲａｓ抑制能のない細胞質浸透抗体（ｅｐＣＴ０３ ＭＧ）と比較して差異がなかった。
図１８Ｄは、細胞質内安定性が向上した腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのヒト肺癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス方法で確認した結果である。
具体的には、超低接着９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０３個の前記細胞株をそれぞれ１０％ ＦＢＳが含まれた培地０．１ｍｌに希釈した後、２μＭ濃度の抗体と共に４８時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、２μＭ濃度の抗体を２回追加処理して４８時間ずつ培養した。最後に、総１４４時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌ入れて発光を定量した。
図１８Ｄに示すように、様々なＲａｓ突然変異細胞株で、細胞質安定性が向上したｉｎＲａｓ１３は、対照群として使用したｉｎＲａｓ０３に比べて細胞成長抑制能が向上したことを確認した。また、野生型細胞株では、対照群として使用したＲａｓ抑制能のない細胞質浸透抗体（ｉｎＣＴ０３）と比較して差異がなかった。
上の結果から、既存ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ０３と比較した時、細胞質安定性が向上することによって、ｅｐＲａｓ１３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ１３ともに、Ｒａｓ突然変異細胞株特異的細胞成長抑制効果が向上したことを確認した。
実施例２８．体内持続性を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの薬動学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の評価
図１９Ａは、体内持続性を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰの精製後、還元性又は非還元性条件で１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
具体的には、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ及びｅｐＲａｓ０３ ＭＧ ＩｇＧ４ともに、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認し、また、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量及び軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現精製された個別クローンが溶液状態で単一体として存在し、非自然的二硫化結合によって二重体又はオリゴマーを形成しないことを確認した。
図１９Ｂは、体内持続性を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰの薬動学をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで確認した結果である。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、実験群ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ ＩｇＧ４と対照群ｅｐＲａｓ０３ ＭＧを２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。その後、０．５、１、４、８、１２、２４時間；２、４、７、１４、２１、２８日にそれぞれマウス血液を採取した。採取した血液は１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃条件で遠心分離した後、上澄液である血漿だけを−８０℃に保管した。その後、血漿内のｅｐＲａｓ０３ ＭＧ ＩｇＧ４、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧの濃度を分析するためにＥＬＩＳＡを実施した。具体的に、抗−ヒトＦａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ）を９６ウェル半面積（ｈａｌｆ−ａｒｅａ）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にそれぞれ２．５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄する。１％ ＰＢＳＢ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ ＢＳＡ）で１時間結合した後、採取した血液及び精製した抗体（基準曲線用）を１％ ＰＢＳＢに希釈して２時間結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴで３回洗浄する。その後、ＨＲＰが接合された抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を標識抗体として１時間結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させ、硫酸溶液で反応を中断させた後、４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図１９Ｂに示すように、体内持続性が向上したｅｐＲａｓ０３ ＭＧ ＩｇＧ４の場合、対照群であるｅｐＲａｓ０３ ＭＧに比べて２倍高い半減期を有することを確認した。
実施例２９．腫瘍組織標的能を向上させた腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂのＥｐＣＡＭ標的能向上確認
図２０Ａは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの細胞表面ＥｐＣＡＭへの結合能をＦＡＣＳで確認した実験結果である。
具体的には、各サンプル当たり１×１０５個のＬｏＶｏ細胞を準備する。細胞をＰＢＳＦ（ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ、２％ ＢＳＡ）にＲａｓ０３、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧを１００ｎＭ入れて４℃で１時間培養した。その後、各抗体は、Ａｌｅｘａ４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的認知する抗体と４℃条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後に流細胞分析機で分析した結果、ＥｐＣＡＭを発現させるＬｏＶｏ細胞にｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧ抗体が結合する蛍光強度が測定され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドが相対的に多く融合されたｅｐＲａｓ２３ ＭＧが、相対的に高い蛍光強度を示した。
図２０Ｂは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧｐｐＮＨｐ又は１００ｎＭのＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ・ＧＤＰとの結合能をＥＬＩＳＡで分析した結果である。
具体的に、実施例４と同一の方法でＥＬＩＳＡを行ったが、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに固定後、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭの様々な濃度で、ＧＤＰが結合されたＫＲａｓタンパク質は１００ｎＭ濃度で結合させた後、標識抗体としてＨＲＰが接合された抗−Ｈｉｓ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｉｓ ｍＡｂ）に結合させる。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させて４５０ｎｍ吸光度を定量した。
前記結果から、重鎖可変領域Ｎ末端にＥｐＣＡＭペプチドを融合してもＲａｓとの親和度差を示さないことを確認した。
図２０Ｃは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧのヒト大腸癌細胞株での非付着細胞成長抑制能をアノイキス方法で確認した結果である。
具体的には、超低接着９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０３個のＬｏＶｏ、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６細胞株をそれぞれ１０％ ＦＢＳの培地０．１ｍｌに希釈した後、０．５，２μＭ濃度の抗体と共に４８時間、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養した。その後、０．５、２μＭ濃度の抗体を追加処理して４８時間培養した。総９６時間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを入れて発光を定量した。
図２０Ｃに示すように、Ｒａｓ突然変異細胞株ＬｏＶｏ、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６において、細胞質安定性が向上したｅｐＲａｓ２３ ＭＧは、対照群として使用したｅｐＲａｓ０３ ＭＧに比べて細胞成長抑制能が向上したことを確認した。
図２０Ｄは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの生体分布をマウスで確認し、腫瘍と身体全体の蛍光を定量してグラフで示した結果である。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光標識した抗Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ Ｒａｓ０３、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧを２０μｇ注射した後、０、６、１２、２４、４８、７２時間別にマウスボディー全体から出る蛍光をＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で観察する。この時、マウスは、１．５〜２．５％イソフルラン（Ｐｉｒａｍａｌ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ）を用いて麻酔した。各イメージは、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてボディー全体の蛍光値を定量した。
図２０Ｄに示すように、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合しないＲａｓ０３に比べて、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧは腫瘍組織に存在する抗体の量が多いことを確認した。また、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧはｅｐＲａｓ０３ ＭＧに比べて、抗体注射後、時間経過による腫瘍組織内抗体の量がより多いことを確認した。
図２０Ｅは、腫瘍組織標的能を向上させるためにＥｐＣＡＭ標的ペプチドを重鎖可変領域Ｎ末端に融合させた抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ ｅｐＲａｓ２３ ＭＧの生体分布をマウスで確認し、臓器を摘出して蛍光を定量してグラフで示した結果である。
具体的には、前記実験に続いて、抗体注射して７２時間経過したマウスは安楽死させ、腫瘍及び心臓、肺、肝、腎臓、膵臓、脾臓を摘出し、その臓器での蛍光をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量した。
図２０Ｅに示すように、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合しないＲａｓ０３に比べて、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧは腫瘍組織に存在する抗体の量が多く、その他の臓器に存在する抗体の量が少ないことを確認した。腫瘍組織に位置する抗体の量は、ｅｐＲａｓ２３ ＭＧ、ｅｐＲａｓ０３ ＭＧ、Ｒａｓ０３の順に多量存在した。
実施例３０．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させるための重鎖改良変異体のデザイン及び発現・精製
イムノグロブリン形態の抗体は、体内免疫細胞のＦｃレセプターと結合してＡＤＣＣ機序によって除去され得るが、ＩｇＧ１の場合、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ２３９Ｇ突然変異導入によってＦｃガンマレセプターとの結合が弱く、この機能が阻害される。したがって、完全なイムノグロブリン形態のＩｇＧ１抗体である抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内安定性を向上させるために、ＩｇＧ１の重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ２３９Ｇ突然変異（ＬＡＬＡ−ＰＧ）を導入した変異体（ＩｇＧ１ＬＡＬＡ−ＰＧ）を構築した。具体的に、前記実施例４と同一の方式により、体内持続性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの重鎖発現ベクター（ＲＴ２２ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ−ＰＧ又はＲＴ２２ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ−ＰＧ、Ｎ４３４Ｄ）と細胞質浸透ヒト化軽鎖発現ベクター（ｈＴ４−ｅｐ５９ ＧＳＳＧ ＬＣ）をＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、体内持続性が向上した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂ突然変異を発現させた。
下記表２０は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させるためにＬＡＬＡ−ＰＧ突然変異が導入された重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）の配列情報である。
Figure 2021509020
実施例３１．腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の薬動学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）評価
図２１Ａは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の多量体有無をサイズ排除クロマトグラフィーで確認した結果である。
具体的には、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＰＬＣ １２００シリーズを用いて行った。この時、使用したカラムは、Ｚｅｎｉｘ(R)ＳＥＣ−３００カラムを用いて行った。１ｍｌ／分の流速で実験を行った。移動相は、１５０ｍＭりん酸ナトリウムｐＨ７．０を含んでいた。希釈剤は移動相であった。２８０ｎｍのＵＶで分析を行った。全ｉＭａｂにおいて多量体無しで単量体として抗体が精製されたことを確認した。
図２１Ｂは、腫瘍組織ＥｐＣＡＭ特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の薬動学をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスで確認した結果である。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにｅｐＲａｓ０３、ｅｐＲａｓ１３、ｅｐＲａｓ３３、ｅｐＲａｓ８３を２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。その後、０．５、１、４、８、１２、２４時間；２、４、７、１４、２１、２８日にそれぞれマウス血液を採取した。採取した血液は、１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃条件で遠心分離した後、上澄液である血漿だけを−８０℃に保管した。その後、血漿内のｅｐＲａｓ０３、ｅｐＲａｓ１３、ｅｐＲａｓ３３、ｅｐＲａｓ８３の濃度を分析するためにＥＬＩＳＡを行った。具体的に、実施例２８と同様に、抗−ヒトＦａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ）を９６ウェル半面積プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にそれぞれ２．５μｇ／ｍｌの濃度で１時間常温で結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄する。１％ ＰＢＳＢ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％ ＢＳＡ）で１時間結合した後、採取した血液及び精製した抗体（基準曲線用）を１％ ＰＢＳＢに希釈して２時間結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴで３回洗浄する。その後、ＨＲＰが接合された抗−ヒトＩｇＧ、Ｆｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を標識抗体として１時間結合させた後、０．１％ ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ溶液で反応させ、硫酸溶液で反応を中断させた後、４５０ｎｍ吸光度を定量した。
図２１に示すように、ＬＡＬＡ−ＰＧ突然変異を導入したｅｐＲａｓ３３、ｅｐＲａｓ８３の場合、対照群であるｅｐＲａｓ０３に比べて高い半減期を有し、ｅｐＲａｓ１３はｅｐＲａｓ０３に比べて少量減少した半減期を示すことを確認した。
実施例３２．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄ及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合能評価
抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体が、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄとの結合能が維持され、ＦｃＲｎとの結合能に影響を与えないことを確認するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）をＢｉａｃｏｒｅ２０００機器を用いて行い、結合能を分析した。
具体的には、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＫＲａｓＧ１２Ｄとの結合能を確認するために、ｅｐＲａｓ０３、ｅｐＲａｓ１３、ｅｐＲａｓ８３、ｉｎＲａｓ０３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ１３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ８３ ＭＧを、１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１８００ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、トリス緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析し、ＧｐｐＮＨｐが結合されたＧＳＴ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ完全体に対して１００ｎＭから６．２５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（２０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で１分間流して施行された。結合３分、解離３分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
具体的には、ＦｃＲｎとの結合能を確認するために、ＦｃＲｎを１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ４．０）に２０μｌ／ｍｌ濃度に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約６５０ＲＵ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ）固定化した。その後、リン酸塩緩衝液（１２ｍＭリン酸塩、ｐＨ６．０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析した、ｅｐＲａｓ０３に対して２００ｎＭから６．２５ｎＭの濃度で分析し、ｅｐＲａｓ１３、ｅｐＲａｓ８３に対して２０００ｎＭから６２．５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）はリン酸塩緩衝液（１２ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で３分間流して施行された。結合３分、解離６分で得られた各センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は空白セル（Ｂｌａｎｋ ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び節減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
表２１は、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ ２０００）を用いて、ＧｐｐＮＨｐが結合された完全体形態のＫＲａｓＧ１２Ｄ及びＦｃＲｎに対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体との親和度分析結果を示す。
Figure 2021509020
実施例３３．腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の腫瘍成長抑制能確認
図２２Ａは、腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ ｉＭａｂの体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の多量体有無をサイズ排除クロマトグラフィーで確認した結果である。
具体的には、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＨＰＬＣ １２００シリーズを使用して行った。この時、使用したカラムは、Ｚｅｎｉｘ(R) ＳＥＣ−３００カラムを用いて行った。１ｍｌ／分の流速で実験を行った。移動相は、１５０ｍＭりん酸ナトリウムｐＨ７．０を含んでいる。希釈剤は移動相であり、２８０ｎｍのＵＶで分析を行った。全ｉＭａｂにおいて９５％以上が単量体からなる抗体が精製されたことを確認した。
図２２Ｂは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＬＳ１０３４を異種移植したネズミにおいて、腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、ＫＲａｓＡ１４６Ｔ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＬＳ１０３４ １×１０７個の細胞を各マウスに皮下注射で注入し、約１４日後＜腫瘍の体積が約〜１２０ｍｍ３程度になった時、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群（ｉｎＣＴ０３ ＭＧ、ｉｎＣＴ１３ ＭＧ、ｉｎＣＴ３３ ＭＧ、ｉｎＣＴ８３ ＭＧ）、実験群（ｉｎＲａｓ０３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ１３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ３３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ８３ ＭＧ）を２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。一週間に２回、３、４日間隔で総７回注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて総２４日間腫瘍体積を測定した。
図２２Ｂに示すように、ｉｎＲａｓ０３ ＭＧ（対照群：ｉｎＣＴ０３ ＭＧ）とｉｎＲａｓ１３ ＭＧ（対照群：ｉｎＣＴ１３ ＭＧ）、ｉｎＲａｓ３３ ＭＧ（対照群：ｉｎＣＴ３３ ＭＧ）を投与したマウスで癌細胞成長が抑制されたことを確認した。これに対し、ｉｎＲａｓ８３（対照群：ｉｎＣＴ８３ ＭＧ）を投与したマウスでは癌細胞成長が抑制されていないことを確認した。
図２２Ｃは、ヒト大腸癌ＫＲａｓ突然変異細胞株ＳＷ４０３を異種移植したネズミにおいて腫瘍組織インテグリン特異的抗−Ｒａｓ細胞浸透抗体の体内持続性を向上させたＬＡＬＡ−ＰＧ変異体の腫瘍成長抑制効果を比較した実験結果である。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＫＲａｓＧ１２Ｖ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４０３ １×１０７個の細胞を各マウスに皮下注射で注入し、約１４日後に腫瘍の体積が約〜１２０ｍｍ３程度になった時、同一体積のＰＢＳ媒体対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）と対照群（ｉｎＣＴ０３ ＭＧ、ｉｎＣＴ１３ ＭＧ、ｉｎＣＴ３３ ＭＧ、ｉｎＣＴ８３ ＭＧ）、実験群（ｉｎＲａｓ０３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ１３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ３３ ＭＧ、ｉｎＲａｓ８３ ＭＧ）を２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。一週間に２回、３、４日間隔で総５回注射し、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて総１７日間腫瘍体積を測定した。
図２２Ｃに示すように、ｉｎＲａｓ３３ ＭＧ（対照群：ｉｎＣＴ３３ ＭＧ）を投与したマウスで癌細胞成長が抑制されたことを確認した。これに対し、ｉｎＲａｓ０３ ＭＧ（対照群：ｉｎＣＴ０３ ＭＧ）とｉｎＲａｓ１３ ＭＧ（対照群： ｉｎＣＴ１３ ＭＧ）、ｉｎＲａｓ８３（対照群： ｉｎＣＴ８３ ＭＧ）を投与したマウスでは癌細胞成長が抑制されていないことを確認した。
図２２に示すように、ｉｎＲａｓ３３ ＭＧでは腫瘍成長抑制能が向上したが、ｉｎＲａｓ１３ ＭＧ及びｉｎＲａｓ８３ ＭＧでは腫瘍成長抑制能が類似又は低下したことを確認した。
本発明で提供する、完全なイムノグロブリン形態で腫瘍組織特異的細胞質に浸透して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを直接に抑制する抗体の腫瘍抑制効率を向上させるための方法は、Ｒａｓ・ＧＴＰとの親和度が改良された重鎖可変領域の選別、及び腫瘍組織特異的に向上した細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域の開発によって達成され、これによって、特定腫瘍細胞内に位置しており、突然変異によって常に活性化されるＲａｓ・ＧＴＰを標的し且つその活性を効果的に阻害することができる。
また、本発明で提供する前記抗体の腫瘍組織特異的細胞質浸透能が向上した軽鎖可変領域又はこれを含む抗体は、大部分の正常細胞で発現しているＨＳＰＧとの結合能を下げ、腫瘍組織標的目的で融合されたペプチドによる腫瘍組織特異的に発現する受容体を通じて細胞内在化及びエンドソーム脱出が可能であり、Ｒａｓ・ＧＴＰとの親和度が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）は、細胞質内に前記抗体が到達した時、向上したＲａｓ抑制能を持つようにする。これによって、前記改良された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が組み合わせられた完全なイムノグロブリン形態で腫瘍組織特異的細胞質に浸透して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰを直接抑制する抗体は、向上した腫瘍生長抑制能を示す。
本発明に係る改良された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が組み合わせられた細胞質浸透Ｒａｓ抑制抗体は高い生産収率を有し、治療薬物としての開発が容易であり、腫瘍組織特異的に細胞質浸透を通じて効果的に突然変異Ｒａｓを抑制でき、単独薬物又は既存治療剤との併行治療によって効果的な抗癌活性を期待することができる。

Claims (27)

  1. 下記一般式１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、一般式２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び一般式３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ＧＴＰが結合されて活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）に特異的に結合する重鎖可変領域：
    （一般式１） Ｄ−Ｘ１１−ＳＭＳ
    前記一般式１で、Ｘ１１はＦ又はＹであり、
    （一般式２） ＹＩＳＲＴＳＨＴ−Ｘ２１−Ｘ２２−ＹＡＤＳＶＫＧ
    前記一般式２で、Ｘ２１はＴ、Ｉ又はＬであり、Ｘ２２はＹ、Ｃ、Ｓ、Ｌ又はＡであり、
    （一般式３） Ｇ−Ｆ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｙ
    前記一般式３で、Ｘ３１はＫ、Ｆ、Ｒ又はＮであり、Ｘ３２はＭ又はＬであり、Ｘ３３はＤ又はＮである。
  2. 下記一般式１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、一般式２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２及び一般式３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＧＴＰが結合されて活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）に特異的に結合する重鎖可変領域：
    （一般式１） Ｄ−Ｘ１１−ＳＭＳ
    前記一般式１で、Ｘ１１はＦ又はＹであり、
    （一般式２） ＹＩＳＲＴＳＨＴ−Ｘ２１−Ｘ２２−ＹＡＤＳＶＫＧ
    前記一般式２で、Ｘ２１−Ｘ２２は、ＴＹ、ＩＹ、ＴＣ、ＴＳ、ＩＳ、ＬＣ、ＬＬ又はＩＡであり、
    （一般式３） Ｇ−Ｆ−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｙ
    前記一般式３で、Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３は、ＫＭＤ、ＲＭＤ、ＦＭＮ、ＲＬＤ又はＮＬＤである。
  3. 前記重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号２〜４のアミノ酸配列からなる群から選ばれ、前記重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号５及び配列番号１０〜１６のアミノ酸配列からなる群から選ばれ、前記重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号６〜９及び配列番号１７〜１８のアミノ酸配列からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載の重鎖可変領域。
  4. ｉ）配列番号２のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｉｉｉ）配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号８のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｉｖ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号９のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｖ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２及び配列番号８のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｖｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１０のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｖｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｖｉｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１２のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｉｘ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｘ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１４のＣＤＲ２及び配列番号１７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
    ｘｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１５のＣＤＲ２及び配列番号１８のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
    ｘｉｉ）配列番号３のＣＤＲ１、配列番号１６のＣＤＲ２及び配列番号７のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載の重鎖可変領域。
  5. 配列番号２０〜３２のアミノ酸配列からなる群から選ばれるものである、請求項１に記載の重鎖可変領域。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の重鎖可変領域を含む、完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  7. 細胞質浸透能を有することを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  8. 前記抗体の軽鎖可変領域は、配列番号３４〜４３のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  9. 前記抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、細胞膜タンパク質ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、インテグリンαｖβ３（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ３）又はインテグリンαｖβ５（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ５）を標的するペプチドが融合されたことを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  10. 前記軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号４４〜６３のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  11. ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭからなる群から選ばれるヒト免疫グロブリンに由来した重鎖定常領域又は軽鎖定常領域を含むことを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  12. 前記重鎖定常領域は、ＣＨ３領域のＮ４３４Ｄ、ＣＨ２領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ又はＰ３２９Ｇのいずれか一つ以上の突然変異を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
    （ただし、前記アミノ酸位置はＥＵ番号（ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に従う。）
  13. 前記重鎖定常領域変異体は、配列番号６５〜６９のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１２に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  14. 単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及びこれら抗体のエピトープ−結合断片からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  15. 二重特異抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｂ）であることを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  16. タンパク質、ペプチド、小分子薬物、毒素、酵素又は核酸又はナノ粒子からなる群から選ばれるいずれか一つ以上と融合されたことを特徴とする、請求項６に記載の完全な形態のイムノグロブリン抗体。
  17. 次の段階を含む、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上し、腫瘍組織特異的細胞質浸透能を有する完全な形態のイムノグロブリン抗体の製造方法。
    （１）ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）及びヒト重鎖定常領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた重鎖で重鎖可変領域（ＶＨ）が細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上したヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）に置換された核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングしたエンドソーム脱出重鎖発現ベクターを製造する段階；
    （２）ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）及びヒト軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖で軽鎖可変領域（ＶＬ）が細胞質に浸透するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えたヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）に置換された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）をクローニングした細胞質浸透軽鎖発現ベクターを製造する段階；
    （３）前記製造された重鎖、軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに対する親和度が向上したヒト化重鎖可変領域（ＶＨ）及び腫瘍組織特異的細胞質浸透能を与えたヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む完全なイムノグロブリン形態の抗体を発現させる段階；及び
    （４）前記発現した完全なイムノグロブリン形態の抗体を精製及び回収する段階。
  18. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌の予防又は治療用組成物。
  19. 前記癌は、細胞内Ｒａｓが活性化された突然変異を有することを特徴とする、請求項１８に記載の癌の予防又は治療用組成物。
  20. 前記Ｒａｓが活性化された突然変異は、Ｒａｓの１２番目、１３番目又は６１番目アミノ酸に突然変異が発生した癌であることを特徴とする、請求項１９に記載の癌の予防又は治療用組成物。
  21. 前記癌の予防又は治療は、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の抗体が細胞質内でＢ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ又はＰＩ３Ｋと活性化されたＲａｓ（Ｒａｓ・ＧＴＰ）との結合を抑制することを特徴とする、請求項１８に記載の癌の予防又は治療用組成物。
  22. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を含む腫瘍診断用組成物。
  23. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  24. 請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  25. 次の段階を含む、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域ライブラリー構築方法。
    （１）ライブラリー鋳型であるＲＴ１１重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合に関与する３個の相補性結合部位（ＣＤＲ）のうち、細胞内Ｒａｓ・ＧＴＰに結合する可能性が高いアミノ酸座位を選定する段階；
    （２）前記選定したアミノ酸座位に、ライブラリーに含めようとするアミノ酸をコード可能なデジェネレートコドン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｄｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）をデザインする段階；及び
    （３）前記デザインした重鎖可変領域ライブラリーを酵母表面発現システムを用いてｓｃＦａｂ又はＦａｂ形態で発現させる段階。
  26. 請求項２５に記載の方法で構築された、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域ライブラリー。
  27. 次の段階を含む、Ｒａｓ・ＧＴＰに特異的に結合し、親和度が改良された重鎖可変領域のスクリーニング方法。
    （１）請求項２５に記載の（３）によって製造された、Ｒａｓ・ＧＴＰに結合可能な重鎖可変領域ライブラリーを酵母表面発現システムを用いて発現させる段階；
    （２）ビオチン化時に変形を克服し、安定した形態でＧＴＰ類似体であるＧｐｐＮＨｐと結合された形態のＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄの構築及び発現段階；
    （３）ＧｐｐＮＨｐが結合されたＡｖｉ−ＫＲａｓＧ１２Ｄと前記重鎖可変領域ライブラリーを結合させる段階；及び
    （４）前記ＧｐｐＮＨｐが結合されたＲａｓと前記重鎖可変領域ライブラリー結合の親和度を測定する段階。

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