JP2021508706A - Peg化タンパク質組成物を提供するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、PEG化タンパク質組成物を提供するための方法、特に、モノPEG化タンパク質組成物を提供するために方法に関する。特に、本発明は、モノPEG化エリスロポエチン(EPO)組成物を提供するための方法に関する。
タンパク質のPEG化またはペグ化とは、タンパク質に対する1つまたは複数のPEG(ポリエチレングリコール)基の付加を指す。PEG化は、例えば、インビボ循環半減期を増加させるため、治療用タンパク質のために特に有用である。しかし、PEG化はまた、治療用タンパク質の生物活性を低減させ、それによってその有効性を低減させる可能性がある。したがって、循環時間の増加と治療効力の低減との間には、とるべき釣り合いがある。
添付の図面を参照して、本発明の原理を例証する態様および実験を次に議論する。
本発明は、モノPEG化タンパク質組成物を提供するための方法に関する。本発明は、少なくとも90%のモノPEG化タンパク質を含むタンパク質組成物を提供するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも90%のモノPEG化EPOを含むEPO組成物を提供するための方法を提供する。
タンパク質の「等電点」または「pI」とは、タンパク質がゼロの正味の全体的な電荷を有するpHである。すなわち、タンパク質のpIとは、タンパク質が同等数の正電荷および負電荷を有するpHである。任意の所与のタンパク質についてのpIの決定は、等電点電気泳動などの十分に確立された技術に従って行うことができる。EPOのpIは、4.0〜5.5の範囲にある。pIを測定する代替法は、わずかに異なる値を与える可能性があり、例えば、マイクロチップ等電点電気泳動は、約3.5〜4.0の見かけのpIを与える(Vlckova 2008)。EPOの正確なpIは、例えば、グリコシル化およびシアル酸残基の程度、または電荷バリアントの存在に依存する可能性があり、これは次に、それが生成されている手段(例えば、組換え発現に用いられる宿主細胞)に依存する可能性がある。
本発明は、モノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法を提供する。本発明は、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物からモノPEG化タンパク質を精製するための方法を提供する。
本発明の方法は、第1の混合物を提供する工程(工程a)を含む。本発明の方法は、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む第1の混合物を用いて実施される。第1の混合物は、非PEG化タンパク質およびPEG化タンパク質を含み、該PEG化タンパク質は、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を含む。タンパク質は、EPOであってもよい。
第1の混合物は、イオン交換クロマトグラフィー(AEC)ステップに供される(工程b)。これは、第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているIECフロースルー溶液を提供する。これは、第1の混合物に比べて非PEG化タンパク質の画分が減少しているIECフロースルー溶液を提供する。IECステップは、AECステップまたはCECステップであってもよい。
第1の混合物は、アニオン交換クロマトグラフィー(AEC)ステップに供されてもよい(工程b)。これは、第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているAECフロースルー溶液を提供する。これは、第1の混合物に比べて非PEG化タンパク質の画分が減少しているAECフロースルー溶液を提供する。
IECステップは、CECステップであってもよい。第1の混合物は、カチオン交換クロマトグラフィー(CEC)ステップに供されてもよい(工程b)。これは、第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているCECフロースルー溶液を提供する。これは、第1の混合物に比べて非PEG化タンパク質の画分が減少しているCECフロースルー溶液を提供する。
上記のように、本発明の方法は、第1の混合物をアニオン交換クロマトグラフィー(AEC)ステップに供する工程(工程b)を含む。アニオン交換クロマトグラフィーステップ由来のフロースルーが、第2の混合物を提供するために用いられる(工程c)。例えば、第2の混合物は、1つまたは複数のAECステップ由来の収集されたフロースルーを含んでもよい。第2の混合物を提供する工程は、第2の混合物のバッチをHIC装置(例えば、HICカラム)に提供することを含んでもよい。あるいは、第2の混合物を提供する工程は、インライン接続を介してフロースルーをHIC装置(例えば、HICカラム)に提供することを含んでもよい。
HIC材料は、疎水性リガンドで官能基化されている樹脂を含んでもよい。HIC材料上の疎水性リガンドは、タンパク質の疎水性表面と相互作用し得る。HIC材料上のリガンドおよび置換の程度(高いかまたは低い置換「sub」)が、その最終的な疎水性に、およびそれによってその選択性に寄与し得る。リガンドは、アルキル基またはアリール基を含有し得る。HIC材料の疎水性は、リガンド系列:エーテル、ポリプロピレングリコール(PPG)、フェニル、ブチル、およびヘキシルを通して増大する。
前記方法は、第1の混合物を提供するために、PEG化反応を実施することを含んでもよい。そのような方法において、非PEG化(未反応)タンパク質は、それをその後のPEG化反応に含めることによって、再利用されてもよい。方法は、(a)PEG化反応を実施することによって第1の混合物を提供する工程、(b)IECステップを実施する工程、および(c)IECステップからフロースルーを収集することを含む、第2の混合物を提供する工程を含んでもよい。再利用を含む方法においては、工程a、b、およびcのサイクルが実施され、ここで、非PEG化タンパク質が工程bにおいて回収され;次いで、工程a、b、およびcのさらなるサイクルが実施され、かつここで、回収された非PEG化タンパク質が工程aのPEG化反応に用いられる。すなわち、さらなるサイクルが実施され、ここで、前のサイクル由来の非PEG化タンパク質が、そのさらなるサイクルのPEG化反応に用いられる。IECステップは、AECまたはCECであってもよい。
本発明の方法におけるIECステップおよびHICステップは、順次実施されてもよい。例えば、本発明の方法におけるAECステップおよびHICステップは、順次実施されてもよい。すなわち、方法は、以下の順次の工程を含んでもよい:(a)非PEG化タンパク質とPEG化タンパク質とを含む第1の混合物を提供する工程であって、該PEG化タンパク質が、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を含む、工程;(b)第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているアニオン交換クロマトグラフィー(AEC)フロースルー溶液を提供するために、第1の混合物をAECステップに供する工程であって、該AECステップが、非PEG化タンパク質の結合に適している条件下で第1の混合物をAEC材料にアプライすることを含む、工程;(c)モノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む第2の混合物を提供するために、工程(b)からAECフロースルー溶液を収集する工程;ならびに(d)第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているモノPEG化タンパク質組成物を提供するために、第2の混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)ステップに供する工程であって、該モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含む、工程。
本発明の方法は、タンパク質のPEG化型に対して相対的に低い結合能力とタンパク質の非PEG化型に対して相対的に高い結合能力とを有するIEC材料を用いる。これは、非PEG化タンパク質のPEG化タンパク質からの迅速な分離を容易にするため、有利である。カラムの結合能力の多くは、タンパク質の非PEG化型に対する結合のために用いられ、これは、相対的に小さいカラムを用いた、第1の混合物(非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物)の相対的に大きな体積の処理を容易にする。これは、第1の混合物が、概して、(IEC結合材料がそれに対して相対的に高い結合能力を有する)非PEG化タンパク質が相対的に低く、かつ(IEC結合材料がそれに対して相対的に低い結合能力を有する)PEG化タンパク質が高いためであり、このことは、作動中に、本明細書に開示される方法が、IECステップにおいて相対的に大きな体積の第1の混合物を処理できることを意味する。非PEG化タンパク質のPEG化タンパク質からの相対的に迅速な分離は、非PEG化タンパク質の迅速な再利用、および全体的なプロセス効率を促進する。
クロマトグラフィー材料の結合能力とは、定義された実験条件下で媒体に結合することができるタンパク質の量を指す。本明細書における結合能力とは、動的結合能力を指し得る。動的結合能力とは、移動相(または緩衝液)の流速を含む定義された実験条件下で、媒体に結合することができるタンパク質の量を指す。結合能力は、流速を含まない定義された実験条件を指す、静的結合能力を指し得る。
クロマトグラフィー材料上にロードされるタンパク質の量は、材料の結合能力に依存し得る。例えば、AEC材料が、約35 g/Lの非PEG化EPOに対する結合能力を有し、かつ第1の混合物におけるEPOの約50%が、非PEG化である場合には、AEC材料にアプライされる(総タンパク質に換算した)第1の混合物の最大ロードは、約70 g/Lであることになる。
ポリ(エチレングリコール)すなわちPEGは、中性親水性ポリエーテルである。ポリマー化合物としてのPEGは、規定された分子量では得られないが、実際のところ分子量分布を有するため、本文脈における(kDaでの)「分子量」という用語は、PEGの平均分子量として理解されるべきであり;「約」という用語は、いくらかのPEG分子または残基は、示される分子量よりも重く、いくらかはそれよりも軽いことを示し、すなわち、本文脈における「約」という用語は、その中のPEG分子の95%が示される分子量の+/-10%以内の分子量を有する、分子量分布を指し得る。例えば、30 kDaの分子量は、27 kDa〜33 kDaの範囲を表し得る。
「エリスロポエチン」およびその略語である「EPO」という用語は、SEQ ID NO: 1もしくはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれに対して実質的に相同なタンパク質もしくはポリペプチドを指し、その生物学的特性は、骨髄における赤血球産生の刺激ならびにコミットした赤血球前駆細胞の***および分化の刺激に関する。組換えエリスロポエチンは、組換えDNA技術によって、または内在性遺伝子活性化によって、真核細胞、例えば、CHO細胞、またはBHK細胞、またはHeLa細胞における発現を介して調製されてもよく、すなわち、エリスロポエチン糖タンパク質は、内在性遺伝子活性化によって発現される。例えば、US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、およびWO 91/09955を参照されたい。EPOは、ヒトEPOであってもよい。EPOは、グリコシル化EPOであってもよい。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本発明の方法は特に、モノPEG化EPO組成物を生成するのに適している。本明細書におけるタンパク質または関心対象のタンパク質への言及は、EPOを指し得る。
非PEG化EPOとモノPEG化EPOとオリゴPEG化EPOとを含む第1の混合物を提供するために、EPOを、NHS活性化PEG試薬(約30 kDaの分子量)を用いてpH 8.0で、25 mMビシンおよび7.5 mM Na2SO4においてPEG化した。
EPOのPEG化
EPOストック溶液を融解し、3 kDa Centricon遠心フィルターを用いて6.5 g/lに濃縮して、25 mMビシン、pH 8において緩衝化した。7.7 mlのこの溶液を、次いで、50 ml Falconチューブに移して、0.3 mlの25 mMビシン、pH 8緩衝液と混合した。96 mgのPEG試薬を、秤量し、3 mlの1 mM HClに溶解して、PEG化溶液を調製した。
第1のステップとして、PEG化EPOを、上記で概要を述べたように生成させた。1 mlのPEG化EPO溶液を、Eppendorfカップに移して、残りの9 mlを、50 mlシリンジを用いて150 ml Superloop中に注入し、アニオン交換クロマトグラフィーを開始した。
RP HPLC分析の測定された結果を、表3に示す。循環的にPEG化されたEPOプールにおけるEPOの質量によるパーセンテージは、平均して約95%である。
循環的なPEG化、AECクロマトグラフィーによるエリスロポエチンの除去、およびHICによるモノPEG EPOの精製
この実験の目的は、3回のサイクルにおいてEPOをPEG化すること、ならびに、アニオン交換クロマトグラフィー(AEC)およびHICを用いて、反応生成物(非PEG化EPO、単一PEG化EPO(モノPEG EPO)、およびEPOのオリゴPEG化型)を分離することである。
7 mmの内径および100 mmのベッド高を有するカラムに、Toyopearl SuperQ-650M吸着材料を充填して、200 cm/h(1.28 ml/分)の流速で作動させ、3.847 mlのカラム容量で約30分のプロセスステップ時間を結果としてもたらした。
25 mMビシン、7.5 mM Na2SO4において12.5 g/lの濃度を有するEPOストック溶液を用いた。225 mg EPOに対応する、18 mlの出発体積の、このストック溶液を用いた。
10 mmの内径を有する220 mm高のカラムを用いた。用いた吸着剤は、Tosoh由来のToyopearl Phenyl-650Mであった。カラムの容量は、17.27 mlであった。これを、150 cm/hの流速で作動させた。このカラムを用いて、標的生成物であるモノPEG EPOを、モノPEG EPOおよびオリゴの混合物から抽出した。
上記の生成物プール1(本明細書に開示される方法による「第2の混合物」;2.27 g/lのタンパク質濃度)から、15 mlを採取し、20 mlの25 mMビシン、1 M Na2SO4、pH 8溶液を用いて56 mS/cmの伝導率に調整した。この試料を、150 ml Superloopを通して完全に分配した。
0.58% EPO、79.9%モノPEG EPO、および19.52%オリゴ型から構成される、47.03 mgのタンパク質レベルに対応する、完全な62.7 mlの生成物プール2(本明細書に開示される方法による「第2の混合物」)を、分離のための試料として用いた。試料の伝導率を、50 mS/cmの伝導率の標的まで、25 mMビシン、1 M Na2SO4、pH 8緩衝液によって調整し、150 ml Superloopを介して注入した。
循環的なPEG化、およびAEC
表5は、個々の試料の組成、およびタンパク質の量の収支を示す。
表5は、RP HPLC分析の結果を示す。
個々の画分の低いタンパク質濃度のために、いかなる有意義な結果も、RP HPLCによって生じ得なかった。しかし、クロマトグラムは、モノPEG化EPOの非PEG化型およびオリゴPEG化型からの分離が達成されたことを示す。
本発明および本発明が属する技術分野の最先端をより完全に説明し、かつ開示するために、多数の刊行物が上記で引用されている。これらの参照文献の完全な引用を、下記に提供する。これらの参照文献の各々の全体は、本明細書に組み入れられる。
標準的な分子生物学技術については、Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。
1. 以下の工程を含む、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法:
(a)非PEG化タンパク質とPEG化タンパク質とを含む第1の混合物を提供する工程であって、該PEG化タンパク質が、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を含む、該工程;
(b)該第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているイオン交換クロマトグラフィー(IEC)フロースルー溶液を提供するために、該第1の混合物をIECステップに供する工程であって、該IECステップが、非PEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第1の混合物をIEC材料にアプライすることを含む、該工程;
(c)モノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む第2の混合物を提供するために、工程(b)から該IECフロースルー溶液を収集する工程;ならびに
(d)該第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているモノPEG化タンパク質組成物を提供するために、該第2の混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)ステップに供する工程であって、該モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含む、該工程。
2. 前記IECステップが、アニオン交換クロマトグラフィー(AEC)ステップまたはカチオン交換クロマトグラフィー(CEC)ステップである、記載1による方法。
3. 前記IECステップがAECステップである、記載2による方法。
4. 以下の工程を含む、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法:
(a)非PEG化タンパク質とPEG化タンパク質とを含む第1の混合物を提供する工程であって、該PEG化タンパク質が、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を含む、該工程;
(b)該第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているアニオン交換クロマトグラフィー(AEC)フロースルー溶液を提供するために、該第1の混合物をAECステップに供する工程であって、該AECステップが、非PEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第1の混合物をAEC材料にアプライすることを含む、該工程;
(c)モノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む第2の混合物を提供するために、工程(b)から該AECフロースルー溶液を収集する工程;ならびに
(d)該第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているモノPEG化タンパク質組成物を提供するために、該第2の混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)ステップに供する工程であって、該モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含む、該工程。
5. 前記タンパク質がホルモンまたはサイトカインである、いずれかの前記記載による方法。
6. 前記タンパク質がエリスロポエチンである、いずれかの前記記載による方法。
7. 前記IEC材料が、約1.5 g/L未満の、前記PEG化タンパク質に対する結合能力を有する、前記記載のいずれかによる方法。
8. 前記AEC材料が、約1.5 g/L未満の、前記PEG化タンパク質に対する結合能力を有する、前記記載のいずれかによる方法。
9. i. 前記第1の混合物が、25%未満のオリゴPEG化タンパク質を含み;かつ/または
ii. 前記AECフロースルー溶液が、少なくとも90%のPEG化タンパク質を含み;かつ/または
iii. 前記モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは少なくとも約99.9%のモノPEG化タンパク質を含む、
前記記載のいずれかによる方法。
10. 工程(a)が、前記非PEG化タンパク質とPEG化試薬との反応を含むPEG化反応を実施することをさらに含む、前記記載のいずれかによる方法。
11. 前記PEG化反応が約7.0〜9.0のpHで実施され、かつPEG/タンパク質のモル比が約0.6〜1.0である、記載10による方法。
12. 前記IECステップがAECステップである、記載11による方法。
13. 工程(a)が、前記第1の混合物を提供するために、前記非PEG化タンパク質とPEG化試薬との反応を含むPEG化反応を実施することを含み、該第1の混合物を前記IEC材料にアプライする前に、該第1の混合物のpHを調整するステップが存在しない、記載10または記載11による方法。
14. 工程(a)、(b)、および(c)を含む第1のサイクルの実施であって、工程(b)が、IEC溶出液を提供するために非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることをさらに含む、該実施、ならびに
工程(a)、(b)、および(c)の第2のサイクルの実施であって、該第1のサイクルの工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、工程(a)のPEG化反応に加えられる、該実施
を含む、記載10〜13のいずれかによる方法。
15. 非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることが、約45 mM未満または約45 mMの塩を含む溶出緩衝液を用いる、記載14による方法。
16. 工程(b)が、工程(a)、(b)、および(c)を含む第1のサイクルの実施であって、AEC溶出液を提供するために非PEG化タンパク質を前記AEC材料から溶出させることをさらに含む、該実施、ならびに
工程(a)、(b)、および(c)の第2のサイクルの実施であって、該第1のサイクルの工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、工程(a)のPEG化反応に加えられる、該実施
を含む、記載10〜15のいずれかによる方法。
17. 非PEG化タンパク質を前記AEC材料から溶出させることが、約45 mM未満または約45 mMの塩を含む溶出緩衝液を用いる、記載16による方法。
18. 前記方法が、3回、4回、または5回のサイクルを含み、かつ、各サイクルの工程(b)が、IEC溶出液を提供するために、非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることを含み、かつ工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、次のサイクルにおける工程(a)のPEG化反応に加えられる、記載14〜17のいずれかによる方法。
19. サイクルの工程(b)由来のIEC溶出液が、次のサイクルの工程(a)のPEG化反応に直接加えられる、記載14〜18のいずれかによる方法。
20. 前記方法が、3回、4回、または5回のサイクルを含み、かつ、各サイクルの工程(b)が、AEC溶出液を提供するために非PEG化タンパク質を前記AEC材料から溶出させることを含み、かつ工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、次のサイクルにおける工程(a)のPEG化反応に加えられる、記載14〜19のいずれかによる方法。
21. サイクルの工程(b)由来のAEC溶出液が、次のサイクルの工程(a)のPEG化反応に直接加えられる、記載14〜20のいずれかによる方法。
22. サイクルの工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、次のサイクルの工程(a)のPEG化反応に加えられ、かつ、各サイクルの工程(a)において実質的に一定のPEG化反応条件を維持するために新たな非PEG化タンパク質もまた工程(a)に加えられる、記載14〜21のいずれかによる方法。
23. 工程(a)、(b)、および(c)の2回またはそれ以上のサイクルの実施を含み、
工程(c)が、プールされた第2の混合物である第2の混合物を提供するために、各IECステップから収集された前記フロースルー溶液をプールすることをさらに含み、かつ
工程(d)が、前記第2の混合物をHICステップに供することを含む、
前記記載のいずれかによる方法。
24. 工程(a)、(b)、および(c)の2回またはそれ以上のサイクルの実施を含み、
工程(c)が、プールされた第2の混合物である第2の混合物を提供するために、各AECステップから収集された前記フロースルー溶液をプールすることをさらに含み、かつ
工程(d)が、該第2の混合物をHICステップに供することを含む、
前記記載のいずれかによる方法。
25. i. AEC材料が、Toyopearl Super Q 650Mであり;かつ/または
ii. AECステップが、約7.0〜9.0のpHで実施され;かつ/または
iii. AECステップが、約1.0〜3.0 mS/cmの伝導率で実施され;かつ/または
iv. 第1の混合物が、約10〜30 mMのビシンと約1〜10 mMのNa2SO4とを含むAECロード溶液としてAEC材料にアプライされる、
前記記載のいずれかによる方法。
26. 前記タンパク質がエリスロポエチンである、記載25による方法。
27. 前記第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているHICフロースルー溶液を提供するために、工程(d)が、該第2の混合物をフロースルーモードにおいてHICステップに供することを含み、
該HICステップが、オリゴPEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第2の混合物をHIC材料にアプライすることを含み、該HICフロースルーが前記モノPEG化タンパク質組成物を提供する、
前記記載のいずれかによる方法。
28.前記第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているHIC溶出液を提供するために、工程(d)が、該第2の混合物を結合および溶出モードにおいてHICステップに供することを含み、該HICステップが、
モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第2の混合物をHIC材料にアプライすること、
該モノPEG化タンパク質を提供するHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該HIC材料から溶出させること
を含む、記載1〜26のいずれかによる方法。
29. i. HIC材料が、Toyopearl Phenyl 650Mであり;かつ/または
ii. HICステップが、約7.0〜9.0のpHで実施され;かつ/または
iii. HICステップが、約30〜40 mS/cmの伝導率で実施され;かつ/または
iv. 第2の混合物が、約25 mMのビシンと約390 mMのNa2SO4とを含むHICロード溶液としてHIC材料にアプライされる、
記載27による方法。
30. i. 前記HIC材料が、Toyopearl Phenyl 650Mであり;かつ/または
ii. 前記HICステップが、約7.0〜9.0のpHで実施され;かつ/または
iii. 前記モノPEG化タンパク質をHIC材料から溶出させるステップが、約50 mS/cmから0 mS/cmまでの勾配をアプライすることを含み;かつ/または
iv. 前記第2の混合物が、約25 mMのビシンと約500 mMのNa2SO4とを含むHICロード溶液としてHIC材料にアプライされる、
記載28による方法。
31. i. IECステップおよびHICステップが、実質的に同じpHで実施されるか;または
ii. PEG化反応、IECステップ、およびHICステップが、実質的に同じpHで実施される、
前記記載のいずれかによる方法。
32. i. AECステップおよびHICステップが、実質的に同じpHで実施されるか;または
ii. PEG化反応、AECステップ、およびHICステップが、実質的に同じpHで実施される、
前記記載のいずれかによる方法。
33. モノPEG化タンパク質が、少なくとも約20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、前記記載のいずれかによる方法。
34. 薬学的組成物を提供するために、前記タンパク質組成物を薬学的に許容される担体と共に製剤化する工程をさらに含む、前記記載のいずれかによる方法。
Claims (21)
- 以下の工程を含む、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法:
(a)非PEG化タンパク質とPEG化タンパク質とを含む第1の混合物を提供する工程であって、該PEG化タンパク質が、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を含む、該工程;
(b)該第1の混合物に比べてPEG化タンパク質の画分が増大しているイオン交換クロマトグラフィー(IEC)フロースルー溶液を提供するために、該第1の混合物をIECステップに供する工程であって、該IECステップが、非PEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第1の混合物をIEC材料にアプライすることを含む、該工程;
(c)モノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む第2の混合物を提供するために、工程(b)から該IECフロースルー溶液を収集する工程;ならびに
(d)該第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているモノPEG化タンパク質組成物を提供するために、該第2の混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)ステップに供する工程であって、該モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約90%のモノPEG化タンパク質を含む、該工程。 - 前記タンパク質が、ホルモン、サイトカイン、酵素、または抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がエリスロポエチンである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィー(IEC)ステップが、アニオン交換クロマトグラフィー(AEC)ステップである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IEC材料が、約1.5 g/L未満の、前記PEG化タンパク質に対する結合能力を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- i. 前記第1の混合物が、25%未満のオリゴPEG化タンパク質を含み;かつ/または
ii. 前記IECフロースルー溶液が、少なくとも90%のPEG化タンパク質を含み;かつ/または
iii. 前記モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、もしくは少なくとも約99.9%のモノPEG化タンパク質を含む、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 工程(a)が、前記非PEG化タンパク質とPEG化試薬との反応を含むPEG化反応を実施することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEG化反応が約7.0〜9.0のpHで実施され、かつPEG/タンパク質のモル比が約0.6〜1.0である、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)、(b)、および(c)を含む第1のサイクルの実施であって、工程(b)が、IEC溶出液を提供するために非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることをさらに含む、該実施、ならびに
工程(a)、(b)、および(c)の第2のサイクルの実施であって、該第1のサイクルの工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、工程(a)のPEG化反応に加えられる、該実施
を含む、請求項7または請求項8に記載の方法。 - 非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることが、約45 mM未満または約45 mMの塩を含む溶出緩衝液を用いる、請求項9に記載の方法。
- 前記方法が、3回、4回、または5回のサイクルを含み、かつ、各サイクルの工程(b)が、IEC溶出液を提供するために非PEG化タンパク質を前記IEC材料から溶出させることを含み、かつ工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、次のサイクルにおける工程(a)のPEG化反応に加えられる、請求項9または請求項10に記載の方法。
- サイクルの工程(b)由来のIEC溶出液が、次のサイクルの工程(a)のPEG化反応に直接加えられる、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- サイクルの工程(b)において溶出された前記非PEG化タンパク質が、次のサイクルの工程(a)のPEG化反応に加えられ、かつ、各サイクルの工程(a)において実質的に一定のPEG化反応条件を維持するために新たな非PEG化タンパク質もまた工程(a)に加えられる、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)、(b)、および(c)の2回またはそれ以上のサイクルの実施を含み、
工程(c)が、プールされた第2の混合物である第2の混合物を提供するために、各IECステップから収集された前記フロースルー溶液をプールすることをさらに含み、かつ
工程(d)が、該第2の混合物をHICステップに供することを含む、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 前記IECステップがAECステップであり、かつ
i. AEC材料が、Toyopearl Super Q 650Mであり;かつ/または
ii. AECステップが、約7.0〜9.0のpHで実施され;かつ/または
iii. AECステップが、約1.0〜3.0 mS/cmの伝導率で実施され;かつ/または
iv. 第1の混合物が、約10〜30 mMのビシンと約1〜10 mMのNa2SO4とを含むAECロード溶液としてAEC材料にアプライされる、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているHICフロースルー溶液を提供するために、工程(d)が、該第2の混合物をフロースルーモードにおいてHICステップに供することを含み、
該HICステップが、オリゴPEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第2の混合物をHIC材料にアプライすることを含み、該HICフロースルーが前記モノPEG化タンパク質組成物を提供する、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第2の混合物に比べてモノPEG化タンパク質の画分が増大しているHIC溶出液を提供するために、工程(d)が、該第2の混合物を結合および溶出モードにおいてHICステップに供することを含み、該HICステップが、
モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質の結合に適している条件下で該第2の混合物をHIC材料にアプライすること、
該モノPEG化タンパク質を提供するHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該HIC材料から溶出させること
を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。 - i. HIC材料が、Toyopearl Phenyl 650Mであり;かつ/または
ii. HICステップが、約7.0〜9.0のpHで実施され;かつ/または
iii. HICステップが、約30〜40 mS/cmの伝導率で実施され;かつ/または
iv. 第2の混合物が、約25 mMのビシンと約390 mMのNa2SO4とを含むHICロード溶液としてHIC材料にアプライされる、
請求項16に記載の方法。 - i. IECステップおよびHICステップが、実質的に同じpHで実施されるか;または
ii. PEG化反応、IECステップ、およびHICステップが、実質的に同じpHで実施される、
前記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - モノPEG化タンパク質が、少なくとも約20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 薬学的組成物を提供するために、前記タンパク質組成物を薬学的に許容される担体と共に製剤化する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
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