JP2021505187A

JP2021505187A - 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物

Info

Publication number: JP2021505187A
Application number: JP2020531964A
Authority: JP
Inventors: ジェニファーゴリ，; ジョンズーリス，; ハリハランジャヤラム，
Original assignee: エディタス・メディシン、インコーポレイテッド
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2021-02-18
Also published as: JP2024023294A; KR20200097760A; WO2019118516A1; CA3085338A1; CN111712569A; US20200299661A1; MX2020006072A; EP3724326A1; AU2018383712A1

Abstract

本開示は、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素並びにこのような編集及び／又は発現の調整を評価するための方法及び組成物に関する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの優先権が主張され、そのそれぞれの内容が全体として本明細書に援用される、２０１７年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５９７，１１８号、２０１８年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２３，５０１号、２０１８年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／６６４，９０５号及び２０１８年１０月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７４６，４９４号に対する優先権を主張する。

配列リスト
本明細書には、２０１８年１２月１１日にＥＦＳを介して提出された配列リストが参照によりさらに組み込まれる。３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従い、０８４１７７０２１０ＳＬ．ｔｘｔとして同定される配列リストのテキストファイルは、４４４，０３２バイトであり、２０１８年１２月１１日に作成された。配列表の内容全体は、本明細書に参照により援用される。配列リストは、本明細書の範囲を超えて拡張されず、したがって新しい事項は含まない。

本開示は、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素並びにこのような編集及び／又は発現の調整を評価するための方法及び組成物に関する。

ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は、細菌及び古細菌において、ウイルスの攻撃から防御するための適応性免疫系として発達した。ウイルスへの曝露に際して、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するそのＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的配列へのＣｐｆ１タンパク質の標的化を媒介する。Ｃａｓ１２ａとしても知られるＣｐｆ１タンパク質（「プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）からのＣＲＩＳＰＲ１」）は、次に切断し、それによってウイルス標的を発現停止する。

最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが真核細胞内のゲノム編集のために応用されている。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同指向修復（ＨＤＲ）などの内因性ＤＮＡ修復機構を通じた標的配列改変を可能にする。

本開示は、例えば、治療に関連する細胞株における及び治療に関連する標的配列に関して、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素の改善並びにこのような標的編集及び／又は発現の調整の効率を評価するためのストラテジーを提供する。

一態様では、本開示は、治療に関連する細胞集団における、治療に関連する標的部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、本開示は、治療に関連する標的部位の修飾を含む単離された細胞を提供する。特定の実施形態では、細胞は、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞などのＴ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞、ナチュラルキラー細胞又は樹状細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＨＳＣ又はＨＵＤＥＰ細胞である。

特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、例えばＨＢＧ遺伝子の調節領域を含むＨＢＧ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰ複合体の送達によって生成される、例えばＨＢＧ遺伝子座の破壊などの修飾を含む単離された細胞又は細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子との間の複合体を含む。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の任意の領域が標的化され得る。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子のシス調節領域が標的化される。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域の破壊などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、本開示は、例えば、−１１０ｎｔプロモーター領域などのＨＢＧ遺伝子座の−８００〜−６０ｎｔプロモーター領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座のシス調節領域は、例えば、破壊されるなど、編集され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のシス調節領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊され得る。一般に、ＨＢＧプロモーター領域の破壊及びＣＡＡＴボックスの破壊は、これらの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＨＢＧ遺伝子座のこれらの配列を標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の非限定的例は、図６、９及び１１並びに表１９に特定される。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ１−１と称されるｇＲＮＡ分子の配列を含む。

特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域を標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域を標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスを標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、このような構成要素を検知するために使用される適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスを標的とするガイドＲＮＡとを含む複合体を使用して破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。

特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、例えば転写リプレッサーＢＣＬ１１ａの赤血球系細胞特定発現の妨害などの修飾をはじめとするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を使用して編集されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞又は細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列の任意の領域が標的化され得る。例えば、限定されるものではないが、例えば転写開始部位（ＴＳＳ）から＋５５ｋｂ〜＋６２ｋｂの赤血球系エンハンサー領域などのＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球系エンハンサー領域が標的化され得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域に存在するＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１結合モチーフが破壊され得る。ＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１結合モチーフの破壊は、そのモチーフを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＢＣＬ１１ａのＧＡＴＡ１モチーフを標的とする、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の非限定的例は、図７、１０及び１２で特定される。

特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団に関する。特定の実施形態では、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞内又は細胞集団内でＢＣＬ１１ａ遺伝子を修飾又は破壊するのに使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの１つ又は複数の構成要素は、このような構成要素を検出するために使用される適切な手段を使用して検出不能である。

特定の実施形態では、本開示は、例えば、Ｔ細胞の１つ又は複数の内因性遺伝子の破壊などの修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｔ細胞の内因性遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、修飾は、例えば、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部又はそれらの組み合わせを標的とする、ＲＮＰ複合体などのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子とを含む１つ又は複数の複合体の送達によって生成される。例えば、限定されるものではないが、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０の複合体、例えばＲＮＰ複合体が送達され得、複合体のそれぞれは、異なる遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的化される遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化される遺伝子の調節領域、イントロン又はエクソンを標的とし得る。

特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とし、例えばＴＲＡＣ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。

特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とし、例えばＴＲＢＣ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＢＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。

特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とし、例えばＢ２Ｍ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、核酸配列ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。

特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とし、例えばＣＩＩＴＡ遺伝子の破壊などの修飾を含む例えば単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。

特定の実施形態では、本明細書の開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、これらの遺伝子の２つ以上の１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン又は１つ若しくは複数の調節領域を標的とするｇＲＮＡを使用して、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ遺伝子の２つ以上の組み合わせを標的とし、例えばＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ遺伝子の２つ以上の破壊などの修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団が生成する。特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される遺伝子の１つ又は複数を標的とする、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとｇＲＮＡ分子とを含む１つ又は複数の複合体を含み得る。例えば、限定されるものではないが、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的ドメインを含む第１のｇＲＮＡと、第１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体；及び（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体を含み得る。特定の実施形態では、第１の遺伝子及び第２の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、１つ又は複数の追加的な遺伝子を標的とする追加的なＲＮＰ複合体をさらに含み得る。例えば、限定されるものではないが、多重化の場合、各ＲＮＰ複合体は、同一のＣｐｆ１タンパク質を含有し得るか、又は各ＲＮＰ複合体は、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質変異型などの異なるＣｐｆ１タンパク質を含み得る。

特定の実施形態では、例えば、単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＨＳＣ若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団などの単離された細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、このような構成要素を検知する適切な手段を使用した判定で、細胞集団内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞の約１０％未満、約５％未満又は約１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が編集及び／又は修飾され、例えばＢＣＬ１１ａ遺伝子の破壊、ＨＢＧ遺伝子座の破壊及び／又はＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣから選択される１つ又は複数の遺伝子の破壊を有する。特定の実施形態では、細胞集団は、約１５％を超える編集、約２０％を超える編集、約２５％を超える編集、約３０％を超える編集、約３５％を超える編集、約４０％を超える編集、約４５％を超える編集、約５０％を超える編集、約５５％を超える編集又は約６０％を超える編集を有する。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。

別の態様では、本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法におけるそれらの使用とに関する。本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸をさらに提供する。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６Ｃｐｆ１タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノメチルフィルス（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｐｈｉｌｕｓ）ａｌｖｕｓＭｘ１２０１（ＣＭａＣｐｆ１）、スネアチア・アムニイ（Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ）（ＳａＣｐｆｑ）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ）（ＭｌＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６Ｃｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ５Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ４Ｃｐｆ１）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＬ−１５（ＦｂＣｐｆ１）、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）種ＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）、パルキュバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）群菌ＧＷ２０１１（ＰｇＣｐｆ１）、カンジダツス・ロイズマンバクテリア（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＲｂＣｐｆ１）、カンジダツス・ペレグリンバクテリア（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰｅｒｅｇｒｉｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＰｂＣｐｆ１）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）種ＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）（ＢｆＣｐｆ１）、プレボテラ・ブライアンチイ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｙａｎｔｉｉ）Ｂ１４（Ｐｂ２Ｃｐｆ１）及びバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）口腔分類群２７４（ＢｏＣｐｆ１）からなる群から選択されるＣｐｆ１タンパク質に由来する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＺｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ１３４０１５；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１３４０１５を参照されたい）。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。例えば、限定されるものではないが、このようなＮＬＳ配列は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に配置される。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳ（配列番号３）；Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮｓｔａｎｅｙＬＳ（配列番号４）；及びＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号５）から選択され得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に配置される。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）及びｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）から選択され得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を含む。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号９）及びＨｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号１０）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列（又は他のＮＬＳ配列）の組み合わせ並びに例えば６−ヒスチジン配列などの精製配列あり又はなしの配列を付加することなどのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端／Ｃ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列の１つ又は複数のシステイン残基に改変（例えば、欠失又は置換）を含む。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５及びＣ１２４８からなる群から選択される位置に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、セリン又はアラニンの１つ又は複数のシステイン残基の置換を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ｓ、Ｃ２０５Ｓ、Ｃ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ、Ｃ６０８Ｓ、Ｃ６７４Ｓ、Ｃ１０２５Ｓ及びＣ１２４８Ｓからなる群から選択される改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ａ、Ｃ２０５Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ、Ｃ６０８Ａ、Ｃ６７４Ａ、Ｃ１０２５Ａ及びＣ１２４８Ａからなる群から選択される改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、位置Ｃ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ｓ及びＣ６７４Ｓ又はＣ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ及びＣ６７４Ｓに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ａ及びＣ６７４Ａ又はＣ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ及びＣ６７４Ａに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｅｓｓ（配列番号１１）又はＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｏｗ（配列番号１２）などの１つ又は複数のシステイン残基改変並びに１つ又は複数のＮＬＳ配列の導入の両方を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のシステイン残基の欠失又は置換を含むＣｐｆ１タンパク質は、凝集の減少を示す。

さらなる態様では、本開示は、細胞内で１つ又は複数の標的配列を修飾する方法を提供する。特定の実施形態では、このような方法は、細胞又は細胞集団を、（ａ）関心のある標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含む。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、細胞又は細胞集団中の関心のある標的配列を修飾する。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞である。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、関心のある標的配列は、例えば、プロモーター領域などのＨＢＧ１遺伝子配列であり、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子ＨＢＧ１−１の配列を含む。特定の実施形態では、関心のある標的配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列である。代わりに、標的核酸配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本開示は、例えば、細胞を、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的ドメインを含む第１のｇＲＮＡと、第１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体；及び（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体に接触させることを含む、細胞内で２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数の遺伝子を修飾する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、方法は、（ｃ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子と、第３のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第３のＲＮＰ複合体、及び／又は（ｄ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第４のＲＮＰ複合体をさらに含み得る。特定の実施形態では、各ＲＮＰ複合体は、同一のＣｐｆ１タンパク質を含み得るか、又は各ＲＮＰ複合体は、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質変異型などの異なるＣｐｆ１タンパク質を含み得る。特定の実施形態では、細胞内で例えば２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数の遺伝子を修飾する方法は、細胞を、（ａ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ；（ｂ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び（ｃ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は開示されるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸によってコードされるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含み得る。特定の実施形態では、方法は、（ｄ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子、及び／又は（ｅ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み得る。Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び／又は第４の遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される。特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。

別の態様では、本開示は、本開示に包含されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いて修飾された１つ又は複数の細胞を対象に投与することにより、対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞は、エクスビボ又はインビトロで修飾され、次に対象に投与される。特定の実施形態では、対象を治療するための方法は、（ａ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを有する対象から得られた細胞を接触させることを含む。特定の実施形態では、本開示は、ドナーから得られ、対象への投与前に本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いてエクスビボ又はインビトロで遺伝子改変された１つ又は複数の細胞を対象に投与することにより、それを必要とする対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、対象は、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症に罹患している。特定の実施形態では、対象は、がん又は自己免疫障害に罹患している。

特定の実施形態では、本開示は、異常ヘモグロビン症に罹患している対象に細胞集団を投与する方法をさらに提供し、細胞集団は、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞である。

さらなる態様では、本開示は、関心のある核酸配列を標的とし、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞などの修飾細胞を生成するためのｇＲＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含み、標的配列は、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列である。このようなｇＲＮＡの非限定的例は、図６〜１２及び４６並びに表１９で提供される。特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを提供し、それが細胞に導入されると、ｇＲＮＡ分子の第１の標的化ドメインに相補的な標的配列又はその近傍にインデルが形成され、且つ／又はｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２プロモーター領域内のｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に欠失が生じる。特定の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞内に導入されると、胎児型ヘモグロビンの増加した発現をもたらす。特定の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなど、異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらす。例えば、限定されるものではないが、胎児型ヘモグロビンの発現は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子座及び／若しくは遺伝子に破壊のない細胞又は細胞集団における胎児型ヘモグロビンの発現のレベルと比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％増加し得る。特定の実施形態では、胎児型ヘモグロビンの発現の増加は、約１ピコグラム（ｐｇ）を超え、約２ｐｇを超え、約３ｐｇを超え、約４ｐｇを超え、約５ｐｇを超え、約６ｐｇを超え、約７ｐｇを超え、約８ｐｇを超え、約９ｐｇを超え、又は約１０ｐｇを超え得る。

本開示は、標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子をさらに提供し、標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。このようなｇＲＮＡの非限定的例は、表２〜９で提供される。

本開示は、本明細書で開示されるｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２〜９及び１９並びに図６〜１２で開示されるｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、表１８で提供される染色体の位置（例えば、ゲノム座標）を標的とする。特定の実施形態では、組成物は、例えば、ＲＮＰ複合体を生成するためにＣｐｆ１タンパク質をさらに含み得る。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＲＮＰ複合体集団などの１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物を提供し、各ＲＮＰ複合体は、異なる遺伝子又は遺伝子領域を標的とする。特定の実施形態では、組成物を使用して、例えばがん、自己免疫障害又は異常ヘモグロビン症に罹患している対象など、それを必要とする対象が治療され得る。

別の態様では、本開示は、標的核酸配列を修飾するためのゲノム編集システムに関する。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、ｇＲＮＡ分子；及び本明細書で開示されるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含み得る。本開示は、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される２つ以上の遺伝子を編集するための多重ゲノム編集システムをさらに提供する。

さらなる態様では、本開示は、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するための方法並びにそれを達成するための構成要素に関する。

特定の実施形態では、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法は、標的核酸配列に関して、試験Ｃｐｆ１タンパク質の活性を対照Ｃｐｆ１タンパク質と比較することを含む。特定の実施形態では、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質などの対照と比較して１つ又は複数の修飾を含む。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列の組み込み、６−ヒスチジン精製配列の組み込み及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法は、「一致部位」標的核酸配列に関して、試験Ｃｐｆ１タンパク質の活性を対照Ｃａｓ９タンパク質と比較することを含む。本明細書の用法では、一致部位標的核酸配列は、例えば、ＴＴＴＶＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭなどのＣｐｆ１及びＣａｓ９によって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６−ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、本開示は、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システムによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼゲノム編集システムと比較するためのアッセイに関する。例えば、限定されるものではないが、試験及び対照ゲノム編集システムは、次の側面のいずれか１つ又は複数が異なり得る：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列；例えばゲノム編集システムの構成要素の製造方法などの供給源；ゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素の配合；及び例えば細胞型又は細胞の調製方法など、その中にゲノム編集システムが導入される細胞の同一性。特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、試験ゲノム編集システムの品質管理分析を可能にする。特定の実施形態では、本開示のアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価し、標的は、一致部位配列を含む。

特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。

特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、特定の細胞型における、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、いくつかの細胞型中で特に、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４^＋ＨＳＣをはじめとするが、これに限定されるものではないＨＳＣ）及びヒト臍帯血誘導赤血球系前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞における、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され得る。

特定の実施形態では、一致部位標的核酸の使用は、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムの特定の属性に関して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集のアッセイ及び／又は評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され、異なる製造プロセスによって調製されたＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異が同定され得る。このような方法は、異なる調合物に存在し、且つ異なる送達ストラテジーを用いるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異も同定し得る。

特定の実施形態では、一致部位標的核酸配列は、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１６）からなる群から選択される。特定の実施形態では、一致部位標的核酸配列は、ＭＳ５である。

様々なストラテジーを用いて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムが細胞に送達され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素をコードする、例えばＡＡＶ又は他のウイルスベクターなどのベクターを使用して、細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素の発現が誘導され得る。代わりに、例えばＲＮＰ複合体を細胞に送達するために使用され得る電気穿孔又は任意の他の適切な方法により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの様々な構成要素を含むＲＮＰ複合体が細胞に送達され得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子を使用して、ＲＮＰ複合体が細胞に送達され得る。

添付の図面は、本開示の特定の態様及び実施形態の包括的ではなく、むしろ例示的で概略的な例を提供することを意図している。図面は、任意の特定の理論又はモデルを制限することも又はそれに拘束されることも意図されず、必ずしも縮尺通りに描かれていない。上記を限定することなく、核酸及びポリペプチドは線状配列として又は概略的な二次元若しくは三次元構造として描写され得；これらの描写は、それらの構造に関する任意の特定のモデル又は理論を制限することも又はそれに拘束されることもなく、むしろ例示的であることを意図している。

操作されたＣｐｆ１変異型がどのようにＰＡＭ標的化空間を拡大するかの概要を提供する。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４（８）：８６９−７４Ａｕｇ．２０１６からの４つの一致部位の配列（ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８）の概要及びこれらの一致部位標的配列に関連して、Ｃｐｆ１及びＣａｓ９の性能を評価するのに使用された細胞型を提供する。２つの一致部位遺伝子座（ＭＳ１及びＭＳ５）で、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡＲＮＰの増加する濃度をＣａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰと比較する用量反応実験の結果（図３Ａ）並びに一致部位標的ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８に対するＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の活性を比較するアッセイの結果を描写し、Ｃｐｆ１は、特定の標的部位をＣａｓ９よりも効率的に編集する（図３Ｂ）。２つの一致部位遺伝子座（ＭＳ１及びＭＳ５）で、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡＲＮＰの増加する濃度をＣａｓ９／ｇＲＮＡＲＮＰと比較する用量反応実験の結果（図３Ａ）並びに一致部位標的ＭＳ１、ＭＳ５、ＭＳ１１及びＭＳ１８に対するＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の活性を比較するアッセイの結果を描写し、Ｃｐｆ１は、特定の標的部位をＣａｓ９よりも効率的に編集する（図３Ｂ）。一致部位５ガイドを用いた、固定４．４μＭＲＮＰ用量での複数の細胞型にわたる様々なＡｓＣｐｆ１ＮＬＳ変異型の比較を示す。データは、各細胞型について最大編集を提示する変異型に対して正規化される。初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡＧＷＥＤ５４５を用いた、４．４μＭＲＮＰ用量での様々な２つの最適なＡｓＣｐｆ１ＮＬＳ変異型の比較（図５Ａ）及び初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡＢ２Ｍ−１２を用いた、４．４μＭＲＮＰ用量でのＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ変異型の比較（図５Ｂ）を示す。いずれの場合も、データは、最大の編集を提示する変異型に対して正規化される。初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡＧＷＥＤ５４５を用いた、４．４μＭＲＮＰ用量での様々な２つの最適なＡｓＣｐｆ１ＮＬＳ変異型の比較（図５Ａ）及び初代Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡＢ２Ｍ−１２を用いた、４．４μＭＲＮＰ用量でのＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ変異型の比較（図５Ｂ）を示す。いずれの場合も、データは、最大の編集を提示する変異型に対して正規化される。ＨＳＣ及びＨＵＤＥＰにおけるＨＢＧ１アッセイで用いられるｇＲＮＡ配列を示す。ＨＳＣ及びＨＵＤＥＰにおけるＢＣＬ１１ａアッセイで用いられるｇＲＮＡ配列を示す。ＨＳＣ又はＨＵＤＥＰのいずれかにおけるＨＢＧ１又はＢＣＬ１１ａの特定の配列及びそれらの対応する％編集を示す。ＨＢＢを標的とすると提案されたｇＲＮＡも提供される。ＣＡＡＴボックスモチーフにｇＲＮＡＡｓＣｐｆ１ＷＴＨＢＧ１−１が結合しているＨＢＧ１プロモーター領域を示す。ＧＡＴＡ１モチーフにｇＲＮＡＢＣＬ１１ａＡｓＣｐｆ１ＲＲ−８が結合しているＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の一部を示す。図６で同定されたｇＲＮＡを使用してスクリーニングされたＨＢＧ１プロモーターの領域を示す。この領域は、約１５０ｂｐに及ぶ。ＨＢＧ１−１は、ＣＡＡＴボックスモチーフと重なって示される。図７で同定されたｇＲＮＡを使用してスクリーニングされたＢＣＬ１１ａ赤血球エンハンサーの領域を示す。この領域は、およそ６００塩基対に及び、ＢＣＬ１１ａＲＲ−８は、ＧＡＴＡ１モチーフと重複して示される。ＡｓＣｐｆ１低システインコンストラクトが同定されたシステイン変異体を示す。ＡｓＣｐｆ１Ｃ３３４ＳＣ３７９ＳＣ６７４Ｓ中のシステイン残基の有意に低下したアクセス性を実証するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒマレイミドアッセイの結果を示す。ＭＳ５基質ＤＮＡに対する、ＷＴＡｓＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１システインなし及び２つの低システイン変異型の同等のエンドヌクレアーゼ活性の実証を描写する。ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の標的化を示す。ＨＵＤＥＰ実験は、最適なＣＡ−１３７パルスプログラムとＬｏｎｚａ溶液ＳＥとを使用して実施された。ＨＳＣスクリーニングは、製造業者によって推奨されるように、パルスコードＥＯ−１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実行された。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。ＨＵＤＥＰスクリーニング実行は、最適なＣＡ−１３７パルスプログラムを、Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥを用いて実施された。ＨＳＣスクリーニングは、製造業者によって推奨されるように、パルスコードＥＯ−１００及びＬｏｎｚａ溶液Ｐ３を用いて実行された。ＢＣＬ１１ａ（ＫＯＢＥＨと命名される）の対照ガイドも示される。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して、２．２μＭＡｓＣｐｆ１ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥ、ＳＦ及びＳＧは、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＵＤＥＰで試験された。溶液ＳＥでのパルスコードＣＡ−１３７及びＣＡ−１３８は、最適な編集を実証した。ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して、２．２μＭＡｓＣｐｆ１ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＳＣで試験された。溶液Ｐ２でのパルスコードＣＡ−１３７及びＣＡ−１３８は、最適な編集を実証し、ＦＦ−１００及びＦＦ−１０４も同様であった。ＬｏｎｚａＡｍａｘａにおける特定のパルスコードの使用が標的及びＰＡＭ変異型全体にわたりＨＳＣの編集を増加させることを示す。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣが処理された。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１並びにそのＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。予備スクリーニングでは約３０％のｇＲＮＡが５０％を超える編集を示し、これは、一般に観察されるＳｐＣａｓ９ヒット率と同レベルであり、Ｃｐｆ１が、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及び／又はＢ２Ｍをはじめとするが、これに限定されるものではない、治療遺伝子座における患者のＴ細胞に対する遺伝子編集のために潜在的に使用され得ることが実証される。電気穿孔パルスコードの変更が複数の治療標的遺伝子座におけるＴ細胞の最大編集を有意に改善することを示す。Ｃｐｆ１ＲＮＰによる、疾患関連遺伝子座における初代Ｔ細胞の効率的なノックアウト編集を示す。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。図２３Ｂは、ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、複数の治療的に関連するＴ細胞遺伝子座における効率的な単一ノックアウトを示す。Ｃｐｆ１ＲＮＰによる、疾患関連遺伝子座における初代Ｔ細胞の効率的なノックアウト編集を示す。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。図２３Ｂは、ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、複数の治療的に関連するＴ細胞遺伝子座における効率的な単一ノックアウトを示す。フローサイトメトリーによって測定された、Ｃｐｆ１ＲＮＰで処理されたＴ細胞における２つの治療標的の高効率二重ノックアウトを示す。ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１並びにそのＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。３つの同種異系Ｔ細胞標的上のＴ細胞におけるＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲの高い編集効率を要約する。ヒト初代Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９による２つのＴ細胞標的の二重ノックアウトを図示する。ＣＩＩＴＡ遺伝子座における、Ｃｐｆ１によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。ＳｐＣａｓ９と比較した、３つの同種異系Ｔ細胞標的、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍ上のＴ細胞におけるＣｐｆ１の高い編集効率を要約する。Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１ＲＮＰによる３つのＴ細胞標的の三重ノックアウトの効率を図示する。図３１Ａは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対する上位のＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約し、検出されたオフターゲットの数を示す。図３１Ｂは、標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットが見いだされなかったことを示す。図３１Ａは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対する上位のＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約し、検出されたオフターゲットの数を示す。図３１Ｂは、標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットが見いだされなかったことを示す。Ｔ細胞における最大編集を改善する電気穿孔条件の同定を示す。条件１は、ＤＳ−１３０であり、条件２は、ＣＡ−１３７であった。Ｔ細胞における遺伝子編集の効力を改善するＮＬＳ構成の同定を示す。ＮＬＳｖ１は、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１）を表し、ＮＬＳｖ２は、配列２ｘＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を表す。ＡｓＣｐｆ１とＨＢＧ１−１ガイドを用いた、ＨＳＣのＨＢＧ−１遺伝子座における編集効率を示す。ＭＳ５ガイドＲＮＡを使用した、一致部位５におけるＴ細胞のＮＬＳ変異型の編集効率を示す。フローサイトメトリーで測定された、ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞におけるＭＨＣＩＩの減少を示す。ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞における編集効率を示す。ＣＩＩＴＡｇＲＮＡ、ＣＩＩＴＡ−３４、ＣＩＩＴＡ−４１、ＣＩＩＴＡ−４５及びＣＩＩＴＡ−１０によって標的化されるゲノム位置を示す。ＣＩＩＴＡ遺伝子座で編集されたＴ細胞におけるＭＨＣＩＩの減少百分率を要約する。Ｃｐｆ１ＣＩＩＴＡｇＲＮＡの編集効率を示し、ｇＲＮＡで検出されたオフターゲットの数を示す。ＡｓｐＣｐｆ１ＲＲ及びＷＴＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２ＭｇＲＮＡの編集効率を示す。異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ＲＲ及びＷＴＢ２ＭｇＲＮＡの編集効率を示す。異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ＲＲ及びＷＴＴＲＡＣｇＲＮＡの編集効率を示す。異なる長さのＡｓｐＣｐｆ１ＲＲ及びＷＴＣＩＩＴＡｇＲＮＡの編集効率を示す。未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライミング部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）、Ｐ１プライマー部位及びＰ２’プライミング部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）又はＰ１’プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＺ）の使用から得られた３つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。描写される例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ１’及びＰ２’）及びスタッファー配列（Ｓ１及びＳ２）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ１’／Ｐ２’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）又はＰ１’プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）の使用から得られた２つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ１’）及びスタッファー配列（Ｓ２）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ１’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。未編集ゲノムＤＮＡ標的化部位、標的化組み込みのための例示的なＤＮＡドナー鋳型、潜在的な挿入結果（すなわち切断部位における非標的化組み込み又は切断部位における標的化組み込み）及びＰ１プライマー部位及びＰ２プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＸ）又はＰ１プライマー部位及びＰ２’プライマー部位を標的とするプライマー対（アンプリコンＹ）の使用から得られた２つの潜在的なＰＣＲアンプリコンの概略図である。例示的なＤＮＡドナー鋳型は、組み込まれたプライマー部位（Ｐ２’）及びスタッファー配列（Ｓ１）を含有する。Ａ１／Ａ２：ドナー相同性アーム、Ｓ１／Ｓ２：ドナースタッファー配列、Ｐ１／Ｐ２：ゲノムプライマー部位、Ｐ２’：組み込まれたプライマー部位、Ｈ１／Ｈ２：ゲノム相同性アーム、Ｎ：カーゴ、Ｘ：切断部位。Ｔ細胞受容体α定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座のｇＲＮＡ標的化のために設計された例示的なＤＮＡドナー鋳型を示す。ＨＢＧ１及びＨＢＧ２のプロモーター領域のスクリーニングから同定されたｇＲＮＡを示す。

定義及び略語
別段の指定がない限り、以下の各用語は、このセクションでそれに関連した意味を有する。

不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、関連した名詞の少なくとも１つを指し、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という用語と互換的に使用される。例えば、「モジュール」は少なくとも１つのモジュール又は１つ又は複数のモジュールを意味する。

接続詞「又は」及び「及び／又は」は、非排他的選言肢として同義的に使用される。

「約」又は「およそ」という用語は、本明細書の用法では、当業者による判定で特定の値の許容誤差範囲内を意味し得、これは、例えば、測定システムの制限など、値がどのように測定又は判定されるかに部分的に依存するであろう。例えば、「約」は、所与の値の慣行に従って１標準偏差又内は１標準偏差を超えることを意味し得る。特定の値が本出願本及び特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記載がない限り、「約」という用語は、例えば、「約」という用語によって修飾された値の±１０％などの特定の値の許容誤差範囲を意味し得る。

「から本質的になる」という語句は、列挙された化学種が優勢な種であるが、他の化学種が対象組成物の構造、機能又は挙動に影響を及ぼさない微量又は量で存在し得ることを意味する。例えば、特定の化学種から本質的になる組成物は、一般的に、その化学種を９０％、９５％、９６％又はそれを超えて含む。

「ドメイン」は、タンパク質又は核酸のセグメントを表すために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いかなる特定の機能特性も有する必要はない。

「インデル」は、核酸配列中の挿入及び／又は欠失である。インデルは、本開示のゲノム編集システムによって形成された二本鎖切断などのＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物であり得る。インデルは、最も一般的には、下述したＮＨＥＪ経路などの「誤りがちな」修復経路によって中断が修復された場合に形成される。

ＨＳＣに関する「生産的インデル」とは、ＨｂＦ発現をもたらすインデル（欠失及び／又は挿入）を指す。特定の実施形態では、ＨＳＣの生産的インデルは、ＨｂＦ発現を誘導し得る。特定の実施形態では、ＨＳＣ中の生産的インデルは、ＨｂＦ発現のレベルの増加をもたらし得る。Ｔ細胞に関する「生産的インデル」は、例えば、内因性Ｔ細胞遺伝子などのＴ細胞における標的遺伝子の発現を低下させるインデル（欠失及び／又は挿入）を指す。特定の実施形態では、Ｔ細胞内の「生産的インデル」は、Ｔ細胞上の細胞表面タンパク質又はマーカーの発現の減少又は除去をもたらす。

「遺伝子変換」とは、内因性相同配列（例えば、遺伝子アレイ内の相同配列）の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。「遺伝子修正」とは、外因性一本鎖又は二本鎖ドナー鋳型ＤＮＡなどの外因性相同配列の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。遺伝子変換及び遺伝子修正は、下述したものなどのＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物である。

インデル、遺伝子変換、遺伝子修正及び他のゲノム編集結果は、典型的には配列決定によって（最も一般的には「次世代」又は「合成による配列決定」法により、ただしサンガー配列決定も依然として使用され得る）評価され、全ての配列決定読み取りにおける数値変化の相対頻度（例えば、±１、±２又はそれを超える塩基）によって定量化される。配列決定のためのＤＮＡサンプルは、当該技術分野で公知の多様な方法によって調製され得、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による目的部位の増幅、Ｔｓａｉｅｔａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（５）：４８３（２０１６）、参照により本明細書に援用される）に記載されるＧＵＩＤＥｓｅｑプロセスにおけるような二本鎖切断によって生じるＤＮＡ末端の捕捉を伴い得るか、又は当該技術分野で周知の別の手段によって調製され得る。ゲノム編集結果は、ＧｅｎｏｍｉｃＶｉｓｉｏｎ（Ｂａｇｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）によって製品化されているＦｉｂｅｒＣｏｍｂ（商標）システムなどの原位置ハイブリダイゼーション法及び当該技術分野で公知任意の他の適切な方法によっても評価され得る。

本明細書の用法では、「標的配列における修飾」という語句並びにその均等物は、欠失、挿入、遺伝子変換、遺伝子修正及び／又はインデルの標的配列への導入を包含するが、これらに限定されない。標的配列における修飾は、標的配列の発現の変化をもたらし得、例えば、コード配列における修飾は、その配列によってコードされるタンパク質の発現を妨害し得る一方、調節配列における修飾は、調節配列がタンパク質の発現を活性化するか又は阻害するかに応じて、その調節配列の制御下にあるタンパク質の発現の増加又は減少をもたらし得る。

「Ａｌｔ−ＨＤＲ」、「代替相同指向修復」又は「代替ＨＤＲ」は同義的に使用されて、相同核酸（例えば、姉妹染色分体などの内因性相同配列又は例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用して、ＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。Ａｌｔ−ＨＤＲは、プロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、標準ＨＤＲ媒介物であるＲＡＤ５１及びＢＲＣＡ２によって阻害され得るという点で、標準ＨＤＲと異なる。Ａｌｔ−ＨＤＲは一本鎖又はニックの入った相同核酸鋳型の関与によっても区別されるのに対し、標準ＨＤＲは一般に二本鎖相同鋳型を伴う。

「標準ＨＤＲ」、「標準相同指向修復」又は「ｃＨＤＲ」は、相同核酸（例えば、姉妹染色分体などの内因性相同配列又は例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用したＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、二本鎖切断で顕著な切除があって、少なくとも１つのＤＮＡの一本鎖部分が形成する場合に典型的に機能する。正常細胞では、ｃＨＤＲは、典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解及びライゲーションなどの一連の工程を伴う。プロセスはＲＡＤ５１及びＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的に二本鎖である。

特に断りのない限り、「ＨＤＲ」という用語は、本明細書の用法では標準ＨＤＲ及びａｌｔ−ＨＤＲの両方を包含する。

「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）及び代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）などのライゲーション媒介修復及び／又は非鋳型媒介修復を指し、これは次に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）及び合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）を含む。

「置換」又は「置換された」は、分子（例えば、核酸又はタンパク質）の修飾に関して使用される場合、プロセス制限を必要とせず、単に置換実体が存在することを示す。

「対象」は、ヒト又は非ヒト動物を意味する。ヒト対象は、任意の年齢（例えば、乳児、子供、若年成人又は成人）であり得、疾患に罹患し得るか又は遺伝子の修飾を必要とし得る。代わりに、対象は、動物であり得、上記用語には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類及びより特に非ヒト霊長類、齧歯類（マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコなどが含まれるが、これに限定されるものではない。本開示の特定の実施形態では、対象は、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ又はヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象は家禽である。特定の実施形態では、対象は、植物である。

「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾病を抑制すること、すなわち、その発症又は進行を阻止又は防止すること；疾病を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こすこと；疾病の１つ又は複数の症状を緩和すること；疾病を治癒させることの１つ又は複数をはじめとする、対象（例えば、ヒト対象）における疾病の治療を意味する。

「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、（ａ）疾病を回避又は排除すること；（ｂ）疾病に対する素因に影響を及ぼすこと；又は（ｃ）疾病の少なくとも１つの症状の発症を予防又は遅延させることをはじめとする、例えばヒトなどの哺乳類における疾病の予防を指す。

「キット」とは、特定の目的のために使用され得る機能単位を一緒に構成する、２つ以上の構成要素の任意の集合を指す。例証として（且つ限定ではなく）、本開示による１つのキットは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと複合体化した又は複合体化できるガイドＲＮＡを含み得、（例えば、その中に懸濁された又は懸濁可能な）薬学的に許容可能な担体を伴う。例えば、細胞又は対象において所望のゲノムの改変を引き起こす目的で、キットを使用して、このような細胞又は対象に複合体を導入し得る。キットの構成要素は一緒に包装され得るか、又はそれらは別々に包装され得る。本開示によるキットは、例えば、本開示の方法によるキットの使用を説明する使用説明書（ＤＦＵ）も任意選択的に含む。ＤＦＵは、キットと共に物理的に包装され得るか、又はそれは、例えば、電子的手段によってキット使用者に提供され得る。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）を指し、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、核酸などは、一本鎖若しくは二本鎖のキメラ混合物又はそれらの誘導体若しくは修飾バージョンであり得る。それらは、例えば、塩基部分、糖部分又はリン酸骨格で修飾されて、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメーターなどが改善され得る。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質及び酵素を製造するために細胞機構によって使用される情報をはじめとするが、これに限定されるものではない、遺伝情報を保有する。これらの用語は、二本鎖又は一本鎖のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成及び遺伝子操作ポリヌクレオチド並びにセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これらの用語は、修飾塩基を含有する核酸も含む。

下記の表１に示されるように、慣用的なＩＵＰＡＣ表記法が、本明細書で提示されるヌクレオチド配列において使用される（参照により本明細書に援用されるＣｏｒｎｉｓｈ−ＢｏｗｄｅｎＡ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８５Ｍａｙ１０；１３（９）：３０２１−３０も参照されたい）。しかし、配列がＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかにより、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインにおいてコードされ得る場合、「Ｔ」は「チミン又はウラシル」を示すことに留意すべきである。

「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は同義的に使用され、ペプチド結合を介して共に連結するアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、個々のタンパク質、共に結合するタンパク質の群又は複合体並びにそのようなタンパク質の断片又は部分、変異型、誘導体及び類似体を含む。ペプチド配列は、左側のアミノ又はＮ末端から開始して、右側のカルボキシル又はＣ末端に進む、慣用的な表記法を用いて本明細書に提示される。標準的な一文字又は三文字略語が使用され得る。

「変異型」という用語は、参照実体（例えば、野生型又は天然に存在する実体）と有意な構造的同一性を示すが、例えば参照実体と比較した、ポリペプチドに関連してアミノ酸又はポリヌクレオチドに関連してヌクレオチドなど、１つ又は複数の化学的部分の存在又はレベルが参照実体と構造的に異なる、ポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子などの実体を指す。変異型という用語は、本明細書の用法では、このような実体に付随する１つ又は複数の特性において、参照実体よりも機能的により良い又は優れたポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子などの実体も包含する。多くの実施形態では、変異型は、その参照実体と機能的にも異なる。例えば、限定することなく、「変異型Ｃｐｆ１ポリペプチド」は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ置換を含み、ＴＹＣＶＰＡＭを認識するＡｓＣｐｆ１変異型並びにＳ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒ置換を含み、ＴＡＴＶＰＡＭを認識するＡｓＣｐｆ１変異型を包含する。

本明細書の用法では、「切断事象」という用語は、核酸分子の切断を指す。切断事象は、一本鎖切断事象又は二本鎖切断事象であり得る。一本鎖切断事象は、５’オーバーハング又は３’オーバーハングをもたらし得る。二本鎖切断事象は、平滑末端、２つの５’オーバーハング又は２つの３’オーバーハングをもたらし得る。

本明細書において標的核酸配列上の部位に関して使用される「切断部位」という用語は、そこで二本鎖切断が発生する、標的核酸の２つのヌクレオチド残基間の標的位置又は代わりにそこでＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ依存性プロセスによって媒介される２つの一本鎖切断が発生する、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基のスパン内の標的位置を指す。切断部位は、例えば、平滑型の二本鎖切断の標的位置であり得る。代わりに、切断部位は、例えば、二本鎖切断を形成し、例えば約１０塩基対によって隔てられた、２つの一本鎖切断又はニックのための、標的核酸のいくつかのヌクレオチド残基のスパン内の標的部位であり得る。二本鎖切断又は対の２つの一本鎖ニックのより近い方は、理想的には、標的位置の０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０又は２５ｂｐ以下）にある。デュアルニッカーゼが使用される場合、対内の２つのニックは、互いに２５〜５５ｂｐ以内であり（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５又は４０〜４５ｂｐ）、互いに１００ｂｐ以上離れていない（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０ｂｐ以下）。

本開示は、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法及び構成要素を提供する。例えば、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を与える核酸配列を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法を提供する。特定の非限定的実施形態において、本開示は、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、ＣＤ３４^＋細胞における標的核酸配列の効率的な編集の最初の証拠を提供する。さらに、本開示は、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、胎児型ヘモグロビン（本明細書では「ＨＰＦＨ」と称される）の遺伝性持続性に関連する遺伝子である、ＢＣＬ１１ａ及びＨＢＧ１の効率的な編集の最初の証拠を提供する。本開示は、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼす核酸配列を標的化するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法も提供する。本開示は、有意な編集効率を示し且つ改善された特性を示す修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、このような修飾Ｃｐｆ１タンパク質の効率を評価するためのストラテジーとをさらに提供する。

修飾Ｃｐｆ１タンパク質
一態様では、本開示は、修飾Ｃｐｆ１タンパク質と、標的核酸配列を編集し、且つ／又は標的核酸配列の発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法におけるそれらの使用とに関する。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６Ｃｐｆ１タンパク質（ＡｓＣｐｆ１）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１）、カンジダツス・メタノメチルフィルス（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｌｐｈｉｌｕｓ）ａｌｖｕｓＭｘ１２０１（ＣＭａＣｐｆ１）、スネアチア・アムニイ（Ｓｎｅａｔｈｉａａｍｎｉｉ）（ＳａＣｐｆｑ）、モラクセラ・ラクナータ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａ）（ＭｌＣｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ０８＿００２０５（Ｍｂ２Ｃｐｆ１）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６Ｃｐｆ１タンパク質（ＬｂＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ５Ｃｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７（Ｌｂ４Ｃｐｆ１）、フラボバクテリウム・ブランキオフィルム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒａｎｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＬ−１５（ＦｂＣｐｆ１）、チオミクロスピラ属（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ）種ＸＳ５（ＴｓＣｐｆ１）、パルキュバクテリア（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）群菌ＧＷ２０１１（ＰｇＣｐｆ１）、カンジダツス・ロイズマンバクテリア（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＲｏｉｚｍａｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＲｂＣｐｆ１）、カンジダツス・ペレグリンバクテリア（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰｅｒｅｇｒｉｎｂａｃｔｅｒｉａ）菌ＧＷ２０１１（ＣＰｂＣｐｆ１）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）種ＮＣ３００５（ＢｓＣｐｆ１）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）（ＢｆＣｐｆ１）、プレボテラ・ブライアンチイ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｒｙａｎｔｉｉ）Ｂ１４（Ｐｂ２Ｃｐｆ１）及びバクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）口腔分類群２７４（ＢｏＣｐｆ１）からなる群から選択されるＣｐｆ１タンパク質に由来する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＺｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ１３４０１５；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１３４０１５を参照されたい）。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、それぞれ配列番号２０〜２２のコドン最適化核酸配列を有する、配列番号１７〜１９からなる群から選択される配列を含む。

Ｃｐｆ１核局在化シグナル（ＮＬＳ）変異型
特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（本明細書では「Ｃｐｆ１ＮＬＳ変異型」とも称される）を含む。例えば、限定されるものではないが、本明細書で開示される方法及び組成物に関連して有用なＮＬＳ配列は、細胞核へのタンパク質移入を促進できるアミノ酸配列を含むであろう。本明細書で開示される方法及び組成物に関連して有用なＮＬＳ配列は、当該技術分野で公知である。このようなＮＬＳ配列の非限定的例としては、アミノ酸配列：ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１）を有するヌクレオプラスミンＮＬＳ及びアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２）を有するシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳが挙げられる。

特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、２つ以上、３つ以上又は４つ以上などの１つ又は複数のＮＬＳ配列を有し得る。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、２つのＮＬＳ配列、３つのＮＬＳ配列又は４つのＮＬＳ配列を有し得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、２つのＮＬＳ配列を有し得る。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に配置される。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質のＮＬＳ配列は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に配置される。特定の実施形態では、本開示の修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に位置する１つ又は複数のＮＬＳ配列及びＣｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に位置する１つ又は複数のＮＬＳ配列を有し得、例えば、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を含む。

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＣ末端又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳ（本明細書では「ＡｓｐＣｐｆ１ＮＬＳｖ１」とも称される）（配列番号３）；Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号４）；及びＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（本明細書では「ＡｓｐＣｐｆ１ＮＬＳｖ２」とも称される）（配列番号５）（式中、「Ｈｉｓ」は、６−ヒスチジン精製配列を指し、「ＡｓＣｐｆ１」は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１タンパク質配列を指し、「ｎＮＬＳ」は、ヌクレオプラスミンＮＬＳを指し、「ｓＮＬＳ」は、ＳＶ４０ＮＬＳを指す）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列の付加又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）の付加並びに例えば６−ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＣ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）及びｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列の付加又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）の付加並びに例えば６−ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質配列のＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍に位置するＮＬＳ配列を有する修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号９）及びＨｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号１０）から選択され得る。例えば、２つ以上のｎＮＬＳ配列又はｎＮＬＳ及びｓＮＬＳ配列の組み合わせ（又は他のＮＬＳ配列）のＮ末端／Ｃ末端位置いずれかへの付加並びに例えば６−ヒスチジン配列などの精製配列を含む又は含まない配列の付加などのＮＬＳ配列の同一性及びＮ末端／Ｃ末端位置の追加的な順列は、現在開示されている主題の範囲内である。

ＣＤ３４^＋細胞及びＴ細胞における編集に有利なＮＬＳ修飾などのＣｐｆ１タンパク質修飾を判定するために、異なる位置とタイプのＮＬＳ配列を含有するＡｓＣｐｆ１タンパク質が合成された。タンパク質変異型は、ｇＲＮＡを標的とする一致部位５に複合体化され、ＣＤ３４^＋細胞、Ｔ細胞及びＨＵＤＥＰ（４．４μＭのＲＮＰ）内に電気穿孔された。図４では、各細胞型の最大編集を提示する変異型に正規化された％編集として結果が描写される。データは、ヌクレアーゼの異なる種がＣＤ３４^＋細胞及びＴ細胞（他の細胞の中で特に）の同一標的部位で様々な活性を有すること、並びにＡｓＣｐｆ１による効率的な編集がＣＤ３４^＋細胞及びＴ細胞（他の細胞の中で特に）で達成できることを示す。

システイン修飾Ｃｐｆ１タンパク質及びＲＮＰ
ジスルフィド結合形成は、タンパク質凝集を促進することが知られている。したがって、このようなジスルフィド結合形成の可能性を低減するために改変させ得るシステインを同定する努力の一環として、Ｃｐｆ１結晶構造及び既知のＣｐｆ１一次アミノ酸配列が分析された（図１３）。

本開示の修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質配列の１つ又は複数のシステイン残基における改変（例えば、欠失又は置換）を含み得る。このような修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、凝集の減少を示し、これは、タンパク質の製造を拡大するときに特に有用である。例えば、限定されるものではないが、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５及びＣ１２４８からなる群から選択される、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上又は８つの位置などの１つ又は複数の位置に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、セリン又はアラニンの１つ又は複数のシステイン残基の置換を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、Ｃ６５Ｓ、Ｃ２０５Ｓ、Ｃ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ、Ｃ６０８Ｓ、Ｃ６７４Ｓ、Ｃ１０２５Ｓ及びＣ１２４８Ｓからなる群から選択される置換などの１つ又は複数の改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ６５Ａ、Ｃ２０５Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ、Ｃ６０８Ａ、Ｃ６７４Ａ、Ｃ１０２５Ａ及びＣ１２４８Ａからなる群から選択される１つ又は複数の改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、位置Ｃ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４に改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ｓ及びＣ６７４Ｓ又はＣ３３４Ｓ、Ｃ３７９Ｓ及びＣ６７４Ｓに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃ３３４Ａ及びＣ６７４Ａ又はＣ３３４Ａ、Ｃ３７９Ａ及びＣ６７４Ａに改変を含む。特定の実施形態では、修飾Ｃｐｆ１タンパク質は、例えば、本明細書に記載されるようなＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｅｓｓ（配列番号１１）又はＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｏｗ（配列番号１２）などの１つ又は複数のシステイン残基改変並びに１つ又は複数のＮＬＳ配列の導入の両方を含む。

異常ヘモグロビン症に関連した標的部位におけるＣＤ３４^＋ＨＳＣのＣｐｆ１編集
本開示は、例えば、βサラセミア及び鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症治療するために標的核酸配列を編集するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法をさらに提供する。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法は、胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を調節するＣＤ３４^＋細胞における１つ又は複数の遺伝子の破壊をもたらす。

異常ヘモグロビン症を治療するための１つの治療ストラテジーは、ＨｂＦの発現の増加を伴う。ＨｂＦ発現は、転写リプレッサーＢＣＬ１１ａの赤血球系細胞特異的発現の標的化された破壊を介して誘導され得る（Ｃａｎｖｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２７（１２）：１９２−１９７）。ＨｂＦ発現を増加させる１つのストラテジーは、遺伝子編集を用いてＢＣＬ１１ａ発現を妨害することである。例えば、限定されるものではないが、例えば、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の発現に影響を与える特定の標的配列を標的とし得る。特定の実施形態では、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の任意の領域が標的化され得る。

本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子に修飾を含む細胞又は細胞集団を提供し、例えばＢＣＬ１１ａ発現を妨害、ノックダウン又はノックアウトする。例えば、限定されるものではないが、細胞又は細胞集団は、例えば、ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするＲＮＰ複合体など、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む複合体の送達によって生成され得る。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２を標的とし得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にあるＢＣＬ１１ａの赤血球特異的エンハンサーのＧＡＴＡ１結合モチーフを破壊するように標的化されるであろう。ＢＣＬ１１ａを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するための例示的なｇＲＮＡ分子は、図７、１０及び１２で特定される。

特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、例えば、転写開始部位（ＴＳＳ）から＋５５ｋｂ〜＋６２ｋｂの赤血球エンハンサー領域など、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球エンハンサー領域が標的化され得る。例えば、限定されるものではないが、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域が破壊されているなどのＢＣＬ１１ａ遺伝子が破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のＧＡＴＡ１モチーフが破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。

以下の実施例３で概説されるように、ＡｓＣｐｆ１は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域内の標的部位の編集を問題なく媒介した。最初に、異なるＰＡＭを有するいくつかのＡｓＣｐｆ１変異型ガイドＲＮＡ（図１）がＨＵＤＥＰ２細胞でスクリーニングされ、次に最も効率的なガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ変異型がｍＰＢＣＤ３４^＋細胞内で試験された（図１７）。特に、図１７は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。

例えば、βサラセミア及び鎌状赤血球症などの異常ヘモグロビン症の治療に関連して、胎児型ヘモグロビンの発現を誘導する別のストラテジーは、ＨＢＧ遺伝子座の発現、特にＨＧＢ１及び／又はＨＧＢ２の発現を妨害することである。

特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の任意の領域が標的化され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座の非コード領域が破壊され得る（例えば、表１８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のイントロンが破壊され得る。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、標的化されるＨＢＧ遺伝子のシス調節領域が破壊され得る。例えば、限定されるものではないが、シス調節領域は、プロモーター及び／又はエンハンサーを含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域の−８００〜−６０ｎｔの領域が破壊され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を用いて、ＨＢＧプロモーター領域の−１１０ｎｔプロモーター領域及び／又はＨＢＧプロモーター領域内に存在するＣＡＡＴボックスが破壊され得る。一般に、ＨＢＧプロモーター領域の破壊及びＣＡＡＴボックスの破壊は、これらの配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの送達を介して達成され得る。ＨＢＧ遺伝子座のこれらの配列を標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムで使用するための例示的なｇＲＮＡ分子は、図６、９及び１１並びに表１９に特定される。ＨＢＧ遺伝子座を破壊するために標的化され得る染色体の領域（例えば、ゲノム座標）は、表１８で提供される。特定の実施形態では、ＨＢＧ１遺伝子座を破壊するのに使用されるｇＲＮＡ分子は、ＨＢＧ１−１である。

本開示は、ＨＢＧ遺伝子座に修飾を含む細胞又は細胞集団を提供し、例えばＨＢＧ発現を妨害、ノックダウン又はノックアウトする。例えば、限定されるものではないが、細胞又は細胞集団は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座を標的とするＲＮＰ複合体など、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む複合体の送達によって生成され得る。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。特定の実施形態では、細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを有する。

特定の実施形態では、本開示は、例えば、ＨＢＧ遺伝子座が破壊されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞などの細胞に関する。例えば、限定されるものではないが、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座のプロモーター領域が破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域が破壊される。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧ遺伝子座の−１１０ｎｔプロモーター領域が破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、このような構成要素を検出する適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊されている細胞に関する。特定の実施形態では、このような細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＨＢＧプロモーター領域に存在するＣＡＡＴボックスが破壊されている細胞集団に関する。特定の実施形態では、このような細胞集団は、このような構成要素を検出する適切な方法を使用した判定でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む細胞を含み得る。特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡＨＢＧ１−１を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの使用によってＨＢＧ１遺伝子座が破壊されている細胞集団を提供する。

特定の実施形態では、ＨＢＧ遺伝子座又はＢＣＬ１１ａ遺伝子に修飾を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団は、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素を検知する適切な方法を使用した判定で１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、このような構成要素を検知する適切な方法を使用した判定で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団を提供し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。

特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞内のＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊がない細胞と比較して細胞における胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、ＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子座及び／又は遺伝子の破壊がない細胞における胎児型ヘモグロビンの発現レベルと比較して、胎児型ヘモグロビンの発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％増加され得る。

特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、胎児型ヘモグロビンの発現の増加は、約１ピコグラム（ｐｇ）を超え、約２ｐｇを超え、約３ｐｇを超え、約４ｐｇを超え、約５ｐｇを超え、約６ｐｇを超え、約７ｐｇを超え、約８ｐｇを超え、約９ｐｇを超え、約１０ｐｇを超え、約１１ｐｇを超え、約１２ｐｇを超え、約１３ｐｇを超え、約１４ｐｇを超え、又は約１５ｐｇを超え得る。

特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムによる細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子又はＨＢＧ遺伝子の破壊は、１細胞当たり少なくとも約１ピコグラム、少なくとも約２ピコグラム、少なくとも約３ピコグラム、少なくとも約４ピコグラム、少なくとも約５ピコグラム、少なくとも約６ピコグラム、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム又は約８〜約９ピコグラム若しくは約９〜約１０ピコグラムの胎児型ヘモグロビンの産生をもたらし得る。

本開示は、ゲノム編集システムによって修飾されていない細胞集団と比較してより高い百分率の細胞集団が、ＨｂＦを発現する赤血球系統の細胞集団に分化できる、上記のゲノム編集システムによって修飾された細胞集団にも関する。特定の実施形態では、より高い百分率は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高いことができる。特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞は、赤芽球、赤血球又は赤血球前駆体又は赤芽球に分化でき得る。

特定の実施形態では、例えば、ＨｂＦの相対的発現レベル（例えば、β様グロビン鎖全体に対する）などの発現レベルは、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって測定され得る。

様々なストラテジーを用いて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムが細胞に送達され得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素をコードする、例えばＡＡＶ又は他のウイルスベクターなどのベクターを使用して、細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素の発現が誘導され得る。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの構成要素を含むＲＮＰ複合体は、例えば、電気穿孔を通じて細胞に導入され得る。特定の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、脂質ナノ粒子によって細胞に送達され得る。

以下の実施例３で概説されるように、図１６は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の成功裏の標的化を示す。

合わせて、ＢＣＬ１１ａ遺伝子及びＨＢＧ遺伝子座の破壊に関するこれらのデータは、臨床的に関連する遺伝子座（すなわち既知のＨＰＦＨ標的部位）のＣＤ３４^＋細胞における、ＡｓＣｐｆ１変異型による効率的な編集を示す。

Ｔ細胞の増殖、生存及び／又は機能に関連する標的部位におけるＴ細胞のＣｐｆ１編集
がんを治療するために提案された１つの治療ストラテジーは、養子Ｔ細胞移入を伴う。遺伝子改変されたＴ細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、（１）例えば、養子免疫伝達に続くＴ細胞の限定的増殖などのＴ細胞増殖；（２）例えば、腫瘍環境内因子によるＴ細胞アポトーシス誘導などのＴ細胞生存；及び（３）例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性Ｔ細胞機能の阻害などのＴ細胞機能が挙げられる。有効性を高める１つのストラテジーは、遺伝子編集を用いて、Ｔ細胞の増殖、生存及び／又は機能に関連するＴ細胞遺伝子を修飾又は破壊することである。例えば、限定されるものではないが、例えば、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｔ細胞遺伝子の発現に影響を与える特定の配列を標的とし得る。

本開示に包含される方法及び組成物を使用して、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子の１つ又は複数などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することにより、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＣＢＬＢ及び／又はＰＴＰＮ６遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＦＡＳ及び／又はＢＩＤ遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞の生存に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、例えばＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子などの１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞機能に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物を使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子を修飾することによってＴ細胞の持続性が改善され得る。

特定の実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をはじめとするが、これに限定されるものではない１つ又は複数のＴ細胞発現遺伝子は、標的化ノックアウトとして独立して標的化され、例えばＴ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼす。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つ）をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、２つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つ）を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される３つなどの３つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される４つなどの４つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される５つなどの５つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される６つなどの６つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される７つなどの７つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される８つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される９つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子など、９つのＴ細胞発現遺伝子を独立してノックアウトすることを含む。

上に記載される遺伝子に加えて、遺伝子操作Ｔ細胞の有効性に影響を及ぼすために、いくつかの他のＴ細胞発現遺伝子が標的化され得る。これらの遺伝子としては、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩが挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｋｅｒｓｈａｗｅｔａｌ．２０１３Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ１３，５２５−５４１）。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つ又は複数が個々に又は組み合わせてのいずれかで修飾され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示された方法を使用して、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ及びＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つ又は複数が個々に又は上記の８つの遺伝子（すなわちＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子）のいずれか１つ又は複数との組み合わせてのいずれかで修飾され得る。

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、例えば、非コード領域（例えば、プロモーター領域又は調節領域）内の位置又はコード領域内の位置などの遺伝子の位置（例えば、ノックアウト位置）を標的とすることにより、又は例えばイントロンの配列又はエクソンの配列などの遺伝子の転写配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、コード配列、例えばコード領域、例えば遺伝子の初期コード領域（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子）は、発現の修飾及びノックアウトの標的になる。特定の実施形態では、Ｔ細胞発現遺伝子の非コード領域内の位置（例えば、プロモーター領域又は調節領域）（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子）は、Ｔ細胞発現遺伝子の発現の修飾及びノックアウトの標的になる。

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、遺伝子のコード配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、コード配列は、初期コード配列である。特定の実施形態では、遺伝子のコード配列は、Ｔ細胞発現遺伝子の発現のノックアウトを標的とする。

特定の実施形態では、本明細書で開示される方法及び組成物は、遺伝子の非コード配列を標的とすることにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を修飾する。特定の実施形態では、非コード配列は、プロモーター領域内の配列、エンハンサー配列、イントロン配列、３’ＵＴＲ内の配列、ポリアデニル化シグナル配列又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、遺伝子の非コード配列は、遺伝子の発現のノックアウトの標的になる。

特定の実施形態では、現在開示される方法は、例えば、遺伝子の修飾を誘導することにより、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の１つ又は２つの対立遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、修飾は、挿入、欠失、変異又はそれらの組み合わせを含む。

特定の実施形態では、標的化ノックアウトアプローチは、Ｃｐｆ１酵素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される。

特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＡＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表２及び３で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表２及び３で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。

特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＴＲＢＣ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＴＲＢＣ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表４及び５で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表４及び５で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。

特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、ＡＧＵＧＧＧＧＧＵＧＡＡＵＵＣＡＧＵＧＵを含む。本開示は、表６、７及び８で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表６、７及び８で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。

特定の実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のいずれかの鎖に相補的であり得る。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、エクソン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、イントロン内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、遺伝子の調節領域内にある。特定の実施形態では、２つ以上の配列が標的化され、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の標的化部分は、１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン、１つ若しくは複数の調節領域又は１つ若しくは複数のエクソン、１つ若しくは複数のイントロン及び１つ若しくは複数の調節領域内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的とするこのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用するためのｇＲＮＡ分子標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。本開示は、表９で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む組成物を提供する。本開示は、表９で提供されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含む組成物をさらに提供する。

ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣのノックアウト及び／又はノックダウンは、限定することなく、がん及び例えば自己免疫障害などの非がん疾患を治療するための養子免疫療法に関連するものをはじめとする様々な状況において有用であり得る。本開示の特定の実施形態によれば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣは、治療で使用されるＴ細胞などの免疫細胞においてノックアウトされる。非限定的な一例として、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は異種Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの操作された受容体を発現し得、その受容体は、腫瘍細胞などの病理に関与するとされる、細胞又は組織上の抗原を認識するように構成され得る。それらが操作された受容体を発現するかどうかにかかわらず、本開示によるＴＣＲ、ＭＨＣＩ及び／又はＭＨＣＩＩノックアウトＴ細胞を用いて、その中でＧｖＨ又はＨｖＧ応答が安全性又は有効性の懸念を提示することもある組織又は器官が標的化され得る。

ＴＣＲ、ＭＨＣＩ及び／又はＭＨＣＩＩノックアウト及び／又はノックダウン細胞は、「同種異系」細胞療法で用いられ得、その中で細胞が対象から採取され、修飾されて、例えばＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ発現の妨害など、ノックアウト又はノックダウンされ、次に異なる対象に戻され得る。いずれのアプローチでも、採取と投与との間において、本開示のＴＣＲ、ＭＨＣＩ及び／又はＭＨＣＩＩノックアウト及び／又はノックダウン細胞は、増殖、刺激、精製又は選別、導入遺伝子による形質導入、凍結及び／又は解凍などの様々な方法で操作され得る。

本明細書に記載されるようなＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト又はノックダウンすることは、（１）ＧｖＨ応答を防げ；（２）ＨｖＧ応答を防げ；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。本明細書に記載されるようなＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣタンパク質の発現をノックダウンすることは、同様に、（１）ＧｖＨ応答を防げ；（２）ＨｖＧ応答を防げ；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。

特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される２つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される３つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞において、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣの全ての４つの遺伝子を独立してノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。

特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＴＲＡＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。特定の実施形態では、現在開示されている方法は、Ｔ細胞においてＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子をノックアウト及び／又はノックダウンすることを含む。

特定の実施形態では、Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子、２つ以上の遺伝子、３つ以上の遺伝子又は４つ以上の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、（１）ＧｖＨ応答を防止し；（２）ＨｖＧ応答を防止し；及び／又は（３）Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善し得る。例えば、限定されるものではないが、Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンを使用して、例えば同種異系Ｔ細胞などの「同種異系」細胞が生成され得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、「同種異系」細胞療法で用いられ得、その中で細胞が対象から採取され、修飾されて、例えばＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ発現の妨害など、ノックアウト又はノックダウンされ、次に異なる対象に戻される。

特定の実施形態では、Ｔ細胞における、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子、２つ以上の遺伝子、３つ以上の遺伝子又は４つ以上の遺伝子ノックアウト及び／又はノックダウンは、修飾されていないＴ細胞と比較して、Ｔ細胞におけるＭＨＣＩＩ受容体発現の減少をもたらす。特定の実施形態では、修飾されて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされている細胞集団は、修飾されていない細胞集団におけるＭＨＣＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍ発現の量と比較して、ＭＨＣＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍの発現の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％の減少を示す。

特定の実施形態では、２つ以上の遺伝子のノックアウト及び／又はノックダウンは、各標的遺伝子の編集のための異なるヌクレアーゼの使用を伴い得る。例えば、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムを使用して、１つの標的遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされ得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集システムを使用して、第２の標的遺伝子がノックアウト及び／又はノックダウンされ得る。

本開示は、本明細書で開示されるＴ細胞の１つ又は複数の内因性遺伝子に１つ又は複数の修飾を含む単離されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団を提供する。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含まない。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である。

特定の実施形態では、本開示は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＢＣ及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、Ｔ細胞の内因性遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集の使用に関する。例えば、限定されるものではないが、修飾は、例えば、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部又はそれらの組み合わせを標的とする、例えばＲＮＰ複合体などのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ分子を含む１つ又は複数の複合体の送達によって生成される。特定の実施形態では、例えば、ＲＮＰ複合体などの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０の複合体が送達され得、複合体のそれぞれは、異なる遺伝子を標的とする。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が編集及び／又は修飾される。特定の実施形態では、Ｔ細胞集団の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される少なくとも１つの内因性Ｔ細胞遺伝子に生産的インデルを有する。

Ｃｐｆ１変異型、異なる細胞型及び調合物についてのベンチマーキングアッセイ
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、例えば、「一致部位」標的核酸配列などの標的核酸配列に関して、対照ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ編集システムと、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの活性とを比較することによって評価され得る。

一致部位標的核酸配列は、Ｃｐｆ１と、例えばＣａｓ９などの第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとによって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。例えば、ＴＴＴＶＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭが本例で用いられ得る。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６−ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本例で用いられ得る例示的な一致部位標的核酸配列としては、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１６）が挙げられる。

例えば、ＣＤ３４^＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比して評価するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出され得る。次に、検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較され得る。

標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集（又は別のＣＲＩＳＰＲベースのシステムによる編集）及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介を比較する上記の方法は、用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムの特定の属性の評価を可能にする。例えば、限定されるものではないが、このような方法を使用して、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と対比してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集が評価され、異なる製造プロセスによって調製されたＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異が同定され得る。このような方法は、異なる調合物に存在し、且つ異なる送達ストラテジーを用いるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの活性の差異も同定し得る。

特定の実施形態では、本開示は、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システムによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼゲノム編集システムと比較するためのアッセイに関する。より具体的には、本開示は、一致部位における編集のレベル又は効率が、遺伝子編集システムが任意の他の部位における編集においてどの程度効率的であるかの指標となるように、それに対して遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１又はその変異型と、一致部位に相補的なｇＲＮＡ）が標的化される、一致部位（例えば、一致部位５を含有する細胞）を用いるアッセイを提供する。換言すれば、遺伝子編集システムの様々な構成要素を変化させ、一致部位（例えば、一致部位５）で達成される編集のレベル又は効率を測定することにより、編集効率が評価され得る。

例えば、限定されるものではないが、試験及び対照遺伝子又はゲノム編集システムは、次の側面のいずれか１つ又は複数が異なり得る：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列；例えばゲノム編集システムの構成要素の製造方法などの供給源；ゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素の配合；及び例えば細胞型などのゲノム編集システムが導入される細胞の同一性又は細胞の調製方法。特定の実施形態では、本明細書に記載のアッセイは、試験ゲノム編集システムの品質管理分析を可能にする。特定の実施形態では、本開示のアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価し、標的は、一致部位配列を含む。

電気穿孔パルスコードスクリーニング
本開示は、標的部位におけるより高度な編集をもたらす電気穿孔パルスコードをさらに提供する。実施例に示されるように、電気穿孔パルスコードのスクリーニングは、本開示のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる、より高度な効率編集をもたらすコードの同定を可能にする。例えば、限定されるものではないが、図１８は、一連の特定のパルスコード及び溶液を用いた、ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。同様に、図１９は、ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１の例示的ヌクレオフェクションスクリーニングを示す。特定の実施形態では、パルスコードＣＡ−１３７及びＣＡ−１３８を使用して、Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによるより高効率の編集が促進され得る。例えば、限定されるものではないが、図２０及び図２３Ｃは、ＣＡ−１３７パルスコードの効率の向上を立証する。

治療方法
本開示は、開示されたゲノム編集方法使用して編集されている細胞を投与することにより、疾患及び／又は障害を治療する方法をさらに提供する。特定の実施形態では、本開示は、対象の１つ又は複数の細胞を修飾することにより、対象を治療する方法に関する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞がエクスビボで修飾され、次に対象に投与される。例えば、限定されるものではないが、対象を治療するための方法は、対象からの細胞を、例えばエクスビボで、（ａ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び（ｂ）本明細書で開示されるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに接触させることを含み得る。特定の実施形態では、本開示は、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムによって修飾された１つ又は複数の細胞を対象に投与することを含む、対象を治療するための方法を提供する。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞がドナーから得られ、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して遺伝子改変され、次に対象に投与される。

特定の実施形態では、本開示の方法は、例えば、同種異系Ｔ細胞を産生するために、開示されたゲノム編集方法を使用して編集されているＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。例えば、限定されるものではないが、本開示の方法は、編集されて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣの発現がノックアウト又はノックダウンされている１つ又は複数のＴ細胞の投与を含み得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は編集されて、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及び／又はＴＲＢＣ発現がノックアウト又はノックダウンされている。特定の実施形態では、１つ又は複数のＴ細胞は、エクスビボで編集されており、次に対象に投与される。特定の実施形態では、１つ又は複数の細胞は、ドナーから得られる。特定の実施形態では、このようなＴ細胞を使用して、がん又は自己免疫障害を有する対象が治療され得る。特定の実施形態では、対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集Ｔ細胞集団において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団の細胞の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。

特定の実施形態では、本開示の方法は、開示されたゲノム編集方法を使用して編集されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、編集されて、ＢＣＬ１１ａ又はＨＢＧ発現がノックアウト又はノックダウンされ得る。例えば、限定されるものではないが、本明細書で開示されるゲノム編集方法を使用して編集されているＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、それを必要とする対象における異常ヘモグロビン症の治療のために使用され得る。特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症は、重篤な鎌状赤血球症（ＳＣＤ）又はβサラセミア、δサラセミア又はβ／δ−サラセミアなどのサラセミアであり得る。特定の実施形態では、異常ヘモグロビン症の治療の例示的プロトコルは、それを必要とする対象からＣＤ３４＋ＨＳＰＣ採取すること、本明細書で開示されるゲノム編集方法を使用して自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをエクスビボで編集すること、それに続いて、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを対象に再輸液することを含み得る。特定の実施形態では、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣによる治療は、ＨｂＦ誘導の増加をもたらし得る。

特定の実施形態では、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの採取前に、対象は、適用可能な場合にはヒドロキシ尿素による治療を中止し、十分なヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを維持するために輸血を受け得る。特定の実施形態では、骨髄から末梢血中にＣＤ３４＋ＨＳＰＣを動員するために、対象にプレリキサホル（例えば、０．２４ｍｇ／ｋｇ）が静脈内投与され得る。特定の実施形態では、対象は、１回又は複数回の白血球アフェレーシスサイクルを受け得る（例えば、サイクル間がおよそ１ヶ月間で、１サイクルは、連日実施される２回のプレリキサホル動員白血球アフェレーシス採取として定義される）。特定の実施形態では、対象に実施される白血球アフェレーシスサイクルの回数は、バックアップ保存のための未編集の自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ／ｋｇの用量と共に、対象に再輸液するための（例えば、≧１．５×１０^６細胞／ｋｇ）、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの用量（例えば、≧２×１０^６細胞／ｋｇ、≧３×１０^６細胞／ｋｇ、≧４×１０^６細胞／ｋｇ、≧５×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ〜３×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ〜４×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ〜５×１０^６細胞／ｋｇ）を達成するのに必要な回数であり得る。特定の実施形態では、対象から採取されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、本明細書で考察されるゲノム編集方法のいずれかを使用して編集され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示される、ｇＲＮＡの任意の１つ又は複数及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの１つ又は複数がゲノム編集方法で使用され得る。

特定の実施形態では、治療は、自己由来幹細胞移植を含み得る。特定の実施形態では、対象は、ブスルファン馴化による骨髄破壊的馴化を受け得る（例えば、１ｍｇ／ｋｇの試験用量で、初回用量薬物動態分析に基づいて用量調整される）。特定の実施形態では、馴化は、４日間連続して行われ得る。特定の実施形態では、３日間のブスルファン休薬期間後、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（例えば、≧２×１０^６細胞／ｋｇ、≧３×１０^６細胞／ｋｇ、≧４×１０^６細胞／ｋｇ、≧５×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ〜３×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ〜４×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ〜５×１０^６細胞／ｋｇ）が対象に再輸液され得る（例えば、末梢血中に）。特定の実施形態では、編集された自己由来ＣＤ３４＋ＨＳＰＣは、特定の対象のために製造され、凍結保存され得る。特定の実施形態では、対象は、連続的な骨髄破壊的馴化レジメン及び編集された自己由来ＣＤ３４＋細胞の輸液に続いて、好中球の移植を達成し得る。好中球移植は、≧０．５×１０^９／ＬのＡＮＣの３回の連続測定として定義され得る。特定の実施形態では、対象に投与されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団の細胞の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の細胞がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。

特定の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムは、約１０％以上の臨床的に関連するか又は治療的に関連する編集効率をもたらし得る。例えば、限定されるものではないが、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集システムは、約５％以上、約１０以上、１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上の臨床的に関連するか又は治療的に関連する編集効率をもたらし得る。

特定の実施形態では、本明細書で開示される治療方法で投与される細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％が修飾される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集細胞集団内の細胞の約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２５％未満又は約０．１％未満がＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの１つ又は複数の構成要素を含む。

ゲノム編集システム
「ゲノム編集システム」又は「遺伝子編集システム」という用語は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムから適合された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの少なくとも２つの構成要素を含む。これらの２つの構成要素は、特定の核酸配列と結合して、例えば１つ又は複数の一本鎖切断（ＳＳＢ又はニック）、二重鎖切断（ＤＳＣ）及び／又は点変異を生成することにより、核酸配列中又はその周囲のＤＮＡを編集できる複合体を形成する。

天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムは、進化的に２つのクラスと５つの型に組織化され（Ｍａｋａｒｏｖａｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１Ｊｕｎ；９（６）：４６７−４７７（Ｍａｋａｒｏｖａ）、参照により本明細書に援用される）、本開示のゲノム編集システムは、任意の型又はクラスの天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を適合させ得る一方、本明細書に提示される実施形態は、一般にクラス２及びＩＩ型又はＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムから適合される。ＩＩ型及びＶ型を包含するクラス２システムは、相対的に大型の多ドメインＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）と、１つ又は複数のガイドＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ、任意選択的にｔｒａｃｒＲＮＡ）とによって特徴付けられ、それは、ｃｒＲＮＡの標的（又はスペーサー）配列に相補的な特定の遺伝子座と会合（標的化）して切断する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。本開示によるゲノム編集システムは、細胞ＤＮＡ配列を同様に標的化して編集するが、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムとは著しく異なる。例えば、本明細書に記載の単分子ガイドＲＮＡは自然界に存在せず、且つ本開示によるガイドＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、いずれも天然に存在しない任意の数の修飾を組み込み得る。

ゲノム編集システムは、様々な方法で実装され得（例えば、細胞又は対象に投与又は送達され得る）、異なる実装が異なる用途に適し得る。例えば、ゲノム編集システムは、特定の実施形態では、タンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質又はＲＮＰ）として実装され、それは、脂質又はポリマーの微粒子又はナノ粒子、ミセル、リポソームなどの薬学的に許容可能な担体及び／又は封入剤を任意選択的に含む医薬組成物に含まれ得る。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡ構成要素をコードする１つ又は複数の核酸として（任意選択的に、１つ又は複数の追加的な構成要素と共に）実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、このような核酸を含む１つ又は複数のベクター、例えばアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターとして実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、前述のいずれかの組み合わせとして実装される。本明細書に記載の原理に従って動作する追加的な又は修正された実装は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。

本開示のゲノム編集システムは、単一の特定のヌクレオチド配列を標的化し得るか又は標的化し得、２つ以上のガイドＲＮＡの使用により、２つ以上の特定のヌクレオチド配列を並行して編集できることに留意すべきである。複数のｇＲＮＡの使用は、本開示を通して「多重化」と称され、関心のある複数の無関係の標的配列を標的化するため又は単一の標的ドメイン内に複数のＳＳＢ若しくはＤＳＢを形成するため、場合によりこのような標的ドメイン内で特定の編集をするために用いられ得る。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍａｅｄｅｒｅｔａｌ．（Ｍａｅｄｅｒ）による国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレットは、潜在的なスプライス部位の生成をもたらし、その結果として遺伝子の機能を低下させ又は排除する、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子における点変異を修正する（Ｃ．２９９１＋１６５５ＡからＧへ）ためのゲノム編集システムを記載する。Ｍａｅｄｅｒのゲノム編集システムは、点変異の両側の（すなわちそれを挟む）配列を標的化する２つのガイドＲＮＡを利用して、変異側面に位置するＤＳＢを形成する。これは次に、変異を含む介在配列の欠失を促進し、それによって潜在的スプライス部位を除去し正常な遺伝子機能を回復させる。

別の例とし、参照によりその全体が本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏら（「Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏら」）による国際公開第２０１６／０７３９９０号パンフレットは、「二重ニッカーゼシステム」と称される配置である、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａなどの一本鎖ニックを生じるＣａｓ９）と組み合わせて、２つのｇＲＮＡを利用するゲノム編集システムを記載する。Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらの二重ニッカーゼシステムは、１つ又は複数のヌクレオチドでオフセットされている目的の配列の逆ストランドに、２つのニックを生じるように構成され、上記ニックが組み合わされて、オーバーハングを有する二本鎖切断を作り出す（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎらｏの場合には５’であるが３’オーバーハングも可能である）。オーバーハングは、次に、いくつかの状況において相同指向修復事象を促進し得る。また、別の例として、Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔらによる国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット（「Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔ」、参照によりその全体が本明細書に援用される）は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ（「支配ＲＮＡ」と称される）を記載し、それは、例えば、いくつかのウイルス形質導入細胞において、さもなければ構成的に発現され得るＣａｓ９の一過性発現を可能にするために、１つ又は複数の追加的なｇＲＮＡを含むゲノム編集システムに含まれ得る。これらの多重化用途は限定的ではなく、むしろ例示的であること意図しており、当業者は、他の多重化用途が一般に、本明細書に記載のゲノム編集システムと適合性があることを理解するであろう。

ゲノム編集システムは、場合により、ＮＨＥＪ又はＨＤＲなどの細胞ＤＮＡ二本鎖切機序断によって修復される二本鎖切断を形成し得る。これらの機序は、例えば、Ｄａｖｉｓ＆Ｍａｉｚｅｌｓ，ＰＮＡＳ，１１１（１０）：Ｅ９２４−９３２，Ｍａｒｃｈ１１，２０１４（Ｄａｖｉｓ）（Ａｌｔ−ＨＤＲについて記載する）；Ｆｒｉｔｅｔａｌ．ＤＮＡＲｅｐａｉｒ１７（２０１４）８１−９７（Ｆｒｉｔ）（Ａｌｔ−ＮＨＥＪについて記載する）；及びＩｙａｍａａｎｄＷｉｌｓｏｎＩＩＩ，ＤＮＡＲｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３−Ａｕｇ；１２（８）：６２０−６３６（Ｉｙａｍａ）（標準ＨＤＲ及びＮＨＥＪ経路について一般的に記載する）などの文献にわたり記載されている。

ゲノム編集システムがＤＳＢを形成することによって機能する場合、このようなシステムは任意選択的に、特定の様式の二本鎖切断修復又は特定の修復結果を促進し又は容易にする、１つ又は複数の構成要素を含む。例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらは、その中に一本鎖オリゴヌクレオチド「ドナー鋳型」が付加されているゲノム編集システムも記載しており；ドナー鋳型は、ゲノム編集システムによって切断される細胞ＤＮＡの標的領域に組み込まれ、標的配列の変化をもたらし得る。

特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一本鎖又は二本鎖の切断を引き起こすことなく、標的配列を改変するか、又は標的配列中又はその付近の遺伝子の発現を改変する。例えば、ゲノム編集システムは、ＤＮＡに作用する機能ドメインに融合したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含み得、それによって標的配列又はその発現を改変する。一例として、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ機能ドメインに結合（例えば、融合）し得、標的化されたＣからＡへの置換を生成することによって機能し得る。例示的なヌクレアーゼ／デアミナーゼ融合体は、参照により援用される、Ｋｏｍｏｒｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ５３３，４２０−４２４（１９Ｍａｙ２０１６）（「Ｋｏｍｏｒ」）に記載される。代わりに、ゲノム編集システムは、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）などの切断不活性化（すなわち「デッド」）ヌクレアーゼを利用し得、細胞ＤＮＡの１つ又は複数の標的化領域上に安定な複合体を形成し、それにより、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ転写、クロマチンリモデリングなどをはじめとする、標的領域が関与する機能を妨害することによって機能し得る。

特定の実施形態では、本開示に包含されるゲノム編集システムは、標準アッセイにおいて特定の最小限の編集百分率を示すであろう。例えば、限定されるものではないが、本開示に包含される特定のゲノム編集システムは、特定の標準アッセイにおいて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の編集を示すであろう。当該技術分野で公知の１つ若しくは複数のアッセイ又は例えば後述の実施例１に記載されるものなどの本明細書に記載されるアッセイは、標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集を評価するために使用され得る。一例として、後述の実施例１では、例えばＣＤ３４^＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比した評価が記載され、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出される。次に、検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較され得る。

特定の実施形態では、本開示のゲノム編集システムは、細胞集団内で同時に、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される１つ又は複数、２つ以上、３つ以上又は４つ以上の遺伝子をノックアウト又はノックダウンし得る。特定の実施形態では、本開示のゲノム編集システムは、１つ又は複数、２つ以上、３つ以上又は４つ以上のｇＲＮＡ分子を含み得、各ｇＲＮＡ分子は、例えば、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子から選択される遺伝子などの異なる遺伝子に対する標的化ドメインを含む。例えば、限定されるものではないが、本開示の多重ゲノム編集システムは、（ｉ）第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、第１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第１のＲＮＰ複合体、（ｉｉ）第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と、第２のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第２のＲＮＰ複合体、（ｉｉｉ）第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第３のＲＮＰ複合体、及び／又は（ｉｖ）第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子と、第４のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む第４のＲＮＰ複合体を含み得る。特定の実施形態では、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表６、７及び８に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＡＣを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表２及び３に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＣＩＩＴＡを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表９に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＢＣを標的化するためのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、表４及び５に列挙される標的化ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、編集効率は、全ての標的遺伝子について＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％又は＞９９％であり得る。特定の実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞集団であり得る。

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、細胞内のゲノム又はエピソーム配列などの標的配列に対する、Ｃｐｆ１などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特定の結合（又は「標的化」）を促進する、任意の核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含むか又はキメラとも称される）又はモジュール型（例えば、二重化によって通常互いに結合する、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡなどの２つ以上、典型的には２つの別々のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ｇＲＮＡ及びそれらの構成部分は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ５６（２），３３３−３３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ２３，２０１４（Ｂｒｉｎｅｒ）、参照により援用される）及びＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献にわたり記載される。

細菌及び古細菌では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは一般に、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質；外来配列に相補的な５’領域を含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；及びｃｒＲＮＡの３’領域に相補的でありそれと二重鎖を形成する、５’領域を含むトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いかなる理論にも拘束されることは意図されないが、この二重鎖はＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を促進し、その活性に必要であると考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを遺伝子編集における使用に適合させる間、１つの非限定的例において、ｃｒＲＮＡ（その３’末端）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’末端）の相補的領域を架橋する、４ヌクレオチド（例えば、ＧＡＡＡ）「テトラループ」又は「リンカー」配列により、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが単一の単分子又はキメラガイドＲＮＡに連結され得ることが発見された。（それらの全てが参照により本明細書に援用される、Ｍａｌｉｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３Ｆｅｂ１５；３３９（６１２１）：８２３−８２６（「Ｍａｌｉ」）；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｍａｒ；３１（３）：２３３−２３９（「Ｊｉａｎｇ」）；及びＪｉｎｅｋｅｔａｌ．，２０１２ＳｃｉｅｎｃｅＡｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６−８２１（「Ｊｉｎｅｋ」））。

ガイドＲＮＡは、単分又はモジュラー型を問わず、編集が望まれる細胞のゲノム中のＤＮＡ配列などの標的配列中の標的ドメインに完全に又は部分的に相補的な「標的化ドメイン」を含む。標的化ドメインは、限定されるものではないが、「ガイド配列」（Ｈｓｕｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３Ｓｅｐ；３１（９）：８２７−８３２，（「Ｈｓｕ」）、参照により本明細書に援用される）、「相補的領域」（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏら）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）及び包括的に「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）をはじめとする文献において、様々な名称で呼ばれている。それらに与えられた名称とはかかわりなく、標的化ドメインは、典型的には１０〜３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では１６〜２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチド長）であり、Ｃａｓ９ｇＲＮＡの場合には５’末端又はその付近にあり、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡの場合には３’末端又はその付近にある。

標的化ドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的には（以下で考察されるように必ずしもそうとは限らないが）、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ／Ｃｐｆ１複合体の形成又は活性に影響を及ぼし得る複数のドメインを含む。例えば、上記のように、ｇＲＮＡの第１及び第２の相補的ドメイン（リピート：アンチリピート二重鎖とも称される）によって形成される二重鎖構造は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介し得る。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５６，９３５−９４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２７、２０１４（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４）及びＮｉｓｈｉｍａｓｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１６２，１１１３−１１２６，Ａｕｇｕｓｔ２７，２０１５（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１５）、いずれも参照により本明細書に援用される）。第１及び／又は第２の相補的ドメインは、ＲＮＡポリメラーゼによって終結シグナルとして認識され得る、１つ又は複数のポリＡ鎖を含有し得ることに留意すべきである。そのため、第１及び第２の相補的ドメインの配列は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒに記載されるようなＡ−Ｇスワップの使用又はＡ−Ｕスワップの使用を通じて任意選択的に修飾され、これらの区域が除去されてｇＲＮＡの完全なインビトロ転写が促進される。第１及び第２の相補的ドメインに対するこれらの及び他の類似の改変は、本開示の範囲内である。

第１及び第２の相補的ドメインと共に、Ｃａｓ９ｇＲＮＡは典型的には、インビボでヌクレアーゼ活性に関与するが、インビトロでは必ずしも関与しない、２つ以上の追加的な二重鎖領域を含む。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１５）。第二の相補的ドメインの３’部分の付近にある第１のステムループ１は、「近位ドメイン」（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ２０１４及び２０１５）及び「ｎｅｘｕｓ」（Ｂｒｉｎｅｒ）など様々に呼ばれる。１つ又は複数の追加的なステムループ構造は、一般に、ｇＲＮＡの３’末端の付近に存在し、数は種によって異なり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡが典型的に２つの３’ステムループ（リピート：アンチリピート二重鎖を含む合計４つのステムループ構造：アンチリピート二重鎖）を含む一方で、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び他の種は、単に１つのみ有する（合計３つのステムループ構造）。種毎にまとめられた、保存的ステムループ構造（及びより一般的にはｇＲＮＡ構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒに提供されている。

前述の説明は、Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡに焦点を当ててきたが、ここまでに記載されたものといくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用する、他のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが発見され又は発明されている（又は将来的に発見される可能性がある）ことを理解されたい。例えば、Ｃｐｆ１（「プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｃｅｌｌａ）１」由来のＣＲＩＳＰＲ）は最近発見されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼであり、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。（Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ１６３，７５９−７７１Ｏｃｔｏｂｅｒ２２，２０１５（ＺｅｔｓｃｈｅＩ）、参照により本明細書に援用される）。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムにおいて使用するためのｇＲＮＡは、一般に、標的化ドメイン及び相補的ドメイン（交互に「ハンドル」と称される）を含む。Ｃｐｆ１と共に使用するためのｇＲＮＡにおいて、標的化ドメインは通常、Ｃａｓ９ｇＲＮＡに関して上述したように、５’末端ではなくむしろ３’末端又はその付近に存在する（ハンドルはＣｐｆ１ｇＲＮＡの５’末端又はその付近にある）ことにも留意すべきである。

当業者は、異なる原核生物種由来のｇＲＮＡ間又はＣｐｆ１とＣａｓ９のｇＲＮＡ間に構造上の相違が存在し得るが、ｇＲＮＡが作用する原理は概して一貫していることを理解するであろう。この動作の一貫性のために、ｇＲＮＡは、広い意味で、それらの標的化ドメイン配列によって定義され得、当業者は、所与の標的化ドメイン配列が、単分子若しくはキメラｇＲＮＡ又は１つ若しくは複数の化学修飾及び／若しくは配列修飾（置換、追加のヌクレオチド、切断など）を含むｇＲＮＡをはじめとする、任意の適切なｇＲＮＡに組み込まれ得ることを理解するであろう。したがって、本開示における提示の経済性のために、ｇＲＮＡはそれらの標的化ドメイン配列の観点のみから記載され得る。

より一般的には、当業者は、本開示のいくつかの態様が、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法及び組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ｇＲＮＡという用語は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１の特定の種と適合性のｇＲＮＡだけでなく、任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に使用され得る任意の適切なｇＲＮＡを包含するものと理解されるべきである。例として、ｇＲＮＡという用語は、特定の実施形態では、ＩＩ型又はＶ型などのクラス２ＣＲＩＳＰＲシステム又はＣＲＩＳＰＲシステムに存在する任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、又はそれに由来するか、又はそれから適合化されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、使用するためのｇＲＮＡを含み得る。

本開示は、表２〜９及び１９で提供されるｇＲＮＡのいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡ分子及びその組成物を提供する。本開示は、表２〜９及び１９に記載されるｇＲＮＡの配列を含む１つ又は複数のｇＲＮＡを含む組成物及びその組成物をさらに提供する。本開示は、表１８で提供される染色体領域（例えば、ゲノム座標）を標的とするｇＲＮＡ及びその組成物を提供する。

本開示は、例えば、細胞集団において、標的部位に約１０％を超える編集をもたらすｇＲＮＡを提供する。例えば、限定されるものではないが、本開示のｇＲＮＡは、例えば、細胞集団において標的部位において、約１５％を超える編集、約２０％を超える編集、約２５％を超える編集、約３０％を超える編集、約３５％を超える編集、約４０％を超える編集、約４５％を超える編集、約５０％を超える編集、約５５％を超える編集、約６０％を超える編集、約６５％を超える編集、約７０％を超える編集、約７５％を超える編集、約８０％を超える編集、約８５％を超える編集、約９０％を超える編集、約９５％を超える編集、約９６％を超える編集、約９７％を超える編集、約９８％を超える編集又は約９９％を超える編集をもたらす。

ｇＲＮＡ設計
標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ；Ｈｓｕ；Ｆｕｅｔａｌ．，２０１４Ｎａｔｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３２（３）：２７９−８４，Ｈｅｉｇｗｅｒｅｔａｌ．，２０１４Ｎａｔｍｅｔｈｏｄｓ１１（２）：１２２−３；Ｂａｅｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０（１０）：１４７３−５；及びＸｉａｏＡｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３０（８）：１１８０−１１８２に以前記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。非限定的例として、ｇＲＮＡ設計は、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小化するために、使用者の標的配列に対応する潜在的な標的配列の選択を最適化するためのソフトウェアツールの使用を伴い得る。オフターゲット活性は切断に限定されないものの、各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に導出された重み付けスキームを用いて予測され得る。これらの及び他のガイド選択方法は、Ｍａｅｄｅｒ及びＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに詳細に記載されている。

ｇＲＮＡ修飾
ｇＲＮＡの活性、安定性又は他の特徴は、特定の修飾を組み込むことによって改変され得る。一例として、一過性に発現又は送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を起こし易くあり得る。したがって、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対して安定性を導入する、１つ又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載の特定の修飾ｇＲＮＡは、細胞に導入された際に、先天性免疫応答の低下を示し得るとも考えられている。当業者は、外因性核酸、特にウイルス又は細菌起源のものに応答して、例えば哺乳類細胞などの細胞において一般的に観察される特定の細胞応答を承知している。サイトカインの発現及び放出の誘導並びに細胞死を含み得るそのような応答は、本明細書に提示される修飾によって低下し又は完全に排除され得る。

このセクションで論じられる特定の例示的な修飾は、限定されるものではないが、５’末端又はその付近（例えば、５’末端の１〜１０、１〜５又は１〜２ヌクレオチド以内）及び／又は３’末端又はその付近（例えば、３’末端の１〜１０、１〜５又は１〜２ヌクレオチド以内）などのｇＲＮＡ配列中の任意の位置に含まれ得る。場合により、修飾は、Ｃａｓ９ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ｇＲＮＡのステムループ構造及び／又はｇＲＮＡの標的化ドメインなどの機能的モチーフ内に位置する。

一例として、ｇＲＮＡの５’末端は、以下で示されるような、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造又はＧキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体又は３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗キャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含み得る。

キャップ又はキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学合成又はインビトロ転写中に含まれ得る。

似たような路線で、ｇＲＮＡの５’末端には５’三リン酸基が欠如し得る。例えば、インビトロ転写ｇＲＮＡを（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用することで）ホスファターゼ処理して、５’三リン酸基が除去され得る。

別の一般的な修飾は、ｇＲＮＡの３’末端に、ポリＡトラクトと称される複数の（例えば、１〜１０、１０〜２０又は２５〜２００個の）アデニン（Ａ）残基を付加することを伴う。ポリＡ配列は、ポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用したインビトロ転写に続く化学合成中に又はＭａｅｄｅｒに記載されるようにインビボでポリアデニル化配列によってｇＲＮＡに付加され得る。

本明細書に記載の修飾は任意の適切な方法で組み合わされ得、例えばインビボでＤＮＡベクターから転写されるか、又はインビトロで転写されたｇＲＮＡは、５’キャップ構造又はキャップ類似体のいずれか又は両方と、３’ポリＡ配列とを含み得ることに留意すべきである。

ガイドＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらし、

式中、「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。

３’末端Ｕリボースは、以下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得、

式中、「Ｕ」は、未修飾又は修飾ウリジンであり得る。

ガイドＲＮＡは、例えば、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの１つ又は複数を組み込むことによって分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン及び５−ブロモウリジン又は本明細書に記載されるいずれかの修飾ウリジンなどの修飾ウリジンで置換され得；アデノシン及びグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの例えば８位が修飾された修飾アデノシン及びグアノシン又は本明細書に記載されるいずれかの修飾アデノシン又はグアノシンによって置換され得る。

特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ又はアミノ酸であり得る）；又はシアノ（−ＣＮ）から選択される基によって置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ＰｈＴｘ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つ又は複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾又は例えば２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）１，２’−Ｆ若しくは２’−Ｏ−メチル、グアノシン（Ｇ）をはじめとする２’−フルオロ修飾、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅ０）及びそれらの任意の組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾又は未修飾ヌクレオチドであり得る。

ガイドｇＲＮＡは、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）も含み得、その中で、２’ＯＨ基は、例えば、同一リボース糖の４’炭素へのＣ１〜６アルキレン又はＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって結合され得る。このような架橋を提供するために、限定されるものではないが、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ又はＯ（ＣＨ_２）_ｎ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）をはじめとする任意の適切な部分が使用され得る。

特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；及びグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、その中でリボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換される、Ｒ−ＧＮＡ又はＳ−ＧＮＡ）又はトレオース核酸（その中でリボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）を含み得る。

一般に、ｇＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖類であるリボースを含む。代表的な修飾ｇＲＮＡとしては、限定されるものではないが、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）又は例えばメチレン又はエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタン又はオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル及びホスホロアミダート骨格も有するモルホリノなどの追加的な炭素又はヘテロ原子を有する６又は７員環を形成する）が挙げられる。糖類似体改変の大部分は２’位に局在するが、４’位をはじめとする他の部位も修飾を受け入れやすい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅ又は４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。

特定の実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中の１つ又は複数の又は全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。

特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、その内容全体が参照により本明細書に援用される整理番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第１７／６９０１９号明細書を有する国際特許出願に記載されるものから選択される１つ又は複数のリンカー及び／又はｇＲＮＡ合成のプロセスを含むであろう。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとしては、Ｃｐｆ１などの天然に存在するクラス２ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ並びに例えば変異型などのそれから誘導されるか又はそれから得られる他のヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、機能的にも定義され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用し（例えば、複合体形成し）；及び（ｂ）ｇＲＮＡと一緒に、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的な配列、及び任意選択的に（ｉｉ）下でより詳細に記載される、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」と称される追加的な配列を含むＤＮＡの標的領域と結合し、任意選択的に切断又は修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が例証するように、たとえ同一ＰＡＭ特異性又は切断活性を共有する個々のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ間に変動が存在し得るとしても、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、広い意味で、それらのＰＡＭ特異性及び切断活性によって定義され得る。当業者は、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性及び／又は切断活性を有する任意の適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法及び組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼという用語は総称として理解されるべきであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのいかなる特定の型（例えば、Ｃａｓ９と対比したＣｐｆ１）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）と対比したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））又はバリエーション（例えば、完全長と対比した短縮型又は分割；天然ＰＡＭ特異性と対比した操作されたＰＡＭ特異性など）にも限定されない。

ＰＡＭ配列は、ｇＲＮＡ標的化ドメイン（又は「スペーサー」）に相補的な「プロトスペーサー」配列とのその配列関係からその名称を取っている。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡの組み合わせのための標的領域又は配列を規定する。

様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる配列関係を必要とし得る。一般に、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３’であるＰＡＭ配列を認識する。他方、Ｃｐｆ１は、一般にプロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を認識する。

ＰＡＭ及びプロトスペーサーの特定の配列の向きを認識することに加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定のＰＡＭ配列も認識し得る。例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識し、その中ではＮ残基が、ｇＲＮＡ標的化ドメインによって認識される領域の３’に隣接する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧＰＡＭ配列を認識する。また、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１は、ＴＴＮＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼについて同定されており、新規ＰＡＭ配列を同定するためのストラテジーは、Ｓｈｍａｋｏｖｅｔａｌ．，２０１５，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ６０，３８５−３９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ５，２０１５によって記載されている。操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意すべきである（例えば、操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合、参照分子はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがそれに由来する天然に存在する変異型であり得るか、又は操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとの最大アミノ酸配列相同性を有する天然に存在する変異型であり得る）。

それらのＰＡＭ特異性に加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けられ得、天然ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、典型的には標的核酸中でＤＳＢを形成するが、ＳＳＢのみを生じるか又は全く切断しない、操作された変異型が生成されている（上で論じた）Ｒａｎ＆Ｈｓｕ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ１５４（６），１３８０−１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１２，２０１３（Ｒａｎ）、参照により本明細書に援用される）。

Ｃｐｆ１
ｃｒＲＮＡと、ＴＴＴＮＰＡＭ配列などの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的と複合体形成したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１の結晶構造が、Ｙａｍａｎｏｅｔａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０１６Ｍａｙ５；１６５（４）：９４９−９６２（Ｙａｍａｎｏ）、参照により本明細書に援用される）によって解析されている。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１には、ＲＥＣ（認識）ローブとＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブの２つのローブがある。ＲＥＣローブはＲＥＣ１及びＲＥＣ２ドメインを含み、これらはいかなる既知のタンパク質構造とも類似性がない。その一方で、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ−Ｉ、−ＩＩ及び−ＩＩＩ）と１つのＢＨドメインとを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１ＲＥＣローブはＨＮＨドメインを欠いており、既知のタンパク質構造との類似性を欠く他のドメイである、構造的にユニークなＰＩドメインと、３つのウェッジ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ−Ｉ、−ＩＩ及び−ＩＩＩ）と、ヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインとを含む。

Ｃａｓ９及びＣｐｆ１が構造及び機能において類似性を共有する一方で、特定のＣｐｆ１活性はいずれのＣａｓ９ドメインにも類似していない、構造ドメインによって媒介されることを理解すべきである。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインとは配列的及び空間的に異なる、Ｎｕｃドメインによって媒介されるようである。さらに、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡの非標的化部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９ｇＲＮＡ中のリピート：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、むしろ偽結び目構造を取る。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾
上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、様々な用途に有用であり得る活性及び特性を有するが、当業者は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼも場合により修飾されて、切断活性、ＰＡＭ特異性又は他の構造的若しくは機能的特徴が改変され得ることを認識するであろう。

まず、切断活性を改変する修飾に目を向けると、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低減又は排除する変異が上に記載されている。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９ＨＮＨドメイン又はＣｐｆ１Ｎｕｃドメインに生成され得る例示的な変異は、ＲａｎａｎｄＹａｍａｎｏ及びＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。一般に、２つのヌクレアーゼドメインの１つの活性を低減又は排除する変異は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをもたらすが、ニッカーゼ活性の種類は、いずれのドメインが不活性化されるかによって変化することに留意すべきである。一例として、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの不活性化は、相補鎖又は上部鎖を切断するニッカーゼをもたらす。他方、Ｃａｓ９ＨＮＨドメインの不活性化は、下部鎖又は非相補鎖を切断するニッカーゼをもたらす。

天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５Ｊｕｌ２３；５２３（７５６１）：４８１−５（ＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒＩ）及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｄｅｃ；３３（１２）：１２９３−１２９８（ＫｌｉｅｎｓｔｉｖｅｒＩＩ））の両方について記載されている。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．は、Ｃａｓ９の標的化忠実度を改善する修飾についても記載している（Ｎａｔｕｒｅ，２０１６Ｊａｎｕａｒｙ２８；５２９，４９０−４９５（ＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒＩＩＩ））。天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５Ｊｕｌ２３；５２３（７５６１）：４８１−５（ＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒＩ）の両方について記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。

天然に存在するＣｐｆ１参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｇａｏｅｔａｌ．によって記載されている（参照により本明細書に援用されるＧａｏｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７Ａｕｇ；３５（８）：７８９−７９２）。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、例えば、ＡｓＣｐｆ１変異型などのＣｐｆ１変異型であり得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１変異型は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒバリエーションを含むＡｓＣｐｆ１変異型であり、それは、ＴＹＣＶＰＡＭを認識する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１変異型は、Ｓ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒバリエーションを含むＡｓＣｐｆ１変異型であり、それは、ＴＡＴＶＰＡＭを認識する。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．（ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｆｅｂ；３３（２）：１３９−４２（ＺｅｔｓｃｈｅＩＩ）、参照により援用される）及びＦｉｎｅｅｔａｌ．（ＳｃｉＲｅｐ．２０１５Ｊｕｌ１；５：１０７７７（Ｆｉｎｅ）、参照により援用される）によって記載されるように、２つ以上の部分に分割される。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ結合、標的及びＰＡＭ認識並びに切断活性をなおも維持しながら、ヌクレアーゼのサイズを低下させる１つ又は複数の欠失を通じて、サイズ最適化又は短縮され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択でリンカーにより、別のポリペプチド、ヌクレオチド又は他の構造に共有結合的に又は非共有結合的に結合する。例示的な結合ヌクレアーゼ及びリンカーは、本明細書におけるあらゆる目的のために参照により援用される、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２，５７７−５８２（２０１４）によって記載される。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択的に、核局在化シグナルをはじめとするが、これに限定されるものではない標識を含んで、核内へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質の移動も容易にする。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃ末端及び／又はＮ末端の核局在化シグナルを組み込み得る。核局在化配列は、当該技術分野で公知であり、Ｍａｅｄｅｒ及び他の箇所に記載される。

前述の修飾のリストは、本質的に例示的であることを意図しており、当業者は、本開示に鑑みて、他の修正が特定の用途において可能であるか、又は望ましいことがあり得ることを理解するであろう。したがって、簡潔さのために、本開示の例示的なシステム、方法及び組成物は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを参照して提示されるが、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはそれらの動作原理を変えない様式で改変され得るものと理解されるべきである。このような改変は、本開示の範囲内である。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸
例えば、Ｃｐｆ１又はその機能性断片などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸が、本明細書で提供される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸が、以前記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ２０１３；Ｗａｎｇ２０１３；Ｍａｌｉ２０１３；Ｊｉｎｅｋ２０１２を参照されたい）。

場合により、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は化学修飾され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、以下の特性の１つ又は複数の（例えば、全て）を有するであろう：それはキャップされ得；ポリアデニル化され得；５−メチルシチジン及び／又はプソイドウリジンで置換され得る。

合成核酸配列もコドン最適化され得、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドン又はそれほど一般的でないコドンが、一般的なコドンによって置き換えられる。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。コドン最適化されたＣａｓ９コード配列の例は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに提示されている。

さらに又は代わりに、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。

候補分子の機能解析
候補ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ及びそれらの複合体は、当該技術分野で公知の標準法によって評価され得る。例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらを参照されたい。ＲＮＰ複合体の安定性は、下述される示差走査型蛍光定量法によって評価され得る。

示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。ＤＳＦ技術は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増加し得る、タンパク質の熱安定性を測定する。

ＤＳＦアッセイは、任意の適切なプロトコルに従って実施され得、限定されるものではないが、（ａ）異なる条件（例えば、異なる化学量論比のｇＲＮＡ：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質、異なる緩衝液など）を試験して、ＲＮＰ形成のための最適条件を同定すること；及び（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡの修飾（例えば、化学修飾、配列改変など）を試験して、ＲＮＰ形成又は安定性を改善する修飾を同定することをはじめとする、任意の適切な設定で使用され得る。ＤＳＦアッセイの１つの読み取りは、ＲＮＰ複合体の融解温度の変化であり；比較的高い変化は、ＲＮＰ複合体が、より低い変化によって特徴付けられる標準ＲＮＰ複合体と比較して、より安定している（したがってより大きい活性又はより好ましい形成動態、分解動態又は別の機能特性を有し得る）ことを示唆する。ＤＳＦアッセイがスクリーニングツールとして展開される場合、閾値融解温度変化が特定され得、それにより、結果は、閾値以上の融解温度変化を有する１つ又は複数のＲＮＰである。例えば、閾値は、５〜１０°Ｃ（例えば、５℃°、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃）又はそれを超えるものであり得、結果は、閾値以上の融解温度変化によって特徴付けられる１つ又は複数のＲＮＰであり得る。

ＤＳＦアッセイ条件の２つの非限定的例は、下記の通りである（条件は、Ｃａｓ９の使用を参照する一方、Ｃｐｆ１に関しても同様の条件を用い得る）。

ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、水中の固定濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９＋１０×ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５０）を３８４ウェルプレート内に分注する。次に、様々なｐＨ及び塩を有する溶液中に希釈された、等モル量のｇＲＮＡを添加する。室温で１０分間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。

第２のアッセイは、様々な濃度のｇＲＮＡを、上記のアッセイ１からの最適緩衝液中の固定濃度（例えば、２μＭ）のＣａｓ９ｉに混合し、３８４ウェルプレート内で（例えば、室温で１０分間）インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−６６５０）を添加し、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封する。短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。

ゲノム編集ストラテジー
上述したゲノム編集システムを使用して、本開示の様々な実施形態において、細胞内で又は細胞から得られたＤＮＡの標的領域内で編集する（すなわち修飾する）。特定の編集をするための様々なストラテジーが本明細書に記載され、これらのストラテジーは、一般に所望の修復結果、個々の編集（例えば、ＳＳＢ又はＤＳＢ）の数と位置及びこのような編集の標的部位によって記述される。

ＳＳＢ又はＤＳＢの形成を伴うゲノム編集ストラテジーは、（ａ）標的領域の全部又は一部の欠失；（ｂ）標的領域の全部又は一部内への挿入又はその置換；又は（ｃ）標的領域の全部又は一部の中断をはじめとする修復結果によって特徴付けられる。このグループ分けは、任意の特定の理論又はモデルを制限することも又はそれに拘束されることも意図されず、提示の経済性のためにのみ提供される。当業者は、列挙される結果が相互に排他的でなく、いくつかの修復が他の結果をもたらし得ることを理解するであろう。特定の編集ストラテジー又は方法の説明は、別段の指定がない限り、特定の修復結果を必要とすると理解されるべきではない。

標的領域の置換は、例えば、ＨＤＲ経路によって媒介される２つの修復結果である、遺伝子修正又は遺伝子変換を通じた、相同配列による、標的領域内に存在する配列の全部又は一部の置換を一般に伴う。ＨＤＲは、以下でより詳細に記載されるように、一本鎖又は二本鎖であり得るドナー鋳型の使用によって促進される。一本鎖又は二本鎖鋳型は外因性であり得、その場合、それらは遺伝子修正を促進するか、又はそれらは内因性（例えば、細胞ゲノム中の相同配列）であり得、遺伝子変換を促進する。外因性鋳型は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎｅｔａｌ．（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３４，３３９−３４４（２０１６）、（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、参照により援用される）によって記載されるように、非対称オーバーハングを有することができる（すなわち、ＤＳＢの部位に相補的な鋳型の部分は、鋳型内の中心に位置するのではなく、むしろ３’又は５’方向にオフセットされ得る）。鋳型が一本鎖である場合、それは標的領域の相補的（上部）又は非相補的（下部）鎖のいずれかに対応し得る。

Ｒａｎ及びＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載されるように、遺伝子変換及び遺伝子修正は、場合により、標的領域内又はその周囲に、１つ又は複数のニックを形成することによって促進される。場合により、二重ニッカーゼストラテジーを使用して、２つのオフセットＳＳＢが形成され、次に、オーバーハング（例えば、５’オーバーハング）を有する単一のＤＳＢが形成される。

標的配列の全部又は一部の中断及び／又は欠失は、様々な修復結果によって達成され得る。一例として、ＬＣＡ１０変異についてＭａｅｄｅｒに記載されているように、標的領域を挟む２つ以上のＤＳＢを同時に生成することによって配列を欠失させ得、次にそれはＤＳＢが修復される際に切除される。別の例として、配列は、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖切断の形成と、それに続く修復前のオーバーハングのヌクレオチド末端加水分解プロセシングによって生成される欠失によって中断され得る。

標的配列中断の１つの特定のサブセットは、標的配列中のインデルの形成によって媒介され、その中では修復結果は典型的にはＮＨＥＪ経路（Ａｌｔ−ＮＨＥＪをはじめとする）によって媒介される。ＮＨＥＪは、そのインデル変異との関連のために「誤りがちな」修復経路と称される。しかし、場合により、ＤＳＢはその周囲の配列の改変なしにＮＨＥＪによって修復され（いわゆる「完璧」又は「無瘢痕」修復）；これは一般に、ＤＳＢの両端が完全にライゲートされることを必要とする。その一方で、インデルは、それらがライゲートされる前の遊離ＤＮＡ末端の酵素的プロセシングから生じると考えられ、それは、片方又は両方の遊離末端の片方又は両方の鎖にヌクレオチドを付加し及び／又はそれから除去する。

遊離ＤＳＢ末端の酵素的プロセシングは、本質的に確率論的であり得るため、インデル変異は変動する傾向があり、分布に沿って発生し、特定の標的部位、使用される細胞型、使用されるゲノム編集ストラテジーをはじめとする、様々な要因によって影響され得る。それでもなお、インデル形成について限定的に一般化することは可能であり：単一のＤＳＢの修復によって形成される欠失は、最も一般的には１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐを超えることもあり得る。単一のＤＳＢの修復によって形成された挿入はより短くなる傾向があり、多くの場合に切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含む。しかし、大きい挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムの他の領域又は細胞内に存在するプラスミドＤＮＡに由来が突き止められている。

インデル変異及びインデルを生成するように構成されたゲノム編集システムは、例えば、特定の最終配列の生成が必要でない場合及び／又はフレームシフト変異が耐容される場合、標的配列を中断するのに有用である。それらは、所望の特定の配列が所与の部位におけるＳＳＢ又はＤＳＢの修復から優先的に生じる傾向がある限り、特定の配列が好ましい状況でも有用であり得る。インデル変異は、特定のゲノム編集システム及びそれらの構成要素の活性を評価又はスクリーニングするための有用なツールでもある。これらの及び他の設定では、インデルは、（ａ）ゲノム編集システムと接触される細胞のゲノムにおけるそれらの相対的及び絶対的頻度、及び（ｂ）例えば、未編集の配列に対する±１、±２、±３などの数値的な差の分布によって特徴付けられ得る。一例として、リード発見設定では、複数のｇＲＮＡをスクリーニングして、制御された条件下でのインデル読み取りに基づいて、標的部位での切断を最も効率的に推進するｇＲＮＡが同定され得る。閾値頻度以上のインデルを生成するガイド又はインデルの特定の分布を生成するガイドが、さらなる研究及び開発のために選択され得る。インデルの頻度及び分布は、例えば、ｇＲＮＡを一定に保ち、他の特定の反応条件又は送達方法を変化させることにより、異なるゲノム編集システムの実装又は製剤化及び送達方法を評価するための読み取りとしても有用であり得る。

多重ストラテジー
上記の例示的なストラテジーは、単一のＤＳＢによって媒介される修復結果に焦点を合わせている一方で、本開示によるゲノム編集システムを使用して、同一遺伝子座又は異なる遺伝子座のいずれかで２つ以上のＤＳＢが生成され得る。複数のＤＳＢ又はＳＳＢの形成を含む編集ストラテジーは、例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。本明細書に記載されるように、本開示に包含される方法及び組成物を使用して、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上又は１０以上のＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子などの２つ以上のＴ細胞発現遺伝子を修飾することにより、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性及び／又は機能に影響を及ぼし得る。

ドナー鋳型設計
ドナー鋳型設計は、例えば、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献に詳細に記載される。一本鎖（ｓｓＯＤＮ）又は二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得るＤＮＡオリゴマードナー鋳型（オリゴデオキシヌクレオチド又はＯＤＮ）が、ＤＳＢのＨＤＲに基づく修復を容易にするために使用され得、それは、標的ＤＮＡ配列に修飾を導入し、新しい配列を標的配列に挿入するか、又は標的配列を完全に置換するのに特に有用である。

一本鎖であるか又は二本鎖であるかにかかわらず、ドナー鋳型は、切断される標的配列中の又はその付近の（例えば、側方の又は隣接している）ＤＮＡ領域と相同的な領域を一般に含む。これらの相同領域は、本明細書「相同性アーム」と称され、下に概略的に示される。
［５’相同性アーム］−−［置換配列］−−［３’相同性アーム］

相同性アームは任意の適切な長さ（１つの相同性アームのみが使用される場合には皆無のヌクレオチドを含む）を有し得、３’及び５’相同性アームは、同じ長さを有し得るか又は長さが異なり得る。適切な相同性アーム長の選択は、Ａｌｕ反復配列又は他の非常に一般的な要素などの特定の配列との相同性又はミクロ相同性を回避したいという願望などの様々な要因によって影響を受け得る。例えば、５’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。他の実施形態では、３’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの両方が短縮されて、特定の配列反復要素の包含が回避され得る。さらに、いくつかの相同性アームデザインは、編集効率を改善し又は所望の修復結果の頻度を増加させ得る。例えば、参照により援用されるＲｉｃｈａｒｄｓｏｎｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３４，３３９−３４４（２０１６）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）は、一本鎖ドナー鋳型の３’及び５’相同性アームの相対的非対称性が、修復率及び／又は結果に影響を及ぼすことを見いだした。

ドナー鋳型中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらをはじめとする他の箇所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である場合には皆無のヌクレオチドを含む）であり得、典型的には、編集が所望される細胞内の天然配列に対して１、２、３個又はそれを超える配列修飾を含む。１つの一般的な配列修飾は、処置が所望される疾患又は病状に関連する変異を修復するための天然配列の改変を伴う。別の一般的な配列修飾は、ＳＳＢ若しくはＤＳＢを生成するために使用される、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ配列又はｇＲＮＡの標的化ドメインに、相補的であり又はそれをコードする１つ又は複数の配列を改変し、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減又は排除することを伴う。

直鎖ｓｓＯＤＮが使用される場合、それは（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールされ、（ｉｉ）無傷の標的核酸鎖にアニールされ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールされ、及び／又は（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールされるように構成され得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約若しくは少なくとも１５０〜２００ヌクレオチド又はそれ以下（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド）などの任意の適切な長さを有し得る。

鋳型核酸は、ウイルスゲノムなどの核酸ベクター又は例えばプラスミドなどの環状二本鎖ＤＮＡでもあり得ることに留意すべきである。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコーディング又は非コード要素を含み得る。例えば、鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）を含み、任意選択的に、ｇＲＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする追加の配列を含むウイルスゲノムの一部として（例えばＡＡＶ又はレンチウイルスゲノム中で）送達され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、１つ又は複数のｇＲＮＡによって認識される標的部位に隣接するか又はそれに挟まれ、ドナー鋳型の一端又は両端における遊離ＤＳＢの形成を容易にし得、それは、同一ｇＲＮＡを使用して細胞ＤＮＡ中に形成された対応するＳＳＢ又はＤＳＢの修復に関与し得る。ドナー鋳型として使用するのに適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏｅｔａｌ．に記載される。

どのような形態が使用されても、鋳型核酸は、望ましくない配列を回避するように設計され得る。特定の実施形態では、片方又は両方の相同性アームが短縮され、例えばＡｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などの特定の配列反復要素との重複が回避され得る。

標的化組み込み
本開示は、細胞内の標的核酸の切断部位における切断分離事象時に生じる遺伝子編集事象の定量的評価を可能にするように特別に設計されたドナー鋳型を含むゲノム編集システムをさらに提供する。本明細書に記載のゲノム編集システムのドナー鋳型は、ＤＮＡオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、それは、一本鎖（ｓｓＯＤＮ）又は二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得、二本鎖破断のＨＤＲベースの修復を促進するために使用され得る。ドナー鋳型は、特に、標的ＤＮＡ配列に修飾を導入するか、標的配列に新規配列を挿入するか、又は標的配列全体を置換するのに有用である。本開示は、カーゴ、１つ又は２つの相同性アーム及び１つ又は複数のプライミング部位を含むドナー鋳型を提供する。ドナー鋳型のプライミング部位は、標的核酸へのドナー鋳型の一部の組み込み頻度が容易に評価及び定量化され得るような様式で空間的に配置される。

図４４Ａ、４４Ｂ及び４４Ｃは、代表的なドナー鋳型と、これらのドナー鋳型の使用から得られた潜在的な標的化組み込み結果とを図解する概略図である。本明細書に記載の例示的ドナー鋳型の使用は、標的化核酸中の少なくとも１つのプライミング部位の標的化組み込みをもたらし、これは、標的細胞内の標的化核酸へのカーゴ（例えば、導入遺伝子）の標的化組み込みの頻度を判定するために配列決定され得るアンプリコンを生成するために使用され得る。

例えば、図４４Ａは、５’から３’方向に、第１の相同性アーム（Ａ１）、第１のスタッファー配列（Ｓ１）、第２のプライミング部位（Ｐ２’）、カーゴ、第１のプライミング部位、第２のスタッファー配列及び第２の相同性アームを含む例示的ドナー鋳型を図示する。ドナー鋳型の第１の相同性アーム（Ａ１）は、標的核酸の第１の相同性アームと実質的に同一である一方、ドナー鋳型の第２の相同性アーム（Ａ２）は、標的核酸の第２の相同性アームと実質的に同一である。ドナー鋳型は、第２のプライミング部位（Ｐ２’）が標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と実質的に同一であるように、且つ第１のプライミング部位（Ｐ１’）が標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と実質的に同一であるように設計される。本明細書に記載のヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断分離事象時、単一のプライマー対セットを使用して、標的核酸の切断部位周囲の核酸配列（すなわちＰ１及びＰ２間、Ｐ１及びＰ２’間並びにＰ１’及びＰ２間に存在する核酸）を増幅させ得る。有利には、標的化組み込みなし又は標的化組み込みありの切断分離事象から得られるアンプリコン（アンプリコンＸ、Ｙ及びＺとして示される）のサイズは、ほぼ同じである。アンプリコンは、次に、例えば配列決定又はプローブ配列へのハイブリダイゼーションによって評価され、標的化組み込みの頻度が判定され得る。

代わりに、図４４Ｂ及び４４Ｃは、カーゴ核酸配列から３’（図４４Ｂ）又は５’（図４４Ｃ）のいずれかに位置する単一プライミング部位を含む例示的ドナー鋳型を描写する。この場合も、本明細書に記載のヌクレアーゼを使用した標的核酸の切断分離事象時、これらの例示的ドナー鋳型は、ほぼ同じサイズの２つのアンプリコンが得られるように、単一のプライマー対を使用して、標的核酸の切断部位周囲の核酸配列が増幅され得るように設計される。ドナー鋳型のプライミング部位がカーゴ核酸から３’に位置する場合、非標的化組み込み事象に対応するアンプリコン又は標的化組み込み部位の５’接合部に対応するアンプリコンが増幅され得る。ドナー鋳型のプライミング部位がカーゴ核酸から５’に位置する場合、非標的化組み込み事象に対応するアンプリコン又は標的化組み込み部位の３’接合部に対応するアンプリコンが増幅され得る。これらのアンプリコンを配列決定して、標的化組み込みの頻度が判定され得る。

本開示によるドナー鋳型は、限定することなく、直線又は環状、裸の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをはじめとする任意の適切な様式で実装され得るか若しくはベクター内に含まれ得、且つ／又は（例えば、直接ハイブリダイゼーション若しくはスプリントハイブリダイゼーションによって）ガイドＲＮＡと共有結合的若しくは非共有結合的に結合し得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型はｓｓＯＤＮである。直鎖ｓｓＯＤＮが使用される場合、それは、（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールされ、（ｉｉ）無傷の標的核酸鎖にアニールされ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールされ、且つ／又は（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールされるように構成され得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約１５０〜２００ヌクレオチド又はそれを下回るもの（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ヌクレオチド）などの任意の適切な長さを有し得る。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ｄｓＯＤＮである。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１の鎖を含む。別の実施形態では、ドナー鋳型は、第１の鎖及び第２の鎖を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、例えば、細胞に天然に存在しないオリゴヌクレオチドなどの外因性オリゴヌクレオチドである。

ドナー鋳型は、ウイルスゲノム又は例えばプラスミドなどの環状二本鎖ＤＮＡなどの核酸ベクター内にも含まれ得ることに留意すべきである。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、犬用の骨の形状のＤＮＡであり得る（例えば、米国特許第９，４９９，８４７号明細書を参照されたい）。ドナー鋳型を含む核酸ベクターは、他のコーディング又は非コード要素を含み得る。例えば、ドナー鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）を含み、任意選択的に、ｇＲＮＡ及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする追加の配列を含むウイルスゲノムの一部として（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスゲノム中で）送達され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、１つ又は複数のｇＲＮＡによって認識される標的部位に隣接するか又はそれに挟まれ、ドナー鋳型の一端又は両端における遊離ＤＳＢの形成を容易にし得、それは、同一ｇＲＮＡを使用して細胞ＤＮＡ中に形成された対応するＳＳＢ又はＤＳＢの修復に関与し得る。ドナー鋳型として使用するのに適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏｅｔａｌ．に記載される。

相同性アーム
一本鎖又は二本鎖を問わず、ドナー鋳型は、一般に、例えば、例えば切断部位などの切断される標的配列内の又はその近傍の（例えば、それを挟むか又はそれに隣接している）標的核酸などのＤＮＡの領域と相同的な１つ又は複数の領域を含む。これらの相同領域は、本明細書では「相同性アーム」と称され、下に概略的に示される。
［５’相同性アーム］−［置換配列］−［３’相同性アーム］

本明細書に記載のドナー鋳型の相同性アームは、ドナー鋳型を必要とするＤＮＡ修復プロセスによる標的核酸の切断部位の効率的な分離を可能にするのに十分な長さである限り、任意の適切な長さであり得る。例えば、ＰＣＲによる相同性アーム増幅が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、増幅が実施され得るような長さである。相同性アームの配列決定が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、配列決定が実施され得るような長さである。アンプリコンの定量的評価が望まれる特定の実施形態では、相同性アームは、例えば、同様のＧ／Ｃ含有量、増幅温度などを有することにより、各アンプリコンの同様の増幅回数が達成されるような長さである。特定の実施形態では、相同性アームは、二本鎖である。特定の実施形態では、二本鎖相同性アームは、一本鎖である。

特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０〜２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも３００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも６００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０〜２５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１０００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも３００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも６００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１５００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜２５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜２０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜１５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜１０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０〜５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０〜２５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２０００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１０００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも３００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも４００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも６００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも７００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも１５００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが少なくとも２０００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約４０塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約１００塩基対である。特定の実施形態では、５’相同性アームは、長さが約２００塩基対である。

特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜２５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜２０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜１５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜１０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０〜５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０〜２５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２０００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１０００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも３００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも４００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも６００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも７００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも１５００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが少なくとも２０００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約４０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約１００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが約２００塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが１００塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが５０塩基対以下である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、３’相同性アームは、長さが４０塩基対である。

５’及び３’相同性アームは、同じ長さであり得るか又は長さが異なり得る。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、増幅されて、標的核酸における標的化組み込みなどの遺伝子編集事象の定量的評価を可能にする。特定の実施形態では、遺伝子編集事象の定量的評価は、単一増幅反応で一対のＰＣＲプライマー対を使用して、相同性アームの全体又は一部を増幅させることによる、標的化組み込み部位における５’接合部及び３’接合部の両方の増幅に依存し得る。したがって、５’及び３’相同性アームの長さは、異なり得るが、各相同性アームの長さは、必要に応じて、（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅可能でなければならない。さらに、単一ＰＣＲ反応において、５’相同性アームの増幅と、５’及び３’相同性アームの長さの差との両方が望まれる場合、５’及び３’相同性アームの長さの差は、一対のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅可能でなければならない。

特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの長さには、７５ヌクレオチドを超える差がない。したがって、特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームの長さが異なる場合、相同性アーム間の長さの差は、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ヌクレオチド又は塩基対よりも小さい。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アーム間の長さの差は、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１塩基対未満である。特定の実施形態では、５’及び３’相同性アームは、長さが少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５塩基対だけ異なる。

本開示のドナー鋳型は、切断部位を有する標的核酸との相同組換えを促進するように設計され、標的核酸は、５’から３’方向にＰ１−−Ｈ１−−Ｘ−−Ｈ２−−Ｐ２を含み、
ここで、Ｐ１は、第１のプライミング部位であり；Ｈ１は、第１の相同性アームであり；Ｘは、切断部位であり；Ｈ２は、第２の相同性アームであり；Ｐ２は、第２のプライミング部位であり；ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ａ２又はＡ１−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２を含み、
ここで、Ａ１は、Ｈ１と実質的に同一の相同性アームであり；Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位であり；Ｎは、カーゴであり；Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一のプライミング部位であり；Ａ２は、Ｈ２と実質的に同一の相同性アームである。特定の実施形態では、標的核酸は、二本鎖である。特定の実施形態では、標的核酸は、第１の鎖及び第２の鎖を含む。別の実施形態では、標的核酸は、一本鎖である。特定の実施形態では、標的核酸は、第１の鎖を含む。

特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ａ２を含む。

特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２を含む。

特定の実施形態では、標的核酸は、５’から３’方向にＰ１−−Ｈ１−−Ｘ−−Ｈ２−−Ｐ２を含み、
ここで、Ｐ１は、第１のプライミング部位であり；Ｈ１は、第１の相同性アームであり；Ｘは、切断部位であり；Ｈ２は、第２の相同性アームであり；Ｐ２は、第２のプライミング部位であり；ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ａ２又はＡ１−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２を含み、
ここで、Ａ１は、Ｈ１と実質的に同一の相同性アームであり；Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位であり；Ｎは、カーゴであり；Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一のプライミング部位であり；Ａ２は、Ｈ２と実質的に同一の相同性アームである。

特定の実施形態では、ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２を含む。

特定の実施形態では、ドナー鋳型の第１の鎖は、５’から３’方向にＡ１−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２を含む。

特定の実施形態では、Ａ１は、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２０塩基対である。

特定の実施形態では、Ａ２は、長さが７００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１００塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２０塩基対である。

特定の実施形態では、Ａ１は、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ１は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、Ａ２は、長さが７００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５５０ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが４００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが３００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが１００ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも４０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ａ２は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。

特定の実施形態では、Ａ１の核酸配列は、Ｈ１の核酸配列と実質的に同一である。特定の実施形態では、Ａ１は、Ｈ１と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０ヌクレオチド以下だけ異なる配列を有する。特定の実施形態では、Ａ１は、Ｈ１と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０塩基対以下だけ異なる配列を有する。

特定の実施形態では、Ａ２の核酸配列は、Ｈ２の核酸配列と実質的に同一である。特定の実施形態では、Ａ２は、Ｈ２と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０ヌクレオチド以下だけ異なる配列を有する。特定の実施形態では、Ａ２は、Ｈ２と同一であるか、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９若しくは４０塩基対以下だけ異なる配列を有する。

どのような形式であれ、ドナー鋳型は、望ましくない配列を回避するように設計され得る。特定の実施形態では、片方又は両方の相同性アームが短縮され、例えばＡｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などの特定の配列反復要素との重複が回避され得る。

プライミング部位
本明細書に記載のドナー鋳型は、標的核酸内のプライミング部位の配列と実質的に類似するか又はそれと同一であるが、ドナー鋳型内の相同性配列／相同性アームに対して異なる空間的順序又は配向にある配列を有する少なくとも１つのプライミング部位を含む。ドナー鋳型が標的核酸と相同的に組換えされる場合、プライミング部位は、有利には標的核酸に組み込まれ、その結果、組換え事象によって生じる修飾核酸配列の一部の増幅を可能にする。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１つのプライミング部位を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１及び第２のプライミング部位を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、３つ以上のプライミング部位を含む。

特定の実施形態では、ドナー鋳型は、標的核酸内において、プライミング部位Ｐと実質的に同様であるか又は同一のプライミング部位Ｐ１’を含み、ドナー鋳型が標的核酸に組み込まれると、Ｐ１’は、Ｐ１の下流に組み込まれる。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１のプライミング部位Ｐ１’及び第２のプライミング部位Ｐ２’を含み；Ｐ１’は、標的核酸内で第１のプライミング部位Ｐ１と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２’は、標的核酸内で第２のプライミング部位Ｐ２と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ１及びＰ２は、実質的に同様でないか又は同一でない。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、第１のプライミング部位Ｐ１’及び第２のプライミング部位Ｐ２’を含み；Ｐ１’は、標的核酸内で第１のプライミング部位Ｐ１と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２’は、標的核酸内で第２のプライミング部位Ｐ２と実質的に同様であるか又は同一であり；Ｐ２は、標的核酸上でＰ１の下流に位置し；Ｐ１及びＰ２は、実質的に同様でないか又は同一でなく；ドナー鋳型が標的核酸に組み込まれると、Ｐ１’は、Ｐ１の下流に組み込まれる。Ｐ２’は、Ｐ２の上流に組み込まれ、Ｐ２’は、Ｐ１の上流に組み込まれる。

特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）及び第２のプライミング部位（Ｐ２）を含む。標的核酸の第１のプライミング部位は、第１の相同性アーム内にあり得る。代わりに、標的核酸の第１のプライミング部位は、５’にあり、第１の相同性アームに隣接し得る。標的核酸の第２のプライミング部位は、第２の相同性アーム内にあり得る。代わりに、標的核酸の第２のプライミング部位は、３’にあり、第２の相同性アームに隣接し得る。

ドナー鋳型は、カーゴ配列、第１のプライミング部位（Ｐ１’）及び第２のプライミング部位（Ｐ２’）を含み得、Ｐ２’は、カーゴ配列の５’に位置し、Ｐ１’は、カーゴ配列の３’に位置し（すなわちＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２）、Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一であり、Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ１’及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対並びにＰ２’及びＰ２を含むオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの３つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＹは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１及びＰ２’間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって５’接合部を増幅させる。第３のアンプリコン、アンプリコンＺは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１’及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって３’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。

特定の実施形態では、ドナー鋳型は、カーゴ及びプライミング部位（Ｐ１’）を含み、Ｐ１’は、カーゴ核酸配列の３’に位置し（ｒｎｐＡ１−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ａ２）、Ｐ１’は、Ｐ１と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ１’及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対及びＰ２を標的とするオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの２つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＺは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１’及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって３’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。

特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）及び第２のプライミング部位（Ｐ２）を含み、ドナー鋳型は、プライミング部位Ｐ２’を含み、Ｐ２’は、カーゴ核酸配列の５’に位置し（すなわちＡ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ａ２）、Ｐ２’は、Ｐ２と実質的に同一である。このシナリオにおいて、Ｐ２’及びＰ２を標的とするオリゴヌクレオチドを含むプライマー対及びＰ１を標的とするオリゴヌクレオチドを使用して、標的化される遺伝子座が増幅され得、それにより同様のサイズの２つのアンプリコンが生成され、これを配列決定して標的化組み込みが生じたかどうかが判定され得る。第１のアンプリコン、アンプリコンＸは、標的核酸における非標的化組み込みの結果として、Ｐ１及びＰ２間の核酸配列の増幅によって生じる。第２のアンプリコン、アンプリコンＹは、標的核酸の標的化組み込み事象後にＰ１及びＰ２’間の核酸配列の増幅によって生じ、それによって５’接合部を増幅させる。他の実施形態では、Ｐ１’は、Ｐ１と同一であり得る。さらに、Ｐ２’は、Ｐ２と同一であり得る。

ドナー鋳型のプライミング部位は、標的核酸の一部の増幅及び／又は配列決定による、標的核酸における遺伝子編集事象の定量的評価が可能になる任意の長さであり得る。例えば、特定の実施形態では、標的核酸は、第１のプライミング部位（Ｐ１）を含み、ドナー鋳型は、プライミング部位（Ｐ１’）を含む。これらの実施形態では、Ｐ１’プライミング部位及びＰ１プライマー部位の長さは、単一のプライマーが両方のプライミング部位に特異的にアニールし得るような長さである（例えば、特定の実施形態では、Ｐ１’プライミング部位及びＰ１プライミング部位の長さは、いずれも同一の又は非常に良く類似したＧＣ含有量を有するような長さである）。

特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが５０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが４０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが３０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０塩基対である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが６０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが５０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが４０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが３０塩基対未満である。特定の実施形態では、ドナー鋳型のプライミング部位は、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０塩基対である。

特定の実施形態では、標的核酸の切断部位における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、６００塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸の切断部位における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第１のプライミング部位（Ｐ１）と現在組み込まれたＰ２’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０ヌクレオチド以下である。

特定の実施形態では、標的核酸は、第２のプライミング部位（Ｐ２）を含み、ドナー鋳型は、Ｐ２と実質的に同一のプライミング部位（Ｐ２’）を含む。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、６００塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、６００ヌクレオチド以下である。特定の実施形態では、標的核酸における切断分離事象及び標的核酸によるドナー鋳型の相同組換えに際して、標的核酸の第２のプライミング部位（Ｐ２）と現在組み込まれたＰ１’プライミング部位との間の距離は、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０ヌクレオチド以下である。

特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ａ１の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ａ１の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｎの核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｎの核酸配列内に含まれる。

特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ａ２の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ａ２の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｎの核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｎの核酸配列内に含まれる。

特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｓ１の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ２’の核酸配列は、Ｓ１の核酸配列に直接隣接する。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｓ２の核酸配列内に含まれる。特定の実施形態では、Ｐ１’の核酸配列は、Ｓ２の核酸配列に直接隣接する。

カーゴ
本明細書に記載の遺伝子編集システムのドナー鋳型は、カーゴ（Ｎ）を含む。カーゴは、所望の結果を達成するために必要な任意の長さであり得る。例えば、カーゴ配列は、長さが２５００塩基対未満又は２５００ヌクレオチド未満であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１２ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１０ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、７ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、５ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、４ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、３ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、２ｋｂ以下であり得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、１ｋｂ以下であり得る。特定の実施形態では、カーゴは、長さが約５〜１０ｋｂであり得る。別の実施形態では、カーゴは、長さが約１〜５ｋｂであり得る。別の実施形態では、カーゴは、長さが約０〜１ｋｂであり得る。例えば、例示的な実施形態では、カーゴは、長さが約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００又は１００塩基対又はヌクレオチドであり得る。他の例示的実施形態では、カーゴは、長さが約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０塩基対又はヌクレオチドであり得る。当業者は、サイズ制限がある送達ビヒクル（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、組み込み欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）送達ビヒクルなどのウイルス送達ビヒクル）を使用してドナー鋳型を送達する際、カーゴを含めたドナー鋳型のサイズが送達システムのサイズ制限を超えてはならないことを容易に確認するであろう。

特定の実施形態では、カーゴは、置換配列を含む。特定の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列のエクソンを含む。特定の実施形態では、カーゴは、遺伝子配列のイントロンを含む。特定の実施形態では、カーゴは、ｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、カーゴは、転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、置換配列の逆相補体、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、ｃＤＮＡ配列又は転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、置換配列の一部、遺伝子配列のエクソン、遺伝子配列のイントロン、ｃＤＮＡ配列又は転写調節エレメントを含む。特定の実施形態では、カーゴは、導入遺伝子配列である。特定の実施形態では、カーゴは、標的核酸に欠失を導入する。特定の実施形態では、カーゴは、外因性配列を含む。他の実施形態では、カーゴは、内因性配列を含む。

ドナー鋳型中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏｅｔａｌ．をはじめとする他の箇所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である場合には皆無のヌクレオチドを含む）であり得、典型的には、編集が所望される細胞内の天然配列に対して１つ、２つ、３つ又はそれを超える配列修飾を含む。１つの一般的な配列修飾は、治療が所望される疾患又は病状に関連する変異を修復するための天然配列の改変を伴う。別の一般的な配列修飾は、ＳＳＢ又はＤＳＢを生成するために使用される、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ配列又はｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的であるか又はそれをコードする１つ又は複数の配列を改変し、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減又は排除することを伴う。

編集される細胞型、標的核酸及び達成すべき効果に基づいて、所与の用途のために特定のカーゴが選択され得る。

例えば、特定の実施形態では、標的細胞内の選択された染色体遺伝子座で所望の遺伝子配列を「ノックイン」することが望ましい場合がある。このような場合、カーゴは、所望の遺伝子配列を含み得る。特定の実施形態では、遺伝子配列は、例えば、外因性タンパク質、オルソロガスタンパク質若しくは内因性タンパク質又はそれらの組み合わせなどの所望のタンパク質をコードする。

特定の実施形態では、カーゴは、野生型配列又は野生型配列に関して１つ又は複数の修飾を含む配列を含有し得る。例えば、細胞内の標的遺伝子の変異を修正することが望ましいいくつかの実施形態では、カーゴは、野生型配列を標的タンパク質に復元するように設計され得る。

他の実施形態では、標的細胞内の選択された染色体遺伝子座で、遺伝子配列を「ノックアウト」することも望ましいことがあり得る。このような場合、カーゴは、例えば、標的遺伝子配列のコード領域又は例えば標的遺伝子配列のプロモーター若しくはエンハンサーなどの標的遺伝子配列の発現制御領域などの標的遺伝子配列の発現を妨害する部位に組み込まれるように設計され得る。他の実施形態では、カーゴは、標的遺伝子配列を破壊するように設計され得る。例えば、特定の実施形態では、カーゴは、欠失、挿入、停止コドン又はフレームシフト変異を標的核酸に導入し得る。

特定の実施形態では、ドナーは、標的核酸配列の全部又は一部を欠失させるように設計される。特定の実施形態では、ドナーの相同性アームは、所望の欠失部位を挟むように設計され得る。特定の実施形態では、ドナーは、相同性アーム間にカーゴ配列を含有せず、ドナーの標的化組み込みに続いて、相同性アーム間に位置する標的核酸の一部の欠失をもたらす。他の実施形態では、ドナーは、標的核酸に相同的なカーゴ配列を含み、標的核酸配列の１つ又は複数のヌクレオチドがカーゴに存在しない。ドナーの標的組込みに続いて、標的核酸は、カーゴ配列に存在しない残基に欠失を含むであろう。欠失のサイズは、標的核酸のサイズと所望の効果に基づいて選択され得る。特定の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１〜２０００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１〜１０００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１〜５００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて標的核酸に１〜１００ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。例示的な実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて、標的核酸に約２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチドの欠失を導入するように設計される。他の実施形態では、ドナーは、標的組込みに続いて、標的核酸から例えば約２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００ヌクレオチド以上の欠失などの２０００ヌクレオチドを超える欠失を導入するように設計される。

特定の実施形態では、カーゴは、プロモーター配列を含み得る。他の実施形態では、カーゴは、標的細胞に内因性のプロモーターの制御下にある部位に組み込まれるように設計される。

特定の実施形態では、染色体配列は、不活性化されるが、外因性配列が発現されるように、外因性又はオルソロガスタンパク質又はポリペプチドをコードするカーゴが、タンパク質をコードする染色体配列に組み込まれ得る。他の実施形態では、カーゴ配列は、染色体配列の発現を変化させることなく、染色体配列に組み込まれ得る。これは、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＨＰＲＴ遺伝子座又はＡＡＶ遺伝子座などの「セーフハーバー」遺伝子座にカーゴを組み込むことによって達成され得る。

特定の実施形態では、カーゴは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードする。特定の実施形態では、カーゴは、タンパク質の野生型形態をコードし得るか、又は疾患又障害に罹患した対象においてタンパク質が欠損している場合、タンパク質の野生型形態の発現を回復するように設計される。他の実施形態では、カーゴは、疾患又は障害に関連するタンパク質をコードし、カーゴによってコードされるタンパク質は、タンパク質の改変バージョンが疾患又は障害の発症から保護するように少なくとも１つの修飾を含む。他の実施形態では、カーゴは、タンパク質の改変バージョンが疾患又は障害を引き起こすか又は増強するように、少なくとも１つの修飾を含むタンパク質をコードする。

特定の実施形態では、カーゴを使用して、１つの種からの遺伝子が異なる種のゲノムに挿入され得る。例えば、「ヒト化」動物モデル及び／又は「ヒト化」動物細胞は、例えば、マウス、ラット又は非ヒト霊長類種などの非ヒト動物種のゲノムへのヒト遺伝子の標的化組み込みを通じて生成され得る。特定の実施形態では、このようなヒト化動物モデル及び動物細胞は、１つ又は複数のヒトタンパク質をコードする組み込まれた配列を含有する。

別の実施形態では、カーゴは、穀物、果物又は野菜などの作物をはじめとする植物種に利益を与えるタンパク質をコードする。例えば、カーゴは、植物をより高い温度で栽培することを可能にするタンパク質をコードし得、収穫に続く貯蔵寿命の延長又は耐病性を付与し得る。特定の実施形態では、カーゴは、病気及び害虫への耐性を与えるタンパク質をコードし得る（例えば、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：７８９（クラドスポリウムクラドスポリウム・フルブム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ）耐性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローニング）；Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４３２；Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓｅｔａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ７８：１０８９（シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）に対する耐性のためのＲＳＰ２遺伝子）；国際公開第９６／３０５１７号パンフレット（大豆嚢胞線虫への耐性）参照されたい）。他の実施形態では、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０３２６６４５Ａ１号明細書に記載されるように、カーゴは、除草剤への耐性をコードするタンパク質をコードし得る。別の実施形態では、カーゴは、例えば、限定することなく、例えばデンプンの分岐パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによってもたらされる、脂肪酸代謝の改変、フィチン酸塩含有量の低下及び炭水化物組成の変化などの付加価値のある形質を植物細胞に与えるタンパク質をコードする（例えば、Ｓｈｉｒｏｚａｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｌ．１７０：８１０（ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚｅｔａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０：２２０（レバンスクラーゼ遺伝子）；Ｐｅｎｅｔａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：２９２（α−アミラーゼ）；Ｅｌｌｉｏｔｅｔａｌ．（１９９３）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１：５１５（トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列）；Ｓｏｇａａｒｄｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２４８０（大麦α−アミラーゼ遺伝子）；及びＦｉｓｈｅｒｅｔａｌ．（１９９３）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０４５（トウモロコシ内胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照されたい）。植物細胞における標的化組み込みに有用な他の例示的なカーゴは、その内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０３２６６４５Ａ１号明細書に記載されている。

追加的なカーゴは、編集される細胞型、標的核酸及び達成すべき効果に基づいて、所与の用途のために当業者によって選択され得る。

スタッファー
特定の実施形態では、ドナー鋳型は、任意選択的に１つ又は複数のスタッファー配列を含み得る。一般に、スタッファー配列は、（ａ）本開示のドナー鋳型の標的部位への標的化組み込み及び本開示の特定の方法によるスタッファー配列を含むアンプリコンの引き続く増幅を促進する（又は阻害しない）が、（ｂ）ドナー鋳型の別の部位への組み込みを推進することを回避するように選択されている異種又はランダムな核酸配列である。スタッファー配列は、例えば、相同性アームＡ１とプライマー部位Ｐ２’との間に配置され、ドナー鋳型配列が標的部位に組み込まれたときに生成されるアンプリコンのサイズが調節され得る。このようなサイズ調節を用いて、一例として、組み込まれた標的及び組み込まれていない標的部位によって生成されるアンプリコンのサイズの平衡が保たれ、その結果、各アンプリコンが単一のＰＣＲ反応で生成される効率の平衡が保たれ；続いて、これは、反応混合物中の２つのアンプリコンの相対存在量に基づいて、標的化組み込みの定量的評価を容易にし得る。

標的化組み込み及び増幅を容易にするために、スタッファー配列を選択して、ＤＮＡ修復機構（例えば、相同組換えを介した）によって断部位の分離を妨げ得るか又は増幅を妨げ得る二次構造の形成が最小化され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１−−Ｓ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ａ２又はＡ１−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ｓ２−−Ａ２を含み；
ここで、Ｓ１は、第１のスタッファー配列であり、Ｓ２は、第２のスタッファー配列である。

特定の実施形態では、ドナー鋳型は、５’から３’方向にＡ１−−Ｓ１−−Ｐ２’−−Ｎ−−Ｐ１’−−Ｓ２−−Ａ２を含み、
ここで、Ｓ１は、第１のスタッファー配列であり、Ｓ２は、第２のスタッファー配列である。

特定の実施形態では、スタッファー配列は、細胞全体のゲノムとほぼ同じグアニン−シトシン含有量（「ＧＣ含有量」）を含む。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的化される遺伝子座とほぼ同じＧＣ含有量を含む。例えば、標的細胞がヒト細胞である場合、スタッファー配列は、約４０％のＧＣ含有量を含む。特定の実施形態では、スタッファー配列は、所望のＧＣ含有量を含むランダム核酸配列を作成することによって設計され得る。例えば、４０％のＧＣ含有量を含むスタッファー配列を生成するために、次のヌクレオチドの分布を有する核酸配列が設計され得る：Ａ＝３０％、Ｔ＝３０％、Ｇ＝２０％、Ｃ＝２０％。ゲノムのＧＣ含有量又は標的遺伝子座のＧＣ含有量を判定するための方法は、当業者に知られている。したがって、特定の実施形態では、スタッファー配列は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％６０％、６５％、７０％又は７５％のＧＣ含有量を含む。４０±５％のＧＣ含有量を有する例示的な２．０キロベーススタッファー配列が配列番号２３〜１２３として本明細書で提供される。

特定の実施形態では、第１のスタッファーは、配列番号２３〜１２３に記載される配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５又は少なくとも５００ヌクレオチドを含む配列を有する。別の実施形態では、第２のスタッファーは、配列番号２３〜１２３に記載される配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１０５、少なくとも１１０、少なくとも１１５、少なくとも１２０、少なくとも１２５、少なくとも１３０、少なくとも１３５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５５、少なくとも１６０、少なくとも１６５、少なくとも１７０、少なくとも１７５、少なくとも１８０、少なくとも１８５、少なくとも１９０、少なくとも１９５、少なくとも２００、少なくとも２０５、少なくとも２１０、少なくとも２１５、少なくとも２２０、少なくとも２２５、少なくとも２３０、少なくとも２３５、少なくとも２４０、少なくとも２４５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５又は少なくとも５００ヌクレオチドを含む配列を有する。

スタッファー配列は、標的核酸における切断部位の分離を妨害しないことが好ましい。したがって、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位において、核酸配列との最小の配列同一性を有するべきである。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０ヌクレオチド以内の任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的核酸の切断部位から５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０塩基対以内の任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。

オフターゲット分子組換え事象を回避するために、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム中の核酸配列に対して最小の相同性を有することが好ましい。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム中の核酸に対して最小の配列同一性を有する。特定の実施形態では、スタッファー配列は、標的細胞のゲノム内の（塩基対又はヌクレオチドでの測定で）同一長さの任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０塩基対のストレッチは、標的細胞ゲノムの核酸の任意の少なくとも２０塩基対のストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０ヌクレオチドのストレッチは、標的細胞ゲノムの核酸の任意の少なくとも２０ヌクレオチドのストレッチと６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。

特定の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型中の核酸配列（例えば、カーゴの核酸配列又はドナー鋳型に存在するプライミング部位の核酸配列）との最小の配列同一性を有する。特定の実施形態では、スタッファー配列は、ドナー鋳型内の（塩基対又はヌクレオチドでの測定で）同一長さの任意の核酸配列と８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０塩基対のストレッチは、ドナー鋳型の核酸の任意の２０塩基対のストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。特定の実施形態では、スタッファー配列の２０ヌクレオチドのストレッチは、ドナー鋳型の核酸の任意の２０ヌクレオチドのストレッチと８０％、７０％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％又は１０％未満が同一である。

特定の実施形態では、第１の相同性アーム及びその隣接するスタッファー配列（すなわちＡ１＋Ｓ１）の長さは、第２の相同性アーム及びその隣接するスタッファー配列（すなわちＡ２＋Ｓ２）の長さにほぼ等しい。例えば、特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと同じである（塩基対又はヌクレオチドでの判定による）。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２５ヌクレオチド以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチド以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２５塩基対以下だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ａ２＋Ｓ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対以下だけ異なる。

特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、１００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｈ１の長さは、４０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、１５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、１００塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、５０塩基対以下である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１又は２０塩基対である。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｈ２の長さは、４０塩基対である。

特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと同じである（ヌクレオチド又は塩基対での判定による）。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５ヌクレオチド未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５塩基対未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ１＋Ｓ１の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対だけ異なる。

特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと同じである（ヌクレオチド又は塩基対での判定による）。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５ヌクレオチド未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２ヌクレオチドだけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２の長さと２５塩基対未満だけ異なる。特定の実施形態では、Ａ２＋Ｓ２の長さは、Ｈ１＋Ｘ＋Ｈ２長さと２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２塩基対だけ異なる。

標的細胞
本開示によるゲノム編集システムを使用して、細胞が操作又は修飾され、例えば標的核酸が編集又は修飾され得る。操作は、様々な実施形態において、インビボ又はエクスビボで行われ得る。

本開示の実施形態に従って様々な細胞型が操作又は修飾され得、インビボ用途などの場合、例えば本開示によるゲノム編集システムを複数の細胞型に送達することにより、複数の細胞型が修飾又は操作され得る。しかし、他の場合、操作又は修飾を特定の細胞型に限定することが望ましいことがあり得る。例えば、いくつかの例では、遺伝子型の修飾が細胞表現型の変化をもたらすと予想される、Ｍａｅｄｅｒの例における光受容細胞などの、限定された分化能を有する細胞又は最終分化細胞を編集することが望ましくあり得る。しかし、他の場合、低分化型、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）又は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、幹細胞又は前駆細胞を編集することが望ましいことがある。例として、細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）又は所与の用途又は適応症に関連する細胞型に分化する他の幹細胞又は前駆細胞型であり得る。

特定の実施形態では、操作される細胞は、真核細胞である。例えば、限定されるものではないが、細胞は、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、ヤギ、豚、鳥、鶏、七面鳥、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、霊長類又はヒト細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、体細胞、胚芽細胞又は出生前細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、接合体細胞、胚盤胞細胞、胎芽細胞、幹細胞、有糸***コンピテント細胞又は減数***コンピテント細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、ヒト胚の一部でない。特定の実施形態では、操作される細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、系統限定前駆細胞、リンパ系前駆細胞、骨髄系前駆細胞、共通骨髄系前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球赤血球前駆細胞、レチナール細胞、光受容体細胞、棒細胞、円錐細胞、網膜色素上皮細胞、小柱網細胞、蝸牛毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋肉衛星細胞、ニューロン、神経細胞幹細胞、間葉系幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、単球、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、網状赤血球、Ｂ細胞（例えば、前駆細胞Ｂ細胞、プレＢ細胞、プロＢ細胞、記憶Ｂ細胞、血漿Ｂ細胞など）、胃腸上皮細胞、胆管上皮細胞、膵管上皮細胞、腸管幹細胞、肝実質細胞、肝臓星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膵島細胞（例えば、β細胞、α細胞、δ細胞）、膵臓外分泌細胞、シュワン細胞又は乏突起膠細胞である。特定の実施形態では、操作される細胞は、例えば、単子葉植物又は双子葉植物細胞などの植物細胞である。

特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、網状赤血球、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、リンパ系前駆細胞（ＬＰ）細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）又は内皮細胞（ＥＣ）などの循環血液細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄細胞（例えば、網状赤血球、赤血球系細胞（例えば、赤芽球）、ＭＥＰ細胞、骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ／ＧＭＰ）、ＬＰ細胞、赤血球前駆（ＥＰ）細胞、ＨＳＣ、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）細胞、内皮細胞（ＥＣ）、造血内皮（ＨＥ）細胞又は間葉系幹細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、骨髄系前駆細胞（例えば、共通骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）細胞又は顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、共通リンパ系前駆（ＣＬＰ）細胞などのリンパ系前駆細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は赤血球前駆細胞（例えば、ＭＥＰ細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、造血幹／前駆細胞（例えば、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）、ＭＰＰ細胞又は系統制限前駆（ＬＲＰ）細胞）である。特定の実施形態では、標的細胞は、ＣＤ３４^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ４９ｆ^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻細胞、ＣＤ１０５^＋細胞、ＣＤ３１^＋若しくはＣＤ１３３^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ１３３^＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、臍帯血ＣＤ３４^＋ＨＳＰＣ、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、羊水ＣＤ３４^＋細胞、羊水内皮細胞、胎盤内皮細胞又は胎盤造血ＣＤ３４^＋細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、動員された末梢血造血ＣＤ３４^＋細胞である（患者が例えばＧ−ＣＳＦ又はプレリキサホルなどの動員剤で治療された後）。特定の実施形態では、標的細胞は、末梢血内皮細胞である。

当然ながら、修飾又は操作される細胞は、標的化される細胞型及び／又は所望の編集結果に応じて、様々に、***細胞又は非***細胞である。

細胞がエクスビボで操作又は修飾される場合、細胞は直ちに使用され得る（例えば、対照に投与され得る）か、又はそれらは後で使用するために維持又は保存され得る。当業者は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して、細胞が培養物中で維持又は保存され得る（例えば、液体窒素中で凍結される）ことを理解するであろう。

ゲノム編集システムの実装：送達、配合及び投与経路
上で考察されるように、本開示のゲノム編集システムは、任意の適切な方法で実装され得、これは、限定されるものではないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、任意のドナー鋳型核酸をはじめとするシステムの構成要素が、ゲノム編集システムの形質導入、発現又は導入をもたらすような、且つ／又は細胞、組織又は対象において所望の修復結果を引き起こすような、任意の適切な形態又は形態の組み合わせで、送達、配合又は投与され得ることを意味する。ゲノム編集システム実装のいくつかの非限定的例が、表１０及び１１に記載される。しかし、当業者は、これらの一覧が包括的でなく、他の実装が可能であることを理解するであろう。特に表１０を参照すると、この表は、単一のｇＲＮＡ及び任意のドナー鋳型を含むゲノム編集システムのいくつかの例示的実装を列挙する。しかし、本開示によるゲノム編集システムには、複数のｇＲＮＡ、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びタンパク質などの他の構成要素が組み込まれ得、当業者には、表に示された原理に基づいて様々な実装が明らかになるであろう。表中、［Ｎ／Ａ］は、ゲノム編集システムが、示された構成要素を含まないことを示す。

表１１は、本明細書に記載されるようなゲノム編集システムの構成要素のための様々な送達方法を要約する。この場合も、一覧は、限定的ではなく、むしろ例示的であることが意図される。

ゲノム編集システムの核酸ベースの送達
本開示によるゲノム編集システムの様々な要素をコードする核酸は、当該技術分野で公知の方法によって又は本明細書に記載されるようにして、対象に投与され又は細胞内に送達され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡ並びにドナー鋳型核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ又はＤＮＡ複合体を使用する）又はそれらの組み合わせによって送達され得る。

ゲノム編集システムをコードする核酸又はその構成要素は、例えば、形質移入若しくは電気穿孔によって裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡとして細胞に直接送達され得るか、又は標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。表１１に要約されるベクターなどの核酸ベクターも使用され得る。

核酸ベクターは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ及び／又はドナー鋳型などのゲノム編集システム構成要素をコードする、１つ又は複数の配列を含み得る。ベクターは、タンパク質をコードする配列と結合する（例えば、その中に挿入され又はそれに融合する）シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化又はミトコンドリア局在化のための）をコードする配列も含み得る。一例として、核酸ベクターは、１つ又は複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）を含むＣｐｆ１コード配列を含み得る。

核酸ベクターは、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの任意の適切な数の調節／制御要素も含み得る。これらの要素は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。

本開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは表１１に記載され、追加的な適切なウイルスベクター及びそれらの使用と製造は、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される。当該技術分野で公知の他のウイルスベクターも使用され得る。さらに、ウイルス粒子を使用して、ゲノム編集システムの構成要素が、核酸及び／又はペプチドの形態で送達され得る。例えば、「空の」ウイルス粒子が、任意の適切な積荷を含有するように組み立てられ得る。ウイルスベクター及びウイルス粒子は、標的化リガンドを組み込んで、標的組織特異性が改変されるようにも操作され得る。

ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクターが、本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達するために使用され得る。非ウイルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーはナノ粒子であり、これは有機又は無機であり得る。ナノ粒子は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに要約される。任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素又はこのような構成要素をコードする核酸を、送達し得る。例えば、有機（例えば、脂質及び／又はポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形において送達ビヒクルとして使用するのに適し得る。ナノ粒子製剤及び／又は遺伝子移入で使用するための例示的な脂質が表１２に示され、表１３は遺伝子移入及び／又はナノ粒子製剤で使用するための例示的ポリマーを列挙する。

非ウイルスベクターは標的化修飾を任意選択的に含み、取り込みを改善し及び／又は特定の細胞型を選択的に標的化する。これらの標的化修飾としては、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））及び細胞透過性ペプチドが挙げられる。このようなベクターはまた、任意選択的に、融合誘導性及びエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用し、（例えば、積荷のエンドソーム漏出を促進するための）酸誘発立体構造変化を受け、且つ／又は例えば細胞区画への放出のための刺激切断可能ポリマーを組み込む。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。

特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素などの、ゲノム編集システムの構成要素以外の１つ又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つ又は複数と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つ又は複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間又は４週間未満）前又は後に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素などのゲノム編集システムの１つ又は複数の構成要素が送達されるのとは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性が低下され得るように、例えば組み込み欠損レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達され得、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素及び／又はｇＲＮＡ構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療用タンパク質をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。

ＲＮＰ及び／又はＲＮＡをコードするゲノム編集システム構成要素の送達
ＲＮＰ（ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの複合体）及び／又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、そのいくつかがＣｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏらに記載される当該技術分野で公知の方法により、細胞に送達されるか又は対象に投与され得る。インビトロでは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードし及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡが、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮又は圧搾によって送達され得る（例えば、Ｌｅｅ２０１２を参照されたい）。脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、ＧａｌＮＡｃ又は他のコンジュゲート媒介送達及びそれらの組み合わせもインビトロ及びインビボ送達のために使用され得る。

インビトロでは、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバー又はキュベット内において、ドナー鋳型核酸分子の存在下又は非存在下で細胞をＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び／又はｇＲＮＡをコードするＲＮＡと混合するステップと、１回又は複数回の規定の長さ及び振幅の電気インパルスを適用するステップとを含む。電気穿孔のシステム及びプロトコルは、当該技術分野で公知であり、本開示の様々な実施形態に関連して、任意の適切な電気穿孔ツール及び／又はプロトコルが使用され得る。例示的なシステムとしては、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｏｎｚａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）、ＦｌｏｗＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）形質移入システム（ＭａｘＣｙｔｅ）及びＮｅｏｎ（商標）形質移入システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。

投与経路
ゲノム編集システム又はそのようなシステムを用いて修飾又は操作された細胞は、局所的又は全身的を問わず、任意の適切な様式又は経路によって対象に投与され得る。全身性の投与法としては、経口及び非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、例として、静脈内、骨髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内及び腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、例えば、ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞又は赤血球前駆体若しくは前駆細胞を標的化するように修飾又は配合され得る。

局所投与様式としては、例として、骨梁への骨髄内注射又は骨髄腔への大腿内注射及び門脈への注入が挙げられる。特定の実施形態では、全身投与（例えば、静脈内）と比較して、局所的に（例えば、骨髄内に直接）投与された場合、（全身的アプローチと比較して）有意により少量の構成要素が効果を発揮し得る。局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的に毒性の副作用の発生を低減又は排除し得る。

投与は、周期的ボーラス（例えば、静脈内）として又は内部リザーバー若しくは外部リザーバーからの持続注入（例えば、静注バッグ又は植込み型ポンプから）として提供され得る。構成要素は、例えば、持続放出薬物送達デバイスからの連続放出により、局所的に投与され得る。

加えて、構成要素は、長時間にわたって放出されるように調合され得る。放出系は、生分解性材料又は拡散によって組み込まれた構成要素を放出する材料のマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内で均一に又は不均一に分布し得る。多様な放出系が有用であり得るが、適切なシステムの選択は、特定の用途によって要求される放出速度に左右される。非分解性及び分解性放出系の両方が使用され得る。適切な放出系としては、ポリマー及びポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス又は炭酸カルシウム及び糖（例えば、トレハロース）などであるが、これに限定されるものではない、無機及び有機賦形剤及び希釈剤が挙げられる。放出系は、天然又は合成であり得る。しかし、通常、より信頼でき、より再現可であり、より画定された放出プロファイルを生じることから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する構成要素が、材料を通じた又は材料の分解による、拡散によって放出されるように選択され得る。

典型的な合成生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）及びポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）及びポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；及びその化学誘導体（例えば、アルキル及びアルキレンなどの化学基の置換及び付加、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって日常的に行われる他の修飾）、共重合体及びそれらの混合物が挙げられる。典型的な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリル及びメタクリル酸及びポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）及びポリ（酢酸ビニル）などのビニルポリマー−ポリアクリレート及びポリメタクリレート；ポリ（ウレタン）；セルロースと、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース及び様々な酢酸セルロースなどのその誘導体；ポリシロキサン；任意のその化学的誘導体（例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化及び当業者によって慣例的に加えられる他の修飾）、共重合体及びそれらの混合物が挙げられる。

ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）微小球も使用され得る。典型的に、微小球は、中空球を形成するように構造化された、乳酸及びグリコール酸ポリマーから構成される。球は直径がおよそ１５〜３０ミクロンであり得、本明細書に記載される構成要素が負荷され得る。

構成要素の多峰性又は差動送達
当業者は、本開示に鑑みて、本明細書で開示されるゲノム編集システムの異なる構成要素が、一緒に又は別々に且つ同時に又は非同時に送達され得ることを理解するであろう。ゲノム編集システム構成要素の別々の及び／又は非同期の送達は、ゲノム編集システムの機能に対する時間的又は空間的制御を提供し、それらの活性によって引き起こされる特定の効果を制限するために、特に望ましくあり得る。

異なる又は差動様式は、本明細書の用法では、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子、ｇＲＮＡ、鋳型核酸又はペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学的又は薬物動態特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択された区画、組織又は臓器に、異なる組織分布、異なる半減期又は異なる時間的分布をもたらし得る。

例えば、自律複製又は細胞核酸内への挿入により、細胞内又は細胞子孫内に残留する核酸ベクターによる送達などのいくつかの送達様式は、構成要素のより持続性の発現及び存在をもたらす。例としては、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス性などのウイルス性送達が挙げられる。

例として、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡなどのゲノム編集システムの構成要素は、その結果生じる、体内、特定の区画、組織又は臓器に送達された構成要素の半減期又は持続性に関して異なる様式によって送達され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはこのような様式によって送達され得る。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素は、身体又は特定の区画、若しくは組織、若しくは臓器に対して、より低い持続性又はより少ない曝露をもたらす様式によって送達され得る。

より一般的には、特定の実施形態では、第１の送達様式が使用されて第１の構成要素が送達され、且つ第２の送達様式が使用されて第２の構成要素が送達される。第１の送達様式は、第１の薬力学的又は薬物動態学的特性を与える。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織又は臓器内における、構成要素又は構成要素をコードする核酸の、分布、持続性又は曝露であり得る。第２の送達様式は、第２の薬力学又は薬物動態学的特性を与える。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織又は臓器内における、構成要素又は構成要素をコードする核酸の、分布、持続性又は曝露であり得る。

特定の実施形態では、例えば、分布、持続性又は曝露などの第１の薬力学的又は薬物動態学的特性は、第２の薬力学的又は薬物動態学的特性よりも限定的である。

特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、分布、持続性又は曝露などの薬力学的又は薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最小化するように選択される。

特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、分布、持続性又は曝露などの薬力学的又は薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最大化するように選択される。

特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、核酸、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えばＡＡＶ又はレンチウイルスなどの相対的に持続性の要素の使用を含む。このようなベクターは比較的持続性であるため、それらから転写される生成物は、比較的持続性になる。

特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、ＲＮＡ又はタンパク質などの比較的一過性の要素を含む。

特定の実施形態では、第１の構成要素はｇＲＮＡを含み、送達様式は比較的持続性であり、例えばｇＲＮＡは、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスなどのプラスミド又はウイルスベクターから転写される。これらの遺伝子はタンパク質生成物をコードせず、ｇＲＮＡは単独で作用できないため、これらの遺伝子の転写は、生理学的に重要でない。第２の構成要素であるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子は、例えば、ｍＲＮＡとして又はタンパク質として一過性様式で送達され、完全ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子／ｇＲＮＡ複合体のみが存在し、短期間活性であることを確実にする。

さらに、構成要素は、互いに補完して安全性及び組織特異性を高める異なる分子形態又は異なる送達ベクターで送達され得る。

差動送達様式の使用は、性能、安全性及び／又は有効性を高め得、例えば最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減し得る。細菌由来Ｃａｓ酵素からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞表面に提示されるため、例えば、Ｃａｓ９分子などの免疫原性構成要素のより低持続性様式による送達は、免疫原性を低下させ得る。二部送達系は、これらの欠点を軽減し得る。

差動送達様式を使用して、異なるが重複する標的領域に、構成要素が送達され得る。形成活性複合体は、標的領域の重なりの外で最小化される。したがって、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡなどの第１の構成要素は、第１の送達様式によって送達され、例えば組織分布などの第１の空間的分布がもたらされる。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子などの第２の構成要素は、第２の送達様式によって送達され、例えば組織分布などの第２の空間的分布がもたらされる。特定の実施形態では、第１の様式は、リポソーム、例えばポリマーナノ粒子などのナノ粒子及び例えばウイルスベクターなどの核酸から選択された第１の要素を含む。第２の様式は、群から選択された第２の要素を含む。特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、細胞特異的受容体又は抗体などの第１の標的化要素を含み、第２の送達様式はその要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、第２の細胞特異的受容体又は第２の抗体などの第２の標的化要素を含む。

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、ウイルス送達ベクター、リポソーム又はポリマーナノ粒子中で送達される場合、単一組織のみを標的化することが望ましいことがあり得る場合、複数組織への送達とその中での治療活性の可能性がある。二部送達系はこの難題を解決し、組織特異性を高め得る。ｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、別個であるが重複する組織向性がある別々の送達ビヒクルにパッケージされれば、完全に機能的な複合体は、両方のベクターによって標的化される組織内のみに形成される。

例示的な非限定的実施形態
Ａ．特定の非限定的な実施形態では、本明細書で開示された主題は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲを提供する。

Ａ１．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ２．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＣ末端又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ３．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端又はその近傍に２つのＮＬＳ配列を含む、前述のＡ１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ４．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＣ末端又はその近傍に２つのＮＬＳ配列を含む、前述のＡ２のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ５．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼのＮ末端及びＣ末端の両方又はその近傍にＮＬＳを含む、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ６．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが２つ以上のＮＬＳ配列を含む場合、ＮＬＳ配列は、同一であるか又は異なる、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ７．ＮＬＳ配列又は配列群は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ａ８．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列は、ＮＬＳ（配列番号３）；Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号４；Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号５）；Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）；Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）；ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号８）；Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号９）；及びＨｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号１０）からなる群から選択される、前述のＡのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ．特定の非限定的実施形態では、本明細書で開示された主題は、システインアミノ酸の欠失又は置換を含む単離されたＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを提供する。

Ｂ１．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５又はＣ１２４８に欠失又は置換を含む、前述のＢのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ２．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列と比較して、Ｃ６５Ｓ／Ａ、Ｃ２０５Ｓ／Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ、Ｃ６０８Ｓ／Ａ、Ｃ６７４Ｓ／Ａ及びＣ１０２５Ｓ／Ａからなる群から選択される置換を含む、前述のＢ１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ３．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ３３４及びＣ６７４又はＣ３３４、Ｃ３７９及びＣ６７４のいずれかに欠失又は置換を含む、前述のＢ１のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ４．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列と比較して、（１）Ｃ３３４Ｓ／Ａ及びＣ６７４Ｓ／Ａ；及び（２）Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ及びＣ６７４Ｓ／Ａからなる群から選択される置換を含む、前述のＢ３のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ５．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＮＬＳをさらに含む、前述のＢのＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｂ６．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの配列は、Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｅｓｓ（配列番号１１）及びＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳＣｙｓ−ｌｏｗ（配列番号１２）から選択される、前述のＢ５のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。

Ｃ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする単離された核酸を提供する。

Ｄ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含むゲノム編集システムを提供する。

Ｅ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、細胞内において、関心のある標的配列を修飾する方法であって、細胞を、
関心のある標的配列と相補的なｇＲＮＡ；及び
Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含み、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、関心のある標的配列を修飾する、方法を提供する。

Ｅ１．細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆細胞（ＨＵＤＥＰ細胞）である、前述のＥの方法。

Ｅ２．ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である、前述のＥ１の方法。

Ｅ３．Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である、前述のＥ１の方法。

Ｅ４．Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、関心のある標的配列を修飾して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の編集を達成する、前述のＥの方法。

Ｅ５．関心のある第２の標的配列と相補的な第２のｇＲＮＡさらに含む、前述のＥの方法。

Ｅ６．第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをさらに含む、前述のＥの方法。

Ｅ７．関心のある標的配列は、ＨＢＧ１遺伝子配列の一部；及びＢＣＬ１１ａ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥの方法。

Ｅ８．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＥ７の方法。

Ｅ９．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述のＥ８の方法。

Ｅ１０．Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述のＥ７の方法。

Ｅ１１．Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述のＥ１０の方法。

Ｅ１２．関心のある標的配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部；ＢＩＤ遺伝子配列の一部；ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部；ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部；ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部；ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部；Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部；ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部；及びＴＲＢＣ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥの方法。

Ｅ１３．関心のある標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部；ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部；及びＴＲＢＣ遺伝子配列の一部からなる群から選択される、前述のＥ１２の方法。

Ｅ１４．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１３の方法。

Ｅ１５．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある、前述のＥ１３の方法。

Ｅ１６．ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１２の細胞。

Ｅ１７．ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＥ１２の細胞。

Ｆ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、対象を治療する方法であって、対象からの細胞を、
標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ；及び
Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含む方法を提供する。

Ｆ１．Ｃｐｆ１分子は、標的核酸における二本鎖切断を形成する、前述のＦの方法。

Ｆ２．Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種株ＢＶ３Ｌ６Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）及びラクノスピラ菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、前述のＦ又はＦ１の方法。

Ｆ３．対象は、異常ヘモグロビン症に罹患している、前述のＦ〜Ｆ２のいずれか１つの方法。

Ｆ４．異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、前述のＦ３の方法。

Ｆ５．細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆細胞（ＨＵＤＥＰ細胞）である、前述のＦ〜Ｆ４のいずれか１つの方法。

Ｆ６．Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である、前述のＦ５の方法。

Ｆ７．ＨＳＣ細胞は、ＣＤ３４^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞、ＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ４９ｆ^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻細胞、ＣＤ１０５^＋細胞、ＣＤ３１^＋若しくはＣＤ１３３^＋細胞又はＣＤ３４^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ１３３^＋細胞である、前述のＦ５の方法。

Ｆ８．接触は、エクスビボで実施される、前述のＦ〜Ｆ７のいずれか１つの方法。

Ｆ９．接触細胞は、対象の身体に戻される、前述のＦ〜Ｆ８のいずれか１つの方法。

Ｇ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
（ａ）Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、
（ｂ）標的核酸の標的配列に相補的なｇＲＮＡ；及び
（ｃ）標的核酸の１つ又は複数の修正から利益を得るであろう対象からの細胞
を含む反応液混合物を提供する。

Ｈ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
（ａ）Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれか１つの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸組成物、及び
（ｂ）標的核酸の標的配列又はｇＲＮＡの核酸組成物に相補的なｇＲＮＡ
を含むキットを提供する。

Ｉ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、前述のＤのゲノム編集システムを通じて導入された、標的核酸配列における修飾を含む細胞を提供する。

Ｉ１．修飾は、ＨＢＧ１遺伝子配列又はＢｃｌ１１ａ遺伝子配列に対するものである、前述のＩの細胞。

Ｉ２．修飾ＨＢＧ１遺伝子配列は、ＨＢＧ遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＩ１の細胞。

Ｉ３．修飾ＨＢＧ１遺伝子配列は、ＨＢＧ遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。

Ｉ４．修飾Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。

Ｉ５．修飾Ｂｃｌ１１ａ遺伝子配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述の請求項Ｉ１に記載の細胞。

Ｊ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価する方法であって、
（ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
（ｂ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
を含む方法を提供する。

Ｊ１．一致側標的核酸配列は、一致部位１（配列番号１３）、一致部位５（配列番号１４）、一致部位１１（配列番号１５）及び一致部位１８（配列番号１６）からなる群から選択される、前述のＪの方法。

Ｊ２．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる細胞型で活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。

Ｊ３．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる調合物中の活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。

Ｊ４．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる濃度における活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。

Ｊ５．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して製造された後に活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。

Ｊ６．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して細胞に送達された後に活性についてアッセイされる、前述のＪの方法。

Ｊ７．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、異なるアミノ酸配列を含む、前述のＪの方法。

Ｋ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、ＢＣ１１ａ及びＨＢＧ１からなる群から選択される、内因性遺伝子の遺伝子発現を下方制御できるＣＲＩＳＰＲシステムを含む細胞を提供する。

Ｋ１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＫの細胞。

Ｋ２．ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域である、前述のＫ１の細胞。

Ｋ３．ＢＣ１１ａ遺伝子配列の一部は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域のＧＡＴＡ１モチーフである、前述のＫ１の細胞。

Ｋ４．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＨＢＧ１遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＫの細胞。

Ｋ５．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ１遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域である、前述のＫ４の細胞。

Ｋ６．ＨＢＧ１遺伝子配列の一部は、ＨＢＧ１遺伝子の−１１０ｎｔプロモーター領域のＣＡＡＴボックスである、前述のＫ４の細胞。

Ｋ７．細胞は、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ１０５＋細胞、ＣＤ３１＋若しくはＣＤ１３３＋細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ１３３＋細胞である、前述のＫの細胞。

Ｌ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、少なくとも１つの内因性遺伝子の遺伝子発現を下方制御できるＣＲＩＳＰＲシステムを含む、細胞を提供する。

Ｌ１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬの細胞。

Ｌ２．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ１の細胞。

Ｌ３．Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード配列の５０１番目のヌクレオチドと最後のヌクレオチドとの間にある、前述のＬ１の細胞の方法。

Ｌ４．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ〜Ｌ３のいずれかの細胞。

Ｌ５．ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＡＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ４の細胞。

Ｌ６．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ〜Ｌ５のいずれかの細胞。

Ｌ７．ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部は、ＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ６の細胞。

Ｌ８．ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部に相補的なｇＲＮＡを含む、前述のＬ〜Ｌ７のいずれかの細胞。

Ｌ９．ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列の最初の５００ｂｐ内にある、前述のＬ８の細胞。

Ｌ１０．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ及びＣＩＩＴＡからなる群の遺伝子発現を下方制御できる、前述のＬの細胞。

Ｌ１１．ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＣＩＩＴＡからなる群の遺伝子発現を下方制御できる、前述のＬの細胞。

Ｌ１２．細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である、Ｌ〜Ｌ１１のいずれか１つの前述の細胞。

Ｍ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するためのアッセイであって、
（ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
（ｂ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
を含むアッセイを提供する。

Ｍ１．一致側標的核酸配列は、一致部位１（配列番号１３）、一致部位５（配列番号１４）、一致部位１１（配列番号１５）及び一致部位１８（配列番号１６）からなる群から選択される、前述のＭのアッセイ。

Ｍ２．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる細胞型で活性についてアッセイされる、前述のＭ１のアッセイ。

Ｍ３．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる調合物中の活性についてアッセイされる、前述のＭ２のアッセイ。

Ｍ４．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なる濃度における活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。

Ｍ５．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して製造された後に活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。

Ｍ６．試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ及び対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、
（ａ）同一アミノ酸配列を有し；
（ｂ）異なるプロセスを介して細胞に送達された後に活性についてアッセイされる、前述のＭのアッセイ。

Ｎ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、
第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び
Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含む多重ゲノム編集システムを提供する。

Ｎ１．第１の遺伝子及び第２の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮの多重ゲノム編集システム。

Ｎ２．第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述のＮの多重ゲノム編集システム。

Ｎ３．第１の遺伝子、第２の遺伝子及び第３の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮ２の多重ゲノム編集システム。

Ｎ４．第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述のＮ２の多重ゲノム編集システム。

Ｎ５．第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣからなる群から選択される、前述のＮ４の多重ゲノム編集システム。

Ｏ．特定の実施形態では、本明細書で開示された主題は、細胞内において複数の遺伝子を修飾する方法であって、細胞を、
第１の遺伝子の標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む第１の（ｇＲＮＡ）；
第２の遺伝子の標的配列に相補的な第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子；及び
Ａ〜Ａ８及びＢ〜Ｂ８のいずれかの前述のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は前述のＣの核酸によってコードされるＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
に接触させることを含み、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を修飾する、方法を提供する。

Ｏ１．第３の遺伝子の標的配列に相補的な第３の標的化ドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子及び第３の遺伝子を修飾する、前述のＯの方法。

Ｏ２．第４の遺伝子の標的配列に相補的な第４の標的化ドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子を修飾する、前述のＯ１の方法。

Ｏ３．第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子及び第４の遺伝子は、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＣＩＩＴＡ及びＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される、前述のＯ２の方法。

Ｏ４．細胞は、Ｔ細胞である、前述のＯの方法。

以下の実施例は、単なる例示であり、決して本発明の範囲又は内容を限定することを意図されない。

実施例１ − 一致部位を使用したベンチマーキングアッセイによって評価される、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９及びＡｓＣｐｆ１変異型による成人ヒトＣＤ３４＋細胞の効率的な編集
標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、例えば、「一致部位」標的核酸配列などの標的核酸配列に関して、対照ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ編集システムと、試験ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１編集システムの活性とを比較することによって評価され得る。

一致部位標的核酸配列は、Ｃｐｆ１と、例えばＣａｓ９などの第２のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとによって編集されるという要件の両方を組み込んでいる。例えば、ＴＴＴＶＡｓＣｐｆ１野生型プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）及びＮＧＧＳｐＣａｓ９野生型ＰＡＭを本例で用いた。上述したように、試験Ｃｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質と比較して１つ又は複数の修飾を含み得る。このような修飾の例としては、１つ又は複数のＮＬＳ配列を組み込むための前述の修飾、６−ヒスチジン精製配列を組み込むための前述の修飾及びＣｐｆ１タンパク質システインアミノ酸の改変並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本例で用いられた例示的な一致部位標的核酸配列としては、一致部位１（「ＭＳ１」；配列番号１３）、一致部位５（「ＭＳ５」；配列番号１４）、一致部位１１（「ＭＳ１１」；配列番号１５）及び一致部位１８（「ＭＳ１８」；配列番号１８）が挙げられる（図２）。

例えば、ＣＤ３４^＋ＨＳＣなどの特定の細胞型における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介と対比して評価するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集システム、すなわちＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、一致部位標的を含む標的核酸の少なくとも一部に相補的なｇＲＮＡとを含むシステムが、例えば、ＲＮＰとして又はシステムの構成要素をコードするベクターの使用を介して、関心のある細胞型の細胞に導入される。標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、本明細書で開示されるように検出される。検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整は、同一の一致部位標的及び同一の細胞型に対してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いた場合に検出された標的核酸配列の編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整と比較される。

この実施例では、成人ヒト動員末梢血ＣＤ３４^＋造血幹／前駆細胞において、野生型（ＷＴ）Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐ）Ｃａｓ９及びＡｓＣｐｆ１ヌクレアーゼの編集のベースラインレベルを比較した。これらのＣＤ３４^＋細胞は、病的表現型がヌクレアーゼ修飾遺伝子型によって修正され得る血液学的障害（例えば、β異常ヘモグロビン症）の治療のための臨床標的である。ＣＤ３４^＋細胞におけるＳｐＣａｓ９及びＡｓＣｐｆ１によるベースライン編集を判定するために、細胞を解凍してサイトカインで予備刺激し、次にヒトゲノム中の一致部位（ＭＳ）を標的とするガイドＲＮＡに複合体化されたＡｓＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９タンパク質で電気穿孔した（図２）。「一致部位」という用語は、ヌクレアーゼによって標的化される部位が、異なるＰＡＭ配列（それぞれＮＧＧ及びＴＴＴＶ）を利用しているにもかかわらず、ＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９の両方について同一であるという事実を指す。ＣＤ３４^＋細胞における効率的な編集に必要なリボ核酸（ＲＮＰ）の最小有効濃度を判定するために、ＣＤ３４^＋細胞において、いくつかの一致部位についてＲＮＰ用量反応を実施したが、そのうちの２つが図３Ａに描写される。標的部位における編集の百分率を判定するために、ＡｓＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９電気穿孔細胞からゲノム（ｇ）ＤＮＡを抽出し、標的部位でアンプリコンＰＣＲを実施し、ＤＮＡ配列決定分析がそれに続いた。

図３Ａは、ＡｓＣｐｆ１が同一標的部位の編集においてＳｐＣａｓ９よりも実質的に効率的である１つの事例（ＭＳ５）及びＳｐＣａｓ９が同一標的部位の編集においてＡｓＣｐｆ１と比較してより効率的である１つの事例（ＭＳ１）の結果を図示する。ＭＳ５を標的とするために使用したｇＲＮＡは、ＭＳ５ガイドＲＮＡであった。この例では、約４μＭのＣｐｆ１ＲＮＰは、一致部位５において効率的な（約６０％）編集をサポートし、この編集は、その部位を標的とする同一用量のＳｐＣａｓ９ＲＮＰによって達成された編集と比較してより高かった（図３Ａ）。

図３Ｂは、電気穿孔後に複数の一致部位を４．４μＭＲＮＰで比較した結果を示す。これらの結果は、部位において編集が生じたことを確立し、その中では、ａ）ＳｐＣａｓ９は、ＡｓＣｐｆ１よりも効率的であり、ｂ）ＡｓＣｐｆ１は、ＳｐＣａｓ９よりも効率的であり、ｃ）編集のレベルは、ＳｐＣａｓ９とＡｓＣｐｆ１との間で同様であった。

ＣＤ３４^＋細胞における編集のための最適なタンパク質構成を判定するために、例えばＡｓＣｐｆ１タンパク質のＣ末端又はＮ末端などの異なる位置に位置する、異なるタイプのＮＬＳ配列を含有するＡｓＣｐｆ１タンパク質を合成した。本明細書に記載されるように、ｎＮＬＳは、ヌクレオプラスミンＮＬＳを表し、ｓＮＬＳは、ＳＶ４０ＮＬＳを指す（図４）。この実施例では、次のＮＬＳ構成を分析した：Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｎＮＬＳ（配列番号３）、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号７）、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１（配列番号６）、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号９）、Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ（配列番号５）及びＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ（配列番号４）。異なるタンパク質変異型をＭＳ５ｇＲＮＡと複合体化させ、次にＣＤ３４^＋細胞、Ｔ細胞及びＨＵＤＥＰ内に電気穿孔した（４．４μＭＲＮＰ）。図４では、各細胞型の最大編集を提示する変異型に正規化された％編集として結果が描写される。総合して、これらのデータは、異なる種のヌクレアーゼがＣＤ３４^＋細胞（他の細胞の中で特に）の同一標的部位において様々な活性を有していること及び効率的な編集が（他の細胞の中で特に）ＣＤ３４^＋細胞においてＡｓＣｐｆ１によって達成され得ることを示す。特に、図４に示されるように、ＮＬＳ構成Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１、Ｈｉｓ−ｓＮＬＳ−ＡｓＣｐｆ１及びＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳを有するタンパク質変異型は、全ての細胞型にわたりＭＳ５における高い編集を示した。

実施例２ − 電気穿孔パルスコードスクリーニング
本開示のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによるより高効率の編集可能にする電気穿孔パルスコードを同定するために、可能なパルスコードのスクリーニングを実施した。図１８は、ＨＵＤＥＰにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５ガイドＲＮＡを使用して２．２μＭＡｓＣｐｆ１ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液ＳＥ、ＳＦ及びＳＧは、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＵＤＥＰで試験した。溶液ＳＥでのパルスコードＣＡ−１３７及びＣＡ−１３８は、最適な編集を実証した。

図１９は、ＨＳＣにおけるＡｓＣｐｆ１のヌクレオフェクションスクリーニングを示す。用量は、２：１のガイド：タンパク質で一致部位５（ＭＳ５）ガイドＲＮＡを使用して２．２μＭＡｓＣｐｆ１ＲＮＰであった。ＡｓＣｐｆ１ＷＴタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。Ｌｏｎｚａ溶液Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５は、異なるパルスプログラムを使用して、１条件当たり５万個のＨＳＣで試験した。溶液Ｐ２でのパルスコードＣＡ−１３７（本明細書では「条件２」とも称される）及びＣＡ−１３８は、最適な編集を実証し、ＦＦ−１００及びＦＦ−１０４も同様であった。

図２０は、上記のスクリーニングで同定されたパルスコードの効率の向上を確認する。具体的には、図２０は、ＬｏｎｚａＡｍａｘａにおける特定のパルスコードの使用が、様々なｇＲＮＡ及びＰＡＭ変異型を使用したＨＳＣ中のＢＣＬ１１ａ遺伝子座における編集を増加させることを示す。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たり５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。

実施例３ − 胎児型ヘモグロビンの産生の増加に関連するヒトゲノム中の標的部位におけるＣＤ３４^＋細胞のＡｓＣｐｆ１指向編集
胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現は、転写リプレッサー、ＢＣＬ１１Ａの赤血球細胞特異的発現の標的化された破壊を通じて誘導される（Ｃａｎｖｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２７（１２）：１９２−１９７）。遺伝子編集ストラテジーを通じてＨｂＦ発現を増加させる１つの潜在的なストラテジーは、Ｃｐｆ１が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にあるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサーのＧＡＴＡ１結合モチーフを破壊するように誘導することである。この例では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン２の＋５８ＤＨＳ領域にある標的部位のＡｓＣｐｆ１媒介編集を評価した。

最初に、異なるＰＡＭを有するＡｓＣｐｆ１変異型ガイドＲＮＡ（図１）をＨＵＤＥＰ２細胞でスクリーニングし、次に最も効率的なガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ変異型をｍＰＢＣＤ３４^＋細胞内で試験した（図１７）。図１７で試験されたガイドＲＮＡの配列は、図７に提供される。特に、図１７は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける１つのＷＴＦｎＣｐｆ１標的と共に、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＢＣＬ１１ａエンハンサー領域のスクリーニングを示す。ＨＵＤＥＰスクリーニングは、ＣＡ−１３７パルスプログラム及びＬｏｎｚａ溶液ＳＥを用いて実施した。ＨＳＣスクリーニングは、パルスコードＥＯ−１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実施した。ＢＣＬ１１ａ（図１７ではＫＯＢＥＨと命名される）の対照ガイドも示される。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たりおよそ５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬ）の内毒素レベルを有した。

ＨｂＦ発現を増加させる別の潜在的なストラテジーは、例えば、ＨＢＧ１又はＨＢＧ２などのＨＢＧ遺伝子の標的化された破壊を介したものである。図１６は、ＨＵＤＥＰ及びＨＳＣにおける、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲＰＡＭ変異型によるＨＢＧ１プロモーター領域の標的化を示す。図１６で試験されたガイドＲＮＡの配列は、図６に提供される。モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ）ＡＡＸ１１＿００２０５（Ｍｂ３Ｃｐｆ１）も試験したが、それは、図６でＭｂＣｐｆ１と称される。ＨＵＤＥＰ実験は、ＣＡ−１３７パルスプログラムとＬｏｎｚａ溶液ＳＥとを用いて実施した。ＨＳＣスクリーニングは、パルスコードＥＯ−１００とＬｏｎｚａ溶液Ｐ３とを用いて実施した。用量は、全てのガイドに対して、２：１のガイド：タンパク質比率で４．４μＭＲＮＰであった。１条件当たりおよそ５万個のＨＳＣを処理した。ＡｓＣｐｆ１ＷＴ及びＲＲタンパク質は、＜５ＥＵ／ｍＬの内毒素レベルを有した。図３４は、ＨＢＧ１−１ｇＲＮＡを使用したＨＢＧ１遺伝子座の編集を示す。ＡｓＣｐｆ１は、細胞内で８μＭの最終ＲＮＰ用量のために、１：４のタンパク質：ガイド比でｇＲＮＡと複合体化させた。ＲＮＰは、複合体形成のために室温で３０分間インキュベートした。図３４に示されるように、ＨＢＧ１−１ｇＲＮＡの使用は、ＨＳＣに６０％を超える編集をもたらした。図１６及び図３４で示される編集効率間の差異は、例えば、電気穿孔パルスコードなどのその下で実験が実施された異なる条件を反映する。

総合して、これらのデータは、臨床的に関連する遺伝子座におけるＣＤ３４^＋細胞のＡｓＣｐｆ１変異型による効率的な編集を示す（すなわち既知のＨＰＦＨ標的部位）。

実施例４ − システイン修飾Ｃｐｆ１タンパク質及びＲＮＰの生成
ジスルフィド結合形成は、タンパク質凝集を促進することが知られていることから、改変されて、ジスルフィド結合形成の可能性を減少させ得るシステインを同定する努力の一環として、Ｃｐｆ１結晶構造及び既知のＣｐｆ１一次アミノ酸配列を分析した（図１３）。Ｃｐｆ１に存在する８つのシステインのいくつかは、溶媒に曝露されているようであった一方、他のものは、埋没され、他の分子間システインから隔絶されているようであり、したがってジスルフィド結合形成のリスクは、高くなかった（図１３）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８Ｃ５マレイミド（パーツ番号Ａ１０２５４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるシステイン標識アッセイを使用して、４８時間のインキュベーション後における、野生型及び残基Ｃ３７９がセリンに変異していない変異型と比較した、ＡｓＣｐｆ１Ｃ３３４ＳＣ３７９ＳＣ６７４Ｓ中のシステイン残基の有意に低下したアクセス性を実証した（図１４）。「ＡｓＣｐｆ１システインなし」サンプルは、マレイミド試薬による標識を示さない。Ｃ３７９で変異していない変異型であるＡｓＣｐｆ１Ｃ３３４ＳＣ６７４Ｓサンプルは、野生型とほぼ同等の標識を示し、結晶構造内で部分的に曝露しているようであるＣ３７９がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８Ｃ５マレイミド試薬に容易にアクセス可能であることが示唆された。全ての標識反応は、製造業者の推奨事項に従って実施した。簡潔に述べると、これは、Ｈ１５０緩衝液及び１０％ＤＭＳＯ中で最低２４時間にわたり４°Ｃでインキュベートされる、１０μＭのタンパク質を有するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８Ｃ５マレイミド染料の２０倍のモル過剰量を必要とする。

上述した野生型及び３つの変異型の編集能力は、図１５で比較された。Ｃｙｓ−ｌｅｓｓＡｓＣｐｆ１では編集の減少が観察される一方、ＡｓＣｐｆ１−Ｃ３３４Ｓ−Ｃ６７４Ｓ及びＡｓＣｐｆ１−Ｃ３３４Ｓ−Ｃ３７９Ｓ−Ｃ６７４Ｓ変異型では、ＡｓＣｐｆ１野生型と同様の編集レベルが達成された（図１５）。

実施例５ − 初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１による高効率編集
序論
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）システムは、エクスビボゲノム編集治療において、他のヌクレアーゼに比べて、容易に合成され得るより小さい単一ｃｒＲＮＡ、野生型タンパク質及び操作されたＰＡＭ変異型によってＴ及びＣに富むＰＡＭを標的とする能力及び異なる修復結果をもたらし得る５’ねじれ型カットをはじめとする、いくつかの潜在的な利点を提供し得る。

エクスビボ送達のために、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用は、多くの場合、プラスミドＤＮＡなどの核酸ベースの送達よりも好ましくあり得る。本明細書では、いくつかのＣｐｆ１オルソログをＲＮＰとして生成し、複数の細胞型においてＳｐＣａｓ９により、標的化可能な複数のゲノム遺伝子座で堅固に編集した。ＡｓＣｐｆ１及びその遺伝子操作されたＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型による、Ｔ細胞における９０％を超える編集が実証された。

タンパク質レベル及びガイドレベルの両方におけるＣｐｆ１ＲＮＰ複合体の活性の改善が実証され、それは、細胞型全体にわたり効性を改善した。集合的に、知見は、ゲノム編集治療のための、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのＲＮＰ送達の有望性を強調した。

結果
いくつかの試験Ｃｐｆ１オルソログからＡｓＣｐｆ１を選択した。初代Ｔ細胞におけるＡｓＣｐｆ１スクリーニングは、いくつかの適切な標的部位を産生した。図２１及び図２５は、ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座における、ＡｓＣｐｆ１及びそのＲＲ及びＲＶＲＰＡＭ変異型によるＴ細胞治療標的のスクリーニングを示す。図２１で試験されたガイドＲＮＡの配列は、表４に提供される。各標的について、パルスコードＣＡ−１３７及び緩衝液Ｐ２を用いてＡｍａｘａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２μＬの５０μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ＴＲＡＣガイド（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。予備スクリーニングで、約３０％のｇＲＮＡが５０％を超える編集を示し、これは、一般に観察されたＳｐＣａｓ９ヒット率と同レベルであり、Ｃｐｆ１が、重要な治療遺伝子座又は複数の治療遺伝子座において遺患者のＴ細胞を遺伝子編集するために潜在的に使用され得ることが示された。図２１、図２５及び図２８に概説された結果は、４つの同種異系Ｔ細胞標的（ＴＲＢＣ、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ）上のＴ細胞における、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ、ＲＲ及びＲＶＲの高い編集効率を示し、これは、図２６に要約される。特に、３７〜４３％のガイドが＞５０％の編集を与え、ヒットに分類される。

Ｔ細胞における効率的な編集は、ＮＬＳの構成及び電気穿孔条件を変更することで達成した。ＣＡＲ及びＴＣＲ操作されたＴ細胞療法は、免疫腫瘍学の展望に変革的付加価値をもたらす可能性を有する。図３２に示されるように、特定の電気穿孔条件は、Ｔ細胞における最大編集を改善する。図３２でＲＲ−２５と標識されるガイドＲＮＡは、本明細書において、「Ｂ２Ｍ−２」、「Ｂ２Ｍ−２９」及び「Ｂ２Ｍ２９−ＲＲ」とも本明細書で称される。図３２でＷＴ−１１と標識されるガイドＲＮＡは、本明細書において、「Ｂ２Ｍ−１」、「Ｂ２Ｍ−１２」及び「Ｂ２Ｍ１２−ＷＴ」とも本明細書で称される。さらに、電気穿孔パルスコードの変更も、図２２に示されるように、複数の治療標的遺伝子座におけるＴ細胞の最大編集を有意に改善した。標的番号２は、ＴＲＢＣであり、標的番号３は、Ｂ２Ｍであった。パルスコード番号１は、ＤＳ−１３０であり（本明細書では「条件１」とも称される）、パルスコード番号２は、ＣＡ−１３７であった（本明細書では「条件２」とも称される）。各標的について、パルスコードＤＳ−１３０と、緩衝液Ｐ２又はパルスコードＣＡ−１３７と、緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、各ＲＮＰについて、２μＬの５０μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ＲＮＰと、ＴＲＢＣ又はＢ２Ｍを標的とするガイド（２：１のガイド：タンパク質の比率）の４．４μＭの最終濃度で５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。図３３に示されるように、ＮＬＳの構成を変更することは、Ｔ細胞における効力も改善した。ＡｓｐＣｐｆ１ＮＬＳｖ２（本明細書では「Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ−ｓＮＬＳ」とも称される）は、ＡｓｐＣｐｆ１ＮＬＳｖ１（本明細書では「Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ｓＮＬＳ」とも称される」）より優れた編集効率を示した。

効率的な単一及び複数のノックアウト編集は、Ｃｐｆ１ＲＮＰを用いて、疾患関連遺伝子座の初代Ｔ細胞で達成された。図２３Ａは、エクスビボ細胞療法のＲＮＰワークフローを示す。ＡｓＣｐｆ１又は操作されたＰＡＭ変異型を使用した、治療に関連する複数のＴ細胞座（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ）における効率的な単一ノックアウトを図２３Ｂに示す。３つのＴ細胞標的（ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ及びＢ２Ｍ）における単一ノックアウトで比較を行った。各標的について、パルスコードＤＳ−１３０及び緩衝液Ｐ２を用いてＡｍａｘａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２μＬの５０μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ＲＮＰ（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。ＴＲＡＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ＲＲ酵素を有するＴＲＡＣ−１４０であった（本明細書では「ＴＲＡＣ−２」及び「ＴＲＡＣ−１４０ＲＲ」とも称される）。ＴＲＢＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ酵素を有するＴＲＢＣ−４であった。Ｂ２Ｍガイドは、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ酵素を有するＢ２Ｍ−１２であった。図２９は、ＳｐＣａｓ９と比較した、Ｃｐｆ１ＲＮＰを使用した複数の治療的に関連するＴ細胞座における単一ノックアウトの効率を示す。

Ｃｐｆ１ＲＮＰで処理されたＴ細胞における２つの治療標的（ＴＣＲ及びＢ２Ｍ）の高効率な二重ノックアウトは、図２４に示すようにフローサイトメトリーによって測定した。図２４は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍが効果的にノックダウンされたＴ細胞の分布を示す。各標的について、パルスコードＤＳ−１３０と緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、各ＲＮＰについて、１μＬの１００μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ＲＮＰと、Ｂ２Ｍを標的とするガイドと並んで、１μＬの１００μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ＲＮＰと、ＴＲＡＣを標的とするガイド（２：１のタンパク質：ガイド比率）の最終濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質％ノックアウトは、４日後にフローサイトメトリーによって測定した。ＴＲＡＣガイドは、ＡｓＣｐｆ１ＲＲ酵素を有するＴＲＡＣ−１４０であった。Ｂ２Ｍガイドは、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ酵素を有するＢ２Ｍ−１２であった。

図２７は、ヒト初代Ｔ細胞における、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９による２つのＴ細胞標的、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣの二重ノックアウトを図示する。各標的について、パルスコードＣＡ−１３７と緩衝液Ｐ２とを用いてＡｍａｘａｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＴＲＡＣ又はＢ２ＭＣａｓ９又はＣｐｆ１ガイドのいずれかと複合体化した（４：１のタンパク質：ガイド比率）２μＬの５０μＭＣａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質の最終ＲＮＰ濃度４．４μＭで５０万個のＴ細胞を電気穿孔した。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。図２７に示されるように、ほとんどのＴ細胞は、Ｂ２ＭとＴＲＡＣとの両方をノックダウンするように問題なく編集された。また、これらの結果は、それぞれのＴ細胞標的に対して異なるヌクレアーゼを使用し得ることを示す。使用したＣｐｆ１ＴＲＡＣガイドは、ＴＲＡＣ−１４０であり、Ｃｐｆ１Ｂ２Ｍガイドは、Ｂ２Ｍ−１２であった。

図３０は、ヒト初代Ｔ細胞におけるＣｐｆ１ＲＮＰによる３つのＴ細胞標的（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ）の三重ノックアウトを図示する。タンパク質のノックアウト百分率は、フローサイトメトリーによって測定した。図３０に示されるように、全ての３つのＴ細胞標的で効率的な編集が観察された。この実験は、ＴＲＡＣガイドＴＲＡＣ−１４０に複合体化したＡｓＣｐｆ１ＲＲ（ＰＲＯ２８２）を有する２．９μＭのＲＮＰの、Ｂ２ＭガイドＢ２Ｍ−１２に複合体化したＡｓＣｐｆ１ＷＴ（ＰＲＯ２８１）を有する２．９μＭのＲＮＰ、ＣＩＩＴＡガイドＣＩＩＴＡ−３４に複合体化したＡｓＣｐｆ１ＷＴ（ＰＲＯ２８１）を有する２．９μＭのＲＮＰを合計ＲＮＰ濃度８．７μＭで一緒に送達して実施した。各ＲＮＰについて、ガイド：タンパク質比率は、２：１であった。ＲＮＰは、Ｌｏｎｚａシステム上でパルスコードＣＡ−１３７と緩衝液Ｐ２を使用して５０万個のＴ細胞に送達した。編集は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍではフローサイトメトリー及びＮＧＳにより、ＣＩＩＴＡではＮＧＳのみで評価した。同様の結果は、ＴＲＡＣガイドＴＲＡＣ−１３、Ｂ２ＭガイドＢ２Ｍ−２９及びＣＩＩＴＡガイドＣＩＩＴＡ−４５、ＣＩＩＴＡ−４１及びＣＩＩＴＡ−１０を同一条件下で使用しても得られた。

図３１Ａは、潜在的なオフターゲットを同定し検証するために使用したワークフローを図示する。図３１Ｂは、３つのＴ細胞標的、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍに対するトップＣｐｆ１候補ガイドの特異性を要約する。図３１Ａ及び図３１Ｂに示されるように、コンピュータを用いたＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ及びＧＵＩＤＥ−ｓｅｑオフターゲットアッセイからの潜在的なオフターゲット部位の標的化アンプリコン配列決定により、検出可能なオフターゲットは、見いだされず、試験した全てのガイドＲＮＡは、高い編集効率をもたらした。

図４０は、Ｔ細胞標的ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡについて、ＷＴＡｓＣｐｆ１及びＲＲＡｓＣｐｆ１変異型のＴ細胞におけるトップ同種異系ガイドＲＮＡの用量反応を示す。最高用量のＲＮＰで処理された細胞からのゲノムＤＮＡは、標的化アンプリコン配列決定に送って、ガイドのそれぞれの標的部位のインデルを評価した。この実験は、Ｌｏｎｚａ電気穿孔装置及びパルスコードＣＡ−１３７を使用してＴ細胞において実施した。

実施例６ − ＣＩＩＴＡのＣｐｆ１媒介性ノックアウトの表現型解析
Ｔ細胞におけるＣＩＩＴＡのノックアウトが主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）受容体の発現に及ぼす影響を判定するために、ＣＩＩＴＡ遺伝子のエクソンを標的とするように操作されたＲＮＰで細胞を形質移入した。この遺伝子は、ＭＨＣＩＩ受容体の表面発現に関与している。エクソン中のインデルは、ＣＩＩＴＡを不活性化するトランケーションをもたらし、Ｔ細胞表面上のＭＨＣＩＩ（ＨＬＡＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）受容体の発現を妨げる。

ＡｓＣｐｆ１変異型とガイドＲＮＡとを１：２の比率で組み合わせることにより、ＡｓＣｐｆ１ＲＮＰを複合体化した。使用したｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡ−３４（エクソン１を標的とする）、ＣＩＩＴＡ−４１（エクソン２を標的とする）、ＣＩＩＴＡ−４５（エクソン３を標的とする）及びＣＩＩＴＡ−１０（エクソン６を標的とする）であった（図３７Ｂ）。ｇＲＮＡＣＩＩＴＡ−４５は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ−４５ＲＲ」及び「ＣＩＩＴＡ−２」とも称される。ｇＲＮＡＣＩＩＴＡ−４１は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ−４１ＲＲ」とも称される。ｇＲＮＡＣＩＩＴＡ−３４は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ−３４ＷＴ」とも称される。ｇＲＮＡＣＩＩＴＡ−１０は、本明細書では「ＣＩＩＴＡ−１」及び「ＣＩＩＴＡ−１０ＷＴ」とも称される。次に、サンプルを室温で３０分間インキュベートした後、チューブを液体窒素に浸し、ヌクレオフェクションまで−８０℃で保存した。３μＬのＲＮＰを９６ウェルＬｏｎｚａヌクレオフェクションプレートの各ウェルに移した。１条件当たり、５０万個のＴ細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを１サンプル当たり２０μＬのＬｏｎｚａＰ２ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁し、次に２０μＬの再懸濁Ｔ細胞をＬｏｎｚａ９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。パルスコードＣＡ−１３７を用いて、細胞を速やかにヌクレオフェクションした。次に、８０μＬの予熱した（３７℃）増殖培地を各ウェルに混合した。１００μＬの増殖培地を有する予熱した９６ウェルの非ＴＣ処理プレートに全量（３μＬのＲＮＰ、Ｐ２バッファー中の２０μＬのＴ細胞及び８０μＬの培地）を移した。細胞は、分析まで５％ＣＯ_２で３７℃においてインキュベートした。ヌクレオフェクション後４日目に細胞のサブセットを溶解し、ゲノムＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のために提出した。残りの細胞をヌクレオフェクションの６日後に増殖させ、刺激培地（高ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５）内でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して活性化し、ＭＨＣＩＩの表面発現を刺激した。７日目に細胞をビーズから洗い落とし、ＭＨＣＩＩ（ＨＬＡＤＲ、ＤＰ、ＤＱ）受容体を標的とするモノクローナル抗体で染色して、ＣＩＩＴＡのノックアウトを表現型で評価した。この結合は、フローサイトメトリーを介して定量化した。

図３６に提供される画像は、フローサイトメーターによるｍＡｂ（細胞表面）上のＦＩＴＣ−Ａフルオロフォアの検出を描写する。蛍光強度は、細胞表面上のＭＨＣＩＩ受容体へのｍＡｂ結合の有無に直接相関する。高い蛍光がＭＨＣＩＩ受容体の表面発現が高いことを示す一方、シグナルの不在は、これらの受容体の成功裏のノックアウトを示す。Ｘ軸は、対数目盛上の蛍光強度の増加（左から右）を示す。Ｙ軸は、事象（細胞）の発生率を直線的に表す。１０^３の閾値は、ノックアウト集団と未編集団を離てる点として判定された。１０^３の左側の細胞は、ノックアウト細胞として分類され、この閾値の右側の細胞は、未編集と見なされる。図３６に示されるように、Ｃｐｆ１ガイドＣＩＩＴＡ−４５は、ＭＨＣＩＩ陽性細胞の明らかな減少を示し、これは、未処理の細胞では見られない。Ｔ細胞は、パルスコードＣＡ−１３７でＬｏｎｚａシステムを使用して、ＣＩＩＴＡ−４５と複合体化したＡｓＣｐｆ１ＲＲで処理した。さらに、ガイドは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座で高い編集効率を有した（図３７Ａ）。

ガイドＣＩＩＴＡ−４１、ＣＩＩＴＡ−１０及びＣＩＩＴＡ−３４は、ＣＩＨＣ−４５と同様のＭＨＣＩＩの減少を示した（図３８）。このデータは、これら４つのガイドのそれぞれがＣＩＩＴＡを効率的に編集するだけでなく、望ましい表現型の効果も示すことを検証した。ＣＩＩＴＡを高効率で編集することが知られているＳｐＣａｓ９ガイドは、陽性対照として示される。全てのＣｐｆ１又はＳｐＣａｓ９ＣＩＩＴＡガイドは、パルスコードＣＡ−１３７でＬｏｎｚａシステムを使用して、Ｔ細胞で４μＭのＲＮＰ用量で試験した。最高用量のＲＮＰで処理された細胞からのゲノムＤＮＡは、標的化アンプリコン配列決定に送って、オフターゲット部位のインデルを評価した。ＣＩＩＴＡ−４５及びＣＩＩＴＡ−１０の予測オフターゲット部位における検出の閾値を超えるインデル形成が観察されなかった一方、ＣＩＩＴＡ−３４は、１つのオフターゲットを有した（図３９）。

実施例７ − 編集効率に関するプロトスペーサーの長さ
ガイドＲＮＡの標準プロトスペーサーは、２０ヌクレオチド長であり、この配列は、標的ＤＮＡ配列に相補的である。標的配列に相補的なヌクレオチドの数を増減することにより、ガイドＲＮＡのその標的ＤＮＡへの結合エネルギーを変化させ得、形成されたインデルの百分率を変化させ得る。長さを１８及び１９に調節することで、ガイドＢ２Ｍ−１２、Ｂ２Ｍ−２９、ＴＲＡＣ−１３（本明細書では「ＴＲＡＣ−１３ＷＴ」及び「ＴＲＡＣ−１」とも称される）、ＣＩＩＴＡ−１０及びＣＩＩＴＡ−４５のインデル形成が減少する（図４１、図４２及び図４３）。さらに、図４１、図４２及び図４３に示されるように、長さを２０から２１、２２又は２３ヌクレオチドに増やすことは、ＴＲＡＣ−１４０などのいくつかのガイドに対する最小限の影響を有し、ＴＲＡＣ−１３、Ｂ２Ｍ−１２、Ｂ２Ｍ−２９、ＣＩＩＴＡ−１０及びＣＩＩＴＡ−４５などの他のほとんどものの効力を向上させる。Ｌｏｎｚａ電気穿孔装置及びパルスコードＣＡ−１３７を使用して、ＡｓＣｐｆ１ＷＴ又はＡｓＣｐｆ１ＲＲのいずれかにより、Ｔ細胞における用量反応の実験を実施した。

実施例８ − ＴＲＡＣ遺伝子座における標的化組み込み
図４５に示されるように、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座を標的とするｇＲＮＡのために、例示的なＤＮＡドナー鋳型を設計した。各ドナーは、同一カーゴ（ｈＰＧＫ−ＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ配列）を含有したが、５’及び３’オーバーハング領域をはじめとする異なる相同性アーム配列を有した（表１４）。各ドナーの相同性アーム長及びアーム配列は、それぞれ表Ｙ及びＺに示される。ドナー１は、両方のドナーの長さを同様に保つためのスタッファー配列（表１６）を有する。適切なｇＲＮＡ及び関連するＡＡＶドナー鋳型を有するＡｓＣｐｆ１ＲＲリボ核タンパク質を用いて、２つのドナー濃度で初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて標的化組み込み実験を実施した。実験後、細胞を７日目まで増殖させ、フローサイトメトリーを行って、ＧＦＰ発現による標的化組み込み率を調べた。

使用したｇＲＮＡは、ＴＲＡＣ−１４０：ＧＵＧＡＣＡＡＧＵＣＵＧＵＣＵＧＣＣＵＡ（ＲＮＡ配列）；ＧＴＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＡ（ＤＮＡ配列）である。

より高いＡＡＶドナー濃度を使用した、ＴＲＡＣ遺伝子座における標的化組み込み効率は、表１７に示される。

表１７に示されるように、長い相同性アーム（５００ｂｐ）を含有するドナー鋳型は、より短い相同性アームを含有するドナーよりもわずかに高いレベルの標的化組み込みを有した。

実施例９：ＨＢＧプロモーター領域を標的とするＣｐｆ１ｇＲＮＡのスクリーニング
単一ＲＮＰの構成要素として又は「ブースター要素」と組み合わせて、ＣＤ３４＋細胞におけるＨＢＧプロモーター領域の編集を増加させ、修飾細胞の赤血球子孫における胎児型グロビン発現を誘導するために使用し得る他のＡｓＣｐｆ１ｇＲＮＡを同定するために、ＨＢＧプロモーターのいくつかのドメインを標的とするＨｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ＮＬＳ−ＮＬＳ（「ＡｓＣｐｆ１」）；ＡｓＣｐｆ１Ｓ５４２Ｒ／Ｋ６０７Ｒ（「ＡｓＣｐｆ１ＲＲ」）；又はＡｓＣｐｆ１Ｓ５４２Ｒ／Ｋ５４８Ｖ／Ｎ５５２Ｒ（「ＡｓＣｐｆ１ＲＶＲ」）ｇＲＮＡ配列（表１８）を設計した（表１９及び図４６に列挙される）。ＡｓＣｐｆ１ＲＲ及びＡｓＣｐｆ１ＲＶＲは、それぞれＴＹＣＶ／ＡＣＣＣ／ＣＣＣＣ及びＴＡＴＶ／ＲＡＴＲＰＡＭを認識する操作されたＡｓＣｐｆ１変異型である（Ｇａｏ２０１７）。

Ａｍａｘａ電気穿孔装置（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＲＮＰ（５μＭ）含有ＡｓＣｐｆ１タンパク質、ＡｓＣｐｆ１ＲＲタンパク質又は表１９の単一ｇＲＮＡと複合体化したＡｓＣｐｆ１ＲＶＲ（使用した特定のＣｐｆ１分子についてはｇＲＮＡＩＤ名称を参照されたい；図４６は、ｇＲＮＡの登録簿識別番号を提供する）を動員された末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞に送達した。７２時間後、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、次にＰＣＲ増幅された標的部位のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定（ＮＧＳ）により、挿入／欠失のレベルを分析した。各ｇＲＮＡの編集の百分率（インデル＝欠失及び挿入）が上記の表１９に示される。特定の実施形態では、表１９（及び図４６）に記載されるｇＲＮＡの１つ又は複数を含むＣｐｆ１ＲＮＰを使用して、表１８に列挙される領域を標的とし、ＨｂＦ発現を誘導し得る。

ＲＮＰ複合体を生成するために、Ｃｐｆ１ｇＲＮＡを１ｘＨ１５０＋マグネシウム（１０ｎｍｏｌｅｓに対して２８．４μｌ）中で３５２μＭに希釈し、ＡＢ１４００ＰＣＲプレートに移し、スローアニールプロトコル（９０℃〜２５℃で２％ランプとそれに続く４℃）で稼働するＰＣＲ装置に入れた。ＡＢ１４００ＬＰＣＲプレートに５μｌの３５２ｕＭアニールガイドを添加し、Ｃｐｆ１を１ｘＨＧ３００で１７６μＭに希釈し、５μｌの３５２μＭアニールガイドに５μｌの１７６μＭＣｐｆ１を添加して、１０μｌの８８μＭＲＮＰを得た。

ＬｏｎｚａヌクレオフェクションによってＲＮＰを成人体ＨＳＣに導入するために、必要な増殖因を有する１３０μｌの完全ＨＳＣ培地をＣｅｌｌＳｔａｒプレート１３０μｌに添加し、必要になるまで３７°Ｃのインキュベーターに入れた。成人ＨＳＣをＣｏｕｎｔｅｓｓ上で係数し、５０Ｋ細胞／ウェル：２．５０ｅ６細胞／ｍｌ（２プレートのバイオレップスでは１０．５ｅ６細胞）の処方に基づいて、２つのバイオレップス（２プレート）をカバーするのに十分な細胞を１５ｍｌ又は５０ｍｌの円錐管にピペットで移した。次に、１本の管（２プレートバイオレップス相当）をＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機内において１０００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。培地を除去し、細胞をＰ２溶液（全プレートでは４．２ｍｌ）に再懸濁した。大容量分注スチップを備えたＭａｎｔｉｓを使用して、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートの１ウェル当たり２０μｌの細胞溶液を分注した。Ｐ５０チップを備えたＢｉｏｍｅｋを使用して、細胞を含有するＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅプレートに２μｌのＲＮＰを移し、ピペットで上下させることによって混合した。次に、プレートをＡｍａｘａシャトルに入れて、ＣＡ−１３７／溶液Ｐ２のプログラムＣｐｆ１を実行した。Ｐ５０チップを備えたＢｉｏｍｅｋを使用して、細胞を培地と共にＮｕｃｌｅｃｏｃｕｖｅｔｔｅプレートから余熱したＣｅｌｌＳｔａｒプレートに移し、３７℃で７２時間インキュベートした。製造業者の使用説明に従ってＤＮＡｄｖａｎｃｅキットを使用して、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出した。ｈｇ３８参照ゲノムに対する挿入／欠失は、標的部位のＮＧＳ分析を使用して定量化した。

参照による援用
全本明細書で言及される全ての文献、特許及び特許出願は、あたかも個々の出版物、特許又は特許出願が、具体的に且つ個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。

均等物
当業者は、日常的実験のみを用いて、本明細書に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか又は見極めることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims

プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含むＲＮＰ複合体の送達によって生成される、前記ＨＢＧ遺伝子配列又は前記ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む単離された細胞。
ＨＢＧ遺伝子のシス調節領域の破壊を含む１つ又は複数の細胞を有するＣＤ３４＋細胞又は造血幹細胞（ＨＳＣ）集団であって、前記破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、前記ＨＢＧ遺伝子の前記シス調節領域を標的とするｇＲＮＡとを含むＲＮＰ複合体を使用して生成される、ＣＤ３４＋細胞又は造血幹細胞（ＨＳＣ）集団。
前記シス調節領域は、ＨＢＧ遺伝子プロモーターのＣＡＡＴボックスを含む、請求項２に記載の細胞集団。
異常ヘモグロビン症の症状の治療又は緩和を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項２又は３に記載の細胞集団を前記対象に投与することを含む方法。
前記細胞集団は、未修飾細胞集団と比較して胎児型ヘモグロビン発現の発現の増加を有するか、又は投与に引き続いて胎児型ヘモグロビンの増加した発現をもたらし、前記胎児型ヘモグロビンの発現の前記増加は、前記異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量である、請求項４に記載の方法。
プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、核酸配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、前記核酸配列における修飾を含む単離されたＴ細胞であって、前記核酸配列は、ＦＡＳ遺伝子配列の一部、ＢＩＤ遺伝子配列の一部、ＣＴＬＡ４遺伝子配列の一部、ＰＤＣＤ１遺伝子配列の一部、ＣＢＬＢ遺伝子配列の一部、ＰＴＰＮ６遺伝子配列の一部、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、単離されたＴ細胞。
ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡからなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子の破壊を含むＴ細胞集団であって、前記破壊は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍからなる群から選択される遺伝子を標的とするｇＲＮＡとを含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を使用して生成され、前記Ｔ細胞集団の少なくとも６０％のＴ細胞は、前記Ｔ細胞の表面上において、検出可能なレベルのＭＨＣＩＩ受容体、ＴＣＲ又はＢ２Ｍを含まない、Ｔ細胞集団。
破壊されたＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は操作されたＴ細胞受容体（ｅＴＣＲ）をさらに含む、請求項７に記載のＴ細胞集団。
前記Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ４^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋中央記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋エフェクター記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ８^＋幹細胞記憶Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、ＴＨ１７ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ１ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＨ９ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｔ細胞又はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７⁻Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞である、請求項６〜８のいずれ一項に記載の単離されたＴ細胞又はＴ細胞集団。
核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲであって、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、前記ヌクレアーゼのＮ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列、前記ヌクレアーゼのＣ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列又は前記ヌクレアーゼのＮ末端及びＣ末端若しくはその近傍の１つ若しくは複数のＮＬＳ配列を含む、単離されたＣＲＩＳＰＲ。
前記ＮＬＳ配列は、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ｎＮＬＳ）（配列番号１）及びシミアンウイルス４０「ＳＶ４０」ＮＬＳ（ｓＮＬＳ）（配列番号２）からなる群から選択される、請求項１０に記載の単離されたＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ。
システインアミノ酸の欠失又は置換を含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからの単離されたＣＲＩＳＰＲであって、前記Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＡｓＣｐｆ１アミノ酸配列のＣ６５、Ｃ２０５、Ｃ３３４、Ｃ３７９、Ｃ６０８、Ｃ６７４、Ｃ１０２５又はＣ１２４８に欠失又は置換を含み、前記置換は、Ｃ６５Ｓ／Ａ、Ｃ２０５Ｓ／Ａ、Ｃ３３４Ｓ／Ａ、Ｃ３７９Ｓ／Ａ、Ｃ６０８Ｓ／Ａ、Ｃ６７４Ｓ／Ａ及びＣ１０２５Ｓ／Ａからなる群から選択される、単離されたＣＲＩＳＰＲ。
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする単離された核酸。
ＨＳＣ又はＴ細胞の集団において、関心のある１つ又は複数の標的配列を修飾する方法であって、前記細胞集団を、
（ａ）前記関心のある標的配列に相補的なｇＲＮＡ分子；及び
（ｂ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体とエクスビボ又はインビトロで接触させることを含み、前記１つ又は複数のＲＮＰ複合体は、前記細胞集団内の前記１つ又は複数の関心のある標的配列を修飾する、方法。
前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを含む、請求項１４に記載の方法。
前記標的核酸配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の方法。
細胞集団を対象に投与する方法であって、前記細胞集団は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲと、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、前記ＨＢＧ遺伝子配列又は前記ＢＣＬ１１ａ遺伝子配列における修飾を含む、方法。
前記対象は、異常ヘモグロビン症に罹患している、請求項１７に記載の方法。
前記細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はヒト臍帯血誘導赤血球前駆（ＨＵＤＥＰ）細胞を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
Ｔ細胞の集団を対象に投与する方法であって、前記細胞集団は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ分子とを含む複合体の送達によって生成される、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＩＩＴＡ及びＢ２Ｍからなる群から選択される前記遺伝子における修飾を含む、方法。
前記対象は、がん又は自己免疫障害に罹患している、請求項２０に記載の方法。
前記細胞集団内の前記細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％は、生産的インデルを含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲのｇＲＮＡ分子であって、前記標的配列は、ＨＢＧ遺伝子配列又はＢＣＬ１１ａ遺伝子配列であり、前記ｇＲＮＡ分子は、図６、図７、図８、図４６及び表１９で提供される配列と同一であるか、又は３つ以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む、ｇＲＮＡ分子。
（ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞に導入され、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記第１の標的化ドメインに相補的な前記標的配列又はその近傍に形成され；及び／又は（ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域又はＨＢＧ２プロモーター領域内における、前記ｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に生じる、請求項２３に記載のｇＲＮＡ分子。
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞集団に導入されると、
（ａ）胎児型ヘモグロビンの発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されなかった細胞集団又はその子孫集団における胎児型ヘモグロビンの発現のレベルと比較して前記細胞集団又はその子孫で増加し；及び／又は
（ｂ）異常ヘモグロビン症の症状を部分的に又は完全に緩和するのに適した量で前記胎児型ヘモグロビンの発現の増加をもたらす、請求項２３に記載のｇＲＮＡ分子。
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲをさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
請求項２７に記載の組成物を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む組成物。
異常ヘモグロビン症に罹患している対象の治療で使用するための、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子又は請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
標的配列に相補的な第１の標的化ドメインを含む、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲのｇＲＮＡ分子であって、前記標的配列は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列の一部、ＴＲＡＣ遺伝子配列の一部、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列の一部、ＴＲＢＣ遺伝子配列の一部及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記ｇＲＮＡ分子は、表２〜９で提供される配列と同一であるか、又は３つ以下のヌクレオチドだけ異なる配列を含む、ｇＲＮＡ分子。
（ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細胞に導入され、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記第１の標的化ドメインに相補的な前記標的配列又はその近傍に形成され；及び／又は（ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムが細胞に導入されると、欠失は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子配列、前記ＴＲＡＣ遺伝子配列、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子配列又は前記ＴＲＢＣ遺伝子配列内における、前記ｇＲＮＡの第１の標的化ドメインに相補的な配列に生じる、請求項３０に記載のｇＲＮＡ分子。
請求項３０又は３１に記載のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１（Ｃｐｆ１）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼからのＣＲＩＳＰＲをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
がんに罹患している対象の治療で使用するための、請求項３０若しくは３１に記載のｇＲＮＡ分子又は請求項３２若しくは３４に記載の組成物。
ゲノム編集システムであって、
（ａ）図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図４６並びに表２〜９及び１９で提供される配列を含むｇＲＮＡ分子；及び
（ｂ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＣｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
を含む１つ又は複数のＲＮＰ複合体を含むゲノム編集システム。
試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによる標的核酸配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介編集及び／又は標的核酸配列の発現の調整を評価するためのアッセイであって、
（ａ）一致部位標的核酸配列を含む標的核酸配列の編集及び／又は発現の調整に関して、前記試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性を判定すること；
（ｂ）前記一致部位標的核酸配列を含む前記標的核酸配列の前記編集及び／又は発現の調整に関して、前記試験Ｃｐｆ１ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの前記活性を対照ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性と比較すること
を含むアッセイ。