JP2021505182A - 二重特異性抗体製品のための連続製造プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
(i)灌流バイオリアクター中に少なくとも1つの哺乳動物細胞培養物を含む液体細胞培養培地を供給する工程であって、哺乳動物細胞培養物が、二重特異性抗体製品を発現することができ、且つ細胞が、灌流バイオリアクター中における播種時に少なくとも0.5×10^6細胞/mLの濃度を有する工程、
(ii)バイオリアクターから細胞を除去することなく、灌流量(D)を適用して好ましくは連続的な様式で液体細胞培養培地を交換することによって、哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程であって、灌流量が最初のうちは、少なくとも0.4の1日当たりの容器容量(vvd)に相当し、続いて連続的に、徐々に又は漸増的に、本明細書で1日当たりの容器容量(vvd)としても理解される少なくとも1バイオリアクター容量に増加され、その時、生物量設定値に達し、生物量設定値が、少なくとも35×10^6細胞/mLの生細胞密度(VCD)に等しい工程、
(iii)好ましくはバイオリアクターから細胞を除去することなく、灌流量(D)を適用して連続的又は漸増的に液体細胞培養培地を交換することによって灌流培養を維持し、その時、生物量設定値に達する工程であって、工程(iii)における灌流量が、本明細書で1日当たりの容器容量(vvd)としても理解される少なくとも1バイオリアクター容量に相当する工程、及び
(iv)任意選択的にバイオリアクターから余分な細胞を抜いて、生物量設定値を維持する工程であって、
バイオリアクター中の二重特異性抗体製品濃度は、工程(ii)〜(iv)の全体にわたって液体細胞培養培地から二重特異性抗体製品を連続的に収集すること及び/又はDをVCDに調整することによって3.5g/L未満に保たれる工程を含む。
前記態様によれば、生物量設定値は、少なくとも65×10^6細胞/mLのVCDに等しいことが工程(ii)においてさらに想定される。
前記態様によれば、細胞培養の増殖は、少なくとも4日間、好ましくは少なくとも7日間、好ましくは少なくとも12日間起こることも工程(ii)において想定される。
前記態様によれば、灌流量(D)は、連続的に、すなわち、不連続的ではなく増加されることが工程(ii)においてさらに想定される。
前記態様によれば、灌流量(D)は、2〜6.4vvdの範囲、好ましくは2vvd、最も好ましくは2.01vvdであることも工程(iii)において想定される。
前記態様によれば、二重特異性抗体製品の第1の結合ドメインは、CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、BCMA及びPSMAからなる群から選択される少なくとも1つの標的細胞の表面抗原に結合することが想定される。
前記態様によれば、第2の結合ドメインは、
(a)配列番号1に示されるとおりのCDR−H1、配列番号2に示されるとおりのCDR−H2、配列番号3に示されるとおりのCDR−H3、配列番号4に示されるとおりのCDR−L1、配列番号5に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号6に示されるとおりのCDR−L3、
(b)配列番号29に示されるとおりのCDR−H1、配列番号30に示されるとおりのCDR−H2、配列番号31に示されるとおりのCDR−H3、配列番号34に示されるとおりのCDR−L1、配列番号35に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号36に示されるとおりのCDR−L3、
(c)配列番号42に示されるとおりのCDR−H1、配列番号43に示されるとおりのCDR−H2、配列番号44に示されるとおりのCDR−H3、配列番号45に示されるとおりのCDR−L1、配列番号46に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号47に示されるとおりのCDR−L3、
(d)配列番号53に示されるとおりのCDR−H1、配列番号54に示されるとおりのCDR−H2、配列番号55に示されるとおりのCDR−H3、配列番号56に示されるとおりのCDR−L1、配列番号57に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号58に示されるとおりのCDR−L3、
(e)配列番号62に示されるとおりのCDR−H1、配列番号63に示されるとおりのCDR−H2、配列番号64に示されるとおりのCDR−H3、配列番号65に示されるとおりのCDR−L1、配列番号66に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号67に示されるとおりのCDR−L3、
(f)配列番号83に示されるとおりのCDR−H1、配列番号84に示されるとおりのCDR−H2、配列番号85に示されるとおりのCDR−H3、配列番号86に示されるとおりのCDR−L1、配列番号87に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号88に示されるとおりのCDR−L3、
(g)配列番号94に示されるとおりのCDR−H1、配列番号95に示されるとおりのCDR−H2、配列番号96に示されるとおりのCDR−H3、配列番号97に示されるとおりのCDR−L1、配列番号98に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号99に示されるとおりのCDR−L3、
(h)配列番号105に示されるとおりのCDR−H1、配列番号106に示されるとおりのCDR−H2、配列番号107に示されるとおりのCDR−H3、配列番号109に示されるとおりのCDR−L1、配列番号110に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号111に示されるとおりのCDR−L3、
(i)配列番号115に示されるとおりのCDR−H1、配列番号116に示されるとおりのCDR−H2、配列番号117に示されるとおりのCDR−H3、配列番号118に示されるとおりのCDR−L1、配列番号119に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号120に示されるとおりのCDR−L3、
(j)配列番号126に示されるとおりのCDR−H1、配列番号127に示されるとおりのCDR−H2、配列番号128に示されるとおりのCDR−H3、配列番号129に示されるとおりのCDR−L1、配列番号130に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号131に示されるとおりのCDR−L3、
(k)配列番号137に示されるとおりのCDR−H1、配列番号138に示されるとおりのCDR−H2、配列番号139に示されるとおりのCDR−H3、配列番号140に示されるとおりのCDR−L1、配列番号141に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号142に示されるとおりのCDR−L3、
(l)配列番号152に示されるとおりのCDR−H1、配列番号153に示されるとおりのCDR−H2、配列番号154に示されるとおりのCDR−H3、配列番号155に示されるとおりのCDR−L1、配列番号156に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号157に示されるとおりのCDR−L3、及び
(m)配列番号167に示されるとおりのCDR−H1、配列番号168に示されるとおりのCDR−H2、配列番号169に示されるとおりのCDR−H3、配列番号170に示されるとおりのCDR−L1、配列番号171に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号172に示されるとおりのCDR−L3
からなる群から選択されるCDR−H1、CDR−H2及びCDR−H3を含むVH領域並びにCDR−L1、CDR−L2及びCDR−L3を含むVL領域を含むことも想定される。
前記態様によれば、HCCFは、工程(ii)及び(iii)又は工程(iii)のみから得られることが想定される。
前記態様によれば、灌流培養は、少なくとも7日間、好ましくは少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28日間、最も好ましくは少なくとも35日間、規定の細胞比灌流量で供給し、バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、生物量設定値を維持することによって連続的に行われていることが想定される。
本発明の別の態様では、CMよりも短い期間でありながら、本明細書で提示されるとおりのものと同等の品質の製品特性を有利にもたらすフェドバッチ及び灌流の複合型の方法が想定される。今度は、製品の量はより少なく、FBとほぼ同等である。好ましくは、バイオリアクター中の製品濃度が低いほど、本発明によるCMプロセスと同様により良好な製品品質をもたらす。しかしながら、細胞培養期間は最小化される。このような本発明による複合型のプロセスは、(i)播種から約7日目までのフェドバッチ、(ii)その後の、好ましくは収集のために交互のタンジェンシャルフロー(ATF)濾過システムを使用する短い灌流培養の期間(CMと同等)のプロセス工程を含む。製品の除去は、製品濃度の低下及び製品品質の向上のために、本発明によるCMプロセスと同様の方法で実施されることが好ましい。
用語「哺乳動物細胞の培養物」は、制御された一連の物理的条件下で維持又は増殖される複数の哺乳動物細胞を含有する液体培養培地を意味する。
用語「分解」は一般に、ペプチド又はタンパク質などの、より大きい実体の少なくとも2つのより小さい実体への崩壊を意味し、そのうちの1つの実体は、他の実体又は実体(複数)よりも著しく大きい場合がある。
第3のドメインのポリペプチド単量体(「Fc部分」又は「Fc単量体」)を互いに融合するペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも25アミノ酸残基(25、26、27、28、29、30など)を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも30アミノ酸残基(30、31、32、33、34、35など)を含む。リンカーが最大40アミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大35アミノ酸残基、最も好ましくはちょうど30アミノ酸残基である。このようなペプチドリンカーの好ましい実施形態は、アミノ酸配列Gly−Gly−Gly−Gly−Ser、すなわちGly4Ser(配列番号187)又はそのポリマー、すなわち(Gly4Ser)xによって特徴付けられ、ここで、xは、5又はそれを超える整数(例えば、6、7又は8)である。好ましくは、整数は、6又は7であり、より好ましくは、整数は、6である。
(a)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号27に示されるCDR−L1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号28に示されるCDR−L2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号29に示されるCDR−L3;
(b)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号117に示されるCDR−L1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号118に示されるCDR−L2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号119に示されるCDR−L3;並びに
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号153に示されるCDR−L1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号154に示されるCDR−L2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号155に示されるCDR−L3
から選択されるCDR−L1、CDR−L2及びCDR−L3を含むVL領域を含むことが好ましい。
(a)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号12に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号13に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号14に示されるCDR−H3;
(b)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号30に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号31に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号32に示されるCDR−H3;
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号48に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号49に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号50に示されるCDR−H3;
(d)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号66に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号67に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号68に示されるCDR−H3;
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号84に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号85に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号86に示されるCDR−H3;
(f)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号102に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号103に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号104に示されるCDR−H3;
(g)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号120に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号121に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号122に示されるCDR−H3;
(h)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号138に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号139に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号140に示されるCDR−H3;
(i)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号156に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号157に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号158に示されるCDR−L3;並びに
(j)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号174に示されるCDR−H1、国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号175に示されるCDR−H2、及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号176に示されるCDR−L3
から選択されるCDR−H1、CDR−H2及びCDR−H3を含むVH領域を含む。
(a)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号17又は21に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号15又は19に示されるVH領域;
(b)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号35又は39に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号33又は37に示されるVH領域;
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号53又は57に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号51又は55に示されるVH領域;
(d)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号71又は75に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号69又は73に示されるVH領域;
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号89又は93に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号87又は91に示されるVH領域;
(f)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号107又は111に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号105又は109に示されるVH領域;
(g)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号125又は129に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号123又は127に示されるVH領域;
(h)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号143又は147に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号141又は145に示されるVH領域;
(i)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号161又は165に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号159又は163に示されるVH領域;並びに
(j)国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号179又は183に示されるVL領域及び国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号177又は181に示されるVH領域
からなる群から選択されるVL領域及びVH領域を含むDC3に結合する第2のドメインによって特徴付けられる。
a)放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)などの放射性同位体又は重同位体であり得る同位体標識
b)磁気標識(例えば、磁気粒子)
c)酸化還元活性部分
d)蛍光基(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、化学発光基及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素(発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない)
e)酵素群(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)
f)ビオチン化基
g)二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど)。
また、本発明の抗体コンストラクトの好ましい実施形態では、前記第3のドメインは、アミノからカルボキシルの順に、
ヒンジ−CH2−CH3−リンカー−ヒンジ−CH2−CH3
を含む。
(182)第1のドメインが、2つの抗体可変ドメインを含み、且つ第2のドメインが、2つの抗体可変ドメインを含むか;
(ii)第1のドメインが、1つの抗体可変ドメインを含み、且つ第2のドメインが、2つの抗体可変ドメインを含むか;
(iii)第1のドメインが、2つの抗体可変ドメインを含み、且つ第2のドメインが、1つの抗体可変ドメインを含むか;又は
(iv)第1のドメインが、1つの抗体可変ドメインを含み、且つ第2のドメインが、1つの抗体可変ドメインを含む抗体コンストラクトを提供する。
(a)第1のドメイン;
(b)配列番号187〜189からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;
I 第2のドメイン;
(d)配列番号187、
188、189、195、196、197及び198からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;
I 第3のドメインの第1のポリペプチド単量体;
(f)配列番号191、192、193及び194からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;及び
(g)第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
を含むように特徴付けられる。
(a)配列番号7、8、17、27、28、37、38、39、40、41、48、49、50、51,52、59、60、61、62、63、64、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、89、90、91、92、93、100、101、102、103、104、113、114、121、122、123、124、125、131、132、133、134、135、136、143、144、145、146、147、148、149、150、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、173、174、175、176、177、178、179、180、181からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のドメイン
(b)配列番号187〜189からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;
I 国際公開第2008/119567号パンフレットの配列番号23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185若しくは187又は配列番号202からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のドメイン;
(d)配列番号187、188、189、195、196、197及び198からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;
I 国際公開第2017/134140号パンフレットの配列番号17〜24からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第3のドメインの第1のポリペプチド単量体;
(f)配列番号191、192、193及び194からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー;及び
(g)国際公開第2017/134140号パンフレットの配列番号17〜24からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する第3のドメインの第2のポリペプチド単量体を含む。
(a)配列番号27、28、37〜41; CD33
(b)配列番号48〜52の各々; EGFRvIII
(c)配列番号59〜64の各々; MSLN
(d)配列番号71〜82の各々; CDH19
(e)配列番号100〜104の各々; DLL3
(f)配列番号7、8、17、113及び114 CD19
(g)配列番号89〜93の各々; FLT3
(h)配列番号121〜125の各々; CDH3
(i)配列番号132〜136の各々; BCMA及び
(j)配列番号143〜151、158〜166及び173〜181の各々 PSMA
からなる群から選択され、且つそれらを対象とするアミノ酸配列を有することによって特徴付けられる。
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩及び/又はヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、2−フェニルアラニン
・抗菌剤及び抗真菌剤などの抗菌薬
・アスコルビン酸、メチオニン、ナトリウム69yophili(sodium 69yophili)又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;
・生理的なpH又はそれよりわずかに低いpHで組成物を維持するのに使用される緩衝液、緩衝液系及び緩衝化剤;緩衝液の例は、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−HCl、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩、及びヒスチジンである;例えば、約pH7.0〜8.5のトリス緩衝液;
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル;
・生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール/水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む水性担体;
・ポリエステルなどの生分解性ポリマー;
・マンニトール又はグリシンなどの充填剤;
・エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート剤;
・等張剤及び吸収遅延剤;
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン)
・注入剤;
・単糖類;二糖類;及び他の糖質(グルコース、マンノース又はデキストリンなど);糖質は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトール又はキシリトールであり得る;
・(低分子量)タンパク質、ポリペプチド又はタンパク質性担体、例えばヒト若しくはウシ血清アルブミン、ゼラチン又は好ましくはヒト起源の免疫グロブリン;
・着色及び着香剤;
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、[α]−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤;
・乳化剤;
・ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー)
・ナトリウムなどの塩形成対イオン;
・抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤;例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素である);
・Zn−タンパク質錯体などの金属錯体;
・溶媒及び共溶媒(70yophilis、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど);
・糖及び糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース(myoinisitose)、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール(myoinisitol)、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール(例えば、イノシトール)、ポリエチレングリコール;及び多価糖アルコール;
・懸濁化剤;
・界面活性剤又は湿潤剤、例えばプルロニック(登録商標)、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール(tyloxapal);界面活性剤は、好ましくは、>1.2KDの分子量を有する洗剤及び/又は好ましくは>3KDの分子量を有するポリエーテルであり得る;好ましい洗剤の非限定的な例は、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及びTween 85であり;好ましいポリエーテルの非限定的な例は、PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000及びPEG 5000である;
・スクロース又はソルビトールなどの安定性増強剤;
・等張性増強剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール;
・塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は固定油を含む非経口送達ビヒクル;
・体液及び栄養補充液、電解質補充液(リンゲルデキストロースをベースにしたものなど)を含む静脈内送達ビヒクル。
化学修飾に関するトリプシンペプチドマッピング
二重特異性抗体コンストラクトのタンパク質試料は、例えば、Millipore Microcon 30Kデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化される。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いて例えば、メチオニンを含有する6Mのグアニジン塩酸塩(GuHCl)(例えば、Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)緩衝液中で変性させられ、例えば、500mMのジチオスレイトール(DTT)(例えば、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)により例えば37℃で30分間還元され、その後例えば、500mMのヨード酢酸(IAA)(例えば、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)との例えば、室温の暗所での20分間のインキュベーションによりアルキル化される。未反応のIAAは、DTTの添加によってクエンチされる。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液(例えば、メチオニンを含有する50mMのトリス、pH7.8)へと緩衝液交換されて、残留しているDTT及びIAAが除去される。トリプシン消化は、例えば、37℃で1時間、1:20(w/w)の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施される。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、例えば、pH4.7の酢酸緩衝液中の8MのGuHClを添加することによってクエンチされる。
宿主細胞タンパク質(HCP)ELISA
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗HCP免疫グロブリンG(IgG)(Amgen、内製の抗体)でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びHCP較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗HCP IgG−ビオチン(Amgen、内製の抗体)がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン(商標)西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP−コンジュゲート)(例えば、Amersham−GE、Buckinghamshire、UK)がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン(TMB)(例えば、Kirkegaard and Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)がプレートに添加される。発色は1Mのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。
・製剤:
pH6.0のリン酸カリウム、L−アルギニン塩酸塩、トレハロース、ポリソルベート80
医薬組成物の形態の本発明の抗体コンストラクトの安定性の評価に関する他の例は、付属の実施例4〜12に提供される。それらの実施例において、本発明の抗体コンストラクトの実施形態は、異なる医薬製剤において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が当技術分野で知られる他の半減期延長(HLE)形式の二重特異性T細胞エンゲージ抗体コンストラクトと比較される。一般に、本発明による特定のFc様式で提供される抗体コンストラクトは、通常、異なるHLE形式とともに提供される抗体コンストラクト及びいかなるHLE形式も有しない抗体コンストラクト(例えば、「カノニカル」な抗体コンストラクト)の両方と比較して、温度及び光ストレスなどの広範囲のストレス条件に対してより安定であることが想定される。前述の温度安定性は、低温(凍結温度を含む室温未満)及び高温(体温までの又は体温を超える温度を含む室温超)の両方に関連し得る。当業者が認めるとおり、診療において避けるのが困難なストレスに対するそのような安定性の向上により、診療において分解産物がより少なくなるため、抗体コンストラクトがより安全になる。結果として、前述の安定性の向上は、安全性の向上を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「免疫障害」は、この用語の一般的な定義に沿って自己免疫疾患、過敏症、免疫不全などの免疫障害を表す。
・局所経路(例えば、皮膚上、吸入、鼻、83yophilisa、耳介/耳、膣、粘膜);
・腸経路(例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸);及び
・非経口経路(例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内)
を含むが、これらに限定されない。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬及び物質などに限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するように意図されてはおらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
CD19xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、CD19xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2L又は500Lのスケール)。
CD19xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスが開始される前に、CD19xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するCHO細胞を含有するバイアルが解凍された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(10L又は50Lのスケール)。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー(CEX−HPLC)
弱カチオン交換(CEX)分離は、Thermo Scientific(商標)ProPac WCX−10カラム(4.0×250mm、10μm)及びAgilent HPLC 1100シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、製剤緩衝液を使用して22.5μg/mLに希釈され、続いてローディングの前に2−(N−モルホリノ)エタンスルホニック(MES)緩衝液(pH5.8)で調整され、NaClの増加性の勾配を用いて30℃の設定温度で分離された。移動相Aは、pH5.8の20mMのMESであり、移動相Bは、pH5.8の20mMのMES及び1.0MのNaClであった。直線勾配は、0.5mL/分の流速にて55分で7%Bから54%Bへと実施された。およそ1.5μgの試料が注入され、シグナルは、FL検出(280nmでの励起、345nmでの発光)でモニターされた。
化学修飾に関するトリプシンペプチドマッピング
CD19xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトのタンパク質試料は、Millipore Microcon 30Kデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化された。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いてメチオニンを含有する6Mのグアニジン塩酸塩(GuHCl)(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)緩衝液中で変性させられ、500mMのジチオスレイトール(DTT)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)により37℃で30分間還元され、その後500mMのヨード酢酸(IAA)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)との室温の暗所での20分間のインキュベーションによりアルキル化された。未反応のIAAは、DTTの添加によってクエンチされた。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液(メチオニンを含有する50mMのトリス、pH7.8)へと緩衝液交換されて、残留しているDTT及びIAAが除去された。トリプシン消化は、37℃で1時間、1:20(w/w)の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施された。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、pH4.7の酢酸緩衝液中の8MのGuHClを添加することによってクエンチされた。
宿主細胞タンパク質(HCP)ELISA
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗HCP免疫グロブリンG(IgG)(Amgen、内製の抗体)でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びHCP較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗HCP IgG−ビオチン(Amgen、内製の抗体)がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン(商標)西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP−コンジュゲート)(Amersham−GE、Buckinghamshire、UK)がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)がプレートに添加される。発色は1Mのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。
EGFRvIIIxCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、EGFRvIIIxCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
EGFRvIIIxCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、EGFRvIIIxCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
製品品質の分析方法として
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)
SE−HPLCは、Waters BEH200サイズ排除カラム(4.6x150mm、1.7μm)及びWaters UHPLCシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、0.4mL/分の流速で、NaCl塩を含有するリン酸緩衝液(移動相は、pH6.8の100mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClであった)を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、280nmのUV吸光度によってモニターされた。およそ6μgの試料がロードされた。
TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体のフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体(全長)を発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体の連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体を発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。 細胞が5×106細胞/mLで生産バイオリアクターに播種された後、静電容量プローブ(Hamilton Bonaduz AG、Switzerland)によって測定されるとおりの80pF/cm(60〜80×106細胞/mL)の設定値まで細胞密度及び生物量を増加させるのに6日間の最初の細胞増殖期が存在した。生産バイオリアクターは、pH6.9、64mm Hgの溶存酸素及び36℃で制御された。灌流培養は、細胞増殖期の1日目に、ポリエーテルスルホン0.2−μmフィルター(GE Healthcare、Pittsburg、PA)、及び専売の既知組成の灌流培地による交互タンジェンシャルフロー(ATF)濾過システム(Refine Technologies、Hanover、NJ)を使用して、0.5VVDの灌流量で開始された。灌流量は、1日目の0.5VVDから6日目の2VVDへと徐々に増加された。6日目に生物量設定値に到達すると、HCCFの回収が開始され(すなわち、TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体を含有する無細胞浸透液)、灌流培養は、さらに28日間、2VVD灌流量(0.02〜0.03nL/細胞−日の定常状態のCSPR)で供給し、且つ余分な細胞を抜いて生物量設定値を維持することによって継続された。細胞密度(CDV、Nova Biomedical、Waltham、MA)、代謝産物(NovaFlex、Nova Biomedical、Waltham、MA)及び浸透液力価(HPLC分析)は、培養期間全体にわたって測定された。HCCFは、8〜10日目及び29〜31日目に回収され、プロテイン−A捕捉クロマトグラフィーへと処理が進められた後、NaCl勾配溶出による強カチオン交換(CEX)クロマトグラフィー工程が行われた。CEX溶出物は、還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(RCE−SDS)、分析的カチオン交換クロマトグラフィー(CEX−HPLC)、ペプチドマッピング及び宿主細胞タンパク質(HCP)ELISAを用いて製品品質の特質及びプロセスに関連する不純物について分析された。表6に示される標準化された値は、FBにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した;FBに関して、これは1に対応し;CMに関しては、記載される比率に対応するある数である。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー(CEX−HPLC)
強カチオン交換(CEX)分離は、YMC− BioPro SP−F;100×4.6mml.D;5μmカラム及びAgilent HPLC 1100シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、ローディングの前に移動相Aを使用して3.0mg/mLに希釈され、NaClの増加性の勾配を用いて25℃の設定温度で分離された。移動相Aは、pH6.9の20mMのリン酸ナトリウムであり、移動相Bは、pH6.9の20mMのリン酸ナトリウム及び0.5MのNaClであった。直線勾配は、0.6mL/分の流速にて10分で2%Bから25%Bへと実施された。およそ90μgの試料が注入され、シグナルは、280nmでのUV検出によりモニターされた。
還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(RCE−SDS)
還元CE−SDSは、Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CEシステム上で実施された。タンパク質試料は、水で0.5mg/mLまで希釈され、続いてBeckman SDS試料緩衝液中において70℃で10分間−βメルカプトエタノール(β−ME)で還元された(Beckman Coulter、Brea、CA)。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー(50μm ID×30.0cm有効長)に動電学的に注入され(20秒間の5kV)、SDSゲル緩衝液を使用して分離され(15kVで30分間の分離)、検出は、フォトダイオードアレイ検出器による220nmのUVを使用して得られた。
トリプシンペプチドマッピング
TNF−アルファxTL1A二重特異性抗体のタンパク質試料は、水で3mg/mLの作業量に希釈され、続いてエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する4MのGuHCl緩衝液中で変性され、500mMのDTTにより37℃で30分間還元された後、500mMのIAAとの室温の暗所での20分間のインキュベーションによりアルキル化される。未反応のIAAは、DTTの添加によってクエンチされた。試料は脱塩され、重力流によるNAP−5カラム(GE Healthcare、UK)により消化緩衝液(メチオニンを含有する50mMのトリス、pH7.8)へと緩衝液交換された。トリプシン消化は、1:10の比で実施され、37℃で35分間インキュベートされた。消化は、10%のギ酸を用いてクエンチされた。
宿主細胞タンパク質(HCP)ELISA
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗HCP免疫グロブリンG(IgG)(Amgen、内製の抗体)でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びHCP較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗HCP IgG−ビオチン(Amgen、内製の抗体)がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン(商標)西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP−コンジュゲート)(Amersham−GE、Buckinghamshire、UK)がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)がプレートに添加される。発色は1Mのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。
CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するCHO細胞(クローンA)を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)
SE−HPLCは、Waters BEH200サイズ排除カラム(4.6x150mm、1.7μm)及びWaters UHPLCシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、0.4mL/分の流速で、NaCl塩を含有するリン酸緩衝液(移動相は、pH6.8の100mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClであった)を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、280nmのUV吸光度によってモニターされた。およそ6μgの試料がロードされた。
CD33xCD3 BiTE抗体コンストラクトのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクト(クローンB)を発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(3Lのスケール)。
CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクト(クローンB)を発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(3Lのスケール)。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)
SE−HPLCは、Waters BEH200サイズ排除カラム(4.6x150mm、1.7μm)及びWaters UHPLCシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、0.4mL/分の流速で、NaCl塩を含有するリン酸緩衝液(移動相は、pH6.8の100mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClであった)を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、280nmのUV吸光度によってモニターされた。およそ6μgの試料がロードされた。
CMプロセスから製品濃度の低下及び製品の品質の向上の恩恵を受けながら、培養時間を最小化するために、複合型フェドバッチプロセスが試験された。これに関して、プロセスは、播種から7日目までフェドバッチであり、続いて収集のための交互タンジェンシャルフロー(ATF)濾過システムを使用して短期間の灌流培養を行った。CMプロセスと同様の方法における製品の除去は、製品濃度を低下させ、且つ製品品質を向上させた。
CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの従来の15日フェドバッチプロセス(従来のFB)
FBプロセスは、CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクト(クローンB)を発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(3Lのスケール)。
CD33xCD3 BiTE(登録商標)抗体コンストラクトの複合型の10日フェドバッチプロセス(複合型のFB)
複合型のFBプロセスは、従来のFBと同じスケールアップ及び生産条件及びサンプリングを使用した。3日間の1VVDの精密濾過の複合型FBプロセス(複合型−3D−1VVD)の間、3及び6日目に規定量の専売の既知組成フィード培地が培養に供給された。7日目に、培養は、ポリエーテルスルホン 750kDaフィルター(GE Healthcare、Pittsburg、PA)による交互タンジェンシャルフロー(ATF)濾過システム(Refine Technologies、Hanover、NJ)を使用して、1日当たり1容器容量(1VVD)で3日間専売の既知組成フィード培地により灌流された。CD33xCD3 BiTE抗体製品は、フィルターを通して浸透され、7〜10日目の間にHCCFとして回収された。HCCFは、プロテイン−L捕捉クロマトグラフィーへと処理を進められ、溶出物は、サイズ排除クロマトグラフィー(SE−HPLC)及びカチオン交換クロマトグラフィー(CEX−HPLC)を使用して、製品品質の特質について分析された。表10に示される標準化された値は、FBにおける全ての絶対数の平均で割られた全ての絶対数の平均に対応した;FBに関して、これは1に対応し;CMに関しては、記載される比率に対応するある数である。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)
SE−HPLCは、Waters BEH200サイズ排除カラム(4.6x150mm、1.7μm)及びWaters UHPLCシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、0.4mL/分の流速で、NaCl塩を含有するリン酸緩衝液(移動相は、pH6.8の100mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClであった)を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、280nmのUV吸光度によってモニターされた。およそ6μgの試料がロードされた。
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー(CEX−HPLC)
弱カチオン交換(CEX)分離は、Waters Protein−Pak Hi Res CM 4.6×100mmカラム及びWaters超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)システムを使用して実施された。タンパク質試料は、ローディングの前に製剤緩衝液 10mMリン酸カリウム、8%スクロース、0.01%(w/v)ポリソルベート80、1%(w/v)Captisol(pH6.1±0.04)で予め条件を整えられた。試料は、26℃の設定温度、0.mL/分の流速にて、3種の移動相(A、B、及びC)の様々な勾配下で分離された。移動相AはpH6.0の50mMリン酸ナトリウムであり、移動相BはpH8.0の50mMのトリス−HCl、250mMの塩化ナトリウムであり、移動相CはpH8.0の50mMのトリス−HCl、500mMの塩化ナトリウムであった。およそ8.0μgの試料が注入され、シグナルは、FLD検出(280nmでの励起、345nmでの発光)でモニターされた。
BCMAxCD3 BITE(登録商標)−HLEのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、BCMAxCD3 BiTE(登録商標)−HLEを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
BCMAxCD3 BITE(登録商標)−HLEの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、BCMAxCD3 BiTE(登録商標)−HLEを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(10L又は50Lのスケール)。
製品品質の分析方法
電荷バリアント分析のためのカチオン交換高速クロマトグラフィー(CEX−HPLC)
弱カチオン交換(CEX)分離は、Thermo Scientific(商標)ProPac WCX−10カラム(4.0×250mm、10μm)及びAgilent HPLC 1100シリーズを使用して実施された。タンパク質試料は、移動相Aにより500μg/mLに希釈され、NaClの増加性の勾配を用いて30℃の設定温度で分離された。移動相Aは、pH6.0の50mMのリン酸ナトリウムであり、移動相Bは、pH6.0の50mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaClであった。直線勾配は、0.5mL/分の流速にて50分で10%Bから40%Bへと実施された。およそ50μgの試料が注入され、シグナルは、可変波長検出器によって220nmでUV検出によりモニターされた。
化学修飾に関するトリプシン/エラスターゼペプチドマッピング
タンパク質試料は、Millipore Microcon 30Kデバイスを使用して、フィルターに基づく方法で消化された。タンパク質試料は、フィルター上に添加され、遠心分離されて試料マトリックスが除去され、続いてメチオニンを含有する6Mのグアニジン塩酸塩(GuHCl)(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL)緩衝液中で変性させられ、37.5mMのジチオスレイトール(DTT)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)により37℃で30分間還元され、その後87.5mMのヨード酢酸(IAA)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)との室温の暗所での20分間のインキュベーションによりアルキル化された。未反応のIAAは、DTTの添加によってクエンチされた。上記の全ての工程はフィルター上で行われた。その後、試料は、遠心分離によって消化緩衝液(メチオニンを含有する50mMのトリス、pH7.8)へと緩衝液交換されて、残留しているDTT及びIAAが除去された。トリプシン消化は、37℃で1時間、1:20(w/w)の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上で実施された。小さいトリプシン消化物は、遠心分離によって回収され、大きいトリプシン消化物は、1:20(w/w)の酵素対タンパク質比を用いてフィルター上において37℃で30分間実施されるエラスターゼ消化にかけられた。消化混合物は、遠心分離によって回収され、続いて、pH4.7の250mMの酢酸緩衝液中の8MのGuHClを添加することによってクエンチされた。
還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(還元CE−SDS)
還元CE−SDSは、Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CEシステム上で実施された。タンパク質試料は、水で0.5mg/mLまで希釈され、続いてBeckman SDS試料緩衝液中において70℃で10分間β−メルカプトエタノール(β−ME)で還元された(Beckman Coulter、Brea、CA)。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー(50μm ID×30.0cm有効長)に動電学的に注入され(20秒間の5kV)、SDSゲル緩衝液を使用して分離され(15kVで40分間の分離)、検出は、フォトダイオードアレイ検出器による220nmのUVを使用して得られた。
宿主細胞タンパク質(HCP)ELISA
マイクロタイタープレートは、ウサギ抗HCP免疫グロブリンG(IgG)(Amgen、内製の抗体)でコーティングされる。プレートが洗浄され、ブロッキングさた後、試験試料、対照及びHCP較正標準が、プレートに添加され、インキュベートされる。未結合のタンパク質がプレートから洗浄され、プールされたウサギ抗HCP IgG−ビオチン(Amgen、内製の抗体)がプレートに添加され、インキュベートされる。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン(商標)西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP−コンジュゲート)(Amersham−GE;Buckinghamshire、UK)がプレートに添加され、インキュベートされる。プレートが最後に洗浄され、発色性基質テトラメチルベンジジン(TMB)(Kirkegaard and Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)がプレートに添加される。発色は1Mのリン酸で停止され、光学密度が分光光度計で測定される。
DNAの方法(qPCR)
試料は、プロテイナーゼKによる消化によって調製された後、DNA抽出及びイソプロピルアルコール沈殿が行われた。CHO細胞特異的な反復DNA配列(RepAと称される)を増幅するためにプライマーが設計され、それらの間をアニールするために特異的なプローブが設計された。プローブは、その5’末端で蛍光レポーター色素FAM(6−カルボキシフルオセイン)により標識され、その3’末端でクエンチャー色素TAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン)により標識される。アニールされたプローブが未変化であるとき、レポーター色素の蛍光は、クエンチャー色素の近接によってクエンチされる。各PCRサイクルの伸長期の間、Taq DNAポリメラーゼがアニールされたプローブを切断し、プローブからレポーター色素を放出し、蛍光の増加をもたらす。この蛍光の増加は、反応中に存在する増幅された標的DNAの量に正比例し、リアルタイムPCR機器によってPCR反応全体にわたって連続的にモニターされる。増幅の対数期内で、産物配列の量はDNAの開始量に比例する。CHO細胞から単離されたゲノムDNAの既知の量の検量線を使用して、原物の試料におけるゲノムDNAの濃度に対して蛍光のレベルを相関させる。
DLL3xCD3 BITE(登録商標)−HLEのフェドバッチプロセス(FB)
FBプロセスは、DLLxCD3 BiTE(登録商標)−HLEを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に生産フェドバッチバイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
DLL3xCD3 BITE(登録商標)−HLEの連続製造プロセス(CM)
CMプロセスは、DLLxCD3 BiTE(登録商標)−HLEを発現するCHO細胞を含有するバイアルを解凍することによって開始された。スケールアップの間、細胞は、標的となる生細胞密度(VCD)で新鮮な選択増殖培地中において再懸濁された。培養容量は、振盪フラスコ又はバイオリアクター中で連続的に増大されて、最終的に灌流生産バイオリアクターに播種するのに十分な細胞量を生成した(2Lのスケール)。
製品品質の分析方法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)
SE−HPLCは、Waters BEH200サイズ排除カラム(4.6x150mm、1.7μm)及びWaters UHPLCシステムを使用して実施された。タンパク質試料は、0.4mL/分の流速で、NaCl塩を含有するリン酸緩衝液(移動相は、pH6.8の100mMのリン酸ナトリウム、250mMのNaClであった)を使用して、そのまま注入され且つ均一濃度で分離され、溶出物は、220nmのUV吸光度によってモニターされた。およそ10μgの試料がロードされた。
還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム(還元CE−SDS)
還元CE−SDSは、Beckman Coulter ProteomeLab PA800 PLUS CEシステム上で実施された。タンパク質試料は、製剤緩衝液で1.0mg/mLまで希釈され、続いてBeckman SDS試料緩衝液中において70℃で10分間β−メルカプトエタノール(β−ME)で還元され(Beckman Coulter、Brea、CA)、最終濃度を0.48mg/mLとした。還元され、変性されたタンパク質試料は、非被覆溶融シリカキャピラリー(50μm ID×20.0cm有効長)に動電学的に注入され(30秒間の10kV)、SDSゲル緩衝液を使用して分離され(15kVで40分間の分離)、検出は、フォトダイオードアレイ検出器による220nmのUVを使用して得られた。
Claims (26)
- 少なくとも第1の結合ドメイン及び第2の結合ドメインを含み、
前記第1の結合ドメインが前記第2の結合ドメインとは異なる標的に結合する二重特異性抗体製品の生産のための連続的な上流製造プロセスであって、前記プロセスが:
(i)灌流バイオリアクター中に少なくとも1つの哺乳動物細胞培養物を含む液体細胞培養培地を供給する工程であって、前記哺乳動物細胞培養物が、前記二重特異性抗体製品を発現することができ、且つ前記細胞が、前記灌流バイオリアクター中における播種時に少なくとも0.4×10^6細胞/mLの濃度を有する工程、
(ii)バイオリアクターから前記細胞を除去することなく、灌流量(D)を適用して好ましくは連続的な様式で前記液体細胞培養培地を交換することによって、前記哺乳動物細胞培養物を増殖させる工程であって、前記灌流量が最初のうちは、少なくとも0.4の1日当たりの容器容量(vvd)に相当し、続いて連続的に、徐々に又は漸増的に、少なくとも1vvdに増加され、その時、生物量設定値に達し、前記生物量設定値が、少なくとも35×10^6細胞/mLの生細胞密度(VCD)に等しい工程、
(iii)好ましくはバイオリアクターから前記細胞を除去することなく、前記灌流量(D)を適用して連続的又は漸増的に前記液体細胞培養培地を交換することによって灌流培養を維持し、その時、前記生物量設定値に達する工程であって、工程(iii)における前記灌流量が、少なくとも1vvdに相当する工程、及び
(iv)任意選択的に前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持する工程であって、
前記バイオリアクター中の前記二重特異性抗体製品濃度が、工程(ii)〜(iv)の全体にわたって前記液体細胞培養培地から前記二重特異性抗体製品を連続的に収集することによって3.5g/L未満に保たれる工程
を含む、連続的な上流製造プロセス。 - 工程(i)において、前記細胞が、前記バイオリアクター中における播種時に少なくとも1×10^6細胞/mLの濃度を有する、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(ii)において、前記生物量設定値が、少なくとも65×10^6細胞/mLのVCDに等しい、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(ii)において、前記生物量設定値が、少なくとも71×10^6細胞/mLのVCDに等しい、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(ii)において、前記細胞培養の前記増殖が、少なくとも4日間、好ましくは少なくとも7日間、好ましくは12日間起こる、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(ii)において、前記灌流量(D)が、0.4〜7vvdの範囲である、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(iii)において、前記灌流量(D)が、1〜7vvdの範囲である、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(iii)において、前記灌流量(D)が、2〜6.4vvdの範囲であり、好ましくは2vvd、最も好ましくは2.01vvdに等しい、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(iii)において、前記灌流量(D)が、0.01〜0.15nL/細胞−日(1日当たりの細胞当たりのnL)の範囲、好ましくは0.015〜0.035nL/細胞−日の範囲又は0.051〜0.1nL/細胞−日の範囲の細胞比灌流量(CSPR)である、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(v)において、前記二重特異性抗体製品濃度が、1.2g/L未満、好ましくは0.5g/L未満、最も好ましくは0.12g/L未満に保たれる、請求項1に記載のプロセス。
- 工程(v)における収集前の前記バイオリアクターにおける前記二重特異性抗体製品の滞留時間が、最大2日、好ましくは最大1日、最も好ましくは最大0.5日である、請求項1に記載のプロセス。
- 単離された前記二重特異性抗体のパーセンタイル単量体含量が、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、又は少なくとも80%、90%、93%若しくは95%である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体製品が、二重特異性全長抗体又は非全長二重特異性抗体コンストラクトである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体製品が、第1及び/又は第2の結合ドメインが標的及び/又はエフェクター細胞に結合する二重特異性全長抗体である、請求項13に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体コンストラクトが、半減期延長部分、好ましくはIgG抗体に由来するFcに基づく半減期延長部分、最も好ましくはscFc半減期延長部分を含む、請求項13に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体コンストラクトが、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(登録商標))である、請求項13に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体製品の前記第1の結合ドメインが、CD19、CD33、EGFRvIII、MSLN、CDH19、FLT3、DLL3、CDH3、BCMA及びPSMAからなる群から選択される少なくとも1つの標的細胞の表面抗原に結合する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記二重特異性抗体製品の前記第2の結合ドメインが、CD3に結合する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記第1の結合ドメインが、
(a)配列番号1に示されるとおりのCDR−H1、配列番号2に示されるとおりのCDR−H2、配列番号3に示されるとおりのCDR−H3、配列番号4に示されるとおりのCDR−L1、配列番号5に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号6に示されるとおりのCDR−L3、
(b)配列番号29に示されるとおりのCDR−H1、配列番号30に示されるとおりのCDR−H2、配列番号31に示されるとおりのCDR−H3、配列番号34に示されるとおりのCDR−L1、配列番号35に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号36に示されるとおりのCDR−L3、
(c)配列番号42に示されるとおりのCDR−H1、配列番号43に示されるとおりのCDR−H2、配列番号44に示されるとおりのCDR−H3、配列番号45に示されるとおりのCDR−L1、配列番号46に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号47に示されるとおりのCDR−L3、
(d)配列番号53に示されるとおりのCDR−H1、配列番号54に示されるとおりのCDR−H2、配列番号55に示されるとおりのCDR−H3、配列番号56に示されるとおりのCDR−L1、配列番号57に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号58に示されるとおりのCDR−L3、
(e)配列番号65に示されるとおりのCDR−H1、配列番号66に示されるとおりのCDR−H2、配列番号67に示されるとおりのCDR−H3、配列番号68に示されるとおりのCDR−L1、配列番号69に示されるとおりのCDR−L2、配列番号70に示されるとおりのCDR−L3、
(f)配列番号83に示されるとおりのCDR−H1、配列番号84に示されるとおりのCDR−H2、配列番号85に示されるとおりのCDR−H3、配列番号86に示されるとおりのCDR−L1、配列番号87に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号88に示されるとおりのCDR−L3、
(g)配列番号94に示されるとおりのCDR−H1、配列番号95に示されるとおりのCDR−H2、配列番号96に示されるとおりのCDR−H3、配列番号97に示されるとおりのCDR−L1、配列番号98に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号99に示されるとおりのCDR−L3、
(h)配列番号105に示されるとおりのCDR−H1、配列番号106に示されるとおりのCDR−H2、配列番号107に示されるとおりのCDR−H3、配列番号109に示されるとおりのCDR−L1、配列番号110に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号111に示されるとおりのCDR−L3、
(i)配列番号115に示されるとおりのCDR−H1、配列番号116に示されるとおりのCDR−H2、配列番号117に示されるとおりのCDR−H3、配列番号118に示されるとおりのCDR−L1、配列番号119に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号120に示されるとおりのCDR−L3、
(j)配列番号126に示されるとおりのCDR−H1、配列番号127に示されるとおりのCDR−H2、配列番号128に示されるとおりのCDR−H3、配列番号129に示されるとおりのCDR−L1、配列番号130に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号131に示されるとおりのCDR−L3、
(k)配列番号137に示されるとおりのCDR−H1、配列番号138に示されるとおりのCDR−H2、配列番号139に示されるとおりのCDR−H3、配列番号140に示されるとおりのCDR−L1、配列番号141に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号142に示されるとおりのCDR−L3、
(l)配列番号152に示されるとおりのCDR−H1、配列番号153に示されるとおりのCDR−H2、配列番号154に示されるとおりのCDR−H3、配列番号155に示されるとおりのCDR−L1、配列番号156に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号157に示されるとおりのCDR−L3、並びに
(m)配列番号167に示されるとおりのCDR−H1、配列番号168に示されるとおりのCDR−H2、配列番号169に示されるとおりのCDR−H3、配列番号170に示されるとおりのCDR−L1、配列番号171に示されるとおりのCDR−L2、及び配列番号172に示されるとおりのCDR−L3
からなる群から選択されるCDR−H1、CDR−H2及びCDR−H3を含むVH領域並びにCDR−L1、CDR−L2及びCDR−L3を含むVL領域を含む、請求項1に記載のプロセス。 - 収集された前記二重特異性抗体製品が、収集細胞培養液(HCCF)に含まれる、請求項1に記載のプロセス。
- 前記HCCFが、工程(ii)及び(iii)又は工程(iii)のみから得られる、請求項1に記載のプロセス。
- 前記HCCFが、好ましくは室温で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、72、96120及び/又は144時間刻みで、又は連続的に回収され、さらなる処理、例えば、前記二重特異性抗体製品を捕捉するために下流工程に渡される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記下流工程が、捕捉クロマトグラフィー、ウイルス不活性化及び/又はポリッシング工程を含む、請求項21に記載のプロセス。
- 前記灌流培養が、少なくとも7日間、好ましくは少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28日間、最も好ましくは少なくとも35日間、規定の細胞比灌流量で供給し、前記バイオリアクターから余分な細胞を抜いて、前記生物量設定値を維持することによって連続的に行われている、請求項1に記載のプロセス。
- 少なくとも生物量制御デバイス、DO制御デバイス及びレベル制御デバイス、並びに灌流流量調節デバイスを有する注入口、並びに細胞保持デバイス及びHCCF流量調節デバイスを有する放出口を備える灌流バイオリアクターを含む、請求項1に記載の連続的な上流製造プロセスを実施するための装置。
- 請求項1に記載の連続的な上流製造プロセスによって生産される二重特異性抗体製品。
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