JP2021505176A - カルジオリピンのリモデリング及び心筋細胞の成熟を検出、及び促進する方法及び組成物、並びにミトコンドリア機能障害治療の関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願に添付の配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、67910_Sequence_Listing_Final_2018-12-07.txtである。このテキストファイルは11KBで2018年12月7日に作成されたものであり、明細書の提出とともにEFS-Web経由で提出されている。
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号P01 GM081619、及びR01 GM083867、及びR01 GM097372、及びR01 HL135143、及びU01 HL099993、及びU01 HL099997の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有している。
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症は、ヒドラターゼサブユニットA(HADHA)の変異に起因する。この疾患の病因を明らかにするために、HADHA欠損hiPSCから幹細胞由来の心筋細胞を作製し、エピジェネティックレギュレーターであるHOPXをアップレギュレートする新規の人工マイクロRNA成熟カクテル(「MiMaC」)を用いて成熟を促進させた。脂肪酸処理したMiMaC処理HADHA変異体心筋細胞で、この病気の表現型(不整脈状態を引き起す欠損したカルシウムダイナミクスと再分極キネティクス)が明らかになった。シングルセルRNA-seqにより、代謝遺伝子の発現に基づく新規な心筋細胞の発生中間体が明らかになった。この中間体により、対照細胞では成熟様の心筋細胞が発生したが、変異体細胞では脂肪酸β酸化(FAO)の減少、ミトコンドリアのプロトン勾配の低下、クリステ構造の破壊、カルジオリピンリモデリングの欠損などの病理学的状態に移行した。本研究は、ヒト心筋細胞の機能的ミトコンドリアに不可欠なFAOとカルジオリピンリモデリングには、MLCL-AT様酵素であるTFPa/HADHAが必要であることを明らかにした。
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損心筋細胞の生成
ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症の心臓病理をインビトロで細胞レベルで再現するために、CRISPR/Cas9システムを用いてヒトiPSCのHADHA遺伝子の変異を生成した。我々の同質遺伝子対照となる野生型(WT)hiPSC株から、HADHAのエクソン1を標的とする2つの異なるガイドを用いて複数のHADHA変異hiPSC株を生成し、ウエスタンブロット(図示せず)によりクローンに対してHADHA変異を確認した。gRNA1を用いて作製したノックアウト(KO)HADHA(HADHAKO)及び複合ヘテロ接合体(HADHAMut)hiPSC株を、さらなる研究のために使用した。
ヒトの心臓成熟期に起こる生物学的変化をよりよく理解するために、本発明者らは以前にmiRスクリーニングを実施したが、そこでは、多くの有意に調節されたmiRが、20日(D20)hPSC-CMsと1年成熟hPSC-CMsとの間のインビトロ移行期に観察された(Kuppusamy, K.T., et al., Let-7 family of microRNA is required for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015)。このリストは、ヒト胎児心室から成人心室心筋のin vivo miR配列解析データと相互参照された(Akat, K.M., et al., Comparative RNA-sequencing analysis of myocardial and circulating small RNAs in human heart failure and their utility as biomarkers. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014. 111(30): p. 11151-6; Yang, K.C., et al., Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation, 2014. 129(9): p. 1009-21)。本発明者らは、以前に、不完全ではあるが強固な成熟応答を駆動するために、最もアップレギュレーションされたmiRsファミリーであるLet-7がhESC-CMsにおいて過剰発現され得ることを発見した(Kuppusamy, K.T., et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015)。本研究では、追加のmiRsをLet-7と組み合わせて、より完全な成人様トランスクリプトームを促進することにより、hPSC-CMsを急速に成熟させた。アップ及びダウンレギュレーションされたmiRsの上位15個をスクリーンから選択し、各miRsについて上位200個の予測標的(TargetScanHuman)を同定した。各miR'sの予測標的を用い、GeneAnalyticsソフトウェアを用いてパスウェイ解析を行い、どのmiRが心筋細胞の成熟に関連するパスウェイに影響を与えているかを決定した。このパスウェイには、グルコース及び/又は脂肪酸代謝、細胞増殖及び肥大、細胞周期が含まれていた。多くのダウンレギュレーションされたmiRは多能性状態の維持に関連しており、心筋細胞の成熟をスクリーニングするためには選択されなかった。最終的には、パスウェイ解析に基づいて、CM成熟能を評価するための6つのmiRsがさらなる解析のために選択された(3つのアップレギュレーションされたmiRs(miR-452、-208b及び-378e)及び3つのダウンレギュレーションされたmiRs(miR-122、-200a及び-205)である)(図2A)。
上記で示された6つのmiRsについて、hPSC-CMの成熟度を測定するための4つの機能テストを用いて評価した(細胞エリア、収縮力、代謝能力及び電気生理学)。WT D15 hiPSC-CMsに、CRISPR/Cas9を用いてOE miR又はKO miRのいずれかをレンチウィルスで導入した。次に、細胞に、心筋細胞集団を濃縮するために選択された乳酸塩、及びウィルスベクターを含む集団を濃縮するために選択されたピューロマイシンを用いた。機能評価をmiR摂動の2週間後のD30に実施した(図2B)。
hPSC-CMsにおけるグローバルな転写影響を評価するために、いくつかのmiRs(miR-378e OE、-208b OE、-452 OE、-122 KO又は-205 KO)の変化後にRNA配列解析を行った。各miRがグローバルな転写産物レベルで異なる効果を生じさせることができるかどうかを決定するために、サンプルを主成分分析(PCA)で分析した。各サンプルにおいて、約11,000個の蛋白質コード遺伝子が発現しており、全サンプルにわたって少なくとも3つのFPKMの凝集した発現を有するものをPCAに使用した。PCAは、各miRがそれぞれの対照から有意な変化をもたらすことを示した(図示せず)。miR-452 OEはPC1で最大の分離を示したのに対し、miR-122 KOはPC2で最大の分離を示した。このことは、これら2つのmiRがそれぞれhPSC-CMの転写プロファイルにしっかりと影響を与えていることを示唆している。さらに、いずれのmiRも互いにクラスター化していないことから、それぞれのmiRは独自の発現シグネチャを誘導することが可能であった。
MiMaC処理したhPSC-CMの成熟を評価するために、収縮力、細胞エリア、代謝アッセイを行った(図3A)。MiMaC処理したhPSC-CMs(平均力:36 nN、P = 0.002)は、対照細胞(平均力:24 nN)と比較して、トゥイッチ力が統計的に有意に増加した(図3B)。MiMaC処理したhPSC-CMs(平均パワー: 38 fW, P = 0.016)はまた、対照細胞(平均パワー:22 fW)と比較して、生成されたパワーが統計的に有意に増加した(図3D)。
MiMaCがhiPSC-CMsのトランスクリプトームにどのように影響を与えているかをよりよく理解するために、D30のEV対照CMsとD30のMiMaC処理したCMsを比較してRNA配列解析を行った。特徴的な遺伝子セットを用いたパスウェイ濃縮解析の結果、多くの細胞の成熟と筋のプロセスがアップレギュレーションされていることが示された(例えば、筋発生及び上皮間葉転換[34])。上位のダウンレギュレーションされたパスウェイは、心筋細胞の成熟の重要な特徴である細胞周期に関連していた。STRING解析を用いて、2つのパスウェイ(筋発生と上皮間葉転換)に関連する有意にアップレギュレーションされ、相互連結した遺伝子のネットワークを決定した。また、STRING解析を用いて、抑制された細胞周期に関連する有意にダウンレギュレーションされ、相互連結した遺伝子は、有糸***紡錘体及びG2Mチェックポイントであることを示した。これらの知見は、MiMaCツールがhiPSC-CMsにおけるより成熟したトランスクリプトームを促進することを示している。
心臓成熟に重要な分子機構をよりよく理解するために、選択された6つのmiRsの重複する予測標的を決定した。予測標的の一つであるHOPX(図3H)は心筋芽細胞の分化に重要であるが(Jain, R., et al., HEART DEVELOPMENT. Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitment of cardiomyoblasts. Science, 2015. 348(6242): p. aaa6071)、この転写調節因子に関する研究は、後のプロセスであるヒトの心筋細胞の成熟には至っていない。本研究では、HOPX発現がインビトロ(図3I)、in vivo(図3J)、及びMiMaCで処理したhiPSC-CMs(図3K)でアップレギュレートされていることが見られた。選択されたMiMaC miRsがどのように成熟期にHOPX発現を個別に制御しているかを分析するために、HOPXレベルをmiR-122 KO及びLet7i OE hiPSC-CMsで分析した。その結果、D30のmiR-122 KO hiPSC-CMsではHOPXの発現が6.8倍に増加していたが、Let7i OEで成熟したhiPSC-CMs はHOPXの発現に影響はなかった(図示せず)。このデータは、Let7i OE成熟はHOPX心臓成熟パスウェイを支配していないことを示している。このことは、hPSC-CMsにおけるしっかりとした成熟効果を生成するために複数のmiRsを一緒に組み合わせる必要性を強調しており、HOPXはコミット後の心筋細胞の成熟のための強力な候補であるように思われる。
シングルセルRNA-配列解析(scRNA-Seq)を使用し、心筋細胞の成熟のメカニズムを解明し、MiMaCを構成する各miRがCMの成熟においてどのように振る舞うのかをよりよく理解するために、MiMaCツールを利用した。5つのグループのmiR処理したCMsを対象にscRNA-Seqを行った(EV, Let7i & miR-452 OE, miR-122 & -200a KO, MiMaC及びMiMaC + FA)。非バイアスクラスタリングを行い、miR摂動がCMをどのように変化させたかを調べた。5つのサブグループが発見され(図3L)、カイ二乗検定を使用して、miR摂動がこれら5つのクラスターの濃縮をもたらしたかどうかを評価した(図3M)。クラスター0と3ではEV群が、クラスター0と1ではLet7iとmiR-452 OE群が、クラスター0と3ではmiR-122と-200a KO群が、クラスター1と2ではMiMaCとMiMaC + FA群がそれぞれ濃縮されていた。クラスター4は主にリードカウントの悪い細胞で構成されており、それ以上の解析は行わなかった。各サブグループにおける細胞の運命を特徴づけると、細胞の大部分は心筋細胞であり、クラスター1の細胞のごく小さなサブセットは線維芽細胞(ENC1、DCN、THY1)と心外膜マーカー(WT1、TBX18)を示した(図示せず)。これらのデータは、乳酸濃縮プロトコルが、高度に濃縮された心筋細胞集団の生成に成功したことを示している。
miRで処理したCMsの非バイアス解析を行った結果、各miRの組み合わせによって異なる状態のCM成熟の濃縮がもたらされることが明らかになった。興味深いことに、Let7iとmiR-452 OEに富む心筋細胞クラスター1は、OXPHOSとMyc標的遺伝子のしっかりしたアップレギュレーションを示したが、ほとんどの心筋細胞成熟マーカーでは有意に増加していなかった(図3N及び3O)。従って、Let7iとmiR-452 OEで処理すると、代謝成熟を主導する力のある中間体成熟CMが形成された。これらのデータは、生じ得る中間体段階が、胎児様CMからより成熟したCMへの必要な移行段階であることを示唆しており、これにはOXPHOS遺伝子の一過性のアップレギュレーションが必要である。
MiMaCツールの作製によって、HADHA CM病因の研究が可能になった。未成熟なhPSC-CMsは脂肪酸酸化ができなかったため、WT CMsにおいて脂肪酸酸化を引き起こすMiMaCでHADHA Mut及びKO CMsを成熟させる必要があった。最初に、WT、HADHA Mut及びKO CMsの最大OCRを評価した。MiMaCで処理したWT CMsは、対照細胞と比較して、最大OCR(2.2倍の変化)が統計的に有意に増加した(図4A及び4B)。興味深いことに、HADHA KO CMsの最大OCRは落ち込んでいたのに対し、対照及びMiMaC処理したHADHA Mut CMsは、対照WT-CMsと同様の最大OCRを有していた。これらのデータは、Mut CMsとKO CMsにおけるHADHAのミトコンドリア活性の欠損を示唆している。
MTP欠損症の乳児は、出生後に原因不明の突然死を呈することがある。母乳中に含まれるATP生産の主な基質である脂質のストレスが、MTP欠損症による乳児の早期死亡を促進するのではないかと提案されている。この仮説に対処するために、グルコースを含む基本心臓培地(Glc+FA培地)に3種の長鎖脂肪酸の組み合わせ、パルミテート、オレイン酸、リノール酸(これらのFAは、母乳で育てられたヒトの乳児の血清中に最も豊富であるため)を添加した(Glc+FA培地)。パルミテートは、脂肪酸基質として、全ての長鎖遊離脂肪酸の36%を表す、新生児期に循環する最も豊富な脂肪酸の一つである。CMsをFAで処理すると脂質毒性を引き起こす可能性があるが、脂質毒性を引き起こさない3つの脂肪酸の濃度と組み合わせを慎重に開発した(図3L)。
Glc+FA培地で培養したHADHA Mut CMsがカルシウムサイクリングに異常を示したため、このCMsが電気生理学的に異常を示しているかどうかを評価した。電圧感受性蛍光色素Fluovoltを用いて膜電位の変化を測定した。HADHA Mut CMsは、電圧振幅の最大変化、最大脱分極に達するまでの時間、又は脱分極の速度に変化がなかったが(図4G及び4H)、再分極速度を調べるときに有意な差が観察された。波の持続時間(WD)50%(WD50)及び90%(WD90)は、HADHA Mut CMsにおいて、WT CMsと比較して有意に長かった(WD50については図4Iを参照。WD90についても同様の結果が観察された。図示せず)。これらのデータは、HAHDA Mut CMsにおいて再分極が障害されていたことを示している。この表現型は、カルシウムの筋小胞体への還流サイクルの障害に基づいた、観察された異常なカルシウム動態によって引き起こされ得る。
シングルセルRNA配列解析を、FAで処理したときにHADHA変異CM集団がどのように振る舞うかをよりよく理解するために行った。配列解析された細胞群のそれぞれを詳述するtSNEプロットは、WT及びHADHA Mut CMs間の明確な差異と、小さいが有意な重複を示した(図5A)。非バイアスクラスタリングを行うと、6つのクラスターが見出された(0はHADHA Mut CMs非複製、1はWT及びMut CMsの中間体成熟集団、2はHADHA Mut CMs複製、3は健康なCM、4は線維芽細胞様集団、5は上皮細胞様集団)(図5B及び5C)。
HADHA Mut及びKO CMsをグルコース培地のみで培養した場合、HADHA Mut及びKOではWT CMsと比較して明らかな欠損は見られなかった(図示せず。D24及びD30のWT、HADHA Mut及びHADHA KO hiPSC-CMsをグルコース培地で培養し共焦点画像を撮影し、αアクチニン及びアクチン(ファロイジン)の筋原線維染色を行ったところ、異常は認められなかった。ATP合成酵素βサブユニットによるミトコンドリア染色、ミトトラッカー染色により示されるミトコンドリア電位勾配はミトコンドリア異常を示さなかった)。しかしながら、FA培地中で6〜12日間培養すると、WT CMsは正常に見えたが、HADHA Mut及びKO CMsでは、サルコメア及びミトコンドリアの欠陥が顕在化した(図6A。図示せず。グルコース及び脂肪酸培地処理の6D後、HADHA Mut及びKO hiPSC-CMsは、あまり明確でないαアクチニン染色で見られるサルコメア破壊の兆候を示し、変異体のミトトラッカー染色で見られるミトコンドリアプロトン勾配の損失の開始を示した。ATP合成酵素βサブユニットはWTとHADHA Mut hiPSC-CMsの両方で正常なミトコンドリアネットワークを示したが、HADHA KO hiPSC-CMsではミトコンドリアネットワークの損失の開始があった。)12DのGlc+FA培地処理後、WT CMsは健全な筋原線維を有していたが、HADHA Mut CMsはα-アクチニン染色が点状になり、アクチンフィラメントの検出が困難になるなど、サルコメアの分解が見られた(図6A)。HADHA Mut及びKO CMsは長鎖FAを処理することができなかったとして、ミトコンドリアの健康を次に評価した。ミトコンドリアは、ミトコンドリアネットワークの存在を評価するためにATP合成酵素βサブユニットを用いて染色した。KO CMsは、6DのFAで、小さな、より円形のミトコンドリアへミトコンドリアネットワークを失っていたが、WTとHADHA Mut CMsの両方が多くの接続されたミトコンドリアを有していた。これらのミトコンドリアの機能性を評価するために、ミトコンドリアのプロトン勾配は、マイトトラッカーオレンジ染色を介して分析した。Glc+FAリッチメディアの12日間の後、HADHA Mut CMsは、ミトコンドリア膜プロトン勾配が高度に低下していた(図6A及び6B)。
慢性的にFAに曝されたHADHA Mut及びKO CMsの病理学的状態をよりよく理解するために、それらのミトコンドリアを機能的に評価した。Glc+FA処理したHADHA Mut及びKO CMsの最大OCRは、WT細胞に比べて有意に低下した(Mut CM:190pmoles/分/細胞、KO CM:125pmoles/分/細胞、WT CM:359pmoles/分/細胞、P<0.05)(図6F)。さらに、HADHA Mut CMsは、酸素依存性ATP生産の減少を示し(Mut CM:51pmoles/分/細胞、KO CM:43pmoles/分/細胞、WT CM:93 pmoles/分/細胞, P<0.05)(図6G)、HADHA Mut CMは、解糖能の減少を示した(Mut CM:14 mpH/分/細胞、KO CM:18 mpH/分/細胞、WT CM:23 mpH/分/細胞、Mut Vs WT P<0.05)(図示せず。マイトストレスアッセイを介して観察され、オリゴマイシンと2-デオキシ-D-グルコース後の細胞外酸性化率の差として計算された)。FAへの暴露がミトコンドリア膜電位の低下とATP生産の減少につながったので、増加したプロトンリークに部分的に起因する可能性があることが推測された。ATP合成酵素を抑制する場合(オリゴマイシン処理)と電子輸送鎖を抑制する場合(アンチマイシン、ロテノン)のOCRの違いを試験することで、HADHA Mut及びKO CMsはWT CMsに比べて有意に高いプロトンリークを示すことが示された(Mut CM:7.66pmoles/分/細胞、KO CM:10.52pmoles/分/細胞、WT CM:3.64pmoles/分/細胞、P<0.05)。これまでの研究では、ミトコンドリア標的ペプチドであるエラミプレチド(SS-31)が、ミトコンドリアの脱分極及びプロトンリークを防止できることが示されている。興味深いことに、HADHA Mut心筋細胞をエラミプレチド(SS-31)で1nM処理すると、Glc+FAを用いたMut CMsにおいて増加したプロトンリークがレスキューされた(図6H)。これらのデータは、FAに曝されたHADHA Mut及びKO CMsは、プロトンリークの増加に一部起因するミトコンドリア能の低下をもたらしたことを示唆している。
脂肪酸β酸化の第一段階の間に、アシル-CoAデヒドロゲナーゼは、α炭素とβ炭素の間に二重結合を生成する。従って、HADHAの破壊は、第一段階後にFA中間体の増大をもたらすはずである(図7A)。HADHA Mut及びKO CMsにおける長鎖脂肪酸酸化の破壊を評価するために、非標的リピドミック分析を行い、グローバルなリピドミック変化の特徴付けを行った。
カルジオリピン(CL)は、他のミトコンドリア機能とともに電子輸送鎖機能を維持するために、最適なミトコンドリア機能とホメオスタシスに不可欠なリン脂質である。CLはミトコンドリア内膜の主要なリン脂質で、ミトコンドリアで合成され、生後発育や疾患時にダイナミックにリモデリングされる(例えば、Kiebish, M.A., et al., Myocardial regulation of lipidomic flux by cardiolipin synthase: setting the beat for bioenergetic efficiency. J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97、及びHe, Q. and X. Han, Cardiolipin remodeling in diabetic heart. Chem Phys Lipids, 2014. 179: p. 75-81参照)。ヒトの心臓に最も多い種類のCLはテトラリノイル-CL(テトラ[18:2]-CL)である。糖尿病、虚血/再灌流、心不全などの心疾患、又はカルジオリピンリモデリング酵素タファジン(TAZ:バルト症候群を引き起こす)の特異的変異により、テトラ[18:2]-CL値が異常になる。特異的なカルジオリピンの成熟は、出生後早期のマウス心臓において観察される。本発明者らは、成熟パラダイムを用いて、脂肪酸をエネルギー源として利用可能なiPSC由来の心筋細胞(CM)の成熟段階に到達させた。様々な成熟パラダイムは、FAO段階だけでなく、カルジオリピン(CL)早期出生後リモデリングプロセスを模倣することができることが確認された(図8)。標的質量分析リピドミック解析を用いて、野生型(WT)CMの成熟は、以前に観察されたin vivo心筋細胞出生後成熟期の所見と同様に、テトラ[18:2]-CLの有意な増加をもたらすことが示された。これらのデータは、心筋細胞におけるCLの成熟がインビトロで誘導できることを示している。さらに、生後初期のin vivoの発達において示されるように、WT CMは[14:0]、[14:1]、[16:1]、及び[16:0]を有するほとんどのCLを減少させ(図8)、中間体[18:1][18:2][18:2][20:2]を含む炭素数18超のアシル鎖を有するCLを増加させることにより(図8)、そのCLプロファイルをシフトさせた。このCL成熟は成人のCLリモデリング段階には達していないが、観察された出生後の成熟は、正常及び病理学的変異体12-21の状況において、最終的にCMのCL成熟の第一段階を理解し、操作することを目的とした有益なアッセイとして機能する。標的リピドミクスを用いて、FAを添加した場合と添加していない場合のWT CMsを解析した。FA処理したWT CMsは、in vivoの心筋細胞の出生後成熟期において以前に観察された所見と同様に(Kiebish, M.A., et al., J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97、及びHe, Q. and X. Han, Chem Phys Lipids, 2014. 179: p. 75-81, supra参照)、テトラ[18:2]-CLの有意な増加をもたらした(図7F)。これらのデータは、心筋細胞におけるCL成熟がインビトロで誘導され得ることを示している。しかしながら、FA処理後のHADHA KO CMsは、WT FA処理CMsと比較して、テトラ[18:2]-CLの量を増加させることができなかった。さらに、出生後のin vivoの発達において示されるように、WT CMは、[16:1]を有するCLの有意な減少を示し、中間体[18:1][18:2][18:2][20:2]を含む18超の炭素を有するCLの増加を示す、より成熟したCLプロファイルにシフトする(Kiebish, M.A., et al., J Biol Chem, 2012. 287(30): p. 25086-97参照)。しかしながら、HADHA KO CMsは、WT CMsと同様に効率的にCLプロファイルをリモデリングすることができなかった(図7G)。これらのデータは、驚くべきことに、長鎖FAOにおけるその役割に加えて、HADHAが心筋細胞のCLリモデリングプロセスにも必要であることを示している。
HADHAを欠くことによりカルジオリピンのプロファイルがどのように変化しているかをよりよく理解するために、HADHA Mut及びKO CMsにおいてどのような新しいCL種が濃縮したかを調べた。14:0及び16:0などの飽和脂肪酸のアシル鎖を持つCL種は、HADHA Mut及びKO CMにおいて濃縮されていた(図7I, J)。18:0を有するCLのアシル鎖は確認されなかった。典型的には、複数飽和脂肪酸アシル鎖(CLSat)を有する新生CLは、カルジオリピン合成酵素(CLS)から合成されている(例えば、図7Kを参照)。CLSatのリモデリングプロセスの間に、飽和脂肪酸アシル鎖は不飽和脂肪酸アシル鎖に置換される。これらのデータは、HADHA変異体における新生CLSatの蓄積を示唆する。
本研究では、MiMaC成熟hiPSC-CMsを用いた初のヒトMTP欠損心臓モデルをインビトロで開発し、長鎖FAO及びCLリモデリングにおけるTFPα/HADHA欠損が前不整脈状態を示唆する不規則な拍動のような疾患を引き起こすことを発見した。さらに、その作用機序を明らかにした(HADHAの変異は、アシル-CoAトランスフェラーゼ活性により、主要なリン脂質であるカルジオリピンの組成に異常をきたした)。CL組成の異常は、ミトコンドリアクリステの欠陥とミトコンドリアのプロトン勾配の大きな低下をもたらす。このミトコンドリアの欠陥は、サルコメアの分解、カルシウムハンドリング欠陥、及び電気生理学として現れた。カルシウムの保存と再分極の遅れは、心筋細胞の不均一な拍動パターンに寄与し、その結果、SIDSのMTP欠損新生児に見られる組織レベルの不整脈を誘発し得る。
hESC及びhiPSC並びに心臓分化
コンクリンラボラトリーで以前に得られたhESC株RUES2(NIHhESC-09-0013)及びhiPSC株WTC#11(Kreitzer, F.R., et al., A robust method to derive functional neural crest cells from human pluripotent stem cells. Am J Stem Cells, 2013. 2(2): p. 119-31)を、mTeSR培地(StemCelll Techellogencess)中のMatrigel成長因子還元基底膜マトリックス(Corning)上で培養した。以前に行ったように、単層ベースの直接分化プロトコールを用いて、hESC-CMsとhiPSC-CMsを生成した(Palpant, N.J., et al., Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nat Protoc, 2017. 12(1): p. 15-31)。以前に行ったように、hiPSC-CMカルジオリピンアッセイを、低分子単層ベースの直接分化プロトコールで行った(Burridge, P.W., et al., Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 855-60)。分化後15日目に、乳酸選択プロセスを用いてhPSC-CMを心筋細胞集団に濃縮した(Tohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127-37)。心筋細胞集団を40〜60%の範囲で生成し、これを乳酸濃縮の4日後に75〜80%の心筋細胞に濃縮した。
LentiCrisprV2プラスミド(Sanjana, N.E., O. Shalem, and F. Zhang, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods, 2014. 11(8): p. 783-4)(Addgeneプラスミド# 52961)を用いて、HADHAのエクソン1を標的とする2つの異なるgRNAを、CRISPRScanを用いて設計した(Moreno-Mateos, M.A., et al., CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods, 2015. 12(10): p. 982-8)。gRNAの配列は表1に記載されている。gRNA及びCas9発現プラスミドをGeneJuice(EMD Millipore)を用いてWTC株に一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、WTCを2日間ピュロマイシン選択し、クローナリーエクスパンドした。クローンのDNAを単離し、ターゲティングガイドの周囲の領域をPCR増幅し(表1のガイドを参照)、配列決定を行い、HADHAのエクソン1におけるCRISPR-Cas9システムによって生成された挿入及び欠失エラーを測定した。ウエスタン分析を行い、HADHA変異体中のHADHA蛋白質のレベルを測定した。gRNA1実験から31クローンを配列決定のために送り、6クローン(19%)には変異がなかったが、25クローン(81%)には変異が見られた。gRNA2では、24クローンを配列決定のために送り、1クローンには突然変異がなかった(4%)が、23クローン(96%)には突然変異が見られた。変異株のうち2株を本研究でさらに分析した。
HADHA gRNAの潜在的なオフターゲットを Crispr-RGENのCas-OFFinderツール(Bae, S., J. Park, and J.S. Kim, Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics, 2014. 30(10): p. 1473-5)を用いて同定した。次に、トップ予測されたオフターゲットをGoTaq PCRで増幅し、配列決定した。オフターゲットプライマーは、表2に記載されている。
Trizolを用いてRNAを細胞から抽出し、7300リアルタイムPCRシステム(Appplied Biosystems)を用いてSYBRグリーンqPCRで分析した。使用したプライマーを表3に示す。全てのqPCR実験の線形発現値は、デルタ-デルタCt法を用いて計算した。
細胞を、20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、15%グリセロール、1% Triton X-100、1Mβ-グリセロールフォスフェイト、0.5M NaF、0.1Mピロリン酸ナトリウム、オルトバナデート、PMSF及び2% SDSを含む溶解バッファーを用いてプレート上で直接溶解した(Moody, J.D., et al., First critical repressive H3K27me3 marks in embryonic stem cells identified using designed protein inhibitor. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017)。25Uのベンゾナーゼヌクレアーゼ(EMD Chemicals, Gibbstown, NJ)を使用直前の溶解バッファーに添加した。蛋白質は、BSA(ウシ血清アルブミン)を標準として、EnWallac Visionを用いて、ブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad)により定量した。蛋白質サンプルを4×Laemmliサンプルバッファーと混合し、加熱(95℃、5分)し、SDS-PAGE(プロテアンTGXプレキャスト4%-20%グラジエントゲル、Bio-Rad)に供し、セミドライトランスファー(Bio-Rad)によりニトロセルロースメンブレン(Bio-Rad)に転写した。メンブレンを5%ミルクで1時間ブロッキングし、一次抗体を4℃で一晩インキュベートした。次に、膜を二次抗体(1:10000、ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウスIgG HRP複合体(Bio-Rad))で1hrインキュベートし、イモビロン-ルミノール試薬アッセイ(EMD Millipore)を用いて検出を行った。一次抗体は以下の通りである。アルファチューブリン抗体 セルシグナリングテクノロジーズ(2144) 1:2000、ベータチューブリン プロメガ(G7121)抗マウス1:4000、ベータアクチン セルシグナリングテクノロジーズ(4970) 1:4000、HADHAアブキャム(ab54477抗ウサギ1: 1000、UCP3アブキャム(ab3477)抗ウサギ1:200、SLC25A4 (ANT1) シグマ(SAB2105530)抗ウサギ1:1000、OXPHOS MitoSciences (MS604/G2830)抗マウス1:1000、抗GFPインビトロジェン(A-11122)抗ウサギ1:1000。
LentiCrisprV2プラスミド(Addgene 52961)を用いて、マイクロRNA-141、-200a、-205及び-122をノックアウト(KO)した。プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)NGGカットサイトが隣接しているか、成熟マイクロRNAのシード領域にあるかのいずれかを有する各miRのためのgRNAを試験のために選択した。各miRのグローバルな減少は、各miRの成熟形態に対して特異的なプローブを用いたTaqMan RT-qPCRを介して評価した。
HEK 293FT細胞をトランスフェクションの1日前にプレーティングした。トランスフェクションの日に、選択したOE又はKOプラスミドを、1μgのDNAあたり1μg/μLのポリエチレニミン(PEI)の存在下で、パッケージングベクターpsPAX2(psPAX2はDidier Trono Addgeneプラスミド#12260由来)及びpMD2.G(pMD2.GはDidier Trono Addgeneプラスミド#12259由来)と混合した。培地を24時間後に変更し、トランスフェクションの48時間後及び72時間後にレンチウィルスを収集した。ウィルス粒子をPEG-it(System Biosciences, Inc)を用いて濃縮した。
hiPSC-CMをヘキサジメトリンブロマイド(Polybrene, 6μg/ml)の存在下での誘導後14日目に形質導入した。レンチウィルスを17〜24時間アプライし、その後除去した。細胞をさらに2週間培養した。心筋細胞の濃縮された集団を得るために乳酸選択を採用した(Tohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127-37)。ベクターをポジティブに組み込んだ細胞を選択するためにプロマイシン選抜を行った。2週間の培養後、エンドポイント分析のために細胞を収集した。MiMaC群のために、hiPSC-CMを低用量の4種類の異なるレンチウィルスを同時に形質導入した一方で、対照を両方の対照ベクター(pLKO.1及びLentiCRISPRv2エンプティベクター)で形質導入した。
細胞を4%(vol/vol)パラホルムアルデヒドで固定し、5%(vol/vol)正常ヤギ血清(NGS)で1時間ブロッキングし、1%NGS中の一次抗体とともに一晩インキュベートした後、NGS中で二次抗体染色を行った。CMエリアの測定はイメージJソフトウェアを用いて行った。ミトトラッカー強度の定量化は、イメージJソフトウェアを用いて、共局在化の定量化に関する以前に公表された方法に従って行った(Li, Q., et al., A syntaxin 1, Galpha(o), and N-type calcium channel complex at a presynaptic nerve terminal: analysis by quantitative immunocolocalization. J Neurosci, 2004. 24(16): p. 4070-81)。解析は、ライカTCS-SPE共焦点顕微鏡で、40x又は63xオブジェクティブとライカソフトウェアを用いて行った。使用した一次抗体は以下のとおりである。αアクチニン1:250シグマA7811抗マウス、HADHA 1:250アブキャムab54477抗ウサギ、ATPシンターゼβ 1:250アブキャムab14730抗マウス、チチン1:300ミオメディックスTTN-9 (cTerm)抗ウサギ、GFP 1:300インビトロジェンA-11122抗ウサギ。使用した二次抗体及びその他の試薬は以下の通りである。0.02μg/mlの濃度のDAPI、ファロイジンアレキサフルオロ568 1:250、アレキサフルオロ488又は647結合ヤギ抗マウス及び抗ウサギ二次抗体1:500(Molecular Probes)。B27+インスリンサプリメントを添加したRPMI中で300nMの最終濃度で使用したMitotrackerCMTMRos Life technologies(M7510)を、固定化の前に45分間細胞とインキュベートした。
自発的に拍動している心筋細胞の電気生理学的記録を、AxISソフトウェア(Axion Biosystems)を用いて2分間収集した。生データ収集後、シグナルをバターワースバンドパスフィルタと90μVスパイク検出閾値を用いてフィルタリングした。フィールド電位持続時間は、ポリノミアルフィットT波検出アルゴリズムを用いて自動的に決定した。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロポストのアレイを以前に記載されたように作製した(Beussman, K.M., et al., Micropost arrays for measuring stem cell-derived cardiomyocyte contractility. Methods, 2016. 94: p. 43-50)。マイクロポストの先端をマウスラミニン(Life Technologies)でコーティングし、B27サプリメント及び10%ウシ胎児血清を添加したRPMI培地中で約75,000/cm2の密度でAttofluor(R)ビューイングチャンバー(Life Technologies)中のマイクロポスト上に細胞を播種した。次の日、培地の除去し、1日おきに血清フリーRPMI培地と交換した。細胞の拍動が再開したら(典型的には、播種後3〜5日)、個々の細胞の収縮を、60倍の水浸漬オブジェクティブを使用した、ニコンエクリプスTi正立顕微鏡に装着した浜松ORCA-Flash2.8サイエンティフィックCMOSカメラを用いて(70 FPSの最小値で)イメージングした。イメージングの前に、細胞培養培地を1.8 mMのCa2+を含むTyrodeバッファーに交換し、ライブセルチャンバーをイメージングプロセスを通して37℃で細胞を維持するために使用した。個々のセル下の各ポストiの偏向Δiを追跡するために、カスタム記述されたmatlabコードを使用し、合計のトゥイッチ力を計算した(
ここで、
でポスト間の間隔は6μmであった)。
シーホースXF96細胞外フラックス分析装置を、以前に記載されたようにミトコンドリア機能を評価するために使用した(Kuppusamy, K.T., et al., Let-7 family of microRNA is required for maturation and adult-like metabolism in stem cell-derived cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015)。プレートを1:60希釈したマトリゲル還元成長因子(Corning)で前処理した。分化後約28日目に、心筋細胞を、XF96ウェルあたり50,000細胞の密度でプレート上に播種した。シーホースアッセイを、XF96ウェルプレートへの播種から3日後に実施した。アッセイの1時間前に、培地をベース培地(緩衝化されていないDMEM)に交換した。アッセイの1時間前に、培地を、ピルビン酸ナトリウム(ギブコ/インビトロジェン、1mM)、及び25mMグルコース(MitoStressアッセイ用)、パルミテートアッセイ用の0.5mMカルニチンを含む25mMグルコースを添加したベース培地(非緩衝化DMEM;シーホースXFアッセイ培地)で交換した。基質及び阻害剤の注入を、1μMの4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP; Seahorse Biosciences)、MitoStressアッセイ(パルミテートアッセイのための200mMパルミテート又は33μMBSA、及び50μMエトモキシル(ETO))のためのオリゴマイシン(2.5μM)、アンチマイシン(2.5μM)、及びロテノン(2.5μM)の最終濃度を達成するために、測定中に行った。OCR値は、さらに、355nm励起及び460nm発光における蛍光を用いた測定で、Hoechst染色(Hoechst 33342;シグマ-アルドリッチ)によって定量化し、各ウェル中に存在する細胞の数に正規化した。最大OCRは、オリゴマイシン添加後のOCRと比較したFCCPへの応答におけるOCRの変化として定義される。ATP生産は、基礎呼吸とオリゴマイシン添加後の呼吸との差で計算した。プロトンリークは、オリゴマイシン添加後とアンチマイシン及びロテノン添加後の呼吸の差で計算した。パルミテートをエネルギー源として利用するための細胞容量は、2回目のパルミテート添加後の平均OCRと2回目のパルミテート添加前の最終呼吸値との間の差で計算した。試薬は、特に示されていない限り、シグマ製であった。
30日目のhiPSC-CMをRNA調製及びゲノムワイドRNA-seq(>2000万リード)のために収集した。RNA-seqサンプルは、Tophatバージョン2.0.13を使用してhg19にアラインメントした(Trapnell, C., L. Pachter, and S.L. Salzberg, TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics, 2009. 25(9): p. 1105-11)。ゲノムレベルリード数は、Ensembl GRCh37遺伝子アノテーションを用いたhtseq-count(Anders, S., P.T. Pyl, and W. Huber, HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, 2015. 31(2): p. 166-9)を用いて定量した。各二値比較におけるRNA-seqサンプル全体の正規化リードカウント1以上の総発現を有する遺伝子をDESeqを用いた差分解析のために保持した(Anders, S. and W. Huber, Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol, 2010. 11(10): p. R106)。主成分分析にはRのPrincomp関数を使用した。Gene Ontology濃縮分析にはTopGO Rパッケージ(Alexa, A., J. Rahnenfuhrer, and T. Lengauer, Improved scoring of functional groups from gene expression data by decorrelating GO graph structure. Bioinformatics, 2006. 22(13): p. 1600-7)を使用した。miR摂動による心臓成熟経路への影響を評価するために、各条件をエンプティベクター(EV)と比較し、アップレギュレーション遺伝子(>1.5倍変化)とダウンレギュレーション遺伝子(<-1.5倍変化)を同定した。アップレギュレート遺伝子とダウンレギュレート遺伝子を別々に、心臓の成熟に有益なパスウェイのキュレーションされたセットに対する濃縮のためにハイパージオメトリック検定を実行した結果、m×nのマトリクスが得られた。ここで、mは経路の数(m=7)、nは条件の数(n=6、EVを含む)である。アップレギュレーション遺伝子とダウンレギュレーション遺伝子の濃縮p値の間の比の負のlog10を計算して、治療の全体的な「利益」を表した。正の値が大きい(>0)場合は、治療の結果、心臓成熟経路の遺伝子のダウンレギュレーションよりもアップレギュレーションの方が多いことを意味し、負の値が大きいほど、心臓成熟経路における遺伝子のダウンレギュレーションが多いことを意味する。
シングルセルRNA-seq生データを10X GenomicsのCellRangerパイプラインを介して処理する。CellRangerパイプラインのアウトプットをSeurat Rパッケージを使用してさらに解析した(Satija, R., et al., Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol, 2015. 33(5): p. 495-502)。リードの40%超がミトコンドリア遺伝子にマップされている細胞、検出された遺伝子が200個未満、又はユニーク分子識別子(UMI)が2000個未満の細胞は除去した。残りの細胞をUMIの数とミトコンドリア遺伝子にマップされた%によってスケーリングした。成熟シングルセルRNA-seqデータのtSNE解析のパラメータは、2905上位可変遺伝子、上位10主成分、分解能0.5であった。HADHA変異体単細胞RNA-seqデータのtSNE解析のためのパラメータは、3375上位変数遺伝子、上位10主成分、及び分解能0.4であった。クラスタリングにおける細胞周期の影響を評価するために、Kowalczyk et al(Kowalczyk, M.S., et al., Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Res, 2015. 25(12): p. 1860-72)の細胞周期遺伝子とSeuratパッケージのCellCycleScoring機能を使用した。いずれかのクラスタ内の細胞の少なくとも25%で検出され、偽発見率<0.1を有する遺伝子を、差異的に発現していると定義する。発現値は、ヒートマップにプロットされた全細胞にわたる各遺伝子について正規化されている(即ち、Zスコア)。ヒトのin vivo成熟化マーカーは、ロードマップエピゲノミクスプロジェクト(Roadmap Epigenomics, C., et al., Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature, 2015. 518(7539): p. 317-30)の胎児心臓と比較して成人心臓でアップレギュレーションされた遺伝子に基づいている。マウスのin vivo成熟化マーカーは、DeLaughter et al(DeLaughter, D.M., et al., Single-Cell Resolution of Temporal Gene Expression during Heart Development. Dev Cell, 2016. 39(4): p. 480-490)によるin vivo心筋細胞シングルセルRNA-seqデータでアップレギュレートされた遺伝子に基づいている。胎児に比べて成人心臓で有意に高い遺伝子をDESeqを用いて選択した(成人では2倍高い、FDR <0.05)。その後、これらの遺伝子を各scRNA-seqクラスタの中で最も高発現の上位30遺伝子と交差させ、図3Oのヒートマップ用の最終的な遺伝子リストを得た。Gene Ontology濃縮はTopGOパッケージ(Alexa, A., J. Rahnenfuhrer, and T. Lengauer, Improved scoring of functional groups from gene expression data by decorrelating GO graph structure. Bioinformatics, 2006. 22(13): p. 1600-7)を用いて行った。
心筋細胞をマトリゲルコーティングされた丸いガラスカバースリップ上にプレーティングした。心筋細胞をチロードバッファー(1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、5.4mM KCl、140mM NaCl、0.33mM NaH2PO4、10mM HEPES、5mMグルコース、pH to 7.4)中の1mM Fluo-4 AM(ライフテクノロジーズ、F14201)とともに37℃で25分間インキュベートした。その後、基材をイメージングのための事前に温められたチロードバッファーで新鮮な60ミリメートルペトリディッシュに移した。サンプルは、ニコンエクリプスTi正立顕微鏡に装着した浜松ORCA-Flash2.8サイエンティフィックCMOSカメラを使用してイメージングした。ビデオは40x水浸漬オブジェクティブを用いて、少なくとも20フレーム/秒のフレームレートで撮影した。蛍光パワーはブリーチせずに偏光解消中の蛍光変化を十分に捕捉できるように調整し、全ての実験で同じ蛍光パワーを使用した。心筋細胞を0.5Hz又は1Hzのいずれかの炭素電極(Ladd Research、30250)を用いて5V/cmで二相的に刺激し、少なくとも5つの拍動を分析のために各ビデオ間でキャプチャした。
細胞をカコジル酸ナトリウムバッファー中の4%グルタルアルデヒドで固定し、オスミウムテトロキシドでポスト固定し、1%酢酸ウラニルでエンブロック染色し、一連のエタノールで脱水し、エポンアラルダイトに包埋しだ。70nmセクションをライカEM UC7ウルトラマイクロトームで切断し、JEOL 1230 TEMで観察した。
ベース培地(グルコース培地と称する)はインスリンを添加したB27を添加したRPMI培地である。脂肪酸培地はBSAに結合したオレイン酸(シグマO3008)12.7μg/ml、BSAに結合したリノール酸(シグマL9530)7.05μg/ml、BSAに結合したパルミテートナトリウム(シグマP9767)52.5μM、L-カルニチン125μMを有するグルコース培地である。
SS-31をStealth BioTherapeuticsから入手し、PBSに溶解した。1nMの最終濃度を実験に使用した。
各ボックスプロットの'x'は平均値を示し、横棒は中央値を示し、外れ値は示されていない。*はP<0.05を示す。
棒グラフは平均±SEMを示す。SEMを示さない棒グラフは、1サンプル又は2サンプルのRNA配列解析データから生成されたものである。
蛋白質アソシエーションマップをSTRINGバージョン10.5を使用して生成した。各図では、互いに接続された遺伝子は、互いに関連性を有する。作用効果は3つある。矢印->正、--| -負、及び最後に丸をつけた線-不特定。また、8種類の作用があり、それを線の色で表す。緑-活性、青-結合、シアン-表現型、黒-反応、赤-抑制、紫-触媒作用、ピンク-翻訳後修飾、及び黄色-転写調節。筋構造の発達と細胞外マトリックスの組織化について、MiMaCによって有意に変化した遺伝子を同定するためにKmeansクラスタリングを使用した。マルコフクラスタリングアルゴニズム(MCL)を細胞***を制御するためにMiMaCがダウンレギュレーションした遺伝子を同定するために使用した。
統計解析をNが3以上の実験で行った。P値はスチューデントのt検定又はワンウェイANOVAを用いて計算した。スチューデントのt検定はシャピロ-ウィルク正規性検定を実施した。ワンウェイANOVAはコルモゴロフ-スミルノフ正規性検定を実施した。多重比較のために、ホルム-シダック法を使用した。正規性検定に失敗したワンウェイANOVA分析のために、順位に基づく分散分析のクラスカル-ウォリスワンウェイANOVAが実行された。多重比較はダンの手法を使用した。全ての統計検定はα=0.05を使用した。
12D Glc+FA培地で処理した野生型(WT)hiPSC-CMs並びに6D及び12D Glc+FA培地で処理したHADHA Mut hiPSC-CMsを使用した。抽出の直前に、各細胞ペレットを40μLのDMSOに溶解し、超音波処理により膜を破壊した。細胞は、20秒オン、10秒オフで構成される3つのサイクルを使用して超音波処理にかけた。超音波処理の間、細胞を氷上に保つように注意した。振とう後、懸濁液を2mLのガラス製LCバイアルに移した。
100万個の細胞を、-20°CでPE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)、PC(17:0/0:0)、C17 スフィンゴシン、セラミド(d18:1/17:0)、SM (d18:0/17:0)、パルミチン酸-d3、PC (12:0/13:0)、コレステロール-d7、TG (17:0/17:1/17:0)-d5、DG (12:0/12:0/0:0)、DG (18:1/2:0/0:0)、MG (17:0/0:0/0:0)、PE (17:1/0:0)、LPC (17:0)、LPE (17:1)の内部標準液を含む225μlメタノール、及び-20°Cで内部標準コレステロールエステル22:1を含む750μl MTBE(メチルターシャリーブチルエーテル)(シグマアルドリッチ)で抽出した。細胞を20秒間ボルテックスし、5分間超音波処理し、オービタルミキシングチリング/ヒーティングプレート(Torrey Pines Scientific Instruments)を用いて4℃で6分間振盪した。次に、188μlのLC-MSグレードの水(Fisher)を加えた。サンプルをボルテックスし、14,000 rcf(エッペンドルフ5415D)で遠心分離した。上部(非極性、有機)相を2個の350μLアリコートに集め、蒸発させて乾燥させた。1つの有機相アリコートを、50 ng/mlのCUDA((12-[[(シクロヘキシルアミノ)カルボニル]アミノ]-ドデカン酸)(Cayman Chemical)を含む100μLのメタノール:トルエン(9:1、v/v)混合物に再懸濁した。次に、サンプルをボルテックスし、5分間超音波処理し、16,000 rcfで遠心分離し、リピドミック分析のために調製した。方法ブランク及びプールされたヒト血漿(BioreclamationIVT)を品質管理サンプルとして含めた。6テクニカルレプリケートでWT FA CM, HADHA Mut 12D FAはn=2、HADHA KO CMはn=3、及びHADHA Mut 6D FAはn=2であった。
再懸濁したサンプルを、ESIのポジティブモードとネガティブモードについて、それぞれ3μLと5μLでWaters Acquity UPLC CSH C18(長さ100mm×内径2.1 mm、粒径1.7μm)に注入し、さらにWaters Acquity VanGuard CSH C18プレカラム(5mm×内径2.1 mm、粒径1.7μm)を65℃に維持した状態でVanquish UHPLCシステムに接続した。脂質カバレッジを向上させるために、ポジティブモード及びネガティブモード分析に異なる移動相修飾剤を使用した(Cajka, T. and O. Fiehn, Increasing lipidomic coverage by selecting optimal mobile-phase modifiers in LC-MS of blood plasma. Metabolomics, 2016. 12(2): p. 34)。ポジティブモードには10mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸を、ネガティブモードには10mM酢酸アンモニウム(シグマ-アルドリッチ)を使用した。ポジティブモード及びネガティブモードともに、(A) 60:40 v/v アセトニトリル:水(LC-MSグレード)、及び(B) 90:10 v/vイソプロパノール:アセトニトリルの同じ移動相成分を使用した。0分15%(B)、0-2分30%(B)、2-2.5分48%(B)、2.5-11分82%(B)、11-11.5分99%(B)、11.5-12分99%(B)、12-12.1分15%(B)、及び12.1-15分15%(B)でグラジエントを開始した。流速は0.6 mL/minを使用した。データ収集にはQ-Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap質量分析計を以下のパラメータで使用した。質量範囲m/z 100-1200、MS1分解能60,000、データ依存MS2分解能15,000、NCE 20、30、40、標的/MS1スキャン、ガス温度369℃、シースガス流量(窒素)60単位、補助ガス流量25単位、スウィープガス流量2単位、スプレー電圧3.59kV。
デコンボリューション、ピークピッキング、アラインメント、及び同定のために、MS-DIAL(Tsugawa, H., et al., MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nat Methods, 2015. 12(6): p. 523-6)を使用して非標的リピドミックデータ処理を行った。mspフォーマットのMS/MSスペクトルデータベース(Kind, T., et al., LipidBlast in silico tandem mass spectrometry database for lipid identification. Nat Methods, 2013. 10(8): p. 755-8)に加えて、インハウスm/z及び保持時間ライブラリを使用した。各群のサンプルの少なくとも50%に存在する場合に特徴が報告された。統計分析は、既知の合計を使用してデータを正規化するか、各サンプルをスケーリングするためのmTIC正規化によって最初に行われた。正規化されたピーク高さは、統計解析のためにRに提出された。ANOVA分析は、FDR補正及びポストホックテストを用いて実施した。
説明の目的のためだけに、本明細書の開示によって包含される例示的な実施形態の非限定的なリストは、以下を含む。
A1. 心筋細胞の成熟を誘導する方法であって、未成熟な心筋細胞にLet7iマイクロRNA(miRNA)の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの2つ以上を誘導する工程を含む、方法。
A2. 未成熟な心筋細胞に、Let7iのmiRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの3つ以上を誘導する工程を含む、実施形態A1の方法。
A3. 未成熟な心筋細胞にLet7i miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む、実施形態A1又はA2の方法。
A4. 過剰発現を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むベクターを接触させる工程を含む、実施形態A1〜A3の1項に記載の方法。
A5. 前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸の一過性の発現を促進するように構成されている、実施形態A4の方法。
A6. 前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸が未成熟な心筋細胞のゲノムに組み込まれるように構成されたウィルスベクターである、実施形態A4又はA5の方法。
A7. 前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである、実施形態A4〜A6の方法。
A8. miRNAの発現低下を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする核酸断片、又は発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする転写物をコードする核酸を含むベクターを接触させる工程を含む、実施形態A1〜A7の1項に記載の方法。
A9. 発現低下を誘導する工程が、前記miRNAをコードする遺伝子のノックアウトを実施する工程を含む、実施形態A1〜A8の1項の方法。
A10. 前記発現低下を誘導する工程が、ヌクレアーゼ酵素、及び前記ヌクレアーゼ酵素による発現低下の標的となるmiRNAをコードする核酸の特異的切断を促す配列を有するガイド核酸、を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程を含む、実施形態A1〜A9の1項に記載の方法。
A11. ヌクレアーゼ酵素を揺する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ヌクレアーゼ酵素又は前記ヌクレアーゼ酵素をコードするベクターを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記酵素の発現を促進するように構成される、実施形態A1〜A10の1項の方法。
A12. ガイド核酸を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ガイド核酸又は前記ガイド核酸をコードするベクターを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記ガイド核酸の発現を促進するように構成される、実施形態A10の方法。
A13. 前記ヌクレアーゼ酵素が、Cas9又はTALENSのようなエンドヌクレアーゼである、実施形態A10又はA11の方法。
A14. 前記ベクターがウィルスベクターである、実施形態A8〜A12の1項に記載の方法。
A15. 前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである実施形態A14の方法。
A16. 前記未成熟な心筋細胞が幹細胞に由来する、実施形態A1〜A15の1項の方法。
A17. 前記未成熟な心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する実施形態A1〜A16の1項の方法。
A18. 前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、実施形態A16又はA17の方法。
A19. 前記未成熟な心筋細胞と、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸から選択される2種以上の長鎖脂肪酸とを接触させる工程をさらに含む、実施形態A1〜A18の1項の方法。
A20. 1種以上の前記長鎖脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸を含む、実施形態A19の方法。
A21. 前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態A1〜A20の1項に記載の方法。
A22. 前記遺伝子異常が、前記心臓の代謝又は病理学的疾患状態に関連している、実施形態A21の方法。
A23. 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、実施形態A22の方法。
A24. 前記心筋細胞が、HADHA、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOの1つをコードする遺伝子の変異を含む、実施形態A22の方法。
B1. 実施形態A1〜A24の1項に記載の任意の方法により生産された心筋細胞。
B2. 前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態B1の心筋細胞。
B3. 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、実施形態B2の心筋細胞。
B4. 前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、実施形態B3の心筋細胞。
C1. 成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態を有する対象の治療方法であって、実施形態B1に記載の心筋細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
C1. 前記対象は、損傷した心臓組織又は細胞を有する、実施形態C1の方法。
C2. 前記対象が糖尿病、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、ミトコンドリア疾患を有する、及び/又は梗塞に罹患している、実施形態C1又はC2の方法。
C3. 前記ミトコンドリア疾患が脂肪酸酸化(FAO)障害である、実施形態C1〜C3の1項の方法。
C4. 前記対象が、HADHAをコードする遺伝子の変異を有する、実施形態C1〜C4の1項の方法。
C5. 前記対象が不整脈を経験する、実施形態C1〜C5の1項の方法。
C6. 前記対象は乳幼児突然死症候群(SIDS)のリスクが高い、実施形態C1〜C6の1項の方法。
D1. 心臓機能の調節のための化合物をスクリーニングする方法であって、
実施形態B1〜B4の1項に記載の1つ以上の心筋細胞を候補薬剤と接触させる工程、及び
前記1つ以上の心筋細胞における心臓機能パラメータを測定する工程、
前記心臓機能パラメータの変化が、前記候補薬剤が心臓機能を調節することを示す、方法。
D2. 前記成熟した心筋細胞が遺伝子異常を有する、実施形態D1の方法。
D3. 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、実施形態D1又はD2の方法。
D4. 前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、実施形態D1〜D3の1項の方法。
D5. 前記心臓機能パラメータが、脂質プロファイル、カルジオリピンプロファイル、代謝プロファイル、酸素消費率、ミトコンドリアプロトン勾配、収縮力、カルシウム輸送、伝導速度、グルコースストレス、及び細胞死を含む、実施形態D1〜D4の1項の方法。
E1. 対象におけるミトコンドリア脂肪酸酸化(FAO)障害の治療方法であって、対象のミトコンドリアのカルジオリピンプロファイルを安定化する、又は成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む。
E2. 前記FAO障害が、糖尿病、心不全、神経変性、高齢化、先天性心疾患、虚血、ミオパシー、及び/又は梗塞のインスタンスと関連している、実施形態E1の方法。
E3. 前記FAO障害が脂肪酸(FA)β酸化障害である実施形態E1又はE2の方法。
E4. 前記ミトコンドリア障害の表現型が、乳幼児突然死症候群のリスクの増加と関連している、実施形態E1〜E3の1項の方法。
E5. カルジオリピンプロファイルを安定化する工程が、カルジオリピンの酸化を防止する工程を含む、実施形態E1〜E4の1項の方法。
E6. 組成物がエラミプレチドであるか、又は含む、実施形態E1〜E4の1項の方法。
F1. 培養心筋細胞の病理学的状態を検出する方法であって、心筋細胞におけるカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含み、ここで、炭素数18超のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態の低下を示す、方法。
F2. 前記カルジオリピンの増加又は減少は、野生型の未成熟な心筋細胞に対して相対的なものである、実施形態F1の方法。
F3. 前記培養心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する、実施形態F1又はF2の方法。
F4. 前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、実施形態F3の方法。
F5. 前記病理状態がミトコンドリア機能障害と関連している、実施形態F1〜F4の1項の方法。
F6. 前記ミトコンドリア機能障害がミトコンドリア三機能蛋白質欠損症である、実施形態F5の方法。
F7. 前記培養心筋細胞と、前記培養心筋細胞の病理学的状態を低下させるための候補薬剤とを接触させる工程をさらに含む、実施形態F1〜F6の1項の方法。
F8. 前記培養心筋細胞の病理学的状態に関する前記候補薬剤の効果を確認するために、前記培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程の前、途中、及び/又は後に、前記培養心筋細胞のカルジオリピンプロファイルを複数回測定する工程を含む、実施形態F7の方法。
G1. 培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物であって、Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの2つ以上を含む、組成物。
G2. Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの3つ以上を含む、実施形態G1の組成物。
G3. Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトを含む、実施形態G1又はG2の組成物。
G4. 前記マイクロRNAをコードする及び/又はオリゴマーをコードする核酸コンストラクトが、それぞれ1つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結している、実施形態G1〜G3の1項の組成物。
G5. 1以上の前記コンストラクトが、細胞への送達のために構成された1以上のベクターに組み込まれている、実施形態G1〜G4の1項の組成物。
G6. 前記1種以上のベクターがウィルスベクターである、実施形態G5の組成物。
G7. 少なくとも1つのウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はAAVベクターである、実施形態G5又はG660の組成物。
G8. 前記miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマー及び前記miR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーは、それぞれ、miR-122及びmiR-200aを切断するための遺伝子編集酵素を誘導するように構成されたガイドRNA分子である、実施形態G1〜G7の1項に記載の組成物。
G9. 前記遺伝子編集酵素がヌクレアーゼである実施形態G8の組成物。
G10. ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態G1〜G9の1項の組成物。
G11. 前記ヌクレアーゼがCas9である、実施形態G9又はG10の組成物。
G12. G1. さらに1種以上の長鎖脂肪酸を含む、実施形態G1〜G11項の組成物。
G13. 前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸のうちの2種以上を含む、実施形態G12の組成物。
G14. 前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸を含む、実施形態G12又はG13の組成物。
H1. 実施形態G1〜G14の組成物(composition)又は組成物(compositions)を含む、キット。
H2. 細胞培地及び/又は1以上の未成熟な心筋細胞をさらに含む、実施形態H1のキット。
Claims (68)
- 心筋細胞の成熟を誘導する方法であって、未成熟な心筋細胞にLet7iマイクロRNA(miRNA)の過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの2つ以上を誘導する工程を含む、方法。
- 未成熟な心筋細胞に、Let7iのmiRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下のうちの3つ以上を誘導する工程を含む、請求項1の方法。
- 未成熟な心筋細胞にLet7i miRNAの過剰発現、miR-452の過剰発現、miR-122の発現低下、及びmiR-200aの発現低下を誘導する工程を含む、請求項2の方法。
- 過剰発現を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸を含むベクターとを接触させる工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
- 前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸の一過性の発現を促進するように構成されている、請求項4の方法。
- 前記ベクターが、過剰発現させるmiRNAをコードする核酸が未成熟な心筋細胞のゲノムに組み込まれるように構成されたウィルスベクターである、請求項4の方法。
- 前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである、請求項6の方法。
- miRNAの発現低下を誘導する工程は、未成熟な心筋細胞と、発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする核酸断片、又は発現低下の標的のmiRNAにハイブリダイズする転写物をコードする核酸を含むベクターとを接触させる工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
- 発現低下を誘導する工程が、前記miRNAをコードする遺伝子のノックアウトを実施する工程を含む、請求項1の方法。
- 前記発現低下を誘導する工程が、ヌクレアーゼ酵素、及び前記ヌクレアーゼ酵素による発現低下の標的となるmiRNAをコードする核酸の特異的切断を促す配列を有するガイド核酸、を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程を含む、請求項1〜3の1項に記載の方法。
- ヌクレアーゼ酵素を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ヌクレアーゼ酵素又は前記ヌクレアーゼ酵素をコードするベクターとを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記酵素の発現を促進するように構成される、請求項10の方法。
- ガイド核酸を有する前記未成熟な心筋細胞を提供する工程は、前記未成熟な心筋細胞と、前記ガイド核酸又は前記ガイド核酸をコードするベクターとを接触させる工程を含み、ここで、前記ベクターは、前記心筋細胞における前記ガイド核酸の発現を促進するように構成される、請求項10の方法。
- 前記ヌクレアーゼ酵素が、Cas9又はTALENSのようなエンドヌクレアーゼである、請求項10の方法。
- 前記ベクターがウィルスベクターである、請求項8、11、又は12の1項に記載の方法。
- 前記ウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターである請求項14の方法。
- 前記未成熟な心筋細胞が幹細胞に由来する、請求項1の方法。
- 前記未成熟な心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する請求項14の方法。
- 前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、請求項16又は17の方法。
- 前記未成熟な心筋細胞と、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸から選択される2種以上の長鎖脂肪酸とを接触させる工程をさらに含む、請求項1〜18の1項の方法。
- 1種以上の前記長鎖脂肪酸がパルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸を含む、請求項19の方法。
- 前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項1〜20の1項に記載の方法。
- 前記遺伝子異常が、前記心臓の代謝又は病理学的疾患状態に関連している、請求項21の方法。
- 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、請求項22の方法。
- 前記心筋細胞が、HADHA、FATP1、FACS1、OCTN2、L-CPTI、M-CPT I、CAT、CPTII、VLCAD、LCAD、MCAD、SCAD、LCHAD、SHYD、M/SCHAD、SKAT、MKAT、HS、HL、ETF、及びETFQOの1つをコードする遺伝子の変異を含む、請求項22の方法。
- 請求項1〜24の1項に記載の任意の方法により生産された心筋細胞。
- 前記心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項25の心筋細胞。
- 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、請求項26の心筋細胞。
- 前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、請求項27の心筋細胞。
- 成熟したカルジオリピンプロファイルを有する心筋細胞の投与によって治療可能な状態を有する対象の治療方法であって、請求項25に記載の心筋細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記対象は、損傷した心臓組織又は細胞を有する、請求項29の方法。
- 前記対象が糖尿病、先天性心疾患、虚血、ミオパチー、ミトコンドリア疾患を有する、及び/又は梗塞に罹患している、請求項29の方法。
- 前記ミトコンドリア疾患が脂肪酸酸化(FAO)障害である、請求項29の方法。
- 前記対象が、HADHAをコードする遺伝子の変異を有する、請求項29の方法。
- 前記対象が不整脈を経験する、請求項29の方法。
- 前記対象は乳幼児突然死症候群(SIDS)のリスクが高い、請求項29の方法。
- 心臓機能の調節のための化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項25〜28の1項に記載の1つ以上の心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程、及び
前記1つ以上の心筋細胞における心臓機能パラメータを測定する工程、
前記心臓機能パラメータの変化が、前記候補薬剤が心臓機能を調節することを示す、方法。 - 前記成熟した心筋細胞が遺伝子異常を有する、請求項36の方法。
- 前記遺伝子異常が脂肪酸酸化(FAO)障害と関連している、請求項37の方法。
- 前記遺伝子異常が、HADHAをコードする遺伝子の変異である、請求項38の方法。
- 前記心臓機能パラメータが、脂質プロファイル、カルジオリピンプロファイル、代謝プロファイル、酸素消費率、ミトコンドリアプロトン勾配、収縮力、カルシウム輸送、伝導速度、グルコースストレス、及び細胞死を含む、請求項36の方法。
- 対象におけるミトコンドリア脂肪酸酸化(FAO)障害の治療方法であって、対象のミトコンドリアのカルジオリピンプロファイルを安定化する、又は成熟したカルジオリピンリモデリングを促進する組成物の有効量を投与する工程を含む、方法。
- 前記FAO障害が、糖尿病、心不全、神経変性、高齢化、先天性心疾患、虚血、ミオパシー、及び/又は梗塞のインスタンスと関連している、請求項41の方法。
- 前記FAO障害が脂肪酸(FA)β酸化障害である請求項41の方法。
- 前記ミトコンドリア機能障害の表現型が、乳幼児突然死症候群のリスクの増加と関連している、請求項41の方法。
- カルジオリピンプロファイルを安定化する工程が、カルジオリピンの酸化を防止する工程を含む、請求項41の方法。
- 組成物がエラミプレチドであるか、又は含む、請求項41〜45の方法。
- 培養心筋細胞の病理学的状態を検出する方法であって、心筋細胞におけるカルジオリピンプロファイルを測定する工程を含み、ここで、炭素数18超のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な増加、及び炭素数18未満のアシル鎖を有するカルジオリピンの相対的な減少は、心筋細胞の病理学的状態の低下を示す、方法。
- 前記カルジオリピンの増加又は減少は、野生型の未成熟な心筋細胞に対して相対的なものである、請求項47の方法。
- 前記培養心筋細胞がインビトロで幹細胞に由来する、請求項47の方法。
- 前記幹細胞が胚性幹細胞、多能性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、請求項49の方法。
- 前記病理状態がミトコンドリア機能障害と関連している、請求項47の方法。
- 前記ミトコンドリア機能障害がミトコンドリア三機能蛋白質欠損症である、請求項51の方法。
- 前記培養心筋細胞と、前記培養心筋細胞の病理学的状態を低下させるための候補薬剤とを接触させる工程をさらに含む、請求項47の方法。
- 前記培養心筋細胞の病理学的状態に関する前記候補薬剤の効果を確認するために、前記培養心筋細胞と候補薬剤とを接触させる工程の前、途中、及び/又は後に、前記培養心筋細胞のカルジオリピンプロファイルを複数回測定する工程を含む、請求項53の方法。
- 培養心筋細胞の成熟を誘導するための組成物であって、Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの2つ以上を含む、組成物。
- Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトのうちの3つ以上を含む、請求項55の組成物。
- Let7iマイクロRNAをコードする核酸コンストラクト、miR-452をコードする核酸コンストラクト、miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクト、及びmiR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーであるか又はコードする核酸コンストラクトを含む、請求項55の組成物。
- 前記マイクロRNAをコードする及び/又はオリゴマーをコードする核酸コンストラクトが、それぞれ1つ以上のプロモーター配列に作動可能に連結している、請求項55〜57の1項の組成物。
- 1以上の前記コンストラクトが、細胞への送達のために構成された1以上のベクターに組み込まれている、請求項55〜57の1項の組成物。
- 前記1種以上のベクターがウィルスベクターである、請求項59の組成物。
- 少なくとも1つのウィルスベクターがレンチウィルスベクター又はAAVベクターである、請求項60の組成物。
- 前記miR-122をコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマー及び前記miR-200aをコードする配列の一部にハイブリダイズするオリゴマーは、それぞれ、miR-122及びmiR-200aを切断するための遺伝子編集酵素を誘導するように構成されたガイドRNA分子である、請求項55〜61の1項に記載の組成物。
- 前記遺伝子編集酵素がヌクレアーゼである請求項62の組成物。
- ヌクレアーゼをさらに含む、請求項55〜63の1項の組成物。
- 前記ヌクレアーゼがCas9である、請求項63又は請求項64の組成物。
- さらに1種以上の長鎖脂肪酸を含む、請求項55〜65の1項の組成物。
- 前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸のうちの2種以上を含む、請求項66の組成物。
- 前記1種以上の長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、オレイン酸、及びリノール酸を含む、請求項67の組成物。
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