JP2021504695A - リガンド−薬物複合体を分析するための酸媒介アッセイ - Google Patents
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Abstract
【要約書】酸媒介開裂を使用したリガンド−薬物複合体を分析する方法、および本方法を実行するためのキットが本明細書で提供される。さらに、リガンド−薬物複合体の分析および開発のための方法の様々な応用も提供される。【選択図】図3
Description
関連出願の相互参照
本出願は2017年11月22日付けで出願した米国特許出願第62/590,169号の恩典を主張するものであり、これらの特許の開示内容は、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
本出願は2017年11月22日付けで出願した米国特許出願第62/590,169号の恩典を主張するものであり、これらの特許の開示内容は、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
背景
リガンド−薬物複合体(LDC)は標的療法の関心が高まっていることから注目されている。LDCは、細胞毒性薬、典型的には強い全身毒性を有する小分子薬物、および組織または細胞特異的抗原に対して高い選択的リガンド(例えば、抗体−薬物複合体(ADC)のケースでは抗体)からなり、血液循環では比較的安定なリンカーを介して相互連結されているが標的環境においては細胞毒性薬を放出する。抗体−薬物複合体(ADC)は、次世代の標的療法として、特に腫瘍学においてはかなり有望である。非常に強力な細胞毒性薬を病変組織に送達するために抗体の免疫学的特異性の活用が抗腫瘍活性を改善させ、そしてオフターゲット毒性を制限する。この手法は現在、FDAに認可された2種類のADC、すなわちブレンツキシマブ ベドチンおよびAdo−トラスツズマブ エムタンシン(Vermaら、2012、Younesら、2010)(Vermaら、2012、Younesら、2010)で使用に成功しており、多くの前臨床試験および治療実験で注目されている。
リガンド−薬物複合体(LDC)は標的療法の関心が高まっていることから注目されている。LDCは、細胞毒性薬、典型的には強い全身毒性を有する小分子薬物、および組織または細胞特異的抗原に対して高い選択的リガンド(例えば、抗体−薬物複合体(ADC)のケースでは抗体)からなり、血液循環では比較的安定なリンカーを介して相互連結されているが標的環境においては細胞毒性薬を放出する。抗体−薬物複合体(ADC)は、次世代の標的療法として、特に腫瘍学においてはかなり有望である。非常に強力な細胞毒性薬を病変組織に送達するために抗体の免疫学的特異性の活用が抗腫瘍活性を改善させ、そしてオフターゲット毒性を制限する。この手法は現在、FDAに認可された2種類のADC、すなわちブレンツキシマブ ベドチンおよびAdo−トラスツズマブ エムタンシン(Vermaら、2012、Younesら、2010)(Vermaら、2012、Younesら、2010)で使用に成功しており、多くの前臨床試験および治療実験で注目されている。
LDCの薬物動態プロファイル、毒性および化学安定性の改善に向けて集中的な研究活動が進められている。大部分のLDCは薬物負荷が変化するリガンドの不均一な混合物であり、これは、可変数の薬物または薬物−リンカー分子が1つのリガンドに結合し得ることを意味する。一旦、LDCが生物環境に置かれると、例えば薬物または薬物−リンカーは消失し、さらなる不均質をもたらす。大部分のADCは、内因性リジンやシステイン残基を介した抗体への強力な細胞毒性薬の結合にアミドやチオエーテル化学を利用し、マレイミド−システイン共役が臨床病期ADCプログラムに多く使用されている一方、マレイミドは幾分かの共役後不安定性を提示することが示されている。したがって、薬物の標的特異的送達を確保し、そしてオフターゲット毒性を制限するために薬物−抗体結合の安定性を改善することがLDCにとって必要である。
そのような改善型LDCの開発には一般的に複数の生物分析アッセイを必要とする。生体内変化、および薬物または薬物リンカーの安定性は、様々な分析方法を用いて、経時的または生物環境に曝露した後にリガンドに対して安定に結合する薬物の濃度を測定することでアッセイができる。そのようなアッセイは、以降の測定のために薬物またはその一部を放出する手段が必要である。これは酵素的切断によって行ってもよい。しかしながら、一部の薬物および薬物リンカーは酵素によって切断されない。したがって、放出された薬物またはその一部の検出および定量に適切な分析方法と共に、使用に適したLDCから薬物および薬物リンカーを切断する代替手段が必要である。
概要
本出願の開示は、サンプル中のLDCを測定、分析および定量し、それによってリガンドに共役した薬物の量を決定する方法を提供する。具体的には、当該方法は、例えば、トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液の酸で処理することによってLDCから放出し得る分析標的を含むLDCを使用する。さらに、LDCから放出された分析標的の測定に基づくLDCの量、濃度および安定性を決定する方法を提供することを含む。本明細書で提供されるLDC分析方法は、高い安定性と低い毒性をもった新規なLDCを開発するのに不可欠な手段ということができる。
本出願の開示は、サンプル中のLDCを測定、分析および定量し、それによってリガンドに共役した薬物の量を決定する方法を提供する。具体的には、当該方法は、例えば、トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液の酸で処理することによってLDCから放出し得る分析標的を含むLDCを使用する。さらに、LDCから放出された分析標的の測定に基づくLDCの量、濃度および安定性を決定する方法を提供することを含む。本明細書で提供されるLDC分析方法は、高い安定性と低い毒性をもった新規なLDCを開発するのに不可欠な手段ということができる。
より具体的には、1つの態様において、本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体 (LDC)を分析する方法であって、(a)LDCを含むサンプルを提供する工程であって、ここでLDCはリガンドと分析標的を含み、分析標的は薬物分子またはその一部を含む、工程;および(b)サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、LDCから分析標的の放出を誘導する、接触させる工程を含む、上記方法を提供する。
一部の実施形態においては、方法は、(a)LDCから放出された分析標的の量を測定する工程;および(b)放出された分析標的の量を用いて、サンプル中の薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程をさらに含む。
一部の実施形態においては、LDCから放出された分析標的の量を測定する工程は、分析標的を液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)にかけることを含む。一部の実施形態においては、LDCから放出された分析標的の量を測定する工程は、分析標的を液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析(LC−MS/MS)にかけることを含む。
一部の実施形態においては、方法は、(a)サンプル中のリガンド量を測定する工程;および(b)リガンドの測定量を使用して、サンプル中の薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程をさらに含む。
一部の実施形態においては、方法は、サンプルをトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程の前に、サンプルからLDCを収集する工程をさらに含む。一部の実施形態においては、LDCを収集する工程は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる。
一部の実施形態においては、LDCから放出された分析標的の量を測定する工程は、LDCの標準曲線を使用して行われる。
一部の実施形態においては、方法は、(a)サンプルに固定量の内部標準を添加する工程であって、ここで内部標準はリガンドおよび第二分析標的を含み、第二分析標的はLDCの標識誘導体である、工程;(b)サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、LDCから分析標的のおよび内部標準から第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程;(c)内部標準から放出された第二分析標的の量を測定する工程;ならびに(d)内部標準から放出された第二分析標的の量に基づいてLDCから放出された分析標的の量を測定する工程をさらに含む。
一部の実施形態においては、第二分析標的は分析標的と異なる分子量を有する。一部の実施形態においては、内部標準はLDCの同位体標識版を含む。一部の実施形態においては、同位体標識は安定または不安定である。一部の実施形態においては、同位体標識は重水素または炭素13である。
一部の実施形態においては、方法は、サンプルをトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程の前に、サンプルからLDCおよび内部標準を収集する工程をさらに含む。一部の実施形態においては、LDCまたは内部標準を収集する工程は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる。一部の実施形態においては、リガンドは抗体またはその機能性断片であり、プロテインA樹脂、プロテインG樹脂およびプロテインL樹脂から選択される樹脂とサンプルを接触させることによってLDCまたは内部標準がサンプルから抽出される。
一部の実施形態においては、サンプルを10体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる。
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である。一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である。
一部の実施形態においては、分析標的はテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む。
別の態様では、本発明は、リガンド−薬物複合体(LDC)の安定性を決定する方法であって、(a)LDCに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程;(b)本明細書で提供された方法で第一サンプルおよび第二サンプル中のLDCを分析する工程であって、それによって、第一サンプルおよび第二サンプル中のLDCから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程;ならびに(c)第一サンプルおよび第二サンプル中の放出された分析標的の量を比較することによってLDCの安定性を決定する工程を含む、方法を提供する。
一部の実施形態においては、該方法は、(a)第一サンプルおよび第二サンプル中のリガンドの量を測定する工程;ならびに(b)第一サンプルおよび第二サンプル中の放出された分析標的とリガンドの量の比率を決定する工程をさらに含む。
一部の実施形態においては、サンプル、第一サンプル、または第二サンプルは、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである。一部の実施形態においては、生物サンプルは、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される。一部の実施形態においては、生物サンプルは血漿から取得される。一部の実施形態においては、血漿はLDCで処理された。一部の実施形態においては、血漿はLDCで治療されているヒト対象に由来する。
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中のLDCを定量する方法であって、(a)LDCを含むサンプルを提供する工程であって、ここでLDCは分析標的を含み、分析標的は薬物分子を含む、工程;(b)サンプルに内部標準を添加する工程であって、ここで内部標準は、LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、工程;(c)LDCおよび内部標準をサンプルから抽出する工程;(d)LDCおよび内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる工程であって、ここでTFAは、LDCから分析標的を、および内部標準から第二分析標的を放出させる、工程;ならびに(e)LDCから放出された分析標的および内部標準から放出された第二分析標的の量を決定する工程であって、ここでLDCから放出された分析標的の量はサンプル中のLDCの量と相関する、工程を含む、方法を提供する。
一部の実施形態においては、LDCから放出された分析標的の量は、内部標準から放出された第二分析標的の量を用いて決定され、ここでLDCから放出された分析標的の量はサンプル中のLDCの抗体に共役した薬物分子の濃度と相関する。
一部の実施形態においては、LDCから放出された分析標的の量は、LDCの標準曲線を使用して決定される。
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンF(MMAF)またはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である。一部の実施形態においては、分析標的はMMAFまたはテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む。いくつかの実施形態では、分析標的はmcMMAFを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含み、第二分析標的は6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はペグ化リンカーDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はMMAEを含み、第二分析標的は6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている。
一部の実施形態においては、LDCおよび内部標準は、10体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる。
一態様では、本発明は、サンプル中のLDC量を決定するためのキットであって、(a)LDCのための内部標準であって、ここで内部標準は、LDCの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準;および(b)1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
別の態様では、本発明は、サンプル中のLDC量を決定するためのキットであって、(a)標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、ここで標識リンカー−薬物複合体は、リガンドに共役することによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド;ならびに(b)1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
図は、単に説明するだけの目的で本発明の種々の実施形態を表す。当業者は、本明細書に図示された構造および方法の代替実施形態が本明細書に記載した発明の原理から逸脱することなく使用し得ることは以下の説明から容易に認識するであろう。
詳細な説明
定義
特に断りがない限り、本明細書で使用される技術および科学的用語の全ては、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用するとき、次の用語は以下に帰せられる意味を有する。
定義
特に断りがない限り、本明細書で使用される技術および科学的用語の全ては、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用するとき、次の用語は以下に帰せられる意味を有する。
「リガンド−薬物複合体」または「LDC」は、医薬品、例えば、細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤に共役したリガンド(例えば、抗体)を意味する。「リガンド」には、ポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、環状ペプチドおよび糖ペプチドを含むペプチド、または任意の他の細胞結合分子もしくは物質が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、リガンドは、アプタマー(オリゴヌクレオチドまたはペプチド)、ならびに種々のタンパク質、例えばインターフェロン、リンホカイン、ノッティン、アドネクチン、アンチカリン、ダルピン、アビマー、Kunitz型ドメインおよびセンチリンを含む。追加のリガンドとしては、ホルモン、成長因子、コロニー刺激因子、ビタミン、および栄養素輸送分子が含まれる。好適なリガンドとしては、例えば、抗体、例えば完全長抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。抗体はまた、二重特異性抗体および多特異的抗体を含む。
「抗体−薬物複合体」または「ADC」は、抗体、抗原結合断片、または医薬品に共役したその工学変異体を指す。典型的には、抗体−薬物複合体は細胞表面の標的抗原(例えば、CD70)に結合し、続いて細胞に抗体−薬物複合体が内在化し、その後細胞中に薬物を放出する。抗体またはその抗原−結合断片は医薬品と共有結合または非共有結合し得る。特定の実施形態では、LDCの薬物、特にADCの薬物は、リガンドまたはより具体的には抗体にリンカーを介して共役している。リンカーは一般的には、薬物への共役および化学スペーサによって分離されたリガンドへの共役から生じる残基を含む。化学スペーサは、単純に炭化水素鎖、アルケニレン(例えば、−(CH2)n−、式中nは選択した整数、またはnは2−10である)、または1つ以上の酸素、カルボニル(C=O)、硫黄、もしくはアミノ基(例えば、NHまたはNアルキル)を含むヘテロアルケニレン鎖であり得る。リンカーは構造的により複雑であってもよく、例えば、リンカーは、PEG(ポリエチレングリコール)基、もしくは他の親水性基で置換されてもよく、または例えばβ−グルクロニダーゼによって脱離されるβ−グルクロニドのように基の切断がリンカーを開裂させるような開裂可能な基を含み得る。
リンカーは、薬物にリガンドを連結する化学種である。典型的には、LDCは2つの共役工程によって形成される。リンカー前駆体は、ほとんどの場合スペーサによって分離され、任意に置換された2つの異なる反応基を有したヘテロ二官能性種であり、最も多くは薬物分子と反応し、1つの反応基を保持するリンカー−薬物結合体を形成する。ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、異なる反応性を有する2つの反応基の間にスペーサを含む。例えば、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、1つの末端にアミノ反応基および他の末端にチオール反応基を含み得る。他のより特定の例では、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、薬物のアミンと反応しカルバメートを形成するためのカーボネートを含み得る。他のより特定の例では、ヘテロ二官能性リンカー前駆体は、薬物のアミンと反応しアミドを形成するためのアジドまたはN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステルまたはスルホ−NHSエステル)を含み得る。そのような各アミン反応基は、選択した既知条件下でチオールとの反応用に選択されるマレイミド基をもつリンカー前駆体では対をな靜置している場合がある。薬物に共役した後、反応基の1つがリンカー−薬物複合体に残留する。
次いで、反応基を保持するリンカー−薬物複合体はリガンドへの薬物の共役のための試薬として使用し得る。例えば、リガンド共役試薬はリガンド上のチオール基との反応のためにマレイミド基を含むことができる。より一般的には、リガンド共役試薬はリガンド上の基との共役のために任意の好適な反応基を含むことができる。反応基は、例えばアミン基、カルボキシレート基、チオール基またはヒドロキシル基と反応し得る。
「分析標的」は、リガンド−薬物複合体から放出または脱離され、1つ以上の公知の分析技術、例えば質量分析によって検出または測定(定量化)される薬物またはその一部を指す。分析標的は、少なくとも薬物またはその一部を含み、さらにリンカーの一部を含み得る。分析標的の量は、分析標的が放出または脱離されてくるリガンド−薬物複合体の量を表す。より具体的には、分析標的はLDCの薬物またはLDCの薬物の一部である。薬物がアウリスタチンである特定の実施形態では、分析標的は薬物から放出されるテトラペプチドであり得る。
内部標準が使用される場合、分析標的は内部標準から放出または脱離される薬物またはその一部であり得る。典型的な実施形態では、内部標準から放出される分析標的は、リガンド−薬物複合体から放出される分析標的と、例えば、異なる分子量を持つこと、および/または標識することによって区別することができる。
用語「抗体」は、抗原の存在に応答して身体によって生成され、そして抗原、ならびに抗原結合断片およびその工学変異体に結合する免疫グロブリンタンパクを意味する。したがって、用語「抗体」は、例えば無傷モノクローナル抗体(例えば、ハイブリドーマ法で生成された抗体)および抗原結合抗体断片、例えば、F(ab’)2、Fvフラグメント、ディアボディ、単鎖抗体、scFvフラグメント、またはscFv−Fcを含む。遺伝子学的に改変された無傷抗体および断片、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖Fvフラグメント、単鎖抗体、ディアボディ、ミニ抗体、直鎖抗体、多価または多特異性(例えば、二重特異性)ハイブリッド抗体なども含まれる。したがって、用語「抗体」は拡張的に使用され、抗体の抗原結合部位を含み、そしてその抗原に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質が含まれる。
「抽出する」、「抽出される」、「抽出」および「抽出している」という用語は、いくつかのタンパク質および他の分子を含む不均質サンプルからのLDCまたはADCの単離を指す。不均質サンプル、特に生物サンプルからLDCまたはADCを選択的に抽出することが可能な、当該技術分野で公知の適切な方法または材料は、本明細書に記載の方法に使用することができる。抽出は、例えばアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーおよび免疫沈降を含み得る。
リガンドまたは抗体が結合する種を含む樹脂へのLDCまたはADCの結合は抽出に使用することができる。抗体結合タンパク質はADCの抽出に使用できる。例えば、サンプルからのADCの抽出は、プロテインAカラム上でのサンプルの通過、またはサンプルとプロテインA樹脂との接触およびその後のサンプルからの樹脂の除去が、抗体を捕捉するために必然的に含まれ、これによってサンプルからADCが抽出し得る。ADCの表面タンパク質に関しては、プロテインA、プロテインGまたはプロテインLを抽出用に使用し得る。プロテインA、プロテインGまたはプロテインLへの所定の抗体の結合のための構造的要件は、当該技術分野においては公知であり、当業者は所定の抗体と共に使用する適切な表面タンパク質をそれらから選択することができる。これらのタンパク質を使用する抽出に有用な材料には、例えば、ビーズ状アガロースまたは磁気ビーズまたはプロテインA、プロテインGもしくはプロテインLが共有結合で固定化されている類似の支持材料などの樹脂が含まれる。
「細胞内で開裂された」および「細胞内開裂」という用語は、リガンド−薬物複合体(例えば、抗体−薬物複合体)に関する細胞内での代謝プロセスまたは反応を指し、それによって共有結合、例えば、薬物部分とリガンドユニットの間のリンカーが壊れて、細胞内に遊離薬物または抗体から解離した他の代謝産物が生じる。したがって、薬物−リンカー−リガンド複合体の開裂部分が細胞内代謝産物である。
「放出する」、「放出される」、および「放出している」という用語は、本明細書に記載の酸媒介切断法によるLDCからの分析標的の細胞外切断を指す。所定の数のリンカー−薬物結合体を担持(すなわち、共役)している所定のLDCに関しては、一般的に、放出された分析標的の量は、放出反応に使用される酸濃度(下記参照)、反応の温度および圧力(下記参照)および用いられる反応時間によって変化するであろう。サンプルからサンプルまでの結果の一貫性に関しては、同じ酸濃度および反応条件を用いる必要がある。本明細書に記載した酸処理ではLDCから全ての分析標的を放出する必要がない。必要なのは、用いられる分析方法を考慮して、分析標的の精密で正確な測定値を取得するのに十分な分析標的の量を放出することである。
「接触する」、「接触される」、および「接触している」という用語は、試験サンプルまたは対照サンプル(生物サンプルを含む)でもよいサンプルに酸または試薬を添加することを指し、だから、サンプルの成分は酸または試薬が利用できるように作られており、その結果反応を起こすことができる。本明細書の方法における酸添加と関連する反応は、LDCまたはより具体的にはADCからの分析標的の放出である。
「細胞傷害効果」は、標的細胞の枯渇、排除および/または殺傷を意味する。「細胞毒性薬」は、細胞に対して細胞傷害効果を持つことによって、標的細胞の枯渇、排除および/または殺傷を媒介する化合物を指す。当該用語は、放射性同位体(例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、60C、およびLuの放射性同位体)、化学療法剤ならびに低分子毒素または合成類縁体およびそれらの誘導体を含む細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素を含む。特定の実施形態では、細胞毒性薬は抗体に結合し、または抗体と組み合わせて投与される。適切な細胞毒性薬はさらに本明細書に記載されている。
「細胞毒性」は、リガンド−薬物複合体化合物またリガンド−薬物複合体の細胞内代謝産物の殺細胞、細胞増殖抑制性もしくは抗増殖効果を指す。細胞毒性は、細胞の半分が生存する単位体積当たりの濃度(モルまたは質量)である、IC50値で表現し得る。
「患者」または「対象」という用語は、予防または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび非ヒト霊長類、ウサギ、ラット、マウスなど、そしてそれらのトランスジェニック種のような他の哺乳動物の対象を含む。
「標準曲線」または「検量線」という用語は、定量的な研究手法として使用されるグラフを指す。標準曲線を作成するために、既知の特性をもつ複数のサンプルを測定してグラフ化することにより、後でグラフに内挿して未知サンプルに関する同じ特性の判断が可能になる。既知特性を持つサンプルが標準であり、グラフは標準曲線である。標準曲線は、未知量の検体を含み得るサンプル中の検体の量または濃度を測定する場合に特に使用される。標準曲線単独の使用は外部標準の使用を意味する。当該技術分野では理解されるように、定量される所定の検体(すなわち、LDC)の標準曲線は、一般にサンプル中の予想される検体の濃度範囲に広げる必要がある。再び、当該技術分野では理解されるように、標準曲線の準備に使用されるサンプルは、検体が測定される試験サンプルおよび任意の対照サンプルと同様の工程で処理される。標準曲線はまた、内部標準の使用と組み合わせて用いることができる。この場合は、内部標準の一定量(または固定量)が既知の検体濃度の標準曲線を作成するために使用される各サンプルに添加される。同じ一定量の内部標準が各試験サンプルおよび任意のブランクまたは対照サンプルに添加される。外部標準のような標準曲線(検量線)の使用、ならびにMS、LC―MSおよびLC―MS/MS法を含む分析法による検体の定量用に内部標準を添加した標準曲線の使用との併用の詳細は当該技術分野では周知である。当業者は、本明細書で論じられた生物サンプルを含む様々なサンプル中の検体濃度の決定におけるそのような分析手法の使用方法を理解している。
「内部標準」は、定量される化学種(例えばLDC)と同様に選択的分析において挙動する化学種であるが、使用されている分析法での化学種とは区別できる。典型的には、内部標準は、定量される化学種と区別するために標識されるが、用いられる標識は定量される化学種の挙動と比較してその挙動に顕著に異なる影響を及ぼさない。好ましくは、定量される化学種の測定値(例えば、検体ピーク面積)に影響を及ぼすあらゆる物が同様に内部標準の測定にも影響を及ぼすであろう。定量される化学種とその内部標準の比率は、好ましくは試験サンプル中の化学種の測定値より小さいバラツキを示す。質量分析法で使用する場合、内部標準は定量される化学種とは異なる分子量を有する。
ほとんどの場合、重水素(2H)および炭素13(13C)などの安定同位体による標識が使用される。標識は、検体と内部標準の分離測定を可能にしなければならない。好ましくは、同位体標識された内部標準は、定量される化学種の分子量と少なくとも3amu(すなわち、3個以上の2Hまたは13Cで標識)相違する。より具体的には、標識は6amu以上の分子量の相違をもたらす。内部標準はまた、定量される化学種のサロゲートでもあり得る。サロゲート内部標準は、例えば、水素の代わりにメチル基または他の低分子アルキルに置換、あるいはハロゲン、例えば水素の代わりにフッ素に置換するなど、原子または化学基を異なる基で置換することで定量される化学種と構造的に異なる。そのようなサロゲートは、同位体標識された内部標準を容易に得ることができない場合に特に使用し得る。
「決定する」、「決定される」および「決定している」という用語は、分析標的の量の測定値および1つ以上の相関因子の既知量に基づいて特定の検体の濃度または量を確認することを意味する。当該技術分野においては理解されるように、検体濃度は他の測定値の結果と結合して、検体の他の構造的および物理的特性を決定することができる。
商標が本明細書で使用される場合、商標は、文脈によって明らかにそうでない限り、商標の製品の製剤、ジェネリック医薬品、および医薬品有効成分(複数)を含む。
他の解釈上の取決め
本明細書に列挙した範囲は、記載の終点を含む範囲内の全値の省略表現であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、および50からなる群の任意の数字、数字の組み合わせまたは下位域を含むことが理解される。
本明細書に列挙した範囲は、記載の終点を含む範囲内の全値の省略表現であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、および50からなる群の任意の数字、数字の組み合わせまたは下位域を含むことが理解される。
他に示されない限り、1つ以上の立体中心を有する化合物への言及は、各立体異性体および全てのそれらの立体異性体の組み合わせを意図する。
リガンド−薬物複合体(LDC)を分析するためのアッセイ
一態様では、本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法であって、(a)LDCを含むサンプルを提供し、ここでLDCはリガンドおよび分析標的を含み、分析標的は薬物分子またはその一部を含む;(b)サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、LDCから分析標的の放出を誘導する、接触させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態においては、方法は、(a)LDCを含むサンプルを提供し、ここでLDCは分析標的を含み、分析標的は薬物分子を含む;(b)サンプルに内部標準を添加し、ここで内部標準は、LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む;(c)サンプルからLDCおよび内部標準を抽出する;(d)LDCおよび内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる、ここでTFAは、LDCから分析標的および内部標準から第二分析標的を放出させる;(e)LDCから放出された分析標的および内部標準から放出された第二分析標的の量を決定し、ここでLDCから放出された分析標的の量はサンプル中のLDC量と相関する工程を含む。
一態様では、本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法であって、(a)LDCを含むサンプルを提供し、ここでLDCはリガンドおよび分析標的を含み、分析標的は薬物分子またはその一部を含む;(b)サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、LDCから分析標的の放出を誘導する、接触させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態においては、方法は、(a)LDCを含むサンプルを提供し、ここでLDCは分析標的を含み、分析標的は薬物分子を含む;(b)サンプルに内部標準を添加し、ここで内部標準は、LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む;(c)サンプルからLDCおよび内部標準を抽出する;(d)LDCおよび内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる、ここでTFAは、LDCから分析標的および内部標準から第二分析標的を放出させる;(e)LDCから放出された分析標的および内部標準から放出された第二分析標的の量を決定し、ここでLDCから放出された分析標的の量はサンプル中のLDC量と相関する工程を含む。
リガンド−薬物複合体(LDC)を含むサンプル
本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法を提供する。LDCはリガンドおよび分析標的を含む複合体である。分析標的は、薬物分子またはその一部を含む。LDCまたはLDCを含むと思われている種々のサンプルは、本明細書で提供される方法を使用して分析にかけることができる。具体的には生物サンプルを分析できる。
本発明は、サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法を提供する。LDCはリガンドおよび分析標的を含む複合体である。分析標的は、薬物分子またはその一部を含む。LDCまたはLDCを含むと思われている種々のサンプルは、本明細書で提供される方法を使用して分析にかけることができる。具体的には生物サンプルを分析できる。
サンプル
生物または非生物サンプル中のLDCは本明細書で提供される方法によって分析することができる。好ましい実施形態において、サンプルは哺乳動物対象に由来する生物サンプルである。具体的には、一部の実施形態において、生物サンプルは以下の血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿の1つから得られている。
生物または非生物サンプル中のLDCは本明細書で提供される方法によって分析することができる。好ましい実施形態において、サンプルは哺乳動物対象に由来する生物サンプルである。具体的には、一部の実施形態において、生物サンプルは以下の血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿の1つから得られている。
一部の実施形態においては、サンプルはインビボでLDCと接触させた生物サンプルである。例えば、サンプルは、LDCに曝露された対象に由来する生物サンプルの場合がある。一部の実施形態においては、サンプルはLDCの投与後の一定時点で得られる。一部の実施形態においては、サンプルはLDCの投与後の複数の時点で得られる。一部の実施形態においては、サンプルはLDCの投与前に得られる。
一部の実施形態においては、サンプルはエクスビボでLDCと接触させた生物サンプルである。一部の実施形態においては、サンプルは一定期間、LDCと接触させる。一部の実施形態においては、LDCと異なる期間接触させた多数のサンプルを分析にかける。一部の実施形態においては、サンプルはLDCへの曝露前に得られる。
リガンド−薬物複合体(LDC)
リガンド
一部の実施形態においては、リガンドは標的分子に対して特異的親和性を有しているタンパク質である。一部の実施形態においては、リガンドは抗体である。有用なポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。有用なモノクローナル抗体は、特定の抗原決定基(例えば、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸、またはそれらの断片)に対する抗体の均質集団である。対象抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)は、連続細胞株の培養によって抗体分子を生産する当該技術分野で公知の任意の技術を用いて調製することができる。
リガンド
一部の実施形態においては、リガンドは標的分子に対して特異的親和性を有しているタンパク質である。一部の実施形態においては、リガンドは抗体である。有用なポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。有用なモノクローナル抗体は、特定の抗原決定基(例えば、腫瘍細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学物質、核酸、またはそれらの断片)に対する抗体の均質集団である。対象抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)は、連続細胞株の培養によって抗体分子を生産する当該技術分野で公知の任意の技術を用いて調製することができる。
有用なモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラヒト−マウス(または他種)モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、完全長抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の多数の任意の技術によって作成し得る(例えば、Tengら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308−7312;Kozborら、1983,Immunology Today 4:72−79;およびOlssonら、1982,Meth.Enzymol.92:3−16)。
抗体は、標的細胞(例えば、がん細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原)に免疫特異的に結合する抗体または腫瘍細胞もしくは基質に結合した他の抗体の機能的活性断片、誘導体もしくは類似体であり得る。この関連で、「機能的活性」とは、断片、誘導体または類縁体が、抗体からこれらが誘導されるその抗体と同じ抗原を認識する抗イディオタイプ抗体を引き出すことができることを意味する。具体的には、例示的な実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプ抗体の抗原性は、抗原を特異的に認識するCDR配列のC末端であるフレームワークおよびCDR配列の欠失によって強めることができる。どのCDR配列が抗原に結合するかを決定するために、CDR配列を含む合成ペプチドが、当該技術分野において公知の任意の結合試験法(例えば、BIAcoreアッセイ)を用いた抗原との結合アッセイに使用できる。(Kabatら、1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest、 Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.;Kabat Eら、1980,J.Immunology 125(3):961−969を参照されたい)。
他の有用な抗体としては、例えば、これらに限定されないが、F(ab’)2フラグメント、Fabフラグメント、Fvs、単鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、scFv、scFv−Fvなどの抗体の断片、または抗体と同じ特異性を有した任意の他の分子などが含まれる。
さらに、例えば、標準組み換えDNA技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組み換え抗体は有用な抗体である。キメラ抗体は、分子の異なる部分が異なる動物種に由来する、例えばマウスモノクローナルに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である(例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,816,567号および米国特許第4,816,397号を参照)。ヒト化抗体は、非ヒト種からの1つ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有するからの非ヒト種由来の抗体分子である(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,585,089号を参照)。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の組み換えDNA技術、例えば、参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる国際公開WO87/02671:欧州特許公開0184187:欧州特許公開0171496:欧州特許公開0173494:国際公開WO86/01533:米国特許第4,816,567号;欧州特許公開012023:Berterら、1988、Science 240:1041−1043:Liuら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439−3443:Liuら、1987,J.Immunol.139:3521−3526:Sunら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214−218;Nishimuraら、1987,Cancer.Res.47:999−1005:Woodら、1985,Nature314:446−449:およびShawら、1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553−1559:Morrison,1985,Science229:1202−1207:Oiら、1986,BioTechniques 4:214:米国特許第5,225,539号:Jonesら、1986,Nature 321:552−525:Verhoeyanら、1988,Science239:1534:およびBeidlerら、1988,J.Immunol.141:4053−4060に記載された方法を使用して作ることができる。
完全ヒト抗体は特に望ましく、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現する能力はないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して生産することが可能である。
抗体としては、共有結合により抗体が抗原結合免疫特異性を保持することが可能になる限り、すなわち、そのような任意の分子種の共有結合によって改変される類似体および誘導体がいずれも含まれる。例えば、限定するためではないが、抗体の誘導体および類似体としては、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/妨害基、タンパク質分解的切断、細胞抗体ユニットまたは他のタンパク質への連結などによってさらに修飾されているものが含まれる。任意の多数の化学修飾は、これらに限定されないが、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下での代謝合成などを含む公知技術によって行うことができる。さらに、類似体または誘導体は1つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる。
抗体は、Fc受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾(例えば、置換、欠失または付加)をもつ場合がある。特に、抗体は、抗FcドメインとFcRn受容体の間の相互作用に関与するとして同定されたアミノ酸残基に修飾をもつことが可能である(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開WO97/34631を参照)。
がん細胞抗原に対して免疫特異的な抗体は市販されており、または、例えば化学合成もしくは組み換え発現技術のように当業者に公知の任意の方法によって作成できる。がん細胞抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、GenBankデータベースまたは類似のデータベース、公表文献から、または定常クローニングおよびシーケンシングによって入手することができる。
特定の実施形態においては、有用な抗体は、活性化リンパ球上で発現した受容体または受容体複合体に結合することができる。受容体または受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、TNF受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパクを含み得る。適切な免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD2O、CD22、CD28、CD30、CD70、CD79、CD90、CD152/CTLA−4、PD−1、およびICOSである。適切なTNF受容体スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4−1BB、TNF−R1、TNFR−2、RANK、TACI、BCMA、オステオプロテグリン、Apo2/TRAIL−R1、TRAIL−R2、TRAIL−R3、TRAIL−R4、およびAPO−3である。適切なインテグリンの非限定的な例は、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103、およびCD104である。適切なレクチンの非限定的な例は、C型、S型およびI型レクチンである。
一部の実施形態においては、リガンドは受容体リガンドである。受容体リガンドは、特定の細胞型、組織または器官に豊富な結合パートナーを有し得る。リガンドは、受容体の自然発生アゴニストもしくはアンタゴニスト、または受容体に対して親和性を有する合成分子の場合がある。受容体リガンドは、タンパク質、核酸または、例えばペプチド、ビタミンおよび炭水化物などの他の受容体リガンドの場合もある。一実施形態において、リガンドは葉酸受容体に対して親和性を有する葉酸である。
一部の実施形態においては、リガンドは薬物が標的器官または組織を標的にするために使用、開発されてきたターゲティング部位である。当該技術分野で公知のそのような部位特異的リガンドを使用して、そして本明細書で提供される方法に用いることができる。
薬物
LDCの薬物は、細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制剤として本明細書で言及している任意の細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制薬にもすることができる。薬物は、リンカーを含む試薬前駆体の適切な反応基、例えばアミノ基、カルボン酸基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、またはアルデヒドもしくはケトン基と結合を形成し得るアミノ、アルキルアミノ基またはカルボキシレートのような官能基を有する。一実施形態において、薬物はリンカーに結合してアミドまたはカルバメートを生成する。一実施形態において、薬物はアミド結合によってリンカーに結合する。一実施形態において、薬物は単一のアミド結合を含む。一実施形態において、薬物はカルバメートによってリンカーに結合し、そして薬物はアミド結合を含む。特定の実施形態では、TFA処理は、リンカーへのアミド結合または薬物の内部アミド結合の切断によって薬物またはその一部を放出させる。
LDCの薬物は、細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制剤として本明細書で言及している任意の細胞毒性、細胞増殖抑制性また免疫抑制薬にもすることができる。薬物は、リンカーを含む試薬前駆体の適切な反応基、例えばアミノ基、カルボン酸基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、またはアルデヒドもしくはケトン基と結合を形成し得るアミノ、アルキルアミノ基またはカルボキシレートのような官能基を有する。一実施形態において、薬物はリンカーに結合してアミドまたはカルバメートを生成する。一実施形態において、薬物はアミド結合によってリンカーに結合する。一実施形態において、薬物は単一のアミド結合を含む。一実施形態において、薬物はカルバメートによってリンカーに結合し、そして薬物はアミド結合を含む。特定の実施形態では、TFA処理は、リンカーへのアミド結合または薬物の内部アミド結合の切断によって薬物またはその一部を放出させる。
細胞毒性または免疫抑制剤の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合体、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、シスプラチン、モノ白金、ビス白金、三核白金錯体およびカルボプラチンなどの白金錯体)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、ふっ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備成形化合物、プリン抗代謝物、プロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼI抑制剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。特に有用な細胞毒性薬クラスは、例えば、DNA副溝結合体、DNAアルキル化剤およびチューブリン抑制剤を含む。例示的な細胞毒性薬としては、例えば、アウリスタチン、カンプトセシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシンおよびメイタンシノイド(例えば、DM1およびDM4)、タキサン、ベンゾジアゼピン(例えば、ピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)、インドリノベンゾジアゼピンおよびオキサゾリジノベンゾジアゼピン)ならびにビンカアルカロイドが挙げられる。薬物を含む選択ベンゾジアゼピンは、WO2010/091150、WO2012/112708、WO2007/085930、およびWO2011/023883に記載されている。
例示的な実施形態においては、薬物は1つ以上、2つ以上、3つ以上または4つ以上のアミノ酸基を含むペプチド性薬物である。例示的な実施形態においては、薬物は、N末端、N−メチル化アミノ酸基を含むペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、N末端、アルキル側基を有するN−メチル化アミノ酸を含むペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、N末端、N−メチル化アラニン、N−メチル化イソロイシン、N−メチル化ロイシンまたはN−メチル化バリンを有するペプチド性薬である。さらなる例示的な実施形態においては、薬物は、N末端、N−メチル化バリンを有するペプチド性薬である。
好ましい実施形態では、薬物はアウリスタチンである。アウリスタチンは、これらに限定されないが、AE、AFP、AEB、AEVB、MMAFおよびMMAEを含む。アウリスタチンの合成および構造は、あらゆる目的のために参照によりそれぞれの全部が本明細書に援用される米国特許公開第2003−0083263号、第2005−0238649号、第2005−0009751号、第2009−0111756号、および第2011−0020343号:国際特許公開WO04/010957、国際特許公開WO02/088172、および米国特許第7,659,241号および第8,343,928号に記載されている。本発明の例示的なアウリスタチンはチューブリンに結合し、所望の細胞株上に細胞毒性または細胞増殖抑制効果に与える。一実施形態において、例示的なアウリスタチンはN−末端、N−メチル化アミノ酸を含む。より具体的には、例示的なアウリスタチンは、N−末端N、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンなどのアルキル側鎖を有するN−メチル化アミノ酸を含む。さらに具体的には、例示的なアウリスタチンはN−末端、N−メチル化バリンを含む。
他の個別の細胞毒性薬または免疫抑制剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン(AMC)、アスパラギナーゼ、5−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カリケアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、カルムスチン(BSNU)、CC−1065、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトカラシンB、ダカルバジン、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エストロゲン、5−フルオロデオキシウリジン、5−フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラミシジンD、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン(CCNU)、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、6−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、パリトキシン、プリカマイシン、プロカルバジン、リゾキシン、ストレプトゾトシン、テニポシド、6−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、VP−16およびVM−26が挙げられる。
好適な細胞毒性薬としては、DNA副溝結合体(例えば、エンジインおよびレキシトロプシン、CBI化合物;米国特許第6,130,237号を参照)、デュオカルマイシン(米国公開第20060024317号を参照)、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、CC−1065、SN−38、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンAおよびB、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、ディスコデルモライド、エリュテロビン、およびミトキサントロンも含まれる。
抗チューブリン剤の例としては、これらに限定されないが、タキサン(例えば、タキソール.RTM.(パリタキセル)、タキソテール.RTM.(ドセタキセル))、T67(Tularik)、ビンカアルカロイド(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン)が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体(例えば、エポチロンAおよびB)、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、およびエリュテロビンが挙げられる。メイタンシンおよびメイタンシノイドは抗チューブリン剤の別のグループである(ImmunoGen,Inc.;Chariら、1992,Cancer Res.52:127−131および米国特許第8,163,888号を参照)。
LDCの調製に有用な、そして具体的にはADCの調製に有用な追加的細胞毒性化合物は、米国特許第6,884,869号に記載されたものであり、特に細胞毒性化合物の記載に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書における追加的な記載は、記載された細胞毒性化合物をもった薬物複合体の調製を説明する。
リンカー
薬物をリンカーに結合するための一般的手順は当該技術分野では公知である。例えば、米国特許第8,163,888号、第7,659,241号、第7,498,298号、米国公開US20110256157、ならびに国際出願WO2011023883およびWO2005112919を参照されたい。
薬物をリンカーに結合するための一般的手順は当該技術分野では公知である。例えば、米国特許第8,163,888号、第7,659,241号、第7,498,298号、米国公開US20110256157、ならびに国際出願WO2011023883およびWO2005112919を参照されたい。
リンカーは細胞内条件下で開裂可能であり、例えば、リンカーの開裂が細胞内環境(例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内)でリガンドから治療薬を放出する。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーの場合がある。細胞内開裂剤としては、カテプシンBとDおよびプラスミンを含めることができる(例えば、Dubowchik and Walker,Pharm.Therapeutics 83:67−123,1999を参照)。例えば、がん組織で高発現するチオール依存性プロテアーゼカテプシンBによって開裂可能なペプチドリンカーを使用することができる(例えば、Phe−LeuまたはVal−Citペプチドを含むリンカー)。リンカーはまた、細胞内グリコシダーゼによって切断される糖リンカー(例えば、グルクロニダーゼによって開裂可能なグルクロニドリンカー)を含む炭水化物リンカーであり得る。
リンカーはまた、硫黄(チオール)を介してリガンドに結合し、抗体のタンパク質分解によって放出されるマレイミド−アルキレンリンカーまたはマレイミド−アリールリンカーなどの非開裂性リンカーとすることができる。
抗体は、例えば、抗体のアミン基(例えば、N末端アミノ基またはリシンのようなアミノ酸側基のアミン基)、チオール基(−SH、例えばシステイン残基のもの)、カルボキシレート(例えば、C末端カルボキシレート、またはグルタミン酸のようなアミノ酸側鎖のもの)またはヒドロキシ基(例えば、セリン残基)を介するなど、任意の適切な反応基を介して1つ以上のリンカーに共役することができる。
例示的なADCにおいては、モノメチルアウリスタチンEはプロテアーゼ開裂ペプチドリンカーを介して抗体へ共役しており、モノメチルアウリスタチンFはリンカーマレイミドカプロン酸(mc)を介して抗体に共役する。リンカーは、さらに溶解度または薬物動態を調節する化学基を含み得る。例えば、例示的なリンカーはペグ化されている。特定の例示的リンカー−薬物結合体は、
mc−MMAFであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する;あるいは
DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸(グルクロニダーゼによって開裂可能)を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むLDCにおいては、本明細書に記載した酸処理がmc−MMAFからテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(この場合Dapはドラプロリンである)、およびDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEからMMAE薬物全体を放出させる。LDCおよびADCのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または13Cによって標識されたものが含まれる。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたMMAE中の13Cによって標識されたものが含まれる。上記構造において、13Cまたは重水素化が予想される部位は「*」で示される。
mc−MMAFであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する;あるいは
DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸(グルクロニダーゼによって開裂可能)を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むLDCにおいては、本明細書に記載した酸処理がmc−MMAFからテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(この場合Dapはドラプロリンである)、およびDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEからMMAE薬物全体を放出させる。LDCおよびADCのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または13Cによって標識されたものが含まれる。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたMMAE中の13Cによって標識されたものが含まれる。上記構造において、13Cまたは重水素化が予想される部位は「*」で示される。
本明細書の定量法は、一般に本明細書で分析標的として指定したLDCの断片の放出を採用しており、これがLDC全体を代表して分析標的が定量される。分析標的の定量により、放出された分析標的の量、サンプル中のLDC中の分析標的の量および/またはサンプル中のLDCの量の測定が可能となる。何かの判断においては、適切な公知方法によって、サンプル中のリガンド量を知り、または決定すること、あるいは、所定のLDCに共役する薬物分子数(または平均数)を知り、または決定することが必要である。さらに具体的には、本明細書の分析標的はLDCの薬物分子またはLDCの薬物分子の一部である。薬物はリンカー種によってLDCのリガンドに共役しているため、分析標的は薬物またはその一部に加えてリンカー全体またはその一部も含み得る。特定の実施形態において、本明細書の分析標的はLDCに共役する薬物である。特定の実施形態において、本明細書の分析標的はLDCに共役する薬物の一部である。本明細書の特定な実施形態では、薬物はペプチドまたはその誘導体であり、そして分析標的はペプチド薬物またはペプチド薬物のペプチド部分である。特定の実施形態において、薬物がペプチドまたはその誘導体である場合、分析標的は、ジペプチドもしくはその誘導体、トリペプチドもしくはその誘導体、またはテトラペプチドもしくはその誘導体である。
トリフルオロ酢酸(TFA)によって媒介される開裂
本発明の方法は、1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液とサンプルを接触させて、LDCから分析標的の放出を誘導する工程を含む。TFAのアセトニトリル溶液も用いることができる。
本発明の方法は、1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液とサンプルを接触させて、LDCから分析標的の放出を誘導する工程を含む。TFAのアセトニトリル溶液も用いることができる。
用いるTFA濃度は、1〜20%、1〜10%、2.5〜30%、2.5〜20%、2.5〜10%、5〜15%、7〜13%、9〜11%、または9.5〜10.5%の体積百分率の場合があり、全範囲が包括される。TFA濃度は、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、または約30%の全体積百分率である。好ましい実施形態では、TFAは10体積%である。
TFA濃度は水中、サンプル混合物中または任意の他の許容可能な溶媒中への100%TFAの希釈結果とし得る。TFAは、サンプルに添加する前に希釈してもよく、またはサンプル混合物自体を希釈してもよい。
TFA反応は、可変の時間および温度条件下で行い得る。例えば、反応は20〜80℃、例えば約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、約42℃、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、約70℃、約71℃、約72℃、約73℃、約74℃、約75℃、約76℃、約77℃、約78℃、約79℃または約80℃で行い得る。
TFA反応は、典型的には周囲圧力で行われる。有意な圧力損失がなく、そのような反応で反応圧力を変えることができることは当業者には自明であろう。圧力の変化は温度の変化を要件とし得ることは自明であろう。高圧下で実施される反応ではより低い反応温度を使用することができる。酸の濃度、反応時間および反応温度は、分析標的の所望の放出レベルを達成するために反応圧力と共に本明細書に記載した範囲内で変更し得る。
反応は、約12〜24時間、10〜20時間、または15〜17時間の期間実施し得る。しかしながら、選択した分析方法が所望の確度と精度の測定値を与えることを可能にする酸濃度、温度、時間、および圧力の任意の組み合わせを使用し得る。他の箇所でも述べられているように、所定の実験または定量の結果の一貫性に関しては、所与の実験または定量化用の全試験サンプル(未知)、全対照群および全較正用サンプルに対して用いられる反応条件は同じにする必要がある。例示的な一実施形態において、開裂反応は70℃および周囲圧力でTFA10%を用いて約16時間行った。
これらに限定されないが、例えば、他のフッ素化酸、有機または無機酸などのその他の酸が記載した方法で使用し得る。具体的な代替酸としてはトリフルオロメタンスルホン酸が含まれる。揮発性の酸は一般に塩酸などの無機酸の方が好ましい。
分析標的の測定
一部の実施形態においては、方法はサンプル中の分析標的を測定する工程をさらに含む。サンプルで遭遇することが予想される濃度範囲で分析標的の定量に適した分析方法を使用することができる。
一部の実施形態においては、方法はサンプル中の分析標的を測定する工程をさらに含む。サンプルで遭遇することが予想される濃度範囲で分析標的の定量に適した分析方法を使用することができる。
一部の実施形態においては、LDCまたは内部標準は分析標的の測定前にサンプルから抽出される。分析標的は、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって収集が可能である。一部の実施形態においては、LDCまたは内部標準は、リガンドとして抗体または機能性断片を含む。これらの場合、LDCまたは内部標準は、プロテインA樹脂、プロテインG樹脂およびプロテインL樹脂から選択される樹脂とサンプルを接触させることによって収集できる。
一部の実施形態においては、分析標的は、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)を使用して検出し定量化される。より具体的には、タンデム質量分析法(MS/MS)が使用される。MS/MS法では、分析標的の選択した親イオンの1つ以上のフラグメントイオンが観察された。最初のMS段階で、当該技術分野で公知のように分析標的の親イオンを選択し、そして親イオンをフラグメンテーション、典型的には衝突誘起フラグメンテーションにかけて、例えば、質量関数(m/z)としてイオン電流ピークを生成させる各フラグメントと関連するイオン電流の測定によって定量が可能な1つ以上のそれぞれのフラグメントイオンを生成させる。親イオンおよび1つ以上のそのフラグメントイオンが由来する化学種の定量のためにフラグメントの積分ピーク面積を測定できる。本明細書に記載の分析標的の測定への適用では1つ以上のフラグメントが、放出された分析標的の親イオンに由来する。
本明細書に記載の分析標的の定量に任意のMS/MS法を使用できるが、トリプル四重極または四重極イオントラップを用いる方法がより一般的に使用される。本明細書の方法に使用される質量分析計は、サンプルの質量スペクトル全体または、より典型的には対象の質量スペクトルの選択部分を観察するように操作し得る。特に、MS/MS法においては、選択した親イオンの1つ以上のフラグメントイオンからの信号(例えば、イオン電流)を監視し得る。選択反応モニタリング(SRM)操作を用いて選択親イオンから生成された単一断片イオンを観察することができる。あるいは、多重反応モニタリング(MRM)操作を用いて選択親イオンから生成された1つ以上のフラグメントイオンを観察することができる。用語のフラグメントイオンの使用は、選択したイオンの解離またはフラグメンテーションによりMS/MSで生成されるイオンに関連する。方法は、当該技術分野では公知であり、一般に、フラグメントイオンおよびフラグメントイオンではない他の生成イオンを含むプロダクトイオンをより多く生成する選択親イオンの反応を伴う検体の定量に有用であることが理解されよう。そのような全プロダクトイオンを生成するMS/MS法は、本明細書に記載の方法で類似的に用いることができる。
一部の実施形態においては、様々なサンプル中の分析標的の定量用に適した液体クロマトグラフィー法が使用される。
一部の実施形態においては、方法は、外部標準として標準曲線(検量線)の使用、およびMS、LC―MS、LC―MS/MS法による検体の定量用に内部標準を添加した標準曲線の使用の併用を含む。一部の実施形態においては、標準曲線を使用して、本明細書で論じた生物サンプルを含む、様々なサンプル中の検体の濃度を決定することができる。具体的には、内部標準からの検体量を使用してLDCから検体量を決定することができる。特定の実施形態においては、内部標準からの検体量を使ってLDCからの検体量の決定用の標準曲線を作成する。それらの実施形態において、内部標準からの検体およびLDCからの検体は標識によって区別が可能である。
濃度アッセイ
一部の実施形態においては、方法はサンプル中のLDCの濃度を決定する工程をさらに含む。本発明はまた、サンプル中のLDC中のリガンドに共役する薬物の濃度を決定する方法を提供する。
一部の実施形態においては、方法はサンプル中のLDCの濃度を決定する工程をさらに含む。本発明はまた、サンプル中のLDC中のリガンドに共役する薬物の濃度を決定する方法を提供する。
定量分析は、好ましくはアッセイ内の較正を含む。標準曲線は、例えばLDCの濃度を増やした一連の少なくとも6つのサンプルを調製することで作成できる。内部標準を標準曲線サンプルに添加し、次いでサンプルをプロテインAおよび上述のLC−MS/MS法によって処理する。各標準のピーク面積を内部標準について得られたピーク面積で割り、そして得られたピーク面積比を標準濃度の関数としてプロットする。一部の実施形態においては、少なくとも6つのデータポイントを、例えば線形回帰分析を使って曲線に当て嵌める。
安定性アッセイ
一部の実施形態においては、方法を使用してLDCの安定性を決定する。
一部の実施形態においては、方法を使用してLDCの安定性を決定する。
1つの例示的アッセイにおいては、LDCを滅菌血漿に置いて、37℃で保温静置した。保温静置の開始時点と1時間〜1週間以上の様々な時点で、一定分量を取り出し、−80℃で凍結させる。当該時点の終了後に、サンプルは、リガンドおよび共役薬物を特異的に抽出するタンパク質精製法にかけた。例えば、抗体−薬物複合体は、プロテインAアフィニティー樹脂に流して抗体を捕捉してもよく、そしてその後、樹脂を緩衝液で洗浄する。リガンド−薬物複合体の捕捉後、1−30体積%のトリフルオロ酢酸で処理することで捕捉したリガンドから薬物が放出される。放出された薬物は、次いで標準LC−MS法で定量が可能であり、保温静置前のアリコートについて測定された薬物の量で除した各時点で測定した薬物の量を使って、各時点でリガンドに共役したまま残っている薬物の百分率を決定することができる。本アッセイの精度は、同じ薬物−リンカーの同位体標識版を用いて調製される内部標準リガンド−薬物複合体を含めることによって、例えば、それから放出される薬物は、質量差によって試験薬物−リンカーから放出される薬物からLC−MSアッセイで独立して検出できる。この同位体標識内部標準リガンド−薬物複合体は、リガンド捕捉工程(例えば、プロテインA)の直前に等量で各サンプルに添加される。LDCから放出された薬物または薬物の一部の定量は、次いで内部標準を使って従来型液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS/MS)法によって行う。薬物動態アッセイに使用する質量分析法は当該技術分野では公知である。(例えば、Wantら、Spectroscopy 17:681−691(2003);Okeleyら、Clin Cancer Res.16:888−897(2010);Singhら、DMD(2017);Alleyら、Bioconjugate Chem.19:759−765(2008)を参照されたい)。
他の実施形態では、LDCが対象に投与され、LDCの投与後の異なる時点で対象からサンプルを取得する。多数のサンプルを、LDCからの分析標的の測定に関して本明細書で提供される方法にかける。一部の実施形態においては、内部標準はLDCと一緒に投与される。サンプル中のLDCの量を比較し、それを使用して経時でLDCの安定性を決定できる。
一部の実施形態においては、LDCがエクスビボでサンプルに添加される。サンプルは、LDCの添加後の種々の時点の後に収集される。多数のサンプルを、LDCからの分析標的の測定に関して本明細書で提供される方法にかける。一部の実施形態においては、内部標準はLDCと一緒にサンプルに添加される。サンプル中のLDCの量を比較し、それを使用して経時的にエクスビボでLDCの安定性を決定できる。
他のアッセイ
本明細書で提供される方法を使用し、リガンドあたりの薬物の平均数を決定できる。例えば、リガンドあたりの薬物の平均数は、本明細書に記載した方法によって得られたリガンド共役薬物の濃度をリガンドの濃度で割ることによって測定できる。
本明細書で提供される方法を使用し、リガンドあたりの薬物の平均数を決定できる。例えば、リガンドあたりの薬物の平均数は、本明細書に記載した方法によって得られたリガンド共役薬物の濃度をリガンドの濃度で割ることによって測定できる。
他の実施形態においては、本明細書に記載した酸媒介開裂法および関連分析法は、サンプル中のLDCの量の決定、またはLDCに共役した薬物の量の決定に依存する様々な実験に使用が可能である。本明細書の方法は、例えば、疾患または障害の治療用臨床薬の開発の背景においてLDCからの薬物の放出動態の決定に使用できる。本明細書の方法はまた、LDCの薬物動態の試験に使用可能である。本明細書の方法を使用し、臨床応用におけるLDCの使用を評価できる。
キット
別の態様では、サンプル中のLDCの測定またはLDCに共役した薬物量の測定のためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載したアッセイの実行に有用な1つ以上の化学物質および一般的には1つ以上の化学成分を含む。キットには、典型的には、一緒に包装された別々の容器に選択された量で異なる化学成分が提供され、そしてアッセイを実行するための取扱説明書が含まれる場合がある。所定のキット内の化学成分の量は、一般的に各キットに対して選択されたアッセイ数を実行するための選択された量で提供される。例えば、各キットは、1つのアッセイを実行するために設計される場合があり、その結果、与えられたアッセイの全工程を実行するのに十分な量の全化学種が提供される。キットはまた、アッセイを実行するのに必要な試薬または溶剤を供給する場合がある。キットは、例えば、サンプルから所定のLDCまたはLDCの一種を抽出するための試薬を提供できる。一実施形態では、本明細書のキットは、任意のADCを含む任意の所定のLDCに対して適切に標識された内部標準を含む。キットの内部標準は、標識が薬物中に配置されている同位体標識LDCとすることができる。そのようなキットはまた、標準曲線の調製用の未標識LDCを含み得る。
別の態様では、サンプル中のLDCの測定またはLDCに共役した薬物量の測定のためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載したアッセイの実行に有用な1つ以上の化学物質および一般的には1つ以上の化学成分を含む。キットには、典型的には、一緒に包装された別々の容器に選択された量で異なる化学成分が提供され、そしてアッセイを実行するための取扱説明書が含まれる場合がある。所定のキット内の化学成分の量は、一般的に各キットに対して選択されたアッセイ数を実行するための選択された量で提供される。例えば、各キットは、1つのアッセイを実行するために設計される場合があり、その結果、与えられたアッセイの全工程を実行するのに十分な量の全化学種が提供される。キットはまた、アッセイを実行するのに必要な試薬または溶剤を供給する場合がある。キットは、例えば、サンプルから所定のLDCまたはLDCの一種を抽出するための試薬を提供できる。一実施形態では、本明細書のキットは、任意のADCを含む任意の所定のLDCに対して適切に標識された内部標準を含む。キットの内部標準は、標識が薬物中に配置されている同位体標識LDCとすることができる。そのようなキットはまた、標準曲線の調製用の未標識LDCを含み得る。
別の実施形態では、キットは、任意の選択抗体を含む任意の選択リガンドを、リンカーおよび薬物に共役させるための反応基を含有する標識リンカー−薬物結合体を含む試薬を含む。より具体的には、試薬が薬物または薬物の一部で標識されるため、分析標的の放出時に標識が分析標的と共に放出される。キットはさらに、選択リガンドまたは抗体との共役を実行するための試薬または溶媒を含む場合がある。キットはまた、未標識LDCの調製のための未標識リンカー−薬物試薬を含み得る。キットはさらに、未標識または標識分析標的、例えば酸処理によって放出される薬物または薬物の一部を含み得る。特定の実施形態において、キットは、L−mc−MMAFまたはL−DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEの測定用の内部標準として役立つ、任意の選択リガンドまたは抗体に共役する同位体標識mc−MMAFまたは同位体標識DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む。そのようなキットは臨床用途に適したLDCの開発のための研究支援として使うことができる。そのようなキットはまた、患者に負荷しているLDCまたはLDC薬の監視に必要な臨床応用に使用することができる。
一部の実施形態においては、キットは、リンカー−薬物結合体を共役するための一対の試薬、そして単一の共役反応に必要な試薬に加えて別包装でリガンドも含み得る。キットは、反応を実行するための溶媒または緩衝液、そして使用説明書を含む場合があり得る。リガンドと薬物−リンカーの結合方法は当該技術分野では公知である。(例えば、Lyonら、Methods in Enzymology,vol.52,pgs.123−138,2012;Sunら、Bioconjugate Chem.16:1282−1290,2005を参照されたい)。内部標準および試薬は安定または不安定同位体によって同位体標識されている。安定同位体としては、これらに限定されないが、2H、13C、および15Nが含まれる。放射性同位体または不安定同位体としては、これらに限定されないが、3H、14C、および12Nが含まれる。
あるいは、内部標準は、異なる分子量を付与するが、同位体標識をしない構造修飾によってLDCから区別し得る。例えば、内部標準は、分析標的のある位置に水素の代わりにメチル基またはハロゲンを含み得る。これは、分子量を変化させるが、内部標準がTFAと反応する仕方は実質的に変えない効果がある。当該技術分野では理解されているように、使用される所定の検体用の任意の内部標準は、所定の分析方法で検体として挙動するのを確実にするために評価されなければならない。
以下の実施例は例示のために提供されており、限定するためではない。
実施例1:アッセイ法
実験サンプル、キャリブレータおよび内部標準(IS)の調製
1.ADCキャリブレータの希釈物は、下記濃度の抗体結合薬物(ADC)でサンプル基質(例えば、緩衝液、血漿など)に調製した。
a.8点の検量線:10μM、4μM、1.6μM、640nM、256nM、102.4nM、41nM、16.4nMのADC等量。
b.ブランクを含めた(ADCなし、サンプル基質のみ)
2.ADC内部標準(「IS」)の希釈は、500nMのADC等量の単一濃度でサンプル基質に調製した。
3.一定体積のADC ISを、一定体積の各キャリブレータまたは未知サンプルと合わせて、最終体積を250μl〜1000μlの範囲とした。
実験サンプル、キャリブレータおよび内部標準(IS)の調製
1.ADCキャリブレータの希釈物は、下記濃度の抗体結合薬物(ADC)でサンプル基質(例えば、緩衝液、血漿など)に調製した。
a.8点の検量線:10μM、4μM、1.6μM、640nM、256nM、102.4nM、41nM、16.4nMのADC等量。
b.ブランクを含めた(ADCなし、サンプル基質のみ)
2.ADC内部標準(「IS」)の希釈は、500nMのADC等量の単一濃度でサンプル基質に調製した。
3.一定体積のADC ISを、一定体積の各キャリブレータまたは未知サンプルと合わせて、最終体積を250μl〜1000μlの範囲とした。
ADCキャリブレータとISの設定濃度(工程1と2)およびISをADCキャリブレータおよびサンプルと混合した後の最終体積(工程3)は、実験ごとに変化する;これらの値は分析対象のADCにも依存する;この方法は広範囲の用途に適合する。
96ウェルフィルタープレートの調製
プロテインAアガロースMabSelect(GEヘルスケア)は、1部のアガロース樹脂対3部の緩衝材のスラリー比で緩衝液(PBS、pH7.4)中に平衡化した。
プロテインAアガロースMabSelect(GEヘルスケア)は、1部のアガロース樹脂対3部の緩衝材のスラリー比で緩衝液(PBS、pH7.4)中に平衡化した。
スラリー(200μl樹脂)の800μlをフィルタープレートに添加し、4℃で5分間、1250xgで遠心分離し、水相を除去した。
このポイント以降の各遠心分離工程について、96ウェルポリプロピレン製2ml希釈ブロックを使用して、緩衝材、サンプルおよびキャリブレータ流体、洗浄水および溶出体積を収集した。
サンプル捕捉と溶出
1.200μlのADCキャリブレータ(+IS)と実験サンプル(+IS)を200μlのプロテインA樹脂に加えて振とうした(1時間、4℃、約1000rpm)。
2.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、サンプル基質を除去した。
3.洗浄緩衝液を加えて(1X PBS、pH7.4;200〜400μl)、4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、サンプル基質の除去を完了した。
4.洗浄工程は、溶出前に1〜3回行った。
5.樹脂からADCを溶出するために200μlのIgG溶出緩衝材(Thermo Scientific)を加え、プレートを振とう機に置いた(1時間、4℃、約1000rpm)。
6.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、ADC/ISを溶出した。
7.工程4と5を繰り返して樹脂からADC/ISの溶出を完了した。溶出したADC/ISを1つにまとめた最終容積は400μlであった。
1.200μlのADCキャリブレータ(+IS)と実験サンプル(+IS)を200μlのプロテインA樹脂に加えて振とうした(1時間、4℃、約1000rpm)。
2.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、サンプル基質を除去した。
3.洗浄緩衝液を加えて(1X PBS、pH7.4;200〜400μl)、4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、サンプル基質の除去を完了した。
4.洗浄工程は、溶出前に1〜3回行った。
5.樹脂からADCを溶出するために200μlのIgG溶出緩衝材(Thermo Scientific)を加え、プレートを振とう機に置いた(1時間、4℃、約1000rpm)。
6.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、ADC/ISを溶出した。
7.工程4と5を繰り返して樹脂からADC/ISの溶出を完了した。溶出したADC/ISを1つにまとめた最終容積は400μlであった。
サンプル処理
1.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(IgG溶出緩衝液中)を60℃で4時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
2.400μlの10体積%トリフルオロ酢酸(TFA)(水希釈)を加えて、プレートをテフロン(商標)被覆シリコンプレートマットで密封した。
3.密封したプレートをジャケット付きサーモミキサーに配置し、一晩温置した(70℃で約16時間、約600〜800rpm)。
4.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、凝縮沈降させた。
5.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(10体積%TFA中)を40℃で4時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
6.500μlの氷冷100%MeOHを加えて、プレートをプレートシーラーで覆い、振とう機上に置いた(4℃で20分間、約1000rpm)。
7.プレートを4℃で5分間、4000xgで遠心分離し、デブリを沈降させた。
8.容積500μlの400μlをオートサンプラープレートに移した。
9.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(100%MeOH中)をプレートが乾燥するまで40℃、窒素ガス下で蒸発させた。
10.サンプルは、0.1%ギ酸(FA)中の95/5CH3CN(アセトニトリル、CAN)/H2Oの1000μlまたは0.1%FA中の20%アセトニトリルで再構成した。工程は、使用したクロマトグラフィーの種類に依存した。
1.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(IgG溶出緩衝液中)を60℃で4時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
2.400μlの10体積%トリフルオロ酢酸(TFA)(水希釈)を加えて、プレートをテフロン(商標)被覆シリコンプレートマットで密封した。
3.密封したプレートをジャケット付きサーモミキサーに配置し、一晩温置した(70℃で約16時間、約600〜800rpm)。
4.プレートを4℃で5分間、2000xgで遠心分離し、凝縮沈降させた。
5.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(10体積%TFA中)を40℃で4時間、窒素ガス下またはプレートが乾燥するまで蒸発させた。
6.500μlの氷冷100%MeOHを加えて、プレートをプレートシーラーで覆い、振とう機上に置いた(4℃で20分間、約1000rpm)。
7.プレートを4℃で5分間、4000xgで遠心分離し、デブリを沈降させた。
8.容積500μlの400μlをオートサンプラープレートに移した。
9.ADC/ISキャリブレータおよびサンプル(100%MeOH中)をプレートが乾燥するまで40℃、窒素ガス下で蒸発させた。
10.サンプルは、0.1%ギ酸(FA)中の95/5CH3CN(アセトニトリル、CAN)/H2Oの1000μlまたは0.1%FA中の20%アセトニトリルで再構成した。工程は、使用したクロマトグラフィーの種類に依存した。
サンプル分析
1.LCカラムと質量分析計を平衡化した。
2.20μLの再構成サンプルをLCに注入した。
3.放出された分析標的の適切なクロマトグラフィーを提供する質量分析計直結型LCカラムを使用し、分析標的と内部標準フラグメントイオンは、多重反応モニタリング(MRM)操作法を用いて測定した。
4.分析標的のピーク面積は、内部標準分析標的について得られたピーク面積で割った。得られた分析標的/ISピーク面積比は、分析標的キャリブレータ濃度(ng/ml)の関数としてプロットし、点を線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。
1.LCカラムと質量分析計を平衡化した。
2.20μLの再構成サンプルをLCに注入した。
3.放出された分析標的の適切なクロマトグラフィーを提供する質量分析計直結型LCカラムを使用し、分析標的と内部標準フラグメントイオンは、多重反応モニタリング(MRM)操作法を用いて測定した。
4.分析標的のピーク面積は、内部標準分析標的について得られたピーク面積で割った。得られた分析標的/ISピーク面積比は、分析標的キャリブレータ濃度(ng/ml)の関数としてプロットし、点を線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。
次の分析は、DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAE共役抗体から分析標的としてMMAEを放出することを特に指向した。
1.タンデム質量分析計に接続した50x3.0mm 5μmのシリカ系カラム(BETASIL(商標)、ThermoFisher Scientific)を液体クロマトグラフィーに取り付け、両方を平衡化した。
2.20μLの再構成サンプルをLCに注入した。
3.移動相A(H2O中の0.1%ギ酸)と移動相B(ACN中の0.1%ギ酸)は以下の勾配(表1)を使用し、予測されるMMAE(分析標的)保持時間は1.16分であった。
(表1)LC勾配
4.MMAE濃度は、718m/zから686m/z(MMAEの前駆体とフラグメントイオン)および726m/zから694m/z(d8−MMAEの前駆体とフラグメントイオン)の遷移を選択的に監視する多重反応モニタリング(MRM)LC−MS/MSアッセイを使用して決定した。
5.各MMAE標準のピーク面積は、内部標準d8−MMAEで得られたピーク面積で割った。得られたMMAE/d8−MMAE面積比は、MMAE標準濃度(ng/ml)の関数としてプロットし、点は線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。MMAE測定の場合、LC−MS/MSデータを取得し、LC−MS/MS機器メーカー(Analyst(登録商標)1.6.1およびMultiquant(商標)バージョン2.1、AB SCIEX)から入手可能な操作およびデータ解析ソフトウェアを用いて処理した。
1.タンデム質量分析計に接続した50x3.0mm 5μmのシリカ系カラム(BETASIL(商標)、ThermoFisher Scientific)を液体クロマトグラフィーに取り付け、両方を平衡化した。
2.20μLの再構成サンプルをLCに注入した。
3.移動相A(H2O中の0.1%ギ酸)と移動相B(ACN中の0.1%ギ酸)は以下の勾配(表1)を使用し、予測されるMMAE(分析標的)保持時間は1.16分であった。
(表1)LC勾配
4.MMAE濃度は、718m/zから686m/z(MMAEの前駆体とフラグメントイオン)および726m/zから694m/z(d8−MMAEの前駆体とフラグメントイオン)の遷移を選択的に監視する多重反応モニタリング(MRM)LC−MS/MSアッセイを使用して決定した。
5.各MMAE標準のピーク面積は、内部標準d8−MMAEで得られたピーク面積で割った。得られたMMAE/d8−MMAE面積比は、MMAE標準濃度(ng/ml)の関数としてプロットし、点は線形回帰曲線に当て嵌めた。サンプルから測定された応答比は、標準曲線によって決定された線の方程式を使って定量した。MMAE測定の場合、LC−MS/MSデータを取得し、LC−MS/MS機器メーカー(Analyst(登録商標)1.6.1およびMultiquant(商標)バージョン2.1、AB SCIEX)から入手可能な操作およびデータ解析ソフトウェアを用いて処理した。
実施例2:抗体−薬物複合体のエクスビボ安定性
2種類のADCのエクスビボ安定性は、酸触媒加水分解法を使用して評価した。ADC1とADC2は、マレイミドカプロイルリンカー(mc)を使用した強力な抗有糸***性の抗チューブリンアウリスタチ誘導体(モノメチルアウリスタチンF)であるmcMMAFに結合した抗体である。
2種類のADCのエクスビボ安定性は、酸触媒加水分解法を使用して評価した。ADC1とADC2は、マレイミドカプロイルリンカー(mc)を使用した強力な抗有糸***性の抗チューブリンアウリスタチ誘導体(モノメチルアウリスタチンF)であるmcMMAFに結合した抗体である。
mcリンカーが上記のリンカーの場合、nは5である。mcMMAFは、上記種の場合にnは5、および薬物はMMAFである。
mcMMAFリンカー−薬物結合体は酵素的に開裂しない。
保存
・ADC1−PBS中7.1mg/mL(4.3薬物/mAb;203.5uM mcMMAF当量)
・IS1−PBS中4.4mg/mL(4.0薬物/mAb;117.3uM mcMMAF当量)
・ADC2−PBS中5.5mg/mL(4.1薬物/mAb;150.3uM mcMMAF当量)
・IS2−PBS中9.0mg/mL(3.8薬物/mAb;228.0uM 標識mcMMAF当量)
・ADC1−PBS中7.1mg/mL(4.3薬物/mAb;203.5uM mcMMAF当量)
・IS1−PBS中4.4mg/mL(4.0薬物/mAb;117.3uM mcMMAF当量)
・ADC2−PBS中5.5mg/mL(4.1薬物/mAb;150.3uM mcMMAF当量)
・IS2−PBS中9.0mg/mL(3.8薬物/mAb;228.0uM 標識mcMMAF当量)
スプラーグドーリーラットのNa+クエン酸血漿4mlに250μg/mlの濃度でADC1またはADC2をスパイクした。スパイクされた血漿の1mlを標準曲線の作成に使用した。標準曲線サンプルは、ADC1またはADC2いずれかの連続希釈液を含んだ。
スパイクされた血漿の残り3mlから、450μlを0時間、6時間、1日、2日、4日および7日の時点で取り出した。ADC1(IS1)とADC2(IS2)の内部標準を調製した。内部標準はそれぞれ13C標識薬物(具体的には、MMAFのフェニル環を6個の13Cで標識)を含み、6amuが質量に加わった。内部標準は、ラットのクエン酸血漿で10μMの薬物−リンカー等量([5X]濃度)に希釈した。
96ウェルサンプル/標準プレプレートの調製。200μlの各ADCサンプルと各標準曲線サンプルを3回混合し、リバースピペッティングで96ウェル、350μl/ウェル内に予め置いた。50μlの内部標準をADCサンプルと標準曲線サンプルに加えた。それぞれ配置したサンプルを3〜5回混合した。
96ウェルフィルタープレートの調製。プロテインAアガロースは、洗浄し、1部樹脂対3部緩衝液(800μl中200μl樹脂床)スラリー比でpH7.4のPBSで平衡化した。プロテインAアガロースの800μlのスラリー体積を、96ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを4℃で5分間、1250xgで遠心分離し、水相を除去した。
200μlの各ADCサンプルと標準曲線サンプルを3回混合し、次いで、リバースピペッティングでフィルタープレート上の適切な位置に移した。
プレートは、4℃で1時間、750−1000rpmに設定したタイタープレートシェーカーに固定した。
96ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって96ウェルの2mlのコレクションプレートに回収した。
各樹脂床は、200μlの緩衝液(40mM KPO4、20mM EDTA)で1回洗浄した。洗浄画分は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって回収し、保存した。
ADC溶出200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに室温下、約1000rpmで5分間置いた。溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。別の200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートをサーモミキサーに室温下、約1000rpmで5分間置いた。溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。これによって400μlの最終溶出体積が得られた。
溶離液は、60℃で3〜4時間、窒素ガス下で蒸発させた。
蒸発後、400μlの10体積%のトリフルオロ酢酸(TFA)(水希釈)を各ウェルに添加した。テフロン被覆シリコンプレートマットを使用して96ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、70℃、約850rpmで一晩(約16時間)保温静置した。
96ウェルプレートは、ハードスピン(4000xg、5分間)にかけてタンパク質の沈殿物をペレット化した。300μlを回収し、新しい96ウェル、2mlのコレクションプレートに移した。プレートは、40℃で2〜3時間、窒素ガス下で蒸発させた。
各サンプルを溶解するために300μlの33%CH3CN(アセトニトリル)/0.1体積%ギ酸に再懸濁し、3分間、約1000rpmでボルテックスした。
プレートを5分間、500xgで回転し、200μlの各サンプルをシラン化ガラスインサートでHPLCへ移した。
25μlの各サンプルを四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析を介して分析した。
全時点での対応標準曲線を処理し、そして放出されたMMAFの濃度を決定した。結果は、図1に示す。
実施例3:臨床サンプル分析
ADC3で治療した患者からの臨床サンプルを分析した。ADC3はmcMMAF共役抗体である。
ADC3で治療した患者からの臨床サンプルを分析した。ADC3はmcMMAF共役抗体である。
保存
・ADC3−PBS中15mg/mL 4薬物/mAb
・IS3−PBS中4.59mg/mL(3.6薬物/mAb;110.2μM mcMMAF当量)
・ADC3−PBS中15mg/mL 4薬物/mAb
・IS3−PBS中4.59mg/mL(3.6薬物/mAb;110.2μM mcMMAF当量)
ADC3標準曲線サンプルをK2EDTAヒト血漿中に希釈した。内部標準(50μMのADC当量に希釈)もサンプルあたり100μl/標準の準備のためK2EDTAヒト血漿に希釈した。
96ウェルサンプル/標準プレプレートの調製。100μlの各サンプルと標準曲線サンプルを混合し、96ウェル内に予め置いた。次に、200μlの内部標準を各サンプル/標準曲線サンプルに加えた。500μlのPBS−Tを各ウェルに添加した。
96ウェルフィルタープレートの調製。プロテインAアガロースは、洗浄し、1部樹脂対3部緩衝液(800μl中200μl樹脂床)スラリー比でpH7.4のPBSで平衡化し、そして使用前に4℃でストック溶液として貯蔵した。アガロースの800μlのスラリー体積(200μl樹脂床)を96ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを4℃で5分間、1250xgで遠心分離し、水相を除去した。
700μlの各サンプル/標準曲線サンプル/PBS−Tを3回混合し、次いで、リバースピペッティングでフィルタープレート上の適切な位置に移した。
プレートは、4℃で1時間、750〜1000rpmに設定したタイタープレートシェーカーに固定した。
96ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって96ウェルの2mlのコレクションプレートに回収した。
各樹脂床を200μlのPBSで1回洗浄した。洗浄画分は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって回収し、保存した。
ADC溶出。200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、そしてプレートは、サーモミキサーに4℃下、約1000rpmで5分間置いた。
溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。別の200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに4℃、約1000rpmで5分間置いた。溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。これによって400μlの最終溶出体積が得られた。
各ウェルに40μlの100%TFAを加えて10体積%TFAを得、テトラペプチド分析標的を放出させた。テフロン(商標)被覆シリコンプレートマットを使用して96ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、化学的ヒュームフードに70℃、約850rpmで一晩温置した。
96ウェルプレートは、ハードスピン(4000xg、5分間)にかけてタンパク質の沈殿物をペレット化した。300μlを回収し、新しい96ウェル、2mlのコレクションプレートに移した。プレートは、40℃で2〜3時間、窒素ガス下で蒸発させた。
各サンプルを溶解するために2%アセトニトリル+0.1%ギ酸の100μlに再懸濁し、3分間、約1000rpmでボルテックスした。
サンプル中の分析標的は、LC−MS/MSを使用して分析した。サンプル中の抗体の量は、ELISAアッセイ法で測定した。結果は、図2に示し、抗体あたりの薬物としてプロットした。
実施例4:抗体−薬物複合体(分析物断片)のインビボ安定性
ADC4の安定性は、10mg/kgまたは20mg/kgのADC4で処理したラットで分析した。ADC4は、ペグ化モノメチルアウリスタチンE(DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAE)共役抗体である。MMAEリンカーは、ペグ化されており、そしてジアミノプロピオン酸および、β−グルクロニダーゼによって開裂するβ−グルクロニドを含有する(下記の構造を参照)。酸放出産物はMMAE(分析標的)である。
ADC4の安定性は、10mg/kgまたは20mg/kgのADC4で処理したラットで分析した。ADC4は、ペグ化モノメチルアウリスタチンE(DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAE)共役抗体である。MMAEリンカーは、ペグ化されており、そしてジアミノプロピオン酸および、β−グルクロニダーゼによって開裂するβ−グルクロニドを含有する(下記の構造を参照)。酸放出産物はMMAE(分析標的)である。
カルバメートを生成するためのリンカーのカルボネートのMMAE共役は、TFA処理によるMMAE薬物全体の開裂を容易にすると考えられている。
保存
・ADC4、PBS中5.4mg/mL(36.0uM ADC)(7.93薬物/mAb;285.5MMAE当量)
・IS4、PBS中7.03mg/mL(46.9uM ADC)(7.93薬物/mAb;371.9uM d8−MMAE当量)
・ADC4、PBS中5.4mg/mL(36.0uM ADC)(7.93薬物/mAb;285.5MMAE当量)
・IS4、PBS中7.03mg/mL(46.9uM ADC)(7.93薬物/mAb;371.9uM d8−MMAE当量)
ラットのK2EDTA添加血漿にADC4と内部標準をスパイクした。内部標準は2H−標識MMAEを含み、質量に8Daを加えた。MMAE標準曲線サンプルも調製した。
前プレートを調製した(実施例1を参照)。
96ウェルフィルタープレートの調製。プロテインAアガロースは、洗浄し、1部樹脂対3部緩衝液(800μlスラリー中200μl樹脂床)スラリー比でpH7.4のPBS中に平衡化した。アガロースの800μlのスラリー体積(200μl樹脂床)を96ウェルフィルタープレート上の適切な位置に加えた。プレートを4℃で5分間、1250xgで遠心分離し、水相を除去した。
前プレートからの各標準の200μlを3回混合した後、フィルタープレート上の適切な位置に移した。
プレートは、4℃で1時間、約900rpmに設定したタイタープレートシェーカー に固定した。
96ウェルフィルタープレート分画を通した流体は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって96ウェルの2mlのコレクションプレートに回収した。
各樹脂床は、pH7.4の1XPBSの400μlで2回洗浄した。洗浄画分は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって回収し、保存した。
ADC溶出 200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、そしてプレートは、サーモミキサーに室温下、約900rpmで5分間置いた。
溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。別の200μlのIgG溶出緩衝液を各樹脂床に加え、プレートは、サーモミキサーに室温下、約900rpmで5分間置いた。溶離液は、4℃で5分間、2000xgの遠心分離によって2mlのコレクションプレートに回収した。これによって400μlの最終溶出体積が得られた。
サンプルは、60℃で3〜4時間、窒素ガス下で蒸発させた。
蒸発後、400μlの10体積%TFA(水で希釈)を各ウェルに添加した。テフロン被覆シリコンプレートマットを使用して96ウェルプレートを密封した。プレートは、ジャケット付きサーモミキサー内に置いて、70℃、約650rpmで一晩(約16時間)保温静置した。
96ウェルプレートは、2000xgで5分間遠心分離し、ウェルの側面から凝集沈降させた。プレートは、40℃で約4時間、窒素ガス下で蒸発させた。
蒸発後、500μlの氷冷MeOHを各ウェルに添加した。プレートは、プレートシーラーで被覆し、4℃で20分間、タイタープレートシェーカーに置いた。
プレートは、ハードスピン(4000xg、5分間)にかけた。400μl(500μlの全体積のうち)をオートサンプラープレートに移した。
オートサンプラープレートは、乾燥するまで40℃、窒素ガス下で蒸発させた。サンプルは、0.1%FA中95/5アセトニトリル/水の1000μlで再構成した。
サンプルは、LC−MS/MSを使用して分析した。結果は、図3に示す。
実施例5:高い安定性をもった抗体−薬物複合体の開発
強力な細胞毒性薬に部位特異的に結合できる改変システイン抗体群(S239C、E269C、K326CおよびA327C)を作成し、本明細書で提供した方法でそれらの安定性を試験した。実験では、ほぼ100%の安定性をもった均一な2負荷ADCが同定された。さらに、ADCの安定性がHICで測定された見掛け疎水性と相関することが観察されたことから、チオスクシンイミド加水分解を速めることなく安定性を付与する付加的手段として化学的隔離が示唆された。
強力な細胞毒性薬に部位特異的に結合できる改変システイン抗体群(S239C、E269C、K326CおよびA327C)を作成し、本明細書で提供した方法でそれらの安定性を試験した。実験では、ほぼ100%の安定性をもった均一な2負荷ADCが同定された。さらに、ADCの安定性がHICで測定された見掛け疎水性と相関することが観察されたことから、チオスクシンイミド加水分解を速めることなく安定性を付与する付加的手段として化学的隔離が示唆された。
構造解析と分子モデリング
無傷抗体および、Fcガンマ受容体3に結合するヒトFc領域のタンパク質データベースファイル(それぞれの登録番号1HZHと1E4K)を解析に使用した。Pymol(Schrodinger,2010)を使用して図4Aに提供した分子構造モデルを作成した。鋳型としてのFcガンマ受容体3(登録番号1HZH)に結合させたヒトFc領域を使用し、選択残基(K326、S239、E269およびA327)をin silicoでシステインに変換し、新しい残基に対する溶媒露出度をGETAREA(Fraczkiewicz and Braun,1998)を使用して計算した。4つの残基に対する溶媒露出度は、図4Bに提示し、部位間で最大5倍の差異を示した。さらに、改変システイン抗体(S239C、E269C、K326CおよびA327C)についての静電計算は、APBS(Bakerら、2001)を使用して実行し、図4Cに提示した。
無傷抗体および、Fcガンマ受容体3に結合するヒトFc領域のタンパク質データベースファイル(それぞれの登録番号1HZHと1E4K)を解析に使用した。Pymol(Schrodinger,2010)を使用して図4Aに提供した分子構造モデルを作成した。鋳型としてのFcガンマ受容体3(登録番号1HZH)に結合させたヒトFc領域を使用し、選択残基(K326、S239、E269およびA327)をin silicoでシステインに変換し、新しい残基に対する溶媒露出度をGETAREA(Fraczkiewicz and Braun,1998)を使用して計算した。4つの残基に対する溶媒露出度は、図4Bに提示し、部位間で最大5倍の差異を示した。さらに、改変システイン抗体(S239C、E269C、K326CおよびA327C)についての静電計算は、APBS(Bakerら、2001)を使用して実行し、図4Cに提示した。
複合体の調製
追加的な重鎖システイン残基(S239C、E269C、K326CおよびA327C)で改変させたヒト化抗CD70(h1F6)(McEarchenら、2008)は、非開裂性アウリスタチン、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンF(mcMMAF)、プロテアーゼ開裂性ピロロベンゾジアゼピンまたはサンドラマイシン(Biomar)薬リンカーに、以前に記載されたプロトコル(Jeffreyら、2013)にしたがって共役させた。簡潔に、抗体は、10等量のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)と1mM EDTAを添加し、そして1Mのトリス緩衝液(pH 9.0)を用いてpH7.4に調整することで完全に還元した。反応液は、37℃で1時間温置した後に22℃に冷却し、30等量のデヒドロアスコルビン酸を加えた。1Mのトリス−HCl緩衝液 (pH3.7)でpH6.5に調整し、1時間、22℃で放置して酸化反応を進行させた。この結果、生来のジスルフィドは再構成したが、改変重鎖システインは還元状態のまま残り、共役に利用可能であった。次に、1M のトリス緩衝液(pH9.0)を加えて溶液pH7.4まで再度上げた。次に、2.5等量の薬物−リンカーを添加して共役を行い、反応液を放置して30分間、22℃で進行させた。得られた複合体は、使い捨てPD−10カラム(GEヘルスケア)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。薬物負荷度および薬物結合部位は、ジチオスレイトールでADCを還元した後、PLRPカラム上のHPLC分析、および重鎖と軽鎖成分の統合処理(Sunら、2005)によって決定した。集合の度合はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。HPLCおよび質量分析ならびに本開示で記載された方法を使用した無傷ADCの分析から、予想されたmAbあたり約2つの薬物をもったADCの均一集合(図5)を確認した;対照的に野生型mAbはこれらの条件下でいかなる薬物−リンカーも合体していない。
追加的な重鎖システイン残基(S239C、E269C、K326CおよびA327C)で改変させたヒト化抗CD70(h1F6)(McEarchenら、2008)は、非開裂性アウリスタチン、マレイミドカプロイルモノメチルアウリスタチンF(mcMMAF)、プロテアーゼ開裂性ピロロベンゾジアゼピンまたはサンドラマイシン(Biomar)薬リンカーに、以前に記載されたプロトコル(Jeffreyら、2013)にしたがって共役させた。簡潔に、抗体は、10等量のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)と1mM EDTAを添加し、そして1Mのトリス緩衝液(pH 9.0)を用いてpH7.4に調整することで完全に還元した。反応液は、37℃で1時間温置した後に22℃に冷却し、30等量のデヒドロアスコルビン酸を加えた。1Mのトリス−HCl緩衝液 (pH3.7)でpH6.5に調整し、1時間、22℃で放置して酸化反応を進行させた。この結果、生来のジスルフィドは再構成したが、改変重鎖システインは還元状態のまま残り、共役に利用可能であった。次に、1M のトリス緩衝液(pH9.0)を加えて溶液pH7.4まで再度上げた。次に、2.5等量の薬物−リンカーを添加して共役を行い、反応液を放置して30分間、22℃で進行させた。得られた複合体は、使い捨てPD−10カラム(GEヘルスケア)を使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。薬物負荷度および薬物結合部位は、ジチオスレイトールでADCを還元した後、PLRPカラム上のHPLC分析、および重鎖と軽鎖成分の統合処理(Sunら、2005)によって決定した。集合の度合はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。HPLCおよび質量分析ならびに本開示で記載された方法を使用した無傷ADCの分析から、予想されたmAbあたり約2つの薬物をもったADCの均一集合(図5)を確認した;対照的に野生型mAbはこれらの条件下でいかなる薬物−リンカーも合体していない。
EC部位結合確認
野生型(WT Fc)、改変システイン抗体(S239C)および共役化ADC(S239C+薬物)は、エンドプロテイナーゼGlu−C(シグマ アルドリッチ)によるプロテアーゼ処理にかけた。Glu−Cによる消化により、233位のヒンジシステインのC末端を開裂したFcフラグメントが遊離した。このFcフラグメントの質量分光分析から、野生型ADCが消化された場合、発生したFcフラグメントは質量24,054Da(図5、最上パネル)をもち、これは共役部位が全て233位のN末端側にあることと一致し、共役の兆しがないことを示した。S239C抗体の消化では、セリンとシステインの間の質量差に相当する質量16Daが追加されて合計24,070DaのFcフラグメントが得られる(図5、中央パネル)。S239C純粋2負荷ADCの消化では、セリンとシステインの質量差および薬物リンカーの付加に相当する質量942Daが追加されて合計24,995DaのFcフラグメントが生じる(図5、下部パネル)。質量スペクトル(図5)は、変異体Fc領域だけが薬物リンカーを合体し、導入されたシステイン(S239C)が新しい結合部位であることを示す。全改変システイン抗体(E269C、K326CおよびA327C)で同様な結果が見られ、そして相当するFabの質量スペクトル解析から、全内因性システインはジスルフィド結合として存在しており、薬物リンカーに共役していなかったことを示した(データの未提示)。
野生型(WT Fc)、改変システイン抗体(S239C)および共役化ADC(S239C+薬物)は、エンドプロテイナーゼGlu−C(シグマ アルドリッチ)によるプロテアーゼ処理にかけた。Glu−Cによる消化により、233位のヒンジシステインのC末端を開裂したFcフラグメントが遊離した。このFcフラグメントの質量分光分析から、野生型ADCが消化された場合、発生したFcフラグメントは質量24,054Da(図5、最上パネル)をもち、これは共役部位が全て233位のN末端側にあることと一致し、共役の兆しがないことを示した。S239C抗体の消化では、セリンとシステインの間の質量差に相当する質量16Daが追加されて合計24,070DaのFcフラグメントが得られる(図5、中央パネル)。S239C純粋2負荷ADCの消化では、セリンとシステインの質量差および薬物リンカーの付加に相当する質量942Daが追加されて合計24,995DaのFcフラグメントが生じる(図5、下部パネル)。質量スペクトル(図5)は、変異体Fc領域だけが薬物リンカーを合体し、導入されたシステイン(S239C)が新しい結合部位であることを示す。全改変システイン抗体(E269C、K326CおよびA327C)で同様な結果が見られ、そして相当するFabの質量スペクトル解析から、全内因性システインはジスルフィド結合として存在しており、薬物リンカーに共役していなかったことを示した(データの未提示)。
エクスビボでのマレイミド安定性
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)し、ラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(200μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルを37℃で7日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。MMAFからのN末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物(Val−Dil−Dap−Phe)を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ADCからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)し、ラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(200μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルを37℃で7日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。MMAFからのN末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物(Val−Dil−Dap−Phe)を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ADCからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
本発明者らは、薬物複合体の逆マイケル損失を起こすマレイミド性向が共役部位に依存することを見出し、野生型の4薬物負荷ADCの感受性が最も高く、7日間で薬物負荷のおおよそ40%が損失した(図7A)。比較して、S239Cは最も安定し、同じ期間で損失は10%未満であった。A327C、E269CおよびK326Cは、それぞれ21%、28%および26%の中程度の薬物損失を示した(図7B)。
エクスビボでのマレイミド加水分解
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)することでラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(500μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルは、37℃で7日間保温静置した。各サンプル(500μL)を300μLのProSepA樹脂と回転させてADCを捕捉し(50%PBSスラリー、4℃、一晩)、次いで、ウルトラフリー−MCスピンカップ(1分間、11,000xg)を通してろ過した。樹脂結合ADCは、PBS(3x500μL)で洗浄し、300μLのIgG溶出緩衝液(サーモフィッシャーサイエンティフィック)でpH8の1Mトリスの30μLに溶出した。溶離液の各サンプル(100μL)は、1μLのPNGアーゼF(500U/μL、ニューイングランド・バイオラボ)および5μLのLysC(0.1μg/μL、プロメガ)と室温で30分間、続けて37℃で25分間処理し、その後に100mMのジチオスレイトール(10μL)を添加して、さらに15分間、37℃で保温静置した。サンプルは、PLRP−Sクロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化(QTOF)質量分析を経由してLC−MSで分析した。データは、MassLynx4.0のMaxEnt1解析によってデコンボリューションした。脱グリコシル化HC FcプラスmcMMAFおよび脱グリコシル化HC FcプラスmcMMAFプラス水のピーク高を使用して加水分解薬物のパーセントを計算した。
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)することでラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(500μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルは、37℃で7日間保温静置した。各サンプル(500μL)を300μLのProSepA樹脂と回転させてADCを捕捉し(50%PBSスラリー、4℃、一晩)、次いで、ウルトラフリー−MCスピンカップ(1分間、11,000xg)を通してろ過した。樹脂結合ADCは、PBS(3x500μL)で洗浄し、300μLのIgG溶出緩衝液(サーモフィッシャーサイエンティフィック)でpH8の1Mトリスの30μLに溶出した。溶離液の各サンプル(100μL)は、1μLのPNGアーゼF(500U/μL、ニューイングランド・バイオラボ)および5μLのLysC(0.1μg/μL、プロメガ)と室温で30分間、続けて37℃で25分間処理し、その後に100mMのジチオスレイトール(10μL)を添加して、さらに15分間、37℃で保温静置した。サンプルは、PLRP−Sクロマトグラフィーとエレクトロスプレーイオン化(QTOF)質量分析を経由してLC−MSで分析した。データは、MassLynx4.0のMaxEnt1解析によってデコンボリューションした。脱グリコシル化HC FcプラスmcMMAFおよび脱グリコシル化HC FcプラスmcMMAFプラス水のピーク高を使用して加水分解薬物のパーセントを計算した。
保温静置前のサンプルは、一貫したマレイミド加水分解量(約15%)を示し、これは全変異体ADCについては約20Daの質量の増加によって示された。保温静置後のサンプルは、S239C、A327C、E269CおよびK327Cの場合にそれぞれ7%、9%、61%、65%と大きく異なる付加的開環レベルを有した(表3)。この結果は、逆ミカエル脱離反応に対する安定性と薬物リンカーの化学ミクロ環境による加水分解速度の増加との間でほぼ完全な逆相関を表す。
結合部位の生物物理学的特徴
チオスクシンイミド結合の加水分解と安定化のこれらの比率の相違の原因を調査するために、本発明者らは、改変させた結合部位のいくつかの特性の相違、すなわち、1)結合部位周囲の静電気環境(図4C);2)改変システインの計算された溶媒露出度(図4B);および3)各改変ADCの見掛け疎水性(表3)に注目した。
チオスクシンイミド結合の加水分解と安定化のこれらの比率の相違の原因を調査するために、本発明者らは、改変させた結合部位のいくつかの特性の相違、すなわち、1)結合部位周囲の静電気環境(図4C);2)改変システインの計算された溶媒露出度(図4B);および3)各改変ADCの見掛け疎水性(表3)に注目した。
局所荷電残基は陽子引き抜きを促進または回避する可能性があり、その結果、マレイミド結合体の安定または脱離が生じる。故に、本発明者らは、静電ポテンシャルによって改変Fc領域モデルの溶媒アクセス可能表面を解析した。結合部位を取り巻くこれらの電位の視覚評価から、K326CおよびE269CのADCでは、開環を促進するイオン性残基の一貫した置換がわかっていない。実際、これらの導入されたシステインは、それぞれ塩基性および酸性環境にあり、加水分解に対して安定性または感受性に相違を示さなかった。また、本発明者らは、同様にそれぞれ塩基性および酸性環境にあるS239CとA327Cを安定化させる可能性のある荷電残基を見出していない。
複合体の加水分解は、チオスクシンイミドのカルボニル原子への溶媒分子の接近を要件とする。239位に結合したマレイミドは簡単に溶媒から遮蔽され、そのような反応に関与できない可能性がある。結合部位への溶媒接近がチオスクシンイミド加水分解傾向を予測できるかどうかを判断するために、本発明者らは、in silicoで作成したモデルのConnolly分子表面を計算した。本発明者らは、曝露された表面と加水分解率の間に相関がないことを見出した(図4B)。しかしながら、疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用すると、複合体の保持時間と薬物−リンカー安定性の間に相関が見出された。本アッセイはまた、安定性が最も小さく、そして最も速く加水分解する改変ADC(E269CおよびK326C)が最大の見掛け疎水性を提示することを示す。
競合結合
PBS中の1x105の抗原発現細胞株(786−0)を氷上の96ウェルV−ボトムプレートの各ウェルに等分した。細胞を、600nMのAlexa Fluor−647標識野生型m1F6および濃度を増加させた(0.19nM〜600nM)非標識変異体ADCまたは野生型ADCと共に1時間培養した。細胞をペレット化してPBSで3回洗浄した。次いで、細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁した。蛍光は、フローサイトメトリーで分析し、飽和した蛍光信号のパーセントを用いて標識抗体結合の比率を決定し、その後、勾配変化をもったシグモイド型用量反応曲線にデータを当て嵌めてEC50を推定した。
PBS中の1x105の抗原発現細胞株(786−0)を氷上の96ウェルV−ボトムプレートの各ウェルに等分した。細胞を、600nMのAlexa Fluor−647標識野生型m1F6および濃度を増加させた(0.19nM〜600nM)非標識変異体ADCまたは野生型ADCと共に1時間培養した。細胞をペレット化してPBSで3回洗浄した。次いで、細胞をペレット化し、125μLのPBS/BSAに再懸濁した。蛍光は、フローサイトメトリーで分析し、飽和した蛍光信号のパーセントを用いて標識抗体結合の比率を決定し、その後、勾配変化をもったシグモイド型用量反応曲線にデータを当て嵌めてEC50を推定した。
競合抗体によって蛍光信号が50%減少する濃度は表2にIC50として報告されている。野生型およびシステイン変異体は測定値に誤差内で同じであり、これはシステイン置換およびその後の共役がADCによる標的の関与に影響を与えないことを示す。このADC群の相対親和性の測定に加えて、本発明者らは、抗原発現細胞に与える細胞傷害効果を試験した(表2)。驚くべきことに、変異体ADCの処方上の薬物用量が野生型ADCの半分しかなかった事実にもかかわらず、変異体ADCの全てがCD70陽性細胞と保温静置した場合に野生型ADCと類似の有効性を有した。
表2説明文:相対結合親和性を定量化するために、固定濃度の蛍光標識した親抗体を、濃度を増加させた非標識変異体または親抗体で滴定し、そして抗原発現細胞に適用した。競合抗体が蛍光信号を50%減少させる濃度は、IC50として報告する。インビトロ活性を評価するため、濃度を増加させたADCを抗原発現細胞に適用した。半最大応答を与えるADCの濃度をEC50として報告する。
インビトロでの細胞毒性アッセイ
アメリカンタイプカルチャーコレクションから786−0細胞株を取得し、製造会社が推奨する培養条件で増殖させた。黒色側面の透明ボトム96ウェルプレート(Corning Costar)にウェルあたり150μLの増殖培地に細胞を固定した。24時間後、保存薬物を5倍に階段的に希釈しながら滴定し、8点用量曲線を作成し、ウェルあたり50μlを2重に添加した。次いで、細胞を37℃、5%CO2で96時間培養した。100μLのCellTiter−Glo(プロメガ)溶液と0.5時間培養して細胞毒性を測定し、次いで、EnVision XCiteプレートリーダー(パーキンエルマー)で蛍光を測定した。エクセル(マイクロソフト)とグラフパッド(プリズム)を用いてデータを処理し、用量応答曲線を作成してIC50値を産出して、データを収集した。
アメリカンタイプカルチャーコレクションから786−0細胞株を取得し、製造会社が推奨する培養条件で増殖させた。黒色側面の透明ボトム96ウェルプレート(Corning Costar)にウェルあたり150μLの増殖培地に細胞を固定した。24時間後、保存薬物を5倍に階段的に希釈しながら滴定し、8点用量曲線を作成し、ウェルあたり50μlを2重に添加した。次いで、細胞を37℃、5%CO2で96時間培養した。100μLのCellTiter−Glo(プロメガ)溶液と0.5時間培養して細胞毒性を測定し、次いで、EnVision XCiteプレートリーダー(パーキンエルマー)で蛍光を測定した。エクセル(マイクロソフト)とグラフパッド(プリズム)を用いてデータを処理し、用量応答曲線を作成してIC50値を産出して、データを収集した。
インビボ活性試験
786−Oモデルを構築するために、無胸腺nu/nu雌ドナーマウス(ハーラン)の右脇腹に5x106細胞を移植した。ドナー腫瘍が約500mm3[(LxW2)/2]のときにマウスを安楽死させて腫瘍を無菌で切除し、約0.5x0.5mm断片を殺菌した13−ゲージトロカールに担持して麻酔マウスに移植した、腫瘍が約100mm3に達したときに、マウスを無作為に治療群に割り当て、単一時点で10mg/kgADCを腹腔内注射により投与した。腫瘍を週2度測定し、体積は式V=(LxW2)/2を用いて計算した。腫瘍が約1,000mm3に達したときに動物を麻酔した。腫瘍体積は、式(AxB2)/2を用いて計算し、式中、AとBはそれぞれ最大と二番目に大きい腫瘍の垂直寸法である。マウスの平均腫瘍体積と重量を監視し、腫瘍体積が1,000mm3に達したときにマウスを殺処分した。
786−Oモデルを構築するために、無胸腺nu/nu雌ドナーマウス(ハーラン)の右脇腹に5x106細胞を移植した。ドナー腫瘍が約500mm3[(LxW2)/2]のときにマウスを安楽死させて腫瘍を無菌で切除し、約0.5x0.5mm断片を殺菌した13−ゲージトロカールに担持して麻酔マウスに移植した、腫瘍が約100mm3に達したときに、マウスを無作為に治療群に割り当て、単一時点で10mg/kgADCを腹腔内注射により投与した。腫瘍を週2度測定し、体積は式V=(LxW2)/2を用いて計算した。腫瘍が約1,000mm3に達したときに動物を麻酔した。腫瘍体積は、式(AxB2)/2を用いて計算し、式中、AとBはそれぞれ最大と二番目に大きい腫瘍の垂直寸法である。マウスの平均腫瘍体積と重量を監視し、腫瘍体積が1,000mm3に達したときにマウスを殺処分した。
単回投与の786−0インビボ有効性モデル(図6)において、未治療マウスと比較したときに全ADCが腫瘍成長に顕著な影響を及ぼした。しかしながら、変異体間で成果に差異があった。変異体のうち、2負荷S239Cが最良の腫瘍成長抑制を示し、野生型4負荷ADCと類似して腫瘍成長を約25日間遅くした。A327Cは、有効性でS239Cよりわずかに低かった(腫瘍成長を10日間遅くした)が、腫瘍成長の遅延がわずか約5日にとどまった同一活性をもつE269CおよびK326Cを上回った。
参照による援用
本出願に列挙されている全ての公開、特許、特許出願および他の書類は、各個別の公開、特許、特許出願または他の書類が、個別にあらゆる目的で参照により援用されることが示されているのと同じ程度で、参照することによって、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
本出願に列挙されている全ての公開、特許、特許出願および他の書類は、各個別の公開、特許、特許出願または他の書類が、個別にあらゆる目的で参照により援用されることが示されているのと同じ程度で、参照することによって、全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
等価物
本開示は、とりわけカンナビノイド組成および同伴組成を提示する。本開示はまた、カンナビノイドおよび同伴組成を投与することによる神経変性疾患の治療法を提供する。様々な上記の明細書に含まれる特定の実施形態の例証および説明は制限されない。様々な変化は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行うことができることは理解されよう。多くの変形は、本明細書の検討で当業者には自明となるであろう。
本開示は、とりわけカンナビノイド組成および同伴組成を提示する。本開示はまた、カンナビノイドおよび同伴組成を投与することによる神経変性疾患の治療法を提供する。様々な上記の明細書に含まれる特定の実施形態の例証および説明は制限されない。様々な変化は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行うことができることは理解されよう。多くの変形は、本明細書の検討で当業者には自明となるであろう。
一部の実施形態においては、分析標的はテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1)を含む。
一部の実施形態においては、薬物分子はモノメチルアウリスタチンF(MMAF)またはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である。一部の実施形態においては、分析標的はMMAFまたはテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1)を含む。いくつかの実施形態では、分析標的はmcMMAFを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1)を含み、第二分析標的は6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はペグ化リンカーDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む。一部の実施形態においては、分析標的および第二分析標的はMMAEを含み、第二分析標的は6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている。
別の態様では、本発明は、サンプル中のLDC量を決定するためのキットであって、(a)標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、ここで標識リンカー−薬物複合体は、リガンドに共役することによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド;ならびに(b)1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液を含む、キットを提供する。一部の実施形態においては、内部標準は同位体標識されている。
[本発明1001]
サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程;ならびに
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。
[本発明1002]
a.前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程;および
b.放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法(LC−MS)にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法(LC−MS/MS)にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
a.前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;および
b.前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCを収集する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記LDCを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記LDCの標準曲線を使用して行われる、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
a.固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記LDCの標識誘導体である、加える工程;
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程;
c.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程;ならびに
d.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記内部標準が前記LDCの同位体標識版を含む、本発明1009〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記同位体標識が安定または不安定である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記同位体標識が重水素または炭素13である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記サンプルをトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、本発明1009〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記LDCまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインA樹脂、プロテインG樹脂およびプロテインL樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記LDCまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、本発明1007または1015の方法。
[本発明1017]
前記サンプルが10体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触する、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
リガンド−薬物複合体(LDC)の安定性を決定する方法であって、
a.前記LDCに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程;
b.本発明1002〜1020のいずれかの方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程;ならびに
c.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記LDCの安定性を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1022]
a.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;ならびに
b.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記生物サンプルが血漿から取得される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記血漿が前記LDCで処理された、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記血漿が前記LDCで治療されているヒト対象に由来する、本発明1025〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプル中のLDCを定量する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程;
b.前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程;
c.前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を抽出する工程;
d.前記LDCおよび前記内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる工程であって、前記TFAが、前記LDCから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程;ならびに
e.前記LDCから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記LDCから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のLDCの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。
[本発明1029]
前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定され、前記LDCから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記LDCの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記LDCの標準曲線を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定される、本発明1028〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)またはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、本発明1028〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記分析標的がMMAFまたはテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記分析標的がmcMMAFを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記分析標的および前記第二分析標的がMMAEを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記LDCおよび前記内部標準を10体積%の濃度の前記TFA水溶液と接触させる、本発明1028〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.前記LDCのための内部標準であって、前記LDCの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準;および
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。
[本発明1039]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1038のキット。
[本発明1040]
サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド;ならびに
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。
[本発明1041]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1040のキット。
[本発明1001]
サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程;ならびに
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。
[本発明1002]
a.前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程;および
b.放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法(LC−MS)にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法(LC−MS/MS)にかけることを含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
a.前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;および
b.前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCを収集する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記LDCを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記LDCの標準曲線を使用して行われる、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
a.固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記LDCの標識誘導体である、加える工程;
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程;
c.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程;ならびに
d.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記内部標準が前記LDCの同位体標識版を含む、本発明1009〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記同位体標識が安定または不安定である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記同位体標識が重水素または炭素13である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記サンプルをトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、本発明1009〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記LDCまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインA樹脂、プロテインG樹脂およびプロテインL樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記LDCまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、本発明1007または1015の方法。
[本発明1017]
前記サンプルが10体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触する、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
リガンド−薬物複合体(LDC)の安定性を決定する方法であって、
a.前記LDCに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程;
b.本発明1002〜1020のいずれかの方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程;ならびに
c.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記LDCの安定性を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1022]
a.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;ならびに
b.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記生物サンプルが血漿から取得される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記血漿が前記LDCで処理された、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記血漿が前記LDCで治療されているヒト対象に由来する、本発明1025〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
サンプル中のLDCを定量する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程;
b.前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程;
c.前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を抽出する工程;
d.前記LDCおよび前記内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる工程であって、前記TFAが、前記LDCから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程;ならびに
e.前記LDCから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記LDCから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のLDCの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。
[本発明1029]
前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定され、前記LDCから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記LDCの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記LDCの標準曲線を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定される、本発明1028〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)またはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、本発明1028〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記分析標的がMMAFまたはテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記分析標的がmcMMAFを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記分析標的および前記第二分析標的がMMAEを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記LDCおよび前記内部標準を10体積%の濃度の前記TFA水溶液と接触させる、本発明1028〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.前記LDCのための内部標準であって、前記LDCの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準;および
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。
[本発明1039]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1038のキット。
[本発明1040]
サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド;ならびに
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。
[本発明1041]
前記内部標準が同位体標識されている、本発明1040のキット。
例示的なADCにおいては、モノメチルアウリスタチンEはプロテアーゼ開裂ペプチドリンカーを介して抗体へ共役しており、モノメチルアウリスタチンFはリンカーマレイミドカプロン酸(mc)を介して抗体に共役する。リンカーは、さらに溶解度または薬物動態を調節する化学基を含み得る。例えば、例示的なリンカーはペグ化されている。特定の例示的リンカー−薬物結合体は、
mc−MMAFであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する;あるいは
DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸(グルクロニダーゼによって開裂可能)を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むLDCにおいては、本明細書に記載した酸処理がmc−MMAFからテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1)(この場合Dapはドラプロリンである)、およびDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEからMMAE薬物全体を放出させる。LDCおよびADCのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または13Cによって標識されたものが含まれる。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたMMAE中の13Cによって標識されたものが含まれる。上記構造において、13Cまたは重水素化が予想される部位は「*」で示される。
mc−MMAFであり、式中、リンカーのマレイミド基はリガンドそして特に抗体のチオール基と反応する;あるいは
DPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEであり、式中、リンカーはペグ化されており、そしてグルクロン酸(グルクロニダーゼによって開裂可能)を含み、リンカーのマレイミド基はリガンドのチオール基と反応し得る。上記のリンカー薬物結合体を含むLDCにおいては、本明細書に記載した酸処理がmc−MMAFからテトラペプチドVal−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1)(この場合Dapはドラプロリンである)、およびDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEからMMAE薬物全体を放出させる。LDCおよびADCのための内部標準は、例えばリンカー−薬物結合体の標識によって調製が可能であり、ここで標識は本明細書に記載された酸による処理で放出される。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、放出されたテトラペプチド中で重水素化または13Cによって標識されたものが含まれる。mc−MMAFに共役したLDCおよびADCの例示的な内部標準としては、重水素化または放出されたMMAE中の13Cによって標識されたものが含まれる。上記構造において、13Cまたは重水素化が予想される部位は「*」で示される。
エクスビボでのマレイミド安定性
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)し、ラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(200μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルを37℃で7日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。MMAFからのN末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物(Val−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1))を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ADCからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
IgGをプロテインA樹脂(ProSepA、ミリポア)と保温静置し、4℃で一晩回転させた後、ろ過して樹脂を除去(ウルトラフリー−MC遠心式フィルター、ミリポア)し、ラット血漿(Bioreclamation IVT)からIgGを取り出した。ADCをIgG枯渇血漿にスパイクした(0.25mg/mL)。一定分量(200μL)を直ぐに取り出して(t=0d)、そして残りのサンプルを37℃で7日間まで保温静置した。関連した時点で、被験物質と内部標準を抽出して消化した。MMAFからのN末端アミノ酸に相当するテトラペプチド産物(Val−Dil−Dap−Phe(SEQ ID NO:1))を固相抽出法で精製し、四重極飛行時間(Q−TOF)質量分析により標準を基準に定量した。本開示方法を使用して、ADCからテトラペプチドを放出し、そして放出された量を定量した。
Claims (41)
- サンプル中のリガンド−薬物複合体(LDC)を分析する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCはリガンドおよび分析標的を含み、前記分析標的は薬物分子またはその一部を含む、提供する工程;ならびに
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的の放出を誘導する、接触させる工程
を含む、方法。 - a.前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程;および
b.放出された前記分析標的の量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー質量分析法(LC−MS)にかけることを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記分析標的を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法(LC−MS/MS)にかけることを含む、請求項2に記載の方法。
- a.前記サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;および
b.前記測定したリガンドの量を使用して、前記サンプル中の前記薬物分子またはその一部の濃度を決定する工程
をさらに含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプルを前記トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCを収集する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記LDCを収集する工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項6に記載の方法。
- 前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する前記工程が、前記LDCの標準曲線を使用して行われる、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
- a.固定量の内部標準を前記サンプルに加える工程であって、前記内部標準は前記リガンドおよび第二分析標的を含み、前記第二分析標的は前記LDCの標識誘導体である、加える工程;
b.前記サンプルを1〜30体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる工程であって、それによって、前記LDCから前記分析標的のおよび前記内部標準から前記第二分析標的の放出を誘導する、接触させる工程;
c.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を測定する工程;ならびに
d.前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量に基づいて、前記LDCから放出された前記分析標的の量を測定する工程
をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第二分析標的が前記分析標的と異なる分子量を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記内部標準が前記LDCの同位体標識版を含む、請求項9〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同位体標識が安定または不安定である、請求書11に記載の方法。
- 前記同位体標識が重水素または炭素13である、請求項12に記載の方法。
- 前記サンプルをトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触させる前記工程の前に、前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を収集する工程をさらに含む、請求項9〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記LDCまたは前記内部標準を収集する前記工程が、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、硫安塩析精製、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属−キレートクロマトグラフィーまたは免疫沈降によって行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記リガンドが抗体またはその機能性断片であり、プロテインA樹脂、プロテインG樹脂およびプロテインL樹脂から選択される樹脂と前記サンプルを接触させることによって、前記LDCまたは前記内部標準が前記サンプルから収集される、請求項7または15に記載の方法。
- 前記サンプルが10体積%の濃度のトリフルオロ酢酸(TFA)水溶液と接触する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンE(MMAE)またはモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)である、請求項18に記載の方法。
- 前記分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- リガンド−薬物複合体(LDC)の安定性を決定する方法であって、
a.前記LDCに曝露した後に異なる時点で単一源から第一サンプルおよび第二サンプルを取得する工程;
b.請求項2〜20のいずれか一項に記載の方法で前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCを分析する工程であって、それによって、前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記LDCから放出された分析標的の量を決定する、分析する工程;ならびに
c.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的の量を比較することによって、前記LDCの安定性を決定する工程
を含む、方法。 - a.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記リガンドの量を測定する工程;ならびに
b.前記第一サンプルおよび前記第二サンプル中の前記放出された分析標的と前記リガンドの量の比率を決定する工程
をさらに含む、請求項21に記載の方法。 - 前記サンプル、前記第一サンプル、または前記第二サンプルが、哺乳類の組織または哺乳類の水性体液に由来する生物サンプルである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物サンプルが、血漿、血清、血液、組織、生検組織、糞便および尿のうちの一つから取得される、請求項23に記載の方法。
- 前記生物サンプルが血漿から取得される、請求項24に記載の方法。
- 前記血漿が前記LDCで処理された、請求項25に記載の方法。
- 前記血漿が前記LDCで治療されているヒト対象に由来する、請求項25〜26のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中のLDCを定量する方法であって、
a.前記LDCを含むサンプルを提供する工程であって、前記LDCが分析標的を含み、前記分析標的が薬物分子を含む、提供する工程;
b.前記サンプルに内部標準を添加する工程であって、前記内部標準が、前記LDCの標識誘導体であり、かつ第二分析標的を含む、添加する工程;
c.前記サンプルから前記LDCおよび前記内部標準を抽出する工程;
d.前記LDCおよび前記内部標準を1〜30体積%の濃度のTFA水溶液と接触させる工程であって、前記TFAが、前記LDCから前記分析標的をおよび前記内部標準から前記第二分析標的を放出させる、接触させる工程;ならびに
e.前記LDCから放出された前記分析標的および前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を決定する工程であって、前記LDCから放出された前記分析標的の量が前記サンプル中のLDCの量と相関する、決定する工程
を含む、方法。 - 前記内部標準から放出された前記第二分析標的の量を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定され、前記LDCから放出された分析標的の量が、前記サンプル中の前記LDCの抗体に結合した前記薬物分子の濃度と相関する、請求項28に記載の方法。
- 前記LDCの標準曲線を用いて、前記LDCから放出された前記分析標的の量が決定される、請求項28〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬物分子がモノメチルアウリスタチンF(MMAF)またはモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析標的がMMAFまたはテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析標的がmcMMAFを含む、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析標的および前記第二分析標的がテトラペプチドVal−Dil−Dap−Pheを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析標的および前記第二分析標的がペグ化リンカーDPR−PEG−gluc−カルバメート−MMAEを含む、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析標的および前記第二分析標的がMMAEを含み、前記第二分析標的が6以上の炭素および13または6以上の重水素によって同位体標識されている、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記LDCおよび前記内部標準を10体積%の濃度の前記TFA水溶液と接触させる、請求項28〜36のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.前記LDCのための内部標準であって、前記LDCの標識誘導体であり、かつ薬物分子を含む、内部標準;および
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。 - 前記内部標準が同位体標識されている、請求項38に記載のキット。
- サンプル中のLDCの量を決定するためのキットであって、
a.標識リンカー−薬物複合体およびリガンドであって、前記標識リンカー−薬物複合体が、前記リガンドに共役し、それによって、内部標準を形成できる、標識リンカー−薬物複合体およびリガンド;ならびに
b.1〜30体積%の選択した濃度で適用するためのトリフルオロ酢酸TFA水溶液
を含む、キット。 - 前記内部標準が同位体標識されている、請求項40に記載のキット。
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