JP2021503439A - エバンスブルー誘導体の化学的コンジュゲートおよびそれらの放射線治療剤および造影剤としての使用 - Google Patents

エバンスブルー誘導体の化学的コンジュゲートおよびそれらの放射線治療剤および造影剤としての使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、式ＩＩＩで示される化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物（式中、Ｒ１〜Ｒ１２およびＬ１〜Ｌ４の定義は明細書に記載のとおりであり、Ｒ１３は１１７Ｌｕを含んでなるキレート基であり、Ｒ１３はペプチドである）に関する。式Ｉで示される化合物がリンカーを介してペプチドと共有結合することで式ＩＩＩの化合物が提供され、それにより治療化合物の半減期が延長し得る。本発明はまた、開示された化合物の医薬組成物、ならびに疾患の診断または治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】図１

Description

本発明は、エバンスブルー色素の官能化誘導体に関し、より具体的には、放射線治療剤および造影剤として有用なエバンスブルー色素の官能化誘導体に関する。
医薬の効果は、薬物動態に大きく依存する。特に、医薬用の化合物は、患者に対して所望の効果を発揮するのに十分な半減期を有していなければならない。体内での医薬品化合物の半減期を増大させるための様々なアプローチが用いられている。半減期を増大させる１つの方法は、身体からの薬剤のクリアランスの速度を低下させることであり、それは、薬剤の直接の修飾によるか、またはクリアランス経路に作用する他の薬剤の添加による、クリアランスメカニズムの阻害によって行うことができる。タンパク質薬は、プロテアーゼによる分解に対して非常に脆弱であるため、クリアランスの低減が特に望まれる。
腎臓は一般に６０ｋＤａ未満の分子をろ過するため、クリアランス速度を低減するための１つの方法は、例えば、タンパク質の融合、グリコシル化またはポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）の付加によってタンパク質薬の分子サイズを増大させることである。しかしながら、これらのアプローチのいくつかには短所がある。例えば、薬剤の薬物動態を改善する１つの一般的なストラテジーは、治療化合物にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分を結合させることであり、これはＰＥＧ化として公知の方法である。しかし、薬剤または治療用タンパク質にＰＥＧを共有結合させることにより、宿主の免疫系から薬剤をマスキングすることで免疫原性および抗原性が低下し、また薬剤の流体力学的サイズが増大することで腎臓クリアランスが低下することにより循環時間を長くすることができる。またＰＥＧ化により、疎水性の薬剤やタンパク質に水溶性を付与することも可能である。しかしながら、ＰＥＧ鎖のかさ高いサイズに起因して、ＰＥＧ化後の生物学的活性は必然的に損なわれる。
小さい分子またはタンパク質薬を、アルブミンまたは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインなどの大きなタンパク質と融合させることにより、薬剤の分子サイズが増大し、ひいては腎臓クリアランスが低減することで、薬剤半減期を長くすることが可能である。サイズの増大に加えて、アルブミンまたはＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合は、融合後の複合体に官能性を付与し、また、結合したリガンドを循環系中で再利用することにより細胞内の異化作用からそれらを回収する胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を可能にする。このＦｃＲｎとの相互作用は、ヒトにおいて、アルブミンおよびＩｇＧの２１日にもわたる非常に長い血清中半減期に寄与している。したがって、アルブミンまたは血清ＩｇＧと相互作用するタンパク質または小分子薬を設計することは、腎臓クリアランスおよび細胞内の異化作用の両方が低減することによる半減期の顕著な増大の可能性がある。これらの方法を通じて、治療薬のインビボでの曝露を延長することができる。
血漿中において最も豊富な（約５０ｍｇ／ｍＬ）タンパク質として、６６．５ｋＤａの分子量を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、血液における主要なキャリアータンパク質である。ＨＳＡは、長鎖脂肪酸の主要な可溶化剤、ビリルビンとの結合によるタンパク質の解毒、および血液中における重金属イオンの輸送ビヒクルとして作用する。１９９０年代半ば以降、アルブミンは、炎症性または悪性組織に対する薬剤のターゲティング、またはそれらの半減期の延長のためのキャリアータンパク質として研究されている。２つの主要なアルブミンベースの技術が、治療に用いることを目的として開発されている。１つの方法は、親油性薬剤およびＨＳＡを高圧下でジェット噴射し、アルブミン−薬剤ナノ粒子を形成させる方法である。もう１つの方法は、静脈内注射の後、循環アルブミンに共有結合または非共有結合によりin situで結合するアルブミン結合ペプチドまたはプロドラッグを開発することである。
アルブミンは、循環血液中に非常に豊富に存在するため、薬物のキャリアーとして、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）よりも有利である。薬物の放出を考慮に入れると、アルブミン結合能と結合からの効果的な薬物放出との間でバランスをとる必要があるため、共有結合よりも物理的な結合が好ましい。システインの３４位のフリーのチオール基は細胞外タンパク質に特有の特徴であり、血漿中におけるチオール濃度のほぼ９０％を占めるため、プロドラッグをアルブミンと共有結合させるためには、通常、アルブミンの３４位のシステインが用いられる。例えば、この種のプロドラッグの最初のかつ最も進歩したプロトタイプは、ドキソルビシンの（６−マレイミドカプロイル）ヒドラゾン誘導体（ＤＯＸＯ−ＥＭＣＨ）であり、これは静脈内投与後、内因性アルブミンの３４位のシステインに迅速かつ選択的に結合する、ドキソルビシンの酸感受性プロドラッグである。アルドキソルビシンは酸感受性ヒドラゾンリンカーを含んでおり、腫瘍細胞によるアルブミンコンジュゲートの細胞内取り込み後、腫瘍組織においてよくみられる弱酸性環境で細胞外へ、または、酸性のエンドソームもしくはリソソームコンパートメントにおいて細胞内へ、ドキソルビシンを放出することが可能である。
アルブミンとの物理的相互作用の１つの例は、ミリスチン酸（テトラデカン酸）がＢ鎖２９位のリジンアミノ酸に結合している糖尿病治療用のインスリンアナログである、レベミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ）（登録商標）（Novo Nordisk）の開発である。血清アルブミンと結合するレベミル上にある脂肪酸は、インスリンを長時間作用形態にする。インスリン投与の他に、糖尿病におけるグルコースレベル制御のための他の選択肢は、インスリン分泌を刺激することである。ペプチドホルモンＧＬＰ−１−（７−３７）は、プログルカゴン分子の選択的な切断から生じ、膵細胞におけるインスリン分泌を増加させるが、遍在する酵素による分解により半減期は１．５〜２分間に過ぎない。レベミル（登録商標）と同様、ＧＬＰ−１−（７−３７）は、ＧＬＰ−１ペプチド配列においてグルタミン酸のＮ末端側に導入されたリジンのε−アミノ基が脂肪酸（例えばパルミチン酸）により誘導体化される。得られる新薬リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））は、アルブミンとの結合により、代謝による分解に対して安定なＧＬＰ−１のアルブミン結合誘導体であり、皮下投与後１１〜１５時間の血漿中半減期を有する。より良好な薬剤様特性のために修飾された抗糖尿病ペプチドの更なる例は、Kaspar, et al. “Future Directions for Peptide Therapeutics Development”, Drug Discovery Today, 18(17):807-817 (2013)に開示されている。
アルブミンベースの薬物送達システムは、糖尿病などの代謝障害に対する重要な治療オプションであるのみならず、癌治療にも有用である。薬物のキャリアーとしてのアルブミンの使用には、固形腫瘍への薬物送達に関していくつかの特有の利点がある。第１に、アルブミンベースの薬物キャリアーは、受動的な腫瘍ターゲティングに関して、高分子の透過性と保持能を増大する（ＥＰＲ効果）。さらに、腫瘍内皮上のｇｐ６０受容体やＳＰＡＲＣ（腫瘍間質に存在する、アルブミンに対する高い結合能を有する分泌糖タンパク質）などの２つのアルブミン結合タンパク質が、腫瘍環境において過剰発現することが解っている。ＥＰＲ効果の他に、２つのアルブミン結合タンパク質の相互作用が、腫瘍におけるアルブミンの取り込みおよび保持を促進する。
エバンスブルー（ＥＢ）は、血清アルブミンに対し高い親和性を有するアゾ色素である。ＥＢは血液量の測定においてよく使用されるが、巨大分子の透過性を示す目的でも使用できる。ＥＢはアルブミンと強く結合するため、アルブミンの大きな分子が局在する部位のマーカーとして利用でき、血液脳関門（ＢＢＢ）などのバリアの透過性評価に使用することができる。アルブミンはＢＢＢを通過できず、また実質的にすべてのＥＢがアルブミンに結合するため、ＥＢがＣＮＳに取り込まれるときは、ＢＢＢが障害をきたしている場合のみである。また、アルブミンに結合したＥＢは、正常な細胞ではなく、損傷した細胞または死細胞に取り込まれるため、ＥＢは生存率のアッセイにも用いられる。
エバンスブルー色素の誘導体は当分野において公知である。例えば、中国特許第ＣＮ１０３２４２２５５号（Ｚｈａｎｇら）は、アルブミンと結合する端部欠失型のＥＢが、放射性核種または他の標識と結合できるマクロ環のキレート基（ＮＯＴＡ、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）と結合している造影剤を開示している。マクロ環のキレート基により形成されるこのような誘導体は、薬剤を、血液プールのイメージングにおいて有用なものにしている。同様に、国際特許出願ＷＯ２００４／０７５９２５（Katayamaら）は、アルブミンと結合する端部欠失型のＥＢが、放射性核種と結合する直鎖状キレート基に結合している、剥離した血管内皮部位のイメージングに有用な薬剤を開示している。ＥＢ−ＮＯＴＡの合成および使用は開示されている（Niu et al., “In Vivo Labeling of Serum Albumin for PET”, J. Nucl. Med. 55:1150-1156 (2014)参照）。
アルブミンベースの治療薬には広範な可能性があるため、改良された薬剤−アルブミンコンジュゲートに対するニーズが存在する。本発明は、そのニーズに応えるものと考えられる。
一態様において、本発明は、式ＩＩＩの化合物または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物に関する
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから独立に選択され、
Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキルであり、
Ｒ１４は、ペプチドであり、
Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
Ｒ１３は、１１７Ｌｕを含んでなるキレート基である）。
更なる態様において、本発明は、薬学的に許容される担体と共に、更に放射性核種を含む上記化合物の１つを含む医薬組成物に関する。
更なる態様において、本発明は、哺乳動物における癌を治療または診断する方法であって、哺乳動物に、治療有効量の上記化合物の１つを、場合により１以上の更なる活性成分と組合せて投与することを含む方法に関する。
これらの態様、また他の態様は、以下の発明の詳細な説明の記載から明らかになるであろう。
一実施形態による、治療剤または造影剤として有用な化合物を示す図である。 図２Ａ〜２Ｃは、化合物の濃度（Ｌｏｇモル濃度、Ｌｏｇ［Ｍ］）に対する最大結合量（％）のプロットである（競合物のない場合のインテグリンαｖβ３に対する結合（図２Ａ）；６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）と競合する場合のインテグリンαｖβ３に対する結合（図２Ｂ）、およびアルブミンに対する結合（図２Ｃ））。図２Ｄおよび２Ｅは、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込み（図２Ｄ）および内在化（図２Ｅ）に関して、合計に対する％を時間（分）に対してプロットしたものである。 図３Ａおよび３Ｂは、インテグリンαｖβ３に対する列挙した化合物の結合に関する、濃度（Ｌｏｇモル濃度、Ｌｏｇ［Ｍ］）に対する最大結合量（％）のプロットである。 図４Ａおよび４Ｂは、列挙した細胞タイプのうち、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ−２９細胞における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取り込み（図４Ａ）、ならびにＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における内在化（図４Ｂ）、について、合計に対する％を時間（分）に対してプロットしたものである。 ＨＴ−２９細胞における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの内在化について、合計に対する％を時間（分）に対してプロットしたものである。 ヒト腫瘍組織に結合した６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤのマイクロＰＥＴ画像である。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤのマイクロＰＥＴ画像である。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）を時間（時間）に対してプロットしたものである。 血液および腫瘍における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）の時間（時間）に対するプロットのセットである。 各種組織における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）をプロットしたものである。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤのマイクロＰＥＴ画像である。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）を時間（時間）に対してプロットしたものである。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの異なるタイプの組織による取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）をプロットしたものである。 マウス腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢの取り込みについて、グラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）を時間（時間）に対してプロットしたものである。 腫瘍体積（ミリメートル、ｍｍ）を各処置アームの処置日数に対してプロットしたものである。 体重（開始日に対する重量（％））を各処置アームの処置日数に対してプロットしたものである。 生存率（％）を各処置アームの処置日数に対してプロットしたものである。 図１８Ａおよび１８Ｂは、腫瘍体積（図１８Ａ、ミリメートル、ｍｍ）および体重（図１８Ｂ、開始日に対する体重（％））を各処置アームの処置日数に対してプロットしたものである。 注入後３日における、腫瘍異種移植モデルの各処置アームについての、マイクロＰＥＴ画像のセット、およびグラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）のセットをプロットしたものである。 注入後１０日における、腫瘍異種移植モデルの各処置アームについての、マイクロＰＥＴ画像のセット、およびグラム当たりの注入された投与量の百分率（％ＩＤ／ｇ）のセットをプロットしたものである。 各処置アームにおける、処置後の各種染色された細胞の画像である。 ６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ注入後の３人の健常なヒトボランティアのＰＥＴ画像である。 ６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ注入後のヒト患者におけるグリア芽細胞腫のＰＥＴ画像である。 ６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ注入後のヒト患者におけるグリア芽細胞腫の標準取り込み値（ＳＵＶ）を時間（時間）に対してプロットしたものである。 （ｉ）短縮型エバンスブルー（ＥＢ）色素分子、（ｉｉ）金属キレート、および（ｉｉｉ）マレイミドを特徴とする付加分子の設計を示す。 短縮型ＥＢの誘導体の合成を示す。 ＴＡＴＥ−ＳＨの合成、およびＴＡＴＥ−ＳＨを含む反応混合物のＨＰＬＣ分析を示す。 ＥＢ−ＴＡＴＥの合成を示す。 ＥＢ−ＴＡＴＥおよびＴＡＴＥの構造を示す。 ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 図３２Ａおよび３２Ｂは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥと６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの血液および腫瘍による時間依存的な取り込みを示す図である。 図３３Ａおよび３３Ｂは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥと６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの血液および腫瘍による時間依存的取り込み（平均と最大）を示す図である。 図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥと６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの膀胱、肝臓および腎臓による時間依存的な取り込みを示す図である。 図３５Ａおよび３５Ｂは、ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２陽性／陰性細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示すプロットである。 ＨＣＴ１１６陽性細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 ＨＣＴ１１６陰性細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 図３８Ａ、３８Ｂ、３８Ｃおよび３８Ｄは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。 図３９Ａおよび３９Ｂは、ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２＋／−細胞における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。 図４０Ａおよび４０Ｂは、ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２＋／−細胞における８６Ｙ−ＴＡＴＥの細胞取り込み／内在化試験の結果を示す図である。 結合動態（ＥＢ−ＴＡＴＥ−ＢＳＡの会合／解離定数）を示すプロットである。 ＨＣＴ１１６＋異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 ＨＣＴ１１６＋／−異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 図４４Ａ、４４Ｂ、４４Ｃおよび４４Ｄは、８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび８６Ｙ−ＴＡＴＥについての腫瘍および血液のＴＡＣ（時間放射能曲線）を示す図である。 図４５Ａ、４５Ｂおよび４５Ｃは、肝臓、腎臓および８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび８６Ｙ−ＴＡＴＥについての膀胱のＴＡＣを示す図である。 注射から４８時間後のＨＣＴ１１６＋異種移植モデル（ＳＳＴＲ２陽性腫瘍）における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥと８６Ｙ−ＴＡＴＥの体内分布を示す図である。 注射から４８時間後のＨＣＴ１１６＋異種移植モデル（ＳＳＴＲ２陽性腫瘍）における８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ Ｅの体内分布を示す図である。 ＡＲ４２Ｊ異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 注射から４８時間後のＡＲ４２Ｊ異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価を示すＰＥＴ画像である。 図５０Ａおよび５０Ｂは、ＡＲ４２Ｊ腫瘍モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥのＴＡＣを示す図である。 注射から４８時間後のＡＲ４２Ｊ異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの体内分布を示す図である。 ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２＋腫瘍の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２−腫瘍の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ、５４Ｄ、５４Ｅおよび５４Ｆは、ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療についての腫瘍増殖曲線を示す図である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルの９０Ｙ放射線治療についての腫瘍増殖曲線を示すプロットである。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルの９０Ｙ放射線治療についての生存曲線を示すプロットである。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルの９０Ｙ放射線治療についての体重曲線を示すプロットである。 図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃ、５８Ｄ、５８Ｅおよび５８Ｆは、ＨＣＴ１１６異種移植モデルの９０Ｙ放射線治療についての腫瘍増殖曲線を示す図である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療として、ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２−腫瘍についての免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療として、ＳＳＴＲ２についての免疫蛍光染色の結果を示す画像である。 ６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥイメージングを用いた処置の前後の、ＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２＋腫瘍におけるＳＳＴＲ２の発現を示すＰＥＴ画像である。 図６２Ａ、６２Ｂ、６２Ｃおよび６２Ｄは、ＡＲ４２Ｊ異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療に関する腫瘍成長曲線である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療に関する腫瘍成長曲線である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療に関する生存曲線である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルにおける９０Ｙ放射線治療に関する体重曲線である。 Ｋｉ６７およびＴＵＮＥＬ ＨＣＴ１１６異種移植モデルの染色実験の結果を示す画像である。 ＨＣＴ１１６異種移植モデルのＨ＆Ｅ染色の結果を示す画像である。 ＤＭＥＢ−ＣＴＴの構造を示す。 膜関連タンパク質のみを染色した後のＰＳＭＡ発現レベルを示す。 図７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃおよび７０Ｄは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの細胞内取り込み／内在化の結果を示す図である。 ＰＣ３−ＰＩＰ異種移植片における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの評価を示すＰＥＴ画像である。 図７２Ａおよび７２Ｂは、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの腫瘍および血液のＴＡＣを示す。 各種異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの腫瘍内取り込みを示す図である。 ＰＣ３−ＰＩＰ異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＥＢ−ＣＴＴの生体内分布を示す図である。 図７５Ａ〜図７５Ｂは、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）患者の治療として以前に臨床で用いられたＳＳＴＲ結合ペプチドの例を示す。 図７６Ａ〜図７６Ｂは、（Ａ）Ａ４２７−７（ＳＳＴＲ２＋）および（Ｂ）Ａ４２７−４（ＳＳＴＲ２−）細胞における抗ＳＳＴＲ２（赤）および核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な免疫蛍光染色を示す。 それぞれ、非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥまたはＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの添加または非添加で、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下での177Ｌｕ-ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥおよび177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥのＡ４２７−７における細胞内在化の結果を示す。 ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの生体内分布の経時変化を示す。 ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの生体内分布の経時変化を示す。 ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの腫瘍対組織比の経時変化を示す。 ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの腫瘍対組織比の経時変化を示す。 注射から７２時間後のＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥのＳＰＥＣＴ画像を示す（非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを添加せず（左）；過剰量の非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを添加（右））。１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥをマウスに注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。 注射後の異なる時点でのＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す。マウスに１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。 注射後の異なる時点でのＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す。マウスに２ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。 注射から１および２４時間後のＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す（非標識ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを添加せず（左）、過剰量の非標識ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを添加（右））。１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥをマウスに注射した。 ＳＳＴＲ２異種移植モデルにおける177Ｌｕ放射性核種療法の結果を示し、Ｘ軸は腫瘍接種後の日数を表し、Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を表す。処置は７日目に、ＰＢＤ、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥまたは177Ｌｕ−ＥＢ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを異なる用量で１回静脈内注射した。
用語
化合物は標準的な化合物名を用いて記載する。特に定義しない限り、本願明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同様の意味を有する。
用語「ａ」および「ａｎ」は、量の限定を意味せず、むしろ参照された項目の少なくとも１つの存在を意味する。用語「または」は、「および／または」を意味する。用語「含んでなる」、「有する」、「包含する」および「含有する」は、非限定的な用語として解釈される（すなわち「含むが、これに限定されない」ことを意味する）。
数値範囲の記載は、本願明細書において明示しない限り、単に、その範囲に入る各個別の値を個々に参照する簡略的な方法として意図するものであり、各個別の値は、本願明細書において個々に記載されているかのように明細書に組み込まれるものである。すべての範囲の端点は、その範囲に含まれ、それぞれに組合せ可能である。
本願明細書に記載のすべての方法は、本願明細書において特に明記しない限り、または
文脈から明らかにそうでない場合を除き、適切な順序で実施できる。いずれのおよびすべての例または例示的な用語（例えば「〜など」）の使用は、クレームに記載しない限り、単に本発明をより十分に説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の文言は、請求の範囲に記載していない要素を本発明の実施に必須なものとして示していると解釈されるべきではない。特に明記しない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本開示の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
さらに、本開示は、すべての変形、組合せおよび置換を包含し、その際、列記した１以上の請求項に由来する１以上の限定、要素、節および説明的用語は、他の請求項にも導入される。例えば、別の請求項に従属する請求項はいずれも、引用元の請求項が同じ他の従属項のいずれかに存在する１以上の限定を含む態様に変更し得る。
要素がリストとして、例えばマーカッシュ形式で、示される場合、その要素の各サブグループもまた開示され、どの要素もそのグループから除外することができる。
すべての化合物は、その化合物に存在する原子の可能なすべての同位体を包含すると理解される。同位体には、質量数が異なるが同じ原子番号を有する原子が含まれ、重同位体および放射性同位体が包含される。一般的な例としては、限定されないが、水素の同位体としてはトリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃが挙げられる。したがって、本願明細書に開示される化合物は、化合物の構造中に、またはそれに結合する置換基として、重同位体または放射性同位体を含みうる。有用な重同位体または放射性同位体の例としては、１８Ｆ、１５Ｎ、１８Ｏ、７６Ｂｒ、１２５Ｉおよび１３１Ｉが挙げられる。
式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩおよび式ＩＶには、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩおよび式ＩＶのすべての薬学的に許容される塩が含まれる。
非限定的な用語「含んでなる」には、「〜から本質的になる」や「〜からなる」などの中間的およびクローズエンドな用語が含まれる。
用語「置換された」は、指定した原子または基の１以上のいずれかの水素原子が、指定した基から選択されたもので置き換えられることを意味するが、指定した原子の原子価が通常の価数を上回ることはない。置換基および／または可変要素の組合せは、そのような組合せが安定な化合物、または有用な合成中間体をもたらす場合にのみ許容できる。安定な化合物または安定な構造とは、該化合物が、反応混合物からの単離、およびその後の有効な治療薬への製剤化に耐えるのに十分に強い化合物を意味する。
２つの文字または記号の間のもの以外のダッシュ（「−」）は、置換基の結合する位置を示すために用いられる。
「アルキル」には、特定した炭素原子数、一般に１〜約８個の炭素原子を有する、分岐状および直鎖状の脂肪族飽和炭化水素基が含まれる。本明細書で用いられる用語Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキル基を示す。他の実施形態には、１〜８個の炭素原子、１〜４個の炭素原子または１もしくは２個の炭素原子を有するアルキル基（例えばＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキルおよびＣ１−Ｃ２アルキル基）が含まれる。例えば−Ｃ０−Ｃ２アルキル（フェニル）など、Ｃ０−Ｃｎアルキルが本願明細書において他の基との組合せで用いられる場合は、指定した基（この場合フェニル基）が一重の共有結合（Ｃ０アルキル）によって直接結合しているか、または、特定した炭素原子数（この場合１、２、３または４個の炭素原子）を有するアルキル鎖により結合していることを意味する。アルキル基は、例えば−Ｏ−Ｃ０−Ｃ４アルキル（Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル）のように、ヘテロ原子などの他の基を介して結合していてもよい。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、３−メチルブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｓｅｃ−ペンチル基が挙げられるが、これらに限定されない。
「アルコキシ」は、指定した炭素原子数を有する上記のアルキル基が、酸素架橋（−Ｏ−）により、それが置換する基に共有結合した基である。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、２−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、イソペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシおよび３−メチルペントキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、「アルキルチオ」または「チオアルキル」基は、指定した炭素原子数を有する上記のアルキル基が、硫黄架橋（−Ｓ−）により、それが置換する基に共有結合した基である。同様に、「アルケニルオキシ」、「アルキニルオキシ」および「シクロアルキルオキシ」は、それぞれ、アルケニル、アルキニルおよびシクロアルキル基が、酸素架橋（−Ｏ−）により、それが置換する基に共有結合した基を意味する。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味し、本願明細書において、重同位体および放射性同位体を含むそのすべての同位体を包含するものとして定義される。有用なハロ同位体の例としては、１８Ｆ、７６Ｂｒおよび１３１Ｉが挙げられる。さらなる同位体も当業者に容易に認識される。
「ハロアルキル」は、特定した炭素原子数を有し、１個以上のハロゲン原子で、通常は最大許容数までのハロゲン原子で置換された分岐状および直鎖状アルキル基を意味する。ハロアルキルの例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチルおよびペンタフルオロエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ハロアルコキシ」は、酸素架橋（アルコールラジカルの酸素）が結合した上記のハロアルキル基である。
「ペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）を介して相互に結合したアミノ酸の鎖である分子を意味する。
「医薬組成物」は、少なくとも一つの活性成分（例えば式ＩＩの化合物またはその塩）と、少なくとも一つの他の物質（例えば担体）とを含んでなる組成物を意味する。医薬組成物は、ヒトの、または、ヒト以外の医薬に関する米国ＦＤＡのＧＭＰ基準（適正製造基準）を満たすものである。
「担体」は、活性化合物とともに投与される希釈剤、添加剤またはビヒクルを意味する。「薬学的に許容される担体」は、医薬組成物の調製において有用であり、一般に安全、非毒性で、生物学的に望ましくない性質を有さない物質（例えば、添加剤、希釈剤またはビヒクル）を意味し、獣医学的使用およびヒトの医薬への使用に対して許容できる担体が含まれる。「薬学的に許容される担体」は、そのような担体の１つおよび１つ以上の両方を包含する。
「患者」は、医学的処置を必要とするヒトまたはヒト以外の動物を意味する。医学的処置には、存在する状態（例えば疾患または障害）の処置または診断的処置が含まれる。いくつかの実施形態では、患者はヒト患者である。
「提供する」とは、与えること、投与すること、販売すること、配布すること、移転すること（利益の有無を問わない）、製造すること、配合することまたは分注すること、を意味する。
「処置」または「処置する」とは、何らかの疾患の症状を低減する、疾患の進行を遅延させる、または疾患の退縮を引き起こすのに十分な量で患者に活性化合物を提供することを意味する。ある特定の実施形態では、疾患の処置は、患者がその疾患の症状を示す前に開始してもよい。
医薬組成物の「治療上有効量」とは、患者に投与したときに、治療上の恩恵（例えば症状の改善、疾患の進行を低減、または疾患の退縮）をもたらすのに有効な量を意味する。
「治療化合物」とは、疾患の診断または処置に用いることができる化合物を意味する。該化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質または他の種類の分子であってもよい。
有意な変化とは、統計的有意差に関する標準的なパラメトリック検定において、統計的に有意（例えばＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定でｐ＜０．０５）である、検出可能な変化である。
化合物に関する説明
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの化合物は、１以上の非対称な元素（例えば立体中心、対称軸等（例えば不斉炭素原子））を含んでもよく、その結果、化合物は異なる立体異性体の形態で存在しうる。これらの化合物は、例えば、ラセミ体または光学活性体であってもよい。二つ以上の非対称な元素を有する化合物の場合、これらの化合物はさらにジアステレオマー混合物であり得る。不斉中心を有する化合物の場合、純粋な光学異性体、およびそれらの混合物がすべて包含される。これらの状況において、単一のエナンチオマー（すなわち光学活性体）は、不斉合成、即ち光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ体の分割によって得ることが可能である。ラセミ体の分割は、例えば、分割剤の存在下での結晶化または例えばキラルＨＰＬＣカラムを使用するクロマトグラフィーなどの慣用の方法により実施することができる。それらを得るために用いる方法に関係なく、すべての形態が本願明細書において包含される。
活性成分のすべての形態（例えば溶媒和物、光学異性体、エナンチオマー、多形、化合物の遊離形態および塩）が、単独または組合せで使用することができる。
用語「キラル」とは、鏡像体のパートナと重ね合わせることができない分子を指す。
「立体異性体」は、同一の化学構成を有するが、原子または基の空間的配置が異なる化合物である。
「ジアステレオマー」とは、二つ以上のキラル中心を有し、分子が互いに鏡像関係ではない立体異性体である。ジアステレオマーは、例えば融点、沸点、スペクトル特性、反応性などの物性が異なる。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動、分割剤の存在下での結晶化、または例えばキラルＨＰＬＣカラムを用いるクロマトグラフィーなどの高分解能の分析的手法を用いて分離できる。
「エナンチオマー」とは、相互に重ね合わせることができない鏡像関係にある、化合物の２つの立体異性体を指す。エナンチオマーの５０：５０の混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と呼ばれ、化学的反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がない場合に生じうる。
本願明細書において用いられる立体化学の定義および慣例技術は、一般にＳ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、および、Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９９４）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性の形態で存在し、すなわち、それらは平面偏光面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記載する場合、接頭辞のＤおよびＬ、またはＲおよびＳを用いて、キラル中心についての分子の絶対配置を定義する。接頭辞のｄおよびｌ、または（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転方向を示すために用い、（−）またはｌは化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は右旋性である。
「ラセミ混合物」または「ラセミ体」は、２つの鏡像異性体の等モル（すなわち５０：５０）混合物であり光学活性を有さない。化学的反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がない場合ラセミ混合物であり得る。
「キレート基」または「キレーター」とは、単一の中心原子（通常は金属イオンである）に２以上の別々の配位結合を形成し得るリガンド基である。本願明細書において開示されるキレート基は、複数のＮ、ＯまたはＳヘテロ原子を有する有機基であり、２以上のヘテロ原子による同一の金属イオンとの結合形成を可能にする構造を有する。
「薬学的に許容される塩」には、開示した化合物の誘導体であって、親化合物が、無機および有機の、無毒性の、酸または塩基付加塩となることで修飾されたものが含まれる。本発明の化合物の塩は、慣用の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これら化合物の遊離酸の形態と、適切な化学両論量の塩基（例えばナトリウム、カルシウム、マグネシウムまたはカリウムの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）との反応により、または、これら化合物の遊離塩基の形態と、適切な化学両論量の酸との反応により、調製することができる。このような反応は、典型的には、水もしくは有機溶媒中、または、これら２つの混合液中で実施される。実行可能な場合には、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性媒体が用いられる。本発明の化合物の塩には更に、該化合物のおよび該化合物の塩の溶媒和物が含まれる。
薬学的に許容される塩としては、アミンなどの塩基性残基の無機塩または有機酸塩、酸性残基（例えばカルボン酸）のアルカリまたは有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、親化合物の、例えば無毒性の無機または有機酸から形成される、慣用の非毒性の塩や第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、慣用の無毒性の酸塩としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等）に由来するもの、ならびに有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ここでｎは０〜４である）等）から調製される塩が含まれる。更なる適切な塩のリストは、例えば、G. Steffen Paulekuhn, et al., Journal of Medicinal Chemistry 2007, 50, 6665 and Handbook of Pharmaceutically Acceptable Salts: Properties, Selection and Use, P. Heinrich Stahl and Camille G. Wermuth, Editors, Wiley-VCH, 2002に記載されている。
上記のとおり、一態様において、本発明は、以下に示す式Ｉの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含する。
式Ｉ中、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１0およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから独立に選択される。Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキルである。Ｒ１３は、キレート基である。いくつかの実施形態において、キレート基は、マクロ環部分（例えばＮＯＴＡ基、ＤＯＴＡ基、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）、ジピコリラミンエタン酸（ＤＰＡ）、シクロデキストリン、クラウンエーテルまたはポルフィリンなど）、または直鎖状部分（例えば１，４，７−トリアザヘプタン−１，４，７，７−四酢酸基）であってよい。これら化合物のいくつかの化学構造を以下に示す。
式Ｉはまた、−（ＣＨ２）ｍ−である連結基Ｌ１（式中、ｍは０〜１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０〜１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｐ−である連結基Ｌ３（式中、ｐは０〜１２の整数である。）を含んでもよい。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４それぞれにおいて、ＣＨ２はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはない。
いくつかの実施形態において、連結基Ｌ１〜Ｌ３は、ポリエチレングリコール部分−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−を含む。
式Ｉの一実施形態において、Ｌ１は−ＮＨ（ＣＯ）である。式Ｉの他の実施形態において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−である。式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｌ３は−ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ２−である。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ４は独立して、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから選択される。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ水素である。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ４は独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択される。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１およびＲ４はそれぞれメチルである。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１２は水素である。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１３は、
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
式Ｉのさらに他の実施形態において、Ｒ１３は、
である。
他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＩの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含する。
式ＩＩにおいて、連結基Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、ＣＨ２はそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはない。式ＩＩにおいて、Ｒ１３は、キレート基である。
式ＩＩのいくつかの実施形態において、Ｒ１３は、
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
式ＩＩのさらに他の実施形態において、Ｒ１３は、
である。
式ＩＩの他の実施形態において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−である。
ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）を発現する腫瘍に対する放射性核種療法は、進行性の低〜中程度の神経内分泌腫瘍の治療に有効であることが証明されている。多くの画像トレーサーや放射線治療薬が近年開発されている。ＳＳＴＲ結合ペプチドのいくつかの例を図７５Ａ〜７５Ｂに示す。これらのペプチドはＳＳＴＲ２特異性であることが分かっており、臨床現場で神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）患者の治療に使用されている。ただし、臨床での使用では、一般的な放射性核種で標識された既存のソマトスタチンペプチドベースの類縁体は、全体での応答率が比較的低い。たとえば、現在臨床で最も広く使用されているＳＳＴアナログである177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥは、患者あたり２９ギガベクレル（ＧＢｑ）の高い累積活性が注入されたにもかかわらず、全体の有効応答率は３０％に過ぎない（Cives and Strosberg、2017）。
本発明の発明者らは、尿路を通じてよりゆっくりと排出され、それに付随して、血液循環半減期を増大させ、腫瘍内でのより高い標的化された蓄積量をもたらす化学的類縁体を調製することにより、ソマトスタチン放射線療法の有効性を改善することを試みた。この目標は、オクトレオテート、オクトレオチドなどの一般的な臨床的に使用されるＳＳＴペプチド誘導体を、循環血清アルブミンに可逆的に結合するエバンスブルーアナログ（ＥＢ）とコンジュゲートさせて、ＳＳＴＲに対する親和性および特異性を保持した放射性医薬品を提供することで達成された。この新しく設計された分子はまた、コンジュゲートされた標的ペプチドの高い内在化率を保持し、したがって、ＳＳＴＲ陽性腫瘍において有意に高い蓄積を示した。新規のＥＢ−ＳＳＴＲペプチド誘導体を、治療用の純粋なベータエミッター、90Ｙ、177Ｌｕなどで標識することで、ＳＳＴＲ異種移植モデルを有するマウスの腫瘍応答と生存率が改善され、ペプチド自体と比較して長期的効果があった。このアプローチは、ＳＳＴＲを含む腫瘍を有する患者にとってより効果的な治療戦略を提供し得る。
したがって、他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＩＩの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含するものである。
式ＩＩＩにおいて、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから選択され、Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキルであり、Ｒ１３は、１１７Ｌｕを含んでなるキレート基であり、Ｒ１４は、ペプチドである。
式ＩＩＩはまた、−（ＣＨ２）ｍ−である連結基Ｌ１（式中、ｍは０〜１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０〜１２の整数である。）、−（ＣＨ２）ｐ−である連結基Ｌ３（式中、ｐは０〜１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｑ−である連結基Ｌ４（式中、ｑは０〜１２の整数である。）を含んでもよい。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４それぞれにおいて、ＣＨ２はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはない。式ＩＩＩにおいて、Ｒ１３は、１１７Ｌｕを含んでなるキレート基である。
式ＩＩＩの一実施形態において、Ｌ１は−ＮＨ（ＣＯ）−であり、Ｒ１およびＲ４はそれぞれメチルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素である。
Ｒ１４のペプチドは、治療用ペプチド（例えば疾患を治療できるペプチド）または疾患の診断に使用できるペプチドであってよい。Ｒ１４のペプチドとしては、例えば、インターフェロンα、ＧＣＳＦ、オクトレオテート、ボンベシン、ＲＧＤ、α−ＭＳＨ、ＣＴＴ１２９８またはアプタマーなどのペプチドが挙げられる。このペプチドは、式ＩＩＩの一部として結合したままでも生物活性を示すものであってもよく、または、このペプチドは、例えばペプチダーゼ酵素により式ＩＩＩから切断されるものであってもよい。このペプチドは、標的の細胞または組織に結合可能なペプチドであってもよく、例えば、このペプチドは腫瘍に結合可能なものであってもよい。結合は、共有結合または非共有結合によるものであってよい。
例えば、Ｒ１４のペプチドは、環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓであってよい。Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってよい。
他の実施形態において、Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってよい。
さらに他の実施形態において、Ｒ１４のペプチドは、以下のものであってもよい。
いくつかの実施形態において、Ｒ１４は治療化合物である。治療化合物は、治療特性を有するいかなる化合物でもあってよく、治療用小分子、ペプチド薬またはタンパク質ベースの治療剤が含まれる。式ＩＩＩにおいて有用な、適当な治療用小分子の例としては、ドキソルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、カンプトセシン、テモゾロマイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。式ＩＩＩにおいて有用な、適当なペプチド薬の例としては、インスリン、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、オクトレオチド、ボンベシン、ＲＧＤペプチド（アルギニルグリシルアスパラギン酸）またはそれらの治療用フラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。式ＩＩＩにおいて有用な、適当な治療用タンパク質の例としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼなど、またはそれらの治療用フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、式ＩＩＩにおける治療化合物Ｒは、哺乳類、好ましくはヒトにおける疾患または状態の治療または診断に使用できる。例えば、一実施形態において、Ｒは、癌または糖尿病を治療または診断する能力に関して選択される。
Ｒ１４は、天然の治療用分子または治療活性を有するそのフラグメントであってよいと理解すべきである。好ましくは、Ｒ１４は、それと式Ｉのマレイミド部分との間のコンジュゲーションまたは架橋による式ＩＩＩのコンジュゲート複合体の形成を促進するスルフヒドリル部分を含む。治療化合物上の活性なスルフヒドリル部分は、天然由来（例えばエキセンディン−４におけるＣｙｓ−４０）であってよく、またはアミノ酸置換または化学修飾等の周知の方法により治療化合物またはそのフラグメントに人工的に導入してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｒ１４は、放射性核種（例えば１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉ）をさらに含んでなる。放射性核種を含むＲ１４の有用な置換基の例は以下のとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、
である。
いくつかの実施形態において、式ＩＩＩにおけるＲ１３基は、放射性核種（６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８９Ｚｒ、９９Ｔｃ、１５３Ｓｍ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａなど）をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１３に含まれる放射性核種は、６４Ｃｕまたは９０Ｙである。この放射性核種は、キレート化により、または化学分野において公知の慣用の共有結合またはイオン結合などの他の手段により、Ｒ１３に結合され得る。この放射性核種は、イメージングまたはスキャニング、例えばＰＥＴイメージングなどの目的に適するものであってよく、式ＩＩＩの化合物はＰＥＴ造影剤となり得る。この放射性核種は、患者の治療（例えば放射線治療）の目的に適するものであってよく、式ＩＩＩの化合物は癌の治療剤となり得る。
他の態様において、本発明は、以下に示す式ＩＶの化合物を有するエバンスブルー色素の化学的コンジュゲート、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物を包含する。
式ＩＶにおいて、Ｒ１４はペプチドであり、Ｒ１３は１１７Ｌｕを含んでなるキレート基である。
式ＩＶはまた、−（ＣＨ２）ｎ−である連結基Ｌ２（式中、ｎは０〜１２の整数である。）、および−（ＣＨ２）ｑ−である連結基Ｌ４（式中、ｑは０〜１２の整数である。）を含んでもよい。Ｌ２およびＬ４それぞれにおいて、ＣＨ２はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはない。
いくつかの実施形態において、連結基Ｌ１〜Ｌ４は、ポリエチレングリコールセグメント−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−を含む。
一実施形態において、Ｌ２は−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−であり、Ｌ４−Ｒ１４は以下のとおりである。
他の実施形態において、Ｒ１３は、
、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される。
いくつかの実施形態において、Ｒ１３は、
である。
式ＩＩＩの化合物について記載したＲ１４の実施形態の説明は、式ＩＶの化合物にも適用される。また、式ＩＶのＲ１３および／またはＲ１４は上記の放射性核種を更に含んでもよく、式ＩＩＩの化合物について記載した放射性核種の実施形態の説明は、式ＩＶの化合物にも適用される。
いくつかの実施形態において、本開示における新規な分子は、アルブミン結合モチーフとしての短縮型エバンスブルードメイン、放射性核種による標識のためのキレーター、スペーサ、リンカーとしてのマレイミド由来残基、および生体分子結合モチーフを含む（図１）。
［医薬調製物］
ある式への参照は、下位概念のすべての式への参照を包含し、例えば式ＩＩＩは式ＩＶの化合物を包含する。本願明細書において開示される化合物は、そのまま化合物として投与することもできるが、好ましくは医薬組成物として投与される。したがって、本発明は、少なくとも一つの薬学的に許容される担体と共に、式ＩＩＩの化合物などの化合物またはその化合物の薬学的に許容される塩を含んでなる医薬組成物を包含する。医薬組成物は、唯一の活性成分として式ＩＩＩの化合物または塩を含んでいてもよいが、好ましくは少なくとも更に一つの活性成分を含む。特定の実施形態において、医薬組成物は、単位投与形態中に、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの式ＩＩＩの化合物と、所望により、約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約２００ｍｇ〜約６００ｍｇの更なる活性成分とを含む。医薬組成物は、式ＩＩＩの化合物などの化合物と、更なる活性成分とを、あるモル比で含み得る。例えば、医薬組成物は、更なる活性成分と式ＩＩＩの化合物とを、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１、または約１．５：１〜約４：１のモル比で含み得る。
本願明細書において開示される化合物は、慣用の薬学的に許容される担体を含有する単位投与製剤として、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入または噴霧により、舌下的に、経皮的に、口腔的に、直腸内に、点眼用溶液として、または他の手段により投与し得る。本医薬組成物は、例えばエアゾール、クリーム、ゲル、丸薬、カプセル、錠剤、シロップ、経皮パッチまたは点眼用溶液としてなど、任意の薬学的に有用な形態に製剤化されていてもよい。投与形態によっては（例えば錠剤およびカプセルなど）、適切な量（例えば所望の目的を達成するための有効量）の活性成分を含有する適当なサイズの投与単位に分割される。
担体には、賦形剤や希釈剤が含まれ、また治療を受ける患者への投与に適するだけの十分に高い純度を有し、また十分に低い毒性を有していなければならない。担体は不活性であってもよく、またはそれ自体が薬学的な利点を有していてもよい。化合物と共に用いられる担体の量は、化合物の単位用量当たりの投与のための材料の実用的な量を提供するのに十分な量である。
担体の種類としては、結合剤、緩衝剤、着色料、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、香料、流動促進剤、滑沢剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、錠剤化剤および湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの担体は複数のクラスに列挙され、例えば植物油は、いくつかの製剤においては滑沢剤として、他の場合には希釈剤として使用され得る。薬学的に許容される担体の例としては、糖類、デンプン、セルロース、トラガント粉末、モルト、ゼラチン、タルクおよび植物油が挙げられる。場合により、本発明の化合物の活性を実質的に妨害しない活性成分を医薬組成物に含有させてもよい。
医薬組成物／合剤は、経口投与用に製剤化することができる。これらの組成物は、式ＩＩＩの化合物を０．１〜９９重量％（ｗｔ％）、通常では式ＩＩＩの化合物を少なくとも約５重量％含む。いくつかの実施形態では、約２５重量％〜約５０重量％、または約５重量％〜約７５重量％の式ＩＩＩの化合物を含む。
［治療方法］
式ＩＩＩの化合物、ならびに該化合物を含む医薬組成物は、糖尿病または癌などの疾患の診断または治療に有用である。本発明によれば、糖尿病の治療方法は、そのような治療を必要とする患者に式ＩＩＩの化合物を治療有効量で投与することを含んでなる。一実施形態において、患者は、哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者に理解できるように、本発明はまた、例えばネコ、イヌなどのコンパニオンアニマルや家畜などのヒト以外の患者の治療方法を包含する。
医薬組成物の治療有効量は、好ましくは、疾患または状態の症状を軽減または改善するのに十分な量である。例えば糖尿病の場合、治療有効量は、高血糖を軽減または改善するのに十分な量であり得る。本願明細書に記載される化合物または医薬組成物の治療有効量は、患者に投与したときに、式ＩＩＩの化合物の十分な濃度をもたらす。十分な濃度とは、好ましくは、障害を予防し、または障害と戦うのに必要な、患者の身体における化合物の濃度である。そのような量は、例えば化合物の血中濃度の分析することにより、または理論的に生物学的利用能を算出することにより、実験的に確認することができる。
本発明によれば、本願明細書において開示される治療方法は、特定の投与量の式ＩＩＩの化合物を患者に提供することを含む。上記で示した症状の治療において有用な１日あたりの各化合物の投与量レベルは、約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇ／ｋｇ体重である（患者１人あたり１日に約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。一回投与形態を製造するために担体材料と組合せられる化合物の量は、治療を受ける患者や投与の具体的な形式に依存して変わるであろう。単位投与形態は通常、各活性成分を約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間で含有するであろう。ある特定の実施形態において、２５ｍｇ〜５００ｍｇ、または２５ｍｇ〜２００ｍｇの式Ｉの化合物が患者に毎日投与される。投与の頻度は、使用する化合物および治療する具体的な疾患に応じて変わる。しかしながら、ほとんどの疾患や障害の治療では、１日４回以下の投与レジメが用いられ、特定の実施形態では、１日１回または２回の投与レジメが用いられる。
しかしながら、特定の患者に対する具体的な用量レベルは、使用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物の組み合わせ、および治療を受けている具体的な疾患の重篤度などのさまざまな要因に依存すると理解されよう。
式ＩＩＩの化合物は、糖尿病などの疾患や状態を治療または予防するために単独で（すなわち投与レジメにおける唯一の治療薬として）投与してもよく、または他の活性成分との組合せで投与してもよい。式ＩＩＩの１以上の化合物を、１以上の他の活性成分（例えば抗癌細胞毒性剤）の投与レジメと連携して投与してもよい。一実施形態において、哺乳動物における癌の治療または診断方法は、この哺乳動物に、治療有効量の式ＩＩＩの化合物を、場合により１以上のさらなる活性成分と組合せて投与することを含む。
当業者には理解されるように、本願明細書において提供される治療方法は、ウマや家畜（例えばウシ、ヒツジ、乳牛、ヤギ、ブタ等）ならびにイヌおよびネコ等のペット（コンパニオンアニマル）の治療のような獣医学的用途を含め、ヒト以外の哺乳動物の治療にも有用である。
診断または研究の用途には、齧歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類およびブタ（例えば近交系のブタ等）を含む様々な哺乳動物が適当な被験体となり得る。さらに、インビトロでの用途（例えばインビトロの診断や研究用途）には、上記の被験体の体液（例えば血液、血漿、血清、細胞組織液、唾液、***物および尿）や細胞および組織サンプルが使用に適する。
一実施形態において、本発明は、糖尿病の障害を治療する方法であって、そのような治療が必要であると特定された患者に、有効量の式ＩＩＩの化合物を投与することを含む方法を提供する。本願明細書において提供される式ＩＩＩの化合物は、単独で投与してもよく、または１以上の他の活性成分と組合せて投与してもよい。
他の実施形態において、この糖尿病の治療方法は、そのような治療が必要である患者に、１以上のさらなる化合物と組合せて式ＩＩＩの化合物を投与することをさらに含んでもよく、該さらなる化合物の少なくとも１つは活性成分である。１以上のさらなる化合物としては、抗癌治療化合物（例えばドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトセシン、テモゾロマイド、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス等）などのさらなる治療化合物が挙げられる。
本発明の組成物は、多くの小分子や生物製剤を、１ステップで、高収率および高純度で容易に修飾できるという利点を提供する。ＥＢ部分とアルブミンの結合が比較的強いため、ＥＢ部分およびリンカーの数の調整によりインビボでの体内分布を容易に制御することができる。さらに、ＥＢ部分が相対的に小さいため、小分子または生物製剤の生物学的機能に干渉する可能性も減少する。キレーター（例えばＥＢ部分に結合するＮＯＴＡまたはＤＯＴＡ）の付加により、放射性核種のような更なる基を簡単に付加することができ、それにより、本発明の分子が造影剤および／または放射性治療剤として機能させることができる。したがって、本発明は、高い有効性を有する、持続性および長時間作用性の治療剤および造影剤を開発するための効率的なシステムを提供する。
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明する。特に明記しない限り、部およびパーセンテージはすべて重量により、温度はすべて摂氏温度で表す。
［略語］
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＴ コンピュータ断層撮影
ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＯＴＡ １，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸
ＨＡＴＵ １−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析
ＬＣ／ＭＳ 液体クロマトグラフィー／質量分析
ＮＯＴＡ １，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＥＴ ポジトロン放出断層撮影
ＲＴ 室温
ＳＡＴＡ Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
［一般的方法］
Ｂｏｃ−リジン−Ｆｍｏｃアミノ酸は、Bachemから購入した。ＮＯＴＡ−ビス（ｔ−Ｂｕエステル）およびＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）は、Macrocyclicsから購入した。Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＰＥＧ４ビオチン化試薬は、Thermo Fisher Scientificから購入した。アビジン−セファロースビーズはGE Healthcareから入手した。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドは、C.S.Bioから購入した。他の全ての溶媒および化学薬品は、Sigma-Aldrichから購入した。
分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、以下の２つのグラジェントシステムを有するPhenomenex Luna C8カラム（５μｍ、４．６０×１５０ｍｍ）で行った：
システム１：８０％の溶媒Ａ（５０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ）および２０％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ）を開始から２分間、次いで流速１ｍＬ／分にて１５分間で溶媒Ｂが９０％となるまで増加させるグラジェント
システム２：９５％の溶媒Ａおよび５％の溶媒Ｂで開始し、３５分後に流速１ｍＬ／分にて６５％の溶媒Ｂに変更するグラジェント
紫外線（ＵＶ）吸光度を２５４および６００ｎｍでモニターした。化合物は、Biotage精製システム（Ｃ−１８、２１０×２５ｍｍ）またはHigginsカラム（Ｃ−１８、５μｍ、２５０×２０ｍｍ）にて（それぞれ流速２５ｍＬ／分、１２ｍＬ／分にてグラジェントシステム２を使用）、溶媒の変更［溶媒Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ、溶媒Ｂ：０．１％のＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ］を除き、システム２と同様のグラジェントを用いて精製した。ＬＣ−ＭＳ分析は、文献記載の手順（１）と同様に行った。６４ＣｕＣｌ２は、NIH Cyclotron Facilityから入手した。放射性ＴＬＣは、ｉＴＬＣプレートと、展開溶媒として０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ５）を用い、AR-2000 Bioscanスキャナで実施した。１８Ｆ−ＦＧＤは、Cardinal Healthから購入した。１８Ｆ−ＦＬＴは、文献記載の手順（２）に従い合成した。
実施例１：エバンスブルーアミン（ＥＢ−ＮＨ２）の調製
２−トリジン（４．３ｇ）および塩化メチレン（４０ｍＬ）を含む１００ｍＬ容の丸底フラスコに、ジ−ｔ−ブチルジカルボネート（４．４ｇ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。反応液を濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、３．２ｇのＮ−Ｂｏｃ−２−トリジンを得た。ＬＣ−ＭＳ：［ＭＨ］＋＝３１３．４１３５（ｍ／ｚ）（計算値）：３１２．１８３８。
Ｎ−Ｂｏｃ−２−トリジン（０．４６ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を、ガラスバイアル中のアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した後、塩酸（０．３Ｍ、１５ｍＬ）を添加した。冷却した亜硝酸ナトリウム溶液（５ｍＬの水中、０．３１ｇ）を滴加し、２０分間撹拌し、溶液は明るい黄色に変化した。この溶液を、０℃にて、水（２０ｍＬ）中に１−アミノ−８−ナフトール−２，４−ジスルホン酸一ナトリウム塩（０．５９ｇ）および重炭酸ナトリウム（０．４９ｇ）を含む別のガラスバイアルに滴加した。ＬＣ／ＭＳにより反応の完了を確認し、反応液を更に精製することなく凍結乾燥し、Ｂｏｃ−ＥＢ生成物を得た。［Ｍ−Ｈ］−＝５４１．４４２５、計算値：５４２．０９３０。
Ｂｏｃ ＥＢ生成物を８０％のＴＦＡ、１０％の１，２−エタンジチオールおよび１０％のチオアニソールの溶液に添加し、反応が完了するまで撹拌した。混合液を水（１００ｍＬ）で希釈し、Ｃ−１８クロマトグラフィーカートリッジ（３×１５ｃｍ）にロードした。カラムを水で洗浄した後、８０％エタノールで所望の生成物を溶出させた。溶出液中の溶媒を蒸発させた後、８０％純度の生成物ＥＢ−ＮＨ２を０．６ｇ得た。少量の生成物をＨＰＬＣにより更に精製した。ＬＣ−ＭＳ：［Ｍ−Ｈ］−＝５４１．４４２５、計算値：５４２．０９３０。
実施例２：ＥＢ−ＬＹＳ−ＢＯＣの合成
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２〜３ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−Ｆｍｏｃ（３．６当量）の溶液に、アルゴン雰囲気下で（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ、４．２当量）を添加した。溶液を室温（ＲＴ）で１０分間撹拌した。次に、１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した後、５〜７ｍＬのＤＭＦ中のＥＢ−ＮＨ２を添加した。反応液をＲＴで一晩撹拌した。ＥＢ−ＮＨ２の、保護されたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＢｏｃとのＥＢコンジュゲートへの変換を、分析用ＨＰＬＣ（システム１）を用いてモニターした。保持時間は、ＥＢ−ＮＨ２は７．７分、ＥＢ−保護Ｌｙｓコンジュゲートは１１分であった。変換完了後、２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）を添加し、反応液を更に１時間撹拌した。ＤＭＦを高真空オイルポンプにより除去し、反応液をメタノール／Ｈ２Ｏ（２：１）中に再度溶解させ、Ｂｉｏｔａｇｅシステムで精製した。回収したＨＰＬＣフラクションを、分析用ＨＰＬＣに再注入した結果、純度は９０％超であり、それを更に凍結乾燥した。ＥＢ−Ｌｙｓ−Ｂｏｃの保持時間（ｒ．ｔ．）は、８．３分（システム１）または２３．２分（システム２）であった。ＬＣ−ＭＳ分析により質量は７６９［ＭＨ］−であると確認した。
実施例３：ＮＯＴＡ−ＥＢ−ＬＹＳ−ＢＯＣの合成

ＥＢ−Ｌｙｓ−ＢｏｃとＮＯＴＡ−ビス（ｔ−Ｂｕエステル）との反応は、上記と同様の条件で行った。分析用ＨＰＬＣ（システム２）により、保持時間２９．３分、純度＞９０％、質量１１６７［ＭＨ］−であることを確認した。
実施例４：ＮＯＴＡ−ＥＢ−ＬＹＳの合成
脱保護は、チオアニソール：１，２−エタンジチオール：アニソール：ＴＦＡ（５：３：２：９０）を用い、ＲＴにて行った。脱保護の完了を、ＨＰＬＣ（保持時間１７．１分）によりモニターした。精製前に、アルゴン流によりＴＦＡを除去した。ＮＯＴＡ−ＥＢ−Ｌｙｓを、Ｂｉｏｔａｇｅシステムで精製した。ＬＣ−ＭＳ分析により質量は９５４［ＭＨ］−であることを確認した。
実施例５：ＮＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＮＭＥＢ）の合成
ＮＯＴＡ−ＥＢ−Ｌｙｓを０．５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させた。次に、１．２６当量のトリメチルアミンを添加した後、０．２ｍＬのＤＭＦ中の１．２６当量の３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加した。反応液をＲＴで２時間撹拌した。Ｈｉｇｇｉｎｓカラムで精製を行った。分析用ＨＰＬＣへの注入（システム２）の結果、保持時間１７．４分、純度＞９０％、および質量１１０５［ＭＨ］−と示された。
実施例６：ＲＧＤ−ＳＨの合成
２０〜３０ｍｇのｃ（ＲＧＤｆｋ）を、１．５ｍＬのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中に溶解させた。１．３当量のＳＡＴＡを、ジメチルスルホキシド中に溶解させ、ペプチドに添加した。ＨＰＬＣがコンジュゲートされたペプチドへの完全な変換を示すまで、溶液を１〜１．５時間撹拌した。一晩凍結乾燥することにより溶媒を除去した。０．１Ｍのホウ酸バッファー（ｐＨ８．６）およびＨ２Ｏ（１：１）中の７０ｍｇのヒドロキシルアミンおよび２０ｍｇのエチレンジアミン四酢酸を用いて、アセチル基の脱保護をＲＴにて１時間行った。ＨｉｇｇｉｎｓカラムでＲＧＤ−ＳＨの精製を行った。純粋なペプチドを分析用ＨＰＬＣへ再注入した結果、保持時間１７．３分、純度９０％超と示された。ＬＣ−ＭＳ分析により質量は６７６［ＭＨ］−と確認された。
実施例７：ＮＭＥＢ−ＲＧＤの合成
ＮＭＥＢを、脱気した０．３ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％（ｗ／ｖ）のアスコルビン酸ナトリウムの溶液に溶解させた。ＲＧＤ−ＳＨ（１．１当量）を５０μＬのＤＭＦに溶解し、ＮＭＥＢ溶液に添加した。この反応液を室温にて２時間撹拌した。Ｈｉｇｇｉｎｓシステムで精製を行った。ＮＭＥＢ−ＲＧＤの保持時間は１７．５４分、純度は＞９０％、質量は１７８３［ＭＨ］−であった。
実施例８：ＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ−ＲＧＤ（ＤＥＢ−ＲＧＤ）の合成
チオール化したＲＧＤにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢの合成は、キレーターとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いて、実施例７と同様に行った。ＨＰＬＣの結果、保持時間１７．８分、質量１８８３．９［ＭＨ］−であった。
実施例９：チオール化オクトレオテートにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＥＢ−ＴＡＴＥ）の合成
チオール化されたオクトレオテートにコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢの合成は、キレーターとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いて、実施例７と同様に行った。ＨＰＬＣの結果、保持時間３．３５分、質量１８６２．５８［ＭＨ］−であった。
実施例１０：ＣＴＴ１２９８にコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢ（ＤＭＥＢ−ＣＴＴ）の合成
ＣＴＴ１２９８（前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンド）にコンジュゲートしたＤＯＴＡ−マレイミド−ＥＢの合成は、キレーターとしてＤＯＴＡ−トリス（ｔ−Ｂｕエステル）を用いて、実施例７と同様に行った。ＨＰＬＣの結果、保持時間２．３２分、質量１８６５．３８［ＭＨ］−であった。
実施例１１：比較化合物
上記の構造を有する化合物ＮＭＥＢ−ＲＡＤ、ＤＯＴＡ−ＲＧＤ、ＮＯＴＡ−ＲＧＤおよびＮＥＢを、実施例２〜８と同様の方法により合成した。
実施例１２：化合物の標識
１０μＬの６４ＣｕＣｌ２（１．５〜２．２ＧＢｑ、４２〜６０ｍＣｉ）を、０．５ｍＬの０．４Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．６）で希釈した。次に、０．３７〜０．７４ＧＢｑ（１０〜２０ｍＣｉ）を、ペプチド（１００μｇ）を含むバイアルに移した。反応液を３７℃で３０分間混合した後、分析用ＨＰＬＣ（システム１、保持時間６．３７）、ｉＴＬＣプレートと展開溶液として０．１Ｍのクエン酸（ｐＨ５）を用いた放射性ＴＬＣ（ＡＲ−２０００ Ｂｉｏｓｃａｎスキャナ）のいずれかにより、純度を試験した。フリーの６４ＣｕのＲｆは約０．９であり、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤのＲｆは約０．１であった。６４Ｃｕ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび６４Ｃｕ−ＤＭＥＢ−ＣＴＴの標識は、同様の方法で行った。Ｙ−９０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）標識は、３７０−４４４ｍＢｑ（１０〜１２ｍＣｉ）を用いて６４Ｃｕについて上記したのと同様の条件で行った。
実施例１３：マウス血清における安定性試験
７．４〜１１．１ＭＢｑ（０．２〜０．３ｍＣｉ）の６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを、３７℃で１、４、８および２４時間、０．５ｍＬのマウス血清とインキュベートした。各時点でサンプルを分取し、放射性ＴＬＣ測定においてｉＴＬＣプレート上にロードし展開した。
実施例１４：細胞培養
Ｕ８７ＭＧヒト神経膠芽腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト黒色腫およびＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌の細胞株をＡＴＣＣから購入し、それぞれ、最小必須培地、リーボビッツＬ−１５培地およびマッコイ５Ａ培地にて培養した。いずれの細胞にも、１０％のウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で細胞を培養した。
実施例１５：ＮＭＥＢ−ＲＧＤおよびＦＴＩＣ−アルブミンの細胞取込み
１０５個の細胞を三組、一定量のＦＩＴＣ−アルブミンおよび漸増量のＮＭＥＢ−ＲＧＤと共に２時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを用いて取得した。細胞の蛍光を平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表した。
実施例１６：組織病理染色
内皮細胞、腫瘍血管と腫瘍細胞両方でのインテグリン発現を視覚化するため、それぞれ、ＣＤ３１、ＣＤ６１（マウスインテグリンβ３）またはヒトインテグリンαｖβ３の免疫蛍光染色を採用した。本発明で使用したマウス抗ヒトインテグリンαｖβ３抗体は、ヒトインテグリンαｖβ３のみを認識し、腫瘍細胞のマウスインテグリンαｖβ３とは交差反応しない。簡潔に言えば、凍結組織切片（５μｍ）を冷却したアセトンで固定し、ＰＢＳでリンスし、室温で１時間、１％のウシ血清アルブミン溶液でブロッキングした。スライドを、ラット抗マウスＣＤ３１、ハムスター抗ラットＣＤ６１またはマウス抗ヒトインテグリンαｖβ３モノクローナル抗体の１：１００の希釈液と共に室温で一晩インキュベートした後、それぞれ、１：２００のAlexa Fluor488標識ロバ抗ラット、Alexa Fluor647標識抗ハムスターおよびAlexa Fluor488標識抗マウス二次抗体とインキュベートした。細胞核の染色のためにサンプルをＤＡＰＩで封入した。蛍光イメージを落射蛍光顕微鏡（２００Ｘ、オリンパス、Ｘ８１）により得た。同じ条件で画像を取得し、同じスケールで表示した。
実施例１７：標的化放射線治療後の組織病理染色
動物を屠殺した後、群Ａ〜ＦのＵ８７ＭＧ腫瘍サンプルを回収し切片を調製した。ＣＤ３１の染色手順は前述と同様であった。Ｋｉ−６７染色は、凍結した腫瘍切片を冷却したアセトンで２０分間固定し、室温で３０分間空気乾燥させた。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による３０分間のブロッキングの後、スライドを、Ｋｉ−６７特異的モノクローナル抗体（１：１０００、Abcam）で染色し、次にＣｙ−３とコンジュゲートさせたロバ抗ウサギ二次抗体（１：２００、Thermo Fisher Scientific）とインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、サンプルを、細胞核の染色のためＤＡＰＩ（Vector）で封入した。蛍光イメージは、落射蛍光顕微鏡（２００Ｘ、オリンパス、Ｘ８１）により得た。
市販のキット（Roche Applied Science）を用い、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ビオチン−ｄＵＴＰ標識（ＴＵＮＥＬ）による免疫蛍光分析を行った。製造元の説明書に従い、サンプルを１０％ホルマリンで固定し、０．１％トリトンと氷上で２分間インキュベーションして浸透化した。固定化および浸透化の後、ＴＵＮＥＬ反応混合液５０μＬをサンプルに添加した。次に、スライドを、暗所にて、加湿雰囲気下、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳでリンスし、ＤＡＰＩ（Vector）で封入した後、落射顕微鏡でＧＦＰチャンネルを用い、サンプルを観察した。ヒト組織の染色は、ｓｃ−７３１２抗体（Santa Cruz biotechnology）を用いてHistoserv社により行われた。マウス組織のＨ＆Ｅ染色もHistoserv社により行なわれた。
実施例１８：ＦＶＢマウスにおける安定性アッセイ
ＦＶＢマウスに、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）注射した。１時間および４時間後、マウス（ｎ＝２）を安楽死させ、心臓から血液を採取した。遠心分離（３５００ｒｐｍにて５分間）を用いて、血漿から赤血球を分離した。その後、血漿０．２ｍＬを冷却メタノールで希釈し（１：１）、３０秒間ボルテックスし、１０，６００ｇで５分間遠心分離した。抽出されたスープを採取し、０．４５μｍフィルターで濾過し、分析用ＨＰＬＣ（システム１）に注入した。
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤはマウス血清中で２４時間は安定であり、脱金属化は特に観察されなかった。インビボでは、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは血液中で４時間は安定であり、極性の高い成分が少量見られただけであった。抽出された放射能の９０％超が血液タンパク質フラクションと結合した。２４時間後にアルブミン／血液から抽出された６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの量が低過ぎてＨＰＬＣ分析ができなかったため、インビボでの安定性の評価は４時間に限定された。
実施例１９：腫瘍モデル
雌の無胸腺ヌードマウス（Harlan Laboratories）を、病原体フリーの条件下、動物施設に収容した。５〜６週齢の雌の無胸腺ヌードマウスに、５×１０６個の細胞を右肩へ注入することにより、腫瘍モデルを作製した。マウスは、腫瘍体積が３００ｍｍ３に達したとき（接種後１４〜２０日）、小動物ＰＥＴ試験を受け、腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達したとき（接種後１０〜１４日）、９０Ｙ放射性核種治療を受けた。
実施例２０：生体内分布
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを注入したＵ８７ＭＧ腫瘍異種移植マウスを、ＰＥＴイメージングの２４時間後に屠殺した。血液、筋肉、骨、肝臓、腎臓、脾臓、腸、心臓および腫瘍を採取し、湿重量を測定した。６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを注入したＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ−２９腫瘍異種移植マウスについては、血液、腫瘍および心臓を採取した。放射線量をγ−カウンタで測定した。結果を％ＩＤ／ｇで表した。
実施例２１：ＮＭＥＢ−ＲＧＤのインビトロキャラクタリゼーション
Ｕ８７ＭＧ細胞を用いた競合アッセイにおいて、インテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合親和性を、ｃ（ＲＧＤｆＫ）と比較した。ＮＭＥＧ−ＲＧＤおよびｃ（ＲＧＤｆＫ）のＩＣ５０値は、１８Ｆ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）と競合させた場合、１時間後で、それぞれ５９．８８±１３．９５ｎＭおよび４６．６１±１８．７７ｎＭであり（図２Ａ）、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）と競合させた場合、４時間後で、それぞれ７４．０７±２８．２４ｎＭおよび８５．２１±１３．９９ｎＭであった（図２Ｂ）。両トレーサーに対する比活性は同様であり（６．６６ＧＢｑ／μｍｏｌ）、両トレーサーの結合の違いが受容体の飽和によるものではないと仮定できるものであった。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で、ＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合親和性は、１時間のインキュベート時間では低かった（数値が高かった）（４１２．０３±３７１．３８ｎＭ、図２Ｂ）。対称的に、ＮＭＥＢ−ＲＧＤのアルブミンに対するＮＭＥＢ−ＲＧＤ結合親和性は、インテグリンαｖβ３に対する親和性と比べて３９倍低かった（数値が高かった）（２．３４±１．３８μＭ、図２Ｃ）。アルブミンに対するこの低い親和性は、報告されているアルブミンに対するエバンスブルー（ＥＢ）の結合親和性（約２．５μＭ）と同程度であった。アルブミン存在下におけるインテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの低い結合親和性は、バッファー中の低い遊離ＮＭＥＢ−ＲＧＤ濃度またはＥＢ−ＲＧＤ−アルブミン複合体の顕著に遅い会合速度に起因するのかを調べるため、インテグリンαｖβ３に対するＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合を、４時間にわたり、アルブミンの存在下で評価した。これらの条件で、競合物質としての６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）との競合により、ＩＣ５０は、２２１．１３±７７．０２ｎＭまで減少した（図２Ｂ）。
ｃ（ＲＧＤｆｋ）およびＥＢ−ＲＧＤ誘導体について、キレーターをＮＯＴＡからＤＯＴＡに置き換えても、４時間のインキュベート後での、インテグリンαｖβ３に対する結合親和性は変わらなかった（ＩＣ５０は、ＨＳＡを添加しない場合、ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）で６７．７９±３３．６３ｎＭ、対してＤＭＥＢ−ＲＧＤで７６．６１±３１ｎＭ、また１％ＨＳＡの存在下では１８５．２３±１２１．２８ｎＭ）（図３Ａ）。ＲＧＤペプチドにおけるグリシン残基をアラニンに置き換えると、受容体に対する結合能は失われた（図３Ｂ）。
実施例２２：細胞取込みおよび内在化
６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの細胞取込みおよび内在化を、インテグリンαｖβ３の発現レベルが異なる（高、中および低）、それぞれ公知の３種の細胞株（Ｕ８７ＭＧ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９）を用いて試験および評価した。培地中にアルブミンが存在しない場合、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取込みは、いずれの時点でも有意に高かった（図２Ｄ）。Ｕ８７ＭＧ細胞（インテグリンαｖβ３の発現レベルが最も高い）による６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取込みは、インキュベート時間が長くなると増加し、４時間後で合計の１．８６±０．２２％に達した。ＨＴ２９細胞（インテグリン発現レベルが最も低い）の場合、取込みは顕著に低かった（０．７６±０．０３％、図４Ａ）。インテグリンαｖβ３に対する６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの特異性を、過剰量のｃ（ＲＧＤｆｋ）またはＮＭＥＢ−ＲＧＤ（図２Ｄ）との同時インキュベートにより試験した。５分後では、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取込みは内在化によるものではなかったが、後の時点では、取込まれたほとんどの６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは内在化した（図２Ｅ）。この現象は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９細胞株でもみられた（図４Ａ〜Ｂ、図５）。ＮＭＥＢ−ＲＧＤの内在化が、ＮＭＥＢ−ＲＧＤに結合したアルブミンも内在化するか否かを試験するため、Ｕ８７ＭＧ細胞を、漸増濃度のＮＭＥＢ−ＲＧＤで蛍光標識したアルブミンとインキュベートし、細胞全体の蛍光を測定した。いずれのＥＢ−ＲＤＧ濃度でも、fitc-アルブミン単独では、ベースラインを上回る細胞蛍光の増加は見られなかった。ＮＭＥＢ−ＲＧＤの量が増加しても細胞の蛍光は増大せず、ＮＭＥＢ−ＲＧＤは、アルブミンの内在化を誘導しないと示唆され、インテグリンαｖβ３と結合する前にアルブミンから遊離すると考えられる。
実施例２３：６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤによる腫瘍異種移植モデルのマイクロＰＥＴイメージング
Ｕ８７ＭＧ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９腫瘍組織における、腫瘍血管形成およびインテグリンαｖβ３発現レベルを、ＣＤ３１、ＣＤ６１（マウスインテグリンβ３）およびヒトインテグリンαｖβ３に対する蛍光抗体を用いて視覚化した。Ｕ８７ＭＧおよびＨＴ２９腫瘍はいずれも、高いＣＤ３１染色により示される増加した血管形成を示した一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍では染色は比較的弱かった（図６）。Ｕ８７ＭＧ腫瘍組織は、最も高いヒトインテグリンαｖβ３発現を示した（図６）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ではインテグリン発現は低かったが、ＨＴ２９よりは高かった（図６）。マウスインテグリンβ３（ＣＤ６１）の発現レベルはＣＤ３１染色と同程度で、細胞の順序は、Ｕ８７ＭＧ＞ＨＴ２９＞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５であった（図６）。
最初に、Ｕ８７ＭＧ異種移植モデル（高インテグリンαｖβ３および高血管形成）において、４つの放射性トレーサーすべてについて評価した。６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤは、いずれの時点でも、すべてのトレーサーより顕著に高い取込みを示した（それぞれ、注射後（ｐ．ｉ．）１、４および２４時間で、９．８７±１．４０、１４．０９±１．６２および１６．６４±１．９９％ＩＤ／ｇ）（図７）。％ＩＤ／ｇの平均と最大とを比較すると、腫瘍における蓄積はさらに高くなり、ｐ．ｉ．４および２４時間で、２７〜３０％ＩＤ／ｇに達し、６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）の取込みより１５倍高かった（図８）。血液における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの取込みは、ｐ．ｉ．１時間で比較的高かったが（９．５８±０．８４％ＩＤ／ｇ）、ｐ．ｉ．４および２４時間で、それぞれ、５．７３±０．６７および２．４６±０．２５％ＩＤ／ｇにまで有意に低下し、腫瘍対バックグラウンド比は高くなった（図７および図９）。インテグリンαｖβ３に対する６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの結合特異性を、ｃ（ＲＧＤｆｋ）または非標識ＮＭＥＢ−ＲＧＤの同時注入により試験した。過剰量のモノマーを同時注入したとき、腫瘍による取込みは、ｐ．ｉ．１時間では、ブロッキングがない場合の取込みの約２５％まで著しく低下した（５．７７±０．０８％ＩＤ／ｇ、Ｐ＝０．０１７）。ｐ．ｉ．４時間では、腫瘍による取込みは１１．１±０．０５％ＩＤ／ｇに増加し、この取込みは、ｐ．ｉ．２４時間で、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤと同程度の値まで若干増加した（図７）。過剰量の非標識ＮＭＥＢ−ＲＧＤを用いた同時注入により、すべての時点で腫瘍による取込みを５５〜６５％ブロックした（図７および図９）。ＰＥＴ定量化の妥当性を更に確認するため、ｐ．ｉ．２４時間でのＰＥＴイメージングの直後に生体内分布試験を実施し、腫瘍における高い６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取込みを確認した（図１０）。
６４Ｃｕ−ＮＯＴＡｃ（ＲＧＤｆｋ）は、尿路を通じて血液から急速に排出され、腫瘍における低い蓄積を示した（ｐ．ｉ．１、４および２４時間で、１．２９±０．１７、１．１５±０．０７、１．０６±０．０３％ＩＤ／ｇ、図７および図９に対応）。非特異的トレーサーである６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＡＤは、すべての時点で、腫瘍での蓄積は低かった（約６％ＩＤ／ｇ）。血液における取込みは、すべての時点で、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤより有意に高かった（ｐ．ｉ．４時間で１０〜１２％ＩＤ／ｇ、およびｐ．ｉ．２４時間で３．７±０．３％ＩＤ／ｇ、図７および図９）。６４Ｃｕ−ＮＥＢは、すべての時点で、血液における最も高い蓄積を示した一方、腫瘍における取込みは、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＡＤより僅かに高かった（ｐ．ｉ．４時間まで６〜７％ＩＤ／ｇ、およびｐ．ｉ．２４時間で約８％ＩＤ／ｇ、図７および図９）。
Ｕ８７ＭＧ異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取込みを、異なるインテグリンおよび血管形成レベルを有するＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植モデルと比較した（図１１〜１２）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植モデルにおける６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取込みはいずれも、すべての時点でＵ８７ＭＧより有意に低かった（図１１〜１２）。血液および心臓への取込みは、３つのモデル全てで同じであった（図１３）。腫瘍による取込みが、主に特異的な受容体への結合に起因し、ＥＰＲ効果によるものではないことを確認するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨＴ２９異種移植モデルに、血液プールイメージングトレーサー（６４Ｃｕ−ＮＥＢ）を注入した。６４Ｃｕ−ＮＥＢ取り込みは、ＣＤ３１およびＣＤ６１染色と相関しており、Ｕ８７ＭＧ＞ＨＴ２９＞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の順であった（図１４）。
実施例２４：放射線治療
ＮＭＥＢ−ＲＧＤを、インテグリンαｖβ３標的化放射線治療に適用した。ＮＭＥＢを、放射線治療用同位体９０ＹをキレートすることができるＤＯＴＡを含むよう改変した（以下ＤＭＥＢと称する）。Ｕ８７ＭＧ腫瘍を有するマウス（初期腫瘍サイズ：１５０〜２００ｍｍ３）における、腫瘍増殖に対する放射線治療の有効性を以下の通り評価した：
群Ａ：生理食塩水を注入；群Ｂ：７．４ＭＢｑ（２００μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処置；群Ｃ：３．７ＭＢｑ（１００μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処置；群Ｄ：１．７５ＭＢｑ（５０μＣｉ）の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤで処置；群Ｅ：７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）で処置；および群Ｆ：１．７５ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）で処置（図１５〜１７）。
最初の注入日を０日目とする。処置から６日目で、群間の有意差は明らかであった（図１５）。９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ処置マウス（群Ｂ〜Ｄ）はいずれも、生理食塩水を注入した群Ａよりも腫瘍体積が有意に低かった（ｐ＜０．０１）（図１５）。さらに、処置から８日目より、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤおよび群Ｅ〜Ｆの３つの群のすべてで、腫瘍体積における有意差が観察された（図１５）。これらの差は時間とともに増大し、７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入したマウスの腫瘍は、８日目で体積の減少を示した（群Ｂ、図１５）。９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの更なる注入により腫瘍が除去されるか否かを試験するため、群Ｂ〜Ｄそれぞれに、７．４、３．７または１．７５ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｃ（ＲＧＤｆＫ）を、最初の処置から１４日目に再注入した。線量７．４ＭＢｑでの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの２回目の注入により、腫瘍体積が有意に縮小し（２０日目にＰ＝０．０１であり、２２日目には０．０００３まで縮小（図１５））、腫瘍は最初の処置から３０日目にはほとんど消失した。軽微な腫瘍縮小が群Ｃ（３．７ＭＢｑ線量）において検出され、２回目の注入後数日間持続したが、その後腫瘍体積が再度増加した（図１５）。腫瘍体積に対する効果は、群Ｄ（線量１．７５ＭＢｑ）では観察されなかった。放射線治療の全身毒性を、動物の体重をモニターすることにより評価した。群Ｂのみが、微量ではあるが（５％）２日目に統計学的に有意な体重減少を示し、４日目には体重が回復した（図１６）。他の全ての群の動物の体重は、処置後に増加し続けた（図１６）。同様のパターンが、２回目の注入後に観察された。放射線治療のエンドポイント（生存率の分析に使用）は、腫瘍体積が１６００ｍｍ３に達したとき、腫瘍が潰瘍となったとき、またはマウスが死亡したとき、とした。生存率の分析は、群Ａ、ＥおよびＦと比較して群Ｂ〜Ｄの有意差（ｐ＜０．０１）を示した。群Ｂは、最初の処置の後３０日目まで生存率が１００％であり、群Ｂ、ＣおよびＤは、生存率（％）は用量依存的であった（図１７）。
インテグリンαｖβ３に対する９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ放射線治療の特異性を試験するため、ヒトインテグリンの発現レベルは低いが、マウスインテグリンの発現レベルが中程度であるＨＴ２９で、７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの有効性を試験した（図６）。この腫瘍異種移植モデルの血管形成性は高いにもかかわらず、増殖はＵ８７ＭＧモデルよりもかなり遅い。ＨＴ２９腫瘍を有するマウスへの７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤの注入を、生理食塩水を注入した同じモデルと比較した（図１８Ａ）。処置群と対照群の腫瘍体積は、処置後８日目までは同様であり、その後、処置した腫瘍では、対照群と比較して遅い速度で増殖し始めた。その結果、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ標的化放射線治療は、Ｕ８７ＭＧで示された腫瘍収縮よりもむしろ、ＨＴ−２９腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍増殖の遅延をもたらした（図１６および１８Ａ）。ＨＴ−２９で処置したマウスの体重は、対照群と比較し大幅には変化しなかった（図１８Ｂ）。腫瘍が潰瘍化したため、ＨＴ−２９処置および未処置のマウスを注入後２６日目に屠殺した。
９０Ｙの注入後３日目における１８Ｆ−ＦＤＧのＰＥＴイメージングは、９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入した群でのみ、代謝の低下を示した（図１９）。しかしながら、処置後１０日目にこのスキャンを繰り返したところ、群Ｂについてのみ、有意な代謝の低下を示した（図２０）。１８Ｆ−ＦＬＴのＰＥＴイメージングを、最初の処置から５および１２日目に行った結果、群Ｂでは１８Ｆ−ＦＬＴの取込みが有意に低く、これらマウスの腫瘍における増殖が低いことを示唆した。この取込みは、５〜１２日目の間に低下した（図２０）。
実施例２５：９０Ｙ放射線治療後の腫瘍の生物学的解析
腫瘍血管系を評価するためＣＤ３１染色、腫瘍増殖を評価するためＫｉ−６７染色、およびＤＮＡ損傷を調べるためＴＵＮＥＬ染色を、全６群（Ａ〜Ｆ）に対して行った。大きい壊死面積を有する群Ａ、ＥおよびＦでは、染色は、腫瘍細胞が生存する腫瘍縁部に集中していた。図２１に示すとおり、群Ｂ（７．４ＭＢｑの９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤを注入）における腫瘍血管系は他の群よりも小さかった。１８Ｆ−ＦＬＴのＰＥＴイメージング結果と一致して、群Ａおよび群Ｃ〜Ｆでは比較的高い割合で、Ｋｉ−６７に関して細胞がポジティブに染色された一方、群Ｂでは細胞増殖の有意な低下が観察された（図２１）。他の５群と比較して、群Ｂは、ＴＵＮＥＬ染色により示されるように、かなり高い細胞アポプトーシスを示した（図２１）。ヘマトキシリン−エオジン染色は、群Ｂのほとんどの腫瘍領域が２回の９０Ｙ−ＤＭＥＢ−ＲＧＤ処置後にすでに壊死していたが、他の５群の腫瘍はほぼ全体的に生存していたことを示した（図２１）。
実施例２６：ヒト被験者における６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの評価
３人の健常なボランティアに、６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤを１４８〜２９６ＭＢｑ（４〜８ｍＣｉ）注射し、注射から１、８および２４時間後にＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った（図２２）。注射から１時間後で６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤ取込みが、血液プール、腎臓でみられ、膀胱を通じて分泌され、正常な臓器への望ましくない蓄積はなかった。Table 1に線量測定の算出結果を示す。８ｍＣｉを注入した被験者における、正常な臓器での低い蓄積、実効線量０．０３１５ｍＳｖ／ＭＢｑ（０．１１６６Ｒｅｍ／ｍＣｉ）、および被ばく量０．９３３Ｒｅｍは、１８Ｆ−ＦＤＧのＰＥＴスキャンと非常に類似している。
ＷＨＯステージＩＶの膠芽腫患者に対する６４Ｃｕ−ＮＭＥＢ−ＲＧＤの注入は、腫瘍での高い蓄積を示し、時間とともに増加してｐ．ｉ．１２時間で最大６．２５のＳＵＶに達し（図２３）、２４時間ではわずかな減少を示した（図２４およびTable 2）。腫瘍／非腫瘍の比率もまた、時間とともに増加し、最大７３．４に達した（図２４およびTable 2）。腫瘍生検では、インテグリンαｖβ３の中程度の発現が示された。
実施例２７：ヒト被験者における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの評価
担体分子としてアルブミンを用いて薬物の血液中半減期を延長するため、（ｉ）短縮型エバンスブルー（ＥＢ）色素分子、（ｉｉ）金属キレート、および（ｉｉｉ）マレイミドを「付加（add-on）」した分子を作製した（図２５）。「付加」分子は、フリーのチオール基を含む標的分子に容易にコンジュゲートでき、アルブミンへのＥＢの適度な結合により血液中の半減期を延長し、イメージングおよび放射線治療のための放射性同位体標識を可能にする。短縮型ＥＢ誘導体の合成は、図２６および過去の報告（J Nucl Med. 2017 Apr;58(4):590-597）に記載されている。オクトレオテート（ＴＡＴＥ）（ソマトスタチン受容体結合ペプチド）にコンジュゲートさせるためには、フェニルアラニン残基のαアミン上にフリーのチオール基を導入する必要があった。ＴＡＴＥ−ＳＨの合成を図２７Ａ〜Ｂに記載する。
短縮型ＥＢをＤＯＴＡキレーターとコンジュゲートさせた後、ＴＡＴＥ−ＳＨと結合させ、ＥＢ−ＴＡＴＥを得た（図２８）。比較のため、ＴＡＴＥをＥＢ部分のないＤＯＴＡとコンジュゲートさせ、ＴＡＴＥを得た（図２９）。ＴＡＴＥおよびＥＢ−ＴＡＴＥは、イメージングまたは放射線治療のため、それぞれＣｕ−６４、Ｙ−８６またはＹ−９０で放射性同位体標識し、マウス異種移植モデルにおいて比較した。
文献で確立されたモデルであり、ＳＳＴＲ２を高発現することが報告されている、ＡＲ４２Ｊラット膵臓神経内分泌腫瘍異種移植モデルにおいて、２つの化合物を最初に評価した（図３０および図３１）。ＥＢ−ＴＡＴＥおよびＴＡＴＥを、最初にＣｕ−６４で標識し、マウスに同一の放射線量を注入後（ｐ．ｉ．）、種々の時点でＰＥＴスキャンを行った。６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥは、いずれの時点でも腫瘍への取り込みが有意に高く、ｐ．ｉ．２４時間では高い腫瘍対バックグラウンド比を示した（図３０〜図３１、図３２Ａ〜Ｂおよび図３３Ａ〜Ｂ）。予想どおり、オクトレオテートへのＥＢ部分の付加により、膀胱からの排出は有意に低下した（図３４Ａ〜Ｃ）。次に、これらの２つのトレーサーを、ＳＳＴＲ２でトランスフェクションしたヒトＨＣＴ１１６直腸異種移植モデルで評価した。ＨＣＴ１１６細胞とＳＳＴＲ２−ＨＣＴ１１６でトランスフェクト細胞との間でＳＳＴＲ２発現の相違を調べるため、ＦＡＣＳ分析および免疫蛍光染色を行った（図３５Ａ〜Ｂおよび図３６〜図３７）。陽性および陰性のＨＣＴ１１６ ＳＳＴＲ２細胞における６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥと６４Ｃｕ−ＴＡＴＥの細胞取込み／内在化に関する試験も行った。６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取込みは、いずれの時点でも有意に高く、取込みの大部分は内在化に関連するものであった（図３８Ａ〜Ｄ）。さらに、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥの細胞取込みおよび内在化は、ＳＳＴＲ２に対する特異性を示唆する非標識ＥＢ−ＴＡＴＥの添加によりブロックできた（図３８Ａ〜Ｄ）。
ＥＢ−ＴＡＴＥの将来の潜在的用途は、Ｙ−９０を用いた放射線治療である。９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの様々な器官における分布および蓄積に関するより詳細な理解を可能にするために、ＥＢ−ＴＡＴＥを、ＰＥＴ同位体Ｙ−８６で標識した。さらに、Ｙ−８６はＤＯＴＡによって良好にキレート化される同位体であり、イメージング同位体としてＹ−８６を用いることにより、トランスキレーションまたはＥＢ−ＴＡＴＥと特に関連がない他の現象に起因する放射能の蓄積が減少する。
細胞／内在化試験を繰り返し、６４Ｃｕ−ＥＢ−ＴＡＴＥおよび６４Ｃｕ−ＴＡＴＥ誘導体について同等の結果が得られた（図３９Ａ〜Ｂおよび図４０Ａ〜Ｂ）。また、非標識ＥＢ−ＴＡＴＥおよびウシ血清アルブミンの結合動態試験を実施した。ＥＢ−ＴＡＴＥは、高いＫｏｎと低いＫｏｆｆを有し、エバンスブルー−アルブミンの親和性に類似したμＭ Ｋｄの親和性を有する（図４１）。
得られた放射性同位体標識されたコンジュゲートは、長期にわたる循環半減期を示し、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍における腫瘍内蓄積を増大させた（図４２〜図４３、図４４Ａ〜Ｄ、図４５Ａ〜Ｃ、図４６および図４７Ａ〜Ｂ）。腫瘍内取込みは、「付加」のないペプチドと比較して顕著に増加した（図４２〜図４３、図４４Ａ〜Ｄ、図４５Ａ〜Ｃ、図４６および図４７Ａ〜Ｂ）。ＡＲ４２Ｊ異種移植モデルにおける８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥを評価したところ、高いＳＳＴＲ２レベルを示し、非常に高い腫瘍内取込み値を示した（図４８〜図４９、図５０Ａ〜Ｂおよび図５１）。ＳＳＴＲ２陽性腫瘍において８６Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥをブロックする試みも成功した（図４９、図５０Ａ〜Ｂおよび図５１）。
腫瘍の凍結切片の免疫蛍光は受容体の発現を示した（図５２〜５３）。
９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥを用いたマウスにおける腫瘍放射線治療試験は非常にうまくいき（図５５〜図５７、図５８Ａ〜Ｆ、図５９〜図６１、図６２Ａ〜Ｄおよび図６３〜図６５）、１回または２回の９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥの投与により、受容体陽性の腫瘍が除去された（図５５〜図５７、図５８Ａ〜Ｆ、図５９〜図６１、図６２Ａ〜Ｄおよび図６３〜図６５）。図５８に示した放射線治療実験で、７．４ＭＢｑの３匹のマウス、および３．７ＭＢｑの１匹のマウスは、腫瘍の再増殖を僅かに示した。６８Ｇａ−ＴＡＴＥを用いたＰＥＴイメージングおよび免疫蛍光染色の結果、腫瘍の再増殖はＳＳＴＲ２とは無関係であることが確認された（図５９〜図６１）。９０Ｙ−ＥＢ−ＴＡＴＥ処置群では、生理食塩水および９０Ｙ−ＴＡＴＥ群と比較して低い増殖と高いアポプトーシスが観察された（Ｋｉ６７、ＴＵＮＥＬおよびＨ＆Ｅ染色、図６６〜図６７）。
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンドである小分子ＣＴＴ１２９８へのコンジュゲートによるＥＢ部分の実現性を評価した（図６８）。この分子は、Cancer Targeted Technology（CTT）（http://www.cancertargetedtechnology.com/management.html）から入手した。４種の細胞株およびＰＣ３−ＰＩＰ（トランスフェクション細胞、高いＰＳＭＡ発現を示す）におけるＰＳＭＡ発現を試験した。ＬＮＣａＰは中程度のＰＳＭＡ発現を示し、ＰＣ３およびＣＷ２２Ｒｖ１は低いＰＳＭＡ発現を示した（図６９）。細胞内取込み／内在化については、４種の細胞株のうちＰＣ３−ＰＩＰがすべての時点で最も高い取込みを示し、またそのほとんどが内在化されることが示された（図７０Ａ〜Ｄ）。ＰＥＴ試験はまた、ＰＣ３およびＣｗ２２ＲＶ１異種移植細胞株と比較して、ＰＣ３−ＰＩＰで高い腫瘍蓄積を示した（図７１、図７２Ａ〜Ｂおよび図７３〜図７４）。ＬＮＣａＰ異種移植細胞株も同様に評価する必要がある。
実施例２８：ＤＯＴＡ−ＥＢ−ＴＡＴＥの放射性同位体標識
１ｍＬのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液（ｐＨ＝５）中の５０ｍＣｉの177ＬｕＣｌ３に、１００μｇのＤＯＴＡ−ＥＢ−ＴＡＴＥを加え、９０℃にて２０分間反応させた。生成物をC18 Sep-Pakカートリッジで精製して、バッファー成分と放射性同位体で標識する間に形成したコロイド種（存在する場合）を除去した。Sep-Pakカラム（1mL、Millipore）をメタノールと水で前処理した。純粋な生成物177Ｌｕ-ＤＯＴＡ−ＥＢ−ＴＡＴＥを、エタノール０．５ｍLで溶出した。溶出は、真空の滅菌バイアルを用いて行った。８０℃に加熱することによりエタノールを除去し、生成物を、１ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬの滅菌アスコルビン酸溶液および４ｍＭのＤＴＰＡ溶液を含む滅菌生理食塩水中で製剤化した。
実施例２９：177Ｌｕ ＤＯＴＡ−ＥＢ−ＴＡＴＥの生物学的評価
図７６は、（Ａ）Ａ４２７−７（ＳＳＴＲ２＋）および（Ｂ）Ａ４２７−４（ＳＳＴＲ２−）細胞における抗ＳＳＴＲ２（赤）および核（ＤＡＰＩ、青）の代表的な免疫蛍光染色を示す。
図７７は、それぞれ、非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥまたはＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの添加または非添加で、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下での177Ｌｕ-ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥおよび177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥのＡ４２７−７における細胞内在化の結果を示す。
図７８は、ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの生体内分布の経時変化を示す。
図７９は、ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの生体内分布の経時変化を示す。
図８０は、ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの腫瘍対組織比の経時変化を示す。
図８１は、ＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの腫瘍対組織比の経時変化を示す。
図８２は、注射から７２時間後のＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥのＳＰＥＣＴ画像を示す（非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを添加せず（左）；過剰量の非標識ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを添加（右））。１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥをマウスに注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。
図８３は、注射後の異なる時点でのＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す。マウスに１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。
図８４は、注射後の異なる時点でのＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す。マウスに２ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＭＥＢ−ＴＡＴＥを注射した。白の矢印は腫瘍の位置を示す。
図８５は、注射から１および２４時間後のＳＳＴＲ２＋腫瘍（Ａ４２７−７）を有するマウスにおける177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥの代表的なＳＰＥＣＴ画像を示す（非標識ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを添加せず（左）、過剰量の非標識ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを添加（右））。１ｍＣｉの177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥをマウスに注射した。
図８６は、ＳＳＴＲ２異種移植モデルにおける177Ｌｕ放射性核種療法の結果を示し、Ｘ軸は腫瘍接種後の日数を表し、Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を表す。処置は７日目に、ＰＢＤ、177Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥまたは177Ｌｕ−ＥＢ−ＤＯＴＡ−ＴＡＴＥを異なる用量で１回静脈内注射した。
結論として、ＴＡＴＥペプチドおよびＣＴＴ１２９８小分子への、本発明の新規な「付加」分子のコンジュゲーションは、イメージングおよび放射線治療をこれらの薬剤で顕著に改善した。これらの結果は、本発明の「付加」により、血液中半減期および腫瘍内取込みが改善され、薬物をセラノスティックな物質に変換できることを示している。
本発明の概念を、例示的な原則および実施形態に関して記載したが、当業者であれば、請求項によって定義した本開示の範囲と趣旨から逸脱することなく、変更を加えること、また、記載された事項について置換される均等物を認識するであろう。

Claims (24)

  1. 式ＩＩＩで示される化合物、または薬学的に許容されるそのエステル、アミド、溶媒和物もしくは塩、またはそのようなエステルもしくはアミドの塩、またはそのようなエステル、アミドもしくは塩の溶媒和物
    （式中、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから独立に選択され、
    Ｒ１２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ハロアルキルであり、
    Ｒ１４は、ペプチドであり、
    Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−であって、ｍは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｌ３は、−（ＣＨ２）ｐ−であって、ｐは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｒ１３は、１１７Ｌｕを含んでなるキレート基である）。
  2. Ｌ１が、−ＮＨ（ＣＯ）−であり、Ｒ１およびＲ４がそれぞれメチルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２がそれぞれ水素である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ１４が治療用ペプチドである、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｒ１４が標的細胞または組織に対して結合できるペプチドである、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ１４が腫瘍に結合できる、請求項４に記載の化合物。
  6. Ｒ１４が、インターフェロンα、ＧＣＳＦ、オクトレオテート、ボンベシン、ＲＧＤ、α−ＭＳＨ、ＣＴＴ１２９８またはアプタマーから選択される、請求項４に記載の化合物。
  7. Ｒ１４が環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである、請求項６に記載の化合物。
  8. Ｒ１４が、
    である、請求項４に記載の化合物。
  9. Ｒ１４が、
    である、請求項４に記載の化合物。
  10. Ｒ１３が、
    、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項１に記載の化合物。
  11. 式ＩＩＩで示される化合物が、式ＩＶで示される化合物である、請求項１に記載の化合物
    （式中、
    Ｒ１４はペプチドであり、
    Ｌ２は、−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｌ４は、−（ＣＨ２）ｑ−であって、ｑは０〜１２の整数であり、各ＣＨ２は独立して−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＯ）−または−（ＣＯ）−ＮＨ−に置き換わっていてもよいが、但し、隣接する２つのＣＨ２基が置き換わることはなく、
    Ｒ１３は、１１７Ｌｕを含んでなるキレート基である）。
  12. Ｒ１４が標的細胞または組織に対して結合できるペプチドである、請求項１１に記載の化合物。
  13. Ｒ１４が腫瘍に結合できる、請求項１２に記載の化合物。
  14. Ｒ１４が、環状ペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓである、請求項１１に記載の化合物。
  15. Ｒ１４が、
    である、請求項１１に記載の化合物。
  16. Ｌ２が、−（ＣＨ２）４−ＮＨ（ＣＯ）−（ＣＨ２）２−であり、
    Ｌ４−Ｒ１４が、
    である、請求項１１に記載の化合物。
  17. Ｒ１４が更に放射性核種を含む、請求項１１に記載の化合物。
  18. 前記放射性核種が、１８Ｆ、７６Ｂｒ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉである、請求項１７に記載の化合物。
  19. Ｒ１４が、
    である、請求項１７に記載の化合物。
  20. Ｒ１３が、
    、クラウンエーテル、シクロデキストリンまたはポルフィリンから選択される、請求項１１に記載の化合物。
  21. 請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
  22. 薬学的に許容される担体が、結合剤、緩衝剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、香料、流動促進剤、滑沢剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、錠剤化剤、湿潤剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 哺乳動物における癌の治療または診断方法であって、該哺乳動物に、治療有効量の請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物を、場合により１以上のさらなる活性成分と組合せて投与することを含んでなる方法。
  24. １以上のさらなる活性成分が、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、カンプトセシン、テモゾロマイド、アバスチン、ハーセプチン、エルビタックス、およびそれらの組合せから選択される、請求項２３に記載の方法。
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