JP2021191771A - Mesenchymal stem cells and uses therefor - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、間葉幹細胞に関する。特に本発明は、種々の組織及び器官における血管形成の促進、自己免疫疾患の治療、アレルギー反応の治療、ガンの治療、炎症性疾患の治療、及び回復の促進を含む間葉幹細胞の新規用途に関する。 The present invention relates to mesenchymal stem cells. In particular, the present invention relates to novel uses of mesenchymal stem cells, including promoting angiogenesis in various tissues and organs, treating autoimmune diseases, treating allergic reactions, treating cancer, treating inflammatory diseases, and promoting recovery. ..
間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞を含む系統に容易に分化可能な多能性幹細胞である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ＭＳＣｓの、筋肉（非特許文献４）、ニューロン様前駆体（非特許文献５、非特許文献６）、心筋細胞（非特許文献７、非特許文献８）に、また場合によっては他の細胞種に分化する能力が、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により示されている。さらに、ＭＳＣｓは、造血幹細胞及び胚性幹細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）に有効な支持細胞層をもたらすと見られている（非特許文献９、非特許文献１０）。ＭＳＣｓが、損傷した骨、軟骨、半月板（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）あるいは心筋の組織の修復あるいは再生に有用であり得ることが、種々の動物モデルを用いた最近の研究で示されている（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。複数の研究者はＭＳＣｓを用い、骨形成不全症（非特許文献１６）、パーキンソン症候群（非特許文献１７）、脊髄損傷（非特許文献１８、非特許文献１９）、及び心疾患（非特許文献２０、非特許文献２１）を含む動物疾患モデルへの移植に有望な結果を示した。重要なことには、骨形成不全症への臨床試験（非特許文献２２、非特許文献２３）及び異種骨髄移植の促進移植（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）（非特許文献２４、非特許文献２５）においても有望な結果が報告されている。
Mesenchymal stem cells (MSCs) are pluripotent stem cells that can be easily differentiated into lineages including osteoblasts, muscle cells, chondrocytes and adipocytes (Non-Patent
ＭＳＣｓはその表面に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原を発現するが、ＭＨＣクラスＩＩは制限され（非特許文献２６、非特許文献２７）、またＢ７あるいはＣＤ４０共刺激分子は発現しないが（非特許文献２８）、これはこれらの細胞が低免疫原性表現型を持つことを示している（非特許文献２９）。ＭＳＣｓはまた、ＭＨＣ非依存性方法でＴ細胞増殖反応を抑制する（非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２）。これらのＭＳＣｓの免疫学的性質は、その移植を強化し、移植後に同種異系細胞を認識し拒絶する受容者の免疫システムの能力を制限することができる。ＭＳＣｓは、局所刺激下で適切な細胞系に分化するための能力とともに、免疫反応を調節し、造血をサポートする因子を生成するため、細胞移植研究にとって望ましい幹細胞である（非特許文献３３、非特許文献３４）。
MSCs express major histocompatibility complex (MHC) class I antigens on their surface, but MHC class II is restricted (Non-Patent Document 26, Non-Patent Document 27), and B7 or CD40 co-stimulatory molecules are not expressed. (Non-Patent Document 28), which indicates that these cells have a hypoimmunogenic phenotype (Non-Patent Document 29). MSCs also suppress T cell proliferation reactions in an MHC-independent manner (Non-Patent
出願人は現在、樹状細胞（ＤＣ１及びＤＣ２）、エフェクターＴ細胞（Ｔｈ１及びＴｈ２）、及びＮＫ細胞を含む単離された免疫細胞集団と間葉幹細胞との相互作用を調査した。出願人は前記相互作用に基づいて、間葉幹細胞が、免疫反応プロセスのいくつかの段階を規制し得る種々の因子の産生を調節し得ることを発見した。したがって、間葉幹細胞は、免疫システムが関与する疾病、状態及び障害の治療に、あるいは、炎症又はアレルギー反応を含む疾病、状態、障害の治療に用いられ得る。前記疾病、状態及び障害は、自己免疫疾患、アレルギー、関節炎、炎症を起した創傷、円形脱毛症（はげ頭症）、歯肉炎及び歯周炎（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）を含む歯周病、及び免疫反応が関与する他の疾病、状態あるいは障害を含むがこれらに限定されない。 Applicants have now investigated the interaction of mesenchymal stem cells with isolated immune cell populations, including dendritic cells (DC1 and DC2), effector T cells (Th1 and Th2), and NK cells. Based on the above interactions, Applicants have discovered that mesenchymal stem cells can regulate the production of various factors that can regulate several stages of the immune response process. Thus, mesenchymal stem cells can be used to treat diseases, conditions and disorders involving the immune system, or to treat diseases, conditions and disorders involving inflammation or allergic reactions. The diseases, conditions and disorders involve autoimmune diseases, allergies, arthritis, inflamed wounds, periodontal disease including circular alopecia (bald head disease), periodontitis and periodontitis, and immune responses. Other diseases, conditions or disorders that include, but are not limited to.
さらに、間葉幹細胞は、新たな血管の形成を促進することで血管形成を促進する血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦを産生するように抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を刺激すると考えられる。 In addition, mesenchymal stem cells are thought to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to produce vascular endothelial growth factor, VEGF, which promotes angiogenesis by promoting the formation of new blood vessels.
さらに、間葉幹細胞は、癌抑制及びウイルス感染に対する免疫力を高めるインターフェ
ロン−ベータ（ＩＮＦ−β）を産生するように樹状細胞（ＤＣｓ）を刺激すると考えられる。
In addition, mesenchymal stem cells are thought to stimulate dendritic cells (DCs) to produce interferon-beta (INF-β), which enhances cancer suppression and immunity to viral infections.
本発明の一態様にしたがって、動物の自己免疫疾患を治療する方法が提供される。この方法は、動物の自己免疫疾患を治療するのに有効な量で、間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 According to one aspect of the invention, a method of treating an animal autoimmune disorder is provided. This method comprises administering mesenchymal stem cells to an animal in an effective amount to treat an animal's autoimmune disorder.
本発明のこの態様の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が自己免疫疾患を抑制する最低一つのメカニズムは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）及び／又は樹状細胞（ＤＣ）からインターロイキン１０（ＩＬ−１０）を放出することによると考えられる。 The scope of this aspect of the invention should not be limited to any theoretical reasoning, but at least one mechanism by which mesenchymal stem cells suppress autoimmune disease is regulatory T cells (Treg cells) and / or. It is believed that this is due to the release of interleukin 10 (IL-10) from dendritic cells (DC).
本発明にしたがって治療され得る自己免疫疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺疾患、炎症性大腸炎、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、脱髄疾患、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性胃炎（ＡＩＧ）、及び自己免疫性糸球体疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明の範囲がここに開示された特定の自己免疫疾患の治療に限定されないことは、理解されるべきである。
Autoimmune diseases that can be treated according to the present invention include polysclerosis,
一実施例において、間葉幹細胞が投与される動物は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。 In one example, the animal to which the mesenchymal stem cells are administered is a mammal. Mammals can be primates, including humans and non-human primates.
通常、間葉幹細胞（ＭＳＣ）療法は、例えば以下の手順に基づく：ＭＳＣ含有組織の収集、ＭＳＣｓの単離及び増殖、及び生化学的操作あるいは遺伝子操作を伴った、あるいは伴わない、動物へのＭＳＣｓの投与。 Usually, mesenchymal stem cell (MSC) therapy is based on, for example, the following procedure: collection of MSC-containing tissue, isolation and proliferation of MSCs, and with or without biochemical or genetic manipulation to animals. Administration of MSCs.
投与される間葉幹細胞は、均一組成物か、あるいはＭＳＣｓに富んだ混合細胞集団であり得る。均一間葉幹細胞組成物は、接着性の骨髄細胞あるいは骨膜細胞を培養することで得られ得る。また間葉幹細胞組成物は、接着性の骨髄細胞あるいは骨膜細胞を培養することで得られ得る。また間葉幹細胞は、固有のモノクローナル抗体で同定される特異的細胞表面マーカーにより同定され得る。間葉幹細胞に富む細胞集団の獲得方法は、例えば、米国特許５４８６３５９号に開示されている。間葉幹細胞の代替資源は、血、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、骨、及び軟骨膜を含むがこれらに限定されない。 The mesenchymal stem cells administered can be a homogeneous composition or a mixed cell population rich in MSCs. The uniform mesenchymal stem cell composition can be obtained by culturing adherent bone marrow cells or periosteal cells. The mesenchymal stem cell composition can also be obtained by culturing adherent bone marrow cells or periosteal cells. Mesenchymal stem cells can also be identified by specific cell surface markers identified by unique monoclonal antibodies. A method for acquiring a cell population rich in mesenchymal stem cells is disclosed, for example, in US Pat. No. 5,486,359. Alternative resources for mesenchymal stem cells include, but are not limited to, blood, skin, cord blood, muscle, fat, bone, and perichondrium.
間葉幹細胞は、種々の方法で投与することができる。間葉幹細胞は、静脈内、動脈内、あるいは腹腔内投与等により、全身に投与することができる。 Mesenchymal stem cells can be administered in a variety of ways. The mesenchymal stem cells can be administered systemically by intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, or the like.
間葉幹細胞は、自己、同種異系、異種を含む多種多様な資源から得られ得る。 Mesenchymal stem cells can be obtained from a wide variety of resources, including autologous, allogeneic, and heterologous.
間葉幹細胞は、自己免疫疾患を投与するのに有効な量で動物に投与される。間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与され得る。投与される間葉幹細胞の量は、年齢、体重、患者の性別、治療される自己免疫疾患、及びその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered to animals in an amount effective to administer an autoimmune disorder. Mesenchymal stem cells can be administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. The amount of mesenchymal stem cells administered depends on a variety of factors, including age, body weight, patient gender, autoimmune disease to be treated, and its extent and severity.
間葉幹細胞は、薬学的許容担体と併せて投与され得る。例えば、間葉幹細胞は、注入用の薬学的許容液状媒体中の細胞懸濁液として投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, mesenchymal stem cells can be administered as a cell suspension in a pharmaceutically acceptable liquid medium for injection.
本発明の他の形態にしたがって、動物の炎症反応の治療法が提供される。この方法は、動物における炎症反応を治療するのに有効な量で、間葉幹細胞を動物に投与することを含
む。
According to other embodiments of the invention, treatments for the inflammatory response of animals are provided. The method comprises administering mesenchymal stem cells to the animal in an effective amount to treat the inflammatory response in the animal.
本発明のこの態様の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞がＴ細胞の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への成熟を促進し、それにより炎症反応を制御すると考えられる。また、間葉幹細胞がＴヘルパー１細胞（Ｔｈ１細胞）を抑制し、それにより、例えば乾癬に関連するもの等の特定の炎症反応におけるインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）の発現を減少させるとも考えられる。
The scope of this aspect of the invention should not be limited to any theoretical reasoning, but mesenchymal stem cells promote the maturation of T cells into regulatory T cells (Tregs), thereby controlling the inflammatory response. It is thought that. It is also believed that mesenchymal stem cells suppress
一実施例において、治療され得る炎症反応は、乾癬に関連するものである。 In one example, the inflammatory response that can be treated is that of psoriasis.
他の実施例において、間葉幹細胞は、間葉幹細胞が脳内の小膠細胞（ミクログリア）及び又は星状細胞に接触して炎症を緩和するように、動物に投与され得る。これにより、間葉幹細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞あるいは脳細胞損傷等の疾病あるいは障害において、活性化膠細胞（活性化グリア細胞）により引き起こされる神経変性を抑制する。 In other examples, mesenchymal stem cells can be administered to animals such that the mesenchymal stem cells come into contact with microglia (microglia) and / or stellate cells in the brain to relieve inflammation. Thereby, the mesenchymal stem cells suppress the neurodegeneration caused by activated glial cells (activated glial cells) in diseases or disorders such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebral infarction or brain cell damage.
また、他の実施例において、間葉幹細胞は、間葉幹細胞が皮膚の表皮中のケラチン生成細胞及びランゲルハンス細胞に接触して乾癬、慢性皮膚炎及び接触性皮膚炎に起こり得る炎症を緩和するように、動物に投与され得る。この実施例は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が表皮のケラチン生成細胞及びランゲルハンス細胞に接触し、Ｔ細胞レセプター及びサイトカイン分泌プロファイルを変更して、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現が減少し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）集団が増加すると考えられる。 Also, in other embodiments, the mesenchymal stem cells are such that the mesenchymal stem cells come into contact with keratin-producing cells and Langerhans cells in the epidermis of the skin to alleviate the inflammation that can occur in psoriasis, chronic dermatitis and contact dermatitis. Can be administered to animals. This example should not be limited to any theoretical reasoning, but the mesenchymal stem cells contact the epidermal keratin-producing cells and Langerhans cells, altering the T-cell receptor and cytokine secretion profile, resulting in tumor necrosis. It is believed that the expression of alpha (TNF-α) is reduced and the regulatory T cell (Treg cell) population is increased.
さらなる実施例において、間葉幹細胞は、変形性関節炎、関節リウマチ及びウェブサイトｗｗｗ．ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓに掲載されている他の関節疾患を含むがこれらに限定されない関節炎及び関節炎様状態において起こる、骨中の炎症を緩和させるために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されると意図されないが、間葉幹細胞が関節液中の記憶Ｔ細胞によるインターロイキン−１７分泌を抑制し得ると考えられる。 In a further example, mesenchymal stem cells are used for osteoarthritis, rheumatoid arthritis and website www. arthritis. It can be used to relieve inflammation in bone that occurs in arthritis and arthritis-like conditions, including but not limited to other joint diseases listed in org / joints / diseases. Although the scope of this example is not intended to be limited to any theoretical reasoning, it is believed that mesenchymal stem cells may suppress interleukin-17 secretion by memory T cells in joint fluid.
他の実施例において、間葉幹細胞は、炎症性大腸炎及び慢性肝炎において、それぞれ消化管及び肝臓における炎症を緩和するために用いられ得る。本発明のこの態様の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるとは意図されないが、間葉幹細胞がインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の分泌の増加と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の発生を促進すると考えられる。 In other examples, mesenchymal stem cells can be used to relieve inflammation in the gastrointestinal tract and liver, respectively, in inflammatory colitis and chronic hepatitis. The scope of this aspect of the invention is not intended to be limited to any theoretical reasoning, but mesenchymal stem cells increase the secretion of interleukin-10 (IL-10) and regulatory T cells (Treg cells). It is thought to promote the occurrence of.
他の実施例において、間葉幹細胞は、敗血症及び、火傷、外科処置、移植を含む外傷（ｔｒａｕｍａ）等の病態における、過度の好中球活性化及びマクロファージ活性化を抑制するために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞がＩＬ−１０等の抑制性サイトカインの分泌を促進し、またマクロファージ遊走阻止因子を抑制すると考えられる。 In other examples, mesenchymal stem cells can be used to suppress excessive neutrophil activation and macrophage activation in conditions such as sepsis and pathological conditions such as burns, surgical procedures, trauma including transplantation (trauma). .. The scope of this example should not be limited to any theoretical reasoning, but it is believed that mesenchymal stem cells promote the secretion of inhibitory cytokines such as IL-10 and also suppress macrophage migration inhibitory factors.
他の実施例において、間葉幹細胞は、角膜、水晶体、色素上皮、網膜を含む目、脳、脊髄、妊娠子宮、及び胎盤、卵巣、精巣、副腎皮質、肝臓、及び毛包（ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）等の免疫学的特権部位における炎症を抑えるために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞がＩＬ−１０等の抑制性サイトカインの分泌及びＴｒｅｇ細胞の発生を促進すると考えられる。 In other examples, mesenchymal stem cells include the cornea, lens, pigment epithelium, eyes including the retina, brain, spinal cord, pregnant uterus, and placenta, ovaries, testis, adrenal cortex, liver, and hair follicles, etc. It can be used to suppress inflammation in the immunologically privileged site of the retina. The scope of this example should not be limited to any theoretical reasoning, but it is believed that mesenchymal stem cells promote the secretion of inhibitory cytokines such as IL-10 and the development of Treg cells.
また他の実施例において、間葉幹細胞は、透析及び又は糸球体腎炎の間の末期腎不全（
ＥＳＲＤ）感染を調節するために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が、糸球体構造形成を促進する血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦを発現するように抹消血単核細胞を誘導すると考えられる。
In other examples, mesenchymal stem cells are found in end-stage renal disease during dialysis and / or glomerulonephritis.
ESRD) Can be used to control infection. The scope of this example should not be limited to any theoretical reasoning, but mesenchymal stem cells are peripheral blood mononuclear cells to express vascular endothelial growth factor, VEGF, which promotes glomerular structure formation. Is thought to induce.
さらなる実施例において、間葉幹細胞は、インフルエンザ、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス感染、及びエプスタイン・バーウイルス等のウイルス感染を抑えるために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞がインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）の分泌を促進すると考えられる。 In a further example, mesenchymal stem cells can be used to control viral infections such as influenza, hepatitis C, herpes simplex virus, vaccinia virus infection, and Epstein-Bur virus. The scope of this example should not be limited to any theoretical reasoning, but it is believed that mesenchymal stem cells promote the secretion of interferon-beta (IFN-β).
また他の実施例において、間葉幹細胞は、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）感染及びヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）感染等の寄生虫感染を抑えるために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞がＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞による反応を調節し、それによりβ細胞による免疫グロブリンＥの産生の増加を促進すると考えられる。 In other examples, mesenchymal stem cells can be used to control parasite infections such as Leishmania and Helicobacter infections. The scope of this example should not be limited to any theoretical reasoning, but mesenchymal stem cells regulate the response by T helper 2 (Th2) cells, thereby increasing the production of immunoglobulin E by β cells. Is thought to promote.
しかしながら、本発明のこの態様の範囲が、如何なる特定の炎症反応の治療にも限定されるべきではないことは理解されるべきである。 However, it should be understood that the scope of this aspect of the invention should not be limited to the treatment of any particular inflammatory response.
間葉幹細胞は、前述のとおり、ヒト及び非ヒト霊長類を含む動物に投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered to animals, including humans and non-human primates, as described above.
また間葉幹細胞は、前述のとおり、全身に投与され得る。あるいは、変形性関節症又は関節リウマチの場合には、間葉幹細胞は関節炎部位に直接投与され得る。 Mesenchymal stem cells can also be administered systemically, as described above. Alternatively, in the case of osteoarthritis or rheumatoid arthritis, mesenchymal stem cells can be administered directly to the site of arthritis.
間葉幹細胞は、動物における炎症反応を治療するのに有効な量で投与される。間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与され得る。投与されるべき間葉幹細胞の正確な投与量は、年齢、体重、患者の性別、治療される炎症反応、及びその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered in an effective amount to treat the inflammatory response in animals. Mesenchymal stem cells can be administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. The exact dose of mesenchymal stem cells to be administered depends on a variety of factors, including age, body weight, patient gender, inflammatory response to be treated, and their extent and severity.
間葉幹細胞は、前述のとおり、薬学的許容担体と併せて投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
本発明のまた別の態様にしたがって、動物の癌の治療法が提供される。前記方法は、動物の癌を治療するのに有効な量の間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 According to yet another aspect of the present invention, a method for treating cancer in animals is provided. The method comprises administering to the animal an effective amount of mesenchymal stem cells to treat cancer in the animal.
本発明のこの態様の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が樹状細胞と相互作用し、ＩＦＮ−β分泌をもたらし、腫瘍抑制因子として働くと考えられる。治療され得る癌は、肝細胞癌、子宮頸癌、膵臓癌、前立腺癌、線維肉腫、髄芽腫、及び星状細胞腫を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明の範囲が如何なる特定の癌にも限定されるべきではないことは理解されるべきである。 The scope of this aspect of the invention should not be limited to any theoretical reasoning, but it is believed that mesenchymal stem cells interact with dendritic cells, resulting in IFN-β secretion and acting as a tumor suppressor. .. Cancers that can be treated include, but are not limited to, hepatocellular carcinoma, cervical cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, fibrosarcoma, medulloblastoma, and astrocytoma. However, it should be understood that the scope of the invention should not be limited to any particular cancer.
動物は、前述のとおり、ヒト及び非ヒト霊長類を含む哺乳類であり得る。 Animals can be mammals, including humans and non-human primates, as described above.
間葉幹細胞は、動物における癌を治療するのに有効な量で動物に投与される。通常、間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与される。投与されるべき間葉幹細胞の正確な量は、年齢、体重、患者の性別、治療される癌のタイプ、及びその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered to animals in effective amounts to treat cancer in the animals. Usually, mesenchymal stem cells are administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. To. The exact amount of mesenchymal stem cells to be administered depends on a variety of factors, including age, weight, gender of the patient, type of cancer being treated, and its extent and severity.
間葉幹細胞は、前述のとおり、薬学的許容担体と併せて投与され、また全身に投与され
得る。あるいは、間葉幹細胞は治療される癌に直接投与され得る。
Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier and can be administered systemically, as described above. Alternatively, mesenchymal stem cells can be administered directly to the cancer being treated.
本発明のさらなる別の態様にしたがって、動物のアレルギー性疾患の治療法が提供される。この方法は、動物のアレルギー性疾患を治療するのに有効な量で間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 According to yet another aspect of the present invention, a method for treating allergic diseases in animals is provided. The method comprises administering to the animal mesenchymal stem cells in an amount effective to treat an allergic disease in the animal.
本発明のこの態様の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が、急性アレルギー反応の後に投与された場合、肥満細胞の活性化及び脱顆粒の抑制をもたらすと考えられる。また、間葉幹細胞は、好塩基球活性化を下方制御し、またＴＮＦ−α等のサイトカイン、インターロイキン−８及び単球走化性タンパク質、あるいはＭＣＰ−１等のケモカイン、ロイコトリエン等の脂質メディエータを抑制し、またヒスタミン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、カテプシン等の主要メディエータを抑制すると考えられる。 The scope of this aspect of the invention should not be limited to any theoretical reasoning, but when mesenchymal stem cells are administered after an acute allergic reaction, they result in activation of mast cells and suppression of degranulation. it is conceivable that. In addition, mesenchymal stem cells down-regulate basophil activation and are cytokines such as TNF-α, interleukin-8 and monocyte chemotactic proteins, or chemokines such as MCP-1 and lipid mediators such as leukotrienes. It is also considered to suppress major mediators such as histamine, heparin, chondroitin sulfate, and catepsin.
治療され得るアレルギー性疾患は、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、及び接触性皮膚炎を含むがこれらに限定されない。しかしながら、本発明の範囲が如何なる特定のアレルギー疾患にも限定されるべきでないことは、理解されるべきである。 Allergic diseases that can be treated include, but are not limited to, asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, and contact dermatitis. However, it should be understood that the scope of the invention should not be limited to any particular allergic disease.
間葉幹細胞は、動物のアレルギー疾患を治療するのに有効な量で動物に投与される。動物は哺乳類であり得る。哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。通常、間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与される。正確な投与量は、年齢、体重、患者の性別、治療されるアレルギー疾患、及びその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered to animals in effective amounts to treat allergic diseases in animals. Animals can be mammals. Mammals can be primates, including humans and non-human primates. Usually, mesenchymal stem cells are administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. To. The exact dose depends on a variety of factors, including age, weight, gender of the patient, allergic disease to be treated, and its extent and severity.
間葉幹細胞は、前述のとおり、薬学的許容担体と併せて投与され得る。間葉幹細胞は、例えば静脈内投与あるいは動脈内投与等により、全身に投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. Mesenchymal stem cells can be systemically administered, for example, by intravenous administration, intraarterial administration, or the like.
本発明のさらなる態様にしたがって、動物における創傷治癒を促進する方法が提供される。この方法は、動物における創傷治癒を促進するのに有効な量の間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 According to a further aspect of the invention, there is provided a method of promoting wound healing in an animal. The method comprises administering to the animal an effective amount of mesenchymal stem cells to promote wound healing in the animal.
本発明の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、前述のとおり、間葉幹細胞がＴｒｅｇ細胞及び樹状細胞にインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を放出させると考えられる。ＩＬ−１０は、創傷における炎症を抑制あるいは調節し、それにより創傷の治癒を促進する。 The scope of the present invention should not be limited to any theoretical reasoning, but as mentioned above, it is believed that mesenchymal stem cells release interleukin-10 (IL-10) into Treg cells and dendritic cells. .. IL-10 suppresses or regulates inflammation in wounds, thereby promoting wound healing.
さらに、間葉幹細胞は、他の細胞タイプにより分泌因子を誘導することで、創傷治癒及び骨折治癒を促進し得る。例えば、間葉幹細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）による血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）媒介性放出、及び成長ホルモン、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）、及びエンドセリン−１のＰＧＥ２−媒介性放出を誘導し得る。 In addition, mesenchymal stem cells can promote wound healing and fracture healing by inducing secretory components by other cell types. For example, mesenchymal stem cells include prostaglandin E2 (PGE2) -mediated release of vascular endothelial growth factors (VEGF) by peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and growth hormone, insulin, insulin-like growth factor 1 (IGF-1). ), Insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP-3), and PGE2-mediated release of endoserin-1.
間葉幹細胞は、動物の創傷治癒を促進するのに有効な量で動物に投与される。動物は哺乳類であり得る。また哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。通常、間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与される。投与されるべき間葉幹細胞の正確な量は、年齢、体重、患者の性別、及び治療される創傷の範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered to an animal in an amount effective to promote wound healing in the animal. Animals can be mammals. Mammals can also be primates, including humans and non-human primates. Usually, mesenchymal stem cells are administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. To. The exact amount of mesenchymal stem cells to be administered depends on a variety of factors, including age, body weight, patient gender, and the extent and severity of the wound being treated.
間葉幹細胞は、前述のとおり、薬学的許容担体と併せて投与され得る。間葉幹細胞は、前述のとおり、全身に投与され得る。あるいは、間葉幹細胞は、例えば間葉幹細胞を包含する包袋あるいは貯蔵容器の流体のように、直接創傷に投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. Mesenchymal stem cells can be administered systemically, as described above. Alternatively, the mesenchymal stem cells can be administered directly to the wound, for example as a fluid in a bag or storage container containing the mesenchymal stem cells.
本発明のまた別の態様にしたがって、動物の線維症を治療あるいは予防する方法が提供される。この方法は、動物の線維症を治療あるいは予防するのに有効な量の間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 According to yet another aspect of the present invention, a method for treating or preventing fibrosis in an animal is provided. The method comprises administering to the animal an effective amount of mesenchymal stem cells to treat or prevent fibrosis in the animal.
間葉幹細胞は、肝硬変、末期腎不全に関連する腎臓の線維症、及び肺の線維症を含むがこれらに限定されない任意のタイプの動物の線維症を治療あるいは予防するために、動物に投与され得る。本発明の範囲が如何なる特定のタイプの線維症にも限定されるべきでないことは理解されるべきである。 Mesenchymal stem cells are administered to animals to treat or prevent fibrosis in any type of animal, including but not limited to liver cirrhosis, renal fibrosis associated with end-stage renal disease, and pulmonary fibrosis. obtain. It should be understood that the scope of the invention should not be limited to any particular type of fibrosis.
間葉幹細胞は、動物の線維症を治療あるいは予防するのに有効な量で動物に投与される。動物は哺乳類であり得る。また哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。通常、間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与される。投与されるべき間葉幹細胞の正確な量は、年齢、体重、患者の性別、及び治療あるいは予防される線維症の範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered to an animal in an effective amount to treat or prevent fibrosis in the animal. Animals can be mammals. Mammals can also be primates, including humans and non-human primates. Usually, mesenchymal stem cells are administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. To. The exact amount of mesenchymal stem cells to be administered depends on a variety of factors, including age, body weight, patient gender, and the extent and severity of fibrosis to be treated or prevented.
間葉幹細胞は、前述のとおり、薬学的許容担体と併せて投与され得る。間葉幹細胞は、前述のとおり、全身に投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. Mesenchymal stem cells can be administered systemically, as described above.
本発明の他の目的は、動物の組織あるいは器官における血管形成を促進することである。ここで前記組織あるいは器官は、血管形成を必要としているものである。 Another object of the present invention is to promote angiogenesis in animal tissues or organs. Here, the tissue or organ requires angioplasty.
したがって、本発明のさらなる態様にしたがって、動物の器官あるいは組織における血管形成を促進する方法が提供される。この方法は、動物の器官あるいは組織における血管形成を促進するのに有効な量の間葉幹細胞を動物に投与することを含む。 Therefore, according to a further aspect of the invention, there is provided a method of promoting angiogenesis in an animal organ or tissue. The method comprises administering to the animal an effective amount of mesenchymal stem cells to promote angiogenesis in the animal's organs or tissues.
血管形成は、既存の微小血管床からの新規血管の形成である。 Angioplasty is the formation of new blood vessels from an existing microvascular bed.
血管形成の誘導は、冠状動脈機能不全及び末梢動脈機能不全の治療に用いられ得る。したがって、冠状動脈疾患、虚血性心疾患、及び末梢動脈疾患の治療への非侵襲性の治癒的方法となり得る。血管形成は、心臓以外の組織及び器官における疾病及び障害の治療に、また心臓以外の器官の発達及び又は維持に関与し得る。血管形成は、内部及び外部の創傷、及び皮膚潰瘍の治療に関与し得る。また血管形成は、肺着床、及び胎盤成長、及び胎児血管系の発達に関与する。また血管形成は、軟骨吸収と骨形成の結びつけに極めて重要であり、また的確な成長板形態形成に極めて重要である。 Induction of angioplasty can be used to treat coronary and peripheral arterial dysfunction. Therefore, it can be a non-invasive curative method for the treatment of coronary artery disease, ischemic heart disease, and peripheral arterial disease. Angiogenesis can be involved in the treatment of diseases and disorders in tissues and organs other than the heart, and in the development and / or maintenance of organs other than the heart. Angioplasty can be involved in the treatment of internal and external wounds and skin ulcers. Angioplasty is also involved in lung implantation and placental growth, and development of the fetal vasculature. In addition, angioplasty is extremely important for the link between cartilage resorption and bone formation, and is also extremely important for accurate growth plate morphogenesis.
さらに、血管形成は、肝臓等の高代謝器官の十分な形成及び維持に必要であり、ここで密集した血管網が、十分な栄養と気体の輸送を提供するために必要である。 In addition, angioplasty is required for the sufficient formation and maintenance of highly metabolic organs such as the liver, where a dense vascular network is required to provide adequate nutrient and gas transport.
間葉幹細胞は、様々な方法で血管形成を必要とする組織あるいは器官に投与することができる。間葉幹細胞は、静脈内、動脈内あるいは腹腔内投与等により、全身に投与され得る。あるいは間葉幹細胞は、例えば血管形成を必要とする組織あるいは器官に直接注入することにより、血管形成を必要とする組織あるいは器官に直接投与され得る。 Mesenchymal stem cells can be administered to tissues or organs that require angiogenesis in a variety of ways. Mesenchymal stem cells can be administered systemically by intravenous, intraarterial or intraperitoneal administration. Alternatively, mesenchymal stem cells can be administered directly to a tissue or organ that requires angiogenesis, for example by direct injection into a tissue or organ that requires angiogenesis.
間葉幹細胞は、自己、同種異系、異種を含む多種多様な資源から得られ得る。 Mesenchymal stem cells can be obtained from a wide variety of resources, including autologous, allogeneic, and heterologous.
本発明の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が、動物に投与された場合、新規血管の形成を促進する血管内皮増殖因子、すなわちＶＥＧＦを産生するように末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を刺激すると考えられる。 The scope of the invention should not be limited to any theoretical reasoning, but such that mesenchymal stem cells, when administered to animals, produce vascular endothelial growth factor, VEGF, which promotes the formation of new blood vessels. It is thought to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
一実施例において、動物は哺乳類である。哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類であり得る。 In one embodiment, the animal is a mammal. Mammals can be primates, including humans and non-human primates.
本発明にしたがって、間葉幹細胞は、血管形成を通して軽減、治療、あるいは予防することができる任意の疾病あるいは障害の治療、軽減あるいは予防に用いられ得る。したがって、例えば間葉幹細胞は、四肢、すなわち腕、脚部、手、足、及び頸部あるいは種々の器官におけるものを含む動脈閉塞を治療するために、動物に投与され得る。例えば間葉幹細胞は、脳に分布する動脈の動脈閉塞を治療し、それにより脳梗塞を治療あるいは予防するために用いられ得る。また、間葉幹細胞は、胎児期及び出生後の角膜の血管の治療に用いられ得る。また糸球体構造形成をもたらすために用いられ得る。他の実施例において、間葉幹細胞は、内部及び外部双方の創傷の治療に、また糖尿病及び鎌状赤血球貧血等の疾病により引き起こされる皮膚潰瘍を含むがこれらに限定されない、足、手、脚部あるいは腕に見られる皮膚潰瘍の治療に用いられ得る。 According to the present invention, mesenchymal stem cells can be used to treat, alleviate or prevent any disease or disorder that can be alleviated, treated or prevented through angiogenesis. Thus, for example, mesenchymal stem cells can be administered to animals to treat arterial occlusions, including those in the limbs, namely the arms, legs, hands, feet, and neck or various organs. For example, mesenchymal stem cells can be used to treat arterial occlusion of arteries distributed in the brain, thereby treating or preventing cerebral infarction. Mesenchymal stem cells can also be used to treat blood vessels in the cornea during fetal and postnatal periods. It can also be used to bring about glomerular structure formation. In other examples, mesenchymal stem cells include, but are not limited to, skin ulcers caused by diseases such as diabetes and sickle redemia for the treatment of both internal and external wounds, including, but not limited to, feet, hands, legs. Alternatively, it can be used to treat skin ulcers found on the arms.
さらに、血管形成は胚着床及び胎盤形成に関与するため、間葉幹細胞は、胚着床を促進するために、また流産を予防するために用いられ得る。 In addition, since angiogenesis is involved in embryoimplantation and placental formation, mesenchymal stem cells can be used to promote embryoimplantation and to prevent miscarriage.
さらに、間葉幹細胞は、生まれる前の動物における血管系の発達を促進するために、ヒトを含む生まれる前の動物に投与され得る。 In addition, mesenchymal stem cells can be administered to prenatal animals, including humans, to promote the development of the vascular system in prenatal animals.
他の実施例において、間葉幹細胞は、軟骨吸収及び骨形成を促進するために、また的確な成長板形態形成を促進するために、生後あるいは生前の動物に投与され得る。 In other examples, mesenchymal stem cells can be administered to postnatal or prenatal animals to promote cartilage resorption and bone formation, and to promote proper growth plate morphogenesis.
間葉幹細胞は、動物の血管形成を促進するのに有効な量で投与される。間葉幹細胞は、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ、好ましくは約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で、投与され得る。投与されるべき間葉幹細胞の量は、年齢、体重、患者の性別、治療、軽減、あるいは予防される疾病あるいは障害、及びその範囲と重症度を含む、種々の因子に依存する。 Mesenchymal stem cells are administered in an amount effective to promote angiogenesis in animals. Mesenchymal stem cells can be administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg, preferably from about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg. The amount of mesenchymal stem cells to be administered depends on a variety of factors, including age, body weight, patient gender, treatment, alleviation, or preventable disease or disorder, and its extent and severity.
間葉幹細胞は、薬学的許容担体と併せて投与され得る。例えば、間葉幹細胞は、注入用の薬学的許容液状媒体中の細胞懸濁液として投与され得る。注入は、局所的、すなわち血管形成を必要とする組織あるいは器官に直接であっても、あるいは全身的であってもよい。 Mesenchymal stem cells can be administered in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, mesenchymal stem cells can be administered as a cell suspension in a pharmaceutically acceptable liquid medium for injection. The infusion may be local, i.e. directly to a tissue or organ requiring angioplasty, or systemic.
間葉幹細胞は、治療因子をエンコードする一つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドで遺伝子組み換えされ得る。ポリヌクレオチドは、適切な発現媒体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｈｉｃｌｅｓ）によって間葉幹細胞に送達され得る。間葉幹細胞を遺伝子組み換えするために用いられ得る発現媒体は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。
Mesenchymal stem cells can be genetically modified with one or more polynucleotides that encode therapeutic factors. The polynucleotide is the appropriate expression medium.
It can be delivered to mesenchymal stem cells by vehicles). Expression media that can be used for gene recombination of mesenchymal stem cells include, but are not limited to, retroviral vectors, adenoviral vectors and adeno-associated virus vectors.
治療因子をエンコードする適切なポリヌクレオチドの選択は、治療される疾病あるいは障害、及びその範囲と重傷度を含む、種々の因子に依存する。治療因子をエンコードするポリヌクレオチド、及び適切な発現媒体は、米国特許６３５５２３９号にさらに開示されている。 The choice of the appropriate polynucleotide to encode a therapeutic factor depends on a variety of factors, including the disease or disorder being treated, and its extent and severity. Polynucleotides that encode therapeutic factors, and suitable expression media, are further disclosed in US Pat. No. 6,355,239.
間葉幹細胞が、上述の治療に用いられた場合、増殖因子、サイトカイン、抗炎症剤等の薬剤、及び樹状細胞等の間葉幹細胞以外の細胞を含むがこれらに限定されない、この分野における通常の知識を有する者に知られた他の治療因子と併せて用いられ得ること、及び、必要に応じて、ヒアルロン酸等の細胞用可溶性担体とともに、あるいはコラーゲン、ゼラチン、あるいは他の生体適合性ポリマー等の固形物と併せて投与され得ることは理解されるべきである。 When mesenchymal stem cells are used in the above-mentioned therapies, they include, but are not limited to, growth factors, cytokines, agents such as anti-inflammatory agents, and cells other than mesenchymal stem cells such as dendritic cells. Can be used in conjunction with other therapeutic factors known to those with knowledge of, and optionally with cellular soluble carriers such as hyaluronic acid, or collagen, gelatin, or other biocompatible polymers. It should be understood that it can be administered in combination with solids such as.
ここに開示された方法が、多数の方法で、またこの分野においてよく知られた種々の変更及び置換を伴って実施され得ることは理解されるべきである。また、細胞タイプ間の作用機構あるいは相互作用について説明する任意の理論が本発明を任意の方法に制限すると解釈されるべきではなく、本発明の方法をより十分に理解することができるように提示されていると認識され得る。 It should be understood that the methods disclosed herein can be carried out in a number of ways and with various modifications and substitutions well known in the art. Also, any theory that describes the mechanism of action or interaction between cell types should not be construed as limiting the invention to any method, and is presented so that the methods of the invention can be better understood. Can be perceived as being done.
本発明は、図面に関して開示される。ここで、
図１ ＭＳＣｓの樹状細胞作用の調節
（Ａ）ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１１ｃに対する抗体を用いた成熟単球ＤＣ１細胞のフローサイトメトリー分析、及びＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ１２３（ＩＬ−３レセプター）に対する抗体を用いた形質細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣ２細胞のフローサイトメトリー分析。（−−−（破線））：アイソタイプ コントロール；（＿＿＿（実線））：ＦＩＴＣ／ＰＥ結合抗体。（Ｂ）ＭＳＣｓは、それぞれ活性化したＤＣ１及びＤＣ２からのＴＮＦ−α分泌を抑制し（第一ｙ軸）、ＩＬ−１０分泌を増加させる（第二ｙ軸）。（Ｃ）成熟ＤＣ１細胞とともに培養したＭＳＣｓは、ＭＳＣあるいはＤＣ単独の場合と比較して、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（第一ｙ軸）を抑制し、またＩＬ−４レベルを増加させる（第二ｙ軸）。ＭＳＣｓの存在下での炎症誘発性ＩＦＮ−γの産生の減少、及び抗炎症性ＩＬ−４の産生の増加は、抗炎症性表現型に関してのＴ細胞集団の変動を示唆した。
The present invention is disclosed with respect to the drawings. here,
FIG. 1 Regulation of dendritic cell action of MSCs (A) Flow cytometric analysis of mature monocytic DC1 cells using antibodies against HLA-DR and CD11c, and antibodies against HLA-DR and CD123 (IL-3 receptor) were used. Flow cytometric analysis of plasmacytoid DC2 cells. (--- (Dashed line)): Isotype control; (____ (solid line)): FITC / PE-binding antibody. (B) MSCs suppress TNF-α secretion from activated DC1 and DC2, respectively (first y-axis) and increase IL-10 secretion (second y-axis). (C) MSCs cultured with mature DC1 cells suppress IFN-γ secretion (first y-axis) by T cells and increase IL-4 levels as compared to MSC or DC alone (No. 1). Two y-axis). Decreased production of pro-inflammatory IFN-γ and increased production of anti-inflammatory IL-4 in the presence of MSCs suggested changes in the T cell population with respect to anti-inflammatory phenotype.
図２ ＭＳＣｓの炎症誘発性エフェクターＴ細胞作用の抑制
（Ａ）ＦＩＴＣ結合ＣＤ４抗体（ｘ軸）及びＰＥ結合ＣＤ２５抗体（ｙ軸）を用いた、ＰＢＭＣｓあるいは、ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養（ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ）における非接着性画分の染色によるＴＲｅｇ細胞数（％）のフローサイトメトリー分析。ゲートは、バックグラウンドとしてのアイソタイプ コントロール抗体に基づいて設定された。グラフは、５つの独立した実験の代表である。（Ｂ）細胞培養上清中で、ＭＳＣｓの存在下で発生したＴＨ１細胞は減少したレベルのＩＦＮ−γを分泌し（第一ｙ軸）、またＭＳＣｓの存在下で発生したＴＨ２細胞は増加した量のＩＬ−４を分泌した（第二ｙ軸）。（Ｃ）ＭＳＣｓは、２４ウェルプレート中で０、２４、あるいは４８時間培養された精製ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を抑制する。示されたデータは、一つの実験における平均値±ＳＤサイトカイン分泌であり、また３つの独立した実験の代表である。
FIG. 2 Suppression of inflammation-inducing effector T cell action of MSCs (A) Non-adhesive image in PBMCs or MSC + PBMC culture (MSC + PBMC) using FITC-bound CD4 antibody (x-axis) and PE-bound CD25 antibody (y-axis). Flow cytometric analysis of TReg cell count (%) by minute staining. The gate was set based on the isotype control antibody as the background. The graph is representative of five independent experiments. (B) In the cell culture supernatant, TH1 cells generated in the presence of MSCs secreted decreased levels of IFN-γ (first y-axis), and TH2 cells generated in the presence of MSCs increased. Secreted an amount of IL-4 (second y-axis). (C) MSCs suppress IFN-γ secretion from purified NK cells cultured for 0, 24, or 48 hours in a 24-well plate. The data shown are mean ± SD cytokine secretion in one experiment and are representative of three independent experiments.
図３ ＭＳＣｓのＴｒｅｇ細胞集団数の増加及びＧＩＴＲ発現の増加の誘導
（Ａ）ＰＲＭＣあるいはＭＳＣ＋ＰＢＭＣ（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）培養（３日間さらなる刺激もなく培養された）由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞集団は、２ステップ磁気分離法を用いて単離された。これらの細胞は、（さらなる増殖を阻止するために）放射線照射され、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における刺激因子として用いられた。ここで応答物質（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）は、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）の存在下（２．５ｍｇ／ｍｌ）での同種異系ＰＢＭＣｓ（刺激因子の応答物質に対する比 １：１００）であった。細胞は４８時間培養され、その後３Ｈチミジンが添加され、２４時間後に組み込まれた放射能がカウントされた。結果は、ＭＳＣｓの存在下で発生したＴｒｅｇ集団（レーン３）が、ＭＳＣｓの不在下で発生したＴｒｅｇ細胞（レーン２）と機能上類似していることを示した。（Ｂ）ＰＢＭＣｓは、ＭＳＣｓの不在下（上段プロット）あるいは存在下（下段プロット）（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）で、
３日間培養され、その後非接着性画分が回収され、ＦＩＴＣ標識ＧＩＴＲ及びＰＥ標識ＣＤ４を用いて免疫染色された。結果は、ＭＳＣｓの存在下で培養された細胞のＧＩＴＲ発現において、２倍を超える増加を示す。
FIG. 3 Induction of increase in Treg cell population and increase in GITR expression of MSCs (A) CD4 + CD25 + Treg cell population derived from PRMC or MSC + PBMC (1:10 ratio of MSC to PBMC) culture (cultured for 3 days without further stimulation) Was isolated using a two-step magnetic separation method. These cells were irradiated (to prevent further proliferation) and used as a stimulator in mixed lymphocyte reaction (MLR). Here, the responder was allogeneic PBMCs (ratio 1: 100 of the stimulator to the responder) in the presence of phytoheme aglutinin (PHA) (2.5 mg / ml). The cells were cultured for 48 hours, then 3H thymidine was added, and after 24 hours the incorporated radioactivity was counted. The results showed that the Treg population (lane 3) generated in the presence of MSCs was functionally similar to the Treg cells (lane 2) generated in the absence of MSCs. (B) PBMCs are present in the absence (upper plot) or presence (lower plot) of MSCs (MSC ratio to PBMC 1:10).
After culturing for 3 days, the non-adhesive fraction was recovered and immunostained with FITC-labeled GITR and PE-labeled CD4. The results show a more than 2-fold increase in GITR expression in cells cultured in the presence of MSCs.
図４ ＭＳＣｓのＰＧＥ２の産生、及びＭＳＣ媒介免疫調節作用を無効にするＰＧＥ２の阻害
（Ａ）種々の濃度の、ＰＧＥ２阻害剤であるＮＳ−３９８あるいはインドメタシン（Ｉｎｄｏｍｅｔｈ．）の存在下あるいは不在下で培養されたＭＳＣｓから得られた培養上清におけるＰＧＥ２分泌（平均値±ＳＤ）。阻害剤濃度はμＭであり、提示されたデータは２４時間培養後に得られた値である。（Ｂ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いたＭＳＣｓ及びＰＢＭＣｓにおけるＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２発現。ＭＳＣｓは、ＰＢＭＣｓと比較してはるかに高いレベルのＣＯＸ−２を発現し、ＭＳＣｓがＰＢＭＣｓの存在下で培養された場合には、ＭＳＣｓのＣＯＸ−２発現の３倍以上の増加であった。３つの独立した実験のうちの１つからの代表データが示される。ＭＳＣ＋ＰＢＭＣ培養はトランスウェルチャンバープレートに設置され、ここでＭＳＣｓは下部チャンバーに播種され、ＰＢＭＣｓは上部チャンバーに播種された。（Ｃ）ＰＧＥ２阻害剤インドメタシン（Ｉｎｄ．）あるいはＮＳ−３９８の存在が、コントロールと比較して、活性化ＤＣｓからのＴＮＦ−α分泌と、ＴＨ１細胞からのＩＦＮ−γ分泌を増加させた。データは、ＭＳＣｓ及びＰＧＥ２阻害剤の不在化で発生した培養からの％変化として計算された。（Ｄ）ＭＳＣ−ＰＢＭＣ共培養（１：１０）でのＰＧＥ２阻害剤インドメタシン（Ｉｎｄｏ）及びＮＳ−３９８の存在は、ＰＨＡ処理したＰＢＭＣｓに対するＭＳＣ媒介抗増殖促進作用を無効にする。示されたデータは、一つの実験からのものであり、また３つの独立した実験の代表である。
FIG. 4 PGE2 production of MSCs and inhibition of PGE2 to abolish MSC-mediated immunomodulatory action (A) In the presence or absence of the PGE2 inhibitor NS-398 or indomethacin (Indometh.) At various concentrations. PGE2 secretion (mean ± SD) in the culture supernatant obtained from cultured MSCs. The inhibitor concentration is μM and the data presented are the values obtained after 24 hours of culture. (B) COX-1 and COX-2 expression in MSCs and PBMCs using real-time RT-PCR. MSCs expressed much higher levels of COX-2 compared to PBMCs, and when MSCs were cultured in the presence of PBMCs, there was a more than 3-fold increase in COX-2 expression of MSCs. Representative data from one of the three independent experiments is shown. MSC + PBMC cultures were placed on transwell chamber plates, where MSCs were seeded in the lower chamber and PBMCs were seeded in the upper chamber. (C) The presence of the PGE2 inhibitor indomethacin (Ind.) Or NS-398 increased TNF-α secretion from activated DCs and IFN-γ secretion from TH1 cells as compared to controls. Data were calculated as% changes from cultures that occurred in the absence of MSCs and PGE2 inhibitors. (D) The presence of the PGE2 inhibitors indomethacin (Indo) and NS-398 in MSC-PBMC co-culture (1:10) abolishes the MSC-mediated antiproliferative effect on PHA-treated PBMCs. The data shown are from one experiment and are representative of three independent experiments.
図５ 同種異系ＰＢＭＣｓの存在下での構成的ＭＳＣサイトカイン分泌の増加
予め特性の示されたヒトＭＳＣｓを用いて、ＰＢＭＣｓの存在下（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）（斜線バー）あるいは不在下（白抜きバー）で２４時間培養したＭＳＣｓの培養上清における、サイトカインＩＬ−６及びＶＥＧＦ、脂質メディエータＰＧＥ２、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）のレベルが分析された。ＭＳＣｓはＩＬ−６、ＶＥＧＦ、及びＰＧＥ２を構成的に産生し、これらの因子のレベルはＰＢＭＣｓとの共培養により増加した。これにより、ＭＳＣｓが炎症設定における免疫機能の調節に関与し得ることを示す。
FIG. 5 Increased constitutive MSC cytokine secretion in the presence of allogeneic PBMCs Using pre-characterized human MSCs, in the presence of PBMCs (1:10 ratio of MSCs to PBMCs) or absent The levels of cytokines IL-6 and VEGF, lipid mediator PGE2, and matrix metalloproteinase 1 (pro-MMP-1) in the culture supernatant of MSCs cultured in the presence (white bar) for 24 hours were analyzed. MSCs constitutively produced IL-6, VEGF, and PGE2, and the levels of these factors were increased by co-culture with PBMCs. This indicates that MSCs may be involved in the regulation of immune function in the inflammatory setting.
図６ ＭＳＣｓの用量依存的様式でのマイトジェン誘導Ｔ細胞増殖の抑制
増加数の同種異系ＰＢＭＣｓが、ＰＨＡの存在下（２．５ｍｇ／ｍｌ）あるいは不在下で、９６ウェルプレートに播種された定数のＭＳＣｓ（２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とともにインキュベートされ、３Ｈチミジン取り込みが（カウント数／分、すなわちｃｐｍで）測定された。ＭＳＣｓの存在下で、ＰＨＡで処理したＰＢＭＣｓの増殖の用量依存的抑制があった。３つの独立した実験の１つからの代表的な結果が示される。類似の結果は、ＬｅＢｌａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｇ．１１（２００３）により報告された。
FIG. 6 Suppression of thymidine-induced T cell proliferation in a dose-dependent manner of MSCs A constant number of allogeneic PBMCs seeded in 96-well plates in the presence or absence of PHA (2.5 mg / ml) or in the absence of PHA. Incubated with MSCs (2000 cells / well), 3H thymidine uptake was measured (counts / minute, ie cpm). In the presence of MSCs, there was a dose-dependent inhibition of the growth of PBA-treated PBMCs. Representative results from one of three independent experiments are shown. Similar results are available from LeBlanc, et al. , Scand J. Immunol. , Vol. 57, pg. Reported by 11 (2003).
図７ ＭＳＣ作用機序案の系統図
ＭＳＣｓは、先天性（ＤＣｓ経路 ２から４；及びＮＫ経路 ６）及び適応的（Ｔ経路
１及び５、及びＢ経路 ７）免疫システムの双方からの細胞に作用することで、その免疫調節作用を調節する。侵入病原体に対する反応で、未成熟ＤＣｓは潜在的入口部位に移動し、成熟して、（抗原特異的及び副刺激シグナルで）保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）エフェクターＴ細胞（細胞媒介ＴＨ１免疫あるいは体液性ＴＨ２免疫）となるためのｎａｉｖｅＴ細胞を用意（ｐｒｉｍｅ）する能力を獲得する。ＭＳＣ−ＤＣ相互作用の間に、ＭＳＣｓは、直接細胞間接触で、あるいは分泌された因子を介して、細胞媒介反応（経路２）を開始するＤＣｓの能力を制限することによって、あるいは体液性反応（経路４）を開始する能力を促進することによって、免疫反応の結果を変更し得る。また、成熟エフェクターＴ細胞が存在する場合は、ＭＳＣｓは、ＴＨ１（経路１）反応のバランスをＴＨ２反応（経路５）の方へ、またおそらくＩｇＥ産生Ｂ細胞活性の増加（経路７）、ＧｖＨＤ及び自己免疫疾患症状の抑制について望ましい結果の方へ傾けるために、互いに相互作用し得る。ＭＳＣｓは、ＴＲｅｇ集団の発生の増加（経路３）をもたらす能力において、体制表現型をもたらし、また局所微小環境におけるバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）炎症を弱めることで受容者ホストを救済し得る。破線（−−−）は、提案されたメカニズムを表す。
FIG. 7 Phylogenetic diagram of MSC mechanism of action MSCs to cells from both congenital (DCs pathways 2-4; and NK pathways 6) and adaptive (
本発明は、以下の実施例に関して開示される。しかしながら、本発明の範囲はそれらによって限定されるべきでないことは理解されるべきである。 The present invention is disclosed with respect to the following examples. However, it should be understood that the scope of the invention should not be limited by them.
（実施例１）
材料及び方法
ヒトＭＳＣｓの培養
Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８４，ｐｇ．１４３（１９９９）により開示されたように、ヒトＭＳＣｓを培養した。つまり、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｉｖ ｏｆ Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるインフォームドコセントの後に、匿名提供者の腸骨稜から骨髄サンプルを回収した。ＭＳＣｓを、１％抗生物質−抗真菌（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，ＪＲＨ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）とを含有する、完全ダルベッコ変法イーグル培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）−低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で培養した。ＭＳＣｓは接着性の単層として増殖し、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシンを３７℃で３分間）を用いて分離した。用いた全てのＭＳＣｓが多分化能について予め明らかにされており、また間葉系に分化（軟骨、脂質生成、及び骨形成）する能力を保持していた（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８４，ｐｇ．１４３（１９９９））。
(Example 1)
Materials and Methods Culture of Human MSCs Pittanger et al. , Science, Vol. 284, pg. Human MSCs were cultured as disclosed by 143 (1999). That is, bone marrow samples were collected from the iliac crest of an anonymous donor after informed cocent by Poietics Technologies, Divof Cambrex Biosciences. MSCs containing 1% antibiotic-antibiotic solution (Invitrogen, Carlsbad, California) and 10% fetal bovine serum (FBS, JRH BioScienses, lenexa, Kansasa), complete, codal. It was cultured in medium (complete Dulbecco's Modified Eagle's Medium) -low glucose (Life Technologies, Carlsbad, California). MSCs grew as an adhesive monolayer and separated using trypsin / EDTA (0.05% trypsin at 37 ° C. for 3 minutes). All MSCs used were previously clarified for pluripotency and retained the ability to differentiate (cartilage, lipogenesis, and bone formation) into the mesenchymal system (Pittanger et al., Science, Vol. 284, pg.143 (1999)).
樹状細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｉｖ ｏｆ Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から獲得した。単球系の樹状細胞（ＤＣｓ）の前駆体（ＣＤ１ｃ＋）を、Ｄｚｉｏｎｅｋ、ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６５，ｐｇ．６０３７（２０００）にしたがった２ステップ磁気分離法を用いて、ＰＢＭＣｓからポジティブセレクションした。つまり、ＣＤ１ｃ発現Ｂ細胞が磁気ビーズを用いてＣＤ１９＋細胞を磁気的に除去され、その後、ビオチン標識ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１＋）及び抗ビオチン抗体を用いてＢ細胞除去画分を標識し、それらを、メーカーの使用説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にしたがって磁気カラムを利用して非標識細胞画分から分離した。形質細胞様系統のＤＣｓの前駆体が、陽性に標識される抗体でコートされた細胞（ＢＤＣＡ２＋）の免疫−磁気ソーティングにより、ＰＢＭＣｓから単離された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
Isolation of dendritic cells Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from Poietics Technologies, Divof Cambrex Biosciences (Walkersville, MD). Precursors of monocyte lineage dendritic cells (DCs) (CD1c +) were prepared by Dzionek, et al. , J. Immunol. , Vol. 165, pg. Positive selection was made from PBMCs using a two-step magnetic separation method according to 6037 (2000). That is, CD1c-expressing B cells were magnetically depleted of CD19 + cells using magnetic beads, followed by labeling the B cell depleted fraction with biotectic-labeled CD1c (BDCA1 +) and anti-biotectic antibody, which were labeled by the manufacturer. Separations were made from unlabeled cell fractions using a magnetic column according to the instructions for use (Miltenyi Biotec, Auburn, California). Precursors of plasma cell-like lineages of DCs were isolated from PBMCs by immuno-magnetic sorting of positively labeled antibody-coated cells (BDCA2 +) (Miltenyi Biotec, Auburn, California).
ＭＳＣ−ＤＣ培養
大部分の実験において、等数のヒトＭＳＣｓ及びＤＣｓを、種々の期間培養し、細胞培養上清を回収し、さらなる実験まで−８０℃で保存した。選択した実験では、ＭＳＣｓを
成熟ＤＣ１あるいはＤＣ２細胞とともに（１：１ ＭＳＣ：ＤＣの比）３日間培養し、続いて混合培養（ＭＳＣｓとＤＣｓ）を、増殖を阻止するために放射線照射した。続いて、抗体精製、ｎａｉｖｅ、同種異系Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋）を放射線照射ＭＳＣｓ／ＤＣｓに添加し、さらに６日間培養した。その後、非接着性細胞画分（精製Ｔ細胞）を培養液から回収し、２回洗浄し、さらに２４時間ＰＨＡで再刺激した。その後、細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡにより分泌されたＩＦＮ−γ及びＩＬ−４について分析した。
MSC-DC cultures In most experiments, equal numbers of human MSCs and DCs were cultured for various periods, cell culture supernatants were collected and stored at -80 ° C until further experiments. In selected experiments, MSCs were cultured with mature DC1 or DC2 cells (1: 1 MSC: DC ratio) for 3 days, followed by mixed cultures (MSCs and DCs) irradiated to block proliferation. Subsequently, antibody purification, naive, and allogeneic T cells (CD4 +, CD45RA +) were added to irradiated MSCs / DCs and cultured for another 6 days. Then, the non-adhesive cell fraction (purified T cells) was recovered from the culture medium, washed twice, and re-stimulated with PHA for 24 hours. Then, cell culture supernatants were collected and analyzed for IFN-γ and IL-4 secreted by ELISA.
ＮＫ細胞の単離
ＮＫ細胞の精製集団を、一次試薬としてのビオチン結合モノクローナル抗体（抗ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３６及び抗ＩｇＥ抗体）と、二次標識試薬としてのマイクロビーズに結合した抗ビオチンモノクローナル抗体との混合物で磁気的に標識した非ＮＫ細胞を除去することで、獲得した。磁気標識された非ＮＫ細胞は、磁気領域中のＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）カラムに保持され、一方ＮＫ細胞は、通過して回収された。
Isolation of NK Cells An anti-biotin monoclonal antibody obtained by binding a purified population of NK cells to a biotin-binding monoclonal antibody (anti-CD3, CD14, CD19, CD36 and anti-IgE antibody) as a primary reagent and microbeads as a secondary labeling reagent. Obtained by removing non-NK cells magnetically labeled with a mixture with the antibody. Magnetically labeled non-NK cells were retained in a MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, California) column in the magnetic region, while NK cells were passed through and recovered.
Ｔｒｅｇ細胞集団の単離
Ｔｒｅｇ細胞集団を、２ステップ単離法を用いて単離した。第一に、非ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ビオチン標識抗体と抗ビオチンマイクロビーズの混合物で間接的磁気的に標識した。続いて標識した細胞を、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）での分離により除去した。次に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ２５マイクロビーズで直接標識し、濃縮前ＣＤ４＋Ｔ細胞画分からポジティブセレクションにより単離した。磁気的に標識したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をカラム上に保持し、磁気領域からのカラムの除去の後に溶出した。
Isolation of Treg cell populations Treg cell populations were isolated using a two-step isolation method. First, non-CD4 + T cells were indirectly magnetically labeled with a mixture of biotin-labeled antibody and anti-biotin microbeads. Subsequently, the labeled cells were removed by separation on a MACS column (Miltenyi Biotec, Auburn, California). Next, CD4 + CD25 + cells were directly labeled with CD25 microbeads and isolated from the pre-concentrated CD4 + T cell fraction by positive selection. Magnetically labeled CD4 + CD25 + T cells were retained on the column and eluted after removal of the column from the magnetic region.
ＭＳＣｓの存在下で発生したＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団の増加が実際に抑制されたか否かを測定するために、２ステップ磁気単離法を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＲｅｇ細胞集団をＰＢＭＣあるいはＭＳＣ＋ＰＢＭＣ（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）培養（３日間さらなる刺激もなく培養された）から単離した。これらの細胞を、さらなる増殖を阻止するために放射線照射し、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における刺激因子として用いた。ここで応答物質は、ＰＨＡの存在下（２．５μｇ／ｍｌ）での同種異系ＰＢＭＣｓ（刺激因子の応答物質に対する比 １：１００）であった。４８時間の培養を実施し、その後３Ｈチミジンを添加して、２４時間後に組み込まれた放射能をカウントした。 To measure whether the increase in the CD4 + CD25 + population that occurred in the presence of MSCs was actually suppressed, a two-step magnetic isolation method was used to combine the CD4 + CD25 + TReg cell population into PBMC or MSC + PBMC (ratio 1: of MSC to PBMC). 10) Isolated from culture (cultured for 3 days without further stimulation). These cells were irradiated to prevent further proliferation and used as a stimulator in mixed lymphocyte reaction (MLR). Here, the responsive substances were allogeneic PBMCs (ratio of stimulators to responsive substances 1: 100) in the presence of PHA (2.5 μg / ml). Cultures were performed for 48 hours, then 3H thymidine was added and the radioactivity incorporated after 24 hours was counted.
ＰＢＭＣｓをＭＳＣｓの不在下あるいは存在下（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）で培養し、その後、非接着性画分を収集し、ＦＩＴＣ標識グルココルチコイド誘導ＴＮＦレセプター、すなわちＧＩＴＲ、及びＰＥ標識ＣＤ４を用いて免疫染色した。 PBMCs are cultured in the absence or presence of MSCs (1:10 ratio of MSCs to PBMCs), then non-adhesive fractions are collected and FITC-labeled glucocorticoid-induced TNF receptors, ie GITR, and PE-labeled CD4. Used for immunostaining.
ＴＨ１／ＴＨ２細胞の発生
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、単球を除去するために、３７℃で４５分間２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種した。非接着性画分を、ＭＳＣｓの存在下あるいは不在下で、ＴＨ１（ＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ））あるいはＴＨ２（ＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−４（４ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＩＦＮ−γ（１μｇ／ｍｌ））条件下、プレート固定抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）抗体、及び抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）抗体の存在下で３日間インキュベートした。細胞を洗浄し、その後２４時間あるいは４８時間、ＰＨＡ（２．５μｇ／ｍｌ）で再刺激した。その後、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）で、培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを測定した。
Development of TH1 / TH2 cells Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were seeded at 2 × 106 cells / ml at 37 ° C. for 45 minutes to remove monocytes. Non-adhesive fractions in the presence or absence of MSCs TH1 (IL-2 (4 ng / ml) + IL-12 (5 ng / ml) + anti-IL-4 (1 μg / ml)) or TH2 (IL-). Presence of plate-fixed anti-CD3 (5 μg / ml) antibody and anti-CD28 (1 μg / ml) antibody under 2 (4 ng / ml) + IL-4 (4 ng / ml) + anti-IFN-γ (1 μg / ml)) conditions. Incubated under 3 days. The cells were washed and then restimulated with PHA (2.5 μg / ml) for 24 or 48 hours. Then, the levels of IFN-γ and IL-4 in the culture supernatant were measured by ELISA (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota).
ＭＳＣｓの培養上清中のＶＥＧＦ、ＰＧＥ２、及びｐｒｏ−ＭＭＰ−１のレベルの分析
予め特定されたヒトＭＳＣｓを用いて、ＰＢＭＣｓの存在下（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）あるいは不在下で２４時間培養したＭＳＣｓの培養上清中で、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＶＥＧＦ、脂質メディエータ プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）のレベルを分析した。
Analysis of VEGF, PGE2, and pro-MMP-1 levels in
ＰＢＭＣｓの増殖
精製ＰＢＭＣｓを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）での遠心分離ロイコパック（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ ｌｅｕｋｏｐａｃｋ）（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）により処理した。分離した細胞を、マイトジェンＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下、ＭＳＣｓの存在下（定着するように、ＰＢＭＣ添加の３から４時間前に播種した）あるいは不在下で、４８時間培養した（トリプリケイト（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）で）。選択した実験においては、ＰＢＭＣｓを、ＰＧＥ２阻害剤インドメタシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）あるいはＮＳ−９３８（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を含有する培地中に再懸濁した。（３Ｈ）−チミジンを添加し（２００μｌの培養液中に２０μｌ）、さらなる２４時間の培養の後に自動収集器を用いて細胞を収集した。ＭＳＣｓあるいはＰＧＥ２阻害剤の作用効果を、ＰＨＡの存在下のコントロール反応（１００％）の割合として計算した。
Propagation of PBMCs Purified PBMCs were treated with Centrifuge leukopack (Cambrex, Walkersville, Maryland) in Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Oslo, Norway). Isolated cells were seeded in the presence of Mightgen PHA (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri), in the presence of MSCs (sown 3-4 hours prior to PBMC addition to colonize) or in the absence of 48 hours. Cultivated (at triplicates). In selected experiments, PBMCs were resuspended in media containing the PGE2 inhibitors indomethacin (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) or NS-938 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan). (3H) -thymidine was added (20 μl in 200 μl culture) and cells were collected using an automatic collector after an additional 24 hours of culture. The effects of MSCs or PGE2 inhibitors were calculated as the percentage of control response (100%) in the presence of PHA.
量的ＲＴ−ＰＣＲ
細胞ペレットからの全ＲＮＡを、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、またメーカーの使用説明書にしたがって、処理した。混入ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いて除去した。０．５μＭ濃度のプライマーとともにＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｐｔｉｃｏｎ検出システム（Ｓｏｕｔｈ
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。種々の条件下で培養された細胞における発現レベルの相対的変化を、内在コントロールとしてのβアクチンを用いて、Ｃｔ値（交点）の違いにより算出した。ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の特異的プライマーの配列は、ＣＯＸ−１：５’−ＣＣＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＴ Ｇ−３’（フォワード）、５’−ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ Ｇ−３’（リバース）；ＣＯＸ−２：５’−ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＣ−３’（フォワード）、５’−ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＴＡ ＣＡＧ−３’（リバース）である。
Quantitative RT-PCR
Total RNA from cell pellet was treated with commercially available kits (Qiagen, Valencia, California) and according to the manufacturer's instructions. Contaminated genomic DNA was removed using a DNA free kit (Ambion, Austin, Texas). QuantiTect SYBR with 0.5 μM concentration primer
MJ Research Opticon detection system (South) using the Green RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, California).
Quantitative RT-PCR was performed in San Francisco (California). Relative changes in expression levels in cells cultured under various conditions were calculated by differences in Ct values (intersections) using β-actin as an endogenous control. The sequences of the specific primers for COX-1 and COX-2 are COX-1: 5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3'(forward), 5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G-3. '(Reverse); COX-2: 5'-ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3'(Forward), 5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3'(Reverse).
増加数の同種異系ＰＢＭＣｓを、ＰＨＡの存在下（２．５μｇ／ｍｌ）で、９６ウェルプレートに播種した定数のＭＳＣｓ（２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とともに７２時間インキュベートし、３Ｈチミジン取り込み（カウント数／分、すなわちｃｐｍで）を測定した。 Increased allogeneic PBMCs were incubated in the presence of PHA (2.5 μg / ml) with a constant number of MSCs (2000 cells / well) seeded on 96-well plates for 72 hours and 3H thymidine uptake (counts / min). , That is, at cpm) was measured.
ＰＢＭＣｓとＭＳＣｓは、ＭＳＣ：ＰＢＭＣが１：１、１：３、１：１０、１：３０、及び１：８１の割合で培養した。 PBMCs and MSCs were cultured in MSC: PBMC ratios of 1: 1, 1: 3, 1:10, 1:30, and 1:81.
結果
本研究において、ヒトＭＳＣｓと、樹状細胞（ＤＣ１及びＤＣ２）、エフェクターＴ細胞（ＴＨ１及びＴＨ２）、及びＮＫ細胞を含む、単離された免疫細胞集団との相互作用を調査した。ＭＳＣｓと各免疫細胞タイプとの相互作用は、ＭＳＣｓが免疫反応プロセスの複数の段階を調節し得ることを示す特異的な結果であった。ＭＳＣ免疫調節作用を調節し
、またＭＳＣ免疫調節作用の原因となり得る分泌因子の産生が評価され、プロスタグランジン合成が関与することが示された。
Results In this study, we investigated the interaction of human MSCs with isolated immune cell populations, including dendritic cells (DC1 and DC2), effector T cells (TH1 and TH2), and NK cells. The interaction of MSCs with each immune cell type was a specific result showing that MSCs can regulate multiple stages of the immune response process. The production of secretory components that regulate MSC immunomodulatory effects and may be responsible for MSC immunomodulatory effects was evaluated and showed that prostaglandin synthesis is involved.
骨髄（ＤＣ１）前駆樹状細胞及び形質細胞様（ＤＣ２）前駆樹状細胞を、それぞれＢＤＣＡ１＋細胞及びＢＤＣＡ２＋細胞の免疫−磁気ソーティングにより単離し、ＤＣ１細胞についてはＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４（それぞれ１×１０３ＩＵ／ｍｌ、及び１×１０３ＩＵ／ｍｌ）とともに、ＤＣ２細胞についてはＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートすることで成熟させた。フローサイトメトリーを用いて、ＤＣ１細胞はＨＬＡ−ＤＲ＋及びＣＤ１１ｃ＋であり、一方ＤＣ２細胞はＨＬＡ−ＤＲ＋及びＣＤ１２３＋であった（図１Ａ）。炎症性因子である細菌性リポ多糖（ＬＰＳ，１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＤＣ１細胞は中程度のレベルのＴＮＦ−αを産生したが、ＭＳＣｓが存在した場合（１：１及び１：１０の比で調査された）には、ＴＮＦ−α分泌の５０％以上の減少があった（図１Ｂ）。他方では、ＤＣ２細胞はＬＰＳの存在下でＩＬ−１０を産生し、そのレベルはＭＳＣ：ＤＣ２共培養（１：１）で２倍以上増加した（図１Ｂ）。したがって、ＭＳＣｓは、培養中の活性化されたＤＣｓのサイトカインプロファイルを、より寛容原生表現型に変更した。さらに、活性化したＤＣｓは、ＭＳＣｓとともに培養された場合に、ＩＦＮ−γを減少させ、またｎａｉｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞により分泌されたＩＬ−４レベルを増加させることができ（図１Ｃ）、これは前炎症性Ｔ細胞表現型から抗炎症性Ｔ細胞表現型へのＭＳＣ媒介変化を示す。 Bone marrow (DC1) precursor dendritic cells and plasma cell-like (DC2) precursor dendritic cells were isolated by immuno-magnetic sorting of BDCA1 + cells and BDCA2 + cells, respectively, and GM-CSF and IL-4 (1 each) for DC1 cells. × 103 IU / ml, and 1 × 103 IU / ml), and DC2 cells were matured by incubation with IL-3 (10 ng / ml). Using flow cytometry, DC1 cells were HLA-DR + and CD11c +, while DC2 cells were HLA-DR + and CD123 + (FIG. 1A). In the presence of the inflammatory factor bacterial lipopolysaccharide (LPS, 1 ng / ml), DC1 cells produced moderate levels of TNF-α, but in the presence of MSCs (1: 1 and 1:10). There was a 50% or greater reduction in TNF-α secretion (FIG. 1B). On the other hand, DC2 cells produced IL-10 in the presence of LPS, the levels of which increased more than 2-fold in MSC: DC2 co-culture (1: 1) (FIG. 1B). Therefore, MSCs changed the cytokine profile of activated DCs in culture to a more tolerant primordial phenotype. In addition, activated DCs can reduce IFN-γ and increase IL-4 levels secreted by nativeCD4 + T cells when cultured with MSCs (FIG. 1C), which is preinflammatory. Shows MSC-mediated changes from T cell phenotype to anti-inflammatory T cell phenotype.
ＩＬ−１０分泌の増加が制御性細胞の発生に関与するため（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６８，ｐｇ．１０８０（２０００））、Ｔ制御性細胞（ＴＲｅｇ）を、ＰＢＭＣｓ及びＭＳＣｓの共培養中で、フローサイトメトリーにより定量した。ＰＢＭＣｓのＭＳＣｓとの３から５日間の培養により、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ２５抗体でのＰＢＭＣｓの染色により測定されたＴＲｅｇ細胞数の増加があり（図２Ａ）、さらにＭＳＣ誘導寛容原生反応を支持した。ＭＳＣｓの存在下で発生したＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴＲｅｇ細胞集団は、増加したレベルのグルココルチコイド誘導ＴＮＦレセプター（ＧＩＴＲ）、ＴＲｅｇ細胞集団上に発現する細胞表面レセプターを発現し、また同種異系Ｔ細胞増殖を抑制した（図３Ａ、３Ｂ）ことから、実際抑制的であった。次に、Ｔ細胞分化に作用する直接の能力に関して、ＭＳＣｓを調査した。抗体選別精製Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔｈ細胞）を用いて、ＩＦＮ−γ産生ＴＨ１細胞及びＩＬ−４産生ＴＨ２細胞を、ＭＳＣｓの存在下あるいは不在下で発生させた。分化の間にＭＳＣｓが存在すると、ＴＨ１細胞によるＩＦＮ−γ分泌が減少し、ＴＨ２細胞によるＩＬ−４分泌が増加した（図２Ｂ）。Ｔｈ細胞がエフェクターＴＨ１タイプあるいはＴＨ２タイプに分化した後（３日）に、ＭＳＣｓが培養に添加された場合は、ＩＦＮ−γあるいはＩＬ−４のレベルの著しい変化は見られなかった（不図示）。これらの実験は、ＭＳＣｓがエフェクターＴ細胞分化に直接作用し、Ｔ細胞サイトカイン分泌を体液性表現型に変化させることができることを示す。 Since increased IL-10 secretion is involved in the development of regulatory cells (Kingsley, et al., J. Immunol., Vol. 168, pg. 1080 (2000)), T regulatory cells (TRegs) are used as PBMCs. And MSCs in co-culture, quantified by flow cytometry. Culturing PBMCs with MSCs for 3 to 5 days resulted in an increase in the number of TReg cells measured by staining PBMCs with anti-CD4 and anti-CD25 antibodies (FIG. 2A), further supporting the MSC-induced tolerant progenitor reaction. .. CD4 + CD25 + TReg cell populations generated in the presence of MSCs expressed increased levels of glucocorticoid-induced TNF receptors (GITRs), cell surface receptors expressed on TReg cell populations, and suppressed allogeneic T cell proliferation (allogeneic T cell proliferation). As shown in FIGS. 3A and 3B), it was actually suppressive. Next, MSCs were investigated for their direct ability to act on T cell differentiation. Using antibody-selected and purified T cells (CD4 + Th cells), IFN-γ-producing TH1 cells and IL-4-producing TH2 cells were generated in the presence or absence of MSCs. The presence of MSCs during differentiation reduced IFN-γ secretion by TH1 cells and increased IL-4 secretion by TH2 cells (FIG. 2B). When MSCs were added to the culture after Th cells differentiated into effector TH1 or TH2 type (3 days), no significant changes in IFN-γ or IL-4 levels were observed (not shown). .. These experiments show that MSCs can act directly on effector T cell differentiation to alter T cell cytokine secretion into a humoral phenotype.
同様に、ＭＳＣｓを精製ＮＫ細胞（ＣＤ３−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３６−）と比率１：１で異なる期間（０から４８時間）培養すると、培養上清中でのＩＦＮ−γ分泌の減少があった（図２Ｃ）。したがって、これはＭＳＣｓがＮＫ細胞作用をも調節することができることを示す。 Similarly, when MSCs are cultured in purified NK cells (CD3-, CD14-, CD19-, CD36-) at a ratio of 1: 1 for different periods (0 to 48 hours), IFN-γ secretion in the culture supernatant is reduced. There was (Fig. 2C). Therefore, this indicates that MSCs can also regulate NK cell action.
過去の研究は、ＭＳＣｓが水溶性因子によりＴ細胞作用を調節することを示している（ＬｅＢｌａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．３１，ｐｇ．８９０（２００３）；Ｔｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．７５，ｐｇ．３８９（２００３））。ＭＳＣｓが、ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ２、ＶＥＧＦ、及びｐｒｏＭＭＰ−１を含む複数の因子を構成的に分泌し、ＰＢＭＣｓを含む培養によりそれぞれのレベルが増加したことが観察された（図５）。ＤＣｓによる、ＴＮＦ−α産生の抑制、及びＩＬ−１０産生の増加をもたらすＭＳＣ生成因子を調査するために、プロスタグランジンＥ２の潜在的役割を調査したが、活性化ＤＣｓによるＴＮＦ−γ産生を抑制することが認められた（Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２２３，ｐｇ．１２０（２００３））。ＭＳＣ培養（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの２４時間培養）の条件培地は、おおよそ１０００ｐｇ／ｍｌのＰＧＥ２を含有していた（図４Ａ）。培養上清中に、ＰＧＥ２分泌の既知の誘導因子、例えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γあるいはＩＬ−１βの存在は検出できなかったが（不図示）、これはＭＳＣｓによるＰＧＥ２の構成的分泌を示す。ｈＭＳＣｓによるＰＧＥ２分泌は、ＰＧＥ２産生の既知の阻害剤、ＮＳ−３９８（５μＭ）及びインドメタシン（４μＭ）の存在下で、６０から９０％抑制された（図４Ａ）。ＰＧＥ２分泌の放出が、構成的活性シクロオキシゲナーゼ酵素１（ＣＯＸ−１）及び誘導性シクロオキシゲナーゼ酵素２（ＣＯＸ−２）の酵素活性の結果として起こるため（Ｈａｒｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，ｐｇ．１４４（２００２））、ＭＳＣｓ及びＰＢＭＣｓにおけるＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２のｍＲＮＡ発現を、トランスウェル培養システムを用いて分析した。ＭＳＣｓは、ＰＢＭＣｓと比較してはるかに高いレベルのＣＯＸ−２を発現し、ＭＳＣｓとＰＢＭＣｓの２４時間の共培養（ＭＳＣのＰＢＭＣに対する比 １：１０）の場合には、発現レベルは３倍以上増加した（図４Ｂ）。ＣＯＸ−１レベルのわずかな変化が見られ、これはＭＳＣ−ＰＢＭＣ共培養によるＰＧＥ２分泌の増加（図５）が、ＣＯＸ−２の上向き調節により調節されることを示す。ＤＣｓ及びＴ細胞に対するＭＳＣの免疫調節効果がＰＧＥ２によって調節されたか否かを調査するために、ＰＧＥ２阻害剤ＮＳ−３９８あるいはインドメタシンの存在下で、ＭＳＣｓを活性化樹状細胞（ＤＣ１）あるいはＴＨ１細胞とともに培養した。ＮＳ−３９８あるいはインドメタシンの存在が、ＤＣ１ｓによるＴＮＦ−α分泌と、ＴＨ１細胞からのＩＦＮ−γ分泌をそれぞれ増加させたが（図４Ｃ）、これは免疫細胞タイプに対するＭＳＣの作用が、分泌されたＰＧＥ２により調節され得ることを示す。最近の研究が、ＭＳＣｓが様々な刺激で誘導されるＴ細胞増殖を抑制することを示した（Ｄｅｎｉｃｏｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９９，ｐｇ．３８３８（２００２）；ＬｅＢｌａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｇ．１１（２００３））。ＭＳＣｓがマイトジェン誘導Ｔ細胞増殖を用量依存的様式で抑制することが観察され（図６）、ＰＧＥ２阻害剤ＮＳ−３９８（５μＭ）あるいはインドメタシン（４μＭ）が存在した場合には、ＭＳＣ含有培養液中のＰＨＡ処理ＰＢＭＣｓによる３Ｈチミジン取り込みが、阻害剤を含まないコントロールと比べて、７０％以上増加した（図４Ｄ）。 Previous studies have shown that MSCs regulate T cell action by water-soluble factors (LeBlanc, et al., Exp. Hematol., Vol. 31, pg. 890 (2003); Tse, et al. , Transplantation, Vol. 75, pg. 389 (2003)). It was observed that MSCs constitutively secreted multiple factors including IL-6, prostaglandin E2, VEGF, and proMMP-1, and cultures containing PBMCs increased their levels (FIG. 5). .. To investigate the MSC-producing factors that cause the suppression of TNF-α production and the increase of IL-10 production by DCs, the potential role of prostaglandin E2 was investigated, but TNF-γ production by activated DCs was investigated. It was found to suppress (Vassiliou, et al., Cell. Immunol., Vol. 223, pg. 120 (2003)). Conditional medium for MSC culture (0.5 × 106 cells / ml 24-hour culture) contained approximately 1000 pg / ml of PGE2 (FIG. 4A). The presence of known inducers of PGE2 secretion, such as TNF-α, IFN-γ or IL-1β, could not be detected in the culture supernatant (not shown), indicating constitutive secretion of PGE2 by MSCs. .. PGE2 secretion by hMSCs was suppressed by 60 to 90% in the presence of known inhibitors of PGE2 production, NS-398 (5 μM) and indomethacin (4 μM) (FIG. 4A). Because the release of PGE2 secretion occurs as a result of the enzymatic activity of constitutively active cyclooxygenase enzyme 1 (COX-1) and inducible cyclooxygenase enzyme 2 (COX-2) (Harris, et al., Trends Immunol., Vol. 23). , Pg. 144 (2002)), COX-1 and COX-2 mRNA expression in MSCs and PBMCs was analyzed using a transwell culture system. MSCs express much higher levels of COX-2 compared to PBMCs, and in the case of 24-hour co-culture of MSCs and PBMCs (1:10 ratio of MSCs to PBMCs), expression levels are more than 3-fold. Increased (Fig. 4B). A slight change in COX-1 levels was seen, indicating that the increase in PGE2 secretion by MSC-PBMC co-culture (FIG. 5) is regulated by the upward regulation of COX-2. To investigate whether the immunomodulatory effect of MSCs on DCs and T cells was regulated by PGE2, MSCs activated dendritic cells (DC1) or TH1 cells in the presence of the PGE2 inhibitor NS-398 or indomethacin. Was cultured with. The presence of NS-398 or indomethacin increased TNF-α secretion by DC1s and IFN-γ secretion from TH1 cells, respectively (Fig. 4C), which secreted the effect of MSC on immune cell types. It is shown that it can be regulated by PGE2. Recent studies have shown that MSCs suppress various stimulus-induced T cell proliferation (Denicola, et al., Blood, Vol. 99, pg. 3838 (2002); LeBlanc, et al.,. Scand. J. Immunol., Vol. 57, pg. 11 (2003)). It was observed that MSCs suppressed mitogen-induced T cell proliferation in a dose-dependent manner (FIG. 6), and in the presence of the PGE2 inhibitor NS-398 (5 μM) or indomethacin (4 μM) in MSC-containing culture medium. 3H thymidine uptake by PHA-treated PBMCs was increased by more than 70% compared to the inhibitor-free control (FIG. 4D).
要約すると、ＭＳＣの他の免疫細胞タイプとの相互作用のモデル（図７）が提案される。成熟Ｔ細胞が存在する場合には、ＭＳＣｓは、それらと直接相互作用して、前炎症性ＩＦＮ−γ産生を抑制し（経路１）、制御性Ｔ細胞表現型を促進し（経路３）、また抗炎症性ＴＨ２細胞を促進する（経路５）。さらに、ＭＳＣｓは、ＰＧＥ２を分泌し、前炎症性ＤＣ１細胞を抑制し（経路２）、また抗炎症性ＤＣ２細胞（経路４）あるいは制御性ＤＣｓ（経路３）を促進することで、ＤＣｓを介したＴ細胞免疫反応の結果を変えることができる。ＴＨ２免疫への変化は言い換えると、Ｂ細胞活性の、ＩｇＥ／ＩｇＧ１サブタイプ抗体の発生の増加（経路７）への変化を示す。ＭＳＣｓは、そのＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を抑制する能力により、ＮＫ細胞作用を調節し得る（経路６）。このＭＳＣのモデル：免疫細胞相互作用は、複数の他の研究所で行われた実験と一致する（ＬｅＢｌａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．３１，ｐｇ．８９０（２００３）；Ｔｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．７５，ｐｇ．３８９（２００３）；ＤｉＮｉｃｏｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９９，ｐｇ．３８３８（２００２））。提案されたメカニズムについてのさらなる調査が進行中であり、現在はＭＳＣ投与のｉｎ ｖｉｖｏ効果を調査するために、動物研究が必要である。 In summary, a model of interaction with other immune cell types of MSCs (Fig. 7) is proposed. In the presence of mature T cells, MSCs interact directly with them to suppress pre-inflammatory IFN-γ production (pathway 1) and promote regulatory T cell phenotype (pathway 3). It also promotes anti-inflammatory TH2 cells (pathway 5). In addition, MSCs are mediated by DCs by secreting PGE2, suppressing pre-inflammatory DC1 cells (pathway 2), and promoting anti-inflammatory DC2 cells (pathway 4) or regulatory DCs (pathway 3). The outcome of the T cell immune response can be altered. Changes to TH2 immunity, in other words, indicate changes in B cell activity to increased development of IgE / IgG1 subtype antibodies (pathway 7). MSCs can regulate NK cell action by their ability to suppress IFN-γ secretion from NK cells (pathway 6). This model of MSC: immune cell interactions is consistent with experiments performed in several other laboratories (LeBlanc, et al., Exp. Hematol., Vol. 31, pg. 890 (2003); Tse, et al., Transplantation, Vol.75, pg.389 (2003); DiNicola, et al., Blood, Vol.99, pg.3838 (2002)). Further investigation into the proposed mechanism is underway and currently animal studies are needed to investigate the in vivo effects of MSC administration.
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しかしながら、本発明の範囲は、上述の特定の実施例に限定されるべきでないことは理解されるべきである。本発明は、特に開示されている以外の様式で実施され得るが、これも添付の請求の範囲の範囲内である。 However, it should be understood that the scope of the invention should not be limited to the particular examples described above. The present invention may be practiced in a manner other than that specifically disclosed, which is also within the scope of the appended claims.
しかしながら、本発明の範囲は、上述の特定の実施例に限定されるべきでないことは理解されるべきである。本発明は、特に開示されている以外の様式で実施され得るが、これも添付の請求の範囲の範囲内である。
発明の態様
［１］動物の心臓以外の器官あるいは組織における血管形成を促進することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
［２］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする［１］記載の使用法。
［３］前記動物が、霊長類であることを特徴とする［２］記載の使用法。
［４］前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする［３］記載の使用法。
［５］前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする［１］記載の使用法。
［６］前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、約１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇから約５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｋｇの量で投与されることを特徴とする［１］記載の使用法。
［７］前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、全身に投与されることを特徴とする［１］記載の使用法。
［８］前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、静脈内に投与されることを特徴とする［１］記載の使用法。
［９］前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、前記動物の心臓以外の器官あるいは組織に直接注入により投与されることを特徴とする［１］記載の使用法。
［１０］動物の自己免疫疾患を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
［１１］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする［１０］記載の使用法。
［１２］前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする［１１］記載の使用法。
［１３］動物の炎症反応を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法であって、ここで炎症反応の治療が、脳、皮膚、消化管（炎症性大腸炎において）、肝臓（慢性肝炎において）、目、脊髄、妊娠子宮および胎盤、卵巣、精巣、副腎皮質または毛包における炎症を軽減することを含む、使用法。
［１４］前記炎症反応が、炎症性大腸炎であることを特徴とする［１３］記載の使用法。
［１５］前記単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞が、腸の炎症を制限又は軽減する、［１３］記載の使用法。
［１６］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする［１３］記載の使用法。
［１７］前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする［１６］記載の使用法。
［１８］前記炎症反応が、乾癬に関連するものであることを特徴とする［１３］記載の使用法。
［１９］動物の癌を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法であって、ここで前記間葉幹細胞が腫瘍の増殖を抑制する、使用法。
［２０］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする［１９］記載の使用法。
［２１］前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする［２０］記載の使用法。
［２２］動物のアレルギー性疾患又はアレルギー症状を治療するための医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
［２３］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする、［２２］記載の使用法。
［２４］前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする、［２３］記載の使用法。
［２５］前記アレルギー性疾患又はアレルギー症状が関節炎であることを特徴とする、［２２］記載の使用法。
［２６］動物の創傷治癒を促進することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
［２７］前記動物が、哺乳類であることを特徴とする［２６］記載の使用法。
［２８］前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする［２７］記載の使用法。
［２９］前記創傷が、火傷、切傷および裂傷からなる群より選択されることを特徴とする、［２６］記載の使用法。
［３０］動物の線維症を予防することを特徴とする医薬製剤の製造のための、ヒトの、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
However, it should be understood that the scope of the invention should not be limited to the particular examples described above. The present invention may be practiced in a manner other than that specifically disclosed, which is also within the scope of the appended claims.
Aspects of the Invention [1] Isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchyme for the production of pharmaceutical formulations characterized by promoting angiogenesis in organs or tissues other than the heart of an animal. How to use stem cells.
[2] The usage according to [1], wherein the animal is a mammal.
[3] The usage according to [2], wherein the animal is a primate.
[4] The usage according to [3], wherein the primate is a human.
[5] The usage according to [1], wherein the mesenchymal stem cells of the pharmaceutical preparation are administered in an amount of about 1 × 10 5 cells / kg to about 1 × 10 7 cells / kg.
[6] The usage according to [1], wherein the mesenchymal stem cells of the pharmaceutical product are administered in an amount of about 1 × 10 6 cells / kg to about 5 × 10 6 cells / kg.
[7] The usage according to [1], wherein the mesenchymal stem cells of the pharmaceutical product are systemically administered.
[8] The usage according to [1], wherein the mesenchymal stem cells of the pharmaceutical preparation are administered intravenously.
[9] The usage according to [1], wherein the mesenchymal stem cells of the pharmaceutical product are directly injected into an organ or tissue other than the heart of the animal.
[10] A use of isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations characterized by the treatment of animal autoimmune diseases.
[11] The usage according to [10], wherein the animal is a mammal.
[12] The usage according to [11], wherein the mammal is a human.
[13] A use of isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations characterized by treating an inflammatory response in an animal, wherein. Treatment of inflammatory reactions reduces inflammation in the brain, skin, gastrointestinal tract (in inflammatory colitis), liver (in chronic hepatitis), eyes, spinal cord, pregnant uterus and placenta, ovaries, testis, adrenal cortex or hair follicles Usage, including that.
[14] The usage according to [13], wherein the inflammatory reaction is ulcerative colitis.
[15] The usage according to [13], wherein the isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells limit or reduce intestinal inflammation.
[16] The usage according to [13], wherein the animal is a mammal.
[17] The usage according to [16], wherein the mammal is a human.
[18] The usage according to [13], wherein the inflammatory reaction is related to psoriasis.
[19] A use of isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations comprising treating cancer in an animal, wherein said herein. Usage in which mesenchymal stem cells suppress tumor growth.
[20] The usage according to [19], wherein the animal is a mammal.
[21] The usage according to [20], wherein the mammal is a human.
[22] Use of isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations for the treatment of allergic diseases or symptoms in animals.
[23] The usage according to [22], wherein the animal is a mammal.
[24] The usage according to [23], wherein the mammal is a human.
[25] The usage according to [22], wherein the allergic disease or allergic symptom is arthritis.
[26] Use of isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations characterized by promoting wound healing in animals.
[27] The usage according to [26], wherein the animal is a mammal.
[28] The usage according to [27], wherein the mammal is a human.
[29] The usage according to [26], wherein the wound is selected from the group consisting of burns, cuts and lacerations.
[30] Use of human, isolated, allogeneic, non-genetically engineered mesenchymal stem cells for the manufacture of pharmaceutical formulations characterized by the prevention of animal fibrosis.
Claims (30)
。 13. The usage according to claim 13, wherein the inflammatory response is related to psoriasis.
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