JP2021161098A - Sample cooling method, method for manufacturing cooled product, and cooling tool - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料冷却方法、冷却物の製造方法及び冷却用具に関する。 The present invention relates to a sample cooling method, a method for producing a cooled product, and a cooling tool.
従来、細胞等の生物試料を保存するために、生物試料を液体窒素や冷凍庫を用いて低温保存することが行われている。生物試料を低温保存するために、保存に先立ち、生物試料を冷却する場合があり、その一般的な冷却方法として、生物試料を収めたクライオバイアル等の容器を、ピンセット等を用いて、液体窒素に直接浸すことが行われてきた。 Conventionally, in order to store a biological sample such as cells, the biological sample is stored at a low temperature using liquid nitrogen or a freezer. In order to store the biological sample at a low temperature, the biological sample may be cooled prior to storage, and as a general cooling method, a container such as a cryovial containing the biological sample is used with a tweezers or the like to liquid nitrogen. It has been done to soak directly in.
しかし、一般的なクライオバイアルは、蓋がネジ式になっているため、液体窒素などの超低温下では、容器が収縮すると同時に内部が陰圧になり、ネジと容器本体との間に生じる僅かな隙間から容器内に液体窒素が侵入し得る。さらに、液体窒素が、雑菌やマイコプラズマ、他種の細胞の混入等により汚染されている場合があり、それが生物試料に付着して、生物試料が清浄な状態で凍結保存されない場合がある。 However, since the lid of a general cryovial is a screw type, under ultra-low temperature such as liquid nitrogen, the container shrinks and the inside becomes negative pressure at the same time, and a slight amount of pressure is generated between the screw and the container body. Liquid nitrogen can enter the container through the gap. Furthermore, liquid nitrogen may be contaminated by germs, mycoplasma, contamination with cells of other species, etc., which may adhere to the biological sample, and the biological sample may not be cryopreserved in a clean state.
また、アイスラック（例えば、非特許文献１）等の名称で呼ばれる、チューブ全般を扱うための各種用具が市販されているが、これは、生物試料の調整作業を氷上で行うためのものであり、上記の低温保存を目的とした生物試料の冷却には使用されていない。また仮に使用されたとしても、希少な試料を扱う場面において、冷却の安定性や信頼性が十分ではない。 In addition, various tools for handling tubes in general, which are called ice racks (for example, Non-Patent Document 1), are commercially available, but these are for preparing biological samples on ice. , Not used for cooling biological samples for the purpose of low temperature storage. Even if it is used, the stability and reliability of cooling are not sufficient in the case of handling a rare sample.
本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、生物試料の汚染を防止し生物試料を冷却できる、試料冷却方法、冷却物の製造方法及び冷却用具を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and provides a sample cooling method, a method for producing a cooled product, and a cooling tool capable of preventing contamination of a biological sample and cooling the biological sample. With the goal.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、生物試料を冷却する際に、容器を直接液体窒素に浸けるのではなく、予め冷却された冷却用具を用いて、生物試料を冷却することで、生物試料の汚染を防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の態様を有する。
As a result of diligent studies to solve the above problems, the present inventors used a pre-cooled cooling tool to cool the biological sample, instead of immersing the container directly in liquid nitrogen. We have found that cooling can prevent contamination of biological samples, and have completed the present invention.
That is, the present invention has the following aspects.
（１） 生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックを備え、
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具を用い、
以下の工程を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、及び
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程。
（２） 前記凹部の内部空間と、ブロックを構成する材料とで占められた部分の総和である前記ブロックの総体積に対する、前記凹部の内部空間の総体積が、３０体積％以下である、前記（１）に記載の試料冷却方法。
（３） 前記容器内に収められた前記生物試料を含む冷却対象物の質量に対する、前記ブロックの質量比（冷却対象物の質量：ブロックの質量）が、１：１０〜１：１０００００である、前記（１）又は（２）に記載の試料冷却方法。
（４） 前記ブロックの質量が、３００ｇ以上である、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の試料冷却方法。
（５） 更に、前記凹部を覆う蓋体を備え、前記蓋体は、金属又は金属を含有する材料から構成されている、前記冷却用具を用い、
以下の工程を含む、前記（１）〜（４）のいずれか一つに試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、
前記蓋体を−６０℃以下の温度に冷却する、蓋体冷却工程、
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程、及び
前記試料収容工程の後、−６０℃以下の温度に冷却された前記蓋体を、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置する、蓋体設置工程。
（６） 前記冷却用具の、前記ブロックと前記蓋体との合わせ面同士が面接触する、前記（５）に記載の試料冷却方法。
（７） 前記蓋体が、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置されたとき、前記凹部と対向する部位に、生物試料を収める前記容器の蓋を嵌入するための蓋体凹部が、前記蓋体に設けられている、前記（５）又は（６）に記載の試料冷却方法。
（８） 複数個の前記凹部、及び複数個の前記蓋体凹部を備え、
前記蓋体凹部は、前記ブロックの複数の前記凹部と対向する位置のそれぞれに対して個別に形成されている、前記（７）に記載の試料冷却方法。
（９） 前記ブロックの凹部の内部空間収容後における、前記生物試料を含む冷却対象物の、０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度が、２０℃／分以上である、前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の試料冷却方法。
（１０） 前記ブロックを構成する前記材料の熱伝導率が、５０Ｗ／ｍ・Ｋ以上である、前記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の試料冷却方法。
（１１） 前記生物試料をガラス化させる、前記（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の試料冷却方法。
（１２） 前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の試料冷却方法により、前記生物試料を冷却し、前記生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法。
（１３） 前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の試料冷却方法に用いられる冷却用具であって、
生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックを備え、
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具。
（１４） 前記凹部の内部空間と、前記ブロックを構成する材料とで占められた部分の総和である前記ブロックの総体積に対する、前記凹部の内部空間の総体積が、３０体積％以下である、前記（１３）に記載の冷却用具。
（１５） 前記ブロックの質量が、３００ｇ以上である、前記（１３）又は（１４）に記載の冷却用具。
（１６） 更に、前記凹部を覆う蓋体を備え、前記蓋体は、金属又は金属を含有する材料から構成されている、前記（１３）〜（１５）のいずれか一つに記載の冷却用具。
（１７） 前記蓋体が、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置されたとき、前記凹部と対向する部位に、生物試料を収める前記容器の蓋を嵌入するための蓋体凹部が、前記蓋体に設けられている、前記（１６）に記載の冷却用具。
（１８） 複数個の前記凹部、及び複数個の前記蓋体凹部を備え、
前記蓋体凹部は、前記ブロックの複数の前記凹部と対向する位置のそれぞれに対して個別に形成されている、前記（１７）に記載の冷却用具。
（１９） 前記蓋体の質量が、２００ｇ以上である、前記（１６）〜（１８）のいずれか一つに記載の冷却用具。
（２０） 前記冷却用具の、前記ブロックと前記蓋体との合わせ面同士が面接触する、前記（１６）〜（１９）のいずれか一つに記載の冷却用具。
（２１） 前記ブロックを構成する前記材料の熱伝導率が、５０Ｗ／ｍ・Ｋ以上である、前記（１３）〜（２０）のいずれか一つに記載の冷却用具。
(1) Provided with a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample.
The block uses a cooling tool, which is made of metal or a material containing metal.
A sample cooling method for cooling the biological sample, which comprises the following steps:
A block cooling step of cooling the block to a temperature of −60 ° C. or lower, and a container for containing a biological sample are fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower to fit into the internal space of the recess. A sample storage process in which a biological sample is placed.
(2) The total volume of the internal space of the recess is 30% by volume or less with respect to the total volume of the block, which is the sum of the internal space of the recess and the portion occupied by the material constituting the block. The sample cooling method according to (1).
(3) The mass ratio of the block (mass of the object to be cooled: mass of the block) to the mass of the object to be cooled containing the biological sample contained in the container is 1: 10 to 1: 100,000. The sample cooling method according to (1) or (2) above.
(4) The sample cooling method according to any one of (1) to (3) above, wherein the mass of the block is 300 g or more.
(5) Further, the cooling tool is used, which is provided with a lid covering the recess, and the lid is made of metal or a material containing metal.
A sample cooling method according to any one of (1) to (4) above, which comprises the following steps:
A block cooling step, in which the block is cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
A lid cooling step of cooling the lid to a temperature of −60 ° C. or lower,
After the sample storage step and the sample storage step, in which a container for storing a biological sample is fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower and the biological sample is placed in the internal space of the recess, − A lid installation step of installing the lid cooled to a temperature of 60 ° C. or lower on the block so as to cover the recess.
(6) The sample cooling method according to (5) above, wherein the mating surfaces of the block and the lid of the cooling tool come into surface contact with each other.
(7) When the lid body is installed on the block so as to cover the recessed portion, the lid recessed portion for fitting the lid of the container for storing the biological sample into the portion facing the recessed portion is the lid. The sample cooling method according to (5) or (6) above, which is provided on the body.
(8) A plurality of the recesses and a plurality of the lid recesses are provided.
The sample cooling method according to (7) above, wherein the lid recesses are individually formed for each of a plurality of positions of the block facing the recesses.
(9) The cooling rate of the object to be cooled including the biological sample in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. after being accommodated in the internal space of the recess of the block is 20 ° C./min or more. The sample cooling method according to any one of (8).
(10) The sample cooling method according to any one of (1) to (9) above, wherein the material constituting the block has a thermal conductivity of 50 W / m · K or more.
(11) The sample cooling method according to any one of (1) to (10) above, which vitrifies the biological sample.
(12) Production of a cooled product of a biological sample, which comprises cooling the biological sample by the sample cooling method according to any one of (1) to (11) above to obtain a cooled product of the biological sample. Method.
(13) A cooling tool used in the sample cooling method according to any one of (1) to (11) above.
It is equipped with a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample.
The block is a cooling tool made of metal or a material containing metal.
(14) The total volume of the internal space of the recess is 30% by volume or less with respect to the total volume of the block, which is the sum of the internal space of the recess and the portion occupied by the material constituting the block. The cooling tool according to (13) above.
(15) The cooling tool according to (13) or (14) above, wherein the mass of the block is 300 g or more.
(16) The cooling tool according to any one of (13) to (15), further comprising a lid covering the recess, the lid being made of metal or a metal-containing material. ..
(17) When the lid body is installed on the block so as to cover the recessed portion, the lid recessed portion for fitting the lid of the container for storing the biological sample into the portion facing the recessed portion is the lid. The cooling tool according to (16) above, which is provided on the body.
(18) A plurality of the recesses and a plurality of the lid recesses are provided.
The cooling tool according to (17), wherein the lid recess is individually formed for each of a plurality of positions of the block facing the recess.
(19) The cooling tool according to any one of (16) to (18) above, wherein the weight of the lid is 200 g or more.
(20) The cooling tool according to any one of (16) to (19), wherein the mating surfaces of the block and the lid of the cooling tool are in surface contact with each other.
(21) The cooling tool according to any one of (13) to (20) above, wherein the material constituting the block has a thermal conductivity of 50 W / m · K or more.
本発明によれば、生物試料の汚染を防止し生物試料を冷却できる、試料冷却方法、冷却物の製造方法及び冷却用具を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a sample cooling method, a method for producing a cooled product, and a cooling tool capable of preventing contamination of a biological sample and cooling the biological sample.
以下、適宜図面を参照しながら、本発明の一実施形態に係る試料冷却方法、冷却物の製造方法及び冷却用具を説明する。 Hereinafter, a sample cooling method, a method for producing a cooled product, and a cooling tool according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings as appropriate.
≪冷却用具≫
実施形態の冷却用具は、実施形態の試料冷却方法に用いられる冷却用具であって、生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックを備え、前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されているものである。
実施形態の試料冷却方法については後述する。
≪Cooling equipment≫
The cooling tool of the embodiment is a cooling tool used in the sample cooling method of the embodiment, and includes a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample, and the block contains a metal or a metal. It is composed of materials to be used.
The sample cooling method of the embodiment will be described later.
＜第１実施形態＞
図１は、実施形態の冷却用具１Ａの構成を示す斜視図及び断面図である。冷却用具１Ａは、ブロック１０を備える。ブロック１０には、生物試料を収める容器を嵌入するための凹部Ｃが設けられている。凹部Ｃは、円柱状のブロック１０の上面の中央部に形成されており、上方に開口している。ブロック１０は凹部Ｃを取り囲む側壁部１１及び底部１２を有する。
<First Embodiment>
FIG. 1 is a perspective view and a cross-sectional view showing the configuration of the
なお、ここでは、ブロック１０の形状は円柱状のものを例示しているが、ブロックの形状は特に制限されず、多角柱状、球状等の形状であってもよい。冷却用具をテーブルなどの台の上に置いて利用するときの安定性などを考慮すると、ブロックの形状は底面が平坦な形状が好ましく、ブロックの形状は柱体であることがより好ましい。
Although the shape of the
ブロック１０は、金属又は金属を含有する材料から構成されている。ブロックが当該材料から構成されることで、ブロックの熱伝導率が高められ、生物試料の冷却速度が向上し、生物試料を状態よく冷却（例えば、物理状態的にはガラス化）することができる。生物試料の冷却速度が速いほど、生物試料の保存状態が向上する傾向にある。
ブロックを構成する金属としては、特に制限されるものではなく、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、鉄、ステンレス、これらを含む合金等が挙げられる。金属は、１種を単独で用いてもよく、２種類以上を組合せて用いてもよい。熱伝導率が高く、且つ加工及び入手が容易である点からは、金属としては、銅又はアルミニウムが好ましい。ブロックの熱伝導率を高め、生物試料の冷却速度をより一層向上可能であるとの観点からは、金属としては、銅がより好ましい。
金属を含有する材料における当該金属としては、特に制限されるものではなく、一例として、上記の金属として例示したものが挙げられる。ブロックを構成する材料の総質量に対する金属の含有割合は５０質量％以上であってよく、８０質量％以上であってよく、９０質量％以上であってよい。金属を含有する材料としては、熱伝導率を向上させる観点から、炭素繊維及び金属を含む材料が好ましい。
The
The metal constituting the block is not particularly limited, and examples thereof include copper, aluminum, gold, silver, iron, stainless steel, and alloys containing these. As the metal, one type may be used alone, or two or more types may be used in combination. Copper or aluminum is preferable as the metal from the viewpoint of high thermal conductivity and easy processing and availability. Copper is more preferable as the metal from the viewpoint that the thermal conductivity of the block can be increased and the cooling rate of the biological sample can be further improved.
The metal in the material containing the metal is not particularly limited, and examples thereof include those exemplified as the above-mentioned metal. The content ratio of the metal to the total mass of the materials constituting the block may be 50% by mass or more, 80% by mass or more, and 90% by mass or more. As the material containing metal, a material containing carbon fiber and metal is preferable from the viewpoint of improving thermal conductivity.
ブロックを構成する材料の熱伝導率は、５０Ｗ／ｍ・Ｋ以上であることが好ましく、８０Ｗ／ｍ・Ｋ以上であることがより好ましく、２００Ｗ／ｍ・Ｋ以上であることがさらに好ましく、３００Ｗ／ｍ・Ｋ以上であることが特に好ましい。前記材料の熱伝導率が上記下限値以上であることにより、生物試料の冷却速度が向上し、生物試料を状態よく冷却させることができる。
ブロックを構成する材料の熱伝導率の上限値は特に制限されるものではなく、例えば、５０００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、１０００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、８００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、５００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよい。
上記熱伝導率の数値範囲の一例としては、例えば、５０Ｗ／ｍ・Ｋ以上５０００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、８０Ｗ／ｍ・Ｋ以上１０００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、２００Ｗ／ｍ・Ｋ以上８００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよく、３００Ｗ／ｍ・Ｋ以上５００Ｗ／ｍ・Ｋ以下であってもよい。
ブロックを構成する材料の熱伝導率は、ＡＳＴＭ Ｅ１５３０に準拠して測定された値を採用できる。
The thermal conductivity of the material constituting the block is preferably 50 W / m · K or more, more preferably 80 W / m · K or more, further preferably 200 W / m · K or more, and 300 W. It is particularly preferable that it is / m · K or more. When the thermal conductivity of the material is at least the above lower limit value, the cooling rate of the biological sample is improved, and the biological sample can be cooled in a good state.
The upper limit of the thermal conductivity of the material constituting the block is not particularly limited, and may be, for example, 5000 W / m · K or less, 1000 W / m · K or less, or 800 W / m. -It may be K or less, and it may be 500 W / m · K or less.
As an example of the numerical range of the thermal conductivity, for example, it may be 50 W / m · K or more and 5000 W / m · K or less, or 80 W / m · K or more and 1000 W / m · K or less. It may be 200 W / m · K or more and 800 W / m · K or less, or 300 W / m · K or more and 500 W / m · K or less.
As the thermal conductivity of the material constituting the block, a value measured according to ASTM E1530 can be adopted.
ブロックの質量は、例えば、４ｇ以上であってよく、３００ｇ以上であってよく、５００ｇ以上であってよく、７００ｇ以上であってよく、１０００ｇ以上であってよく、１３００ｇ以上であってよい。ブロックの質量が大きいほど、ブロックの冷却及び蓄冷の効果が高まり、冷却効率及び冷却安定性が向上する。
ブロックの質量の上限に特に制限はないが、ブロックの取り扱いを容易とする観点から、５０００ｇ以下であってよく、４０００ｇ以下であってよく、３５００ｇ以下であってよく、２５００ｇ以下であってよく、２０００ｇ以下であってよい。
上記のブロックの質量の数値範囲の一例としては、４ｇ以上５０００ｇ以下であってよく、３００ｇ以上４０００ｇ以下であってよく、５００ｇ以上３５００ｇ以下であってよく、７００ｇ以上２５００ｇ以下であってよく、１０００ｇ以上２０００ｇ以下であってよく、１３００ｇ以上２０００ｇ以下であってよい。
The mass of the block may be, for example, 4 g or more, 300 g or more, 500 g or more, 700 g or more, 1000 g or more, and 1300 g or more. The larger the mass of the block, the more effective the cooling and cold storage of the block, and the better the cooling efficiency and cooling stability.
The upper limit of the mass of the block is not particularly limited, but from the viewpoint of facilitating the handling of the block, it may be 5000 g or less, 4000 g or less, 3500 g or less, or 2500 g or less. It may be 2000 g or less.
As an example of the numerical range of the mass of the above block, it may be 4 g or more and 5000 g or less, 300 g or more and 4000 g or less, 500 g or more and 3500 g or less, 700 g or more and 2500 g or less, and 1000 g. It may be 2000 g or more and 2000 g or less, and may be 1300 g or more and 2000 g or less.
ここでいう「冷却安定性」とは、ブロックが冷却処理されていないとき、前記凹部の内部空間の生物試料の温度変化が生じ難いことを意味する。冷却安定性に優れることで、冷却された生物試料の品質が向上する。また、冷却方法における冷却用具の扱いを簡便なものとできる。 The term "cooling stability" as used herein means that when the block is not cooled, the temperature of the biological sample in the internal space of the recess is unlikely to change. Excellent cooling stability improves the quality of cooled biological samples. In addition, the handling of the cooling tool in the cooling method can be simplified.
ブロックは、その凹部の内壁面１０ｃの表面の少なくとも一部、好ましくは全部において、金属又は金属を含有する材料が露出していることが好ましい。該材料がブロックの凹部の内壁面に露出していることで、生物試料からの吸熱が良好となり、生物試料を効率よく冷却できる。
またブロックは、その側壁部及び／又は底部の表面の少なくとも一部、或いは全部において、金属又は金属を含有する材料が露出していることが好ましい。このような構成とすることで、ブロックの上記の露出部分に液体窒素や冷凍庫内の冷気などが接触し、ブロック自体を効率よく冷却できる。
The block preferably has a metal or a metal-containing material exposed on at least a part, preferably all of the surface of the
Further, it is preferable that the metal or the material containing the metal is exposed on at least a part or all of the surface of the side wall portion and / or the bottom portion of the block. With such a configuration, liquid nitrogen, cold air in the freezer, and the like come into contact with the exposed portion of the block, and the block itself can be efficiently cooled.
実施形態の冷却用具は、前記凹部の内部空間の総体積に対し、金属又は金属を含有する材料から構成されるブロックの体積が大きいことが好ましい。このような構成とすることで、凹部の内部空間を冷却できるブロックの冷却及び蓄冷の効果が高まり、冷却効率及び冷却安定性が向上する。
非特許文献１等に示される従来の用具では、板状の部材を組み合わせるか、板状の材料を成型して作製されたものであり、その材料が占める体積が低くなるよう設計されている。このような用具は、前記凹部の内部空間の総体積に対し、材料の総体積が小さいものである。これは、従来の用具には、生物試料の冷却効率や冷却安定性を向上させたり、冷却速度を向上させたりする目的はなく、必要な材料を少なくしてコストを抑えることや、軽量化の面が重視されているためと考えられる。
In the cooling tool of the embodiment, it is preferable that the volume of the block made of metal or a metal-containing material is larger than the total volume of the internal space of the recess. With such a configuration, the effect of cooling and storing cold of the block capable of cooling the internal space of the recess is enhanced, and the cooling efficiency and cooling stability are improved.
The conventional tools shown in
実施形態のブロックは、ブロックの凹部の内壁面と底部表面との間の空間、及びブロックの凹部の内壁面と側壁部表面との間の空間が、金属又は金属を含有する材料で占められていることが好ましい。 In the block of the embodiment, the space between the inner wall surface of the recess of the block and the bottom surface and the space between the inner wall surface of the recess of the block and the surface of the side wall are occupied by metal or a material containing metal. It is preferable to have.
上記の事柄を考慮し、実施形態の冷却用具は、前記ブロックの総体積に対する、前記凹部の内部空間の総体積が、３０体積％以下であることが好ましく、１体積％以上３０体積％以下であることが好ましく、５体積％以上２５体積％以下であることがより好ましく、１０体積％以上２３体積％以下であることがさらに好ましい。
ここでブロックの総体積とは、凹部の内部空間と、ブロックを構成する材料とで占められた部分の総和を指す。ブロックが複数の凹部を有する場合、凹部の内部空間の総体積とは、１個のブロックが有する全ての凹部の内部空間の総和を指す。
また、凹部の内部空間は、ブロックの上面（凹部の開口部が形成されている面）に沿って凹部の開口部を区画する面と凹部の内壁面とで囲まれた部分とすることができる。
In consideration of the above matters, in the cooling tool of the embodiment, the total volume of the internal space of the recess is preferably 30% by volume or less with respect to the total volume of the block, and is 1% by volume or more and 30% by volume or less. It is preferably 5% by volume or more and 25% by volume or less, and further preferably 10% by volume or more and 23% by volume or less.
Here, the total volume of the block refers to the total volume of the portion occupied by the internal space of the recess and the material constituting the block. When the block has a plurality of recesses, the total volume of the internal space of the recess refers to the sum of the internal spaces of all the recesses of one block.
Further, the internal space of the recess can be a portion surrounded by a surface for partitioning the opening of the recess and an inner wall surface of the recess along the upper surface of the block (the surface on which the opening of the recess is formed). ..
前記凹部の形状は、容器を嵌入可能なよう該容器の形状を考慮して適宜定めることができる。例えば、凹部の開口部の平面視形状は円形状であってよい。凹部の形状は、容器内のサンプルの冷却効率を高めるため、嵌入される容器と凹部の内壁面１０ｃとの間に生じ得る間隙ができるだけ小さくなるような構成とすることが好ましく、凹部の形状と、凹部に嵌入する容器の生物試料を収容する部分の外形状とを、略同一とすることができる。
The shape of the recess can be appropriately determined in consideration of the shape of the container so that the container can be fitted. For example, the plan view shape of the opening of the recess may be circular. The shape of the recess is preferably configured so that the gap that may occur between the container to be fitted and the
前記凹部の内径Ｌ１は、凹部に嵌入する容器の形状や大きさ等を考慮して適宜定めることができ、例えば、５〜５０ｍｍであってもよく、７〜４０ｍｍであってもよく、８〜１７ｍｍであってもよく、１０〜１４ｍｍであってもよい。ここで、凹部の内径とは、凹部の内径のうちの、最大値を採用することができる。 The inner diameter L1 of the recess can be appropriately determined in consideration of the shape and size of the container to be fitted into the recess, and may be, for example, 5 to 50 mm, 7 to 40 mm, or 8 to 8. It may be 17 mm or 10 to 14 mm. Here, as the inner diameter of the recess, the maximum value of the inner diameter of the recess can be adopted.
図２は、実施形態の冷却用具１Ａ’の構成を示す断面図及び上面図である。冷却用具１Ａ’では、凹部Ｃの形状が、生物試料を収める容器の形状に合わせて、深さ方向に向かうにしたがって内径が狭くなるよう形成されている。このような形状の凹部の内径の最大値は、図２におけるＬ１となる。
凹部に生物試料を収める容器を嵌入することを考慮すると、凹部の内径の最大値は、通常、凹部の開口部の内径と一致する。このような場合、凹部の内径を、凹部の開口部の直径と読みかえてもよい。
FIG. 2 is a cross-sectional view and a top view showing the configuration of the cooling tool 1A'of the embodiment. In the
Considering that a container for containing a biological sample is fitted in the recess, the maximum inner diameter of the recess usually coincides with the inner diameter of the opening of the recess. In such a case, the inner diameter of the recess may be read as the diameter of the opening of the recess.
なお、凹部の平面視形状が真円でない場合には、これらの内径とは、その形状を面積基準にて真円換算した値を採用できる。 When the plan view shape of the concave portion is not a perfect circle, these inner diameters can be a value obtained by converting the shape into a perfect circle based on the area.
凹部の深さは、生物試料を収める容器の形状等を考慮して適宜定めることができ、例えば、１０〜１００ｍｍであってもよく、１５〜５０ｍｍであってもよく、３０〜４０ｍｍであってもよい。 The depth of the recess can be appropriately determined in consideration of the shape of the container for containing the biological sample, and may be, for example, 10 to 100 mm, 15 to 50 mm, or 30 to 40 mm. May be good.
実施形態の冷却用具において、前記１つの凹部あたりの内部空間の体積は、生物試料を収める容器に応じて適宜定めればよいが、一例として、０．１〜１００ｃｍ３であってよく、１〜５０ｃｍ３であってよく、２〜１０ｃｍ３であってよい。 In the cooling tool of the embodiment, the volume of the internal space per recess may be appropriately determined according to the container in which the biological sample is stored , but as an example, it may be 0.1 to 100 cm 3 , and 1 to 1 may be a 50cm 3, it may be a 2~10cm 3.
生物試料に対する冷却の安定性を高めるとの観点から、ブロックの側壁部１１は、ある程度の厚さを有することが好ましい。
側壁部の厚さの最小値Ｌ２は、例えば、１〜１５０ｍｍであってもよく、３〜１００ｍｍであってもよく、６〜１０ｍｍであってもよい。
一例として、凹部の内径Ｌ１に対する側壁部の厚さの最小値Ｌ２の比、（Ｌ１：Ｌ２）が、１：３０〜３０：１であってもよく、１：１５〜１５：１であってもよく、１：５〜５：１であってもよい。
From the viewpoint of enhancing the cooling stability with respect to the biological sample, the
The minimum value L2 of the thickness of the side wall portion may be, for example, 1 to 150 mm, 3 to 100 mm, or 6 to 10 mm.
As an example, the ratio of the minimum value L2 of the thickness of the side wall portion to the inner diameter L1 of the recess, (L1: L2) may be 1:30 to 30: 1, and may be 1: 15 to 15: 1. It may be 1: 5 to 5: 1.
同様に、生物試料に対する冷却の安定性を高めるとの観点から、ブロックの底部１２は、ある程度の厚さを有することが好ましい。
図２に示す冷却用具１Ａ’において、底部１２は、破線で示す領域内部分となる。
底部の厚さの最小値Ｌ３は、例えば、１〜３０ｍｍであってもよく、２〜１５ｍｍであってもよく、３〜７ｍｍであってもよい。
一例として、凹部の内径Ｌ１に対する底部の厚さの最小値Ｌ３の比、（Ｌ１：Ｌ３）が、１：３０〜３０：１であってもよく、１：１５〜１５：１であってもよく、１：５〜５：１であってもよい。
Similarly, the bottom 12 of the block preferably has a certain thickness from the viewpoint of enhancing the cooling stability with respect to the biological sample.
In the cooling tool 1A'shown in FIG. 2, the
The minimum value L3 of the bottom thickness may be, for example, 1 to 30 mm, 2 to 15 mm, or 3 to 7 mm.
As an example, the ratio of the minimum value L3 of the bottom thickness to the inner diameter L1 of the recess, (L1: L3), may be 1:30 to 30: 1, or 1: 15 to 15: 1. It may be 1: 5 to 5: 1.
なお、後述のように、ブロックが複数の凹部を有する場合には、側壁部の厚さ等の数値は、隣り合う凹部との間の距離を基準としてブロックを等分割したと仮定して算出すればよい。 As will be described later, when the block has a plurality of recesses, the numerical values such as the thickness of the side wall portion should be calculated on the assumption that the blocks are equally divided based on the distance between the adjacent recesses. Just do it.
実施形態の冷却用具によれば、生物試料の冷却の冷却効果と冷却安定性が良好であり、それを用いた試料冷却方法により、生物試料の汚染を効果的に防止できる。 According to the cooling tool of the embodiment, the cooling effect and cooling stability of cooling the biological sample are good, and the sample cooling method using the cooling effect can effectively prevent the contamination of the biological sample.
＜第２実施形態＞
実施形態の冷却用具は、更に、前記凹部を覆う蓋体を備え、前記蓋体は、金属又は金属を含有する材料から構成されていることが好ましい。
図３は、実施形態の冷却用具１Ｂの構成を示す斜視図及び断面図である。冷却用具１Ｂは、冷却用具１Ａが、更に、凹部Ｃを覆う蓋体２０を備えたものである。蓋体２０は、金属又は金属を含有する材料から構成されている。
<Second Embodiment>
The cooling tool of the embodiment further includes a lid covering the recess, and the lid is preferably made of metal or a metal-containing material.
FIG. 3 is a perspective view and a cross-sectional view showing the configuration of the
その他の構成は上記の冷却用具１Ａと同様であり、上記第１実施形態の冷却用具１Ａと同様の構成を有する部分については詳細な説明を省略する。
Other configurations are the same as those of the
蓋体２０は着脱自在であり、蓋体２０には、生物試料を収める前記容器の蓋を嵌入するための蓋体凹部Ｃ’が、設けられている。蓋体凹部Ｃ’は、蓋体２０が凹部Ｃを覆うようブロック１０の上方に配置されたとき、凹部Ｃと対向する部位に設けられている。蓋体２０は、蓋体凹部Ｃ’を取り囲む蓋体側壁部２１及び天板部２２を有する。
The
冷却用具１Ｂによれば、蓋体２０を備えることにより、蓋体２０を有さない冷却用具に比べ、蓋体によって生物試料を取り囲むことで生物試料の冷却速度をより向上可能であるとともに、蓋体部分における蓄冷の効果が高まり、冷却の安定性についても、より一層向上させることができる。
According to the
蓋体２０は、ブロック１０上に設置されたとき、蓋体側壁部２１とブロックの側壁部１１との少なくとも一部が接触するような構成とすることが好ましい。このような構成とすることで、ブロック１０と蓋体２０との間で熱移動が生じ、冷却された蓋体２０による生物試料の冷却に対する寄与が大きくなる。また、生物試料が蓋体及びブロックによって覆われるので、冷却の安定性をより一層向上させることができる。
When the
冷却用具１Ｂにおいては、ブロック１０上に蓋体を設置すると、ブロック１０の上面であり蓋体２０との合わせ面１０ａ（凹部の開口部が形成されている面）と、蓋体２０のブロック１０との合わせ面２０ａ（蓋体凹部の開口部が形成されている面）と、が面接触する。このような構成とすることで、合わせ面１０ａ，２０ａを介した熱移動の効率がさらに向上し、冷却された蓋体２０による生物試料の冷却に対する寄与がさらに大きくなる。それにより、生物試料の冷却速度をより一層向上させ、生物試料を状態よく冷却できる。また、生物試料が蓋体及びブロックによって密閉されるので、冷却の安定性をより一層向上させることができる。
In the
合わせ面１０ａと合わせ面２０ａとの面接触部分は、ブロック１０の上面のうち凹部Ｃが形成されていない部分の面積１００面積％に対して、５０面積％以上１００面積％以下であってよく、８０面積％以上１００面積％以下であってよく、９０面積％以上１００面積％以下であってよい。
The surface contact portion between the
蓋体を構成する材料、蓋体を構成する材料の熱伝導率については、上記ブロックにおいて例示したものを採用できる。
ブロックを構成する材料と、蓋体を構成する材料とは、同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
As for the material constituting the lid and the thermal conductivity of the material constituting the lid, those exemplified in the above block can be adopted.
The material constituting the block and the material constituting the lid may be the same or different from each other.
蓋体の質量は、例えば、３ｇ以上であってよく、１００ｇ以上であってよく、２００ｇ以上であってよく、７００ｇ以上であってよい。蓋体の質量が大きいほど、蓋体の冷却及び蓄冷の効果が高まり、冷却効率及び冷却安定性が向上する。
蓋体の質量の上限に特に制限はないが、蓋体の取り扱いを容易とする観点から、４０００ｇ以下であってよく、３０００ｇ以下であってよく、２０００ｇ以下であってよく、１５００ｇ以下であってよい。
上記の蓋体の質量の数値範囲の一例としては、３ｇ以上４０００ｇ以下であってよく、１００ｇ以上３０００ｇ以下であってよく、２００ｇ以上２０００ｇ以下であってよく、７００ｇ以上１５００ｇ以下であってよい。
The mass of the lid may be, for example, 3 g or more, 100 g or more, 200 g or more, and 700 g or more. The larger the mass of the lid body, the higher the effect of cooling and storing the cold body of the lid body, and the better the cooling efficiency and the cooling stability.
The upper limit of the mass of the lid is not particularly limited, but from the viewpoint of facilitating the handling of the lid, it may be 4000 g or less, 3000 g or less, 2000 g or less, and 1500 g or less. good.
As an example of the numerical range of the mass of the lid, it may be 3 g or more and 4000 g or less, 100 g or more and 3000 g or less, 200 g or more and 2000 g or less, and 700 g or more and 1500 g or less.
蓋体は、蓋体凹部の内壁面２０ｃの表面の少なくとも一部、好ましくは全部において、金属又は金属を含有する材料が露出していることが好ましい。該材料が蓋体の蓋体凹部の内壁面に露出していることで、生物試料からの吸熱が良好となり、生物試料を効率よく冷却できる。
また、蓋体はその蓋体側壁部及び／又は天板部の表面の少なくとも一部、好ましくは全部において、金属又は金属を含有する材料が露出していることが好ましい。このような構成とすることで、蓋体の上記の露出部分に液体窒素や冷凍庫の冷気などが接触し、蓋体自体を効率よく冷却できる。
The lid preferably has a metal or a metal-containing material exposed on at least a part, preferably all of the surface of the
Further, it is preferable that the metal or the material containing the metal is exposed in at least a part, preferably all of the surface of the side wall portion and / or the top plate portion of the lid body. With such a configuration, liquid nitrogen, cold air from the freezer, or the like comes into contact with the exposed portion of the lid, and the lid itself can be efficiently cooled.
蓋体においても、上記ブロックにおける説明と同様に、前記蓋体凹部の内部空間の総体積に対し、金属又は金属を含有する材料から構成される蓋体の体積が大きいことが好ましい。このような構成とすることで、蓋体による冷却及び蓄冷の効果が高まり、冷却効率及び冷却安定性が向上する。 Also in the lid, it is preferable that the volume of the lid made of metal or a metal-containing material is larger than the total volume of the internal space of the lid recess, as described in the above block. With such a configuration, the effects of cooling and cold storage by the lid are enhanced, and cooling efficiency and cooling stability are improved.
上記の事柄を考慮し、実施形態の蓋体は、蓋体の蓋体凹部の内壁面と天板部との間の空間、及び蓋体の蓋体凹部の内壁面と蓋体側壁部との間の空間が、金属又は金属を含有する材料で占められていることが好ましい。 In consideration of the above matters, the lid body of the embodiment includes a space between the inner wall surface of the lid recess of the lid and the top plate portion, and the inner wall surface of the lid recess of the lid and the side wall portion of the lid. It is preferable that the space between them is occupied by a metal or a material containing a metal.
上記の事柄を考慮し、前記蓋体の総体積に対する、前記蓋体凹部の内部空間の総体積が、３０体積％以下であることが好ましく、１体積％以上３０体積％以下であることが好ましく、５体積％以上２５体積％以下であることがより好ましく、１０体積％以上２０体積％以下であることがさらに好ましい。
ここで蓋体の総体積とは、蓋体凹部の内部空間と、蓋体を構成する材料とで占められた部分の総和を指す。蓋体が複数の蓋体凹部を有する場合、蓋体凹部の内部空間の総体積とは、１個の蓋体が有する全ての蓋体凹部の内部空間の総和を指す。
また、蓋体凹部の内部空間は、蓋体の上面（蓋体凹部の開口部が形成されている面）に沿って蓋体凹部の開口部を区画する面と蓋体凹部の内壁面とで囲まれた部分とすることができる。
In consideration of the above matters, the total volume of the internal space of the lid recess is preferably 30% by volume or less, and preferably 1% by volume or more and 30% by volume or less, based on the total volume of the lid. It is more preferably 5% by volume or more and 25% by volume or less, and further preferably 10% by volume or more and 20% by volume or less.
Here, the total volume of the lid body refers to the total volume of the portion occupied by the internal space of the lid body recess and the material constituting the lid body. When the lid has a plurality of lid recesses, the total volume of the internal space of the lid recesses refers to the sum of the internal spaces of all the lid recesses of one lid.
Further, the internal space of the lid recess is composed of a surface for partitioning the opening of the lid recess and an inner wall surface of the lid recess along the upper surface of the lid (the surface on which the opening of the lid recess is formed). It can be an enclosed part.
前記蓋体凹部の形状は、容器の蓋を嵌入可能なよう該容器の蓋の形状を考慮して適宜定めることができる。例えば、蓋体凹部の開口部の平面視形状は円形状であってよい。蓋体凹部の形状は、容器内のサンプルの冷却効率を高めるため、嵌入される容器の蓋と蓋体凹部の内壁面２０ｃとの間に生じ得る間隙ができるだけ小さくなるような構成とすることが好ましく、蓋体凹部の形状と、蓋体凹部に嵌入する容器の蓋の外形状とを、略同一とすることができる。
The shape of the lid recess can be appropriately determined in consideration of the shape of the lid of the container so that the lid of the container can be fitted. For example, the plan view shape of the opening of the lid recess may be circular. The shape of the lid recess is configured so that the gap that may occur between the lid of the container to be fitted and the
一般的に、容器の蓋の外径は容器本体の外径よりも大きいため、蓋体の蓋体凹部の内径は、ブロックの凹部の内径よりも大きくてよい。 Generally, since the outer diameter of the lid of the container is larger than the outer diameter of the container body, the inner diameter of the lid recess of the lid may be larger than the inner diameter of the recess of the block.
前記蓋体凹部の内径Ｌ４は、蓋体凹部に嵌入する容器の蓋の形状や大きさ等を考慮して適宜定めることができ、例えば、５〜６０ｍｍであってもよく、１０〜５０ｍｍであってもよく、１２〜２５ｍｍであってもよい。ここで、蓋体凹部の内径とは、凹部の内径のうちの、最大値を採用することができる。 The inner diameter L4 of the lid recess can be appropriately determined in consideration of the shape and size of the lid of the container to be fitted into the lid recess, and may be, for example, 5 to 60 mm, or 10 to 50 mm. It may be 12 to 25 mm. Here, as the inner diameter of the lid recess, the maximum value of the inner diameter of the recess can be adopted.
図４は、実施形態の冷却用具１Ｂの蓋体の構成を示す断面図及び上面図である。このような形状の蓋体凹部の内径の最大値は、図４におけるＬ４となる。
蓋体凹部に生物試料を収める容器の蓋を嵌入することを考慮すると、蓋体凹部の内径の最大値は、通常、蓋体凹部の開口部の内径と一致する。このような場合、蓋体凹部の内径を、蓋体凹部の開口部の直径と読みかえてもよい。
FIG. 4 is a cross-sectional view and a top view showing the configuration of the lid of the
Considering that the lid of the container for containing the biological sample is fitted into the lid recess, the maximum inner diameter of the lid recess usually coincides with the inner diameter of the opening of the lid recess. In such a case, the inner diameter of the lid recess may be read as the diameter of the opening of the lid recess.
なお、蓋体凹部の平面視形状が真円でない場合には、これらの内径とは、その形状を面積基準にて真円換算した値を採用できる。 When the plan-view shape of the recess of the lid is not a perfect circle, these inner diameters can be a value obtained by converting the shape into a perfect circle based on the area.
蓋体凹部の深さは、生物試料を収める容器の蓋の形状等を考慮して適宜定めることができ、例えば、５〜５０ｍｍであってもよく、７〜３０ｍｍであってもよく、１０〜２０ｍｍであってもよい。 The depth of the lid recess can be appropriately determined in consideration of the shape of the lid of the container for containing the biological sample, and may be, for example, 5 to 50 mm, 7 to 30 mm, or 10 to 10 mm. It may be 20 mm.
実施形態の冷却用具において、前記１つの蓋体凹部あたりの内部空間の体積は、生物試料を収める容器に応じて適宜定めればよいが、一例として、０．１〜３０ｃｍ３であってよく、０．５〜２０ｃｍ３であってよく、１〜１０ｃｍ３であってよい。 In the cooling tool of the embodiment, the volume of the internal space per recess of the one lid may be appropriately determined according to the container in which the biological sample is stored, but as an example, it may be 0.1 to 30 cm 3. may be a 0.5~20cm 3, it may be a 1~10cm 3.
生物試料に対する冷却の安定性を高めるとの観点から、蓋体の蓋体側壁部２１は、ある程度の厚さを有することが好ましい。
蓋体側壁部の厚さの最小値Ｌ５は、例えば、１〜１５０ｍｍであってもよく、３〜５０ｍｍであってもよく、５〜２０ｍｍであってもよい。
一例として、蓋体凹部の内径Ｌ４に対する側壁部の厚さの最小値Ｌ５の比、（Ｌ４：Ｌ５）が、１：３０〜３０：１であってもよく、１：１５〜１５：１であってもよく、１：５〜５：１であってもよい。
From the viewpoint of enhancing the cooling stability with respect to the biological sample, the lid
The minimum value L5 of the thickness of the side wall portion of the lid may be, for example, 1 to 150 mm, 3 to 50 mm, or 5 to 20 mm.
As an example, the ratio of the minimum value L5 of the thickness of the side wall portion to the inner diameter L4 of the lid recess, (L4: L5) may be 1:30 to 30: 1, and is 1: 15 to 15: 1. It may be 1: 5 to 5: 1.
同様に、生物試料に対する冷却の安定性を高めるとの観点から、蓋体の天板部２２は、ある程度の厚さを有することが好ましい。
図４に示す蓋体２０において、天板部２２は、破線で示す領域内部分となる。
天板部の厚さの最小値Ｌ６は、例えば、１〜３０ｍｍであってもよく、２〜２０ｍｍであってもよく、３〜１５ｍｍであってもよい。
一例として、蓋体凹部の内径Ｌ４に対する天板部の厚さの最小値Ｌ６の比、（Ｌ４：Ｌ６）が、１：３０〜３０：１であってもよく、１：１５〜１５：１であってもよく、１：５〜５：１であってもよい。
Similarly, the
In the
The minimum value L6 of the thickness of the top plate portion may be, for example, 1 to 30 mm, 2 to 20 mm, or 3 to 15 mm.
As an example, the ratio of the minimum value L6 of the thickness of the top plate portion to the inner diameter L4 of the lid recess, (L4: L6) may be 1:30 to 30: 1, and 1:15 to 15: 1. It may be 1: 5 to 5: 1.
なお、後述のように、蓋体が複数の蓋体凹部を有する場合には、蓋体側壁部の厚さ等の数値は、隣り合う蓋体凹部との間の距離を基準として蓋体を等分割したと仮定して算出すればよい。 As will be described later, when the lid has a plurality of lid recesses, the numerical values such as the thickness of the side wall of the lid are based on the distance between the adjacent lid recesses. It may be calculated on the assumption that it is divided.
実施形態の冷却用具によれば、蓋体を備えることで、生物試料の冷却の冷却効果と冷却安定性が向上し、それを用いた試料冷却方法により、生物試料の汚染を効果的に防止できる。 According to the cooling tool of the embodiment, the provision of the lid improves the cooling effect and cooling stability of cooling the biological sample, and the sample cooling method using the lid can effectively prevent the contamination of the biological sample. ..
＜第３実施形態＞
図５は、実施形態の冷却用具の他の例を示す断面図である。冷却用具１Ｃは、四角柱状のブロック１００を備え、ブロック１００には、生物試料を収める容器を嵌入するための凹部Ｃが複数個設けられている。
<Third Embodiment>
FIG. 5 is a cross-sectional view showing another example of the cooling tool of the embodiment. The
その他の構成は上記の冷却用具１Ａと同様であり、上記第１実施形態の冷却用具１Ａと同様の構成を有する部分については詳細な説明を省略する。
Other configurations are the same as those of the
冷却用具１Ｃによれば、複数個の凹部Ｃを備えることにより、多数の生物試料を効率よく冷却することができる。
According to the
ブロック１つあたりの凹部Ｃの個数は、特に制限されるものではないが、一例として、２〜１００個であってよく、５〜５０個であってよく、７〜２０個であってよい。 The number of recesses C per block is not particularly limited, but as an example, it may be 2 to 100, 5 to 50, or 7 to 20.
＜第４実施形態＞
図６は、実施形態の冷却用具の他の例を示す斜視図及び断面図である。冷却用具１Ｄは、冷却用具１Ｃが、凹部Ｃを覆う蓋体２００を備えたものである。
図６に示されるように、冷却用具１Ｄの蓋体凹部Ｃ’は、複数の凹部Ｃと対向する位置にまたがって形成されている。
<Fourth Embodiment>
FIG. 6 is a perspective view and a cross-sectional view showing another example of the cooling tool of the embodiment. In the
As shown in FIG. 6, the lid body recess C'of the
その他の構成は上記の冷却用具１Ｃと同様であり、上記第１実施形態の冷却用具１Ｃと同様の構成を有する部分については詳細な説明を省略する。
Other configurations are the same as those of the
次に、本実施形態の変形例を示す。
図７に示される冷却用具１Ｅでは、蓋体２１０は複数個の蓋体凹部Ｃ’を有し、蓋体凹部Ｃ’は、ブロック１００の複数の凹部Ｃと対向する位置のそれぞれに対して個別に形成されている。このような構成とすることで、各蓋体凹部Ｃ’の周囲に配置された蓋体側壁部２１のそれぞれが、生物試料に対する冷却効果を発揮し、冷却用具１Ｄの蓋体２００に比べ、生物試料に対する冷却効率をより高めることができる。
Next, a modified example of this embodiment is shown.
In the
蓋体１つあたりの蓋体凹部Ｃ’の個数は、特に制限されるものではないが、一例として、２〜１００個であってよく、５〜５０個であってよく、７〜２０個であってよい。 The number of lid recesses C'per one lid is not particularly limited, but as an example, it may be 2 to 100, 5 to 50, or 7 to 20. It may be there.
＜第５実施形態＞
図８は、実施形態の冷却用具の他の例を示す斜視図及び断面図である。冷却用具１Ｆは、四角柱状のブロック１０を備え、ブロック１０の蓋体２０との合わせ面１０ａに第１位置決め部４１が形成され、蓋体２０のブロック１０との合わせ面２０ａに第２位置決め部４２が形成されている。第１位置決め部４１は凸形状を有し、第２位置決め部４２は凹形状を有している。蓋体２０が取り付けられると、第１位置決め部４１と第２位置決め部４２とが互いにかみ合い、ブロック１０と蓋体２０とのずれが防止される。
<Fifth Embodiment>
FIG. 8 is a perspective view and a cross-sectional view showing another example of the cooling tool of the embodiment. The
次に、本実施形態の変形例を示す。
下方と上方に配置される位置決め部の凹凸の組み合わせは逆でもよい。また位置決め部の位置も、特に制限されるものではない。
例えば、図９に示す冷却用具１Ｇのように、第１位置決め部４３は凹形状を有し、第２位置決め部４４は凸形状を有していてもよい。また、それぞれの位置決め部４３，４４は、合わせ面１０ａ，２０ａの周縁部に沿って形成されている。
Next, a modified example of this embodiment is shown.
The combination of the unevenness of the positioning portion arranged below and above may be reversed. Further, the position of the positioning portion is not particularly limited.
For example, as in the
上記で説明した実施形態の冷却用具は、下記の実施形態の試料冷却方法に好適に用いることができる。実施形態の冷却用具によれば、生物試料を高品質に冷却でき、且つ、生物試料の汚染を防止でき、それを簡便に実現することのできる、非常に優れたものである。 The cooling tool of the embodiment described above can be suitably used for the sample cooling method of the following embodiment. According to the cooling tool of the embodiment, the biological sample can be cooled with high quality, the contamination of the biological sample can be prevented, and the biological sample can be easily realized.
≪試料冷却方法≫
＜試料冷却方法の第１実施形態＞
実施形態の試料冷却方法は、実施形態の冷却用具を用い、以下の「ブロック冷却工程」および「試料収容工程」を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法である。
生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックを備え、
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具を用い、
以下の工程を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、及び
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程。
≪Sample cooling method≫
<First Embodiment of Sample Cooling Method>
The sample cooling method of the embodiment is a sample cooling method of cooling the biological sample using the cooling tool of the embodiment, which includes the following “block cooling step” and “sample storage step”.
It is equipped with a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample.
The block uses a cooling tool, which is made of metal or a material containing metal.
A sample cooling method for cooling the biological sample, which comprises the following steps:
A block cooling step of cooling the block to a temperature of −60 ° C. or lower, and a container for containing a biological sample are fitted into a recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower, and a living organism is placed in the internal space of the recess. A sample storage process in which a sample is placed.
実施形態の冷却用具としては、例えば上記実施形態の冷却用具において例示したものが挙げられ、ここでの詳しい説明を省略する。 Examples of the cooling tool of the embodiment include those illustrated in the cooling tool of the above embodiment, and detailed description thereof will be omitted here.
図１０は、本実施形態の試料冷却方法の手順を示す模式図である。以下、図を参照しながら、実施形態の試料冷却方法を説明する。 FIG. 10 is a schematic view showing the procedure of the sample cooling method of the present embodiment. Hereinafter, the sample cooling method of the embodiment will be described with reference to the drawings.
（ブロック冷却工程）
実施形態のブロック冷却工程は、実施形態の冷却用具の前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する工程である。ブロックの冷却方法は特に制限されるものではない。
(Block cooling process)
The block cooling step of the embodiment is a step of cooling the block of the cooling tool of the embodiment to a temperature of −60 ° C. or lower. The cooling method of the block is not particularly limited.
本実施形態では、図１０（ａ）に示すように、冷却用具１Ａのブロック１０の底部１２を、液体窒素５０に接触させる。ブロック冷却工程において、液体窒素が凹部の内壁面１０ｃに直接接触しないよう、ブロックを冷却することが好ましい。そうすることで、液体窒素が、雑菌やマイコプラズマ、他種の細胞の混入等により汚染されている場合であっても、液体窒素に含まれ得る汚染物質が、生物試料を収めている容器に接する機会が失われ、生物試料の汚染を効果的に防止できる。
In this embodiment, as shown in FIG. 10A, the bottom 12 of the
上記冷却されたブロックの温度は、−６０℃以下であり、−７０℃以下であってもよく、−８０℃以下であってもよく、−１００℃以下であってもよく、−１２０℃以下であってもよく、−１７０℃以下であってもよい。上記上限値以下の温度にブロックを冷却することで、後の試料収容工程において凹部の内部空間に入れられた生物試料を、それと同等の温度にまで冷却できる。
上記冷却されたブロックの温度の下限値は、冷却手段や、生物試料が収容される容器の、耐低温性に適した材料の汎用性などを考慮して、−２７３℃以上が好ましく、−２００℃以上がより好ましく、−１９６℃以上がさらに好ましい。
上記冷却されたブロックの温度の数値範囲の一例としては、−２７３℃以上−６０℃以下であってもよく、−２７３℃以上−７０℃以下であってもよく、−２００℃以上−８０℃以下であってもよく、−２００℃以上−１００℃以下であってもよく、−２００℃以上−１２０℃以下であってもよく、−１９６℃以上−１７０℃以下であってもよい。
The temperature of the cooled block is −60 ° C. or lower, may be −70 ° C. or lower, may be −80 ° C. or lower, may be −100 ° C. or lower, and may be −120 ° C. or lower. It may be −170 ° C. or lower. By cooling the block to a temperature equal to or lower than the above upper limit value, the biological sample placed in the internal space of the recess in the subsequent sample accommodating step can be cooled to a temperature equivalent to that.
The lower limit of the temperature of the cooled block is preferably -273 ° C. or higher, preferably -200 ° C., in consideration of the cooling means and the versatility of the material suitable for low temperature resistance of the container in which the biological sample is housed. ℃ or higher is more preferable, and -196 ° C or higher is even more preferable.
As an example of the numerical range of the temperature of the cooled block, it may be -273 ° C or higher and -60 ° C or lower, -273 ° C or higher and -70 ° C or lower, or -200 ° C or higher and -80 ° C. It may be less than or equal to −200 ° C. or higher and −100 ° C. or lower, −200 ° C. or higher and −120 ° C. or lower, or −196 ° C. or higher and −170 ° C. or lower.
ブロックを冷却処理する冷却手段は、特に制限されるものではなく、例えば、液体窒素（沸点：−１９６℃）、ドライアイス（沸点：−７８．５℃）、冷凍庫（例えば、−８５℃以下、−９０℃以下、−１５０℃以下など）等を用いることができる。
ブロック冷却工程において、冷却手段が凹部の内部に接触しないよう、ブロックを冷却することが好ましい。
生物試料の冷却速度を高め、生物試料の保存状態を高めるとの観点からは、ブロックの冷却温度は低いほうが好ましく、上記の冷却手段のなかでは、液体窒素を用いることが好ましい。一方で、より簡便に冷却操作を行うことを重視した場合には、上記の冷却手段のなかでは、ドライアイス又は冷凍庫を用いることが好ましい。
The cooling means for cooling the block is not particularly limited, and for example, liquid nitrogen (boiling point: -196 ° C.), dry ice (boiling point: −78.5 ° C.), freezer (for example, −85 ° C. or lower, -90 ° C or lower, -150 ° C or lower, etc.) can be used.
In the block cooling step, it is preferable to cool the block so that the cooling means does not come into contact with the inside of the recess.
From the viewpoint of increasing the cooling rate of the biological sample and enhancing the storage state of the biological sample, it is preferable that the cooling temperature of the block is low, and among the above cooling means, it is preferable to use liquid nitrogen. On the other hand, when it is important to perform the cooling operation more easily, it is preferable to use dry ice or a freezer among the above cooling means.
上記の冷却手段を用いた場合、実施形態のブロック冷却工程として、例えば、以下の工程を例示できる。
実施形態の冷却用具の前記ブロックを液体窒素又はその冷気に接触させ、−６０℃以下の温度に冷却するブロック冷却工程。
実施形態の冷却用具の前記ブロックをドライアイス又はその冷気に接触させ、−６０℃以下の温度に冷却するブロック冷却工程。
実施形態の冷却用具の前記ブロックを冷凍庫内に入れて、−６０℃以下の温度に冷却するブロック冷却工程。
When the above cooling means is used, the following steps can be exemplified as the block cooling steps of the embodiment.
A block cooling step in which the block of the cooling tool of the embodiment is brought into contact with liquid nitrogen or cold air thereof and cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
A block cooling step in which the block of the cooling tool of the embodiment is brought into contact with dry ice or cold air thereof and cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
A block cooling step in which the block of the cooling tool of the embodiment is placed in a freezer and cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
ブロック冷却工程の実施時間は、ブロックの温度が上記規定の温度以下となるように適宜定めればよい。ブロックの温度が上記規定の温度以下となった後も、さらに冷却の操作を続けてもよい。 The execution time of the block cooling step may be appropriately set so that the temperature of the block is equal to or lower than the above-specified temperature. Even after the temperature of the block becomes equal to or lower than the above-specified temperature, the cooling operation may be continued.
（試料収容工程）
次いで、ブロック冷却工程の後、試料収容工程をおこなう。
実施形態の試料収容工程は、上記冷却工程において−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる工程である。生物試料が前記凹部の内部空間に入れられると、冷却されたブロックよりも高温の生物試料から急速に熱が奪われ、生物試料が急冷される。
(Sample storage process)
Then, after the block cooling step, a sample accommodating step is performed.
The sample accommodating step of the embodiment is a step of inserting a container for accommodating a biological sample into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower in the cooling step, and inserting the biological sample into the internal space of the recess. be. When the biological sample is placed in the internal space of the recess, heat is rapidly removed from the biological sample having a temperature higher than that of the cooled block, and the biological sample is rapidly cooled.
生物試料は、図１０（ｂ）に示すように、予め生物試料６０が収容された容器６２を、凹部Ｃに嵌入してもよく（パターンＡ）、図１２（ｂ）〜（ｃ）に示すように、生物試料６０が収容されていない容器６２を、凹部Ｃに嵌入しておき、次いで、その容器６２内に生物試料６０を収容してもよい（パターンＢ）。
As the biological sample, as shown in FIG. 10 (b), the
上記のパターンＡの場合、実施形態の試料収容工程として、例えば、以下の工程を例示できる。
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部に、生物試料が収容された容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程。
In the case of the above pattern A, for example, the following step can be exemplified as the sample accommodating step of the embodiment.
A sample storage step in which a container containing a biological sample is fitted into a recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower, and the biological sample is placed in the internal space of the recess.
上記のパターンＢの場合、実施形態の試料収容工程として、例えば、以下の工程を例示できる。
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部に、容器を嵌入した後、該容器内に生物試料６０を収容し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程。
In the case of the above pattern B, for example, the following step can be exemplified as the sample accommodating step of the embodiment.
A sample storage step in which a container is fitted into a recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower, the
本明細書において、「生物試料（biological sample）」とは、生物、生物に由来するもの、および生物から採取されたもの全般を指す。生物試料としては、例えば、細胞、細胞塊、スフェロイド、組織、器官、臓器、オルガノイド、受精卵、初期胚、微生物等を含む概念である。これら生物試料における生物種は特に制限されず、バクテリア、菌類、動物、植物、藻類等が挙げられる。 As used herein, the term "biological sample" refers to living organisms, those derived from living organisms, and those collected from living organisms in general. The biological sample is a concept including, for example, cells, cell clusters, spheroids, tissues, organs, organs, organoids, fertilized eggs, early embryos, microorganisms and the like. The species of these biological samples is not particularly limited, and examples thereof include bacteria, fungi, animals, plants, and algae.
細胞の種類は特に制限されるものではないが、好ましくは、生殖細胞、幹細胞等を例示できる。生殖細胞としては、***、精細胞、***細胞、卵細胞、卵母細胞等を例示できる。幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、組織幹細胞等を例示できる。
また、実施形態の試料冷却方法に好適な生物試料として、生体から採取された病理検体を例示できる。
The type of cell is not particularly limited, but germ cells, stem cells and the like can be preferably exemplified. Examples of germ cells include sperm, spermatocytes, spermatocytes, egg cells, and oocytes. Examples of stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and tissue stem cells.
Further, as a biological sample suitable for the sample cooling method of the embodiment, a pathological sample collected from a living body can be exemplified.
生物試料を収める「容器」としては、当分野で通常用いられるものを適宜使用してよく、凍結保存用チューブ（クライオバイアルとも呼ばれる）が好適である。容器は、耐低温性の材料から構成されることが好ましく、当該材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン等を例示できる。 As the "container" for containing the biological sample, a container usually used in the art may be appropriately used, and a cryopreservation tube (also referred to as a cryovial) is suitable. The container is preferably made of a low temperature resistant material, and examples of the material include polypropylene and polyethylene.
より効果的に生物試料を冷却するとの観点から、前記ブロックの凹部に、生物試料が収容される容器を嵌入したとき、容器と凹部内壁面との間に形成される間隙（例えば、図１４の間隙Ｇを参照）の体積が小さいほうが好ましい。例えば、当該間隙の体積は、５００ｍｍ３以下であってよく、４００ｍｍ３以下であってよく、３００ｍｍ３以下であってよい。 From the viewpoint of cooling the biological sample more effectively, when a container containing the biological sample is fitted into the recess of the block, a gap formed between the container and the inner wall surface of the recess (for example, FIG. 14). It is preferable that the volume of the gap G) is small. For example, the volume of the gap may be 500 mm 3 or less, 400 mm 3 or less, and 300 mm 3 or less.
試料収容工程において、生物試料と冷却用具との間で熱交換が生じることを考慮すると、冷却の安定性の向上のため、前記容器内に収められた生物試料を含む冷却対象物の質量に対する、前記ブロックの質量が、大きいほうが好ましい。
冷却対象物としては、前記容器内に収められたものであり、生物試料の他、例えば、後述のガラス化液や、クライオプレート等の冷却補助具等を含む。
上記の事柄を考慮し、前記容器内に収められた生物試料を含む冷却対象物の質量に対する、ブロックの質量比（冷却対象物の質量：ブロックの質量）が、１：１０〜１：１０００００であることが好ましく、１：５０〜１：５００００であることが好ましく、１：１００〜１：１００００であることが好ましい。
Considering that heat exchange occurs between the biological sample and the cooling tool in the sample storage step, in order to improve the cooling stability, the mass of the object to be cooled including the biological sample contained in the container is increased. It is preferable that the mass of the block is large.
The object to be cooled includes the one contained in the container, and includes, for example, a vitrification liquid described later, a cooling aid such as a cryoplate, and the like, in addition to the biological sample.
In consideration of the above matters, the mass ratio of the block (mass of the object to be cooled: mass of the block) to the mass of the object to be cooled including the biological sample contained in the container is 1: 10 to 1: 100,000. It is preferably 1:50 to 1: 50,000, and preferably 1: 100 to 1: 10000.
実施形態の冷却物の製造方法として、実施形態の試料冷却方法により、前記生物試料を冷却し、前記生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法、を例示する。
本発明の一実施形態として、実施形態の試料冷却方法により、前記生物試料を冷却し、生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法を提供できる。
実施形態の冷却物の製造方法として、例えば、実施形態の冷却用具を用い、ブロック冷却工程、及び試料収容工程を含み、前記試料収容工程により前記生物試料を冷却し、生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法を例示する。
当該製造方法における各工程および冷却用具は、試料冷却方法に例示するものが挙げられ、詳細な説明を省略する。
An example of a method for producing a chilled product of an embodiment is a method for producing a chilled product of a biological sample, which comprises cooling the biological sample by the sample cooling method of the embodiment to obtain a chilled product of the biological sample.
As one embodiment of the present invention, it is possible to provide a method for producing a chilled product of a biological sample, which comprises cooling the biological sample to obtain a chilled product of the biological sample by the sample cooling method of the embodiment.
As a method for producing a cooled product of the embodiment, for example, using the cooling tool of the embodiment, the block cooling step and the sample accommodating step are included, and the biological sample is cooled by the sample accommodating step to obtain a cooled product of the biological sample. An example of a method for producing a cooled product of a biological sample, including the above.
Examples of each step and cooling tool in the manufacturing method include those exemplified in the sample cooling method, and detailed description thereof will be omitted.
実施形態の試料冷却方法は、生物試料を冷却し、冷却した生物試料を低温保存する方法として好適に適用可能である。
実施形態の冷却物の製造方法は、得られた冷却物を低温保存する方法に好適に適用可能である。
The sample cooling method of the embodiment is suitably applicable as a method of cooling a biological sample and storing the cooled biological sample at a low temperature.
The method for producing a cooled product of the embodiment is suitably applicable to a method of storing the obtained cooled product at a low temperature.
試料収容工程において、凹部に入れられる前の生物試料の温度は、試料収容工程のブロックよりも高温であればよい。
生物試料を冷却する場合、試料収容工程において、凹部に入れられる前の生物試料は、未冷却状態のものであってよい。試料収容工程において、凹部に入れられる生物試料の温度は、０℃超であってよく、一例として、１℃以上５０℃以下であってよく、５℃以上４０℃以下であってよい。冷却や加熱を伴わない通常の室内操作では、通常、生物試料の温度は室温（１５〜３０℃）と同温である。
In the sample accommodating step, the temperature of the biological sample before being placed in the recess may be higher than that of the block in the sample accommodating step.
When the biological sample is cooled, the biological sample before being placed in the recess in the sample storage step may be in an uncooled state. In the sample accommodating step, the temperature of the biological sample placed in the recess may be more than 0 ° C., for example, 1 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, and 5 ° C. or higher and 40 ° C. or lower. In normal indoor operation without cooling or heating, the temperature of the biological sample is usually the same as room temperature (15-30 ° C).
高品質な状態で生物試料（以下、生物試料として細胞を例示する）を冷却又は凍結するためには、その冷却過程において生物試料内（例えば細胞内）における氷の結晶成長を抑えることが重要となる。細胞内で氷結晶が成長すると、そのことに起因して、細胞内構造に物理的なダメージが生じてしまう。
生物試料の冷却方法として、緩慢凍結法とガラス化法が知られている。緩慢凍結法は、試料を毎分１℃程度（例えば毎分１〜２℃）の温度降下の速度で冷却することで、細胞外に氷晶を形成させて細胞の凍結脱水を行うことで、細胞内での氷の結晶成長が防止される。一方、ガラス化法は、ガラス化液などで処理した生物試料を液体窒素等の寒剤を用いて急速に冷却することで、氷晶が形成されず、ガラス化状態での低温保存がなされる。ガラス化法は、緩慢凍結法と比べて、氷が成長する温度帯を経過する時間が短く、氷結晶の生成による物理的なダメージが与えられ難い。
In order to cool or freeze a biological sample (hereinafter, cells are exemplified as a biological sample) in a high quality state, it is important to suppress the crystal growth of ice in the biological sample (for example, in the cell) during the cooling process. Become. When ice crystals grow inside the cell, it causes physical damage to the intracellular structure.
As a method for cooling a biological sample, a slow freezing method and a vitrification method are known. In the slow freezing method, the sample is cooled at a rate of temperature drop of about 1 ° C. per minute (for example, 1 to 2 ° C. per minute) to form ice crystals outside the cells to freeze and dehydrate the cells. The growth of ice crystals inside the cell is prevented. On the other hand, in the vitrification method, by rapidly cooling a biological sample treated with a vitrifying solution or the like with a cryogen such as liquid nitrogen, ice crystals are not formed and low-temperature storage is performed in a vitrified state. Compared with the slow freezing method, the vitrification method has a shorter time to elapse in the temperature zone in which ice grows, and is less likely to cause physical damage due to the formation of ice crystals.
上記のガラス化法及び緩慢凍結法では、どちらも生物試料がガラス化された生物試料を昇温させると、再び生存状態にでき得るという利点がある。実施形態の試料冷却方法は、いずれの方法にも好適に適用可能である。実施形態の試料冷却方法は、生物試料の冷却により、生物試料をガラス化させる方法として好適である。 Both of the above-mentioned vitrification method and slow freezing method have an advantage that the biological sample can be revived by raising the temperature of the vitrified biological sample. The sample cooling method of the embodiment is suitably applicable to any method. The sample cooling method of the embodiment is suitable as a method of vitrifying the biological sample by cooling the biological sample.
実施形態の試料冷却方法を、生物試料をガラス化させるガラス化法に適用する場合、例えば、試料収容工程に用いられる生物試料を含む冷却対象物として、予めガラス化液に浸漬させて得た組成物を、上記冷却工程において−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部の内部空間に入れることが挙げられる。
ガラス化液に含有される成分としては、公知のものを使用でき、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類；グルコース、フルクトース、トレハロース及びスクロース等の糖類や、ジメチルスルホキシド、ポリリジン、グリシンベタイン、プロリン、フルクタン等が挙げられる。上記の糖類としては、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、多糖類等が挙げられる。ガラス化液としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド、ポリリジン、グリシンベタイン、プロリン、フルクタン、グルコース、フルクトース、トレハロース及びスクロースからなる群から選択される少なくとも一種の化合物を含有するものが挙げられ、これらに限定されない。
When the sample cooling method of the embodiment is applied to a vitrification method for vitrifying a biological sample, for example, a composition obtained by immersing the sample in a vitrifying solution in advance as a cooling object containing the biological sample used in the sample storage step. An object may be placed in the internal space of the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower in the cooling step.
Known components can be used as the components contained in the vitrification solution, for example, alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol and glycerin; sugars such as glucose, fructose, trehalose and sucrose, and dimethylsulfoxide, Examples thereof include polylysine, glycine betaine, proline and fructan. Examples of the above-mentioned saccharides include monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, polysaccharides and the like. The vitrifying solution contains at least one compound selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, glycerin, dimethylsulfoxide, polylysine, glycine betaine, proline, fructan, glucose, fructose, trehalose and sucrose. These include, but are not limited to.
実施形態の試料冷却方法を、緩慢凍結法に適用する場合、緩慢凍結された生物試料を、さらに低温に冷却することを例示できる。例えば試料収容工程に用いられる生物試料として、予め緩慢凍結させた生物試料を、上記冷却工程において−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部の内部空間に入れることが挙げられる。例えば、緩慢凍結装置で緩慢凍結された生物試料を、冷却用具に移し替える（上記冷却工程において−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの凹部の内部空間に入れる）ことができる。緩慢凍結法と実施形態の試料冷却方法を組み合わせることで、生物試料の汚染を防止しつつ、緩慢凍結された生物試料を高品質に低温保存できる。 When the sample cooling method of the embodiment is applied to the slow freezing method, it can be exemplified that the slow frozen biological sample is cooled to a lower temperature. For example, as a biological sample used in the sample accommodating step, a biological sample that has been slowly frozen in advance may be placed in the internal space of the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower in the cooling step. For example, a biological sample that has been slowly frozen by a slow freezing device can be transferred to a cooling tool (put into the internal space of the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower in the cooling step). By combining the slow freezing method and the sample cooling method of the embodiment, the slow frozen biological sample can be stored at low temperature with high quality while preventing contamination of the biological sample.
なお、ガラス化法等を用いずとも、生物試料を急速冷却により凍結させること自体により、氷晶が形成され難く、生物試料を高品質な状態とできる。そのため、実施形態の試料冷却方法は、生物試料を急速に冷却できるという観点からも、優れた方法である。 By freezing the biological sample by rapid cooling without using a vitrification method or the like, ice crystals are less likely to be formed, and the biological sample can be in a high quality state. Therefore, the sample cooling method of the embodiment is also an excellent method from the viewpoint that the biological sample can be cooled rapidly.
例えば、生物試料に含まれる生体分子を解析することを目的とする場合など、昇温後の生物試料の生存を問わない場合などには、緩慢凍結法やガラス化法を用いることは必須ではない。一例として、生物から採取された生物試料を、そのまま試料収容工程に用いられる生物試料として用いることができ、当該生物試料を、汚染を防止しつつ高品質に凍結できる。 For example, when the purpose is to analyze biomolecules contained in a biological sample, or when the survival of the biological sample after temperature rise is not required, it is not essential to use the slow freezing method or the vitrification method. .. As an example, a biological sample collected from an organism can be used as it is as a biological sample used in a sample storage step, and the biological sample can be frozen with high quality while preventing contamination.
生物試料が急速に冷却されることの指標として、前記ブロックの凹部の内部空間収容後における、前記生物試料を含む冷却対象物の、０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度が、２０℃／分以上であってもよく、３０℃／分以上であってもよく、４０℃／分以上であってもよく、５０℃／分以上であってもよく、８０℃／分以上であってもよく、９０℃／分以上であってもよく、１００℃／分以上であってもよく、１３０℃／分以上であってもよく、１４０℃／分以上であってもよく、１５０℃／分以上であってもよく、１６０℃／分以上であってもよく、１７０℃／分以上であってもよく、２００℃／分以上であってもよく、２５０℃／分以上であってもよく、２８０℃／分以上であってもよく、３００℃／分以上であってもよい。
上記生物試料の０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度の上限値は、特に制限されるものではないが、一例として、５００℃／分以下であってもよく、４８０℃／分以下であってもよく、４６０℃／分以下であってもよく、４４０℃／分以下であってもよく、４２０℃／分以下であってもよく、４００℃／分以下であってもよく、３８０℃／分以下であってもよく、３６０℃／分以下であってもよく、３５０℃／分以下であってもよく、３４０℃／分以下であってもよく、３３０℃／分以下であってもよく、３２０℃／分以下であってもよい。
上記の上限値と下限値とは自由に組み合わせることができ、上記生物試料の０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度の数値範囲としては、一例として、２０℃／分以上５００℃／分以下であってもよく、３０℃／分以上５００℃／分以下であってもよく、４０℃／分以上５００℃／分以下であってもよく、５０℃／分以上５００℃／分以下であってもよく、８０℃／分以上５００℃／分以下であってもよく、９０℃／分以上４８０℃／分以下であってもよく、１００℃／分以上４６０℃／分以下であってもよく、１３０℃／分以上４４０℃／分以下であってもよく、１４０℃／分以上４２０℃／分以下であってもよく、１５０℃／分以上４００℃／分以下であってもよく、１６０℃／分以上３８０℃／分以下であってもよく、１７０℃／分以上３６０℃／分以下であってもよく、２００℃／分以上３５０℃／分以下であってもよく、２５０℃／分以上３４０℃／分以下であってもよく、２８０℃／分以上３３０℃／分以下であってもよく、３００℃／分以上３２０℃／分以下であってもよい。冷却速度が上記範囲内であると、冷却された生物試料の品質が向上するため好ましい。
なお、上記の冷却速度の値は、これが冷却時の値であるので、マイナス（−）の値（例えば、２０℃／分以上は、−２０℃／分以上）として扱ってもよい。
上記の冷却速度の値は、０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度の平均値として算出できる。
As an index of the rapid cooling of the biological sample, the cooling rate of the object to be cooled containing the biological sample in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. after being housed in the internal space of the recess of the block is 20 ° C. It may be 50 ° C./min or higher, 30 ° C./min or higher, 40 ° C./min or higher, 50 ° C./min or higher, 80 ° C./min or higher. It may be 90 ° C./min or higher, 100 ° C./min or higher, 130 ° C./min or higher, 140 ° C./min or higher, 150 ° C./min or higher. It may be more than a minute, it may be 160 ° C./min or more, it may be 170 ° C./min or more, it may be 200 ° C./min or more, or it may be 250 ° C./min or more. Well, it may be 280 ° C./min or higher, or 300 ° C./min or higher.
The upper limit of the cooling rate of the above biological sample in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. is not particularly limited, but as an example, it may be 500 ° C./min or less, and at 480 ° C./min or less. It may be 460 ° C./min or less, 440 ° C./min or less, 420 ° C./min or less, 400 ° C./min or less, 380 ° C./min or less. It may be ℃ / min or less, 360 ℃ / min or less, 350 ℃ / min or less, 340 ℃ / min or less, 330 ℃ / min or less. It may be 320 ° C./min or less.
The above upper limit value and lower limit value can be freely combined, and the numerical range of the cooling rate of the biological sample in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. is, for example, 20 ° C./min or more and 500 ° C./min. It may be 30 ° C./min or more and 500 ° C./min or less, 40 ° C./min or more and 500 ° C./min or less, and 50 ° C./min or more and 500 ° C./min or less. It may be 80 ° C./min or more and 500 ° C./min or less, 90 ° C./min or more and 480 ° C./min or less, 100 ° C./min or more and 460 ° C./min or less. It may be 130 ° C./min or more and 440 ° C./min or less, 140 ° C./min or more and 420 ° C./min or less, or 150 ° C./min or more and 400 ° C./min or less. , 160 ° C./min or more and 380 ° C./min or less, 170 ° C./min or more and 360 ° C./min or less, 200 ° C./min or more and 350 ° C./min or less, 250 ° C./min or more. It may be ℃ / min or more and 340 ° C./min or less, 280 ° C./min or more and 330 ° C./min or less, or 300 ° C./min or more and 320 ° C./min or less. When the cooling rate is within the above range, the quality of the cooled biological sample is improved, which is preferable.
Since this is the value at the time of cooling, the above-mentioned cooling rate value may be treated as a negative (−) value (for example, 20 ° C./min or more is −20 ° C./min or more).
The above cooling rate value can be calculated as an average value of the cooling rate in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C.
生物試料の冷却速度を高めることを目的として、試料収容工程における生物試料は、クライオプレート等の冷却補助具に直接又は間接的に付着又は載置されたものであってよい。
生物試料が、冷却補助具に間接的に付着又は載置された形態とは、例えば、ガラス化液、培地、緩衝液など任意の処理液を介して、生物試料が冷却補助具に付着又は載置された形態が挙げられる。
冷却補助具は、前記容器に入れられる大きさであればよいが、上記蓋体を使用することを考慮すると、凹部の内部空間に完全に収容可能な大きさであることが好ましい。冷却補助具は、一例として、金属又は金属を含有する材料から構成される。クライオプレートは、金属又は金属を含有する材料から構成された板を例示できる。金属又は金属を含有する材料とは、上記の冷却用具で例示したものが挙げられる。クライオプレートはその表面に生物試料を載せる窪みを有していてもよい。
For the purpose of increasing the cooling rate of the biological sample, the biological sample in the sample storage step may be directly or indirectly attached or placed on a cooling aid such as a cryoplate.
The form in which the biological sample is indirectly attached or placed on the cooling aid means that the biological sample is attached or placed on the cooling aid via an arbitrary treatment liquid such as a vitrification solution, a medium, or a buffer solution. The placed form can be mentioned.
The cooling aid may have a size that can be put in the container, but considering the use of the lid, it is preferable that the cooling aid has a size that can be completely accommodated in the internal space of the recess. The cooling aid is, for example, composed of a metal or a material containing a metal. The cryoplate can be exemplified as a plate made of metal or a material containing metal. Examples of the metal or the material containing the metal include those exemplified in the above-mentioned cooling tool. The cryoplate may have a recess on its surface on which the biological sample rests.
ブロック冷却工程で冷却されたブロックは、続く試料収容工程を実施するまでの間も低温状態を保つことは容易であるため、試料収容工程においては、ブロックの冷却処理は必須ではない。
試料収容工程において、ブロックの冷却処理を行わないことは、実施形態の冷却方法を簡便に行えるという利点がある。また、冷却手段を伴わないことにより、冷却用具を清浄に保つのが容易となる。例えば、予め冷却された冷却用具を、冷却手段を伴わずに手術室に持ち込み、手術室内で検体試料を冷却することなどにも好適に使用できる。
Since it is easy to keep the block cooled in the block cooling step in a low temperature state until the subsequent sample containing step is performed, the block cooling process is not essential in the sample containing step.
Not performing the cooling treatment of the block in the sample accommodating step has an advantage that the cooling method of the embodiment can be easily performed. In addition, the absence of cooling means makes it easier to keep the cooling equipment clean. For example, a pre-cooled cooling tool can be suitably used for bringing a pre-cooled cooling tool into an operating room without a cooling means and cooling a sample sample in the operating room.
一方、試料収容工程の間、ブロックを冷却処理することは、ブロックの温度をより低温で維持しやすくなるため好ましい。例えば、図１１に示すように、試料収容工程においても、ブロック１０を液体窒素５０又はその冷気に接触させたままとしておいてよい。より高温の生物試料がブロックに収容されると、ブロックが生物試料の熱を吸熱して、ブロックの温度が上昇するが、試料収容工程の間、冷却手段によってブロックを冷却処理することで、生物試料の冷却効果を向上させることができる。
On the other hand, it is preferable to cool the block during the sample accommodating step because the temperature of the block can be easily maintained at a lower temperature. For example, as shown in FIG. 11, the
試料収容工程の凹部の内部空間での、生物試料の温度は、上記冷却されたブロックの温度と同等かそれ以上となる。当該生物試料の温度は、一例として、−２０℃以下であってよく、−５０℃以下であってよく、−６０℃以下であってよく、−７０℃以下であってよく、−８０℃以下であってよく、−１００℃以下であってよく、−１２０℃以下であってよく、−１７０℃以下であってよい。当該生物試料の温度の下限値は、冷却手段等にもよるが、−２７３℃以上であってよく、−２００℃以上であってよく、−１９６℃以上であってよい。
上記生物試料の温度の数値範囲の一例としては、例えば、−２７３℃以上−２０℃以下であってよく、−２７３℃以上−５０℃以下であってよく、−２００℃以上−６０℃以下であってよく、−２００℃以上−７０℃以下であってよく、−１９６℃以上−８０℃以下であってよく、−１９６℃以上−１００℃以下であってよく、−１９６℃以上−１２０℃以下であってよく、−１９６℃以上−１７０℃以下であってよい。
試料収容工程を実施する時間は、適宜定めればよいが、例えば、生物試料の温度が上記温度となるまでとすればよい。
実施形態に係る試料収容工程として、−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れ、前記生物試料を−２７３℃以上−２０℃以下の温度に冷却する、試料収容工程を例示できる。
The temperature of the biological sample in the internal space of the recess in the sample accommodating step is equal to or higher than the temperature of the cooled block. As an example, the temperature of the biological sample may be −20 ° C. or lower, may be −50 ° C. or lower, may be −60 ° C. or lower, may be −70 ° C. or lower, and may be −80 ° C. or lower. It may be −100 ° C. or lower, it may be −120 ° C. or lower, and it may be −170 ° C. or lower. The lower limit of the temperature of the biological sample may be -273 ° C. or higher, -200 ° C. or higher, or -196 ° C. or higher, although it depends on the cooling means and the like.
As an example of the numerical range of the temperature of the biological sample, for example, it may be -273 ° C or higher and -20 ° C or lower, it may be -273 ° C or higher and -50 ° C or lower, and it may be -200 ° C or higher and -60 ° C or lower. It may be -200 ° C or higher and -70 ° C or lower, -196 ° C or higher and -80 ° C or lower, -196 ° C or higher and -100 ° C or lower, and -196 ° C or higher and -120 ° C. It may be less than or equal to, and may be -196 ° C. or higher and -170 ° C. or lower.
The time for carrying out the sample accommodating step may be appropriately determined, but for example, it may be until the temperature of the biological sample reaches the above temperature.
As a sample accommodating step according to the embodiment, a container for accommodating a biological sample is fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower, the biological sample is placed in the internal space of the recess, and the biological sample is placed. An example of a sample accommodating step of cooling to a temperature of -273 ° C. or higher and -20 ° C. or lower can be illustrated.
ここに示す生物試料の温度は、実施形態の冷却物の製造方法に係る、生物試料の冷却物の温度として例示できる。
また、ここに示す生物試料の温度は、後述の試料保存工程で低温保存される冷却後の生物試料又は生物試料の冷却物の温度として例示できる。
The temperature of the biological sample shown here can be exemplified as the temperature of the cooled product of the biological sample according to the method for producing the cooled product of the embodiment.
Further, the temperature of the biological sample shown here can be exemplified as the temperature of the cooled biological sample or the cooled product of the biological sample, which is stored at a low temperature in the sample storage step described later.
なお、試料収容工程において、−６０℃以下の温度に冷却されたブロックとは、生物試料を入れた後のブロックの温度については含まれないものとする。 In the sample storage step, the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower does not include the temperature of the block after the biological sample is placed.
（試料保存工程）
実施形態の試料冷却方法は、試料収容工程の後、生物試料を−６０℃以下の温度で保存する、試料保存工程を、さらに含んでいてもよい。
(Sample storage process)
The sample cooling method of the embodiment may further include a sample storage step of storing the biological sample at a temperature of −60 ° C. or lower after the sample storage step.
生物試料の保存方法としては、当分野で通常用いられている方法を適宜行うことができる。試料収容工程の後、生物試料を収めた容器を冷却用具から取り出して、生物試料を収めた容器を保存してもよい。例えば、１）液体窒素を満たしたタンクの液体窒素中で、該容器を保存すること（液相保存）や、２）タンクの下部に液体窒素が充填されたタンク内で、液体窒素に直接接しないよう、該容器を保存すること（気相保存）、３）冷凍庫内で該容器を保存することなどが挙げられ、生物試料の保存状態を向上させる観点から上記の気相保存が好ましい。 As a method for preserving the biological sample, a method usually used in the art can be appropriately used. After the sample containment step, the container containing the biological sample may be removed from the cooling device and the container containing the biological sample may be stored. For example, 1) storing the container in the liquid nitrogen of a tank filled with liquid nitrogen (liquid phase storage), or 2) directly contacting the liquid nitrogen in a tank filled with liquid nitrogen at the bottom of the tank. Preservation of the container (gas phase preservation), 3) storage of the container in a freezer, and the like are preferable from the viewpoint of improving the preservation state of the biological sample.
又は、試料収容工程の後、生物試料を収めた容器を冷却用具から取り出さず、生物試料を収めた容器が前記凹部に嵌入されたブロックを備える冷却用具のまま、保存することもできる。例えば、１）液体窒素を満たしたタンクの液体窒素中で、該冷却用具を保存すること（液相保存）や、２）タンクの下部に液体窒素が充填されたタンク内で、液体窒素に直接接しないよう、該冷却用具を保存すること（気相保存）、３）冷凍庫内で該冷却用具を保存することなどが挙げられ、生物試料の保存状態を向上させる観点から上記の気相保存が好ましい。 Alternatively, after the sample storage step, the container containing the biological sample may not be taken out from the cooling tool, and the container containing the biological sample may be stored as the cooling tool having the block fitted in the recess. For example, 1) storing the cooling tool in liquid nitrogen in a tank filled with liquid nitrogen (liquid phase storage), or 2) directly in liquid nitrogen in a tank filled with liquid nitrogen at the bottom of the tank. Preserving the cooling tool so that it does not come into contact with the cooling tool (gas phase preservation), 3) storing the cooling tool in a freezer, etc., and the above-mentioned gas phase preservation from the viewpoint of improving the storage state of the biological sample. preferable.
（冷却用具滅菌工程）
実施形態の試料冷却方法は、試料収容工程の前に、冷却用具を滅菌する冷却用具滅菌工程を、さらに含んでいてもよい。
冷却用具の滅菌方法としては、当分野で通常用いられている方法を適宜行うことができる。例えば、冷却用具を加熱して滅菌する加熱滅菌法や、冷却用具を高圧条件下で蒸気加熱して滅菌する高圧蒸気滅菌法、冷却用具に放射線を照射して滅菌する放射線滅菌法などが挙げられ、高圧蒸気滅菌法としては、所謂オートクレーブ装置を用いたオートクレーブ滅菌（例えば、１２１℃、２気圧）が好ましい。
例えば、オートクレーブバック等の包装材に冷却用具を収容して、オートクレーブ滅菌等の滅菌処理をしておき、試料収容工程の直前に包装材を開封して、その後の試料収容工程を行うことができる。このとき、包装材に冷却用具が収容されたまま、ブロック冷却工程を行ってもよい。
実施形態の試料冷却方法がさらに冷却用具滅菌工程を備えることで、生物試料の汚染の機会がさらに低減されるため好ましい。
(Cooling tool sterilization process)
The sample cooling method of the embodiment may further include a cooling tool sterilization step of sterilizing the cooling tool before the sample storage step.
As a method for sterilizing the cooling tool, a method usually used in the art can be appropriately used. Examples include a heat sterilization method in which a cooling tool is heated and sterilized, a high-pressure steam sterilization method in which a cooling tool is steam-heated and sterilized under high-pressure conditions, and a radiation sterilization method in which a cooling tool is sterilized by irradiating it with radiation. As the high-pressure steam sterilization method, autoclave sterilization using a so-called autoclave device (for example, 121 ° C., 2 atm) is preferable.
For example, a cooling tool can be housed in a packaging material such as an autoclave bag, sterilized by autoclave sterilization or the like, the packaging material can be opened immediately before the sample storage process, and the subsequent sample storage process can be performed. .. At this time, the block cooling step may be performed while the cooling tool is housed in the packaging material.
It is preferred that the sample cooling method of the embodiment further comprises a cooling tool sterilization step, as it further reduces the chance of contamination of the biological sample.
上記の各工程の実施の順番としては、例えば、冷却用具滅菌工程、ブロック冷却工程、試料収容工程、試料保存工程の順に実施することができる。
なお、上記の冷却用具滅菌工程及び試料保存工程は、実施形態の試料冷却方法において、必須の工程ではない。
As the order of carrying out each of the above steps, for example, the cooling tool sterilization step, the block cooling step, the sample accommodating step, and the sample storage step can be carried out in this order.
The cooling tool sterilization step and the sample storage step described above are not essential steps in the sample cooling method of the embodiment.
液体窒素等の冷却手段と、生物試料を収めた容器を直接接触させれば、冷却速度は容易に速めることができるが、上述のように、液体窒素などの冷却手段を介して汚染物質が生物試料を汚染してしまうおそれがある。
一方、本実施形態の試料冷却方法によれば、実施形態の冷却用具を用いて生物試料を冷却するので、生物試料の汚染を効果的に防止できる。
本実施形態の試料冷却方法によれば、ブロック冷却工程において予めブロックを冷却しておくことで、その後の試料収容工程での試料の冷却速度が向上し、生物試料の急速冷却による高品質な低温保存が可能である。
実施形態の冷却用具の前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されているので、熱伝導率が高く、冷却手段と直接に接さずとも優れた冷却速度にて生物試料を冷却でき、生物試料の急速冷却による高品質な低温保存が可能である。
即ち、実施形態の試料冷却方法は、生物試料を高品質に低温保存でき、且つ、生物試料の汚染を防止でき、それを簡便な方法で実現できる、非常に優れた方法である。
The cooling rate can be easily increased by directly contacting the cooling means such as liquid nitrogen with the container containing the biological sample, but as described above, the contaminants are living organisms through the cooling means such as liquid nitrogen. There is a risk of contaminating the sample.
On the other hand, according to the sample cooling method of the present embodiment, since the biological sample is cooled by using the cooling tool of the embodiment, contamination of the biological sample can be effectively prevented.
According to the sample cooling method of the present embodiment, by cooling the block in advance in the block cooling step, the cooling rate of the sample in the subsequent sample accommodating step is improved, and the high quality low temperature due to the rapid cooling of the biological sample. It can be saved.
Since the block of the cooling tool of the embodiment is made of metal or a material containing metal, it has high thermal conductivity and can cool a biological sample at an excellent cooling rate without being in direct contact with a cooling means. High-quality low-temperature storage is possible by rapid cooling of biological samples.
That is, the sample cooling method of the embodiment is a very excellent method that can store a biological sample at a high quality at a low temperature, prevent contamination of the biological sample, and can realize it by a simple method.
＜試料冷却方法の第２実施形態＞
実施形態の試料冷却方法は、蓋体を備えた実施形態の冷却用具を用い、以下の「ブロック冷却工程」、「蓋体冷却工程」、「試料収容工程」及び「蓋体設置工程」を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法である。
実施形態の試料冷却方法として以下を例示できる。
生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックと、前記凹部を覆う蓋体と、を備え
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成され、
前記蓋体は、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具を用い、
以下の工程を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、
前記蓋体を−６０℃以下の温度に冷却する、蓋体冷却工程、
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程、及び
前記試料収容工程の後、−６０℃以下の温度に冷却された前記蓋体を、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置する、蓋体設置工程。
<Second Embodiment of Sample Cooling Method>
The sample cooling method of the embodiment uses the cooling tool of the embodiment provided with a lid, and includes the following "block cooling step", "cover cooling step", "sample storage step", and "cover installation step". , A sample cooling method for cooling the biological sample.
The following can be exemplified as the sample cooling method of the embodiment.
A block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample and a lid covering the recess are provided, and the block is made of metal or a material containing metal.
The lid uses a cooling tool, which is made of metal or a material containing metal.
A sample cooling method for cooling the biological sample, which comprises the following steps:
A block cooling step, in which the block is cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
A lid cooling step of cooling the lid to a temperature of −60 ° C. or lower,
After the sample storage step and the sample storage step, in which a container for storing a biological sample is fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower and the biological sample is placed in the internal space of the recess,- A lid installation step of installing the lid cooled to a temperature of 60 ° C. or lower on the block so as to cover the recess.
第２実施形態の試料冷却方法は、上記の第１実施形態の試料冷却方法が、さらに蓋体冷却工程、及び蓋体設置工程を含むものであり、上記第１実施形態の試料冷却方法と同様の構成を有する部分については詳細な説明を省略する。 The sample cooling method of the second embodiment is the same as the sample cooling method of the first embodiment, wherein the sample cooling method of the first embodiment further includes a lid cooling step and a lid installation step. A detailed description of the portion having the above configuration will be omitted.
蓋体を備えた実施形態の冷却用具としては、例えば上記実施形態の冷却用具において例示したものが挙げられ、ここでの詳しい説明を省略する。 Examples of the cooling tool of the embodiment provided with the lid include those illustrated in the cooling tool of the above embodiment, and detailed description thereof will be omitted here.
図１３は、本実施形態の試料冷却方法の手順を示す模式図である。以下、図を参照しながら、実施形態の試料冷却方法を説明する。 FIG. 13 is a schematic view showing the procedure of the sample cooling method of the present embodiment. Hereinafter, the sample cooling method of the embodiment will be described with reference to the drawings.
（ブロック冷却工程）
実施形態のブロック冷却工程としては、上記の第１実施形態のブロック冷却工程で説明したものが挙げられる。
(Block cooling process)
Examples of the block cooling step of the embodiment include those described in the block cooling step of the first embodiment described above.
（蓋体冷却工程）
実施形態の蓋体冷却工程は、実施形態の冷却用具の前記蓋体を−６０℃以下の温度に冷却する工程である。
ブロックの冷却方法は特に制限されるものではないが、本実施形態では、図１３（ａ）に示すように、冷却用具１Ｂのブロック１０の蓋体２０を、液体窒素５０に接触させる。蓋体冷却工程において、液体窒素が蓋体凹部の内壁面２０ｃに接触しないよう、蓋体を冷却することが好ましい。そうすることで、液体窒素が、雑菌やマイコプラズマ、他種の細胞の混入等により汚染されている場合であっても、液体窒素に含まれ得る汚染物質が、生物試料を収めている容器の蓋に接する機会が失われ、生物試料の汚染を効果的に防止できる。
(Cover cooling process)
The lid cooling step of the embodiment is a step of cooling the lid of the cooling tool of the embodiment to a temperature of −60 ° C. or lower.
The method for cooling the block is not particularly limited, but in the present embodiment, as shown in FIG. 13A, the
上記冷却された蓋体の温度は、上記ブロック冷却工程において、冷却されたブロックの温度として例示した温度であってよい。 The temperature of the cooled lid may be the temperature exemplified as the temperature of the cooled block in the block cooling step.
蓋体を冷却処理する冷却手段についても、上記ブロック冷却工程において、ブロックの冷却手段として例示したものを用いることができる。 As the cooling means for cooling the lid body, those exemplified as the block cooling means can be used in the block cooling step.
実施形態における蓋体冷却工程に、上記ブロック冷却工程において説明した冷却手段を用いた場合、例えば、以下の工程を例示できる。
実施形態の冷却用具の前記蓋体を液体窒素又はその冷気に接触させ、−６０℃以下の温度に冷却する工程。
実施形態の冷却用具の前記蓋体をドライアイス又はその冷気に接触させ、−６０℃以下の温度に冷却する工程。
実施形態の冷却用具の前記蓋体を冷凍庫内に入れて、−６０℃以下の温度に冷却する工程。
When the cooling means described in the block cooling step is used for the lid cooling step in the embodiment, for example, the following steps can be exemplified.
A step of bringing the lid of the cooling tool of the embodiment into contact with liquid nitrogen or cold air thereof to cool the lid to a temperature of −60 ° C. or lower.
A step of bringing the lid of the cooling tool of the embodiment into contact with dry ice or cold air thereof to cool the lid to a temperature of −60 ° C. or lower.
A step of putting the lid of the cooling tool of the embodiment into a freezer and cooling it to a temperature of −60 ° C. or lower.
蓋体冷却工程の実施時間は、蓋体の温度が上記規定の温度以下となるように適宜定めればよい。蓋体の温度が上記規定の温度以下となった後も、さらに冷却の操作を続けてもよい。 The execution time of the lid cooling step may be appropriately set so that the temperature of the lid is equal to or lower than the above-specified temperature. Even after the temperature of the lid becomes equal to or lower than the above-specified temperature, the cooling operation may be continued.
（試料収容工程）
次いで、ブロック冷却工程の後、試料収容工程をおこなう（図１３（ｂ））。
実施形態の試料収容工程としては、上記の第１実施形態の試料収容工程で説明したものが挙げられる。
(Sample storage process)
Next, after the block cooling step, a sample accommodating step is performed (FIG. 13 (b)).
Examples of the sample accommodating step of the embodiment include those described in the sample accommodating step of the first embodiment described above.
（蓋体設置工程）
次いで、ブロック冷却工程及び試料収容工程の後、蓋体設置工程をおこなう（図１３（ｃ））。
実施形態の蓋体設置工程は、−６０℃以下の温度に冷却された前記蓋体を、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置する工程である。
(Cover installation process)
Next, after the block cooling step and the sample accommodating step, a lid installation step is performed (FIG. 13 (c)).
The lid body installation step of the embodiment is a step of installing the lid body cooled to a temperature of −60 ° C. or lower on the block so as to cover the recess.
図１３（ｃ）に示すように、蓋体２０がブロック１０上に設置されると、生物試料６０を収めた容器６２及び容器蓋６３が、冷却されたブロック１０及び蓋体２０によって取り囲まれることで、非常に高効率に生物試料６０を冷却できる。
As shown in FIG. 13 (c), when the
ここで、ブロック１０の合わせ面１０ａと、蓋体２０の合わせ面２０ａとが面接触することが好ましい。生物試料６０は、ブロック１０の側に収容されているので、合わせ面１０ａ，２０ａを介した熱移動の効率が向上し、冷却された蓋体２０による生物試料への冷却に対する寄与がさらに大きくなる。それにより、生物試料の冷却速度をより一層向上させ、生物試料を状態よく低温保存できる。また、生物試料が蓋体及びブロックによって密閉されるので、冷却の安定性をより一層向上させることができる。
Here, it is preferable that the
なお、蓋体設置工程において、−６０℃以下の温度に冷却された蓋体とは、ブロック上に設置した後の蓋体の温度については含まれないものとする。 In the lid installation step, the lid cooled to a temperature of −60 ° C. or lower does not include the temperature of the lid after it is installed on the block.
蓋体設置工程において、生物試料と蓋体を備える冷却用具との間で熱交換が生じることを考慮すると、冷却の安定性の向上のため、前記容器内に収められた生物試料を含む冷却対象物の質量に対する、前記蓋体及びブロックの総質量が、大きいほうが好ましい。
上記の事柄を考慮し、前記容器内に収められた生物試料を含む冷却対象物の質量に対する、ブロック及び蓋体の総質量比（冷却対象物の質量：ブロック及び蓋体の合計質量）が、１：１０〜１：２０００００であることが好ましく、１：５０〜１：７００００であることが好ましく、１：１００〜１：２００００であることが好ましい。
Considering that heat exchange occurs between the biological sample and the cooling tool provided with the lid in the lid installation step, in order to improve the cooling stability, the cooling target including the biological sample contained in the container is used. It is preferable that the total mass of the lid and the block with respect to the mass of the object is large.
In consideration of the above matters, the total mass ratio of the block and the lid (mass of the object to be cooled: total mass of the block and the lid) with respect to the mass of the object to be cooled including the biological sample contained in the container is determined. It is preferably 1: 10 to 1: 200,000, preferably 1: 50 to 1: 70000, and preferably 1: 100 to 1: 20000.
実施形態の冷却物の製造方法として、実施形態の試料冷却方法により、前記生物試料を冷却し、前記生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法、を例示する。
実施形態の冷却物の製造方法として、例えば、実施形態の冷却用具を用い、ブロック冷却工程、蓋体冷却工程、試料収容工程及び蓋体設置工程を含み、前記試料収容工程及び蓋体設置工程により前記生物試料を冷却し、生物試料の冷却物を得ることを含む、生物試料の冷却物の製造方法、を例示する。
当該製造方法における各工程及び冷却用具は、試料冷却方法に例示するものが挙げられ、詳細な説明を省略する。
An example of a method for producing a chilled product of an embodiment is a method for producing a chilled product of a biological sample, which comprises cooling the biological sample by the sample cooling method of the embodiment to obtain a chilled product of the biological sample.
As a method for producing a cooled product of the embodiment, for example, the cooling tool of the embodiment is used, and the block cooling step, the lid cooling step, the sample accommodating step, and the lid setting step are included, and the sample accommodating step and the lid setting step are performed. An example is a method for producing a chilled product of a biological sample, which comprises cooling the biological sample to obtain a chilled product of the biological sample.
Examples of each step and cooling tool in the manufacturing method include those exemplified in the sample cooling method, and detailed description thereof will be omitted.
本実施形態の試料冷却方法は、生物試料を冷却し、冷却した生物試料を低温保存する方法に好適に適用可能である。
実施形態の冷却物の製造方法は、得られた冷却物を低温保存する方法に好適に適用可能である。
The sample cooling method of the present embodiment is suitably applicable to a method of cooling a biological sample and storing the cooled biological sample at a low temperature.
The method for producing a cooled product of the embodiment is suitably applicable to a method of storing the obtained cooled product at a low temperature.
（試料保存工程）
実施形態の試料冷却方法は、試料収容工程の後、生物試料を−６０℃以下の温度で保存する、試料保存工程を、さらに含んでいてもよい。
実施形態の試料保存工程としては、上記の第１実施形態の試料収容工程で説明したものと同様の操作が挙げられる。生物試料を収めた容器を冷却用具から取り出さず、生物試料を収めた容器が前記凹部に嵌入されたブロックを備える冷却用具を保存する場合には、ブロック上に蓋体を設置した状態で保存することができる。蓋体を設置しておくことで、試料の冷却安定性を高めることができる。
(Sample storage process)
The sample cooling method of the embodiment may further include a sample storage step of storing the biological sample at a temperature of −60 ° C. or lower after the sample storage step.
Examples of the sample storage step of the embodiment include the same operations as those described in the sample storage step of the first embodiment described above. When the container containing the biological sample is not taken out from the cooling tool and the cooling tool having the block in which the container containing the biological sample is fitted in the recess is stored, the container is stored with the lid installed on the block. be able to. By installing the lid, the cooling stability of the sample can be improved.
（冷却用具滅菌工程）
実施形態の試料冷却方法は、試料収容工程の前に、ブロック及び蓋体を備える冷却用具を滅菌する冷却用具滅菌工程を、さらに含んでいてもよい。
実施形態の冷却用具滅菌工程としては、上記の第１実施形態の冷却用具滅菌工程で説明したものと同様の操作が挙げられる。
例えば、オートクレーブバック等の包装材に冷却用具を収容する場合には、ブロックと蓋体とを一緒の包装材に収容してもよいし、それぞれ別の包装材に収容して滅菌してもよい。
(Cooling tool sterilization process)
The sample cooling method of the embodiment may further include a cooling tool sterilization step of sterilizing the cooling tool including the block and the lid before the sample containing step.
Examples of the cooling tool sterilization step of the embodiment include the same operations as those described in the cooling tool sterilization step of the first embodiment described above.
For example, when the cooling device is housed in a packaging material such as an autoclave bag, the block and the lid may be housed in the same packaging material, or they may be housed in different packaging materials and sterilized. ..
上記の各工程の実施の順番としては、例えば、冷却用具滅菌工程、ブロック冷却工程、蓋体冷却工程、試料収容工程、蓋体設置工程、試料保存工程の順に実施することができる。ブロック冷却工程と蓋体冷却工程とは、同時に行ってもよいし、蓋体冷却工程の後にブロック冷却工程を行ってもよい。
又は、冷却用具滅菌工程、ブロック冷却工程、試料収容工程、蓋体冷却工程、蓋体設置工程、試料保存工程の順に実施してもよい。
なお、上記の冷却用具滅菌工程及び試料保存工程は、実施形態の試料冷却方法において、必須の工程ではない。
As the order of carrying out each of the above steps, for example, the cooling tool sterilization step, the block cooling step, the lid cooling step, the sample accommodating step, the lid setting step, and the sample storage step can be carried out in this order. The block cooling step and the lid cooling step may be performed at the same time, or the block cooling step may be performed after the lid cooling step.
Alternatively, the cooling tool sterilization step, the block cooling step, the sample storage step, the lid cooling step, the lid setting step, and the sample storage step may be carried out in this order.
The cooling tool sterilization step and the sample storage step described above are not essential steps in the sample cooling method of the embodiment.
本実施形態の試料冷却方法によれば、蓋体とブロックとの両方から試料が冷却されることで、その後の蓋体設置工程での生物試料の冷却効率が向上し、生物試料の高品質な冷却及び低温保存が実現される。
前記蓋体は、金属又は金属を含有する材料から構成されているので、熱伝導率が高く、生物試料の急速冷却による高品質な冷却及び低温保存が可能である。
即ち、実施形態の試料冷却方法は、生物試料を高品質に冷却及び低温保存でき、且つ、生物試料の汚染を防止でき、それを簡便な方法で実現できる、非常に優れた方法である。
According to the sample cooling method of the present embodiment, by cooling the sample from both the lid and the block, the cooling efficiency of the biological sample in the subsequent lid installation step is improved, and the biological sample is of high quality. Cooling and low temperature storage are realized.
Since the lid is made of metal or a material containing metal, it has high thermal conductivity, and high-quality cooling and low-temperature storage by rapid cooling of biological samples are possible.
That is, the sample cooling method of the embodiment is a very excellent method that can cool a biological sample with high quality and store it at a low temperature, prevent contamination of the biological sample, and realize it by a simple method.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
１．ブロックの作製
本実施例で作製したブロック及び蓋体は以下の２種（アルミ製及び銅製）である。
1. 1. Preparation of Blocks The blocks and lids produced in this example are the following two types (aluminum and copper).
図１５及び表１に、本実施例で作製したブロックの形状と、それに関する数値を示す。
図１６及び表２に、本実施例で作製した蓋体の形状と、それに関する数値を示す。
アルミ製のアルミブロック及びアルミ蓋体と、銅製の銅ブロック及び銅蓋体の形状は同一である。
FIG. 15 and Table 1 show the shapes of the blocks produced in this example and the numerical values related thereto.
FIG. 16 and Table 2 show the shape of the lid body produced in this example and the numerical values related thereto.
The shapes of the aluminum block and the aluminum lid made of aluminum and the copper block and the copper lid made of copper are the same.
１．ブロックの凹部に収容された試料の冷却速度の測定
（試薬・器具・機器）
本測定で使用した試薬、器具及び機器類は以下である。
・ガラス化液（ＰＶＳ２）（組成：０．４Ｍショ糖，３００ｇ／Ｌグリセリン，１５０ｇ／Ｌエチレングリコール，及び１５０ｇ／Ｌジメチルスルホキシドを含むＭＳ液体培地）
・クライオバイアル（ポリプロピレン製、ＷＨＥＡＴＯＮ社製、型番Ｗ９８５８６１）
・クライオプレート［アルミ製、農研機構遺伝資源センター製造、Ｎｏ．３ Ｔｙｐｅ，７ｍｍ×３７ｍｍ×０．５ｍｍ、表面に俵型の各窪み（長径２．５ｍｍ，短径１．５ｍｍ，深さ０．７５ｍｍ）を１０個又は１２個有する］
・センサー［シース熱電対（Ｔ熱電対Ｃｌａｓｓ１，株式会社岡崎製作所）、測定データ取得（１／１００秒毎にデータロガー（ＴＲ−Ｖ５００，株式会社キーエンス）に取り込み］
1. 1. Measurement of the cooling rate of the sample contained in the recess of the block (reagents, instruments, equipment)
The reagents, instruments and equipment used in this measurement are as follows.
Vitrified liquid (PVS2) (composition: MS liquid medium containing 0.4 M sucrose, 300 g / L glycerin, 150 g / L ethylene glycol, and 150 g / L dimethyl sulfoxide)
・ Cryovial (made of polypropylene, made by WHEATON, model number W985861)
・ Cryoplate [Aluminum, manufactured by NARO, National Agriculture and Food Research Organization, No. 3 Type, 7 mm x 37 mm x 0.5 mm, with 10 or 12 bale-shaped depressions (major axis 2.5 mm, minor axis 1.5 mm, depth 0.75 mm) on the surface]
・ Sensor [Sheath thermocouple (T thermocouple Class1, Okazaki Seisakusho Co., Ltd.), measurement data acquisition (imported into data logger (TR-V500, KEYENCE Co., Ltd.) every 1/100 second]
［実験例１］
クライオバイアル内に、実際の試料の代わりとして５０μＬのガラス化液（ＰＶＳ２）のみを測定物として入れた。クライオバイアルの蓋に細い穴を空け、そこにセンサーを通し、クライオバイアル内のガラス化液の温度変化を計測できるようにした。
なお、一連の実験は室温２５℃の実験室で行った。そのため、ブロックに収容する前のガラス化液及びクライオバイアルの温度は室温（約２５℃）である。
発砲スチロール容器内に液体窒素（−１９６℃）を１〜２ｃｍ分入れ、そこに上記のアルミブロックを置いて、アルミブロックを液体窒素に接触させ、アルミブロックを−１９６℃に冷却した（ブロック冷却工程に対応）。このとき、アルミブロックの凹部内に、液体窒素が侵入しないようにした。
次いで、アルミブロックを液体窒素に接触させたままで、上記のブロックの凹部に、上記の測定物を収容したクライオバイアルをいれ（試料収容工程に対応）、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 1]
Only 50 μL of vitrified solution (PVS2) was placed as a measurement in the cryovial instead of the actual sample. A small hole was made in the lid of the cryovial, and a sensor was passed through it so that the temperature change of the vitrified solution in the cryovial could be measured.
A series of experiments were conducted in a laboratory at room temperature of 25 ° C. Therefore, the temperature of the vitrified solution and the cryovial before being contained in the block is room temperature (about 25 ° C.).
Liquid nitrogen (-196 ° C) was placed in a foamed styrene container for 1 to 2 cm, the above aluminum block was placed there, the aluminum block was brought into contact with liquid nitrogen, and the aluminum block was cooled to -196 ° C (block cooling). Corresponds to the process). At this time, liquid nitrogen was prevented from entering the recess of the aluminum block.
Next, with the aluminum block in contact with liquid nitrogen, a cryovial containing the above-mentioned measurement object is placed in the recess of the above-mentioned block (corresponding to the sample storage process), the measurement object is cooled, and the temperature change is observed. Measured immediately.
［実験例２］
クライオバイアル内に、実際の試料の代わりとして５０μＬのガラス化液（ＰＶＳ２）を測定物として入れたものを用意した。クライオバイアルの蓋に細い穴を空け、そこにセンサーを通し、クライオバイアル内のガラス化液の温度変化を計測できるようにした。
なお、一連の実験は室温２５℃の実験室で行った。そのため、ブロックに収容する前のガラス化液及びクライオバイアルの温度は室温（約２５℃）である。
発砲スチロール容器内に液体窒素（−１９６℃）を１〜２ｃｍ分入れ、そこに上記のアルミブロック及びアルミ蓋体を置いて、アルミブロック及びアルミ蓋体を液体窒素に接触させ、アルミブロック及びアルミ蓋体を−１９６℃に冷却した（ブロック冷却工程・蓋体冷却工程に対応）。このとき、アルミブロックの凹部及びアルミ蓋体の蓋体凹部内に、液体窒素が侵入しないようにした。
次いで、アルミブロックを液体窒素に接触させたままで、上記のブロックの凹部に、上記の測定物を収容したクライオバイアルをいれ（試料収容工程に対応）、さらに−１９６℃に冷却した上記の蓋体を即座にブロック上に設置し（蓋体設置工程に対応）、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
ここで、蓋体の天板部の一部に予め細い穴を空け、そこにセンサーを通し、ブロックと蓋体との合わせ面同士が面接触するようにした。
[Experimental Example 2]
A cryovial containing 50 μL of vitrified solution (PVS2) as a measurement substance was prepared in place of the actual sample. A small hole was made in the lid of the cryovial, and a sensor was passed through it so that the temperature change of the vitrified solution in the cryovial could be measured.
A series of experiments were conducted in a laboratory at room temperature of 25 ° C. Therefore, the temperature of the vitrified solution and the cryovial before being contained in the block is room temperature (about 25 ° C.).
Put liquid nitrogen (-196 ° C) in a foamed styrene container for 1 to 2 cm, place the above aluminum block and aluminum lid in it, bring the aluminum block and aluminum lid into contact with liquid nitrogen, and make the aluminum block and aluminum. The lid was cooled to -196 ° C (corresponding to the block cooling step and the lid cooling step). At this time, liquid nitrogen was prevented from entering the recess of the aluminum block and the recess of the lid of the aluminum lid.
Next, with the aluminum block in contact with liquid nitrogen, a cryovial containing the above-mentioned measurement object was placed in the recess of the above-mentioned block (corresponding to the sample storage step), and the lid was further cooled to -196 ° C. Was immediately installed on the block (corresponding to the lid installation process), the object to be measured was cooled, and the temperature change was immediately measured.
Here, a small hole was made in advance in a part of the top plate of the lid, and a sensor was passed through the hole so that the mating surfaces of the block and the lid were in surface contact with each other.
［実験例３］
上記の実験例１において、液体窒素の代わりに、冷凍庫（−８０℃）を用いて、上記のアルミブロックを−８０℃に冷却し、次いで、冷凍庫内にて上記のブロックの凹部に、上記の測定物を収容した以外は、上記実験例１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 3]
In Experimental Example 1 above, a freezer (-80 ° C) was used instead of liquid nitrogen to cool the aluminum block to -80 ° C, and then in the freezer, the recesses of the block were filled with the above. Except for accommodating the object to be measured, the object to be measured was cooled in the same manner as in Experimental Example 1 above, and the temperature change thereof was immediately measured.
［実験例４］
上記の実験例２において、液体窒素の代わりに、冷凍庫（−８０℃）を用いて、上記のアルミブロック及びアルミ蓋体を−８０℃に冷却し、次いで、冷凍庫内にて上記のブロックの凹部に、上記の測定物を収容し、冷凍庫内にてアルミ蓋体を即座にブロック上に設置した以外は、上記実験例２と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 4]
In Experimental Example 2 above, a freezer (-80 ° C) was used instead of liquid nitrogen to cool the aluminum block and aluminum lid to -80 ° C, and then the recesses of the block were cooled in the freezer. In the same manner as in Experimental Example 2 above, the measured object was cooled and the temperature change was immediately changed, except that the above-mentioned measured object was housed and the aluminum lid was immediately installed on the block in the freezer. It was measured.
［実験例５］
上記の実験例１において、アルミブロックの代わりに、銅ブロックを用いた以外は、上記実験例１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 5]
In Experimental Example 1 above, the object to be measured was cooled in the same manner as in Experimental Example 1 except that a copper block was used instead of the aluminum block, and the temperature change was immediately measured.
［実験例６］
上記の実験例２において、アルミブロック及びアルミ蓋体の代わりに、銅ブロック及び銅蓋体を用いた以外は、上記実験例２と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 6]
In Experimental Example 2 above, the object to be measured is cooled in the same manner as in Experimental Example 2 except that the copper block and copper lid are used instead of the aluminum block and aluminum lid, and the temperature change is immediately changed. Was measured.
［実験例７］
上記の実験例３において、アルミブロックの代わりに、銅ブロックを用いた以外は、上記実験例３と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 7]
In Experimental Example 3 above, the object to be measured was cooled and the temperature change was immediately measured in the same manner as in Experimental Example 3 except that the copper block was used instead of the aluminum block.
［実験例８］
上記の実験例４において、アルミブロック及びアルミ蓋体の代わりに、銅ブロック及び銅蓋体を用いた以外は、上記実験例４と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 8]
In Experimental Example 4 above, the measured object is cooled in the same manner as in Experimental Example 4 except that the copper block and the copper lid are used instead of the aluminum block and the aluminum lid, and the temperature change is immediately changed. Was measured.
［実験例９〜１６］
上記の各実験例１〜８において、測定物として、ガラス化液の代わりにクライオプレートを用いた以外は、上記各実験例１〜８と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Examples 9 to 16]
In each of the above Experimental Examples 1 to 8, the measured object was cooled in the same manner as in each of the above Experimental Examples 1 to 8 except that a cryoplate was used instead of the vitrified liquid as the measured object, and the temperature change thereof. Was measured immediately.
［実験例１７］
上記の実験例１において、ブロック（及び蓋体も）を使用せず、液体窒素に直接、測定物を収容したクライオバイアルを浸漬させたこと以外は、上記実験例１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 17]
In Experimental Example 1 above, the measurement object was measured in the same manner as in Experimental Example 1 except that the cryovial containing the measurement object was directly immersed in liquid nitrogen without using a block (and the lid). Was cooled, and the temperature change was measured immediately.
［実験例１８］
上記の実験例３において、ブロック（及び蓋体も）を使用せず、冷凍庫（−８０℃）に直接、測定物を収容したクライオバイアルを収容したこと以外は、上記実験例３と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 18]
In Experimental Example 3 above, the same as in Experimental Example 3 except that the cryovial containing the measured object was directly stored in the freezer (-80 ° C) without using the block (and the lid). , The object to be measured was cooled, and the temperature change was immediately measured.
［実験例１９］
上記の実験例９において、ブロック（及び蓋体も）を使用せず、液体窒素に直接、測定物を収容したクライオバイアルを浸漬させたこと以外は、上記実験例９と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 19]
In Experimental Example 9 above, the measurement object was measured in the same manner as in Experimental Example 9 except that the cryovial containing the measurement object was directly immersed in liquid nitrogen without using a block (and the lid). Was cooled, and the temperature change was measured immediately.
［実験例２０］
上記の実験例１１において、ブロック（及び蓋体も）を使用せず、冷凍庫（−８０℃）に直接、測定物を収容したクライオバイアルを収容したこと以外は、上記実験例１１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 20]
In Experimental Example 11 above, the same as in Experimental Example 11 except that the cryovial containing the measurement object was directly stored in the freezer (-80 ° C) without using the block (and the lid). , The object to be measured was cooled, and the temperature change was immediately measured.
［実験例２１］
上記の実験例３において、アルミブロックの代わりに、市販のセラムチューブ用ラック（住友ベークライト株式会社製、耐−８０℃表示、ＡＢＳ樹脂製）を用いた以外は、上記実験例３と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
なお、上記のセラムチューブ用ラックには、PVC（ポリ塩化ビニル）製の透明の薄い蓋（厚さ0.33mm）が付属しているが、この蓋を使用しても、使用しなくても結果は同じであった。
[Experimental Example 21]
In Experimental Example 3 above, the same as in Experimental Example 3 except that a commercially available rack for serum tubes (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., -80 ° C resistant display, made of ABS resin) was used instead of the aluminum block. , The object to be measured was cooled, and the temperature change was measured immediately.
The above serum tube rack comes with a thin transparent PVC (polyvinyl chloride) lid (thickness 0.33 mm), but the result is whether or not this lid is used. Was the same.
［実験例２２］
上記の実験例１１において、アルミブロックの代わりに、市販のセラムチューブ用ラック（住友ベークライト株式会社製、耐−８０℃表示、ＡＢＳ樹脂製）を用いた以外は、上記実験例１１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
なお、上記のセラムチューブ用ラックには、PVC（ポリ塩化ビニル）製の透明の薄い蓋（厚さ0.33mm）が付属しているが、この蓋を使用しても、使用しなくても結果は同じであった。
[Experimental Example 22]
In Experimental Example 11 above, the same procedure as in Experimental Example 11 except that a commercially available rack for serum tubes (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., -80 ° C resistant display, made of ABS resin) was used instead of the aluminum block. , The object to be measured was cooled, and the temperature change was measured immediately.
The above serum tube rack comes with a thin transparent PVC (polyvinyl chloride) lid (thickness 0.33 mm), but the result is whether or not this lid is used. Was the same.
［実験例２３］
上記の実験例３において、アルミブロックの代わりに、市販の紙製サンプルラックを用いた以外は、上記実験例３と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 23]
In Experimental Example 3 above, the object to be measured was cooled and the temperature change was immediately measured in the same manner as in Experimental Example 3 except that a commercially available paper sample rack was used instead of the aluminum block.
［実験例２４］
上記の実験例１１において、アルミブロックの代わりに、市販の紙製サンプルラックを用いた以外は、上記実験例１１と同様にして、測定物の冷却を行い、その温度変化を即時に測定した。
[Experimental Example 24]
In Experimental Example 11 above, the object to be measured was cooled and the temperature change was immediately measured in the same manner as in Experimental Example 11 except that a commercially available paper sample rack was used instead of the aluminum block.
表３に、上記の測定物の温度変化の測定結果から得られた、冷却に要した時間（秒）と、０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度（℃／分）を示す。 Table 3 shows the time required for cooling (seconds) and the cooling rate (° C./min) in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. obtained from the measurement results of the temperature change of the measured object.
冷却用具を使用せず、液体窒素（−１９６℃）を用いて冷却を行った実験例１７及び１９では、冷却速度自体は高い値を示したが、生物試料の汚染を防止することは困難であった。 In Experimental Examples 17 and 19 in which cooling was performed using liquid nitrogen (-196 ° C) without using a cooling tool, the cooling rate itself was high, but it was difficult to prevent contamination of biological samples. there were.
金属材料から構成された冷却用具（ブロック）を使用した実験例１〜１６では、金属材料を含まない樹脂製又は紙製のサンプルラックを使用した実験例２１〜２４と比べ、冷却速度を向上でき、生物試料の汚染を防止することが可能であった。 In Experimental Examples 1 to 16 using a cooling tool (block) made of a metal material, the cooling rate can be improved as compared with Experimental Examples 21 to 24 using a resin or paper sample rack containing no metal material. , It was possible to prevent contamination of biological samples.
また、ブロックに加えて、さらに蓋体を使用した実験例（実験例２、４、６、８等）では、蓋体を使用しない実験例（実験例１、３、５、７等）に比べ、顕著な冷却速度の向上が認められた。 Further, in the experimental examples using the lid in addition to the block (Experimental Examples 2, 4, 6, 8 etc.), compared with the experimental examples not using the lid (Experimental Examples 1, 3, 5, 7 etc.). , A remarkable improvement in cooling rate was observed.
冷却用具を使用せず、冷凍庫で冷却を行った実験例１８及び２０と比べ、金属材料から構成された冷却用具を使用した実験例３〜４、７〜８，１１〜１２及び１５〜１６において、冷却速度の向上が認められた。 Compared with Experimental Examples 18 and 20 in which cooling was performed in a freezer without using a cooling tool, in Experimental Examples 3 to 4, 7 to 8, 11 to 12 and 15 to 16 using a cooling tool composed of a metal material. , The improvement of the cooling rate was recognized.
金属材料の種類については、アルミ製の冷却用具を用いた実験例（実験例１〜４等）よりも、銅製の冷却用具を用いた実験例（実験例５〜８等）のほうが、冷却速度が向上していた。特に、冷却手段として液体窒素（−１９６℃）を用い、銅製の冷却用具のブロック及び蓋体を使用した実験例６では、特に優れた冷却速度示した。 Regarding the type of metal material, the cooling rate of the experimental example using the copper cooling tool (Experimental Examples 5 to 8 etc.) is higher than that of the experimental example using the aluminum cooling tool (Experimental Examples 1 to 4 etc.). Was improving. In particular, in Experimental Example 6 in which liquid nitrogen (-196 ° C.) was used as the cooling means and a block and a lid of a copper cooling tool were used, a particularly excellent cooling rate was shown.
これらの結果から、実施形態に係る冷却用具を使用することで、生物試料の汚染を防止し、優れた冷却速度の達成により冷却対象物を効果的に冷却可能であることが示された。 From these results, it was shown that by using the cooling tool according to the embodiment, contamination of the biological sample can be prevented, and the object to be cooled can be effectively cooled by achieving an excellent cooling rate.
２．ニンニク茎頂の冷却物からのシュート再生率の検証
［実験例２５］
（１）供試材料
青森県の農業生産者が６月に収穫した鱗茎を夏季休眠後に約２か月常温保存したニンニク（Ａ． ｓａｔｉｖｕｍ）‘ホワイト’を供試材料に用いた。鱗茎を水道水で洗浄後、７０％（ｖ／ｖ）エタノールに５分間浸漬し、有効塩素２％（ｖ／ｖ）のアンチホルミンに１０分間浸漬して表面殺菌を行った。滅菌水で２回洗浄後、鱗茎から茎頂（約２ｍｍ）を摘出し、０．３Ｍショ糖を含む寒天培地（ｐＨ５．８）に置床した。培地の組成は１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ・Ｓｋｏｏｇ，１９６２）とし、寒天濃度は８．０ｇ／Ｌに設定した。置床後の茎頂は、２５℃、１６時間日長のＬＥＤ照明下（５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）で前培養を２日間行った。
2. Verification of shoot regeneration rate from cooled garlic shoot apex [Experimental Example 25]
(1) Test material
Garlic (A. sativum)'white', which was harvested in June by an agricultural producer in Aomori prefecture and stored at room temperature for about 2 months after dormancy in summer, was used as a test material. After washing the bulbs with tap water, they were immersed in 70% (v / v) ethanol for 5 minutes and then immersed in 2% (v / v) effective chlorine of antiformin for 10 minutes to sterilize the surface. After washing twice with sterile water, the shoot apex (about 2 mm) was removed from the bulb and placed on an agar medium (pH 5.8) containing 0.3 M sucrose. The composition of the medium was 1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962), and the agar concentration was set to 8.0 g / L. The shoot apex after placement was pre-cultured for 2 days at 25 ° C. under 16-hour day-long LED lighting (55 μmol · m -2 · s -1).
（２−１）Ｖ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法によるニンニク茎頂の処理
本処理は、Ｖ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法（既報：“Development of a Cryopreservation Procedure Using Aluminium Cryo-plates” Yamamoto, Shin-ichi; Rafique, Tariq; Priyantha, Wickramage Saman; Fukui, Kuniaki; Matsumoto, Toshikazu; Niino, Takao、Cryoletters, Volume 32, Number 3, June 2011, pp. 256-265）に沿って行った。
上記のクライオプレート上の１０個のウエルに、０．４Ｍショ糖及び３％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム液を含むＭＳ液体培地を２μＬずつ滴下した。次に、上記で２日間前培養した茎頂を、１ウエルにつき１個入れた。茎頂をウエルに固着させるため、０．４Ｍショ糖及び１００ｍＭ塩化カルシウムを含むＭＳ液体培地０．５ｍＬをクライオプレート上に注入し、アルギン酸ゲルになるよう２５℃で１５分間、固化反応させ茎頂付きのクライオプレートを得た。
次に、１．０Ｍショ糖と２．０Ｍグリセリン液を含むＭＳ液体培地（ＬＳ液）を約１５ｍＬ入れた径５５ｍｍ滅菌プラスチックシャーレ内に、茎頂付きのクライオプレートを移し、２５℃で３０分間の静置（ＬＳ処理）を行った。さらに、茎頂付きのクライオプレートを、ＭＳ液体培地を含むガラス化液ＰＶＳ２（Ｓａｋａｉら，１９９０）が約１５ｍＬ入った径５５ｍｍシャーレ内に移し、２５℃で３０分間の浸透脱水処理を行った。
(2-1) Treatment of garlic shoot apex by V cryo-plate method This treatment is performed by V cryo-plat method (previous report: “Development of a Cryopreservation Procedure Using Aluminum Cryo-plates” Yamamoto, Shin-ichi; Rafique, Tariq; Priyantha, Wickramage Saman; Fukui, Kuniaki; Matsumoto, Toshikazu; Niino, Takao, Cryoletters, Volume 32, Number 3, June 2011, pp. 256-265).
2 μL of MS liquid medium containing 0.4 M sucrose and 3% (w / v) sodium alginate solution was added dropwise to the 10 wells on the cryoplate. Next, one shoot apex pre-cultured for 2 days above was added per well. In order to fix the shoot apex to the well, 0.5 mL of MS liquid medium containing 0.4 M sucrose and 100 mM calcium chloride was injected onto a cryoplate and solidified at 25 ° C. for 15 minutes to form an alginate gel. I got a cryoplate with.
Next, transfer the cryoplate with the shoot apex into a 55 mm diameter sterile plastic petri dish containing about 15 mL of MS liquid medium (LS solution) containing 1.0 M sucrose and 2.0 M glycerin solution, and transfer it at 25 ° C. for 30 minutes. Was allowed to stand (LS treatment). Further, the cryoplate with the shoot apex was transferred into a 55 mm diameter petri dish containing about 15 mL of vitrified liquid PVS2 (Sakai et al., 1990) containing MS liquid medium, and osmotic dehydration treatment was performed at 25 ° C. for 30 minutes.
（３）ニンニク茎頂の超低温保存
上記の実験例と同じ、ブロック及び蓋体を使用してニンニク茎頂の冷却物の製造を行った。具体的には、実験例１０におけるクライオプレートに代えて、上記のＶ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法で処理された茎頂付きのクライオプレートを用いたこと以外は上記の実験例１０と同様にして、実施例のアルミブロック及びアルミ蓋体を使用したニンニク茎頂の冷却物の製造を行った。
(3) Ultra-low temperature storage of garlic shoot apex The same block and lid as in the above experimental example were used to produce a cooled product of garlic shoot apex. Specifically, in the same manner as in Experimental Example 10 except that a cryoplate with a shoot apex treated by the above V cryo-plat method was used instead of the cryoplate in Experimental Example 10. The garlic shoot apex cooled product was manufactured using the aluminum block and aluminum lid of the above.
（４）ニンニク茎頂の昇温と、シュート再生
植物体再生には、２ｍＬ容クライオバイアル内に、１．０Ｍショ糖液を含むＭＳ液体培地１．８ｍＬ入れ、その中に上記で得たニンニク茎頂の冷却物付きのクライオプレートを浸漬させ、２５℃の室温で昇温させた。さらに、そのまま１５分間放置して、茎頂の洗浄と浸透圧調整を行った。茎頂をクライオプレートから取り出し、１／２ＭＳ寒天培地上に置床し、再培養を行った。
再培養は、培養条件２５℃、１６時間日長のＬＥＤ照明下（５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）で行った。寒天濃度は８．０ｇ／Ｌとし、植物成長調整物質として、ベンジルアデニンを０．２ｍｇ／Ｌ添加した。なお、上記の処理液及び培地はｐＨ５．８に調整し、オートクレーブで１２１℃、１５分間の滅菌を行ったものを用いた。
再培養の結果の評価は、置床３０日後に正常に茎頂が伸長し葉が展開したシュートを数えて、これを再生率とした（再生率（％）＝成長したシュートが確認された茎頂数／全茎頂数×１００）。なお、各実験例とも１０茎頂で３反復行い、その平均値を各実験例の再生率の値として示した。
(4) Temperature rise of garlic stem apex and shoot regeneration For plant regeneration, 1.8 mL of MS liquid medium containing 1.0 M sucrose solution was placed in a 2 mL cryovial, and the garlic obtained above was contained therein. A cryoplate with a sucrose apex was immersed and heated at room temperature of 25 ° C. Further, it was left as it was for 15 minutes to wash the shoot apex and adjust the osmotic pressure. The shoot apex was taken out from the cryoplate, placed on a 1 / 2MS agar medium, and recultured.
The reculture was performed under the culture conditions of 25 ° C. and 16 hours of day-long LED illumination (55 μmol · m -2 · s -1). The agar concentration was 8.0 g / L, and 0.2 mg / L of benzyladenine was added as a plant growth regulator. The above-mentioned treatment liquid and medium were adjusted to pH 5.8 and sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes.
The evaluation of the result of reculture was performed by counting the shoots in which the shoot apex was normally elongated and the leaves were expanded 30 days after placing the bed, and this was used as the regeneration rate (regeneration rate (%) = shoot apex in which the grown shoot was confirmed). Number / total shoot apex x 100). In each experimental example, 10 stem apex was repeated 3 times, and the average value was shown as the value of the regeneration rate of each experimental example.
［実験例２６］
（２−２）Ｄ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法によるニンニク茎頂の処理
本処理は、Ｄ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法（既報：“Dehydration Improves Cryopreservation of Mat Rush (Juncus decipiens Nakai) Basal Stem Buds on Cryo-plates” Niino, Takao; Yamamoto, Shin-Ichi; Fukui, Kuniaki; Martinez, Carlos Roman Castillo; Arizaga, Miriam Valle; Matsumoto, Toshikazu; Engelmann, Florent、Cryoletters, Volume 34,Number 6, November 2013, pp. 549-560）に沿って行った。
上記の実験例２５の（２−１）Ｖ ｃｒｙｏ−ｐｌａｔｅ法におけるＬＳ処理の後、ガラス化液への浸漬に代えて、クライオプレートをクリーンベンチ内（パナソニックヘルスケア製、ＭＣＶ−１３１ＢＮＦ−ＰＪ）のシャーレ上で、風速０．６ｍ／secで２時間の風乾処理を行った以外は、上記の実験例２５と同様にして、冷却物の製造、昇温及びシュート再生を行った。
[Experimental Example 26]
(2-2) Treatment of garlic shoot apex by D cryo-plate method This treatment is performed by the D cryo-plat method (previously reported: “Dehydration Improves Cryopreservation of Mat Rush (Juncus decipiens Nakai) Basal Stem Buds on Cryo-plates” Niino, Takao; Yamamoto, Shin-Ichi; Fukui, Kuniaki; Martinez, Carlos Roman Castillo; Arizaga, Miriam Valle; Matsumoto, Toshikazu; Engelmann, Florent, Cryoletters, Volume 34, Number 6, November 2013, pp. 549-560) I went.
After the LS treatment in the (2-1) V cryo-plate method of Experimental Example 25 above, the cryoplate was placed in a clean bench (manufactured by Panasonic Healthcare, MCV-131BNF-PJ) instead of being immersed in the vitrified solution. A cooled product was produced, the temperature was raised, and the shoot was regenerated in the same manner as in Experimental Example 25 above, except that the petri dish was air-dried at a wind speed of 0.6 m / sec for 2 hours.
［実験例２７］
液体窒素の代わりに、冷凍庫（−８０℃）を用いて、上記のブロック及び蓋体を−８０℃に冷却した以外は、実験例２６と同様にして、冷却物の製造、昇温及びシュート再生を行った。
[Experimental Example 27]
A freezer (-80 ° C) was used instead of liquid nitrogen to cool the block and lid to -80 ° C, but in the same manner as in Experimental Example 26, production of a cooled product, temperature rise, and shoot regeneration. Was done.
表５に、シュート再生率の結果を示す。 Table 5 shows the results of the shoot regeneration rate.
表５に示す結果から、実験例２５〜２７の植物試料を、非常に高いシュート再生率で再生可能であることが示された。これは、従来法のクライオバイアルを液体窒素に直接浸漬させる方法と比べても、遜色ない結果である。
以上のことから、実施形態に係る冷却用具を使用して、生物試料の汚染を防止し、且つ極めて高い再生率を示す非常に良好な状態で、生物試料を冷却及び低温保存可能であることが示された。
From the results shown in Table 5, it was shown that the plant samples of Experimental Examples 25 to 27 can be regenerated with a very high shoot regeneration rate. This is a result comparable to the conventional method of immersing the cryovial directly in liquid nitrogen.
From the above, it is possible to cool and store the biological sample at a low temperature in a very good state showing an extremely high regeneration rate while preventing contamination of the biological sample by using the cooling tool according to the embodiment. Shown.
３．卵菌を含むナタネ種子の冷却物からの卵菌再生率の検証
［実験例２８］
（１）供試材料
滅菌したナタネ種子をPDA培地に置床し、そこへ卵菌を接種し２５℃で１カ月培養した。種子の中に侵入し増殖した卵菌を含むナタネ種子を供試材料に用いた。
3. 3. Verification of oomycete regeneration rate from chilled rapeseed seeds containing oomycete [Experimental Example 28]
(1) Test material Sterilized rapeseed seeds were placed on a PDA medium, inoculated with oomycetes, and cultured at 25 ° C. for 1 month. Rapeseed seeds containing oomycetes that invaded and proliferated in the seeds were used as test materials.
（２）ガラス化法による卵菌の処理
本処理は、ガラス化法（既報：A comparison of Vitrification and Droplet vitrification procedures for the cryopreservation of in vitro grown Black chokeberry shoot tips、Acta Horticulturae 908, 325-330, October 2011）に沿って行った。
１．０Ｍショ糖と２．０Ｍグリセリン液を含むＭＳ液体培地（ＬＳ液）を約１５ｍＬ入れた径５５ｍｍ滅菌プラスチックシャーレ内に、卵菌が増殖したナタネ種子を入れ、２５℃で３０分間の静置（ＬＳ処理）を行った。さらに、ナタネ種子を、ＭＳ液体培地を含むガラス化液ＰＶＳ２が約１５ｍＬ入った径５５ｍｍシャーレ内に移し、２５℃で３０分間の浸透脱水処理を行った。クライオプレート上の１０個のウエルに、１ウエルにつき１個のナタネ種子を入れた。
(2) Treatment of egg bacteria by vitrification method This treatment is performed by vitrification method (already reported: A comparison of Vitrification and Droplet vitrification procedures for the cryopreservation of in vitro grown Black chokeberry shoot tips, Acta Horticulturae 908, 325-330, October. 2011) was followed.
Place rapeseed seeds in which egg bacteria have grown in a 55 mm diameter sterile plastic petri dish containing approximately 15 mL of MS liquid medium (LS solution) containing 1.0 M sucrose and 2.0 M glycerin solution, and allow to stand at 25 ° C for 30 minutes. Placement (LS treatment) was performed. Further, the rapeseed seeds were transferred into a petri dish having a diameter of 55 mm containing about 15 mL of the vitrified solution PVS2 containing the MS liquid medium, and subjected to osmotic dehydration treatment at 25 ° C. for 30 minutes. Ten rapeseed seeds were placed in each of the 10 wells on the cryoplate.
（３）卵菌の超低温保存
上記の実験例１０におけるクライオプレートに代えて、上記のガラス化法で処理されたナタネ種子付きのクライオプレートを用いたこと以外は、上記の実験例１０と同様にして、卵菌の冷却物の製造を行った。
(3) Ultra-low temperature storage of oomycetes The same as in Experimental Example 10 above, except that a cryoplate with rapeseed seeds treated by the above vitrification method was used instead of the cryoplate in Experimental Example 10 above. Then, a cooled product of oomycete was produced.
（４）卵菌の昇温と再生
卵菌再生には、２ｍＬ容クライオバイアル内に、１．０Ｍショ糖液を含むＭＳ液体培地１．８ｍＬ入れ、その中に上記で得た卵菌の冷却物付きのクライオプレートを浸漬させ、２５℃の室温で昇温させた。さらに、そのまま１５分間放置して、卵菌を含むナタネ種子の洗浄と浸透圧調整を行った。次いで、０．５Ｍショ糖液を含むＭＳ液体培地に入れ、そのまま１５分間放置した。ナタネ種子をクライオプレートから取り出し、PDA培地上に置床し、再培養を行った。
再培養は，培養条件２５℃で行った。なお、上記の処理液及び培地は、オートクレーブで１２１℃、１５分間の滅菌を行ったものを用いた。
再培養の結果の評価は、置床３日後に正常に卵菌が増殖したナタネ種子を数えて、これを再生率とした（再生率（％）＝成長した菌糸が確認された種数／全種数×１００）。なお、各実験例ともナタネ種子１０個で３反復行い、その平均値を各実験例の再生率の値として示した。
(4) Temperature rise and regeneration of oomycetes For regeneration of oomycetes, 1.8 mL of MS liquid medium containing 1.0 M sucrose solution was placed in a 2 mL cryovial, and the oomycetes obtained above were cooled. A cryoplate with an object was immersed and the temperature was raised at room temperature of 25 ° C. Further, the seeds of rapeseed containing oomycete were washed and the osmotic pressure was adjusted by leaving the seeds as they were for 15 minutes. Then, it was placed in an MS liquid medium containing a 0.5 M sucrose solution and left as it was for 15 minutes. Rapeseed seeds were removed from the cryoplate, placed on PDA medium and recultured.
Reculture was performed under culture conditions of 25 ° C. The above-mentioned treatment liquid and medium used were sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes.
The evaluation of the result of reculture was performed by counting the rapeseed seeds in which oomycetes grew normally 3 days after placement and using this as the regeneration rate (regeneration rate (%) = number of species in which grown hyphae were confirmed / all species. Number x 100). In each experimental example, 10 rapeseed seeds were repeated 3 times, and the average value was shown as the value of the regeneration rate of each experimental example.
表４に、上記の測定物の温度変化の測定結果から得られた、冷却に要した時間と、０℃〜―６０℃の温度範囲における冷却速度を示す。 Table 4 shows the time required for cooling and the cooling rate in the temperature range of 0 ° C. to -60 ° C. obtained from the measurement results of the temperature change of the measured object.
表４に示す結果から、クライオプレートのみ（実験例１０）と、クライオプレートに載せたナタネ種子サンプル（実験例２４）の中心部の冷却速度が、ほぼ同じであることが分かる。 From the results shown in Table 4, it can be seen that the cooling rate of the central portion of the rapeseed seed sample (Experimental Example 24) placed on the cryoplate alone is almost the same as that of the cryoplate alone (Experimental Example 10).
表５に、卵菌の再生率の結果を示す。 Table 5 shows the results of the regeneration rate of oomycetes.
表５に示す結果から、実験例２８の卵菌試料を、非常に高い再生率で再生可能であることが示された。卵菌類は難保存微生物として、従来その保存が困難であったが、本実験により、高い再生率を示す非常に良好な状態で、保存が可能であることが示された。
以上のことから、実施形態に係る冷却用具を使用して、生物試料の汚染を防止し、且つ極めて高い再生率を達成可能な非常に良好な状態で、生物試料を冷却及び低温保存可能であることが示された。
From the results shown in Table 5, it was shown that the oomycete sample of Experimental Example 28 can be regenerated at a very high regeneration rate. As a difficult-to-preserve microorganism, oomycetes have been difficult to preserve in the past, but this experiment showed that they can be preserved in a very good state showing a high regeneration rate.
From the above, it is possible to cool and store the biological sample at a low temperature in a very good state where contamination of the biological sample can be prevented and an extremely high regeneration rate can be achieved by using the cooling tool according to the embodiment. Was shown.
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 Each configuration in each embodiment and a combination thereof are examples, and the configuration can be added, omitted, replaced, and other changes are possible without departing from the spirit of the present invention. Moreover, the present invention is not limited to each embodiment, but is limited only to the scope of claims.
１Ａ，１Ｂ，１Ｂ’，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ，１Ｆ，１Ｇ…冷却用具、１０，１００…ブロック、１０ａ…合わせ面、１０ｃ…凹部の内壁面、１１…側壁部、１２…底部、２０，２００，２１０…蓋体、２０ａ…合わせ面、２０ｃ…蓋体凹部の内壁面、２１…蓋体側壁部、２２…天板部、４１，４３…第１位置決め部、４２，４４…第２位置決め部、５０…液体窒素、６０…生物試料、６２…容器、６３…容器蓋、Ｃ…凹部、Ｃ’…蓋体凹部、Ｇ…間隙 1A, 1B, 1B', 1C, 1D, 1E, 1F, 1G ... Cooling tool, 10,100 ... Block, 10a ... Mating surface, 10c ... Inner wall surface of recess, 11 ... Side wall, 12 ... Bottom, 20,200 , 210 ... lid, 20a ... mating surface, 20c ... inner wall surface of lid recess, 21 ... lid side wall, 22 ... top plate, 41,43 ... first positioning part, 42,44 ... second positioning part , 50 ... Liquid nitrogen, 60 ... Biological sample, 62 ... Container, 63 ... Container lid, C ... Recess, C'... Lid recess, G ... Gap
Claims (21)
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具を用い、
以下の工程を含む、前記生物試料を冷却する試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、及び
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程。 It is equipped with a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample.
The block uses a cooling tool, which is made of metal or a material containing metal.
A sample cooling method for cooling the biological sample, which comprises the following steps:
A block cooling step of cooling the block to a temperature of −60 ° C. or lower, and a container for containing a biological sample are fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower to fit into the internal space of the recess. A sample storage process in which a biological sample is placed.
以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に試料冷却方法：
前記ブロックを−６０℃以下の温度に冷却する、ブロック冷却工程、
前記蓋体を−６０℃以下の温度に冷却する、蓋体冷却工程、
−６０℃以下の温度に冷却された前記ブロックの前記凹部に、生物試料を収める容器を嵌入し、前記凹部の内部空間に生物試料を入れる、試料収容工程、及び
前記試料収容工程の後、−６０℃以下の温度に冷却された前記蓋体を、前記凹部を覆うよう前記ブロック上に設置する、蓋体設置工程。 Further, the cooling tool is used, which comprises a lid covering the recess, and the lid is made of metal or a metal-containing material.
The sample cooling method according to any one of claims 1 to 4, which includes the following steps:
A block cooling step, in which the block is cooled to a temperature of −60 ° C. or lower.
A lid cooling step of cooling the lid to a temperature of −60 ° C. or lower,
After the sample storage step and the sample storage step, in which a container for storing a biological sample is fitted into the recess of the block cooled to a temperature of −60 ° C. or lower and the biological sample is placed in the internal space of the recess,- A lid installation step of installing the lid cooled to a temperature of 60 ° C. or lower on the block so as to cover the recess.
前記蓋体凹部は、前記ブロックの複数の前記凹部と対向する位置のそれぞれに対して個別に形成されている、請求項７に記載の試料冷却方法。 It is provided with a plurality of the recesses and a plurality of the lid recesses.
The sample cooling method according to claim 7, wherein the lid recesses are individually formed for each of a plurality of positions of the block facing the recesses.
生物試料を収める容器を嵌入するための凹部が設けられたブロックを備え、
前記ブロックは、金属又は金属を含有する材料から構成されている、冷却用具。 A cooling tool used in the sample cooling method according to any one of claims 1 to 11.
It is equipped with a block provided with a recess for fitting a container for containing a biological sample.
The block is a cooling tool made of metal or a material containing metal.
前記蓋体凹部は、前記ブロックの複数の前記凹部と対向する位置のそれぞれに対して個別に形成されている、請求項１７に記載の冷却用具。 It is provided with a plurality of the recesses and a plurality of the lid recesses.
The cooling tool according to claim 17, wherein the lid recess is individually formed for each of a plurality of positions of the block facing the recess.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020067346A JP2021161098A (en) | 2020-04-03 | 2020-04-03 | Sample cooling method, method for manufacturing cooled product, and cooling tool |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Family Applications (1)
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