JP2021120620A - Fluid for particle detection - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、粒子検出で用いる流体に関する。 The present invention relates to a fluid used in particle detection.
粒子を個々に１つずつ測定することで、マイノリティーな粒子群を正確に検出可能な技術として、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下ＥＳＺと記載）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。この手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定できる。 The Coulter method (electrical detection band method; hereinafter referred to as ESZ) using electrical detection is a technique capable of accurately detecting a minority particle group by measuring each particle one by one (for example, non-patent literature). 1) is known. In this method, since the information (signal) obtained from each detection means has a one-to-one correspondence with each particle, it is possible to evaluate each particle individually, and the ratio contained numerically is small. Even particles can be measured accurately.
ＥＳＺ法ではアパーチャに粒子を通過させた際に発生する電気的シグナルを用いて粒子径を算出するが、一般にそのダイナミックレンジはアパーチャ径の２〜６０％といわれている。ＥＳＺ法の欠点であるダイナミックレンジの狭さを解消するため粒子を分級し、異なるアパーチャ径を持つＥＳＺ法で検出する方法が開発されている（例えば、特許文献１）。 In the ESZ method, the particle size is calculated using an electrical signal generated when particles are passed through the aperture, and the dynamic range is generally said to be 2 to 60% of the aperture diameter. In order to eliminate the narrow dynamic range, which is a drawback of the ESZ method, a method of classifying particles and detecting them by the ESZ method having different aperture diameters has been developed (for example, Patent Document 1).
特許文献１のように連続的な分離を可能にする技術として、マイクロ流路を用いたピンチドフローフラクショネーション法（Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ法；以下、ＰＦＦと記載）が利用されている。
特許文献１に記載の装置で測定できる粒子の種類は、ポリマー等の有機粒子から無機粒子、細胞、小胞、リポソーム、生体分子等多岐にわたり、これらを懸濁する流体の組成も様々である。よって、高感度な検出をするためには、粒子を希釈懸濁する流体の組成および分離に使用する流体の組成を適切に決定する必要がある。
As a technique for enabling continuous separation as in
The types of particles that can be measured by the apparatus described in
本発明の課題は、ＰＦＦとＥＳＺの組み合わせによる粒子検出において、高感度な粒子検出が可能な流体を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a fluid capable of highly sensitive particle detection in particle detection by a combination of PFF and ESZ.
本発明者らは上記課題を鑑み、粒子を希釈懸濁する流体および分離に使用する流体に含まれる界面活性剤濃度を最適化することで高感度な粒子検出が可能となることを見出した。
すなわち、本発明は、Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ法と電気的検知帯法の組み合わせによる粒子検出において用いることができる、電解質を含み且つ界面活性剤濃度０％以上１０％（Ｖ／Ｖ）未満であることを特徴とする流体である。
In view of the above problems, the present inventors have found that highly sensitive particle detection is possible by optimizing the concentration of the surfactant contained in the fluid for diluting and suspending the particles and the fluid used for separation.
That is, the present invention contains an electrolyte and has a surfactant concentration of 0% or more and less than 10% (V / V), which can be used in particle detection by a combination of the Pinked Flow Fractionation method and the electrical detection band method. It is a characteristic fluid.
本発明により、Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ法と電気的検知帯法の組み合わせによる粒子検出において、高感度な粒子検出が可能な流体を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a fluid capable of highly sensitive particle detection in particle detection by a combination of a Pinked Flow Fractionation method and an electrical detection band method.
以下、本発明を実施するための形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでは無い。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the present invention can be implemented in different embodiments, and is not limited to the examples of the embodiments and examples shown below.
本発明による粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。 The details of the embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 1, which is a schematic diagram showing an embodiment of the device configuration of the particle detection device according to the present invention.
図１に示す通り、粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎは、流体導入口であるインレット１４ａ、１４ｂから導入され、送液部によって流路下流へと送液され、狭窄流路１６、拡大流路１７、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂまたは１０２ｃ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂまたは１０３ｃを通過して、流体排出口であるアウトレット１０４ａまたは１０４ｂまたは１０４ｃへ流出する。拡大流路１７を流れる粒子は粒子回収流路１０２へと流れ、粒子回収流路１０２を経て到達した粒子検出部１０３において、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３の内部と、アウトレット１０４は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂが浸漬されている。さらに、電極５４ａ、５４ｂへは、それぞれに接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７が接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。
As shown in FIG. 1, the fluid 100P containing particles and the fluid 100N not containing particles are introduced from the
粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４は電解質を含む流体で満たされるが、その界面活性剤濃度は０ｗｔ％以上１０％未満である。好ましくは、０％以上５％未満であることが好ましい。電解質は必須であり、塩を用いることができる。一例として塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸リチウム、アミノ酸の塩、例えばヒスチジン塩酸塩、アルギニン塩酸塩、グリシン塩酸塩を用いることができる。塩化ナトリウムが特に好ましい。 The inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 are filled with a fluid containing an electrolyte, and the concentration of the surfactant thereof is 0 wt% or more and less than 10%. Preferably, it is 0% or more and less than 5%. Electrolytes are essential and salts can be used. As an example, salts of sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, sodium acetate, potassium acetate, lithium acetate and amino acids such as histidine hydrochloride, arginine hydrochloride and glycine hydrochloride can be used. Sodium chloride is particularly preferred.
流体には緩衝剤や添加剤が混合していても良い。緩衝剤の一例としてはリン酸、クエン酸、酢酸、コハク酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ヒスチジン、グリシン、アルギニンやこれらの塩を用いることができ、好ましくはリン酸の緩衝溶液が好ましい。添加剤の一例としてはツイーン２０やツイーン８０といった界面活性剤、アルギニン、ヒスチジン、グリシンといったアミノ酸、白糖やマンニトール、ソルビトール、トレハロースといった糖類、アジ化ナトリウムといった防腐剤、ストレプトマイシンやペニシリンなどの抗生物質を用いても良い。また、溶媒としては水が好ましいが、電解質が溶解するものであれば有機溶媒やオイル、油を用いても良い。 The fluid may be mixed with a buffer or an additive. As an example of the buffer, phosphoric acid, citric acid, acetic acid, succinic acid, trishydroxymethylaminomethane, histidine, glycine, arginine and salts thereof can be used, and a buffer solution of phosphoric acid is preferable. Examples of additives include surfactants such as Tween 20 and Tween 80, amino acids such as arginine, histidine and glycine, sugars such as sucrose, mannitol, sorbitol and trehalose, preservatives such as sodium azide, and antibiotics such as streptomycin and penicillin. You may. Water is preferable as the solvent, but an organic solvent, oil, or oil may be used as long as the electrolyte is soluble.
粒子を含む流体１００Ｐは、測定対象とする粒子を含んだ流体である。本発明における粒子とは、粒径が１ｎｍ〜１０００μｍ、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍの範囲にあり、例えば、核酸、タンパク質、小胞、リポソーム、細胞外小胞、無機粒子、金属コロイド、高分子粒子、ウイルス、細胞、細胞塊、前記粒子の凝集体や会合体、融合体などが含まれる。 The fluid 100P containing particles is a fluid containing particles to be measured. The particles in the present invention have a particle size in the range of 1 nm to 1000 μm, preferably 10 nm to 100 μm, and include, for example, nucleic acids, proteins, vesicles, liposomes, extracellular vesicles, inorganic particles, metal colloids, and polymer particles. Includes viruses, cells, cell clumps, aggregates and aggregates of the particles, fusions and the like.
インレット１４ａは、粒子を含むサンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。
The
送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４ａへ直接接続することでインレット１４ａ内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４ａの液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。
The liquid feeding unit may use a method of feeding liquid by a pressure gradient such as a syringe pump, a perista pump, or a pressure feeding pump, or an electroosmotic flow pump in order to suppress a non-uniform velocity distribution in the flow path cross section of the
送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。 The flow rate of the liquid feeding unit is preferably set to an arbitrary value depending on the cross-sectional area of the flow path and the cross-sectional area of the aperture, and as an example, it is preferably set between 0.1 μL / hour and 1 mL / hour.
粒子回収流路１０２は、測定可能粒子径範囲（ダイナミックレンジ）を拡げる観点で２以上設ける。ここで、粒子検出部１０３は粒子回収流路１０２の内部または下流に設けられており、粒子回収流路１０２へ流入してきた粒子を検出するために用いられる。１つの粒子回収流路１０２に対して少なくとも１つの粒子検出部１０３が設けられている必要があり、２以上の粒子検出部１０３または２以上のアパーチャが設けられていてもよい。図２に示すように、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成され、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットへ電極５４を浸漬させることで電極挿入口５９としても機能するようにしてＥＳＺによる粒子検出を行ってもよい。 Two or more particle recovery flow paths 102 are provided from the viewpoint of expanding the measurable particle size range (dynamic range). Here, the particle detection unit 103 is provided inside or downstream of the particle recovery flow path 102, and is used to detect the particles that have flowed into the particle recovery flow path 102. At least one particle detection unit 103 needs to be provided for one particle recovery flow path 102, and two or more particle detection units 103 or two or more apertures may be provided. As shown in FIG. 2, the particle detection unit 103 is composed of two apertures, the downstream of each aperture is connected to an outlet, and the electrode 54 is immersed in each outlet to function as an electrode insertion port 59. Particle detection by ESZ may be performed in this way.
粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２〜６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。
The particle detection unit 103 includes an
電極５４ａ、５４ｂは流体排出口内の電解質を含む溶液内にその先端が浸漬するようにして配置されており、電源から供給された電流は、一方の電極５４ａまたは５４ｂから、アパーチャ５３を通過し、他方の電極へと流れることになる。この場合、ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。この時、Ｌはアパーチャを形成する流路の長さ、ｄｅはアパーチャの等価直径、Ｌ’は中継流路６０の長さ、ｄｅ’は中継流路６０の等価直径とした。また、式（１）によるシグナル低下の加味はその流路構造に応じて適宜行うことが好ましく、必ずしも式（１）と完全に合致した式でなくてもよい。
The
図２のように粒子検出部１０３のアパーチャが複数設けられている場合、各々の断面積または体積が同じであれば両アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、両アパーチャへ流れてきた粒子全てを同様に検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい。 When a plurality of apertures of the particle detection unit 103 are provided as shown in FIG. 2, if the cross-sectional areas or volumes of the apertures are the same, the signals obtained from both apertures are substantially the same. That is, it is possible to detect all the particles flowing into both apertures in the same manner, which is preferable from the viewpoint of quantitative measurement of the concentration.
電源５７は直流または交流電源を用いられるが、測定の際によりノイズが影響しにくいものを選択する方が好ましく、コスト面からは、例えば乾電池等の安価で低ノイズである直流電源を用いる方が好ましい。また、電極の材料は電気抵抗が小さい材質であれば制限はなく、金属、無機化合物、有機化合物を用いることができるが、耐久性とコストの面から金属であることが好ましい。
A DC or AC power supply is used as the
粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。またアパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。
The electric detector of the particle detection unit 103 mainly includes an electrode 54, an electric measuring instrument 56 connected to the electrode 54 via a
解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。 The analysis unit 61 can include an arithmetic unit for calculating the measurement result and a recording medium for recording the measurement result or the calculation result derived from the measurement result. Alternatively, these arithmetic units and recording media may be integrated with the electric measuring instrument 56, or may be an external device that can be connected to the electric measuring instrument 56. The data recorded on the recording medium includes the sampled current value, the change in the current value generated when the particles pass, and the particle size, number of particles, particle concentration, detection time or measurement calculated from the change in the current value. The elapsed time from the start is included.
粒子検出装置の製造
本発明による粒子検出方法を実施するための粒子検出装置の実施形態を備えたマイクロチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下の通り示す。
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ−８ ３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ−８ ３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ−８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。
Manufacture of Particle Detection Device The
A photoresist SU-83005 (Microchem) was dropped onto a 4-inch bare silicon wafer (Filtech Co., Ltd.), and then a photoresist thin film was formed using a spin coater (MIKASA). At this time, a diluent Cyclopentanone (Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was added to SU-8 3005 according to the target film thickness. Subsequently, a channel pattern is formed on the photoresist film using a mask aligner (Ushio, Inc.) and a chrome mask having an arbitrary pattern formed, and the channel pattern is developed using SU-8 Developer (Microchem). As a result, a mold for the flow path to be used was prepared.
Subsequently, uncured LSR7070FC (Momentive Performance) was poured into the prepared mold and heated at 80 ° C. for 2 hours to prepare polydimethylsiloxane (PDMS) having the shape of the flow path transferred. The cured PDMS was peeled off from the mold, molded to an arbitrary size with a cutter, and then the inlet and outlet of the flow path were formed using a puncher. The peeled PDMS and the slide glass (Matsunami Glass Co., Ltd.) were surface-treated with an oxygen plasma generator (Meiwaforsis Co., Ltd.), and then the PDMS and the slide glass were bonded to each other to prepare a
ＥＳＺによる粒子の電気的検出
作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
各インレットは、テフロンチューブを介してＰ−ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社）へ接続し、一定の流量で送液した。
Electrical detection of particles by ESZ The produced
Each inlet was connected to P-PumpBasic (Dolomite Microfluidics) via a Teflon tube, and the liquid was fed at a constant flow rate.
サンプル調製
検出対象である、粒子を含む流体１００Ｐ中の粒子として以下の標準粒子を用いた。
０．１μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３１００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．２μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）
０．５μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子３５００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製
１．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４００９Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製
２．０μｍ粒子としてポリスチレン標準粒子４２００Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製
分離対象の粒子を含有する流体１００Ｐとしては、
ツイーン２０を含有しないリン酸緩衝液
ツイーン２０を０．０２５％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を０．１％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を０．２５％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を０．５％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を１．０％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を２．５％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を５．０％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
ツイーン２０を１０．０％（ｖ／ｖ）含有するリン酸緩衝液
（いずれの緩衝液も塩化ナトリウムを０．９重量％含む。）
を調製した。前記各流体は、粒子を懸濁する前にポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行ってから実験に用いた。
Sample preparation The following standard particles were used as particles in the fluid 100P containing particles to be detected.
Polystyrene standard particles 3100A (manufactured by Thermo Fisher) as 0.1 μm particles
Polystyrene standard particles 3200A (manufactured by Thermo Fisher) as 0.2 μm particles
Polystyrene standard particles 3500A as 0.5 μm particles (Polystyrene standard particles 4009A as 1.0 μm particles manufactured by Thermo Fisher) (Polystyrene standard particles 4200A as 2.0 μm particles manufactured by Thermo Fisher (manufactured by Thermo Fisher) As a fluid 100P containing particles to be separated,
Phosphate buffer solution containing no
Was prepared. Each of the above fluids was used in the experiment after removing foreign substances using a syringe filter (manufactured by Merck Millipore) having a pore size of 0.1 μm before suspending the particles.
実施例１：
図１で示されるマイクロチップ１０を、上述の手順に基づき作製した。各検出部の形状は図２と同様とした。
０．１、０．２、０．５、１．０μｍ標準粒子は、ツイーン２０を含有しないリン酸緩衝液によって希釈した後、両者を混合して粒子懸濁液（サンプル）とした。それぞれのポリスチレン標準粒子の濃度は５μｇ／ｍＬの濃度となるよう調製し、粒子を含む流体１０１Ｐとした。また、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体もツイーン２０を含まないリン酸緩衝液とした。
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４へ粒子を含む流体１０１Ｐと粒子を含まない１０１Ｎを各々０．０３μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき各アパーチャへ流入した粒子を合計８分間検出した。測定結果をヒストグラムへまとめると図３の通りとなり、混合粒子でもピークが分離することを確認した。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度及び平均粒径を表１に示す。
Example 1:
The
The 0.1, 0.2, 0.5, and 1.0 μm standard particles were diluted with a phosphate buffer solution containing no
Using the above-mentioned
実施例２：
０．１、０．２、０．５、１．０、２．０μｍ標準粒子は、ツイーン２０濃度０．０２５％（Ｖ／Ｖ）リン酸緩衝液によって希釈した後、両者を混合して粒子懸濁液（サンプル）とした。粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度０．０２５％（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例１と全て同様にして粒子を１分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図４の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 2:
The 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, and 2.0 μm standard particles are diluted with a
実施例３：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度０．０５％（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を１分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図５の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 3:
All the same as in Example 2 except that the diluted solution of polystyrene particles, the fluid 101N containing no particles, and the fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were set to a
実施例４：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度０．１％（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を１分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図６の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 4:
All the same as in Example 2 except that the diluted solution of polystyrene particles, the fluid 101N containing no particles, and the fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were set to a
実施例５：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度０．２５（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を合計８分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図７の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 5:
All the same as in Example 2 except that the diluted solution of polystyrene particles, the fluid 101N containing no particles, and the fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were set to a
実施例６：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度０．５％（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を合計８分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図８の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 6:
All the same as in Example 2 except that the diluted solution of polystyrene particles, the fluid 101N containing no particles, and the fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were set to a
実施例７：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度５％（Ｖ／Ｖ）のとした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を合計８分間検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図９の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Example 7:
All the same as in Example 2 except that the diluted solution of polystyrene particles, the fluid 101N containing no particles, and the fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were set to a
比較例１：
ポリスチレン粒子の希釈液、粒子を含まない流体１０１Ｎ、粒子検出部１０３の内部とアウトレット１０４へ満たす流体をツイーン２０濃度１０％（Ｖ／Ｖ）のリン酸緩衝液とした点以外は実施例２と全て同様にして粒子を検出した。測定を３回繰り返し、その平均値をヒストグラムへまとめると図１０の通りとなった。測定結果から得られた各標準粒子の粒子濃度の平均値及び平均粒径の平均値を表１に示す。
Comparative Example 1:
Example 2 and Example 2 except that a diluted solution of polystyrene particles, a fluid 101N containing no particles, and a fluid filling the inside of the particle detection unit 103 and the outlet 104 were used as a phosphate buffer solution having a
１０ マイクロチップ
１４ａ、１４ｂ インレット
１６ 狭窄流路
１７ 拡大流路
１８ａ、１８ｂ 入口側分岐流路
２２ ドレイン流路
２３ アウトレット
５０ 粒子
５１ 粒子の流れる方向
５２ アパーチャ形成構造
５３ アパーチャ
５４ａ、５４ｂ 電極
５５ 導線
５６ 電気測定器
５７ 電源
６０ 中継流路
６１ 解析部
６２ 粒子検出流路
１００Ｐ 粒子を含む流体
１００Ｎ 粒子を含まない流体
１０２ａ〜ｃ 粒子回収流路
１０３ａ〜ｃ 粒子検出部
１０４ａ〜ｃ アウトレット
10
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