JP2021106607A - 化学的にコードされ空間的にアドレスされたライブラリースクリーニングプラットフォーム - Google Patents

Abstract

【課題】種々の分子のスクリーニングおよび検出のための高度に多様で高密度のアレイを形成するのに有用であるコードされたスプリットプールライブラリーを提供する。【解決手段】（ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および（ｉｉ）第２のリンカーを通じて核酸ドメインに共有結合している微粒子であって、第２のリンカーが切断可能であり、第１のリンカーは第２のリンカーが切断可能である条件下では切断可能ではない、微粒子を提供する。【選択図】図３

Description

本出願は２０１５年２月２４日に提出された米国特許仮出願公開第６２／１２０，２６２号の利益を主張するものであり、この特許文献の内容は参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

ＡＳＣＩＩファイルとして提出される「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリストの添付物の参照

２０１６年２月２４日に作成されたファイル４８４４０−５１１００１ＷＯ＿ＳＴ２５に書き込まれた配列表は、５，９６７バイトの、機械フォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

スクリーニングおよび検出法のために使用されるアレイにより表示される分子の数はアレイの合成法により限定される。理論上、スプリットプール合成法は膨大なライブラリーを作成することが可能であり、ステップあたり利用される化学ステップの数および独特な構成要素の数によってのみ制限される（すなわち、ステップあたり１００の独特の構成要素を利用する５ステップライブラリーでは理論上は１００^５または１００億のメンバーの化学ライブラリーを産すると考えられる。）。しかし、実際問題として、コードされたスプリットプール戦略は数多くの実際上の制約に直面する。デコード可能であるがスクリーニングできないまたはスクリーニングできるがデコード可能ではないライブラリーは有用ではない。コード化戦略は使用される化学ステップまたは構成要素の数および種類が実際的に制限されることがある。デコード化のために（例えば、高周波タグまたは質量分析により）大きな粒子を必要とするコードされたスプリットプールライブラリープラットフォームは通常は、もっと小さな粒子上で作成することが可能な類似のライブラリーよりも少ないライブラリーメンバーを含有する必要がある。アッセイを粒子上で実施するつもりならば、それぞれの粒子上のリガンド密度およびそれぞれのリガンド周辺の表面化学環境はアッセイを妨げるべきではない。報告されているデコード化戦略の連続的性質は、所与のスクリーンでは費用効果のある様式で同定することが可能な「ヒット」の数も制限し、したがって、スクリーニングされるライブラリーの大きさを制限することが可能である。本発明は当技術分野のこうしたおよび他の問題に取り組む。

（発明の要旨）
一態様では、微粒子が提供される。微粒子は第１のリンカーを通じてリガンド領域に、第２のリンカーを通じて核酸ドメインに共有結合しており、第２のリンカーは切断可能であり、第１のリンカーは第２のリンカーが切断可能な条件下では切断可能ではない。

別の態様では、微粒子に結合している固体支持体であって、微粒子は（ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および（ｉｉ）切断されたリンカー部分に共有結合している、固体支持体が提供される。

別の態様では、切断された微粒子を形成する方法が提供される。この方法はこの実施形態を含む本明細書に提供される微粒子を固形支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成することを含む。固定化された微粒子の第２のリンカーが切断され、それによって切断された微粒子を形成する。

別の態様では、リガンドバインダーを検出する方法が提供される。この方法は（ｉ）この実施形態を含む本明細書に提供される微粒子を固形支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成することを含む。（ｉｉ）相補的核酸が固定化された微粒子の核酸ドメインに結合しており、固体支持体上の核酸ドメインの位置が決定され、それによってデコードされマッピングされた微粒子を形成する。（ｉｉｉ）デコードされマッピングされた微粒子の第２のリンカーが切断され、それによってマッピングされ切断された微粒子を形成する。（ｖｉ）リガンドバインダーがマッピングされ切断された微粒子のリガンドドメインに結合しており、（ｖ）固体支持体上の結合したリガンドバインダーの位置が同定され、それによってリガンドバインダーを検出する。

別の態様では、リガンドバインダーを検出する方法が提供される。この方法は（ｉ）リガンドバインダーをこの実施形態を含む本明細書に提供された微粒子に接触させ、それによって結合されたリガンドバインダーを形成することを含む。（ｉｉ）結合されたリガンドバインダーの固体支持体上の位置が同定され、それによってリガンドバインダーを検出する。

ライブラリーを作成するのに使用される微粒子の全体構造を図示する概略図である。Ａ、Ｂ、およびＣの比の変動は、出発物質ＰｒｏＭａｇ１ＣＯＯＨシリーズ粒子に適用される１つ以上の合成変換を通じて達成される。最初の標的比は、粒子表面を組み立てるのに使用される構成要素の混合物の相対比により設定される。達成される最終比は切断生成物のＴＧＡ、ＬＣ／ＭＳまたはゲル分析と比色分析または蛍光ベースの固相アッセイの組合せを通じて測定される。好ましい範囲：Ｘは０．１−１００ナノモル／ｍｇの濃度を有し；１％Ｘ≦Ａ≦２０％Ｘ；４０％Ｘ≦Ｂ≦９９％Ｘ；０％Ｘ≦Ｃ≦５０％Ｘ；ＸはＡ（ライブラリー分子結合点）、Ｂ（コード化タグ結合点）またはＣ（コア固定化点）である。 コードされたスプリットプール合成を実施することが可能な方法を示す全体的概略図であり、化学ステップおよび構成要素の数の線形増加と共に観察される化学的多様性の指数関数的増加を強調している。概説については、Ｃｚａｒｎｉｋ、Ａ．Ｗ．「Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、」Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９７年、１、６０−６６頁を参照されたい。例：１００の構成要素、６ラウンドのスプリットプール、１×１０^１２の独特のメンバー、６００の化学反応。ｎはスプリットプールラウンドの数であり、ｘは構成要素の数であり、独特のライブラリーメンバー＝Ｘ^ｎ、化学反応＝ｎ^Ｘである。 コードされつつある化学としてペプチド合成を使用する１ラウンドのコードされた合成ステップ中に化学結合が形成され切断されている説明図である。ステップ１では、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸がアミドカップリングを通じて微粒子上の遊離のアミンに結合している。ステップ２では、アルキンと遊離の一級アミンを帯びる核酸タグは銅触媒されたヒュスゲン環化付加を通じて微粒子上のアジド基に結合している。ステップ３では、アジド基はアミドカップリングを通じて核酸上の一級アミンに結合している。ステップ４では、組み込まれたアミノ酸のアミン基を保護しているＦｍｏｃ基が取り除かれる。ステップ４に続く生成物は出発物質（ステップ１に先立って）と同じ反応性部分を表示するが、追加の核酸タグ及び追加のアミノ酸を含有している。反応の詳細については材料と方法を参照されたい。直交合成のために最初の微粒子がどのようにして調製されるかについての詳細な例については材料と方法を参照されたい。 潜在的なタグ付けアプローチのうちの１つにおける核酸タグの結合性を図示する概略図である。この変形では、それぞれのタグ付けステップ中、微粒子上のタグ結合点のすべてが消費され、次に対応量の新しいタグ結合点が新たに結合した核酸タグの末端に作成される。この例における２つのタグ付けステップにより、タグ２に連結しているタグ１からなるそれぞれのビーズ上にオリゴマーを含有する主に核酸の単一集団が作成されると考えられる。意図的に、それぞれのタグ集団は、デコード可能性がそれぞれ個々のタグの存在のみに依存するように独立してデコード可能である、すなわち、タグ２のデコード可能性は、どちらのタグ付けステップにおいても完全な変換にまで行っていないことがあるビーズのサブセットが、十分な量のそれぞれのタグがデコード化のために存在する限り、それでもデコード可能であるようにタグ１に直接結合していることに依存していない、および逆もまた同様であることに注目されたい。 潜在的なタグ付けアプローチのうちの１つにおける核酸タグの結合性を図示する概略図である。この変形では、それぞれのタグ付けステップ中、タグ用の微粒子上のタグ結合点の一部分のみが消費される。示されているように、この例における２つのタグ付けステップにより、それぞれのビーズ上にオリゴマーを含有する核酸の２つの集団、すなわち、タグ１からなる１つの集団とタグ２からなる１つの集団が作成されると考えられる。４つのタグ付けステップでは、ビーズあたり４つの独特な集団が作成されると考えられる。 潜在的なタグ付けアプローチのうちの１つにおける核酸タグの結合性を図示する概略図である。この変形では、それぞれのタグ付けステップ中、微粒子上のタグ結合点の一部分が消費され、次に対応量の新しいタグ結合点が新たに結合した核酸タグの末端に作成される。この例における２つのタグ付けステップにより、それぞれのビーズ上にオリゴマーを含有する核酸の３つの集団、すなわち、タグ１、タグ２およびタグ２に連結されたタグ１からなるオリゴマーが作成されると考えられる。意図的に、それぞれのタグ集団は、それぞれのタグのデコード可能性がそれぞれ個々のタグの存在のみに依存するように独立してデコード可能である、すなわち、タグ２のデコード可能性はタグ１に直接結合していることに依存していない、および逆もまた同様であることに注目されたい。 １ラウンドのタグ付けおよび新しいタグ連結エレメントの付加中の異なるタグ中間体のＬＣトレースを示す図である。保持時間および質量分析スペクトルの変化により示されているように、固相環化付加化学は主に所望の生成物を産している。新しいタグ連結エレメントの固相アミドカップリングに続いて、ＬＣ／ＭＳ分析は所望の生成物への変換を示している。環化付加条件、アミドカップリング条件、および切断条件については材料および方法を参照されたい。 ＰＥＧ修飾微粒子の一部が酸不安定性リンカーで官能化され、７ステップ固相ペプチド合成にかけられたことを示す図である。生成物はＴＦＡを使用して微粒子から切断された。ＴＦＡは取り除かれ残基は質量分析により分析されて、所望のペプチドの合成が成功したことを示している。 ２つの異なる様式でのライブラリー固定化の表示である。図９Ａは、アミド結合形成を通じて活性化カルボキシメチルデキストラン被覆スライドに共有結合的に固定化された出願人の微粒子の一部の明視野像である。 ２つの異なる様式でのライブラリー固定化の表示である。右側の図９Ｂは、カスタム微細加工シリコンウェーハ内に非共有結合的に固定化された出願人の微粒子の一部のＳＥＭ像である。 ４ラウンドのコード化／タグ付けステップ（図６のコード化模式図に概説されている）を受ける微粒子が首尾よくデコード可能であることを示す画像である。微粒子の２つの異なる部分は図６に例示される４ラウンドのタグ付けに同時にかけられた。微粒子のそれぞれの部分はそれぞれのタグ付けステップで独特の１８マーをタグ付けされた。４ラウンドのコード化に続いて、それぞれの部分は、２つの異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブの１対１混合物を含有する一連のハイブリダイゼーション溶液に曝露された。ハイブリダイゼーションに続くタグ付けされた微粒子のアリコートの８つの異なる２チャネル蛍光画像が示されている。コラム１では、２つの微粒子試料が、Ａ０に相補的なＣｙ３標識オリゴヌクレオチドとＡ１に相補的なＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドの１対１混合物でハイブリダイズされた。予想通り、タグＡ０でコードされた粒子は赤色（Ｃｙ３）チャネルで蛍光を発し（上画像、コラム１）、タグＡ１でコードされた粒子は緑色（ＦＩＴＣ）チャネルで蛍光を発した（下画像、コラム２）。この傾向はその他のハイブリダイゼーション条件すべてに当てはまり、これらの条件では粒子はミスマッチドタグよりもむしろ相補的ＤＮＡ配列タグに結合している蛍光標識に対応する波長で選択的に蛍光を発する。 ４ラウンドのコード化／タグ付けステップ（図５に概説されている）を受ける微粒子が首尾よくデコード可能であることを示す画像である。微粒子の２つの異なる部分は図５に例示される４ラウンドのタグ付けに同時にかけられた。微粒子のそれぞれの部分はそれぞれのタグ付けステップで独特の１８マーをタグ付けされた。４ラウンドのコード化に続いて、それぞれの部分は、２つの異なる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブの１対１混合物を含有する一連のハイブリダイゼーション溶液に曝露された。ハイブリダイゼーションに続くタグ付けされた微粒子のアリコートの８つの異なる２チャネル蛍光画像が示されている。コラム１では、２つの微粒子試料が、Ａ０に相補的なＣｙ３標識オリゴヌクレオチドとＡ１に相補的なＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドの１対１混合物でハイブリダイズされた。予想通り、タグＡ０でコードされた粒子は赤色（Ｃｙ３）チャネルで蛍光を発し（上画像、コラム１）、タグＡ１でコードされた粒子は緑色（ＦＩＴＣ）チャネルで蛍光を発した（下画像、コラム２）。その傾向はその他のハイブリダイゼーション条件すべてに当てはまり、これらの条件では粒子はミスマッチドタグよりもむしろ相補的ＤＮＡ配列タグに結合している蛍光標識に対応する波長で選択的に蛍光を発する。 ペプチド合成が出願人のコード化化学と適合することを立証するため、２つのペプチド（ＨＡおよびＭｙｃ、２つの一般的抗体エピトープ）は微粒子上で同時に合成され、合成ステップの４つはＤＮＡタグでコードされたことを示す画像および図である。粒子は、合成の様々なステップでＨＡエピトープに特異的であるＣｙ５標識抗体と一緒にインキュベートされた。ＤＮＡタグおよび完全に保護されたＨＡペプチドを表示した微粒子（側鎖保護化部分は取り除かれていない）は標識抗体とは結合しなかった（１列目画像）。ＤＮＡタグの切断に続いて、側鎖保護されたＨＡペプチドを表示する微粒子は標識抗体と結合しない（２列目画像）。側鎖保護化部分の脱保護（ＴＦＡ処理）に続いて、ＨＡ表示微粒子はこの時点では標識抗体と結合する（３列目画像）。完全に脱保護されたＭｙｃペプチドを表示する微粒子は標識抗体と結合しない（４列目画像）。 ペプチド合成が出願人のコード化化学と適合することを立証するため、２つのペプチド（ＨＡおよびＭｙｃ、２つの一般的抗体エピトープ）は微粒子上で同時に合成され、合成ステップの４つはＤＮＡタグでコードされたことを示す画像および図である。粒子は、合成の様々なステップでＭｙｃエピトープに特異的であるＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識抗体と一緒にインキュベートした。ＤＮＡタグおよび完全に保護されたＭｙｃペプチドを表示した微粒子（側鎖保護化部分は取り除かれていない。）は標識抗体とは結合しなかった（１列目画像）。ＤＮＡタグの切断に続いて、側鎖保護されたＭｙｃペプチドを表示する微粒子は標識抗体と結合しない（２列目画像）。側鎖保護化部分の脱保護（ＴＦＡ処理）に続いて、Ｍｙｃ表示微粒子はこの時点では標識抗体と結合する（３列目画像）。完全に脱保護されたＨＡペプチドを表示する微粒子は標識抗体と結合しない（４列目画像）。 ビーズと染料を混合すると結合を識別する能力を立証することを示す画像である。完全に脱保護されたＨＡペプチドまたはＭｙｃペプチドを帯びるタグなしビーズを混合し、抗ＨＡ−Ｃｙ５および抗Ｍｙｃ−Ａｌｅｘａ４８８の混合物で染色した。蛍光画像は２つのはっきり異なるビーズ集団を示している。 ０．８８μｍのＰｒｏｍａｇ粒子のＳＥＭを示す画像である。 六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍのシリコンチップを示す図である。 正方形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍのシリコンチップを示す図である。 マイクロスフィアで部分的に充填されている正方形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍのシリコンチップを示す図である。 マイクロスフィアで充填されている六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍのシリコンチップを示す図である。 傾斜形のマイクロスフィアで充填されている六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍのシリコンチップを示す図である。 六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍの部分的に充填されたシリコンチップに固定化されたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８標識マイクロスフィアの蛍光画像を示す画像である。 六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍの部分的に充填された水晶チップに固定化されたマイクロスフィアの明視野像を示す画像である。 六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで１．３μｍの部分的に充填された水晶チップに固定化されたマイクロスフィアの自己蛍光を示す画像である。 六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで２．４μｍのシリコンチップを示す画像である。 部分的にマイクロスフィアで充填された六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで２．４μｍのシリコンチップを示す画像である。 シリコンチップに固定化された蛍光標識ＤＮＡ相補体でハイブリダイズされたＤＮＡタグ付のマイクロスフィアの蛍光画像を示す画像である。チップは部分的に充填されており、六角形配列中のウェルの間隔が中心から中心までで２．４μｍを有する。

定義
本発明の種々の実施形態および態様が本明細書で示され説明されるが、そのような実施形態および態様は例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。この時点で、当業者には本発明から逸脱することなく数多くのバリエーション、変化および置き換えが思い浮かぶ。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物を本発明を実行する際に用いることができることは理解されるべきである。

本明細書で使用される見出しは体系化目的のみのためであり、記載される主題を限定するものと解釈するべきではない。これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、説明書、および論文を含む出願中に引用されるすべての文書、または文書の部分は、いかなる目的であれ参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される略称は化学および生物学の技法内でのそれらの従来の意味を有する。本明細書に記載される化学構造および化学式は、化学技法で公知である化学原子価の標準則に従って構成される。

置換基が、左から右に書かれて、その従来の化学式により特定されている場合、置換基は構造を右から左に書くことから生じると考えられる化学的に同一の置換基を等しく包含し、例えば、−ＣＨ_２Ｏ−は−ＯＣＨ_２−と等価である。

単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「アルキル」とは、別段の指定がない限り、直鎖（すなわち、非分岐）もしく分岐非環状炭素鎖（または炭素）、またはこれらの組合せのことであり、これは完全に飽和していても、一不飽和、または多価不飽和でもよく、二価もしくは多価遊離基を含むことが可能であり、炭素原子の数が指示されている（すなわち、Ｃ_１−Ｃ_１０は１から１０の炭素を意味する。）。飽和炭化水素遊離基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチルの相同体および異性体、ならびに同類のものを含むがこれらに限定されない。不飽和アルキル基は１つ以上の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例には、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高次相同体および異性体を含むがこれらに限定されない。アルコキシは、酸素リンカー（−Ｏ−）を介して分子の残部に結合しているアルキルである。アルキル部分はアルケニル部分でもよい。アルキル部分はアルキニル部分でもよい。アルキル部分は完全に飽和していてもよい。

単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「アルキレン」とは、別段の指定がない限り、アルキルに由来する二価遊離基のことであり、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−により例示されるが、これに限定されない。典型的には、アルキル（アルキレン）基は１から２４の炭素原子を有することになり、１０以下の炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、比較的短い鎖アルキルまたはアルキレン基であり、一般に８以下の炭素原子を有する。単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「アルケニレン」とは、別段の指定がない限り、アルケンに由来する二価遊離基のことである。

単独でのまたは別の用語と組み合わせた、用語「ヘテロアルキル」とは、別段の指定がない限り、少なくとも１つの炭素原子ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む、安定な非環状直鎖もしくは分岐鎖、またはこれらの組合せのことであり、その窒素および硫黄原子は任意選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意選択で四級化されていてもよい。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉはヘテロアルキル基の任意の内部位置にまたはアルキル基が分子の残部に結合している位置に置くことができる。例は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、および−ＣＮを含むがこれらに限定されない。２つまたは３つまでのヘテロ原子が、例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３および−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３のように連続していてもよい。ヘテロアルキル部分は１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロアルキル部分は２つの任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロアルキル部分は３つの任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロアルキル部分は４つの任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロアルキル部分は５つの任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロアルキル部分は８つまでの任意選択的に異なるヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。

同様に、単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「ヘテロアルキレン」とは、別段の指定がない限り、ヘテロアルキルに由来する二価遊離基のことであり、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−により例示されるが、これに限定されない。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子は鎖末端のいずれかまたは両方を占めることも可能である（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、および同類のもの）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基では、連結基の配向が連結基の式が書かれる方向によってほのめかされることはない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−は−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２−の両方を表す。上記のように、ヘテロアルキル基は、本明細書で使用されるように、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＯＲ’、−ＳＲ’および／または−ＳＯ_２Ｒ’のようなヘテロ原子を通じて分子の残部に結合している基を含む。「ヘテロアルキル」と列挙され、続いて−ＮＲ’Ｒ”または同類のもののような特定のヘテロアルキル基の列挙がある場合、用語ヘテロアルキルおよび−ＮＲ’Ｒ”は重複性ではなく互いに排他的でもないと理解されている。むしろ、特定のヘテロアルキル基は明確さを加えるために列挙される。したがって、用語「ヘテロアルキル」は本明細書では、−ＮＲ’Ｒ”または同類のもののような特定のヘテロアルキル基を排除するものと解釈されるべきではない。

単独でのまたは別の用語と組み合わせた、「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」とは、別段の指定がない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の非芳香族環状バージョンのことであり、環を構成する炭素は、非水素原子との結合に関与しているすべての炭素結合価のせいで必ずしも水素に結合している必要はない。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子はヘテロ環が分子の残部に結合している位置を占めることが可能である。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロへプチル、３−ヒドロキシ−シクロブタ−３−エニル−１，２、ジオン、１Ｈ−１，２，４−トリアゾリル−５（４Ｈ）−オン、４Ｈ−１，２，４−トリアゾリルおよび同類のものを含むがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例は、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルフォリニル、３−モルフォリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルおよび同類のものを含むがこれらに限定されない。単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」とは、それぞれシクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルに由来する二価遊離基のことである。ヘテロシクロアルキル部分は１つの環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロシクロアルキル部分は２つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロシクロアルキル部分は３つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロシクロアルキル部分は４つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロシクロアルキル部分は５つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。ヘテロシクロアルキル部分は８つまでの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を含むことができる。

単独でのまたは別の置換基の一部としての、用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、別段の指定がない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子のことである。さらに、「ハロアルキル」のような用語はモノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意図されている。例えば、用語「ハロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル」は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルおよび同類のものを含むがこれらに限定されない。

用語「アシル」とは、別段の指定がない限り、−Ｃ（Ｏ）Ｒのことであり、Ｒは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールまたは置換もしくは非置換ヘテロアリールである。

用語「アリール」とは、別段の指定がない限り、多価不飽和芳香族炭化水素置換基のことであり、この置換基は単環または互いに融合されている（すなわち、融合環アリール）もしくは共有結合している多重環（好ましくは１−３環）が可能である。融合環アリールとは、互いに融合した多重環のことであり、融合環のうちの少なくとも１つはアリール環である。用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、ＯまたはＳのような少なくとも１つのヘテロ原子を含有するアリール基（または環）のことであり、窒素および硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素原子（複数可）は四級化されていてもよい。したがって、用語「ヘテロアリール」は融合環ヘテロアリール基（すなわち、融合環のうちの少なくとも１つがヘテロ芳香族環である互いに融合された多重環）を含む。５，６−融合環ヘテロアリーレンとは、互いに融合された２つの環のことであり、１つの環は５員を有しもう一方の環は６員を有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。同様に、６，６−融合環ヘテロアリーレンとは、互いに融合された２つの環のことであり、１つの環は６員を有しもう一方の環は６員を有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。さらに、６，５−融合環ヘテロアリーレンとは、互いに融合された２つの環のことであり、１つの環は６員を有しもう一方の環は５員を有し、少なくとも１つの環はヘテロアリール環である。ヘテロアリール基は炭素またはヘテロ原子を通じて分子の残部に結合させることが可能である。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルを含む。上記のアリールおよびヘテロアリール環系ごとの置換基は、下記の容認できる置換基の群から選択される。単独でのまたは別の置換基の一部としての、「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」とは、それぞれアリールおよびヘテロアリールに由来する二価遊離基のことである。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的例は、ピリジニル、ピリミジニル、チオフェニル、チエニル、フラニル、インドリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキサニル、チアナフタニル（ｔｈｉａｎａｐｈｔｈａｎｙｌ）、ピロロピリジニル、インダゾリル、キノリニル、キノキサリニル、ピリドピラジニル、キナゾリノニル、ベンゾイソオキサゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチオフェニル、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピラジニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、フリルチエニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾリル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピロリル、ジアゾリル、トリアゾリル、テトラアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリルまたはキノリルを含む。上の例は置換されていても置換されていなくてもよく、上のそれぞれのヘテロアリール例の二価遊離基はヘテロアリーレンの非限定的例である。ヘテロアリール部分は１つの環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を含むことができる。ヘテロアリール部分は２つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を含むことができる。ヘテロアリール部分は３つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を含むことができる。ヘテロアリール部分は４つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を含むことができる。ヘテロアリール部分は５つの任意選択的に異なる環ヘテロ原子（例えば、Ｏ、ＮまたはＳ）を含むことができる。アリール部分は単環を有することができる。アリール部分は２つの任意選択的に異なる環を有することができる。アリール部分は３つの任意選択的に異なる環を有することができる。アリール部分は４つの任意選択的に異なる環を有することができる。ヘテロアリール部分は単環を有することができる。ヘテロアリール部分は２つの任意選択的に異なる環を有することができる。ヘテロアリール部分は３つの任意選択的に異なる環を有することができる。ヘテロアリール部分は４つの任意選択的に異なる環を有することができる。ヘテロアリール部分は５つの任意選択的に異なる環を有することができる。

融合環ヘテロシクロアルキル−アリールはヘテロシクロアルキルに融合されたアリールである。融合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリールはヘテロシクロアルキルに融合されたヘテロアリールである。融合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキルはシクロアルキルに融合されたヘテロシクロアルキルである。融合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルは別のヘテロシクロアルキルに融合されたヘテロシクロアルキルである。融合環ヘテロシクロアルキル−アリール、融合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロアリール、融合環ヘテロシクロアルキル−シクロアルキルまたは融合環ヘテロシクロアルキル−ヘテロシクロアルキルはそれぞれが独立して置換されていないまたは本明細書に記載される置換基のうちの１つ以上で置換されていてもよい。

本明細書で使用される用語「オキソ」とは、炭素原子に二重結合している酸素のことである。

本明細書で使用される用語「アルキルスルホニル」とは式−Ｓ（Ｏ_２）−Ｒ’を有する部分のことであり、Ｒ’は上記の置換または非置換アルキル基である。Ｒ’は明示された数の炭素を有することができる（例えば、「Ｃ_１−Ｃ_４アルキルスルホニル」）。

上の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）のそれぞれが指示された遊離基の置換形態と非置換形態の両方を含む。遊離基の種類ごとの好ましい置換基は下に提供されている。

アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む）の置換基は、ゼロから（２ｍ’＋１）に及ぶ数で−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）（’Ｒ”−ＮＲＳＯ_２Ｒ’）、−ＣＮおよび−ＮＯ_２から選択されるがこれらの限定されない種々の基のうちの１つ以上が可能であり、ｍ’はそのような遊離基中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””はそれぞれが好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリール（例えば、１−３のハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基のことである。例えば、本発明の化合物が１つよりも多いＲ基を含む場合、Ｒ基のそれぞれは、これらの基のうちの１つよりも多い基が存在する場合にそれぞれＲ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’基が選択されるのと同じように独立して選択される。Ｒ’とＲ”が同じ窒素原子に結合している場合、Ｒ’とＲ”は窒素原子と組み合わせて４−、５−、６−または７−員環を形成することが可能である。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モノフォリニルを含むがこれらに限定されない。置換基についての上の考察から、当業者であれば、用語「アルキル」はハロアルキル（例えば、−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３および同類のもの）のような水素基以外の基に結合している炭素原子を含む基を含むことが意図されていることを理解する。

アルキル基について記載された置換基に類似して、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は様々であり、例えば、ゼロから芳香族環系上の空の原子価の総数に及ぶ数で、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’’’、ＮＲ”Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、ＮＲＣ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ’’’、Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”−ＮＲＳＯ_２Ｒ’）、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−Ｒ’、−Ｎ_３、−ＣＨ（ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシおよびフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’は好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される。例えば、本発明の化合物が１つよりも多いＲ基を含む場合、Ｒ基のそれぞれは、これらの基のうちの１つよりも多い基が存在する場合にそれぞれＲ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’基が選択されるのと同じように独立して選択される。

部分がＲ置換基で置換されている場合、その基は「Ｒ置換された」と呼ぶことができる。部分がＲ置換されている場合、その部分は少なくとも１つのＲ置換基で置換されており、それぞれのＲ置換基は異なっていてもよい。例えば、本明細書の部分がＲ^１Ａ置換されたまたは置換されていないアルキルである場合、複数のＲ^１Ａ置換基がそれぞれのＲ^１Ａ置換基が異なっていてもよいアルキル部分に結合していることができる。Ｒ置換された部分が複数のＲ置換基で置換されている場合、Ｒ置換基のそれぞれはＲ’、Ｒ”、等のようなプライム記号（’）を使用して本明細書では識別することができる。例えば、部分がＲ^１Ａ置換されたまたは置換されていないアルキルであり、この部分が複数のＲ^１Ａ置換基で置換されている場合、これらの複数のＲ^１Ａ置換基はＲ^１Ａ _’、Ｒ^１Ａ _”、Ｒ^１Ａ _’’’、等として識別することができる。いくつかの実施形態では、複数のＲ置換基は３である。いくつかの実施形態では、複数のＲ置換基は２である。

実施形態では、本明細書に記載される化合物は、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６Ａ、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^２１、Ｒ^２２、Ｒ^２３のうちの複数の例および／または他の置換基および変数を含むことができる。そのような実施形態では、それぞれの変数は任意選択的に異なっており、もっと明確になるようにそれぞれの基を区別するよう適切に標識することができる。例えば、それぞれのＲ^６Ａが異なる場合、Ｒ^６Ａは、例えば、それぞれＲ^６Ａ．１、Ｒ^６Ａ．２、Ｒ^６Ａ．３またはＲ^６Ａ．４と呼ぶことができ、Ｒ^６Ａの定義はＲ^６Ａ．１、Ｒ^６Ａ．２、Ｒ^６Ａ．３および／またはＲ^６Ａ．４によって担われる。Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^６Ａ、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^１９、Ｒ^２０、Ｒ^２１、Ｒ^２２、Ｒ^２３の定義内で使用される変数および／または複数の例に現れ異なっている他の変数は同様にもっと明確になるようにそれぞれの基を区別するよう適切に標識することができる。

２つ以上の置換基を任意選択的に結合させてアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。そのようないわゆる環形成置換基は典型的には、必ずしもそうではないが、環状基礎構造体に結合しているのが見出される。一実施形態では、環形成置換基は基礎構造体の隣接する員に結合している。例えば、環状基礎構造体の隣接する員に結合している２つの環形成置換基は融合環構造体を作り出す。別の実施形態では、環形成置換基は基礎構造体の単一員に結合している。例えば、環状基礎構造体の単一員に結合している２つの環形成置換基はスピロ環構造体を作り出す。さらに別の実施形態では、環形成置換基は基礎構造体の非隣接員に結合している。

アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意選択的に式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）_ｑ−Ｕ−の環を形成してもよく、ＴおよびＵは独立して−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０から３までの整数である。代わりに、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意選択的に式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられてもよく、ＡおよびＢは独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−、または単結合であり、ｒは１から４までの整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合のうちの１つは任意選択的に二重結合により置き換えられてもよい。代わりに、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうちの２つは任意選択的に式−（ＣＲＲ’）_ｓ−Ｘ’−（Ｃ”Ｒ”Ｒ’’’）_ｄ−の置換基で置き換えられてもよく、変数ｓおよびｄは独立して０から３までの整数であり、Ｘ’は−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。置換基Ｒ’、Ｒ”、Ｒ’’’およびＲ’’’’は好ましくは独立して水素、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換アリールおよび置換もしくは非置換ヘテロアリールから選択される。

本明細書で使用されるように、用語「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことが意図されている。

本明細書で使用される「置換基」とは、以下の部分：
（Ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＳＨ、−ＳＯ_２Ｃｌ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_４Ｈ、−ＳＯ_２ＮＨ_２、−ＮＨＮＨ_２、−ＯＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、−ＮＨＣ−（Ｏ）ＮＨ_２、−ＮＨＳＯ_２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ_３、−ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
（Ｂ）（ｉ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＳＨ、−ＳＯ_２Ｃｌ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_４Ｈ、−ＳＯ_２ＮＨ_２、−ＮＨＮＨ_２、−ＯＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、−ＮＨＳＯ_２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ_３、−ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、ならびに
（ｉｉ）（ａ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＳＨ、−ＳＯ_２Ｃｌ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_４Ｈ、−ＳＯ_２ＮＨ_２、−ＮＨＮＨ_２、−ＯＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、−ＮＨＳＯ_２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ_３、−ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
（ｂ）オキソ、ハロゲン、−ＣＦ_３、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＳＨ、−ＳＯ_２Ｃｌ、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_４Ｈ、−ＳＯ_２ＮＨ_２、−ＮＨＮＨ_２、−ＯＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨ_２、−ＮＨＳＯ_２Ｈ、−ＮＨＣ＝（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ_３、−ＯＣＨＦ_２、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール
から選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール
から選択される少なくとも１つの置換基で置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール
から選択される基のことである。

本明細書で使用される「サイズが限定された置換基」とは、「置換基」についての上記の置換基のすべてから選択される基のことであり、それぞれの置換または非置換アルキルは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキルは置換または非置換２−２０員環ヘテロアルキルであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキルは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキルは置換または非置換３−８員環ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換アリールは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリールであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアリールは置換または非置換５−１０員環ヘテロアリールである。

本明細書で使用される「低級置換基」とは、「置換基」についての上記の置換基のすべてから選択される基のことであり、それぞれの置換または非置換アルキルは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_８アルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキルは置換または非置換２−８員環ヘテロアルキルであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキルは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキルは置換または非置換３−７員環ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換アリールは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリールであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアリールは置換または非置換５−９員環ヘテロアリールである。

いくつかの実施形態では、本明細書において化合物中に記載されるそれぞれの置換された基は少なくとも１つの置換基で置換されている。さらに具体的には、いくつかの実施形態では、本明細書において化合物中に記載されるそれぞれの置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレンおよび／または置換ヘテロアリーレンは少なくとも１つの置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基のうちの少なくとも１つまたはすべては少なくとも１つのサイズが限定された置換基で置換されている。他の実施形態では、これらの基のうちの少なくとも１つまたはすべては少なくとも１つの低級置換基で置換されている。

本明細書の化合物の他の実施形態では、それぞれの置換または非置換アルキルは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルであってよく、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキルは置換または非置換２−２０員環ヘテロアルキルであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキルは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキルは置換または非置換３−８員環ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換アリールは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリールであり、および／またはそれぞれの置換または非置換ヘテロアリールは置換または非置換５−１０員環ヘテロアリールである。本明細書の化合物のいくつかの実施形態では、それぞれの置換または非置換アルキレンは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_２０アルキレンであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキレンは置換または非置換２−２０員環ヘテロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキレンは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは置換または非置換３−８員環ヘテロシクロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換アリーレンは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリーレンであり、および／またはそれぞれの置換または非置換ヘテロアリーレンは置換または非置換５−１０員環ヘテロアリーレンである。

いくつかの実施形態では、それぞれの置換または非置換アルキルは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_８アルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキルは置換または非置換２−８員環ヘテロアルキルであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキルは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキルは置換または非置換３−７員環ヘテロシクロアルキルであり、それぞれの置換または非置換アリールは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリールであり、および／またはそれぞれの置換または非置換ヘテロアリールは置換または非置換５−９員環ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、それぞれの置換または非置換アルキレンは置換または非置換Ｃ_１−Ｃ_８アルキレンであり、それぞれの置換または非置換ヘテロアルキレンは置換または非置換２−８員環ヘテロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換シクロアルキレンは置換または非置換Ｃ_３−Ｃ_７シクロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換ヘテロシクロアルキレンは置換または非置換３−７員環ヘテロシクロアルキレンであり、それぞれの置換または非置換アリーレンは置換または非置換Ｃ_６−Ｃ_１０アリーレンであり、および／またはそれぞれの置換または非置換ヘテロアリーレンは置換または非置換５−９員環ヘテロアリーレンである。いくつかの実施形態では、化合物は下の実施例セクション、図または表に記載されている化学種である。

本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」とは、１つ以上のことである。さらに、本明細書で使用される語句「で置換された」とは、指定された基が、列挙された置換基のいずれかまたは全てのうちの１つ以上で置換することができることを意味する。例えば、アルキルまたはヘテロアリール基のような基が「非置換Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルまたは非置換２−２０員環ヘテロアルキルで置換されている」場合、この基は１つ以上の非置換Ｃ_１−Ｃ_２０アルキルおよび／または１つ以上の非置換２−２０員環ヘテロアルキルを含有することができる。さらに、部分がＲ置換基で置換されている場合、この基は「Ｒ置換」と呼ぶことができる。部分がＲ置換である場合、この部分は少なくとも１つのＲ置換基で置換されており、それぞれのＲ置換基は異なっていてもよい。

記号

は、分子の残部または化学式への化学部分の結合点を表している。

本発明の化合物の記述は当業者に公知の化学結合の原則によって制限される。したがって、基がいくつかの置換基のうちの１つ以上で置換されている可能性がある場合、そのような置換は、化学結合の原則に従い、本質的に不安定ではないおよび／または水溶性、中性およびいくつかの公知の生理的条件のような環境条件下で不安定になる可能性があると当業者には知られていると考えられる化合物を与えるように選択される。例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者には公知である化学結合の原則に従って環ヘテロ原子を介して分子の残部に結合しており、したがって、本質的に不安定な化合物を回避する。

他の方法で定義されていなければ、本明細書で使用される専門および科学用語は当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ 第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ １９９４年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ １９８９年）を参照されたい。本明細書に記載される方法、装置および材料に類似するまたは等価ないかなる方法、装置および材料も本発明の実行において使用することが可能である。以下の定義は本明細書で頻繁に使用されるある種の用語の理解を促進するために提供され、本開示の範囲を制限することを意図していない。

「核酸」とはデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドおよび一本鎖形態、二本鎖もしくは多重鎖形態のいずれかでのこれらのポリマー、またはこれらの相補体のことである。用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの直鎖配列のことである。用語「ヌクレオチド」とは典型的には、ポリヌクレオチドの単一単位、すなわち、モノマーのことである。ヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの改変バージョンでも可能である。本明細書で想定されるポリヌクレオチドの例は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）、ならびに一本鎖および二本鎖のＤＮＡとＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子を含む。核酸は直鎖でも分岐でも可能である。例えば、核酸はヌクレオチドの直鎖で可能でありまたは、例えば、核酸がヌクレオチドの１つ以上のアームまたは分岐を含むように核酸は分岐で可能である。任意選択的に、分岐核酸は繰り返し分岐して、デンドリマーおよび同類のもののような高次構造体を形成する。

ホスホチオエート骨格を有する核酸を含む、核酸は１つ以上の反応性部分を含むことが可能である。本明細書で使用されるように、用語反応性部分は別の分子、例えば、共有結合、非共有結合または他の相互作用を通じた核酸またはポリペプチドと反応することができるいかなる基でも含む。例としては、核酸は共有結合、非共有結合または他の相互作用を通じてタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含むことが可能である。

その用語は、合成、天然に存在する、および天然に存在しない、基準核酸に類似する結合特性を有する、ならびに基準ヌクレオチドに類似する様式で代謝される公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基または連鎖を含有する核酸も包含する。そのような類似体の例は、限定せずに、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（ホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ホスホノ蟻酸、メチルホスホン酸、ホウ素ホスホン酸、またはＯ−メチルホスホロアミダイト連鎖（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）を含むリン酸ジエステル誘導体、ならびにペプチド核酸骨格および連鎖を含む。他の類似体核酸は、米国特許第５，２３５，０３３号および米国特許第５，０３４，５０６号ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ、ｅｄｓに記載される核酸を含む、正電荷を帯びた骨格、非イオン性骨格、改変された糖、および非リボース骨格（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴまたはロックド核酸（ＬＮＡ））を有する核酸を含む。１つ以上の炭素環状糖を含有する核酸も核酸の１つの定義に含まれる。リボース−リン酸骨格の改変は種々の理由で、例えば、生理的環境におけるまたはバイオチップ上のプローブとしてそのような分子の安定性および半減期を増加させるために行うことができる。天然に存在する核酸と類似体の混合物を作ることが可能である、代わりに、異なる核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸と類似体の混合物を作ることができる。実施形態では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間連鎖はリン酸ジエステル、リン酸ジエステル誘導体または両方の組合せである。

核酸は非特異的配列を含むことが可能である。本明細書で使用されるように、用語「非特異的配列」とは、他のいかなる核酸配列とも相補的であるように設計されていなまたは部分的にのみ相補的である一連の残基を含有する核酸配列のことである。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触した場合、阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。「阻害性核酸」とは、標的核酸（例えば、タンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡ）に結合して標的核酸の転写（例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡ）を減少させるまたは標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を減少させるまたは転写物スプライシング（例えば、一本鎖モルフォリノオリゴ）を変更することができる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体のポリマー）である。

「標識核酸またはオリゴヌクレオチド」は、核酸に結合している検出可能な標識の存在を検出することにより核酸の存在を検出できるように、リンカーもしくは化学結合を通じて、共有結合的に、またはイオン性、ファンデルワールス、静電気、もしくは水素結合を通じて非共有結合的に、標識に結合している核酸またはオリゴヌクレオチドである。代わりに、結合パートナーの対のうちの一方がもう一方、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンに結合する高親和性相互作用を使用する方法は同じ結果を達成することができる。実施形態において、核酸ドメインは、本明細書に開示されるおよび当技術分野で一般に知られている検出可能な標識を含む。

本明細書で使用される用語「プローブ」または「プライマー」は、試料へのその特異的ハイブリダイゼーションを検出することが可能な１つ以上の核酸断片であると定義されている。プローブまたはプライマーは、これらが使用される特定の技法に応じていかなる長さでも可能である。例えば、ＰＣＲプライマーは一般に１０から４０ヌクレオチド長であり、例えば、サザンブロットのための核酸プローブは１００を超えるヌクレオチド長であることが可能である。プローブは標識されていなくても、標的または試料へのその結合を検出することが可能であるように下記のように標識されていてもよい。プローブは、染色体の１つ以上の特定の（前選択された）部分、例えば、１つ以上のクローン、単離された全染色体もしくは染色体断片またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のコレクション由来の核酸の供給源から作成することが可能である。標的エレメント上に固定された核酸の長さおよび複雑さは本発明に決定的に重要ではない。当業者であれば、所与のハイブリダイゼーション法のための最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル生成を提供し、異なる遺伝子またはゲノム位置の間の必要とされる分解能を提供するようにこれらの要因を調整することが可能である。

プローブは固体表面（例えば、ニトロセルロース、ガラス、水晶、融合シリカスライド）にアレイ状に固定化された単離された核酸であってもよい。いくつかの実施形態では、プローブは、例えば、国際公開第９６／１７９５８号に記載されている核酸のアレイのメンバーであってもよい。高密度アレイを作成することができる技法もこの目的に使用することが可能である（例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３頁；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８７−１０９２頁；Ｋｅｒｎ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４頁；米国特許第５，１４３，８５４号参照）。

単語「相補的な」または「相補性」とは、ポリヌクレオチド内の核酸が第２のポリヌクレオチド内の別の核酸と塩基対を形成する能力のことである。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは配列Ｔ−Ｃ−Ａに相補的である。相補性は、核酸の一部のみが塩基対合に従って適合する部分的でもまたはすべての核酸が塩基対合に従って適合する完全でもよい。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合は「作動可能に連結されて」いる。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合は、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは連結されているＤＮＡ配列が互いに近くにある、分泌リーダーの場合には、近接していてリーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣例に従って使用される。

用語「遺伝子」とは、タンパク質を産生することに関与しているＤＮＡのセグメントを意味し、遺伝子はコード領域に先行するおよび後に続く領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。リーダー、トレーラーならびにイントロンは、遺伝子の転写および翻訳中に必要な調節エレメントを含む。さらに、「タンパク質遺伝子産物」とは特定の遺伝子から発現されるタンパク質である。

遺伝子に関連して本明細書で使用される単語「発現」または「発現された」はその遺伝子の転写産物および／または翻訳産物を意味する。細胞におけるＤＮＡ分子の発現レベルは細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量またはそのＤＮＡによりコードされ細胞により産生されるタンパク質の量に基づいて決定することができる。非コード核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の発現レベルは当技術分野では周知の標準ＰＣＲまたはノーザンブロット法により検出することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１８．１−１８．８８を参照されたい。

用語「組換えの」は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更により改変されていること、または細胞がそのようにして改変された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は細胞の天然（非組換え）形態内では見出せない遺伝子を発現するまたは他の方法では異常に発現される、低発現されるもしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。トランスジェニック細胞および植物は、典型的には組換え法の結果として異種遺伝子またはコード配列を発現する細胞および植物である。

用語「異種の」は、核酸の部分に関連して使用される場合、核酸が天然には互いに同じ関係では見出せない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は典型的には、無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域が新たな機能的核酸を作るように配置されて組換え的に生成される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が天然には互いに同じ関係では見出せない２つ以上の部分配列を含む（例えば、融合）ことを示す。

用語「外来性の」とは所与の細胞または生物の外側を起源とする分子または物質（例えば、化合物、核酸またはタンパク質）のことである。例えば、本明細書で言及される「外来性プロモーター」は、それが発現される植物を起源としないプロモーターである。逆に、用語「内在性の」または「内在性プロモーター」とは所与の細胞または生物原産の、またはこの内を起源とする分子または物質のことである。

用語「単離された」は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態ではそれが会合している他の細胞成分が本質的にないことを表す。この用語は、例えば、均一な状態であることが可能であり、乾燥物でもまたは水溶液でもよい。純度および均一性は典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する優占種であるタンパク質は実質的に精製されている。

用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを表す。いくつかの実施形態では、核酸またはタンパク質は少なくとも５０％純、少なくとも６５％純でもよく、少なくとも７５％純でもよく、少なくとも８５％純でもよく、少なくとも９５％純でもよく、少なくとも９９％純でもよい。

用語「単離された」とは細胞または試料細胞のことでもある。単離された細胞または試料細胞は、細胞が天然の状態にあるときまたは細胞が最初にその天然の状態から取り除かれたときに通常その細胞に付随する成分の多くが実質的にない単一細胞型である。ある種の実施形態では、単離された細胞試料は、その細胞を所望の状態に維持するのに必要なその天然状態由来の成分を保持している。いくつかの実施形態では、単離された（例えば、精製された、分離された）細胞とは、試料中の実質的に唯一の細胞型である細胞である。精製された細胞試料は、１つの型の細胞を少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％含有することができる。単離された細胞試料は、細胞マーカーまたは細胞マーカーの組合せを使用することにより得ることができ、細胞マーカーのいずれも未精製細胞試料中の１つの細胞型に特有である。いくつかの実施形態では、細胞は細胞選別機の使用により単離される。いくつかの実施形態では、細胞タンパク質に対する抗体を使用して細胞を単離する。

本明細書で使用されるように、用語「コンジュゲート」とは、原子または分子間の会合のことである。会合は直接的でも間接的でも可能である。例えば、核酸とタンパク質間のコンジュゲートは、例えば、共有結合により直接的に、または、例えば、非共有結合（例えば、静電気的相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子−双極子、双極子誘導双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用および同類のもの）により間接的でも可能である。実施形態において、コンジュゲートは、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールとアシルハロゲン化物、活性エステルの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）を含むがこれらに限定されないコンジュゲート化学を使用して形成される。これらのおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙら、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ．１９８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８２年において考察されている。実施形態では、微粒子は、微粒子の成分と固体支持体の成分の間の非共有結合化学反応を通じて固体支持体に非共有結合している。他の実施形態では、微粒子は１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載される共有結合性反応性部分（例えば、アミン反応性部分）を含む。他の実施形態では、微粒子は１つ以上の反応性部分、例えば、本明細書に記載される共有結合性反応性部分（例えば、アミン反応性部分）とのリンカーを含む。

本明細書のコンジュゲート化学のために使用される有用な反応性部分または反応性官能基は、例えば、
（ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むがこれらの限定されないカルボキシル基およびこの種々の誘導体；
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒド、等に変換することが可能なヒドロキシル基；
（ｃ）ハロゲン化物が後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンのような求核基で置き換えられ、それによりハロゲン原子の部位で新しい基の共有結合をもたらすことが可能であるハロアルキル基；
（ｄ）例えば、マレイミド基のようなディールス・アルダー反応に関与することができるジエノフィル基；
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムのようなカルボニル誘導体の形成を介して、またはグルニャール付加もしくはアルキルリチウム付加のような機構を介してその後の誘導体化が可能になるようなアルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）それに続くアミンとの反応が、例えば、スルホンアミドを形成するスルホニルハライド基；
（ｇ）ジスルフィドに変換され、アシルハロゲン化物と反応する、または金のような金属に結合させることが可能なチオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化することが可能なアミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加、等を起こすことが可能なアルケン；
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することが可能なエポキシド；
（ｋ）ホスホラミダイトおよび核酸合成に有用な他の基準反応性部分；
（ｌ）金属酸化シリコン結合；
（ｍ）反応性リン基（例えば、ホスフィン）に結合して、例えば、リン酸ジエステル結合を形成する金属；ならびに
（ｎ）スルホン、例えば、ビニルスルホン
を含む。

反応性部分は、これが本明細書に記載されるタンパク質または核酸の化学的安定性に関与しないし、妨害しないように選択することが可能である。例としては、核酸はビニルスルホンまたは他の反応性部分（例えば、マレイミド）を含むことが可能である。任意選択的に、核酸は式Ｓ−Ｓ−Ｒを有する反応性部分を含むことが可能である。Ｒは、例えば、保護化部分であることが可能である。Ｒはヘキサノールでもよい。本明細書で使用されるように、用語ヘキサノールは式Ｃ_６Ｈ_１３ＯＨの化合物を含み、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ペンタノール、２−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、３−メチル−３−ペンタノール、２，２−ジメチル−１−ブタノール、２，３−ジメチル−１−ブタノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、２，３−ジメチル−２−ブタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノール、および２−メチル−１−ブタノールを含む。Ｒは１−ヘキサノールでもよい。

本明細書で使用されるように、用語「約」とは、当業者であれば所定値に相当類似していると見なすと考えられる所定値を含む値の範囲のことである。実施形態では、用語「約」とは、当技術分野で一般に受け入れられている測定を使用して標準偏差内であることである。実施形態では、約は所定値の＋／−１０％に及ぶ範囲のことである。実施形態では、約は所定値を意味する。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーのことを指し、ポリマーは、アミノ酸からなっていない部分にコンジュゲートすることができる。この用語は１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。この用語は大環状ペプチド、非ペプチド官能性で改変されているペプチド、ペプチド模倣薬、ポリアミドおよびマクロラクタムに当てはまる。「融合タンパク質」とは、単一部分として組換え的に発現される２つ以上の別々のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質のことである。

用語「ペプチジル」および「ペプチジル部分」は一価ペプチドを意味する。

用語「アミノ酸」とは、天然に存在するおよび合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸類似物およびアミノ酸模倣物のことである。天然に存在するアミノ酸は遺伝コードによりコードされているアミノ酸、ならびに後で改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似物とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことである。そのような類似物は改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する構造を有する化学化合物のことである。用語「天然に存在しないアミノ酸」および「非天然アミノ酸」とは天然に見出されることのないアミノ酸類似物、合成アミノ酸およびアミノ酸模倣物のことである。

アミノ酸は本明細書では、その一般に知られている３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている１文字記号により指すことができる。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に認められている一文字コードにより指すことができる。

「保存的に改変された変異体」はアミノ酸と核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同じもしくは本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は、本質的に同じ配列のことである。遺伝コードの縮重のせいで、多数の機能的に同一の核酸が任意のタンパク質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されているすべての位置で、コドンはコードされているポリペプチドを変更せずに、記載されている対応するコドンのいずれにも変更することが可能である。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、これは一種の保存的に改変された変異である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸の考えうるあらゆるサイレント変異も記載している。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧは除いて）は改変して機能的に同一の分子を産生可能であることを認識している。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸のそれぞれのサイレント変異は、発現産物に関してはそれぞれの記載されている配列に潜在しているが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。

アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされた配列中の単一アミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更する、付加するまたは欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、変更によりアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸と置換される「保存的改変変異体」であることを認識している。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野では周知である。そのような保存的に改変された変異体は本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを排除しない。

以下の８つの群はそれぞれが互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。

「配列同一性の百分率」は、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較窓におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分はその２つの配列の最適整列化のための基準配列（付加も欠失も含まない）と比べた場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。その百分率は、同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して適合位置の数を得、適合位置の数を比較の窓における位置の総数で割って、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算される。

用語「同一の」またはパーセント「同一性」とは、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列という文脈では、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは手動整列化および目視により測定される、比較窓または指定された領域にわたって最大一致について比較され整列された場合、同じであるまたは同じである指定された百分率のアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明の全ポリペプチド配列または本発明のポリペプチドの個々のドメインの指定された領域にわたって６０％同一性、任意選択的に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一性）を有する２つ以上の配列もしくはサブ配列のことである。その場合、そのような配列は「実質的に同一である」と言われる。この定義は検査配列の相補体のことでもある。任意選択的に、同一性は少なくとも約５０ヌクレオチド長である領域にわたり、またはさらに好ましくは１００から５００もしくは１０００以上のヌクレオチド長である領域にわたり存在する。

配列比較では、典型的には１つの配列が基準配列の役を務め、これと検査配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査および基準配列はコンピュータに入力され、必要ならばサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することが可能である、または代替のパラメータを指定することが可能である。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列と比べた検査配列についてのパーセント配列同一性を計算する。

本明細書で使用される「比較窓」は、その２つの配列が最適に整列された後、配列が同数の連続する位置の基準配列と比較されることができる、例えば、完全長配列または２０から６００、約５０から約２００、もしくは約１００から約１５０アミノ酸またはヌクレオチドからなる群から選択される連続する位置の数のうちのいずれか１つのセグメントを参照することを含む。比較のための配列の整列化の方法は当技術分野では周知である。比較のための配列の最適整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジー整列化アルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似法の検索により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩの、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実施法により、または手動整列化および目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５年増刊）参照）により行うことが可能である。

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般に公開されている。このアルゴリズムは、先ずクエリー配列において長さＷの短いワードを同定することによりハイスコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含み、これはデータベース配列中の同じ長さのワードと整列されると、ある正の値の閾値スコアＴに適合するまたは満たす。Ｔは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの最初の隣接ワードヒットはそれを含有するもっと長いＨＳＰを見つける検索を開始するための種の役を務める。このワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させることが可能な限りそれぞれの配列に沿って両方向に伸長される。蓄積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（適合する残基の対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して蓄積スコアを計算する。それぞれの方向でのワードヒットの伸長は、蓄積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減る；１つ以上のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積のせいで蓄積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸがアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列では）はデフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４ならびに両鎖の比較を使用する。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７頁参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの基準は最小額確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起こると考えられる確率を示す。例えば、核酸は、検査核酸と基準核酸の比較における最小額確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、もっとも好ましくは約０．００１未満である場合には、基準配列に類似していると見なされる。

２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同じであるということは、下記のように、第１の核酸にコードされているポリペプチドが第２の核酸にコードされているポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であることを示している。したがって、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、この２つのペプチドは保存的置換のみが異なる。２つの核酸配列が実質的に同じであるということは、下記のように、その２つの分子またはその相補体が厳密な条件下で互いにハイブリダイズすることをさらに示している。２つの核酸配列が実質的に同じであるということは、同じプライマーを使用してその配列を増幅することが可能であることをさらに示している。

「接触させる」はその平易な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子または細胞を含む化学化合物）を反応する、相互作用するまたは物理的に接触するのに十分近位になるようにする過程のことである。しかし、得られる反応生成物は添加された試薬間の反応から直接にまたは添加された試薬の１つ以上由来であって反応混合物において生成されることが可能な中間体から生成することが可能であることは認識されるべきである。

用語「接触させる」は、２つの化学種を反応させる、相互作用させるまたは物理的に接触させることを含み、この２つの化学種は、例えば、本明細書に記載されるビオチンドメインおよびリガンドバインダーでもよい。実施形態において、接触させるは、例えば、本明細書に記載されるリガンドドメインをリガンドバインダーと相互作用させることを含む。

「対照」試料または値とは、検査試料との比較のための基準、通常は既知の基準としての働きをする試料のことである。例えば、検査試料は、例えば、検査化合物の存在下で検査状態から採取される、および、例えば、検査化合物の非存在下で（負の対照）、または既知の化合物の存在下で（正の対照）既知の状態由来の試料と比較することが可能である。対照は、いくつかの検査または結果から集めた平均値を表すことも可能である。当業者であれば、対照は任意の数のパラメータの評価のために設計可能であることを認識する。例えば、対照は、薬理学的データ（例えば、半減期）または治療手段（例えば、副作用の比較）に基づいて治療効果を比較するよう工夫することが可能である。当業者であれば、所与の状況においてどの標準対照が最も適切であるかを理解し、標準対照値との比較に基づいてデータを分析することができる。標準対照はデータの有意性（例えば、統計学的有意性）を判定するのにも価値がある。例えば、所与のパラメータを表す値が標準対照において広く異なる場合、検査試料の変動は有意性があるとは見なされない。

「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は、^３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されているような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはハプテンおよびタンパク質または例えば、標的ペプチドに特異的に反応性のペプチドまたは抗体に放射性標識を組み込むことにより検出可能にすることができる他の実体を含む。抗体を標識にコンジュゲートするための当技術分野で公知のいかなる適切な方法でも、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載される方法を使用して用いることができる。

「標識されたタンパク質またはポリペプチド」は、標識されたタンパク質またはポリペプチドの存在が標識されたタンパク質またはポリペプチドに結合している標識の存在を検出することにより検出できるように、リンカーもしくは化学結合を通じて共有結合的に、またはイオン性、ファンデルワールス、静電気的もしくは水素結合を通じて非共有結合的に標識に結合しているタンパク質またはポリペプチドである。代わりに、高親和性相互作用を使用する方法は同じ結果を達成することができ、結合パートナーの対のうちの１つがもう一方、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンに結合する。

「生体試料」または「試料」とは、対象または患者から得られるまたはこれらに由来する材料のことである。生体試料は、生検および部検試料のような組織の薄片、ならびに組織学的目的で採取された凍結薄片を含む。そのような試料は、血液および血液分画または製剤（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球、および同類のもの）のような体液、痰、組織、培養細胞（例えば、初代培養物、移植片、および形質転換細胞）、糞便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、等を含む。生体試料は典型的には、霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えば、モルモット、ラット、マウス；ウサギのような哺乳動物、またはトリ；爬虫類；または魚類のような真核生物から得られる。

本明細書で使用される「細胞」とは、そのゲノムＤＮＡを保存するまたは複製するのに十分な代謝または他の機能を実行する細胞のことである。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の色素による染色、子孫を生み出す能力、または、配偶子の場合は、第２の配偶子と結合して生存可能な子孫を生み出す能力を含む当技術分野で周知の方法により同定することが可能である。細胞は原核細胞および真核細胞を含むことができる。原核細胞は細菌を含むが、これに限定されない。真核細胞は酵母細胞ならびに植物および動物、例えば、哺乳動物、昆虫（例えば、スポドプテラ属）由来の細胞ならびにヒト細胞を含むがこれらに限定されない。

用語「抗体」は、当技術分野で一般的に知られている意味に従って使用される。抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとしてまたは種々のペプチダーゼを用いた消化により産生されるいくつかの特徴がはっきりした断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化して、Ｆ（ａｂ）’_２、それ自体がジスルフィド結合によりＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１に結合されている軽鎖であるＦａｂのダイマーを産生する。Ｆ（ａｂ）’_２は穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによりＦ（ａｂ）’_２ダイマーをＦａｂ’モノマーに変換する。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年参照）。種々の抗体断片が無傷の抗体の消化の点から定義されるが、当業者であれば、そのような断片は化学的にまたは組換えＤＮＡ方法を使用することにより新規に合成することができることを認識している。したがって、用語抗体は、本明細書で使用されるように、ホール抗体の改変により産生される抗体断片、または組換えＤＮＡ方法を使用して新規に合成される抗体断片（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定される抗体断片（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁（１９９０）参照）も含む。

モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製では、当技術分野で公知のいかなる技法でも使用することが可能である（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７頁（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、７７−９６頁ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）参照）。「モノクローナル」抗体（ｍＡｂ）とは、単一クローンに由来する抗体のことである。一本鎖抗体を産生するために技法（米国特許第４，９４６，７７８号）は本発明のポリペプチドの抗体を産生するように適応させることが可能である。その上、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物を使用すればヒト化抗体を発現させることができる。代わりに、ファージディスプレイ技術を使用すれば、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定することが可能である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４頁（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３頁（１９９２）参照）。

本明細書で提供される「固体支持体」とは、この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子の結合または会合に適している分離した個別の部位を含有するように改変することが可能であり、この実施形態を含む本明細書で提供される方法に適している任意の材料のことである。固体支持体の例は限定せずに、ガラスおよび改質または官能化ガラス（例えば、カルボキシメチルデキストラン官能化ガラス）、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）等を含む）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、複合材料、セラミックス、およびプラスチック樹脂、シリカまたはシリコンおよび変性シリコン（例えば、模様付シリコン）を含むシリカベースの材料、カーボン、金属、水晶（例えば、模様付水晶）、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、ならびに種々の他のポリマーを含む。一般に、基材は光学的検出を可能とし、感知できるほどの蛍光を発しない。

この実施形態を含む本明細書で提供される固体支持体はイオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）マイクロアレイの一部を形成することができる。この固体支持体は平面（例えば、ガラス、ポリスチレンおよび他のプラスチックならびにアクリル樹脂のような平板上基材）であってもよい。他の立体配置の固体支持体も同様に使用することができることは当業者であれば認識するが、例えば、三次元立体構造を使用することが可能である。固体支持体は微粒子結合のための分離した個別の部位（本明細書では「ウェル」とも呼ばれる）を含有するように改変することができる。これらの部位は一般には物理的に変更された部位、すなわち、微粒子を保持することが可能な基材中のウェルまたは小さなくぼみのような物理的立体構造を含む。ウェルは、フォトリソグラフィー、スタンピング技法、成形法およびマイクロエッチング技法を含むがこれらに限定されない当技術分野で周知の種々の技法を使用して形成することができる。使用される技法は固体支持体の組成および形状に依拠することは当業者であれば認識する。実施形態では、固体支持体の表面に物理的変更を加えてウェルを作成する。ウェルの必要な深さは、そのウェルに添加される微粒子のサイズに依拠する。

本明細書で使用される「微粒子」とは、共有結合または非共有結合を通じて直接的にまたは間接的に分子（例えば、提供されている第１、第２または第３のリンカー、リガンドドメインおよび核酸ドメイン）に結合するのに十分なサイズを有する非平面（例えば、球状）粒子のことである。微粒子は、その表面に結合している分子（例えば、提供されている第１、第２または第３のリンカー、リガンドドメインおよび核酸ドメイン）に物理的支持を与えることができる任意の材料を含むことができる。材料は一般に、表面への分子（例えば、提供されている第１、第２または第３のリンカー、リガンドドメインおよび核酸ドメイン）の結合に関係する状態およびアッセイを実施中に遭遇するいかなるそれに続く処置、取り扱いまたは処理に耐えることができる。材料は天然に存在するものでも、合成でも、または天然に存在する材料の改質でもよい。適切な微粒子材料は、シリコン、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリ（塩化ビニル）、シクロオレフィンコポリマー、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート））、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、金または銀、銅またはアルミニウム表面、磁気表面、例えば、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｏおよびこれらの酸化物、量子ドット、例えば、ＩＩＩ−Ｖ（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＩｎＰまたはＩｎＡｓ）もしくＩＩ−ＶＩ（ＺｎＯ、ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅまたはＣｄＴｅ）半導体、または単独でもしくは他の材料と併せて使用されるインジウム添加フッ化物ナノ結晶、希土添加酸化物ナノ材料を含むことができる。シリカを含む、さらに、例えば、バイオグラスとして入手することができるガラスを含むガラスのような追加の硬質材料を検討することができる。用いることができる他の材料は、例えば、制御された細孔を有するガラスビーズ、架橋ビーズ化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）もしくはアガロース樹脂、または架橋ビスアクリルアミドとアズラクトンのコポリマーのような多孔質材料を含む。他のビーズはポリマービーズ、固体コアビーズ、常磁性ビーズ、またはマイクロビーズを含む。例えば、その表面に組み込まれるアミノ、カルボキシ、チオールまたはヒドロキシル反応性部分のうちのいずれかのような１つ以上の部分を有することができる当技術分野で公知の任意の他の材料も想定されている。実施形態では、微粒子は磁気ポリマーベースの球である。実施形態では、微粒子はＰｒｏＭａｇ（商標）マイクロスフェアである。実施形態では、微粒子の最も長い寸法は１０００μｍ未満である。

組成物
本明細書で提供される組成物は、特に、種々のハイスループットなスクリーニング法に適した高密度アレイの組立てに有用である。本明細書で提供される微粒子は第１のリンカーを通じて結合しているリガンドドメインおよび第２のリンカーを通じて結合している核酸ドメインを含む。固体支持体に結合することにより、この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子はアレイの一部を形成することができる。リガンドドメインおよび核酸ドメインはコードされたスプリットプール化学の方法を使用して微粒子上で合成される。コードされたスプリットプール化学は当技術分野では周知の方法であり、特に以下の参考文献：Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９１年、３７、４８７−４９３頁；Ｋｉｔ Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年；３５４：８２−８４頁；米国特許第６，０６０，５９６号；米国特許第５，７７０，３５８号；米国特許第６，３６８，８７４号；米国特許第５，５６５，３２４号；米国特許第６，９３６，４７７号および米国特許第５，５７３，９０５号に記載されており、これら文献はすべて参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。リガンドドメイン合成（例えば、ペプチドまたは化学化合物合成）のそれぞれのステップは、識別バーコードとして役立つ短い核酸配列により核酸ドメインにコードされている。したがって、それぞれの微粒子は独特のリガンドドメインおよび特異的核酸配列をコードする対応する核酸ドメインを含む。特異的核酸配列はリガンドドメインの構成要素および構成要素がリガンドドメインに組み込まれた順番に対応する。相補的核酸が前記核酸ドメインにハイブリダイズすると、リガンドドメインの組成およびアレイ上のその位置を決定する（デコードする）ことが可能である。リガンドドメインの同一性およびアレイ上のその位置が決定された後、核酸ドメインは取り除かれ、リガンドドメインはさらに改変されてリガンドバインダー（例えば、生体分子）と接触させることができる。

一態様では、微粒子が提供される。微粒子は第１のリンカーを通じてリガンドドメインおよび第２のリンカーを通じて核酸ドメインに共有結合しており、第２のリンカーは切断可能であり、第２のリンカーが切断可能な条件下では第１のリンカーは切断可能ではない。

実施形態では、微粒子はマイクロビーズである。本明細書で言及される「マイクロビーズ」は、径が約０．５μｍから約５００μｍでありほぼ球状のポリマーベースの微粒子である。本明細書で提供される用語「ポリマーベースの」または「ポリマーの」とは、少なくとも１つのポリマー化合物（例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミド、多糖類、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を含む微粒子またはマイクロビーズのことである。実施形態では、マイクロビーズはＰｒｏＭａｇ（商標）マイクロスフェアである。実施形態では、マイクロビーズはポリマーベースの磁気マイクロビーズである。

この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子は２００μｍ未満でもよい。微粒子が２００μｍ未満である場合、当業者であれば、微粒子の最も長い寸法（例えば、径または長さ）は２００μｍよりも小さいことを直ちに認識する。他の実施形態では、微粒子は約２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、微粒子は約０．０１μｍから約２００μｍ、約０．０２μｍから約２００μｍ、約０．０５μｍから約２００μｍ、約０．１μｍから約２００μｍ、約０．５μｍから約２００μｍ、約１μｍから約２００μｍ、約２μｍから約２００μｍ、約５μｍから約２００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、約１５μｍから約２００μｍ、約２０μｍから約２００μｍ、約２５μｍから約２００μｍ、約３０μｍから約２００μｍ、約３５μｍから約２００μｍ、約４０μｍから約２００μｍ、約４５μｍから約２００μｍ、約５０μｍから約２００μｍ、約５５μｍから約２００μｍ、約６０μｍから約２００μｍ、約６５μｍから約２００μｍ、約７０μｍから約２００μｍ、約７５μｍから約２００μｍ、約８０μｍから約２００μｍ、約８５μｍから約２００μｍ、約９０μｍから約２００μｍ、約９５μｍから約２００μｍ、約１００μｍから約２００μｍ、約１０１μｍから約２００μｍ、約１０２μｍから約２００μｍ、約１０５μｍから約２００μｍ、約１０μｍから約２００μｍ、約１１５μｍから約２００μｍ、約１２０μｍから約２００μｍ、約１２５μｍから約２００μｍ、約１３０μｍから約２００μｍ、約１３５μｍから約２００μｍ、約１４０μｍから約２００μｍ、約１４５μｍから約２００μｍ、約１５０μｍから約２００μｍ、約１５５μｍから約２００μｍ、約１６０μｍから約２００μｍ、約１６５μｍから約２００μｍ、約１７０μｍから約２００μｍ、約１７５μｍから約２００μｍ、約１８０μｍから約２００μｍ、約１８５μｍから約２００μｍ、約１９０μｍから約２００μｍまたは約１９５μｍから約２００μｍである。

いくつかの実施形態では、微粒子は約０．０１μｍから約１００μｍ、約０．０２μｍから約１００μｍ、約０．０５μｍから約１００μｍ、約０．１μｍから約１００μｍ、約０．５μｍから約１００μｍ、約１μｍから約１００μｍ、約２μｍから約１００μｍ、約５μｍから約１００μｍ、約１０μｍから約１００μｍ、約１５μｍから約１００μｍ、約２０μｍから約１００μｍ、約２５μｍから約１００μｍ、約３０μｍから約１００μｍ、約３５μｍから約１００μｍ、約４０μｍから約１００μｍ、約４５μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約１００μｍ、約５５μｍから約１００μｍ、約６０μｍから約１００μｍ、約６５μｍから約１００μｍ、約７０μｍから約１００μｍ、約７５μｍから約１００μｍ、約８０μｍから約１００μｍ、約８５μｍから約１００μｍ、約９０μｍから約１００μｍまたは約９５μｍから約１００μｍである。

いくつかの実施形態では、微粒子は約０．０１μｍから約５０μｍ、約０．０２μｍから約５０μｍ、約０．０５μｍから約５０μｍ、約０．１μｍから約５０μｍ、約０．５μｍから約５０μｍ、約１μｍから約５０μｍ、約２μｍから約５０μｍ、約５μｍから約５０μｍ、約１０μｍから約５０μｍ、約１５μｍから約５０μｍ、約２０μｍから約５０μｍ、約２５μｍから約５０μｍ、約３０μｍから約５０μｍ、約３５μｍから約５０μｍ、約４０μｍから約５０μｍまたは約４５μｍから約５０μｍである。

いくつかの実施形態では、微粒子は約０．０１μｍから約２０μｍ、約０．０２μｍから約２０μｍ、約０．０５μｍから約２０μｍ、約０．１μｍから約２０μｍ、約０．５μｍから約２０μｍ、約１μｍから約２０μｍ、約２μｍから約２０μｍ、約５μｍから約２０μｍ、約１０μｍから約２０μｍまたは約１５μｍから約２０μｍである。

いくつかの実施形態では、微粒子は約０．０１μｍから約１０μｍ、約０．０２μｍから約１０μｍ、約０．０５μｍから約１０μｍ、約０．１μｍから約１０μｍ、約０．２μｍから約１０μｍ、約０．３μｍから約１０μｍ、約０．４μｍから約１０μｍ、約０．５μｍから約１０μｍ、約０．６μｍから約１０μｍ、約０．７μｍから約１０μｍ、約０．８μｍから約１０μｍ、約０．９μｍから約１０μｍ、約１μｍから約１０μｍ、約２μｍから約１０μｍまたは約５μｍから約１０μｍである。

実施形態では、微粒子は約０．９μｍである。実施形態では、微粒子は約０．９μｍの径を有する。実施形態では、微粒子は約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５または２００μｍである。他の実施形態では、微粒子は約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５または２００μｍの径を有する。上の数値は微粒子のサイズをμｍで表している。

実施形態では、微粒子は官能化マイクロビーズである。微粒子が官能化マイクロビーズである場合、微粒子は本明細書に記載されるコンジュゲート化学に適した任意の反応性部分を含むことができる。本明細書で提供される用語「官能化された」とは、化合物またはドメイン（例えば、微粒子、リンカー、リガンドドメイン、核酸ドメイン、核酸配列）が本明細書に記載されるコンジュゲート化学のために使用される反応性部分または反応性官能基を含むことである。例えば、官能化マイクロビーズはその表面に組み込まれたアミノ、カルボキシル、チオールまたはヒドロキシル反応性部分のうちのいずれかのような１つ以上の反応性部分を含むことができる。実施形態では、第１の官能基は第１のリンカーを通じたリガンドドメインの結合を可能にする。実施形態では、第２の官能基は第２のリンカーを通じた核酸ドメインの結合を可能にする。実施形態では、第１および第２の官能基は独立して異なっている。したがって、リガンドドメインは核酸ドメインとは異なる官能基にコンジュゲートすることにより第１のリンカーを通じて微粒子に結合していることができる。実施形態では、第３の官能基は微粒子を固体支持体に連結させる。したがって、実施形態では、微粒子は固体支持体に共有結合している。

本明細書で提供される微粒子はポリマーを含むことができる。そのような場合、ポリマーは活性化されることになる反応性部分を保有する。ポリマーは、任意の適切な種類の化合物、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミド、多糖類、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドから選択することができる。実施形態では、微粒子はビスアミノポリエチレングリコール３０００およびヒドロキシルポリエチレングリコール３０００を含む。実施形態では、微粒子はポリマー層を含む。ポリマーの微粒子への結合は、当業者には容易に明らかになる種々の方法により成し遂げることができる。例えば、トリクロロシリルまたはトリサルコキシ（ｔｒｉｓａｌｋｏｘｙ）基を保有するポリマーは微粒子上のヒドロキシル基と反応してシロキサン結合を形成する。金または銀微粒子への結合はポリマー上のチオール基を介して起こることができる。代わりに、ポリマーは、アルカンチオールの自己組織化単分子膜のような中間体種を介して結合していることができる。選択されるポリマーの種類、および微粒子へポリマーを結合させるために選択される方法は、したがって、ポリマーが微粒子表面に結合しているのに適した反応性を有することに、および、特にＤＮＡまたはペプチドへの非特異的吸着に関するポリマーの特性に依拠する。反応性部分はポリマー上に存在していてもよいし、単一または複数の反応性部分の添加によりポリマーに付加してもよい。任意選択的に、スペーサーアーム（例えば、リンカー）を使用すれば、結合する核酸ドメインまたはリガンドドメインに柔軟性を与え、これらドメインが微粒子との立体障害を最小限に抑える方法でその環境と相互作用することを可能にすることができる。

実施形態では、官能化マイクロビーズは磁気ポリマーベースの（ポリマーの）マイクロビーズである。実施形態では、マイクロビーズはＰｒｏＭａｇ（商標）マイクロスフィアである。実施形態では、マイクロビーズは１つより多いポリマーを含む。実施形態では、マイクロビーズは第１のポリマーおよび第２のポリマーを含み、第１のポリマーと第２のポリマーは化学的に異なっている。実施形態では、第１のポリマーはビスアミノポリエチレングリコール３０００であり、第２のポリマーはヒドロキシルポリエチレングリコール３０００である。実施形態では、第１のポリマーは第１の反応性部分を含み第２のポリマーは第２の反応性部分を含む。本明細書で言及される反応性部分は、本明細書に記載されるコンジュゲート化学に有用である機能的な部分のうちのいずれかを含む。実施形態では、第１の反応性部分はアミノ官能基であり第２の反応性部分はヒドロキシル官能基である。実施形態では、ヒドロキシル官能基を反応させてアジドアセテート部分を形成する。実施形態では、第１の反応性部分（例えば、アミノ官能基）を第１のリンカーの反応性部分（例えば、カルボキシル官能基）と反応させる。実施形態では、アジドアセテート部分は第２のリンカーの反応性部分（例えば、アルキニル官能基）と反応させる。

実施形態では、微粒子はポリマーマイクロビーズである。実施形態では、微粒子はデンドリマーである。本明細書で言及される「デンドリマー」は２つのモノマー（例えば、アクリル酸とジアミン）から作られる球状ポリマー分子である。デンドリマーは、小コア分子上の一連の化学的殻からなる正確に定義された化学構造体である。それぞれの殻は常に同じ順で２つの化学物質からなる。実施形態では、微粒子は分岐ポリマーである。実施形態では、微粒子は磁気ポリマーマイクロビーズである。実施形態では、微粒子はカルボキシメチルデキストラン官能化マイクロビーズである。実施形態では、微粒子はポリエチレングリコール官能化マイクロビーズである。さらなる実施形態では、ポリエチレングリコール官能化マイクロビーズは直交性に保護されたアミンを含む。実施形態では、微粒子は磁気マイクロビーズである。実施形態では、微粒子は金属性マイクロビーズである。実施形態では、微粒子はシリカマイクロビーズである。

図１に描かれているように、この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子は複数の第１、第２および第３のリンカーの結合のための複数の結合点を含むことができる。微粒子は、リガンドドメインに結合する第１のリンカーの複数の第１の結合点、核酸ドメインに結合する第２のリンカーの複数の第２の結合点および微粒子を固体支持体に結合させる第３のリンカーの複数の第３の結合点を含むことができる。微粒子あたりの結合点の総数は約２５−５０アトモルでもよい。結合点の総数が１００％に相当する場合、第１の結合点の数は約１％超および約２０％未満であってよい。結合点の総数が１００％に相当する場合、第２の結合点の数は約４０％超および約９０％未満であってよい。結合点の総数が１００％に相当する場合、第３の結合点の数は約０％超および約５０％未満であってよい。

本明細書で提供される「リガンドドメイン」はリガンドバインダー（例えば、分析物、生体分子）に結合することができるドメインである。実施形態では、リガンドドメインはペプチドである。実施形態では、リガンドドメインはポリペプチドである。実施形態では、リガンドドメインは表面糖タンパク質またはこの断片を含む。実施形態では、リガンドドメインは、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質のアミノ酸位９８−１０６に対応するタンパク質配列を有する。実施形態では、リガンドドメインは配列番号１７または配列番号１８の配列を含む。

実施形態では、リガンドドメインは、リガンドドメインの反応性部分（例えば、カルボキシル官能基）に結合している保護化部分を含む。本明細書で使用されるように、保護化部分は、リガンドドメインに共有結合していてリガンドドメインがリガンドバインダーに結合するのを妨げる化学的部分であり、保護化部分は、例えば、必要に応じて化学的手段により取り除くことができる。実施形態では、保護化部分はフルオレニルメチルオキシカルボニルである。実施形態では、保護化部分はｔｅｒｔ−ブチルまたはカルボキシベンジルである。リガンドドメインが保護化部分を含む場合、リガンドドメインは側鎖保護されたポリアミドであってよい。リガンドドメインが保護化部分を含む場合、リガンドドメインを本明細書では「合成中間体」または「合成前駆体」と呼ぶこともできる。実施形態では、保護化部分はアミノ酸側鎖を含む。実施形態では、保護化部分はアミノ末端（例えば、末端の−ＮＨ_２基）またはカルボキシ末端（例えば、末端の−ＣＯＯＨ基）を含む。実施形態では、保護化部分はアミノ酸側鎖に結合している。実施形態では、保護化部分はアミノ末端（例えば、末端の−ＮＨ_２基）またはカルボキシ末端（例えば、末端の−ＣＯＯＨ基）に結合している。保護化部分の存在下では、リガンドドメインはリガンドバインダーに結合することはできない。したがって、実施形態ではリガンドドメインは保護化部分を含みリガンドバインダーとは結合していない。保護化部分を取り除き反応性部分を結合できるリガンドドメインと反応させると、リガンドバインダーが形成される。

本明細書で提供されるリガンドドメインは、微粒子の組成とおよび本明細書で提供される核酸ドメインの合成化学と適合性である任意のマルチステップの支持体結合合成を使用して形成することができる。リガンドドメインおよび核酸ドメインは微粒子上で同時に合成することができる。代わりに、核酸ドメインはリガンドドメインの合成後に微粒子上で合成される。実施形態では、第１のリンカーを通じたリガンドドメインの結合は、第２のリンカーを通じた核酸ドメインの結合に先立って実施される。実施形態では、第１のリンカーを通じたリガンドドメインの結合は、第２のリンカーを通じた核酸ドメインの結合と同時に実施される。実施形態では、リガンドドメインはペプチドである。実施形態では、リガンドドメインは小分子である。実施形態では、リガンドドメインはタンパク質である。実施形態では、リガンドドメインはリガンドバインダーに結合する。リガンドドメインは検出可能な部分（例えば、蛍光部分、発光部分、発色部分、リン光部分、放射性部分または電気活性部分）に結合していることができる。

本明細書で使用される「リガンドバインダー」とは、この実施形態を含む本明細書で提供されるリガンドドメインに結合することができる作用物質（例えば、原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または粒子）のことである。リガンドバインダーは限定せずに、生体分子（例えば、ホルモン、サイトカイン、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原および受容体（神経の、ホルモンの、栄養の、および細胞表面受容体またはそのリガンド）；ホールセルまたはこのライセート（例えば、原核細胞（例えば、病原菌）、真核細胞（例えば、哺乳動物腫瘍細胞）；ウイルス（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス）；および胞子）；化学物質（例えば、溶媒、ポリマー、有機物質）；治療分子（例えば、治療薬、濫用された薬、抗生物質）；または環境汚染物質（例えば、駆除剤、殺虫剤、毒素）を含む。リガンドバインダーはタンパク質、タンパク質の混合物、核酸、核酸の混合物、小分子、小分子の混合物、元素、元素の混合物、合成ポリマー、合成ポリマーの混合物、細胞ライセートでもよい。実施形態では、リガンドバインダーは生体分子である。実施形態では、生体分子は核酸である。実施形態では、生体分子はタンパク質（例えば、抗体）である。実施形態では、リガンドバインダーは抗体である。実施形態では、リガンドバインダーは抗ＨＡ抗体である。実施形態では、リガンドバインダーは抗Ｍｙｃ抗体である。実施形態では、リガンドドメインは配列番号１７のペプチドに結合する。実施形態では、リガンドドメインは配列番号１８のペプチドに結合する。実施形態では、リガンドバインダーは検出可能な部分に結合している。実施形態では、検出可能な部分は蛍光部分である。実施形態では、リガンドバインダーは小分子である。実施形態では、リガンドドメインはリガンドバインダーに結合していない。リガンドドメインがリガンドバインダーに結合していない場合には、リガンドドメインは保護化部分またはリガンドドメインを不活性にする任意の他の適用可能な改変を含むことができる。リガンドバインダーは検出可能な部分（例えば、蛍光部分、発光部分、発色部分、リン光部分、放射性部分または電気活性部分）に結合していることができる。

上記のように、本明細書で提供される「核酸ドメイン」は、リガンドドメインの個々の構成要素およびこれらの構成要素が前記リガンドドメインに組み込まれる順に対応する核酸配列を含む。したがって、それぞれの微粒子は独特のリガンドドメインならびにリガンドドメインの構成要素およびその構成要素がリガンドドメインに組み込まれた順に対応する特定の核酸配列をコードする対応する核酸ドメインを含む。本明細書で提供される核酸ドメインは「タグ」または「コード化タグ」とも呼ばれる。実施形態では、核酸ドメインは核酸配列を含む。実施形態では、核酸配列は約１８塩基対長である。実施形態では、核酸配列は約２０塩基対長である。実施形態では、核酸配列は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７９、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０塩基対長である。実施形態では、核酸配列はシトシンを含まない。

実施形態では、核酸配列は共有結合リンカーを含む。実施形態では、共有結合リンカーは核酸ドメイン内で２つの核酸配列を連結する。実施形態では、核酸ドメインは共有結合リンカーを通じて連結された少なくとも２つの核酸配列を含む。実施形態では、核酸ドメインは共有結合リンカーを通じて連結された少なくとも４つの核酸配列を含む。したがって、実施形態では、核酸ドメインは第１の核酸配列、第２の核酸配列、第３の核酸配列および第４の核酸配列を含み、第１の核酸配列は第１の共有結合リンカーを通じて第２の核酸配列に連結されており、第２の核酸配列は第２の共有結合リンカーを通じて第３の核酸配列に連結されており、第３の核酸配列は第３の共有結合リンカーを通じて第４の核酸配列に連結されている。実施形態では、共有結合リンカー（例えば、第１、第２、第３の共有結合リンカー）は結合、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）_２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。実施形態では、共有結合リンカーは１，３トリアゾレーン（ｔｒｉａｚｏｌｅｎｅ）リンカーである。実施形態では、共有結合リンカーは構造

を有する。実施形態では、共有結合リンカーは構造

を含む。式（Ｉ）では、^＊により標識される結合点は第１の核酸配列への共有結合リンカーの結合を示し、^＊＊により標識される結合は第２の核酸配列への共有結合リンカーの結合点を示している。

実施形態では、核酸ドメインは官能化核酸配列を含む。本明細書で提供される官能化核酸は、本明細書に記載されるコンジュゲート化学のために使用される反応性官能基を含む。実施形態では、核酸ドメインは複数の官能化核酸配列を含む。核酸ドメインが複数の官能化核酸配列を含む場合、官能化核酸配列は複数の共有結合リンカーを通じて連結されている。実施形態では、複数の共有結合リンカーのそれぞれは化学的に異なっている。微粒子上での核酸ドメインおよびリガンドドメインの合成の略図は図４、５および６に描かれている。図５および６に描かれているように、微粒子に結合している核酸ドメインは使用される合成に応じて独立して異なっていてもよく、共有結合リンカーを通じて連結された２つ以上の核酸配列を含むことができる。

この実施形態を含む本明細書で提供される核酸ドメインは、（ｉ）本明細書で提供されるリガンドドメインを形成するために用いられるマルチステップ支持体結合合成、（ｉｉ）微粒子の組成および（ｉｉｉ）本明細書で提供されるデコード化法（すなわち、リガンドドメインの組成およびアレイ上のその位置を同定する）に適合性である。有用なデコード化法は限定せずに、ハイブリダイゼーションまたは酵素ベースの塩基配列決定法（例えば、合成による塩基配列決定、ライゲーションによる塩基配列決定）による塩基配列決定を含む。したがって、実施形態では、核酸配列は相補的核酸配列に結合している。実施形態では、相補的核酸配列は検出可能な部分を含む。実施形態では、検出可能な部分は蛍光部分である。相補的核酸が前記核酸ドメインにハイブリダイズすると、リガンドドメインの組成およびアレイ上のその位置を決定することが可能になる。リガンドドメインの同一性およびアレイ上のその位置が決定された後、核酸ドメインを取り除いてもよく（例えば、第２のリンカーの切断を通じて）、リガンドドメインはさらに改変して（例えば、リガンドドメインの反応性部分を反応させることにより）、リガンドバインダー（例えば、生体分子）に接触させることができる。

本明細書で提供されるリンカーは微粒子とリガンドドメイン（第１のリンカー）、微粒子と核酸ドメイン（第２のリンカー）または微粒子と固体支持体（第３のリンカー）を化学的に連結させる。上記のように、この実施形態を含む本明細書で提供される核酸ドメインは、共有結合リンカー（例えば、１，３トリアゾレーンリンカー）を通じて連結された２つ以上の核酸配列を含むことができる。したがって、実施形態では、核酸ドメインは２つ以上の１，３トリアゾレーンリンカーを含む。本明細書で提供されるリンカー（例えば、第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー）は、当技術分野では周知でありリンカーおよび微粒子の組成と適合する方法を用いて微粒子に共有結合させることができる。本明細書で提供されるリンカーは、微粒子への結合点で、リガンドドメインへの結合点で、核酸ドメインへの結合点で、または固体支持体への結合点で反応性部分のコンジュゲートされた生成物を含むことができる。したがって、本明細書で提供されるリンカーは多価でもよく、コンジュゲート化学法により形成することができる。本明細書で提供される組成物および方法に有用なリンカー（例えば、第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー）の非限定的例は、短いアルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基およびエチレングリコールまたはこれらの誘導体と一緒に、アルキル基（置換されたアルキル基およびヘテロ原子部分を含有するアルキル基を含む）を含む。本明細書で提供されるリンカー（例えば、第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカー）はスルホン基、形成スルホンアミド、エステル基またはエーテル基（例えばトリエチルエーテル）を含むことができる。

実施形態では、第１のリンカーは結合、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）_２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。実施形態では、第２のリンカーは結合、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）_２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。実施形態では、第３のリンカーは結合、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）_２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。実施形態では、第１のリンカーは構造−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−を含む。実施形態では、第１のリンカーは構造−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−を含む。第１のリンカーが構造−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−を有する場合、窒素は官能化固体支持体（例えば、ビスアミノＰＥＧ３０００で官能化する）に結合しており、炭素はリガンドドメインに結合している。上記のように、リガンドドメインの同一性およびアレイ上のその位置が決定された後、核酸ドメインは第２のリンカーの切断を通じて取り除くことができる。実施形態では、第２のリンカーは光開裂性リンカーである。実施形態では、第２のリンカーは酸不安定性リンカーである。実施形態では、第２のリンカーはエステルを含む。実施形態では、第２のリンカーはアルカリ不安定性リンカーである。実施形態では、第２のリンカーは構造：

を有する。実施形態では、第２のリンカーは構造：

を含む。式（ＩＩ）では、^＊により標識される結合点は官能化固体支持体（例えば、ヒドロキシル−アミンＰＥＧ３０００で官能化された）への結合点を示し、^＊＊により標識される結合点は核酸ドメインへの結合点を示している。実施形態では、第２のリンカーは構造：

を有している。式（ＩＩＡ）では、Ｘは２０−３００の整数である。実施形態では、ｘは６８である。式（ＩＩＡ）では、^＊により標識される結合点は固体支持体への結合点を示し、^＊＊により標識される結合点は核酸ドメインへの結合点を示している。実施形態では、第２のリンカーは構造：

を有している。式（ＩＩＢ）では、Ｌ^１は結合、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ−、−ＮＨＳ（Ｏ）_２−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、置換もしくは非置換アルキレン、置換もしくは非置換ヘテロアルキレン、置換もしくは非置換シクロアルキレン、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキレン、置換もしくは非置換アリーレンまたは置換もしくは非置換ヘテロアリーレンである。式（ＩＩＢ）では、^＊により標識される結合点は固体支持体への結合点を示し、^＊＊により標識される結合点は核酸ドメインへの結合点を示している。

本明細書で提供される実施形態に従えば、本明細書で提供される微粒子は、それぞれ複数の第１のリンカーおよび複数の第２のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインおよび複数の核酸ドメインを含むことができる（図３、４または５参照）。したがって、実施形態では、リガンドドメインは複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである。実施形態では、核酸ドメインは複数の第２のリンカーを通じて結合している複数の核酸ドメインである。実施形態では、単一の微粒子に結合している複数の核酸ドメインは同じでもよいし、独立して異なっていてもよい（図５または６参照）。

この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子は固体支持体に結合させることができる。実施形態では、固体支持体は平面支持体である。実施形態では、微粒子は第３のリンカーを通じて固体支持体に連結している。実施形態では、微粒子は固体支持体に非共有結合している（例えば、静電気相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデアワールス相互作用（例えば、双極子−双極子、双極子誘導双極子、ロンドン分散）、リングスタッキング（ｐｉ効果）、疎水性相互作用および同類のものを通じて）。実施形態では、微粒子は固体支持体に機械的に結合している。微粒子が固体支持体に機械的に結合している場合には、微粒子は機械的な手段を通じて支持体上の所定の位置（例えば、ウェル）に物理的に保持されている。実施形態では、複数の微粒子が固体支持体に共有結合されている。実施形態では、微粒子はアミドリンカーを通じて固体支持体に結合している。したがって、実施形態では、第３のリンカーは構造−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（Ｏ）−を有する。実施形態では、固体支持体はカルボキシメチルデキストランを含む。実施形態では、固体支持体はカルボキシメチルデキストラン官能化ガラスを含む。実施形態では、固体支持体はシリコンウェーハである。

実施形態では、複数の微粒子が無秩序アレイを形成する。本明細書で言及される「無秩序アレイ」は微粒子のアレイであって、微粒子が固体支持体上に無作為に組み立てられているまたは固体支持体に無作為に結合しており、規則二または三次元構造を形成していない。実施形態では、複数の微粒子が規則アレイを形成する。規則アレイでは、微粒子は二または三次元秩序に従って固体支持体上に組み立てられているまたは固体支持体に結合している。例えば、六角形のアレイは、それぞれの微粒子が六角形の一部を形成し、それぞれの微粒子が六角形のうちの１つの角を占め、六角形の中心が７番目の微粒子により占められるように、固体支持体上に組み立てられているまたは固体支持体に結合している複数の微粒子からなる。実施形態では、複数の微粒子が六角形のアレイを形成する。実施形態では、複数の微粒子が正方形の充填アレイを形成する。正方形の充填アレイは、それぞれの微粒子が少なくとも４つの微粒子からなる正方形または矩形の一部を形成するように、固体支持体上に組み立てられているまたは固体支持体に結合している複数の微粒子からなる。アレイの形成は当技術分野では周知の使用されている方法であり、特に米国特許第６，１１０，４２６号、米国特許第７，６１５，３６８号、米国特許第７，９３２，２１３号、米国特許第６，８２４，９８７号、米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第８，７９５，９６７号、およびＨｕｇｈｅｓ ＴＲら、（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４、３４２−３４７頁に記載されており、これらの文献はこれによりその全体をおよびあらゆる目的のために組み込む。実施形態では、少なくとも約１０^６個の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、微粒子のそれぞれが異なる。実施形態では、約１０^６から１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、約１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０または１０^１１個の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり１０^６個の微粒子を含む。

実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約１０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約２０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約３０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約４０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約５０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約６０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約７０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約８０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約９０，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約１００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約２００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約３００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約４００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約５００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約６００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約７００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約８００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり少なくとも約９００，０００個の微粒子を含む。

実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり約２００，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり約７８９，０００個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり約５９１，７１５個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミリメートル当たり約２００，０００から約８００，０００個の微粒子を含む。

実施形態では、アレイは４．９９平方ミクロン当たり約１個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは１．４６平方ミクロン当たり約１個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは１．６９平方ミクロン当たり約１個の微粒子を含む。実施形態では、アレイは平方ミクロン当たり約１個の微粒子を含む。

実施形態では、固体支持体は、ウェルのそれぞれが微粒子のうちの１つを捕獲する複数のウェルを含む。実施形態では、核酸ドメインは本明細書に記載される核酸配列である。実施形態では、核酸配列は相補的核酸配列に結合している。実施形態では、相補的核酸配列は検出可能な部分を含む。実施形態では、検出可能な部分は蛍光部分である。

別の態様では、微粒子に結合している固体支持体が提供され、この微粒子は（ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および（ｉｉ）切断されたリンカー部分に共有結合している。本明細書で提供される「切断されたリンカー部分」は、この実施形態を含む本明細書で提供される第２のリンカーの切断を通じて形成される一価の化学的部分である。実施形態では、切断されたリンカー部分は切断可能なリンカーの残遺物である。実施形態では、切断されたリンカー部分は第一級アルコールである。実施形態では、切断されたリンカー部分はアミドである。実施形態では、リガンドドメインは反応する基に結合している保護化部分を含む。実施形態では、リガンドドメインはリガンドバインダーに結合している。実施形態では、リガンドドメインは複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである。実施形態では、切断されたリンカー部分は複数の切断されたリンカー部分である。実施形態では、固体支持体は平面支持体である。実施形態では、微粒子は固体支持体に非共有結合している。実施形態では、微粒子は第３のリンカーを通じて固体支持体に連結されている。実施形態では、微粒子は固体支持体に機械的に結合している。実施形態では、複数の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、複数の微粒子が不規則アレイを形成する。実施形態では、複数の微粒子が規則アレイを形成する。実施形態では、複数の微粒子が六角形のアレイを形成する。実施形態では、複数の微粒子が正方形の充填アレイを形成する。実施形態では、少なくとも約２００，０００個の微粒子が平方ミリメートルの固体支持体当たり結合しており、微粒子のそれぞれが異なっている。実施形態では、少なくとも約１０^６個の微粒子が固体支持体に結合しており、微粒子のそれぞれが異なっている。実施形態では、微粒子は固体支持体に結合している。実施形態では、約１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している。実施形態では、固体支持体は検出装置内にある。実施形態では、検出装置はリガンドドメインに結合しているリガンドバインダーを検出し結合したリガンドバインダーの固体支持体上での位置を同定する。

方法
別の態様では、切断された微粒子を形成する方法が提供される。この方法は（ｉ）この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固体化された微粒子を形成することを含む。（ｉｉ）固定化された微粒子の第２のリンカーを切断し、それによって切断された微粒子を形成する。実施形態では、この方法はステップ（ｉｉ）の切断に先立って、およびステップ（ｉ）の結合後、相補的核酸配列を核酸ドメインに結合させることを含む。実施形態では、切断は、固定化された微粒子を切断試薬に接触させることを含む。実施形態では、切断試薬は酸である。実施形態では、切断試薬はトリフルオロ酢酸である。実施形態では、切断試薬はアルカリ剤である。実施形態では、切断試薬は水酸化アンモニウムである。実施形態では、切断試薬はアンモニアである。実施形態では、切断試薬はメチルアミンである。実施形態では、切断試薬は水酸化アンモニウムとメチルアミンの混合物である。実施形態では、切断は室温で実施される。実施形態では、切断試薬はＵＶ照射である。実施形態では、切断試薬は光照射である。実施形態では、切断は第１のリンカーを切断することを含まない。

実施形態では、方法はステップ（ｉｉ）の切断後、リガンドドメインの反応性部分を反応させ、それによって反応性リガンドドメインを形成するステップ（ｉｉｉ）およびリガンドバインダーを反応性リガンドドメインに結合させるステップ（ｉｖ）を含む。実施形態では、方法はステップ（ｉｉ）の切断後、リガンドバインダーをリガンドドメインに結合させるステップ（ｉｉｉ）を含む。実施形態では、切断のステップ（ｉｉ）はリガンドバインダーをリガンドドメインに結合させることを含む。したがって、第２のリンカーの切断は、リガンドバインダーのリガンドドメインへの結合と同時に起きてもよい。代わりに、リガンドバインダーのリガンドドメインへの結合は第２のリンカーの切断後に起きてもよい。実施形態では、リガンドバインダーのリガンドドメインへの結合は、リガンドドメインの反応性部分を反応させることを含む。

別の態様では、リガンドバインダーを検出する方法が提供される。方法は（ｉ）
この実施形態を含む本明細書で提供される微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成することを含む。（ｉｉ）相補的核酸は固定化された微粒子の核酸ドメインに結合しており、核酸ドメインの固体支持体上の位置が決定され、それによってデコードされマッピングされた微粒子を形成する。（ｉｉｉ）デコードされマッピングされた微粒子の第２のリンカーが切断され、それによってマッピングされ切断された微粒子を形成する。（ｉｖ）リガンドバインダーはマッピングされ切断された微粒子のリガンドドメインに結合しており、および（ｖ）結合したリガンドバインダーの固体支持体上での位置が同定され、それによってリガンドバインダーを検出する。実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の切断とステップ（ｉｖ）の結合は同時に起こる。実施形態では、リガンドバインダーのリガンドドメインへの結合は、リガンドドメインの反応性部分を反応させることを含む。

別の態様では、リガンドバインダーを検出する方法が提供される。この方法は（ｉ）リガンドバインダーをこの実施形態を含む本明細書で提供される微粒子に接触させ、それによって結合したリガンドバインダーを形成することを含む。（ｉｉ）結合したリガンドバインダーの固体支持体上の位置が同定され、それによってリガンドバインダーを検出する。

スプリットプールライブラリー合成を使用すると、出願人は表示される化合物の数を現在の方法の少なくとも１０００倍増加することができた。本明細書で提供される組成物は、固体支持体上の極めて高密度のアレイに固定化された分子の高度に多様なコレクションである。出願人のシステムを調製するため、組み立てられた前駆体ライブラリーは平面アレイに固定化される。それぞれのライブラリーメンバーはこの時点で平面アレイにおいて永久の分離したスペースを占め、デコード化は化学的にコードされたライブラリーであったものを空間的に位置を指定されたライブラリーに変換するので、全固定化されたアレイはデコードされる。化学的コード化単位は取り除かれ、それに続く合成変換が固定化されたライブラリーにわたって実施され、ライブラリー合成を完了する。次に、ライブラリーはスクリーニングされて有用な機能を示す分子を同定することが可能である。

コードされたスプリットプール合成が高密度ビーズ固定化およびオリゴヌクレオチド塩基配列決定という確立している方法と組み合わされると、このシステムは完全にデコードされたスプリットプールライブラリーのスクリーニングを以前は可能でなかった規模で可能にする。次世代塩基配列決定技術との類似によれば、マイクロアレイフォーマットにおける１０^８から１０^１０までの完全にデコードされたスクリーニングセットが達成可能になるはずである。さらなる化学のための「タグなし」ライブラリーが本明細書で提供される。スクリーニングに先立つデコード化により、オリゴヌクレオチドタグを取り除くことが可能であり、これにより２つのこと：（ｉ）オリゴヌクレオチドタグとは不適合であると考えられる追加の化学を固定化されたライブラリー上で行うことが可能である（化学的不適合性はコードされたコンビナトリアル化学の表明されている難問の１つである。）；（ｉｉ）タグを取り除けばタグが目的のアッセイを妨害する可能性がなくなる、が成し遂げられる。コード化化学は出願人が化学ライブラリー作成のためにスプリットプール合成の能力を利用することを可能にするが、選択よりもむしろライブラリーが比較的情報リッチなスクリーニングにおいて評価されることを可能にする。所与のアッセイにおけるすべてのライブラリーメンバーの相対的性能は、「ヒット」を選択されるだけではなく、評価される。１つ以上のアッセイにおいて問題になる化合物は容易に同定し目印を付けることが可能であり、それに続くスクリーニングにおける潜在的な偽陽性の数を減らす。これにより構造活性関係の開発が促進される。

活性についてスクリーニングされる最終生理活性化合物はタグのデコード化および除去後に形成される。固定化されデコードされるのは、保護された合成中間体である。本明細書で提供される発明では、少なくとも１つの追加の化学ステップは、核酸ドメインのデコード化および除去後に実施されて、「生理活性剤」の調製を仕上げる（これには脱保護、大環状化、等を含むことができる。）。

核酸を使用するスプリットプールライブラリー合成をコード化する潜在的な利益は合成上の難問と同様に周知である。出願人の特異的コード化戦略は、以前立証されたよりもステップ当たり少ない線形化学変換でのスクリーニング可能なＤＮＡコードされたライブラリーの作成を可能にし、それぞれのコード化ステップは独立してデコード可能である。

本明細書で「コア」とも呼ばれる微粒子は、デンドリマー、超高分岐ポリマー、官能化シリカ粒子、官能化ポリマー粒子であることが可能である。コアは磁性であることが可能である。コアはサイズが２０ｎｍから２００ミクロン径に及ぶことが可能である。コアは、ライブラリー分子を作る構成要素の結合を可能にする反応性部分、コード化のためのＤＮＡタグの結合を可能にする異なる反応性部分、および、いくつかの場合は、コアの表面への共有結合固定化を助ける第３の異なる反応性部分で官能化されている。

多座配位性コアは、末端が直交性に保護されたアミンであるポリエチレングリコールの表面で官能化されている０．９ミクロン磁気ポリマービーズであることが可能である。

合成前駆体（保護化部分を含むリガンドドメイン）は、合成前駆体を作成するのに使用される任意の合成変換が、コア粒子に結合した後は、コア化学構造に適合性でなければならず記載されるコード化化学と直交性／適合性であるかまたは第１のコード化タグの組込みに先立って実施されるという限定付で、マルチステップの支持体結合合成の任意の生成物であることが可能である。合成前駆体は側鎖保護されたポリアミドであってよい。

コード化タグ（核酸ドメイン）は、切断可能なリンカーを通じて直接的にまたは他のコード化タグを通じて間接的にコア粒子に共有結合された独特の前合成された官能化核酸誘導体からなる。タグ配列は、他のコードされた合成ステップとは無関係に、特定のコードされた合成ステップのデコード化を可能にするのに十分な長さおよび組成であり全ライブラリーをコード化している。例えば、合成において第２のステップをコードするのに使用されるタグをデコード化することは、合成において第１または第３のステップをコード化するのに使用されるタグをデコード化する能力とは完全に無関係であるはずである。ステップ１でのタグの組込みに成功しないと、ステップ２でのタグの組込みに悪影響を及ぼす。ステップ１を「デコード化」できないことは所与のコードされたライブラリーメンバーについてステップ２を「デコード化する」能力に影響を及ぼす。出願人のアプローチはもっと長い核酸配列を必要とすることがあるが、もっと頑強なコード化／デコード化プロセスを提供する。タグはデコード化または塩基配列決定の選択された方法と適合している。例えば、タグの塩基配列決定が連続するハイブリダイゼーションのプロセスにより実施されるためには、タグは望まれない交差ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように、互いに比較的等温性で十分な配列の違いを含有するべきである。タグの塩基配列決定が合成による酵素ベースの塩基配列決定またはライゲーションアプローチによる塩基配列決定のいずれかを通じて行われるためには、タグは共通のプライマー結合部位を必要とする可能性がある。

タグ化学構造物：（ｉ）前駆体ライブラリーを構築するのに使用される合成変換にとり安定で反応性がない；（ｉｉ）タグの塩基配列決定された後はコア粒子から取り除くことが可能である；（ｉｉｉ）デコード化／塩基配列決定の方法と適合する。例えば、ハイブリダイゼーションによる塩基配列決定はＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＲＮＡ、改変ＲＮＡ、改変ＤＮＡ類似物またはこれらのいくつかの組合せを用いて行うことができる。任意の酵素ベースの塩基配列決定アプローチでは、ＤＮＡが好ましい。保護されたオリゴヌクレオチド構造体を使用すれば化学的直交性を改善することができ、タグ上の保護化部分はデコード化に先立って取り除かれる（例えば、核酸塩基の環外アミンはタグの組込みに先立ってまたは直後に保護することができる。）。

タグ切断部位構造物：（ｉ）タグはコア粒子の直接結合していても他のタグを通じてコアに間接的に結合していてもよく、タグのためのすべてのコア粒子結合点は最終的には切断可能な部位を含有する。（ｉｉ）好ましい切断可能構造物は、切断に続いて、それに続く化学またはアッセイを妨害する可能性のある反応性部分のないコア粒子表面を残す（例えば、遊離のアルコールを残すエステル切断部位；遊離のアルコールを残すトリチルエーテル切断部位）。

タグ連結構造物：コード化タグは、Ｃ含有量がゼロでＧ含有量が２５％である２０マーのＤＮＡベースのオリゴヌクレオチドであってよい。タグは少なくとも６塩基対ミスマッチ互いに異なっている。タグは、切断可能なエステル結合を通じて全て最終的にはコア粒子に連結している１，３トリアゾール連結を通じて支持体におよび／または互いに連結している。使用されるいかなる結合方法もおよびいかなる表面もデコード化条件およびマイクロアレイアッセイ条件と、ならびにタグ除去条件およびアレイに適用されたいかなる合成反応条件とも適合しなければならない。出願人は模様水晶、模様シリコン、およびカルボキシメチルデキストラン官能化ガラス上での固定化を実証している。

ＤＮＡタグ除去：条件はタグ切断部位の構造に依存している。エステル連結に関しては、出願人は水酸化アンモニウムおよびメチルアミンを使用した。リガンド脱保護およびさらなる合成的改変。出願人は、ポリアミド構造体から保護している側鎖部分をすべて取り除いた。選択的側鎖脱保護とそれに続くマクロラクタム化が実施される。フルオロフォア−消光剤対またはソルバトクロミズム部分の取込みが実施される。本明細書で提供される組成物は特に、マイクロアレイスクリーニングに有用であり、蛍光標識された目的のタンパク質がアレイ上でインキュベートされてバインダーを同定する蛍光、発色、または電気化学読み出し結合アッセイが立証された。

実施形態では、プロトタイプのチップは六角形アレイにおいてＣ−Ｃ（中心から中心）間隔が２．４ミクロンである。その結果、ビーズ当たり４．９９平方ミクロン（ビーズは六角形に充填しているので予想されたビーズ当たり５．７６平方ミクロンより少ない。）、または平方センチメートル当たり２０００万ビーズ、または平方ミリメートル当たり２０万ビーズ、または標準２５ｍｍ掛ける７５ｍｍの顕微鏡スライドに相当する面積内に約３７６００万粒子になる。

実施形態では、粒子はＣ−Ｃ間隔が１．３ミクロンの六角形アレイに固定化されている。その結果、ビーズ当たり１．４６平方ミクロン、または平方センチメートル当たり７８９０万ビーズ、または平方ミリメートル当たり７８９，０００ビーズ、または２５ｍｍ掛ける７５ｍｍの顕微鏡スライドに相当する面積内に１２億８０００万ビーズになる。

実施形態では、粒子はＣ−Ｃ間隔が１．３ミクロンの正方形に充填したアレイに固定化されている。その結果、ビーズ当たり１．６９平方ミクロン、または平方センチメートル当たり５９００万ビーズ、または平方ミリメートル当たり５９１，７１５ビーズ、または２５ｍｍ掛ける７５ｍｍの顕微鏡スライドに相当する面積内に１１億１０００万ビーズになる。

実施形態では、アレイは六角形に充填していて、平方ミクロン当たり１ビーズの密度である（Ｃ−Ｃ間隔は約１．０７５ミクロン）。

材料および方法
試薬
トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、トリトンＸ−１００（ＴＸ１００）、アジド酢酸（Ａｚａ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＡＯＰ）、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、臭化銅（Ｉ）ジメチルスルフィド錯体（ＣｕＢｒＤＭＳ）、Ｂｏｃ−グリシンおよびＦｍｏｃ−グリシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入しそのまま使用した。他のＦｍｏｃ保護アミノ酸はすべてＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍまたはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから購入した。洗浄および反応緩衝液すべてにおいて使用した水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｉｌｌｉＱ浄化装置から得た。最初の微粒子官能化のために使用したＰｅｇ試薬はＲａｐｐ ＰｏｌｙｍｅｒｅまたはＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから購入した。Ｐｒｏｍａｇビーズは２．６％ｗ／ｖ水溶液としてＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供されており、以下の特徴：８８０ｎｍ平均径を有する。高度に架橋したポリマーマトリックスに包埋した酸化鉄で構成されている。粒子の表面はミリグラム当たり４４０ｎモル当量で遊離のカルボン酸反応性部分を示している。おおよそ２０億の微粒子が１ミリグラムのストック粒子内に含有されている。核酸タグおよび蛍光標識された相補配列はすべてＩＤＴから購入した。

リガンドドメイン配列

追加の試薬の略語
ＤＩＴｘ １％トリトンＸ−１００含有ＭｉｌｌｉＱ水
ＤＭＳＯＴｘ １％トリトンＸ−１００含有ＤＭＳＯ
ＰＢＴ １％トリトンＸ−１００含有１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０
ＡＭＡ 水酸化アンモニウムとエタノール中３０％メチルアミン１対１混合物

一般的微粒子取扱い手順
大半の固相合成手順に類似して、典型的な反応は１）微粒子を反応溶液中に分散させる、２）反応に必要な追加の溶媒または試薬を添加する、３）ある特定の反応温度である期間、時折または絶えず撹拌する、ならびに４）反応に続いて、試薬および反応の可溶性副生成物を一連の洗浄を通して微粒子から分離することを含む。出願人の微粒子のための分離および洗浄ステップは、複数ラウンドの１）微粒子の磁気的な補助を受けたペレット化および上澄みの吸引、続いて２）微粒子ペレットの適切な洗浄液中での再懸濁からなる。

ＰｒｏＭａｇ微粒子官能化
最初のペグ化：

いかなるバッチ間変動をも除去するために、ペグ化ビーズ（４．５対１比のヒドロキシル基とアミン基を用いて）を作成する大規模官能化を行う。２５０μＬのストックＰｒｏＭａｇビーズをＤＭＦＴｘで洗浄し（１ｍＬ、×３）、１５０μＬのＤＭＦＴｘに懸濁する。アミノヒドロキシＰＥＧ３０００（２７０ｍｇ）およびビスアミンＰＥＧ３０００（３０ｍｇ）を１．５ｍＬの円錐チューブに秤量し、油浴中６５℃で融解させる。ビーズを融解したＰＥＧに添加し、加熱しながら徹底的に混合させる。５５マイクロリットルのＤＩＰＥＡを反応混合液に添加しボルテックスして、続いて固形のＰｙＡＯＰ（１６０ｍｇ）を添加した。反応は、油浴中で加熱しながら６５℃で４５分間進んだ。反応での最終濃度は（２００ｍＭのＰＥＧ、６００ｍＭのＰｙＡＯＰ、６００ｍＭのＤＩＰＥＡ）で終わる。４５分後、表面の残りのカルボン酸は２−メトキシエチルアミン（２５０μＬ）でキャップをし、同じ温度で１０分間インキュベートさせ、次にビーズをＤＭＦＴｘで洗浄し（１ｍＬ、×３）、次に２５０μＬのＤＭＦＴｘで再懸濁する。５０μＬのアリコートを取出し、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し（４００μＬ、×３）、よく焼いた清潔／タールパン上に載せ、９５℃のオーブンに置いて、次の方法を実行した。９５℃までジャンプさせ、等温で１０分間、２０℃／分の勾配で５００℃まで上げ、等温で３０分間。［開始質量：１．５９４０ｍｇ、１００℃で９８．８６％、５００℃で３１．３０％］。これは、２５．６％の付加官能化を有する同じプロトコルにより調製された最初の２つの大バッチと比べた場合、２４．３％の付加官能化（１．７０４ｍｇ、１００℃で９９．８１％および５００℃で３２．０８％）であった最後の大バッチとに対して２５．４％付加官能化に相当する。

ＢＯＣ保護（ｘ２）

ビーズの残りはＤＭＳＯＴｘ中で洗浄する（１ｍＬ、×３）ことによりＢｏｃ保護され、１７０μＬのＤＭＦＴｘに懸濁し、１４ｍｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ ＯＨ、続いて２２．３μＬのＴＥＡおよび３０．４ｍｇのＨＡＴＵをその順で添加した。反応は油浴中で６５℃、３０分間続き、その後ビーズはＤＭＦＴｘで洗浄し（５００ｍＬ、×３）、もう１度同じ条件にかけた。次に、ビーズはＡＭＡにかけ（２００μＬ、６５℃、５分間）、次にストック濃度でＤＭＦＴｘ中で洗浄した。

長鎖アジド（ｘ３）と一緒のＤＩＣ／ＤＭＡＰ

ビーズは４００μＬのＤＭＦＴｘに再懸濁し、これに５００ｍＭの長鎖アジド酸（１１．６６ｍｇ／１００μＬ）を８０μＬ、続いて６．７μＬのＤＩＣ、次に１０μＬのＤＭＡＰ（ＤＭＦ中８０ｍｇ／ｍｌストック）添加する。これらのカップリング条件は全部で３回繰り返し、間にＤＭＦＴｘで洗浄した（２００μＬ、×３）。次に、Ｂｏｃ基はＴＦＡで１５分間処理して取り除かれる。次に、この大バッチはＰＢＴ中で洗浄し（４００μＬ、×３）、４００μＬに再懸濁する（ストックから×４希釈）。アジド酢酸をアルカリ切断可能形態に結合させる（エステル結合を通じて微粒子に連結させる）ためのプロトコルは類似の様式で実施される。

標準ＨＡＴＵアミノ酸カップリング条件
４００ｍＭのＨＡＴＵ、４００ｍＭのＦＭＯＣされたアミノ酸、１０％ＤＩＴｘ中８００ｍＭのＴＥＡ、９０％のＤＭＳＯＴｘ、６５℃、３０分

ビーズはＤＩＴｘ中で洗浄し（１００μＬ、×３）、１０μＬのＤＩＴｘに懸濁させる。これに８０μＬのＤＭＳＯＴｘ中のＦＭＯＣされたアミノ酸（２００μＬのｒｘｎ容量では４００ｍＭ）、続いてＴＥＡ（１０μＬ、１０１．１９ｇ／モル、０．７２６ｇ／ｍＬ）を添加し、最後にＨＡＴＵ（１５ｍｇ、３８０．２３ｇ／モル）を一番終わりに固体として添加し、チューブは６５℃で３０分間に設定されたレッドヒートブロック上にセットする。ダブルカップリングは、１００％変換を保証するためすべてのアミノ酸を用いて行う（間での洗浄なし）。

核酸タグ上のアミン反応性部分へのアジドの標準ＨＡＴＵカップリング
４００ｍＭのＨＡＴＵ、４００ｍＭの２−アジド酢酸、１０％ＤＩＴｘ中８００ｍＭのＴＥＡ、９０％のＤＭＳＯＴｘ、６５℃、３０分

ビーズはＰＢＴ中で洗浄し（１００μＬ、×３）、１０μＬのＤＩＴｘに懸濁させる。これにＤＭＳＯＴｘ（８０μＬ）、続いて２−アゾ酢酸（３μＬ、１０１．０６ｇ／モル、１．３５ｇ／ｍＬ）、続いてＴＥＡ（２２．３μＬ、１０１．１９ｇ／モル、０．７２６ｇ／ｍＬ）を添加し、最後にＨＡＴＵ（１５ｍｇ、３８０．２３ｇ／モル）を一番終わりに固体として添加し、チューブは６５℃で３０分間に設定されたレッドヒートブロック上にセットする。ダブルカップリングは、１００％変換を保証するためすべてのアミノ酸を用いて行う（間での洗浄なし）。

銅触媒アジドアルキン（ヒュスゲン）環状付加条件（コード化ステップ）

触媒保存溶液調製：Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ ＤＭＳ（２０５．５８ｇ／モル）はグローブボックスにおいて２０ｍＬのシンチレーションバイアルに既に量り分けられていた。ＤＭＳＯ（グローブボックスに保管されている）は、濃度４．５ｍｇ／ｍＬ（２２ｍＭ）が達成されるようにバイアルに添加される。ＴＨＰＴＡ（トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン）（４３４．５ｇ／モル）はフードの外で量り分けられ、２．８ｍｇ／１２５μＬ（５２ｍＭ）の濃度まで溶解される。Ｃｕ（Ｉ）およびリガンド溶液は１対２ｖ対ｖの割合のＣｕ（Ｉ）とリガンドに組み合わされ以下の濃度：３５ｍＭのＴＨＰＴＡおよび５０％のＤＭＳＯ中７．３ｍＭのＣｕ（Ｉ）Ｂｒ ＤＭＳおよび５０％ＭｉｌｌｉＱ水を与える。

ビーズはＰＢＴ中で洗浄し（１００μＬ、×３）、１３μＬのＰＢＴに懸濁させる。これに１０μＬのオリゴタグを添加する（５００μＭの保存液から）。これを最小４ポンプ／パージサイクルでグローブボックスに移す。２マイクロリットルの触媒保存液を添加し、ＰＣＲチューブを３０分間で６０℃までに設定されたＰＣＲブロック上にセットし、その後反応は１００μＬのＥＤＴＡを添加しＰＢＴで洗浄する（２００μＬ、×５）前に３分間インキュベートすることにより５００ｍＭのＥＤＴＡを用いてクエンチされる（グローブボックスの外側で）。

標準ＦＭＯＣ脱保護条件

室温で１０分間、ＤＭＦＴｘ中２０％ピペラジンを１００μＬ（×３）

競合ハイブリダイゼーション条件、タグＡ０とＡ１を区別するために使用する例

抗Ａ０−Ｃｙ３および抗Ａ１−ＦＩＴＣはＩＤＴから購入し、ＭｉｌｌｉＱ水中５００μＭのストックまで希釈する。ビーズ試料に適用されることになっているハイブリダイゼーション溶液は以下の通りに調製される。４０μＬのホルムアミド、２０μＬの２０Ｘ ＳＳＰＥ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）、１０μＬのＤＩＴｘ、２０μＬのＤＩ、５μＬの抗Ａ０−Ｃｙ３ストック、および５μＬの抗Ａ１−ＦＩＴＣストックを単一のＰＣＲチューブで混合し、使用するまで暗所に保存する。

そのそれぞれの表面でＡ０またはＡ１を示しているビーズ（１．６μｇ）の試料を別々のＰＣＲチューブに置き、ペレット化し、上澄みは真空吸引により取り除いた。それぞれのビーズペレットは直ちに２５μＬのハイブリダイゼーション溶液に懸濁した。ビーズスラリー混合物は光から離して室温で次の１５分間かけてハイブリダイズさせた。指示された期間後、ビーズ試料はペレット化し、ハイブリダイゼーション溶液は真空吸引により取り除いた。次に、ビーズは２５μＬのＰＢＴで３×洗浄し、最終的に２５μＬのＰＢＴに懸濁した。５μＬのこのビーズ試料は取り除き、１３５６ウェルプレートに置き、Ｚｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅ、６３Ｘ水対物レンズ、明視野中１．６ｏｐｔｏｖａｒ、ＤｓＲｅｄおよびＥＧＦＰチャネルを使用して顕微鏡コアで画像化した。それぞれのビーズタイプの追加の５μＬ試料をプレートの別々のウェルに充填しこれを使用して２０１４Ｚｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｖｅ ＺｅｎＢｌｕｅソフトウェアによるＤｓＲｅｄおよびＥＧＦＰについての露光時間を設定した。追加のＡ０試料を使用してＤｓＲｅｄを設定し、追加のＡ１試料を使用してＥＧＦＰを設定した。露光時間を設定後、未感光Ａ０およびＡ１試料は同じ固定露光時間を使用して画像化した。

実施形態
実施形態１．（ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および（ｉｉ）第２のリンカーを通じて核酸ドメインに共有結合している微粒子であって、前記第２のリンカーが切断可能であり、前記第１のリンカーは前記第２のリンカーが切断可能である条件下では切断可能ではない。

実施形態２．前記リガンドドメインが、反応性部分に結合している保護化部分を含む、実施形態１の微粒子。

実施形態３．前記保護化部分がアミノ酸側鎖を含む、実施形態２の微粒子。

実施形態４．前記保護化部分がアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、実施形態２の微粒子。

実施形態５．前記微粒子がマイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態６．前記微粒子が官能化されたマイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態７．前記微粒子が磁気マイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態８．前記微粒子が金属性マイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態９．前記微粒子がシリカマイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態１０．前記微粒子がポリマーマイクロビーズである、実施形態１の微粒子。

実施形態１１．前記微粒子がデンドリマーである、実施形態１の微粒子。

実施形態１２．前記微粒子が分岐ポリマーである、実施形態１の微粒子。

実施形態１３．前記第２のリンカーが光切断可能リンカーである、実施形態１−１２のいずれか１つの微粒子。

実施形態１４．前記第２のリンカーが酸不安定性リンカーである、実施形態１−１２のいずれか１つの微粒子。

実施形態１５．前記第２のリンカーがアルカリ不安定性リンカーである、実施形態１−１２のいずれか１つの微粒子。

実施形態１６．前記リガンドドメインがペプチドである、実施形態１−１５のいずれか１つの微粒子。

実施形態１７．前記リガンドドメインが小分子である、実施形態１−１５のいずれか１つの微粒子。

実施形態１８．前記リガンドドメインがタンパク質である、実施形態１−１５のいずれか１つの微粒子。

実施形態１９．前記リガンドドメインがリガンドバインダーに結合する、実施形態１６の微粒子。

実施形態２０．前記リガンドバインダーが生体分子である、実施形態１９の微粒子。

実施形態２１．前記生体分子が核酸である、実施形態２０の微粒子。

実施形態２２．前記生体分子がタンパク質である、実施形態２０の微粒子。

実施形態２３．前記リガンドドメインがリガンドバインダーに結合していない、実施形態１−１６のいずれか１つの微粒子。

実施形態２４．前記リガンドドメインが複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである、実施形態１−２３のいずれか１つの微粒子。

実施形態２５．前記核酸ドメインが複数の第２のリンカーを通じて結合している複数の核酸ドメインである、実施形態１−２４のいずれか１つの微粒子。

実施形態２６．前記微粒子が固体支持体に結合している、実施形態１−２５のいずれか１つの微粒子。

実施形態２７．前記固体支持体が平面支持体である、実施形態２６の微粒子。

実施形態２８．前記微粒子が第３のリンカーを通じて前記固体支持体に連結している、実施形態２６または２７の微粒子。

実施形態２９．前記微粒子が前記固体支持体に非共有結合している、実施形態２６または２７の微粒子。

実施形態３０．前記微粒子が前記固体支持体に機械的に結合している、実施形態２６または２７の微粒子。

実施形態３１．複数の微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態２６−３０のいずれか１つの微粒子。

実施形態３２．前記複数の微粒子が不規則アレイを形成する、実施形態３１の微粒子。

実施形態３３．前記複数の微粒子が規則アレイを形成する、実施形態３１の微粒子。

実施形態３４．前記複数の微粒子が六角形のアレイを形成する、実施形態３１の微粒子。

実施形態３５．前記複数の微粒子が正方形の充填アレイを形成する、実施形態３１の微粒子。

実施形態３６．前記アレイが平方ミリメートル当たり少なくとも約２００，０００個の微粒子を含む、実施形態３２−３５のいずれか１つの微粒子。

実施形態３７．前記アレイが平方ミリメートル当たり約２００，０００個の微粒子を含む、実施形態３２−３５のいずれか１つの微粒子。

実施形態３８．前記アレイが平方ミリメートル当たり７８９，０００個の微粒子を含む、実施形態３２−３５のいずれか１つの微粒子。

実施形態３９．前記アレイが平方ミリメートル当たり５９１，７１５個の微粒子を含む、実施形態３２−３５のいずれか１つの微粒子。

実施形態４０．少なくとも約１０^６個の前記微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態３１−３５のいずれか１つの微粒子。

実施形態４１．前記微粒子のそれぞれが異なっている、実施形態４０の微粒子。

実施形態４２．約１０^６から１０^９個の前記微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態４０の微粒子。

実施形態４３．約１０^９個の前記微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態４２の微粒子。

実施形態４４．前記固体支持体が複数のウェルを含み、前記ウェルのそれぞれが前記微粒子のうちの１つを捕獲する、実施形態３１−４３のいずれか１つの微粒子。

実施形態４５．前記核酸ドメインが核酸配列を含む、実施形態１−４４のいずれか１つの微粒子。

実施形態４６．前記核酸配列が相補的核酸配列に結合している、実施形態４５の微粒子。

実施形態４７．前記相補的核酸配列が検出可能な部分を含む、実施形態４６の微粒子。

実施形態４８．前記検出可能な部分が蛍光部分である、実施形態４７の微粒子。

実施形態４９．前記微粒子が（ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および（ｉｉ）切断されたリンカー部分に共有結合している、微粒子に結合している固体支持体。

実施形態５０．前記リガンドドメインが、反応基に結合している保護化部分を含む、実施形態４９の微粒子。

実施形態５１．前記リガンドドメインがリガンドバインダーに結合している、実施形態４９の微粒子。

実施形態５２．前記切断されたリンカー部分が切断可能なリンカーの残遺物である、実施形態４９または５１の微粒子。

実施形態５３．前記リガンドドメインが複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである、実施形態５２の微粒子。

実施形態５４．前記切断されたリンカー部分が複数の切断されたリンカー部分である、実施形態５３の微粒子。

実施形態５５．前記固体支持体が平面支持体である、実施形態４９−５４のいずれか１つの微粒子。

実施形態５６．前記微粒子が前記固体支持体に非共有結合している、実施形態４９−５５のいずれか１つの微粒子。

実施形態５７．前記微粒子が第３のリンカーを通じて前記固体支持体に連結している、実施形態４９−５５のいずれか１つの微粒子。

実施形態５８．前記微粒子が前記固体支持体に機械的に結合している、実施形態４９−５５のいずれか１つの微粒子。

実施形態５９．複数の微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態４９−５８のいずれか１つの微粒子。

実施形態６０．前記複数の微粒子が不規則アレイを形成する、実施形態５９の微粒子。

実施形態６１．前記複数の微粒子が規則アレイを形成する、実施形態５９の微粒子。

実施形態６２．少なくとも約１０^６個の前記微粒子が前記固体支持体に結合しており、前記微粒子のそれぞれが異なっている、実施形態５９−６２のいずれか１つの微粒子。

実施形態６３．約１０^６から１０^９個の前記微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態６２の微粒子。

実施形態６４．約１０^９個の前記微粒子が前記固体支持体に結合している、実施形態６３の微粒子。

実施形態６５．前記固体支持体が検出装置の内部にある、実施形態５９−６４のいずれか１つの微粒子。

実施形態６６．前記検出装置が前記リガンドドメインに結合している前記リガンドバインダーを検出し、前記固体支持体上で前記結合したリガンドバインダーの位置を同定する、実施形態６５の微粒子。

実施形態６７．切断された微粒子を形成する方法であって、
（ｉ）実施形態１−２５のいずれか１つの微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成するステップと、
（ｉｉ）前記固定化された微粒子の前記第２のリンカーを切断し、それによって切断された微粒子を形成するステップと
を含む前記方法。

実施形態６８．ステップ（ｉｉ）の前記切断に先立って、およびステップ（ｉ）の前記結合後、相補的核酸配列を前記核酸ドメインに結合させるステップをさらに含む、実施形態６７の方法。

実施形態６９．前記切断が前記固定化された微粒子を切断剤に接触させるステップを含む、実施形態６７または６８の方法。

実施形態７０．前記切断剤が酸である、実施形態６９の方法。

実施形態７１．前記切断剤がトリフルオロ酢酸である、実施形態７０の方法。

実施形態７２．前記切断が前記第１のリンカーを切断するステップを含まない、実施形態６７または６８の方法。

実施形態７３．前記切断剤がアルカリ剤である、実施形態６９の方法。

実施形態７４．リガンドバインダーを検出する方法であって、（ｉ）実施形態１−２５のいずれか１つの微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成するステップ、（ｉｉ）相補的核酸を前記固定化された微粒子の前記核酸ドメインに結合させ、前記核酸ドメインの前記固体支持体上の位置を決定し、それによってデコードされマッピングされた微粒子を形成するステップ、（ｉｉｉ）前記デコードされマッピングされた微粒子の前記第２のリンカーを切断し、それによってマッピングされ切断された微粒子を形成するステップ、（ｉｖ）リガンドバインダーを前記マッピングされ切断された微粒子の前記リガンドドメインに結合させるステップ、および（ｖ）前記結合したリガンドバインダーの前記固体支持体上の位置を同定し、それによって前記リガンドバインダーを検出するステップを含む前記方法。

実施形態７５．リガンドバインダーを検出する方法であって、（ｉ）リガンドバインダーを実施形態４９−５８のいずれか１つの微粒子に接触させ、それによって結合したリガンドバインダーを形成するステップ、および（ｉｉ）前記結合したリガンドバインダーの前記固体支持体上の位置を同定し、それによって前記リガンドバインダーを検出するステップを含む前記方法。

Claims (75)

1. （ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および
   （ｉｉ）第２のリンカーを通じて核酸ドメイン
   に共有結合している微粒子であって、第２のリンカーが切断可能であり、第１のリンカーは第２のリンカーが切断可能である条件下では切断可能ではない、微粒子。
2. リガンドドメインが、反応性部分に結合している保護化部分を含む、請求項１に記載の微粒子。
3. 保護化部分がアミノ酸側鎖を含む、請求項２に記載の微粒子。
4. 保護化部分がアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、請求項２に記載の微粒子。
5. 微粒子がマイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
6. 微粒子が官能化されたマイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
7. 微粒子が磁気マイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
8. 微粒子が金属性マイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
9. 微粒子がシリカマイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
10. 微粒子がポリマーマイクロビーズである、請求項１に記載の微粒子。
11. 微粒子がデンドリマーである、請求項１に記載の微粒子。
12. 微粒子が分岐ポリマーである、請求項１に記載の微粒子。
13. 第２のリンカーが光切断可能リンカーである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の微粒子。
14. 第２のリンカーが酸不安定性リンカーである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の微粒子。
15. 第２のリンカーがアルカリ不安定性リンカーである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の微粒子。
16. リガンドドメインがペプチドである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の微粒子。
17. リガンドドメインが小分子である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の微粒子。
18. リガンドドメインがタンパク質である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の微粒子。
19. リガンドドメインがリガンドバインダーに結合する、請求項１６に記載の微粒子。
20. リガンドバインダーが生体分子である、請求項１９に記載の微粒子。
21. 生体分子が核酸である、請求項２０に記載の微粒子。
22. 生体分子がタンパク質である、請求項２０に記載の微粒子。
23. リガンドドメインがリガンドバインダーに結合していない、請求項１から１６のいずれか一項に記載の微粒子。
24. リガンドドメインが複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の微粒子。
25. 核酸ドメインが複数の第２のリンカーを通じて結合している複数の核酸ドメインである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の微粒子。
26. 微粒子が固体支持体に結合している、請求項１から２５のいずれか一項に記載の微粒子。
27. 固体支持体が平面支持体である、請求項２６に記載の微粒子。
28. 微粒子が第３のリンカーを通じて固体支持体に連結している、請求項２６または２７に記載の微粒子。
29. 微粒子が固体支持体に非共有結合している、請求項２６または２７に記載の微粒子。
30. 微粒子が固体支持体に機械的に結合している、請求項２６または２７に記載の微粒子。
31. 複数の微粒子が固体支持体に結合している、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の微粒子。
32. 複数の微粒子が不規則アレイを形成する、請求項３１に記載の微粒子。
33. 複数の微粒子が規則アレイを形成する、請求項３１に記載の微粒子。
34. 複数の微粒子が六角形のアレイを形成する、請求項３１に記載の微粒子。
35. 複数の微粒子が正方形の充填アレイを形成する、請求項３１に記載の微粒子。
36. アレイが平方ミリメートル当たり少なくとも約２００，０００個の微粒子を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の微粒子。
37. アレイが平方ミリメートル当たり約２００，０００個の微粒子を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の微粒子。
38. アレイが平方ミリメートル当たり７８９，０００個の微粒子を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の微粒子。
39. アレイが平方ミリメートル当たり５９１，７１５個の微粒子を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の微粒子。
40. 少なくとも約１０^６個の微粒子が固体支持体に結合している、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の微粒子。
41. 微粒子のそれぞれが異なっている、請求項４０に記載の微粒子。
42. 約１０^６から１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している、請求項４０に記載の微粒子。
43. 約１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している、請求項４２に記載の微粒子。
44. 固体支持体が複数のウェルを含み、ウェルのそれぞれが微粒子のうちの１つを捕獲する、請求項３１から４３のいずれか一項に記載の微粒子。
45. 核酸ドメインが核酸配列を含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の微粒子。
46. 核酸配列が相補的核酸配列に結合している、請求項４５に記載の微粒子。
47. 相補的核酸配列が検出可能な部分を含む、請求項４６に記載の微粒子。
48. 検出可能な部分が蛍光部分である、請求項４７に記載の微粒子。
49. 微粒子に結合している固体支持体であって、微粒子が
    （ｉ）第１のリンカーを通じてリガンドドメイン、および
    （ｉｉ）切断されたリンカー部分
    に共有結合している、固体支持体。
50. リガンドドメインが、反応基に結合している保護化部分を含む、請求項４９に記載の微粒子。
51. リガンドドメインがリガンドバインダーに結合している、請求項４９に記載の微粒子。
52. 切断されたリンカー部分が切断可能なリンカーの残遺物である、請求項４９または５１に記載の微粒子。
53. リガンドドメインが複数の第１のリンカーを通じて結合している複数のリガンドドメインである、請求項５２に記載の微粒子。
54. 切断されたリンカー部分が複数の切断されたリンカー部分である、請求項５３に記載の微粒子。
55. 固体支持体が平面支持体である、請求項４９から５４のいずれか一項に記載の微粒子。
56. 微粒子が固体支持体に非共有結合している、請求項４９から５５のいずれか一項に記載の微粒子。
57. 微粒子が第３のリンカーを通じて固体支持体に連結している、請求項４９から５５のいずれか一項に記載の微粒子。
58. 微粒子が固体支持体に機械的に結合している、請求項４９から５５のいずれか一項に記載の微粒子。
59. 複数の微粒子が固体支持体に結合している、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の微粒子。
60. 複数の微粒子が不規則アレイを形成する、請求項５９に記載の微粒子。
61. 複数の微粒子が規則アレイを形成する、請求項５９に記載の微粒子。
62. 少なくとも約１０^６個の微粒子が固体支持体に結合しており、微粒子のそれぞれが異なっている、請求項５９から６２のいずれか一項に記載の微粒子。
63. 約１０^６から１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している、請求項６２に記載の微粒子。
64. 約１０^９個の微粒子が固体支持体に結合している、請求項６３に記載の微粒子。
65. 固体支持体が検出装置の内部にある、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の微粒子。
66. 検出装置がリガンドドメインに結合しているリガンドバインダーを検出し、固体支持体上で結合したリガンドバインダーの位置を同定する、請求項６５に記載の微粒子。
67. 切断された微粒子を形成する方法であって、
    （ｉ）請求項１から２５のいずれか一項に記載の微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成するステップと、
    （ｉｉ）固定化された微粒子の第２のリンカーを切断し、それによって切断された微粒子を形成するステップ
    とを含む、方法。
68. ステップ（ｉｉ）の切断に先立って、およびステップ（ｉ）の結合後、相補的核酸配列を核酸ドメインに結合させるステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
69. 切断が、固定化された微粒子を切断剤に接触させるステップを含む、請求項６７または６８に記載の方法。
70. 切断剤が酸である、請求項６９に記載の方法。
71. 切断剤がトリフルオロ酢酸である、請求項７０に記載の方法。
72. 切断が第１のリンカーを切断するステップを含まない、請求項６７または６８に記載の方法。
73. 切断剤がアルカリ剤である、請求項６９に記載の方法。
74. リガンドバインダーを検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１から２５のいずれか一項に記載の微粒子を固体支持体に結合させ、それによって固定化された微粒子を形成するステップ、
    （ｉｉ）相補的核酸を固定化された微粒子の核酸ドメインに結合させ、核酸ドメインの固体支持体上の位置を決定し、それによってデコードされマッピングされた微粒子を形成するステップ、
    （ｉｉｉ）デコードされマッピングされた微粒子の第２のリンカーを切断し、それによってマッピングされ切断された微粒子を形成するステップ、
    （ｉｖ）リガンドバインダーをマッピングされ切断された微粒子のリガンドドメインに結合させるステップ、および
    （ｖ）結合したリガンドバインダーの固体支持体上の位置を同定し、それによってリガンドバインダーを検出するステップ
    を含む方法。
75. リガンドバインダーを検出する方法であって、
    （ｉ）リガンドバインダーを請求項４９から５８のいずれか一項に記載の微粒子に接触させ、それによって結合したリガンドバインダーを形成するステップ、および
    （ｉｉ）結合したリガンドバインダーの固体支持体上の位置を同定し、それによってリガンドバインダーを検出するステップ
    を含む方法。

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