JP2021103109A - 血液分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
測定試料は、フローサイトメーターに流し測定を行うための試料であり、生体から採取された血液試料、蛍光色素及びカチオン性界面活性剤を含む。
蛍光色素としては、核酸に(特にDNAに選択的に)結合して蛍光を発することができるものである限り特に制限されず、各種蛍光色素を使用することができる。蛍光色素としては、イミダゾール系蛍光色素(ヘキスト(商標)、DAPI)、シアニン系蛍光色素(Cy、TOTO(商標)、SYTO(商標))、フェナントリジン系蛍光色素(エチジウムブロマイド、プロピジウムイオダイド)、アクリジン系蛍光色素(アクリジンオレンジ)が挙げられ、好ましくはイミダゾール系蛍光色素またはシアニン系蛍光色素が挙げられる。
カチオン性界面活性剤は、赤血球の細胞膜を損傷する作用があれば、特に制限されない。カチオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、アルキルアミン塩等が挙げられ、特に好ましくは第四級アンモニウム塩が挙げられる。
で表される化合物が挙げられる。
アルキル基は、直鎖状及び分岐鎖状のいずれでもよいが、好ましくは直鎖状である。R1で示されるアルキル基として、好ましくは炭素数10〜20のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数12〜18のアルキル基が挙げられる。R2、R3及びR4で示されるアルキル基として、好ましくは炭素数1〜4のアルキル基が挙げられ、より好ましくは炭素数1〜2のアルキル基が挙げられ、さらに好ましくは炭素数1のアルキル基が挙げられる。アニオンとしては、特に制限されず、例えば塩素イオン、臭素イオン等が挙げられ、好ましくは塩素イオンが挙げられる。
一般式(I)で表される化合物としては、好ましくはオクチルトリメチルアンモニウムブロマイド(OTAB)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド(DTAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド(LTAC)、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド(MTAB)、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド(MTAC)、セチルトリメチルアンモニウムクロライド(CTAC)、セチルピリジニウムクロライド(CPC)、及びステアリルトリメチルンモニウムクロライド(STAC)等が挙げられる。
血液試料は、ピロプラズマ感染が起こる哺乳動物の生体から採取され得る。当該哺乳動物は、例えば、イヌ、ウマ、ウシ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ、トナカイ等の非ヒト哺乳動物である。本明細書において、「血液試料」は、赤血球を含む試料であればよく、全血、全血を処理して得られる試料などを含む。全血を処理して得られる試料としては、たとえば、全血から遠心分離等により赤血球とその他の成分を分離し、その他の成分を除去して得られる試料であってもよい。。
測定試料の調製方法は特に限定されず、当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、血液試料、蛍光色素(好ましくは蛍光色素を含む染色液)及びカチオン性界面活性剤(好ましくはカチオン性界面活性剤を含む溶血剤)を混合することによって調製することができる。
蛍光情報を取得する際の照射光の波長は、蛍光色素を励起可能な波長であれば特に限定されない。照射光の強度は当業者が適宜設定できる。
本試験における染色液としては、エチレングリコールに、蛍光色素(SYTO(商標) 16 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain-1mM Solution in DMSO(Thermo Fisher Scientific製))を混合してなる液(蛍光色素濃度:26μM)を用いた。
本試験における染色液としては、エチレングリコールに、蛍光色素(Hoechst34580(AAT Bioquest製))を溶解してなる液(蛍光色素濃度:23μM)を用いた。
本試験における染色液としては、Fluorocell M(核酸染色蛍光色素濃度:23μM)を用いた。また、本試験における検体希釈液としては、組成7を用いた。
Claims (15)
- 生体から採取された血液試料、核酸を染色する蛍光色素及びカチオン性界面活性剤を混合して調製された測定試料に光を照射し、蛍光情報を取得する工程と、
前記蛍光情報に基づいて、前記血液試料中のピロプラズマに感染した赤血球を検出する工程とを含む、血液分析方法。 - 前記カチオン性界面活性剤が第四級アンモニウム塩である、請求項1に記載の血液分析方法。
- 前記カチオン性界面活性剤が、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド(OTAB)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド(DTAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド(LTAC)、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロマイド(MTAB)、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド(MTAC)、セチルトリメチルアンモニウムクロライド(CTAC)、セチルピリジニウムクロライド(CPC)、及びステアリルトリメチルンモニウムクロライド(STAC)からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記蛍光色素が、イミダゾール系蛍光色素、シアニン系蛍光色素、フェナントリジン系蛍光色素、及びアクリジン系蛍光色素からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記蛍光色素が、イミダゾール系蛍光色素、及びシアニン系蛍光色素からなる群より選択される少なくとも1種を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記測定試料が、さらにノニオン性界面活性剤を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノイソステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル、ポリオキシエチレン水素化ひまし油、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンセチルエーテル、及びポリオキシエチレンモノラウリン酸エステルからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項7に記載の血液分析方法。
- 前記血液試料が非ヒト哺乳動物から採取された血液試料である、請求項1〜8のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、イヌ又はウマである、請求項9記載の血液分析方法。
- 前記検出工程において、前記血液試料中のピロプラズマに感染した赤血球を計数する、請求項1〜10のいずれかに記載の血液分析方法。
- 前記取得工程において、散乱光情報をさらに取得し、
前記検出工程において、前記蛍光情報および前記散乱光情報に基づいて、前記血液試料中のピロプラズマに感染した赤血球を検出する、
請求項1〜11のいずれかに記載の血液分析方法。 - 前記散乱光情報が、前方散乱光情報である、請求項12に記載の血液分析方法。
- 核酸を染色する蛍光色素及びカチオン性界面活性剤を含む、ピロプラズマ検出用試薬。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の血液分析方法に用いるための、請求項14に記載のピロプラズマ検出用試薬。
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