JP2021102569A - Drug carrier agent and pharmaceutical composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標的とする臓器、組織、細胞等への薬物送達のための薬物キャリア剤、及びその薬物キャリア剤を含む医薬組成物に関する。 The present invention relates to a drug carrier agent for delivering a drug to a target organ, tissue, cell, etc., and a pharmaceutical composition containing the drug carrier agent.
血液と脳との間には、物質の移行を制限する血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）が存在することが知られている。これは、脳血管内皮細胞が密着結合することにより細胞同士の間隙が物理的に狭くなっていること、並びに細胞自体の物質の取り込み及び排出が選択的であることによると考えられている。血液脳関門の透過選択性は非常に高く、中枢神経系に障害が生じても、薬物を中枢神経系の目的領域に送達することができないのが現状である。 It is known that there is a blood-brain barrier (BBB) between the blood and the brain that limits the transfer of substances. It is considered that this is because the gap between the cells is physically narrowed by the tight junction of the cerebrovascular endothelial cells, and the uptake and excretion of the substance of the cell itself is selective. The permeabilizing selectivity of the blood-brain barrier is very high, and even if the central nervous system is damaged, the drug cannot be delivered to the target area of the central nervous system.
これまでに脳への薬物送達方法はいくつか報告されており、例えば、特許文献１には、グリコシル化により抗体を脳へ送達する技術が記載されている。特許文献２には、高分子ポリマーが溶液中で自己組織化することで形成されるナノキャリアの表面をグルコースにより修飾することで、薬物を脳へ送達できる技術が記載されている。特許文献３には、ＢＢＢを通過することのできるペプチドを付与することにより、薬物を脳へ輸送する技術が記載されている。 Several methods for delivering a drug to the brain have been reported so far. For example, Patent Document 1 describes a technique for delivering an antibody to the brain by glycosylation. Patent Document 2 describes a technique capable of delivering a drug to the brain by modifying the surface of a nanocarrier formed by self-assembling a high molecular polymer in a solution with glucose. Patent Document 3 describes a technique for transporting a drug to the brain by imparting a peptide capable of passing through the BBB.
一方、シクロデキストリン（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ；以下、単に「ＣＤ」という場合がある。）はグルコース残基がα−１，４結合した環状のオリゴ糖であり、立体的に見れば、いわば底のないバケツ様の構造で、空洞外部が親水性であるのに対し、空洞内部が疎水性を示すという特徴を有する。この特徴により、ＣＤは空洞内部に特定の有機分子（ゲスト分子）を包み込むように取り込む現象（包接）を示すことが知られている。 On the other hand, cyclodextrin (hereinafter, may be simply referred to as "CD") is a cyclic oligosaccharide in which glucose residues are α-1,4 bonded, and is sterically viewed as a bottomless bucket-like substance. The structure is characterized in that the outside of the cavity is hydrophilic, while the inside of the cavity is hydrophobic. Due to this feature, it is known that CD exhibits a phenomenon (inclusion) of incorporating a specific organic molecule (guest molecule) into the cavity so as to wrap it.
このＣＤの包接作用により、医薬品分野においては、薬物の可溶化、安定化、バイオアベイラビリティの改善、呈味改善等のさまざまな用途で利用されている。また、糖やアミノ酸、官能基等をＣＤに付与することにより、生体適合性や指向性を向上させたＣＤ誘導体が開発されており、薬物送達システム（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ；ＤＤＳ）や医薬品原薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ；ＡＰＩ）への応用に関する研究が進められている。例えば、非特許文献１には、β−ＣＤの１級水酸基にカプロン酸２分子をスペーサーとして葉酸修飾することにより、葉酸レセプターを介するがん細胞を標的としたＤＤＳキャリアが記載されている。非特許文献２には、メチル化β−ＣＤに葉酸を修飾することにより、葉酸レセプターを介してがん細胞を標的とした抗がん剤として利用することが記載されている。非特許文献３には、ＣＤにリガンドとなる糖鎖を修飾することにより、各種レクチンとの相互作用を向上させることができることから、特定組織への薬物送達を目的としたＤＤＳキャリアとして利用できる可能性があることが示唆されている。 Due to the inclusion action of this CD, it is used in various applications such as solubilization and stabilization of drugs, improvement of bioavailability, and improvement of taste in the pharmaceutical field. In addition, CD derivatives with improved biocompatibility and directivity have been developed by adding sugars, amino acids, functional groups, etc. to CDs, such as drug delivery systems (DDS) and drug substance (DDS). Research on its application to Active Pharmaceutical Industries (API) is underway. For example, Non-Patent Document 1 describes a DDS carrier that targets cancer cells via a folic acid receptor by modifying the primary hydroxyl group of β-CD with folic acid using two caproic acid molecules as spacers. Non-Patent Document 2 describes that by modifying folic acid to methylated β-CD, it can be used as an anticancer agent targeting cancer cells via a folic acid receptor. In Non-Patent Document 3, since the interaction with various lectins can be improved by modifying the sugar chain that serves as a ligand for CD, it can be used as a DDS carrier for the purpose of delivering a drug to a specific tissue. It has been suggested that there is sex.
しかしながら、脳移行用のシクロデキストリン誘導体について報告は少なく、その新規開発が望まれている。 However, there are few reports on cyclodextrin derivatives for brain transfer, and new development thereof is desired.
本発明の目的は、シクロデキストリンを利用して、薬物送達システムに有用な薬物キャリア剤を提供することにある。また、その薬物キャリア剤を含む医薬組成物を提供することにある。 An object of the present invention is to utilize cyclodextrin to provide a drug carrier agent useful for a drug delivery system. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the drug carrier agent.
本発明者らは、上記目的を達成するため検討を重ねた結果、還元末端を有する糖修飾シクロデキストリンが薬物キャリア剤として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of repeated studies to achieve the above object, the present inventors have found that a sugar-modified cyclodextrin having a reducing end is useful as a drug carrier agent, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の構成を有するものである。 That is, the present invention has the following configuration.
［１］ 下記一般式（１）で表されるシクロデキストリン誘導体を含む薬物キャリア剤。 [1] A drug carrier agent containing a cyclodextrin derivative represented by the following general formula (1).
−ＮＨ−Ｚ ・・・（ａ）
［式中、Ｚは、ウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖のカルボキシル基がアミノ基と縮合して形成される、還元性基を有する単糖又はオリゴ糖の残基を示す。］
［２］ 前記一般式（１）中、Ｒ４及びＲ５は−Ｈで表わされる基を示す、［１］に記載の薬物キャリア剤。
［３］ 前記式（ａ）中、Ｚは、ウロン酸のカルボキシル基がアミノ基と縮合して形成される、還元性基を有する単糖の残基である、［１］又は［２］に記載の薬物キャリア剤。
［４］ 前記ウロン酸が、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、アラビノン酸、フルクツロン酸、タガツロン酸、イズロン酸、グルロン酸から選ばれた１種又は２種以上である、［３］に記載の薬物キャリア剤。
［５］ 前記一般式（１）中、ｍ＋ｎ＝７である、［１］〜［４］のいずれかに記載の薬物キャリア剤。
［６］ 前記一般式（１）中、Ｒ１は前記式（ａ）で表される基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は−Ｈ又は−ＯＨで表される基を示す、［１］〜［５］のいずれかに記載の薬物キャリア剤。
［７］ 前記一般式（１）中、Ｒ１は前記式（ａ）で表される基を示し、Ｒ２及びＲ３は−ＯＨで表わされる基を示し、Ｒ４及びＲ５は−Ｈで表わされる基を示す、［１］〜［５］のいずれかに記載の薬物キャリア剤。
［８］ 前記一般式（１）中、ｎは１である、［１］〜［７］のいずれかに記載の薬物キャリア剤。
［９］ 脳移行用である、［１］〜［８］のいずれかに記載の薬物キャリア剤。
［１０］ ［１］〜［９］のいずれかに記載の薬物キャリア剤と、薬物とを、１剤に又は別々に含む医薬組成物。
−NH-Z ・ ・ ・ (a)
[In the formula, Z represents a residue of a monosaccharide or oligosaccharide having a reducing group formed by condensing the carboxyl group of uronic acid or an oligosaccharide containing uronic acid with an amino group. ]
[2] The drug carrier agent according to [1], wherein in the general formula (1), R 4 and R 5 represent a group represented by −H.
[3] In the formula (a), Z is a residue of a monosaccharide having a reducing group formed by condensing the carboxyl group of uronic acid with an amino group, in [1] or [2]. The drug carrier agent described.
[4] The type according to [3], wherein the uronic acid is one or more selected from glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid, arabinonic acid, fructuronate, tagaturonate, iduronic acid and gluuronic acid. Drug carrier.
[5] The drug carrier agent according to any one of [1] to [4], wherein m + n = 7 in the general formula (1).
[6] In the general formula (1), R 1 represents a group represented by the formula (a), and R 2 , R 3 , R 4 and R 5 represent a group represented by −H or −OH. The drug carrier agent according to any one of [1] to [5] shown.
[7] In the general formula (1), R 1 represents a group represented by the formula (a), R 2 and R 3 represent a group represented by −OH, and R 4 and R 5 represent −H. The drug carrier agent according to any one of [1] to [5], which represents a group represented by.
[8] The drug carrier agent according to any one of [1] to [7], wherein n is 1 in the general formula (1).
[9] The drug carrier agent according to any one of [1] to [8], which is used for brain transfer.
[10] A pharmaceutical composition containing the drug carrier agent according to any one of [1] to [9] and a drug in one agent or separately.
本発明によれば、シクロデキストリンを利用して、薬物送達システムに有用な薬物キャリア剤を提供することができる。また、その薬物キャリア剤を含む医薬組成物を提供することができる。 According to the present invention, cyclodextrin can be utilized to provide a drug carrier agent useful for a drug delivery system. In addition, a pharmaceutical composition containing the drug carrier agent can be provided.
本発明は、シクロデキストリン誘導体、より具体的には還元末端（還元性基）を有する糖修飾シクロデキストリンを用いて、薬物キャリアとして利用するものである。 The present invention uses a cyclodextrin derivative, more specifically, a sugar-modified cyclodextrin having a reducing end (reducing group), and is used as a drug carrier.
本明細書において「シクロデキストリン」は、当業者に周知の物質であり、これと同義である。すなわち、例えば、澱粉などのα−１，４−グルカンにシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより、その分子内転移反応によって生成する環状のα−１，４−グルカンが挙げられる。このように生成する環状グルカンの重合度としては主として６〜８であり、それぞれα−シクロデキストリン（α−ＣＤ）、β−シクロデキストリン（β−ＣＤ）、γ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）と呼ばれている。シクロデキストリンは、立体的にみれば、いわば底のないバケツ様の構造をしており、空洞外部が親水性であるのに対し、空洞内部が疎水性を示すという特徴を有する。この特徴により、シクロデキストリンは空洞内部に特定の有機分子など（ゲスト分子）を包み込むように取込む現象（包接）を示し、包接複合体が形成される。一般にシクロデキストリンによるゲスト分子の包接は、シクロデキストリンの空洞のサイズ及びゲスト分子のサイズ又はゲスト分子の構造の一部のサイズが一致する場合に起こり得る。また、シクロデキストリン空洞内部は疎水性であるため、ゲスト分子が疎水性である場合の方が比較的包接されやすい傾向がある。 As used herein, "cyclodextrin" is a substance well known to those skilled in the art and is synonymous with this. That is, for example, cyclic α-1,4-glucan produced by an intramolecular transfer reaction of α-1,4-glucan such as starch by allowing cyclodextrin glucanotransferase to act. The degree of polymerization of the cyclic glucan thus produced is mainly 6 to 8, and α-cyclodextrin (α-CD), β-cyclodextrin (β-CD), and γ-cyclodextrin (γ-CD), respectively. being called. Cyclodextrin has a so-called bottomless bucket-like structure when viewed three-dimensionally, and has the characteristic that the outside of the cavity is hydrophilic, while the inside of the cavity is hydrophobic. Due to this feature, cyclodextrin exhibits a phenomenon (inclusion) of incorporating a specific organic molecule or the like (guest molecule) into the cavity, and an inclusion complex is formed. In general, inclusion of a guest molecule by cyclodextrin can occur when the size of the cavity of the cyclodextrin and the size of the guest molecule or the size of a part of the structure of the guest molecule match. Moreover, since the inside of the cyclodextrin cavity is hydrophobic, it tends to be relatively easily included when the guest molecule is hydrophobic.
本発明に用いられるＣＤ誘導体は、シクロデキストリンにアミノ基を修飾させ、そのアミノ基とウロン酸（例えばグルクロン酸）の６位炭素のカルボキシル基がアミド結合により結合した構造を有している。具体的には、下記一般式（１）で表される構造を有しており、この構造により、分岐（糖修飾）構造を形成するウロン酸（例えばグルクロン酸）の１位炭素がアルデヒド基となり還元性を示す。なお、本明細書において、当該構造を有するシクロデキストリン誘導体を、「還元末端を有する糖修飾シクロデキストリン」などと記載する場合がある。上記分岐構造は、例えば、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤのいずれに付与されたものでもよい。各ＣＤはそれぞれ性質が異なるため、求められる性質に応じていずれかを適宜選択すればよい。 The CD derivative used in the present invention has a structure in which cyclodextrin is modified with an amino group, and the amino group and the carboxyl group of the 6-position carbon of uronic acid (for example, glucuronic acid) are bonded by an amide bond. Specifically, it has a structure represented by the following general formula (1), and due to this structure, the 1-position carbon of uronic acid (for example, glucuronic acid) forming a branched (sugar-modified) structure becomes an aldehyde group. Shows reducing property. In addition, in this specification, a cyclodextrin derivative having the said structure may be described as "a sugar-modified cyclodextrin having a reducing end" and the like. The branched structure may be, for example, any of α-CD, β-CD, and γ-CD. Since each CD has different properties, one of them may be appropriately selected according to the required properties.
ウロン酸は、単糖を酸化して得られ、単糖のアルデヒド基またはカルボニル基と共にカルボキシル基１個を有するカルボン酸である。特に制限はないが、例えば、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、アラビノン酸、フルクツロン酸、タガツロン酸、イズロン酸、グルロン酸などを用いることができ、これらウロン酸から選ばれた１種又は２種以上のものを用いることができる。また、ウロン酸を含むオリゴ糖なども、上記還元性を示す分岐構造を形成するために用いることができる。ウロン酸を含むオリゴ糖としては、例えばヒアルロン酸オリゴ糖が挙げられる。 Uronic acid is a carboxylic acid obtained by oxidizing a monosaccharide and having one carboxyl group together with an aldehyde group or a carbonyl group of the monosaccharide. Although there is no particular limitation, for example, glucuronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid, arabinonic acid, fructuronate, tagaturonate, iduronic acid, gluuronic acid and the like can be used, and one or two selected from these uronic acids can be used. The above can be used. Further, oligosaccharides containing uronic acid and the like can also be used to form a branched structure exhibiting the above-mentioned reducing property. Examples of oligosaccharides containing uronic acid include hyaluronic acid oligosaccharides.
また、本明細書において「ウロン酸」又は「ウロン酸オリゴ糖」とは、ウロン酸ナトリウムなどのウロン酸塩、ウロン酸オリゴ糖塩等、塩の形態のものも含む意味である。塩の形態ではないもの、塩の形態のもののいずれを用いるかは、所望とするＣＤ誘導体の種類によって適宜選択すればよいが、塩の形態のものを用いると、反応時に水等の溶媒に溶解しやすく、かつ、安価に入手できるというメリットが得られる場合がある。 Further, in the present specification, "uronic acid" or "uronic acid oligosaccharide" means that a salt form such as uronic acid such as sodium uronate or uronic acid oligosaccharide salt is also included. Whether to use a non-salt form or a salt form may be appropriately selected depending on the type of desired CD derivative, but if the salt form is used, it dissolves in a solvent such as water during the reaction. In some cases, it is easy to obtain and can be obtained at low cost.
具体的には、本発明に用いるＣＤ誘導体は、下記一般式（１）で表される化合物からなる。 Specifically, the CD derivative used in the present invention comprises a compound represented by the following general formula (1).
−ＮＨ−Ｚ ・・・（ａ）
［式中、Ｚは、ウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖と、アミノ基とが縮合して形成される、還元性基を有する単糖又はオリゴ糖の残基を示す。］
−NH-Z ・ ・ ・ (a)
[In the formula, Z indicates a residue of a monosaccharide or oligosaccharide having a reducing group, which is formed by condensing uronic acid or an oligosaccharide containing uronic acid with an amino group. ]
なお、上記シクロデキストリン誘導体は、シクロデキストリン中の糖修飾されたグルコース残基が、例えば、その２位炭素及び/又は３位炭素がエピマー化して、マンノース残基、アロース残基、アルトロース残基等の構造になる場合があるが、当該構造を有するＣＤ誘導体も本発明に用いられるＣＤ誘導体に含まれる。 In the cyclodextrin derivative, the sugar-modified glucose residue in cyclodextrin is, for example, epimerized with its 2-position carbon and / or 3-position carbon, resulting in mannose residue, allose residue, and altrose residue. However, a CD derivative having such a structure is also included in the CD derivative used in the present invention.
上記一般式（１）で表されるシクロデキストリン誘導体は、出発物質として下記構造を有するアミノ化ＣＤと、ウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖とを、縮合剤の存在下で縮合反応させることにより得ることができる。 The cyclodextrin derivative represented by the general formula (1) is obtained by subjecting an aminated CD having the following structure as a starting material and uronic acid or an oligosaccharide containing uronic acid to a condensation reaction in the presence of a condensing agent. Obtainable.
すなわち、シクロデキストリンを構成するいずれか１つ以上の糖の、６位、２位、３位のいずれか１以上の水酸基をアミノ化してなるアミノ化シクロデキストリンと、ウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖とを、縮合剤の存在下で縮合反応させることにより、アミノ化ＣＤのアミノ基とウロン酸の６位炭素のカルボキシル基がアミド結合により結合した構造のＣＤ誘導体を得ることができる。 That is, an aminated cyclodextrin obtained by amifying one or more hydroxyl groups at the 6-position, 2-position, and 3-position of any one or more sugars constituting cyclodextrin, and an oligo containing uronic acid or uronic acid. By subjecting the sugar to a condensation reaction in the presence of a condensing agent, a CD derivative having a structure in which the amino group of the amination CD and the carboxyl group of the 6th carbon of uronic acid are bonded by an amide bond can be obtained.
上記アミノ化ＣＤとしては、シクロデキストリンにアミノ基が付与されたものであればよく、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤのいずれにアミノ基が付与されたものでもよく、６位炭素にアミノ基が付与されたものや３位炭素にアミノ基が付与されたもの、２位炭素にアミノ基が付与されたもの、更にはグルコース残基（糖残基）中の複数の炭素にアミノ基が付与されたものも用いることができる。アミノ基を付与するグルコース残基（糖残基）の数も特に制限はなく、ＣＤ分子中の１つのグルコース残基（糖残基）にアミノ基が付与されたものや複数のグルコース残基（糖残基）にアミノ基が付与されたものを用いることができる。 The amination CD may be any cyclodextrin to which an amino group is added, and any of α-CD, β-CD, and γ-CD may have an amino group added to the 6-position carbon. Amino groups are added, amino groups are added to the 3-position carbon, amino groups are added to the 2-position carbon, and amino groups are added to multiple carbons in glucose residues (sugar residues). Those with the above can also be used. The number of glucose residues (sugar residues) that impart an amino group is also not particularly limited, and one glucose residue (sugar residue) in a CD molecule is endowed with an amino group or a plurality of glucose residues (sugar residues). A sugar residue) to which an amino group is added can be used.
なお、シクロデキストリンにアミノ基を付与する段階において、当該アミノ化修飾を受けるシクロデキストリン中のグルコース残基は、例えば、その２位炭素及び/又は３位炭素がエピマー化して、マンノース残基、アロース残基、アルトロース残基等の構造となる場合がある。 At the stage of imparting an amino group to cyclodextrin, the glucose residue in the cyclodextrin undergoing the amination modification is, for example, epimerized with its 2-position carbon and / or 3-position carbon, resulting in mannose residue and allose. It may have a structure such as a residue or an altrose residue.
上記アミノ化ＣＤは、ＣＤをトシル化し、得られたトシル化ＣＤをアジド化し、得られたアジド化ＣＤをアミノ化することにより調製することが可能である。例えば、ＣＤの６位の水酸基のアミノ基への変換は、水酸基を例えば、塩化ｐ−トルエンスルホニル（塩化トシル）でトシル化する。その後、トシル化された水酸基をナトリウムアミドでアジド基へ変換し、最後にアジド基をトリフェニルホスフィンで還元することによりアミノ化ＣＤを得ることができる。また、トシル化された水酸基は、アンモニア水と反応させることでより簡便にアミノ基へ変換してアミノ化ＣＤを得ることもできるが、他の方法で合成してもよい。更に、アミノ化ＣＤは、ＣＤを塩素化し、得られた塩素化ＣＤをアジド化し、得られたアジド化ＣＤをアミノ化することによっても調製することができる。また、トシル化又は塩素化の後に特定の置換度のトシル化ＣＤ又は塩素化ＣＤを液体クロマトグラフィーにより分取してアジド化及びアミノ化することにより、特定の置換度を持つアミノ化ＣＤを合成することができる。更に、試薬として販売されている種々のアミノ化ＣＤを購入して用いることもできる。また、アミノ化ＣＤを塩酸等の酸により塩の状態としたアミノ化ＣＤ塩も用いることができる。すなわち、上記アミノ化ＣＤとは、アミノ化ＣＤ塩も含む意味であり、上記調製においてはアミノ化ＣＤ、アミノ化ＣＤ塩のいずれを用いても可能である。所望とするＣＤ誘導体の種類により適宜選択すればよいが、アミノ化ＣＤ塩を用いると、反応時に水等の溶媒に溶解しやすく、かつ、安価に入手できるといったメリットが得られる場合がある。 The azinated CD can be prepared by tosylating the CD, azide the obtained tosylated CD, and azide the obtained azinated CD. For example, the conversion of the hydroxyl group at the 6-position of CD to an amino group involves tosylating the hydroxyl group with, for example, p-toluenesulfonyl chloride (tosyl chloride). Then, the tosylated hydroxyl group is converted to an azido group with sodium amide, and finally the azide group is reduced with triphenylphosphine to obtain an azinated CD. Further, the tosylated hydroxyl group can be more easily converted into an amino group by reacting with aqueous ammonia to obtain an aminoated CD, but it may be synthesized by another method. Further, the azinated CD can also be prepared by chlorinating the CD, azide the obtained chlorinated CD, and azide the obtained azidized CD. In addition, after tosylation or chlorination, tosylated CDs or chlorinated CDs having a specific degree of substitution are separated by liquid chromatography to azide and aminated to synthesize an aminated CD having a specific degree of substitution. can do. Furthermore, various amination CDs sold as reagents can be purchased and used. Further, an amination CD salt obtained by converting the amination CD into a salt state with an acid such as hydrochloric acid can also be used. That is, the above-mentioned amination CD means that the amination CD salt is also included, and either the amination CD or the amination CD salt can be used in the above preparation. It may be appropriately selected depending on the type of desired CD derivative, but when an aminoated CD salt is used, there are cases where it is easy to dissolve in a solvent such as water at the time of reaction and it can be obtained at low cost.
上記アミノ化ＣＤとウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖とを縮合反応させるための縮合剤としては、通常当業者に周知の縮合剤を使用すればよく、例えば、アミノ酸を縮合させペプチド結合を形成させる反応に用いる触媒等を用いることが可能である。具体的には、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＢＯＰ試薬）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ試薬）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホ二ウムヘキサフルオロりん酸（ＰｙＢＯＰ試薬）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ試薬）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣ試薬）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ試薬）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ試薬）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’）−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸（ＨＢＴＵ試薬）などを用いることができる。縮合剤は、１種類を単品で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。 As a condensing agent for condensing the above-mentioned amination CD with uronic acid or an oligosaccharide containing uronic acid, a condensing agent well known to those skilled in the art may be used. For example, amino acids are condensed to form a peptide bond. It is possible to use a catalyst or the like used for the reaction to cause the reaction. Specifically, 1H-benzotriazole-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt reagent), 1H-benzotriazole-1-yloxytri Pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP reagent), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC reagent), 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide (WSC reagent), N, N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC reagent), 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM reagent), O- (benzotriazole) -1-yl) -N, N, N', N')-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU reagent) and the like can be used. One type of condensing agent may be used alone, or two or more types may be used in combination.
縮合反応の条件は、用いる縮合剤の性質などに応じて適宜調整すればよい。典型的に、例えば、ＢＯＰ試薬の場合は、室温においてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で３時間反応させるなどである。 The conditions of the condensation reaction may be appropriately adjusted according to the properties of the condensing agent used. Typically, for example, in the case of BOP reagents, they are reacted in N, N-dimethylformamide (DMF) for 3 hours at room temperature.
上記のようにして調製されるシクロデキストリン誘導体は、シクロデキストリンにアミド結合を介して結合させるウロン酸が、例えばグルクロン酸の場合、結果物として得られる糖修飾の構造は、還元末端を有するグルコース修飾とみることができる。また、ウロン酸が例えばマンヌロン酸の場合は、還元性を有するマンノース修飾とみることができ、ウロン酸が例えばガラクツロン酸の場合、還元性を有するガラクトース修飾とみることができる。 In the cyclodextrin derivative prepared as described above, in the case of uronic acid that binds to cyclodextrin via an amide bond, for example, glucuronic acid, the resulting sugar-modified structure is a glucose-modified having a reducing end. Can be seen as. Further, when the uronic acid is, for example, mannuronic acid, it can be regarded as a reducing mannose modification, and when the uronic acid is, for example, galacturonic acid, it can be regarded as a reducing galactose modification.
上記に説明した糖修飾ＣＤ誘導体は、薬物送達のための薬物キャリア剤として有用である。そのメカニズムの１つには、これに限定されないが、生体内において普遍的に細胞へのグルコース取り込みに関与しているグルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ１）を介した機構が挙げられる。すなわち、糖修飾ＣＤ誘導体がＧＬＵＴ１のリガンドとして認識されることで、当該ＣＤ誘導体に包接等させた薬物を、組織、臓器、細胞等に効率的に到達させたり、その細胞内に効率的に到達させたりすることができる。より具体的に、例えば、血液脳関門を効率的に通過させたり、あるいは、血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞に効率的に吸収させたりすることができる。ここで、ＧＬＵＴ１の本来のリガンドはグルコースであるが、グルコース以外のマンノースやガラクトース等の単糖類、マルトースやセロビオース等の二糖類を認識することが報告されている（Ｂａｒｎｅｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１３１、２１１−２２１、１９７３）。よって、これらのグルコース以外の単糖類ないし二糖類以上のオリゴ糖に対しても、認識能はグルコースに比べると低いものの、必要なリガンドとしての性能を備えている。ただし、本発明は上記記載に拘束されるものではない。 The sugar-modified CD derivatives described above are useful as drug carriers for drug delivery. One of the mechanisms includes, but is not limited to, a mechanism mediated by glucose transporter 1 (GLUT1), which is universally involved in glucose uptake into cells in the living body. That is, by recognizing the sugar-modified CD derivative as a ligand of GLUT1, the drug encapsulated in the CD derivative can be efficiently reached to tissues, organs, cells, etc., or efficiently into the cells. It can be reached. More specifically, for example, it can efficiently cross the blood-brain barrier or be efficiently absorbed by the cerebral vascular endothelial cells constituting the blood-brain barrier. Here, although glucose is the original ligand of GLUT1, it has been reported that monosaccharides such as mannose and galactose other than glucose and disaccharides such as maltose and cellobiose are recognized (Barnett et al., Biochem. J., 131, 211-221, 1973). Therefore, even for these monosaccharides other than glucose or oligosaccharides of disaccharides or more, although the recognition ability is lower than that of glucose, they have the performance as a necessary ligand. However, the present invention is not bound by the above description.
本発明により提供される薬物キャリア剤は、任意の薬物と組み合わせて使用して、その薬物の生体内の組織、臓器、細胞等への効率的な送達のために好適に用いられる。具体的には、例えば、血液脳関門を通過させて脳内に薬物を効率的に送達させるために好適に用いられる。あるいは、血液脳関門を構成する脳血管内皮細胞に薬物を効率的に吸収させるために好適に用いられる。 The drug carrier agent provided by the present invention is preferably used in combination with any drug for efficient delivery of the drug to tissues, organs, cells, etc. in vivo. Specifically, for example, it is suitably used for efficiently delivering a drug into the brain by passing through the blood-brain barrier. Alternatively, it is suitably used for efficiently absorbing a drug by cerebral vascular endothelial cells constituting the blood-brain barrier.
適用される薬物は任意であり、還元末端を有する糖修飾シクロデキストリンと包接複合体を形成するものであれば特に制限はないが、脳移行用とする観点からは、例えば、分子そのものが脳内において生理活性を有する物質（以下、単に「生理活性物質」という場合がある。）、あるいは脳内の生理機能を発揮させる物質（以下、単に「脳内機能物質」という場合がある。）等を例示することができる。 The drug to be applied is arbitrary and is not particularly limited as long as it forms an inclusion complex with a sugar-modified cyclodextrin having a reducing end, but from the viewpoint of brain transfer, for example, the molecule itself is the brain. Substances that have physiological activity in the body (hereinafter, may be simply referred to as "physiologically active substances"), substances that exert physiological functions in the brain (hereinafter, may be simply referred to as "functional substances in the brain"), etc. Can be exemplified.
生理活性物質としては、これに限定されないが、例えば、低分子化合物、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、核酸などを挙げることができる。 Examples of the physiologically active substance include, but are not limited to, low molecular weight compounds, polypeptides, oligopeptides, proteins, nucleic acids and the like.
生理活性物質として低分子化合物は、これに限定されないが、脳や中枢神経に関連する種々の疾患の治療及び／又は予防のために用いられる医薬品に有効成分として含まれている化合物、例えば、中枢神経疾患治療剤の有効成分、あるいは脳の疾患の治療及び／又は予防のために用いられる化合物、例えば、脳内の炎症を抑えるための抗炎症作用を有する化合物、抗がん作用を示す化合物、脳内感染症治療のための抗菌薬や抗ウィルス薬の有効成分である化合物などを挙げることができる。 Small molecule compounds as physiologically active substances are, but are not limited to, compounds contained as active ingredients in pharmaceuticals used for the treatment and / or prevention of various diseases related to the brain and central nerves, for example, central organs. Active ingredients of therapeutic agents for neurological diseases, or compounds used for the treatment and / or prevention of brain diseases, for example, compounds having an anti-inflammatory effect for suppressing inflammation in the brain, compounds exhibiting an anti-cancer effect, Examples thereof include compounds that are active ingredients of antibacterial agents and antiviral agents for the treatment of intracerebral infectious diseases.
生理活性物質としてペプチド（ポリペプチドやオリゴペプチド）は、例えば、生理活性ペプチドを挙げることができ、脳や中枢神経に関連する疾患の治療及び／又は予防のために用いられるペプチドなどを挙げることができる。具体的には、これに限定されないが、脳内アミロイドベータペプチド分解に関わる酵素発現を調節するソマトスタチン、脳内神経細胞機能を制御するインスリン、又はその他の脳や中枢神経の機能に関連するペプチド、それらの誘導体などを挙げることができる。 Examples of the peptide (polypeptide or oligopeptide) as the physiologically active substance include physiologically active peptides, and peptides used for the treatment and / or prevention of diseases related to the brain and the central nervous system. it can. Specifically, but not limited to, somatostatin, which regulates the expression of enzymes involved in the degradation of amyloid beta peptide in the brain, insulin, which controls the function of nerve cells in the brain, or other peptides related to the function of the brain and central nervous system. Examples thereof include derivatives thereof.
生理活性物質としてタンパク質は、これに限定されないが、脳内で生理活性を有するタンパク質を挙げることができ、疾患の治療及び／又は予防のために用いられるタンパク質等を挙げることができる。例えば、酵素、抗体、転写因子、あるいはそれらを構成する特定の部分などを挙げることができる。 The protein as a physiologically active substance is not limited to this, and examples thereof include proteins having physiological activity in the brain, and examples thereof include proteins used for treatment and / or prevention of diseases. For example, enzymes, antibodies, transcription factors, or specific parts constituting them can be mentioned.
生理活性物質として核酸は、脳や中枢神経に関連する疾患の治療及び／又は予防のために用いられる核酸を挙げることができる。これに限定されないが、例えば、遺伝子ノックダウン法による又はＲＮＡ干渉を用いた各種疾患の治療のための核酸、例えば、アンチセンス核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、ヘテロ２本鎖核酸、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどを挙げることができる。具体的には、これに限定されないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）やパーキンソン病に対する遺伝子治療のためのものなどを挙げることができる。 Nucleic acids as physiologically active substances include nucleic acids used for the treatment and / or prevention of diseases related to the brain and central nervous system. Nucleic acids for the treatment of various diseases, such as, but not limited to, by gene knockdown method or using RNA interference, such as antisense nucleic acids (DNA and RNA), heteroduplex nucleic acids, siRNA and shRNA, etc. Can be mentioned. Specific examples thereof include, but are not limited to, those for gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson's disease.
また、上記生理活性物質等を有効成分とする公知の薬物であってよく、これに限定されないが、例えば、抗癌剤、抗パーキンソン病薬、抗痴呆薬、向精神薬などを挙げることができる。 Further, it may be a known drug containing the above-mentioned physiologically active substance or the like as an active ingredient, and examples thereof include, but are not limited to, an anticancer drug, an antiparkinson's disease drug, an antidementia drug, and a psychotropic drug.
脳内機能物質としては、これに限定されないが、例えば、脳内においてマーカーとなるような分子、脳又は脳内の標的をイメージングするために用いることができる分子などを挙げることができる。脳内イメージング分子としては特に制限はないが、蛍光色素、量子ドット、ナノ磁性体、ナノゴールド、細胞内分子可視化試薬、ＰＥＴで検出できる標識分子、等の生体内で標的を可視化できる化合物などを例示することができる。 Examples of the functional substance in the brain include, but are not limited to, a molecule that serves as a marker in the brain, a molecule that can be used for imaging the brain or a target in the brain, and the like. The imaging molecule in the brain is not particularly limited, but compounds capable of visualizing the target in vivo, such as fluorescent dyes, quantum dots, nanomagnetic substances, nanogolds, intracellular molecular visualization reagents, and labeled molecules that can be detected by PET, are used. It can be exemplified.
本発明において限定されない任意の態様においては、上記した還元末端を有する糖修飾シクロデキストリンを含む薬物キャリア剤は、任意の薬物との組み合わせにより、医薬組成物と成してもよい。その場合、公知の方法を用いて、任意の薬物を、上記した還元末端を有する糖修飾シクロデキストリンとの包接複合体を形成させる等して、それらを１剤として含む医薬組成物を提供することができる。あるいは、使用時に混合して用いるような別剤の形態として含む医薬組成物と成してもよい。 In any aspect not limited in the present invention, the drug carrier agent containing the above-mentioned sugar-modified cyclodextrin having a reducing end may be combined with any drug to form a pharmaceutical composition. In that case, a known method is used to provide a pharmaceutical composition containing any drug as one agent by forming an inclusion complex with the above-mentioned sugar-modified cyclodextrin having a reducing end. be able to. Alternatively, it may be a pharmaceutical composition contained in the form of a separate agent that is mixed and used at the time of use.
本発明により提供される薬物キャリア剤、又はこれを用いる医薬組成物においては、脳内への移行を目的とする薬物に応じて、また、移行目的、例えば、移行速度や移行量等の各種条件に応じて、シクロデキストリンの種類、還元末端を有する糖による置換度、薬物に対する配合量等を適宜選択して用いることができる。また、公知の方法に従って製剤化し、例えば、液剤等の適当な剤型の法上許容される医薬品として、ヒトを含む哺乳動物に対して非経口的または経口的に投与することができる。非経口的投与方法としては、例えば、注射剤又は貼付剤（経皮投与）が例示できる。本発明により提供される薬物キャリア剤、又はこれを用いる医薬組成物は、好ましくは非経口的に投与される。 In the drug carrier agent provided by the present invention, or a pharmaceutical composition using the same, various conditions such as a transfer purpose, for example, a transfer rate and a transfer amount, depending on the drug intended for transfer into the brain. Depending on the above, the type of cyclodextrin, the degree of substitution with a sugar having a reducing end, the amount to be blended with a drug, and the like can be appropriately selected and used. In addition, it can be formulated according to a known method and administered parenterally or orally to mammals including humans as a legally acceptable drug of an appropriate dosage form such as a liquid preparation. Examples of the parenteral administration method include injections and patches (transdermal administration). The drug carrier agent provided by the present invention, or a pharmaceutical composition using the same, is preferably administered parenterally.
本発明により提供さる薬物キャリア剤、又はこれを用いる医薬組成物には、その効果を損なわない範囲で任意の成分を適宜配合できる。任意成分としては、これに限定されないが、例えば、架橋剤、溶解剤、乳化剤、保湿剤、清涼化剤、無機粉体、酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香味剤、ｐＨ調整剤、安定化剤などを挙げることができる。 Any component can be appropriately blended in the drug carrier agent provided by the present invention or the pharmaceutical composition using the drug carrier agent as long as the effect is not impaired. Optional ingredients include, but are not limited to, cross-linking agents, solubilizers, emulsifiers, moisturizers, refreshing agents, inorganic powders, antioxidants, preservatives, colorants, flavoring agents, pH adjusters, stables. Agents and the like can be mentioned.
本発明により提供さる薬物キャリア、又はこれを用いる医薬組成物は、例えば、脳神経系疾患又は障害を予防又は治療するための医薬品として好適に用いられ得る。脳神経系疾患又は障害は、これに限定されないが、例えば、アルツハイマー病、悪性脳腫瘍、パーキンソン病、ニーマン・ピック病Ｃ型、脳卒中、脳血、認知症、筋ジストロフィー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、重症筋無力症、脊髄性筋萎縮症、ダウン症候群、ハンチントン病、統合失調症，うつ症，タウパチー病、ピック病、ページェット病、脳障害を伴うリソソーム病、癌、プリオン病、外傷性脳損傷、ウィルス性及び細菌性の中枢神経系疾患などを挙げることができる。 The drug carrier provided by the present invention, or a pharmaceutical composition using the same, can be suitably used as, for example, a pharmaceutical product for preventing or treating a cranial nerve system disease or disorder. Neurological disorders or disorders are not limited to, for example, Alzheimer's disease, malignant brain tumor, Parkinson's disease, Niemann-Pick's disease type C, stroke, cerebral blood, dementia, muscular dystrophy, multiple sclerosis, muscle atrophic side Cord sclerosis, cystic fibrosis, Angelman syndrome, Riddle syndrome, severe myasthenia, spinal muscle atrophy, Down syndrome, Huntington's disease, schizophrenia, depression, Taupati's disease, Pick's disease, Paget's disease, Examples include lithosome disease with brain damage, cancer, prion disease, traumatic brain damage, viral and bacterial central nervous system diseases.
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples do not limit the scope of the present invention.
＜調製例１＞ 還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤの調製
〔１．モノ−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−ＣＤの調製〕
β−ＣＤ（セルデックスＢ−１００、日本食品化工）３０ｇを１Ｍ ＮａＯＨ水溶液５００ｍＬに溶解させ、氷上にて冷却した。上記溶液にｐ−トルエンスルホニルクロリド１５ｇを添加し、氷上にて５時間反応させた。反応液中の沈殿物を除去した後、溶液をｐＨ７に調整し、生じた析出物を回収した。回収した析出物を沸騰水に溶解して冷却し、再結晶を行った後、減圧乾燥して白色粉末１３．６ｇを得た。ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲにより、上記白色粉末がモノ−６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−ＣＤであることを確認した。
<Preparation Example 1> Preparation of glucose-modified β-CD having a reducing end [1. Preparation of Mono-6-O-p-Toluenesulfonyl-β-CD]
30 g of β-CD (Celdex B-100, Nihon Shokuhin Kako) was dissolved in 500 mL of a 1 M NaOH aqueous solution and cooled on ice. 15 g of p-toluenesulfonyl chloride was added to the above solution, and the mixture was reacted on ice for 5 hours. After removing the precipitate in the reaction solution, the solution was adjusted to pH 7, and the resulting precipitate was recovered. The recovered precipitate was dissolved in boiling water, cooled, recrystallized, and dried under reduced pressure to obtain 13.6 g of white powder. It was confirmed by FT-IR and NMR that the white powder was mono-6-Op-toluenesulfonyl-β-CD.
〔２．モノ−６−アミノ−β−ＣＤの調製〕
上記に調製したトシル化β−ＣＤ１０ｇに２８％アンモニア水溶液１２０ｍＬを添加して５０℃にて１７時間反応させた。反応液をエバポレーターにて濃縮した後、濃縮溶液の１０倍量のアセトンを添加し、生じた沈澱を回収した。沈澱をアセトンで洗浄後、減圧乾燥して白色粉末１０ｇを得た。ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲにより、上記白色粉末がモノ−６−アミノ−β−ＣＤであることを確認した。
[2. Preparation of mono-6-amino-β-CD]
To 10 g of the tosylated β-CD prepared above, 120 mL of a 28% aqueous ammonia solution was added and reacted at 50 ° C. for 17 hours. After concentrating the reaction solution with an evaporator, 10 times the amount of acetone as the concentrated solution was added, and the resulting precipitate was recovered. The precipitate was washed with acetone and then dried under reduced pressure to obtain 10 g of a white powder. It was confirmed by FT-IR and NMR that the white powder was mono-6-amino-β-CD.
〔３．還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤの調製〕
上記に調製したモノ−６−アミノ−β−ＣＤ３００ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５ｍＬに溶解し、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート１１７０ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物４０５ｍｇ及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１３８５μＬを添加した。上記溶液にグルクロン酸を１７１ｍｇ溶解したＤＭＦ溶液１０ｍＬを添加し、Ａｒガスにより封入して常温にて３時間反応させた。反応液の１０倍量のアセトン添加し、生じた沈澱を回収した。沈澱をアセトン及びメタノールで洗浄し、減圧乾燥して白色粉末を得た。更に、ＯＤＳカラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィーにて精製後、凍結乾燥して白色粉末１６６ｍｇを得た。ＮＭＲにより、上記白色粉末が、図１に示す還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤであることを確認した。
[3. Preparation of Glucose-Modified β-CD with Reducing End]
300 mg of mono-6-amino-β-CD prepared above was dissolved in 25 mL of dimethylformamide (DMF), 1H-benzotriazole-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate 1170 mg, 1-hydroxybenzotriazole. 405 mg of hydrate and 1385 μL of N, N-diisopropylethylamine were added. 10 mL of a DMF solution in which 171 mg of glucuronic acid was dissolved was added to the above solution, and the mixture was sealed with Ar gas and reacted at room temperature for 3 hours. Acetone was added in an amount 10 times that of the reaction solution, and the resulting precipitate was recovered. The precipitate was washed with acetone and methanol and dried under reduced pressure to obtain a white powder. Further, it was purified by high performance liquid chromatography for preparative use using an ODS column and then freeze-dried to obtain 166 mg of white powder. By NMR, it was confirmed that the white powder was a glucose-modified β-CD having a reducing end shown in FIG.
＜調製例２＞ 還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤの調製
β−ＣＤ１００質量に対して、グルコース１００質量及び活性炭３質量を均質になるまで混合してステンレスバットに入れ、熱風乾燥機にて１８０℃で１時間加熱した。得られた加熱反応物を超純水に溶解してフィルターろ過により活性炭を除去した溶液を、活性炭及びセライトを混合して作製した活性炭カラムに供し、超純水及び１０％エタノール水溶液を通液することで不純物を溶出させた。続いて、２５％エタノール水溶液を通液することで、グルコース修飾β−ＣＤ粗精製画分を得た。グルコース修飾β−ＣＤ粗精製画分をＯＤＳカラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィーに複数回供することで、残存する不純物及びβ−ＣＤを除去し、グルコース修飾β−ＣＤとして以降の試験に用いた。１Ｈ−ＮＭＲ解析結果より、グルコース修飾β−ＣＤ（グルコース置換度が３．３）であることを確認した。調製されたグルコース修飾β−ＣＤの代表的な構造を図２に示す。
<Preparation Example 2> Preparation of glucose-modified β-CD having no reducing
［試験例１］還元末端の有無の確認
β−ＣＤ、調製例１にて調製した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤ、及び調製例２にて調製した還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤについて、還元末端の有無を確認した。還元末端の有無は、常法であるＰａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法（中村ら、「生物化学実験法１９ 澱粉・関連糖質実験法」、１９８６年、ｐ．４２）に供することで確認した。
[Test Example 1] Confirmation of presence / absence of reducing end β-CD, glucose-modified β-CD having a reducing end prepared in Preparation Example 1, and glucose-modified β having no reducing end prepared in Preparation Example 2. -For CD, the presence or absence of a reducing terminal was confirmed. The presence or absence of the reducing end was confirmed by subjecting it to the conventional Park-Johnson method (Nakamura et al., "Biochemical Experimental Method 19 Starch / Related Sugar Experimental Method", 1986, p. 42).
その結果、調製例１にて調製した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤのみが還元性を有していた。また、このときのグルコース当量は１１．４であり、理論値である１２．４に近い値であった。 As a result, only the glucose-modified β-CD having the reducing end prepared in Preparation Example 1 had reducing property. The glucose equivalent at this time was 11.4, which was close to the theoretical value of 12.4.
［試験例２］糖修飾β−ＣＤ／蛍蛍光物質複合体の細胞内取り込み
ヒト脳血管内皮細胞（ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞）への取り込みを、各種糖修飾β−ＣＤ及び蛍光物質であるテトラフェニルポルフィンテトラスルホン酸（ＴＰＰＳ）の複合体を用いることで確認した。また、対照として、β−ＣＤとの複合体を用いて確認した。
[Test Example 2] Intracellular uptake of sugar-modified β-CD / firefly fluorescent substance complex Incorporation into human cerebral vascular endothelial cells (hCMEC / D3 cells) is performed by various sugar-modified β-CDs and tetraphenylporphyrin, which is a fluorescent substance. It was confirmed by using a complex of tetrasulfonic acid (TPPS). Moreover, as a control, it was confirmed using a complex with β-CD.
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ガラス底面培養容器１枚あたり１×１０４細胞となるよう播種し、ＥＢＭ−２培地中で３７℃にて２４時間インキュベートした。β−ＣＤ、調製例１にて調製した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤ又は調製例２にて調製した還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤ（１２５μＭ）、及びＴＰＰＳ（１０μＭ）の複合体溶液２００μＬを添加し、３７℃にて３時間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド１５０μＬで１０分間処理して固定化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色溶液２００μＬを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点顕微鏡にて蛍光を観察した。蛍光強度は、ＢＺ−ＩＩ解析アプリケーション（ＫＥＹＥＮＣＥ）により算出した。 hCMEC / D3 cells were seeded to 1 × 10 4 cells per glass bottom culture vessel and incubated in EBM-2 medium at 37 ° C. for 24 hours. β-CD, glucose-modified β-CD having a reducing end prepared in Preparation Example 1, or glucose-modified β-CD (125 μM) having no reducing end prepared in Preparation Example 2, and TPPS (10 μM). 200 μL of the complex solution was added and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After washing 3 times with phosphate buffered saline (PBS), it was fixed by treating with 150 μL of 4% paraformaldehyde for 10 minutes. After washing 3 times with PBS, 200 μL of Hoechst stain solution was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing with PBS three times, fluorescence was observed with a confocal microscope. Fluorescence intensity was calculated by the BZ-II analysis application (KEYENCE).
図３には、各例について、共焦点顕微鏡により撮像した画像の一例を示す。 FIG. 3 shows an example of an image captured by a confocal microscope for each example.
図４には、相対蛍光強度の結果を示す。解析結果は平均値±標準誤差で表し、標準誤差は４〜５回の実験を繰り返すことで求めた。図中の「＊」又は「†」は、それぞれ未修飾のβ−ＣＤ又は調製例２にて調製した還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤを添加した場合の蛍光強度に対して有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。 FIG. 4 shows the results of the relative fluorescence intensity. The analysis result was expressed by the average value ± standard error, and the standard error was obtained by repeating the experiment 4 to 5 times. “*” Or “†” in the figure are significant with respect to the fluorescence intensity when unmodified β-CD or glucose-modified β-CD having no reducing end prepared in Preparation Example 2 is added, respectively. Indicates that there is a difference (p <0.05).
その結果、図３、４に示されるように、還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤ／ＴＰＰＳ複合体は、未修飾のβ−ＣＤとの複合体及び還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤとの複合体に比べ、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への取り込み量が有意に増加した。
還元末端を有していないグルコース修飾β−ＣＤに関しては、ＧＬＵＴ１のリガンド認識に必要な修飾グルコースの１位炭素に結合する水酸基がシクロデキストリンのグルコース残基とグリコシド結合を形成しているため、ＧＬＵＴ１にリガンドとして認識されずｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への取り込み量が増加しなかったものと推察される。
As a result, as shown in FIGS. 3 and 4, the glucose-modified β-CD / TPPS complex having a reducing end is a complex with unmodified β-CD and a glucose-modified β- having no reducing end. The amount of uptake into hCMEC / D3 cells was significantly increased as compared with the complex with CD.
For glucose-modified β-CD that does not have a reducing end, the hydroxyl group that binds to the 1-position carbon of the modified glucose required for ligand recognition of GLUT1 forms a glycosidic bond with the glucose residue of cyclodextrin, so GLUT1 It is presumed that the amount of uptake into hCMEC / D3 cells did not increase because it was not recognized as a ligand.
［試験例３］蛍光ラベル化した糖修飾β−ＣＤの細胞内取り込み及び糖の存在の影響
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への取り込みを、５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ）により蛍光ラベル化した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤを用いることで確認した。
[Test Example 3] Intracellular uptake of fluorescently labeled sugar-modified β-CD and the effect of the presence of sugar The uptake into hCMEC / D3 cells was controlled by 5- (4,6-dichlorotriazinyl) aminofluorescein (5-). It was confirmed by using glucose-modified β-CD having a reducing end fluorescently labeled with DTAF).
調製例１にて調製した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤ及び５−ＤＴＡＦを炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、室温にて２４時間インキュベートした後、アセトンで３回洗浄することにより、還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤを蛍光ラベル化した。 Glucose-modified β-CD and 5-DTAF having a reducing end prepared in Preparation Example 1 are dissolved in sodium hydrogen carbonate buffer (pH 9.0), incubated at room temperature for 24 hours, and then washed 3 times with acetone. Thereby, glucose-modified β-CD having a reducing end was fluorescently labeled.
ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を、ガラス底面培養容器１枚あたり１×１０４細胞となるよう播種し、ＥＢＭ−２培地中で３７℃にて２４時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光ラベル化した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤ（１０μＭ）及びグルコース（０−４０ｍＭ）の混合溶液１５０μＬを添加し、３７℃にて３時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド１５０μＬで１０分間処理して固定化した。ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色溶液２００μＬを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点顕微鏡にて蛍光を観察した。蛍光強度は、ＢＺ−ＩＩ解析アプリケーション（ＫＥＹＥＮＣＥ）により算出した。 hCMEC / D3 cells were seeded to 1 × 10 4 cells per glass bottom culture vessel and incubated in EBM-2 medium at 37 ° C. for 24 hours. After washing 3 times with PBS, 150 μL of a mixed solution of glucose-modified β-CD (10 μM) having a fluorescently labeled reducing end and glucose (0-40 mM) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 3 hours. After washing 3 times with PBS, it was fixed by treating with 150 μL of 4% paraformaldehyde for 10 minutes. After washing 3 times with PBS, 200 μL of Hoechst stain solution was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing with PBS three times, fluorescence was observed with a confocal microscope. Fluorescence intensity was calculated by the BZ-II analysis application (KEYENCE).
図５には、各例について、共焦点顕微鏡により撮像した画像の一例を示す。 FIG. 5 shows an example of an image captured by a confocal microscope for each example.
図６には、相対蛍光強度の結果を示す。解析結果は平均値±標準誤差で表し、標準誤差は３回の実験を繰り返すことで求めた。図中の「＊」はグルコース添加しない場合の蛍光強度に対して有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。 FIG. 6 shows the result of the relative fluorescence intensity. The analysis result was expressed as the average value ± standard error, and the standard error was obtained by repeating the experiment three times. “*” In the figure indicates that there is a significant difference (p <0.05) with respect to the fluorescence intensity when glucose is not added.
その結果、図５、６に示されるように、蛍光ラベル化した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤが、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞へ取り込まれることが確認された。また、競合して存在するグルコース量が多くなるにつれて蛍光ラベル化した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤの取り込み量が減少した。よって、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞への取り込みが、還元末端を有するグルコース残基に依存的な機構によりが起こることが明らかとなった。 As a result, as shown in FIGS. 5 and 6, it was confirmed that glucose-modified β-CD having a fluorescently labeled reducing end was taken up by hCMEC / D3 cells. In addition, the amount of glucose-modified β-CD having a fluorescently labeled reducing end decreased as the amount of glucose present in competition increased. Therefore, it was clarified that the uptake into hCMEC / D3 cells is caused by a glucose residue-dependent mechanism having a reducing end.
なお、グルコースの替わりにラクトースを添加して同様の試験を行ったところ、蛍光ラベル化した還元末端を有するグルコース修飾β−ＣＤの取り込み量に変化は見られなかった。 When a similar test was carried out by adding lactose instead of glucose, no change was observed in the amount of glucose-modified β-CD having a fluorescently labeled reducing end.
Claims (10)
−ＮＨ−Ｚ ・・・（ａ）
［式中、Ｚは、ウロン酸又はウロン酸を含むオリゴ糖のカルボキシル基がアミノ基と縮合して形成される、還元性基を有する単糖又はオリゴ糖の残基を示す。］ A drug carrier agent containing a cyclodextrin derivative represented by the following general formula (1).
−NH-Z ・ ・ ・ (a)
[In the formula, Z represents a residue of a monosaccharide or oligosaccharide having a reducing group formed by condensing the carboxyl group of uronic acid or an oligosaccharide containing uronic acid with an amino group. ]
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