JP2021061402A - Magnetic particles and separation and purification method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は磁性粒子及び磁性粒子を用いた分離精製方法に関する。 The present invention relates to magnetic particles and a separation and purification method using magnetic particles.
従来、ライフサイエンスの研究分野及び臨床遺伝子検査分野で用いられてきた核酸抽出方法として、核酸を含む溶液へ、シリカメンブレンフィルタやシリカ粒子と高濃度のカオトロピック塩とを加えて、固相担体（シリカ粒子等）の表面に、核酸を吸着させる方法が利用されている（非特許文献１参照）。
また、遠心、ろ過が不要な吸着方法として、核酸を含む溶液へ、カルボキシ基を修飾したシリカ粒子と高濃度の塩とポリエチレングリコールを加えて、シリカ粒子表面へ核酸を吸着させる原理を用いて、簡単に核酸を分離精製できる方法が知られている（非特許文献２参照）。
しかし、これらの方法は核酸吸着工程において、カオトロピック塩や高濃度の塩を使用するため、コンタミネーションにより核酸精製後に遺伝子増幅やＤＮＡの酵素切断などの操作をした際に悪影響を及ぼすことが問題となっている。
カオトロピック塩や高濃度の塩を使用しない方法として、表面にアミノシランを有する固相担体に静電的な結合により核酸を吸着させた後、リン酸化合物溶液と反応させることにより、核酸を溶媒中に再溶解させる方法（特許文献１）が知られているが、アミノ基の正電荷にアニオン性蛋白などの夾雑物が非特異吸着することで核酸精製後に核酸の精製度が不十分となる場合がある。また、十分に核酸を再溶解させるためにはリン酸化合物を大量に加える必要があり、リン酸の濃度が一定以上になると遺伝子増幅を阻害してしまう問題があった。
As a nucleic acid extraction method conventionally used in the research field of life science and the clinical genetic testing field, a solid phase carrier (silica) is added to a solution containing nucleic acid by adding a silica membrane filter or silica particles and a high-concentration chaotropic salt. A method of adsorbing nucleic acid on the surface of particles, etc.) is used (see Non-Patent Document 1).
In addition, as an adsorption method that does not require centrifugation or filtration, the principle of adding carboxy group-modified silica particles, high-concentration salt, and polyethylene glycol to a solution containing nucleic acid to adsorb the nucleic acid on the surface of the silica particles is used. A method for easily separating and purifying nucleic acid is known (see Non-Patent Document 2).
However, since these methods use chaotropic salts or high-concentration salts in the nucleic acid adsorption step, there is a problem that they have an adverse effect when operations such as gene amplification and DNA enzymatic cleavage are performed after nucleic acid purification by contamination. It has become.
As a method that does not use chaotropic salts or high-concentration salts, the nucleic acid is adsorbed on a solid phase carrier having aminosilane on the surface by electrostatic binding, and then reacted with a phosphate compound solution to bring the nucleic acid into a solvent. A method for redissolving (Patent Document 1) is known, but the degree of purification of nucleic acid may be insufficient after nucleic acid purification due to non-specific adsorption of impurities such as anionic proteins on the positive charge of the amino group. is there. Further, in order to sufficiently redissolve the nucleic acid, it is necessary to add a large amount of a phosphoric acid compound, and there is a problem that gene amplification is inhibited when the concentration of phosphoric acid exceeds a certain level.
本発明が解決しようとする課題は、生物由来の試料等から、簡便に純度の高い核酸を分離精製することができる磁性粒子を提供することにある。 An object to be solved by the present invention is to provide magnetic particles capable of easily separating and purifying highly pure nucleic acids from biological samples and the like.
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性粒子（Ｂ）を含有し、かつ、化学式（１）で表される１価の基を有する磁性粒子（Ｃ）；核酸を含む試料と前記磁性粒子（Ｃ）とを接触させ、複合体（Ｆ）を形成する複合体形成工程と、
磁力で前記複合体（Ｆ）を前記試料から分離する複合体分離工程と、
前記複合体（Ｆ）から核酸を解離させる解離工程とを含む核酸の分離精製方法である。
A complex separation step of separating the complex (F) from the sample by magnetic force,
A method for separating and purifying nucleic acid, which comprises a dissociation step of dissociating nucleic acid from the complex (F).
本発明の磁性粒子を用いることで、生物由来の試料等から、簡便に純度の高い核酸を分離精製することができる。 By using the magnetic particles of the present invention, highly pure nucleic acids can be easily separated and purified from biological samples and the like.
本発明の磁性粒子（Ｃ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性粒子（Ｂ）を含有し、かつ、下記の化学式（１）で表される１価の基を有する磁性粒子である。 The magnetic particles (C) of the present invention contain magnetic particles (B) containing magnetic metal oxide particles (A) and have a monovalent group represented by the following chemical formula (1). Is.
本発明の磁性粒子（Ｃ）は、後に詳述する本発明の分離精製方法［試料（Ｅ）中の核酸を分離する物質の分離精製方法］の使用に特に適している。
本発明における核酸としては、天然核酸からなるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）並びにその修飾物（標識色素を結合させたもの等）、並びに、ペプチド核酸、非天然ヌクレオシド含有核酸等が挙げられる。
ここで、本発明における試料（Ｅ）としては、生物由来の試料［生体体液（血清、血液、リンパ液、腹水及び尿等）、各種細胞類及び培養液等］を始め、前記の核酸を含有する混合物等が挙げられる。
The magnetic particles (C) of the present invention are particularly suitable for use in the separation and purification method of the present invention [method of separating and purifying a substance that separates nucleic acids in sample (E)], which will be described in detail later.
Examples of the nucleic acid in the present invention include oligonucleotides and polynucleotides (DNA, RNA, etc.) and modifications thereof (such as those to which a labeling dye is bound) composed of natural nucleic acids, peptide nucleic acids, unnatural nucleoside-containing nucleic acids, and the like. Be done.
Here, the sample (E) in the present invention contains the above-mentioned nucleic acid, including a biological sample [living body fluid (plasma, blood, lymph, ascites, urine, etc.), various cells, a culture solution, etc.]. Examples include a mixture.
本発明における磁性粒子（Ｂ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する磁性粒子である。
また、本発明における磁性粒子（Ｂ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有するシリカ粒子（Ｂ１）［磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカのマトリックス中に分散された球体であるシリカ粒子であることが好ましい］であることが好ましい。
The magnetic particles (B) in the present invention are magnetic particles containing magnetic metal oxide particles (A).
Further, the magnetic particles (B) in the present invention are silica particles (B1) containing the magnetic metal oxide particles (A) [silica which is a sphere in which the magnetic metal oxide particles (A) are dispersed in a silica matrix. It is preferably particles].
本発明における磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、フェリ磁性、強磁性、又は超常磁性であってよい。上記の中でも、磁気分離後に残留磁化が残らず迅速に再分散させることが可能な超常磁性が好ましい。ここで超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。 The magnetic metal oxide particles (A) in the present invention may be ferrimagnetism, ferromagnetism, or superparamagnetism. Among the above, superparamagnetism, which can be rapidly redispersed without leaving residual magnetization after magnetic separation, is preferable. Here, supermagnetism refers to a temporary magnetic field in which individual atomic magnetic moments of a substance are aligned and induced in the presence of an external magnetic field, and when the external magnetic field is removed, partial alignment is impaired and the magnetic field is not shown. Say that.
前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ）としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。 Examples of the magnetic metal oxide particles (A) include oxides such as iron, cobalt, nickel and alloys thereof, and iron oxide is particularly preferable because it has excellent sensitivity to a magnetic field. As the magnetic metal oxide particles (A), one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
磁性金属酸化物粒子（Ａ）に用いられる酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。 As the iron oxide used for the magnetic metal oxide particles (A), various known iron oxides can be used. Among iron oxides, magnetite, γ-hematite, magnetite-α-hematite intermediate iron oxide and γ-hematite-α-hematite intermediate iron oxide are preferable because of their excellent chemical stability, and they have a large saturation magnetization. Magnetite is more preferable because it has excellent sensitivity to an external magnetic field.
前記の磁性粒子（Ｂ）が含有する磁性金属酸化物粒子（Ａ）は、体積平均粒子径が１〜５０ｎｍであることが好ましく、更に好ましくは１〜３０ｎｍであり、特に好ましくは１〜２０ｎｍである。
前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径が１ｎｍ以上であれば、合成が容易である。
また、体積平均粒子径が５０ｎｍ以下であれば、特に前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有するシリカ粒子の場合はシリカのマトリックスに均一に分散させることが容易であり、また、不純物（試料中の核酸以外の成分）の回収量を低減できる傾向がある。
The magnetic metal oxide particles (A) contained in the magnetic particles (B) preferably have a volume average particle diameter of 1 to 50 nm, more preferably 1 to 30 nm, and particularly preferably 1 to 20 nm. is there.
When the volume average particle diameter of the magnetic metal oxide particles (A) is 1 nm or more, synthesis is easy.
Further, when the volume average particle diameter is 50 nm or less, particularly in the case of the silica particles containing the magnetic metal oxide particles (A), it is easy to uniformly disperse them in the silica matrix, and impurities ( There is a tendency to reduce the amount of recovered particles (components other than nucleic acids) in the sample.
本発明における磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径は、任意の２００個の磁性金属酸化物粒子（Ａ）について走査型電子顕微鏡（例えば、日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の体積平均値である。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径は、後述の磁性金属酸化物粒子（Ａ）作製時の金属イオン濃度を調節することにより制御することができる。また、分級等の方法によっても磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径を所望の値にすることができる。
The volume average particle diameter of the magnetic metal oxide particles (A) in the present invention is a scanning electron microscope (for example, "JSM-7000F" manufactured by Nippon Denshi Co., Ltd.) for any 200 magnetic metal oxide particles (A). It is the volume average value of the particle diameter measured by observing in.
The volume average particle diameter of the magnetic metal oxide particles (A) can be controlled by adjusting the metal ion concentration at the time of producing the magnetic metal oxide particles (A) described later. Further, the volume average particle diameter of the magnetic metal oxide particles (A) can be set to a desired value by a method such as classification.
本発明における磁性粒子（Ｂ）の重量に基づく磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合の下限は、好ましくは６０重量％、更に好ましくは６５重量％であり、上限は好ましくは９５重量％、更に好ましくは９０重量％である。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が６０重量％以上の場合、得られた磁性粒子（Ｃ）の磁性が十分であり、実際の用途面における分離操作に時間を短縮できる。また、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合が９５重量％以下の場合、その合成が容易である。
The lower limit of the weight ratio of the magnetic metal oxide particles (A) based on the weight of the magnetic particles (B) in the present invention is preferably 60% by weight, more preferably 65% by weight, and the upper limit is preferably 95% by weight. More preferably, it is 90% by weight.
When the weight ratio of the magnetic metal oxide particles (A) is 60% by weight or more, the magnetism of the obtained magnetic particles (C) is sufficient, and the time required for the separation operation in the actual application can be shortened. Further, when the weight ratio of the magnetic metal oxide particles (A) is 95% by weight or less, the synthesis thereof is easy.
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）、及び、水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法等により合成することができる。 The method for producing the magnetic metal oxide particles (A) is not particularly limited, but is a co-precipitation method using a water-soluble iron salt and ammonia based on the method reported by Massart (R. Massart, IEEE Trans. Magn. 1981. It can be synthesized by a method using 17,1247) and an oxidation reaction in an aqueous solution of a water-soluble iron salt.
次に、本発明における磁性粒子（Ｂ）の内、前記のシリカ粒子（Ｂ１）の製造方法について説明する。
本発明における磁性粒子（Ｂ１）の製造方法は、少なくとも以下の工程を経る製造方法により製造できる。
（工程）磁性金属酸化物粒子（Ａ）を含有する（アルキル）アルコキシシランの水中油型エマルションを作製して、（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応を行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカに包含されたシリカ粒子を製造する工程。
以下、上記の工程について説明する。
Next, among the magnetic particles (B) in the present invention, the method for producing the silica particles (B1) will be described.
The method for producing magnetic particles (B1) in the present invention can be produced by a production method that goes through at least the following steps.
(Step) An oil-in-water emulsion of (alkyl) alkoxysilane containing magnetic metal oxide particles (A) is prepared, and a hydrolysis polycondensation reaction of (alkyl) alkoxysilane is carried out to produce magnetic metal oxide particles (A). ) Is a step of producing silica particles contained in silica.
Hereinafter, the above steps will be described.
本発明におけるシリカ粒子（Ｂ１）の製造方法としては、磁性金属酸化物粒子（Ａ）及び前記磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に基づいて３０〜１０００重量％の（アルキル）アルコキシシランを含有する分散液（Ｄ１）（以下、単に「分散液（Ｄ１）」とも記載する）と、水、非イオン性界面活性剤及び（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒を含有する溶液（Ｄ２）（以下、単に「溶液（Ｄ２）」とも記載する）とを混合して、水中油型エマルションを作製し、（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応を行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ）がシリカに包含された粒子を製造する方法等が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応後、遠心分離及び磁石等を用いて固液分離することによりシリカ粒子（Ｂ１）が得られる。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン及び／又はアルコキシシランを意味する。
The method for producing silica particles (B1) in the present invention contains 30 to 1000% by weight of (alkyl) alkoxysilane based on the weight of the magnetic metal oxide particles (A) and the magnetic metal oxide particles (A). A solution (D2) containing a dispersion (D1) (hereinafter, also simply referred to as "dispersion (D1)") and a catalyst for hydrolysis of water, a nonionic surfactant, and (alkyl) alkoxysilane. Hereinafter, it is also simply referred to as “solution (D2)”) to prepare an oil-in-water emulsion, and a hydrolysis polycondensation reaction of (alkyl) alkoxysilane is carried out to obtain magnetic metal oxide particles (A). Examples thereof include a method for producing particles contained in silica.
After the hydrolysis polycondensation reaction of (alkyl) alkoxysilane, silica particles (B1) are obtained by centrifugation and solid-liquid separation using a magnet or the like.
In the above and below, the (alkyl) alkoxysilane means an alkylalkoxysilane and / or an alkoxysilane.
使用する（アルキル）アルコキシシランとしては、下記一般式（α）で表される化合物が挙げられる。
Ｒ１ （４−ｐ）Ｓｉ（ＯＲ２）ｐ （α）
一般式（α）中、Ｒ１及びＲ２は、炭素数１〜１０の１価の炭化水素基を表す。また、当該炭化水素基の水素の一部は、アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されていてもよい。
Examples of the (alkyl) alkoxysilane used include compounds represented by the following general formula (α).
R 1 (4-p) Si (OR 2 ) p (α)
In the general formula (α), R 1 and R 2 represent monovalent hydrocarbon groups having 1 to 10 carbon atoms. Further, a part of hydrogen of the hydrocarbon group may be substituted with an amino group, a carboxy group, a hydroxyl group, a mercapto group or a glycidyloxy group.
炭素数１〜１０の１価の炭化水素基としては、炭素数１〜１０の脂肪族炭化水素基（メチル基、エチル基、ｎ−又はｉｓｏ−プロピル基、ｎ−又はｉｓｏ−ブチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ペンチル基及びビニル基等）、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素基（フェニル基等）及び炭素数７〜１０の芳香脂肪族基（ベンジル基等）等が挙げられる。 Examples of the monovalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms include an aliphatic hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms (methyl group, ethyl group, n- or iso-propyl group, n- or iso-butyl group, n). -Or iso-pentyl group, vinyl group, etc.), aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms (phenyl group, etc.), aromatic aliphatic group having 7 to 10 carbon atoms (benzyl group, etc.) and the like.
一般式（α）におけるｐは１〜４の整数を表す。但し、ｐが１のアルキルアルコキシシランを用いる場合は、ｐが２〜４の（アルキル）アルコキシシランと併用する必要がある。反応後の粒子の強度及び粒子表面のシラノール基の量の観点からｐは４であることが好ましい。 P in the general formula (α) represents an integer of 1 to 4. However, when an alkylalkoxysilane having a p of 1 is used, it is necessary to use it in combination with an (alkyl) alkoxysilane having a p of 2-4. From the viewpoint of the strength of the particles after the reaction and the amount of silanol groups on the surface of the particles, p is preferably 4.
一般式（α）で表される化合物の具体例としては、アルコキシシラン（テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン及びテトラブトキシシラン等）；
アルキルアルコキシシラン（メチルトリメトキシシラン及びメチルトリエトキシシラン等）；
アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン［３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン及びＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン等］；
カルボキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（７−カルボキシヘプチルトリエトキシシラン及び５−カルボキシペンチルトリエトキシシラン等）；
水酸基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−ヒドロキシプロピルトリメトキシシラン及び３−ヒドロキシプロピルトリエトキシシラン等）；
メルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン等）；
グリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン（３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン及び３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン等）等が挙げられる。
（アルキル）アルコキシシランは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
Specific examples of the compound represented by the general formula (α) include alkoxysilanes (tetramethoxysilane, tetraethoxysilane, tetraisopropoxysilane, tetrabutoxysilane, etc.);
Alkoxyalkoxysilanes (methyltrimethoxysilane, methyltriethoxysilane, etc.);
Alkoxyalkoxysilanes having an alkyl group substituted with an amino group [3-aminopropyltrimethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane and N-( 2-Aminoethyl) -3-aminopropyltriethoxysilane, etc.];
Alkoxyalkoxysilanes having an alkyl group substituted with a carboxy group (such as 7-carboxyheptiltriethoxysilane and 5-carboxypentyltriethoxysilane);
Alkoxyalkoxysilanes having an alkyl group substituted with a hydroxyl group (3-hydroxypropyltrimethoxysilane, 3-hydroxypropyltriethoxysilane, etc.);
Alkoxyalkoxysilanes having an alkyl group substituted with a mercapto group (3-mercaptopropyltrimethoxysilane, 3-mercaptopropyltriethoxysilane, etc.);
Examples thereof include alkylalkoxysilanes having an alkyl group substituted with a glycidyloxy group (3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane, 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane, etc.) and the like.
As the (alkyl) alkoxysilane, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
（アルキル）アルコキシシランの使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、３０〜１，０００重量％であることが好ましく、更に好ましくは４０〜５００重量％である。（アルキル）アルコキシシランの使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して３０重量％以上の場合、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の表面が均一に被覆されやすくなる。また、（アルキル）アルコキシシランの使用量が磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１０００重量％以下の場合、磁力による回収時間を短縮できる。 The amount of the (alkyl) alkoxysilane used is preferably 30 to 1,000% by weight, more preferably 40 to 500% by weight, based on the weight of the magnetic metal oxide particles (A). When the amount of the (alkyl) alkoxysilane used is 30% by weight or more based on the weight of the magnetic metal oxide particles (A), the surface of the magnetic metal oxide particles (A) is likely to be uniformly coated. Further, when the amount of the (alkyl) alkoxysilane used is 1000% by weight or less with respect to the weight of the magnetic metal oxide particles (A), the recovery time due to the magnetic force can be shortened.
水の使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して５００〜５０，０００重量％であることが好ましく、１，０００〜１０，０００重量％であることが更に好ましい。 The amount of water used is preferably 500 to 50,000% by weight, more preferably 1,000 to 10,000% by weight, based on the weight of the magnetic metal oxide particles (A).
更に、シリカ粒子の合成において、溶液（Ｄ２）等に水溶性有機溶媒等を含有させてもよい。
前記の水溶性有機溶媒としては、２５℃における水への溶解度が１００ｇ／水１００ｇ以上である、炭素数１〜４の１価のアルコール（メタノール、エタノール及びｎ−又はｉｓｏ−プロパノール等）、炭素数２〜９のグリコール（エチレングリコール及びジエチレングリコール等）、アミド（Ｎ−メチルピロリドン等）、ケトン（アセトン等）、環状エーテル（テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピラン等）、ラクトン（γ−ブチロラクトン等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）及びニトリル（アセトニトリル等）等が挙げられる。
これらの内、シリカ粒子（Ｂ１）の粒子径の均一性の観点から、炭素数１〜４の１価のアルコールが好ましい。水溶性有機溶媒は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
Further, in the synthesis of silica particles, the solution (D2) or the like may contain a water-soluble organic solvent or the like.
Examples of the water-soluble organic solvent include monohydric alcohols having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol and n- or iso-propanol, etc.) and carbon having a solubility in water at 25 ° C. of 100 g / 100 g or more of water. Nos. 2-9 glycols (ethylene glycol, diethylene glycol, etc.), amides (N-methylpyrrolidone, etc.), ketones (acetone, etc.), cyclic ethers (tetrahydropyrane, etc.), lactones (γ-butyrolactone, etc.), sulfoxides (dimethyl, etc.) (Sulfoxide, etc.) and nitrile (acetone, etc.) and the like can be mentioned.
Of these, monohydric alcohols having 1 to 4 carbon atoms are preferable from the viewpoint of the uniformity of the particle size of the silica particles (B1). As the water-soluble organic solvent, one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
水溶性有機溶媒を使用する場合、水溶性有機溶媒の使用量は、水の重量に対して、１００〜５００重量％であることが好ましい。 When a water-soluble organic solvent is used, the amount of the water-soluble organic solvent used is preferably 100 to 500% by weight based on the weight of water.
前記の非イオン性界面活性剤としては、
炭素数８〜２４の１価のアルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略記）付加物；
炭素数３〜３６の２〜８価のアルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＡＯ付加物；
炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノール（オクチルフェノール及びノニルフェノール等）のＡＯ付加物；
ポリプロピレングリコールのエチレンオキサイド付加物及びポリエチレングリコールのプロピレンオキサイド付加物；
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＡＯ付加物；
前記の炭素数３〜３６の２〜８価のアルコールの脂肪酸エステル及びそのＡＯ付加物［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等］；
アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、
ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）等が挙げられる。
これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
前記の非イオン性界面活性剤の説明におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイド等が挙げられ、その付加形式はブロック付加であってもランダム付加であってもよい。
また、ＡＯの付加モル数としては、アルコール、フェノール又は脂肪酸１モルあたり、１〜５０モルであることが好ましく、１〜２０モルであることが更に好ましい。
As the nonionic surfactant, the nonionic surfactant
An alkylene oxide (hereinafter, alkylene oxide is abbreviated as AO) adduct of a monohydric alcohol having 8 to 24 carbon atoms (decyl alcohol, dodecyl alcohol, coconut oil alkyl alcohol, octadecyl alcohol, oleyl alcohol, etc.);
AO adducts of 2-8 valent alcohols with 3 to 36 carbon atoms (glycerin, trimethylolpropane, pentaerythritol, sorbitol, sorbitol, etc.);
AO adduct of alkylphenols (octylphenol, nonylphenol, etc.) having an alkyl having 6 to 24 carbon atoms;
Ethylene oxide adduct of polypropylene glycol and propylene oxide adduct of polyethylene glycol;
AO adducts of fatty acids with 8 to 24 carbon atoms (decanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, coconut oil fatty acids, etc.);
Fatty acid esters of 2-8 valent alcohols having 3 to 36 carbon atoms and their AO adducts [TWEEN® 20 and TWEEN® 80, etc.];
Alkyl glucosides (N-octyl-β-D-maltoside, n-dodecanoylsucrose and n-octyl-β-D-glucopyranoside, etc.);
Examples thereof include fatty acid esters of sucrose, fatty acid alkanolamides, and AO adducts thereof (polyoxyethylene fatty acid alkanolamides, etc.).
These may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the AO in the above description of the nonionic surfactant include ethylene oxide, propylene oxide and butylene oxide, and the addition form thereof may be block addition or random addition.
The number of moles of AO added is preferably 1 to 50 mol, more preferably 1 to 20 mol, per 1 mol of alcohol, phenol or fatty acid.
これらの非イオン性界面活性剤の内、水への溶解度及び粘度の観点から、炭素数８〜２４の１価のアルコールのエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物（ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルケニルエーテル等）であることが好ましい。
また、これらの非イオン性界面活性剤の内、最終的に得られた磁性粒子（Ｃ）を用いて分離精製した際に、核酸の分離性を高める観点から好ましいのは、炭素数８〜２４のアルケニル基を有する１価のアルコール（オレイルアルコール等）のエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物である。
なお、「分離性を高める」とは、試料（Ｅ）から磁性粒子（Ｃ）を用いて抽出した成分中の核酸の純度（割合）が高くなることを意味する。
Among these nonionic surfactants, from the viewpoint of solubility in water and viscosity, 1 to 50 mol (preferably 1 to 20 mol) of ethylene oxide adduct (poly) of a monohydric alcohol having 8 to 24 carbon atoms. Oxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkenyl ether, etc.) are preferable.
Further, among these nonionic surfactants, when the finally obtained magnetic particles (C) are used for separation and purification, it is preferable from the viewpoint of improving the separability of nucleic acids to have 8 to 24 carbon atoms. It is an adduct of 1 to 50 mol (preferably 1 to 20 mol) of ethylene oxide of a monohydric alcohol (such as oleyl alcohol) having an alkenyl group of.
In addition, "improving the separability" means that the purity (ratio) of the nucleic acid in the component extracted from the sample (E) using the magnetic particles (C) is increased.
非イオン性界面活性剤の使用量は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１０〜１，０００重量％であることが好ましく、１００〜５００重量％であることが更に好ましい。非イオン性界面活性剤の使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して１０重量％以上又は１，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなる傾向がある。 The amount of the nonionic surfactant used is preferably 10 to 1,000% by weight, more preferably 100 to 500% by weight, based on the weight of the magnetic metal oxide particles (A). When the amount of the nonionic surfactant used is 10% by weight or more or 1,000% by weight or less with respect to the weight of the magnetic metal oxide particles (A), the emulsion is stable and the particle size distribution of the particles to be produced is stable. Tends to be narrower.
前記の工程で用いる溶液（Ｄ２）の使用量は、分散液（Ｄ１）が含有する磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して、１，０００〜１００，０００重量％であることが好ましく、１，５００〜４０，０００重量％であることが更に好ましい。
非イオン性界面活性剤を含む水溶液である溶液（Ｄ２）の使用量が、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量に対して１，０００重量％以上又は１００，０００重量％以下であると、エマルションが安定し、生成する粒子の粒度分布が狭くなる傾向がある。
The amount of the solution (D2) used in the above step is preferably 1,000 to 100,000% by weight with respect to the weight of the magnetic metal oxide particles (A) contained in the dispersion liquid (D1). , 1,500 to 40,000% by weight, more preferably.
When the amount of the solution (D2), which is an aqueous solution containing a nonionic surfactant, is 1,000% by weight or more or 100,000% by weight or less with respect to the weight of the magnetic metal oxide particles (A), The emulsion tends to be stable and the particle size distribution of the resulting particles tends to be narrow.
前記の（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒としては、ルイス酸及び塩酸等を用いることができ、具体的には、無機酸（塩酸等）、有機酸（酢酸等）、無機塩基化合物（アンモニア等）及びアミン化合物（エタノールアミン等）等を用いることができる。
加水分解用触媒の使用量は、（アルキル）アルコキシシランの重量に対して、１〜１０００重量％であることが好ましく、２〜５００重量％であることが更に好ましい。
Lewis acid, hydrochloric acid and the like can be used as the catalyst for hydrolysis of the (alkyl) alkoxysilane, and specifically, an inorganic acid (hydrochloric acid or the like), an organic acid (acetic acid or the like), an inorganic base compound (ammonia) Etc.) and amine compounds (ethanolamine, etc.) and the like can be used.
The amount of the hydrolysis catalyst used is preferably 1 to 1000% by weight, more preferably 2 to 500% by weight, based on the weight of the (alkyl) alkoxysilane.
前記の分散液（Ｄ１）と溶液（Ｄ２）との混合方法は特に限定されず、後述の設備を使用して一括混合することもできるが、シリカ粒子（Ｂ１）の粒子径の均一性の観点から、溶液（Ｄ２）を撹拌しながら分散液（Ｄ１）を滴下する方法が好ましい。 The mixing method of the dispersion liquid (D1) and the solution (D2) is not particularly limited, and batch mixing can be performed using the equipment described later, but from the viewpoint of the uniformity of the particle size of the silica particles (B1). Therefore, a method of dropping the dispersion liquid (D1) while stirring the solution (D2) is preferable.
分散液（Ｄ１）と溶液（Ｄ２）とを混合する際の設備としては、一般に乳化機、分散機として市販されているものであれば特に限定されず、例えば、ホモジナイザー（ＩＫＡ社製）、ポリトロン（キネマティカ社製）及びＴＫオートホモミキサー（プライミクス（株）製）等のバッチ式乳化機、エバラマイルダー（（株）在原製作所製）、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー（プライミクス（株）製）、コロイドミル（（株）神鋼環境ソリューション製）、クリアミックス（エムテクニック社製）、スラッシャー、トリゴナル湿式微粉砕機（日本コークス工業（株）製）、キャピトロン（（株）ユーロテック製）及びファインフローミル（太平洋機工（株）製）等の連続式乳化機、マイクロフルイダイザー（みづほ工業（株）製）、ナノマイザー（ナノマイザー（株）製）及びＡＰＶガウリン（ガウリン社製）等の高圧乳化機、膜乳化機（冷化工業（株）製）等の膜乳化機、バイブロミキサー（冷化工業（株）製）等の振動式乳化機、超音波ホモジナイザー（ブランソン社製）等の超音波乳化機等が挙げられる。
これらの内、粒子径の均一化の観点から、ＡＰＶガウリン、ホモジナイザー、ＴＫオートホモミキサー、エバラマイルダー、ＴＫフィルミックス、ＴＫパイプラインホモミキサー及びクリアミックス（エムテクニック社製）が好ましい。
The equipment for mixing the dispersion liquid (D1) and the solution (D2) is not particularly limited as long as it is generally commercially available as an emulsifier or a disperser, and for example, a homogenizer (manufactured by IKA) or Polytron. Batch type emulsifiers (manufactured by Kinematica Co., Ltd.) and TK Auto Homo Mixer (manufactured by Primix Co., Ltd.), Ebara Milder (manufactured by Aihara Seisakusho Co., Ltd.), TK Philmix, TK Pipeline Homo Mixer (manufactured by Primix Co., Ltd.) , Colloid mill (manufactured by Shinko Environmental Solutions Co., Ltd.), Clearmix (manufactured by M-Technique), Slasher, Trigonal wet pulverizer (manufactured by Nippon Coke Industries Co., Ltd.), Capitron (manufactured by Eurotech Co., Ltd.) And fine flow mills (manufactured by Pacific Kiko Co., Ltd.) and other continuous emulsifiers, microfluidizers (manufactured by Mizuho Kogyo Co., Ltd.), nanomizers (manufactured by Nanomizer Co., Ltd.) and APV Gaulin (manufactured by Gaulin Co., Ltd.) Emulsifiers, membrane emulsifiers such as membrane emulsifiers (manufactured by Refrigeration Industry Co., Ltd.), vibration emulsifiers such as Vibro mixer (manufactured by Refrigeration Industry Co., Ltd.), ultrasonic homogenizers (manufactured by Branson Co., Ltd.), etc. Examples include a sonic emulsifier.
Of these, from the viewpoint of uniform particle size, APV gaulin, homogenizer, TK auto homomixer, Ebara milder, TK fill mix, TK pipeline homo mixer and clear mix (manufactured by M-Technique) are preferable.
（アルキル）アルコキシシランの加水分解重縮合反応の温度は、１０〜１００℃であることが好ましく、更に好ましくは２５〜６０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、更に好ましくは１〜２時間である。 The temperature of the hydrolysis polycondensation reaction of the (alkyl) alkoxysilane is preferably 10 to 100 ° C, more preferably 25 to 60 ° C. The reaction time is preferably 0.5 to 5 hours, more preferably 1 to 2 hours.
本発明において磁性粒子（Ｃ）は、前述の通り、前記の磁性粒子（Ｂ）を含有し、かつ、化学式（１）で表される１価の基を有する。 In the present invention, as described above, the magnetic particle (C) contains the magnetic particle (B) and has a monovalent group represented by the chemical formula (1).
前記の磁性粒子（Ｂ）及び前記化学式（１）で表される１価の基は、タンパク質、オリゴペプチド（２〜４０量体であることが好ましい）、オリゴヌクレオチド（２〜４０量体であることが好ましい）及び鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（炭化水素鎖の炭素数は、１〜１８であることが好ましい。なお、アミド基を有する場合、炭化水素鎖の炭素数は、アミド基の炭素を除いた炭素数とする）からなる群から選ばれる少なくとも１種を介して結合していることが好ましい。
また、前記の磁性粒子（Ｃ）の具体的態様としては、前記の磁性粒子（Ｂ）と、後述のポリマー（Ｐ）［化学式（１）で表される１価の基を有するポリマー］が結合してなる磁性粒子であってもよい。
また、磁性粒子（Ｃ）は、前記の磁性粒子（Ｂ）の表面に化学式（１）で表される１価の基が結合した粒子であることが好ましい。
The magnetic particles (B) and the monovalent group represented by the chemical formula (1) are proteins, oligopeptides (preferably 2 to 40 mer), and oligonucleotides (2 to 40 mer). (Preferably) and a hydrocarbon chain which may have an amide group in the middle of the chain (the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is preferably 1 to 18; when it has an amide group, the hydrocarbon chain The number of carbon atoms in the above is preferably the number of carbon atoms excluding the carbon of the amide group), and it is preferable that they are bonded via at least one selected from the group.
Further, as a specific embodiment of the magnetic particles (C), the magnetic particles (B) and the polymer (P) described later [a polymer having a monovalent group represented by the chemical formula (1)] are bonded. It may be a magnetic particle made of.
Further, the magnetic particles (C) are preferably particles in which a monovalent group represented by the chemical formula (1) is bonded to the surface of the magnetic particles (B).
前記のポリマー（Ｐ）は、一般式（２）で表される構成単位（Ｘ１）を必須構成単位として有し、一般式（３）で表される構成単位（Ｘ２）を構成単位として有さないポリマー（Ｐ１）並びに／又は一般式（２）で表される構成単位（Ｘ１）及び一般式（３）で表される構成単位（Ｘ２）を必須構成単位として有するポリマー（Ｐ２）であることが好ましい。
なお、ポリマー（Ｐ）が複数の構成単位（Ｘ１）又は複数の構成単位（Ｘ２）で構成される場合、複数ある構成単位（Ｘ１）又は構成単位（Ｘ２）は、同一でも異なっていても良い。
The polymer (P) has a structural unit (X 1 ) represented by the general formula (2) as an essential structural unit, and the structural unit (X 2 ) represented by the general formula (3) as a structural unit. have not polymer (P1) and / or formula (2) structural units represented by (X 1) and the general formula polymer having as essential constituent units a structural unit (X 2) represented by (3) (P2 ) Is preferable.
When the polymer (P) is composed of a plurality of structural units (X 1 ) or a plurality of structural units (X 2 ), the plurality of structural units (X 1 ) or the structural units (X 2 ) are the same but different. You may be.
前記の一般式（２）及び一般式（３）において、Ｙ１及びＹ２は、鎖の途中にカルボニル基を有していてもよい炭素数１〜１８の炭化水素鎖を表す（カルボニル基を有する場合、Ｙ１又はＹ２が有する炭素数は、カルボニル基の炭素を除いて、１〜１８である）。
前記の炭素数が１〜１８の炭化水素鎖としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基及びオクタデシレン基等が挙げられる。
In the above general formulas (2) and (3), Y 1 and Y 2 represent a hydrocarbon chain having 1 to 18 carbon atoms which may have a carbonyl group in the middle of the chain (carbonyl group). If so, Y 1 or Y 2 has 1 to 18 carbon atoms, excluding the carbon of the carbonyl group).
Examples of the hydrocarbon chain having 1 to 18 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, a propylene group and an octadecylene group.
上記の一般式（３）において、Ｚは、核酸塩基から水素原子を除去した１価の基である。
前記の核酸塩基としては、天然核酸塩基［アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）又はチミン（Ｔ）］又は非天然核酸塩基［イノシンをベースとしたユニバーサル塩基（特表２００５−５１１０９６及び特表２００３−５２８８８３等に記載のもの）等］等が挙げられる。
また、天然核酸塩基から水素原子を除去した１価の基として好ましいものとしては、下式の塩基等が挙げられる（式中＊は結合手を表す）。
In the above general formula (3), Z is a monovalent group obtained by removing a hydrogen atom from a nucleobase.
Examples of the nucleobase include natural nucleobases [adenine (A), guanine (G), cytosine (C) or thymine (T)] or unnatural nucleobases [inosine-based universal bases (Special Table 2005-511906). And those described in the special table 2003-528883 etc.), etc.] and the like.
Further, as a monovalent group obtained by removing a hydrogen atom from a natural nucleobase, a base of the following formula and the like can be mentioned (* in the formula represents a bond).
前記のポリマー（Ｐ）１分子を構成する構成単位（Ｘ１）及び構成単位（Ｘ２）の合計個数は、核酸の回収量を向上させる観点から、２〜５０であることが好ましく、５〜３０であることが更に好ましく、５〜２５であることが特に好ましい。 The total number of the structural units (X 1 ) and the structural units (X 2 ) constituting one molecule of the polymer (P) is preferably 2 to 50 from the viewpoint of improving the amount of nucleic acid recovered, and is preferably 5 to 50. It is more preferably 30 and particularly preferably 5 to 25.
本願の磁性粒子（Ｃ）は、前述の通り、化学式（１）で表される１価の基を有するが、前記の磁性粒子（Ｂ）との結合を軸とした回転により、プリン型、ピリミジン型の両塩基になりうる。即ち、下式に示すように、相対する塩基がアミジン型の塩基であるアデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）の場合はアミド型の配置、アミド型塩基であるグアニン（Ｇ）又はチミン（Ｔ）の場合はアミジン型配置をとり、すべての天然核酸塩基と塩基対を形成することができる。 As described above, the magnetic particle (C) of the present application has a monovalent group represented by the chemical formula (1), but due to rotation about the bond with the magnetic particle (B), a purine type and a pyrimidine Can be both bases of type. That is, as shown in the following formula, when the opposing base is an adenine (A) or cytosine (C) which is an amidin type base, the amide type arrangement, guanine (G) or thymine (T) which is an amide type base. In the case of, it has an adenine-type arrangement and can form a base pair with all natural nucleobases.
従って、例えば、前記磁性粒子（Ｃ）において、ポリマー（Ｐ１）が結合している場合、又は、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖のみを介して化学式（１）で表される１価の基が結合している場合は、後に詳述する複合体形成工程において、本発明の磁性粒子（Ｃ）は核酸と配列非特異的に塩基対を形成し、後述の複合体（Ｆ）を形成することができる。
また、前記磁性粒子（Ｃ）において、ポリマー（Ｐ２）が結合している場合は、後に詳述する複合体形成工程において、構成単位（Ｘ２）におけるＺの配列に対応した核酸と、配列特異的に塩基対を形成し、後述の複合体（Ｆ）を形成することができる。
なお、上記のポリマー（Ｐ２）は、前述の通り、構成単位（Ｘ２）に加えて、化学式（１）で表される１価の基を有する構成単位（Ｘ１）を有しており、以下の特徴を有する。
前記のポリマー（Ｐ２）が結合した磁性粒子（Ｃ）は、ポリマー（Ｐ２）に代えて、構成単位（Ｘ２）を必須構成単位として有し構成単位（Ｘ１）を構成単位として有さないポリマー（Ｐ’）が結合した磁性粒子と比較して、分離精製対象の核酸との二重鎖形成及びその後の解離が容易である傾向がある。
また、構成単位（Ｘ１）が有する化学式（１）で表される１価の基は、前述の通り、すべての天然核酸塩基と塩基対を形成することができるため、前記のポリマー（Ｐ’）が結合した磁性粒子では分離精製が困難な一塩基多型が生じる核酸であっても、分離精製が可能である。具体的には、ポリマー（Ｐ２）の構成単位の内、分離精製対象の核酸において一塩基多型が生じる部位と塩基対を形成する構成単位を、構成単位（Ｘ１）としておくことで、一塩基多型が生じる核酸であっても分離精製が可能となる。
Therefore, for example, in the magnetic particles (C), when the polymer (P1) is bonded, or only via a hydrocarbon chain which may have an amide group in the middle of the chain, the chemical formula (1) is used. When the represented monovalent group is bonded, the magnetic particle (C) of the present invention forms a base pair non-specifically with the nucleic acid in the complex formation step described in detail later, and the composite described later is used. The body (F) can be formed.
When the polymer (P2) is bound to the magnetic particles (C), the nucleic acid corresponding to the Z sequence in the structural unit (X 2) and the sequence specificity are obtained in the complex formation step described in detail later. It is possible to form a base pair and form a complex (F) described later.
As described above, the above-mentioned polymer (P2) has a structural unit (X 1 ) having a monovalent group represented by the chemical formula (1) in addition to the structural unit (X 2). It has the following features.
The magnetic particle (C) to which the polymer (P2) is bonded has a structural unit (X 2 ) as an essential structural unit instead of the polymer (P2) and does not have a structural unit (X 1 ) as a structural unit. Compared with the magnetic particles to which the polymer (P') is bound, the double chain formation with the nucleic acid to be separated and purified and the subsequent dissociation tend to be easier.
Further, since the monovalent group represented by the chemical formula (1) of the structural unit (X 1 ) can form a base pair with all natural nucleobases as described above, the above-mentioned polymer (P' ) Is bound, and even nucleic acids that generate single nucleotide polymorphisms, which are difficult to separate and purify, can be separated and purified. Specifically, among the structural units of the polymer (P2), the structural unit that forms a base pair with the site where a single nucleotide polymorphism occurs in the nucleic acid to be separated and purified is set as the structural unit (X 1 ). Even nucleic acids that generate base polymorphisms can be separated and purified.
磁性粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、好ましくは０．５〜２０μｍ、更に好ましくは１〜１０μｍ、特に好ましくは１．１〜５μｍである。
磁性粒子（Ｃ）の体積平均粒子径が０．５μｍ以上の場合、分離回収の際の時間を短縮できる傾向にある。また、磁性粒子（Ｃ）の平均粒子径が２０μｍ以下の場合、比表面積を比較的大きくできるため、核酸の分離量を多くすることができ、結合効率が増加する傾向にある。
The volume average particle diameter of the magnetic particles (C) is preferably 0.5 to 20 μm, more preferably 1 to 10 μm, and particularly preferably 1.1 to 5 μm.
When the volume average particle diameter of the magnetic particles (C) is 0.5 μm or more, the time required for separation and recovery tends to be shortened. Further, when the average particle size of the magnetic particles (C) is 20 μm or less, the specific surface area can be made relatively large, so that the amount of nucleic acid separated can be increased, and the binding efficiency tends to increase.
本発明における磁性粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、例えばレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）で測定して得られる体積平均粒子径である。 The volume average particle size of the magnetic particles (C) in the present invention is, for example, the volume average particle size obtained by measuring with a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (“Microtrack MT3300” manufactured by Microtrack Bell Co., Ltd.). Is.
また、磁性粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、製造時の水洗工程の条件変更及び分級等の方法によっても所望の値とすることができる。 Further, the volume average particle diameter of the magnetic particles (C) can be set to a desired value by changing the conditions of the water washing process at the time of production, classifying, or the like.
次に、本発明の磁性粒子（Ｃ）の製造方法、即ち、前記の磁性粒子（Ｂ）に化学式（１）で表される１価の基を結合させる方法について説明する。 Next, a method for producing the magnetic particles (C) of the present invention, that is, a method for binding a monovalent group represented by the chemical formula (1) to the magnetic particles (B) will be described.
本発明における、磁性粒子（Ｂ）に、化学式（１）で表される１価の基を結合させる方法としては、以下の方法等が挙げられる。
グルタルアルデヒド、カルボジイミド化合物、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物（Ｋ）を磁性粒子（Ｂ）に結合させ、それらを介して一般式（４）で表される化合物を、シリカ粒子（Ｂ）に結合させる方法である。
これらの有機化合物（Ｋ）の内、好ましいのは、官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）である。
Examples of the method for binding the monovalent group represented by the chemical formula (1) to the magnetic particles (B) in the present invention include the following methods.
At least one organic compound (K) selected from the group consisting of glutaraldehyde, a carbodiimide compound, streptavidin, biotin and an alkylalkoxysilane (H) having a functional group is bound to the magnetic particles (B) and mediated through them. This is a method of binding a compound represented by the general formula (4) to silica particles (B).
Of these organic compounds (K), preferred is alkylalkoxysilane (H) having a functional group.
一般式（４）において、Ｒ３としては、ストレプトアビジン骨格、ビオチン骨格、カルボニル基、アルデヒド基、メルカプト基、水酸基、アミノ基又はカルボキシ基等を有する１価の基等が挙げられる。
また、カルボキシ基を有する１価の基としては、炭素数１〜１８のアルキレン基及びカルボキシ基が結合した１価の基等が挙げられる。
また、アミノ基を有する１価の基としては、炭素数１〜１８のアルキレン基及びアミノ基が結合した１価の基等が挙げられる。
また、一般式（４）で表される化合物の内、Ｒ３がアミノ基を有する１価の基である化合物としては、アミノ基を有するポリマー（Ｐ）等を用いることもできる。
In the general formula (4), examples of R 3 include a streptavidin skeleton, a biotin skeleton, a carbonyl group, an aldehyde group, a mercapto group, a hydroxyl group, an amino group, a monovalent group having a carboxy group and the like.
Examples of the monovalent group having a carboxy group include an alkylene group having 1 to 18 carbon atoms and a monovalent group to which a carboxy group is bonded.
Examples of the monovalent group having an amino group include an alkylene group having 1 to 18 carbon atoms and a monovalent group to which an amino group is bonded.
Further, among the compounds represented by the general formula (4), as the compound in which R 3 is a monovalent group having an amino group, a polymer (P) having an amino group or the like can also be used.
アミノ基を有するポリマー（Ｐ）としては、末端に位置する構成単位として、アミノ酸（リシン等）由来の構成単位を用いたポリマーであって、アミノ酸由来のＮＨ２末端を有するポリマー等が挙げられる。
このようなアミノ基を有するポリマー（Ｐ）の製造方法としては、特許第５２５１１２５号に記載の方法（ユニバーサル塩基含有オリゴマーを、マニュアル固相合成にて合成する方法）等が挙げられる。
Examples of the polymer (P) having an amino group include a polymer using a structural unit derived from an amino acid (lysine or the like) as a constituent unit located at the terminal, and having an NH 2-terminal derived from an amino acid.
Examples of the method for producing the polymer (P) having such an amino group include the method described in Japanese Patent No. 5251125 (a method for synthesizing a universal base-containing oligomer by manual solid-phase synthesis).
上記アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基としては、アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基及びグリシジルオキシ基等が挙げられ、アルキルアルコキシシラン１分子中に異なる種類の官能基を有していてもよい。 Examples of the functional group of the alkylalkoxysilane (H) include an amino group, a carboxy group, a hydroxyl group, a mercapto group and a glycidyloxy group, and each alkylalkoxysilane has a different type of functional group. May be good.
磁性粒子（Ｂ）に官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）を結合させる方法としては、例えば磁性粒子（Ｂ）として前記のシリカ粒子（Ｂ１）を前記の方法で作製する際に、（アルキル）アルコキシシランとして、アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを使用する方法；及びこれらの置換基を有しない（アルキル）アルコキシシランを使用してシリカ粒子（Ｂ１）を作製した後、シリカ粒子（Ｂ１）を、アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランで処理する方法等が挙げられる。 As a method for binding the alkylalkoxysilane (H) having a functional group to the magnetic particles (B), for example, when the silica particles (B1) are produced as the magnetic particles (B) by the above method, (alkyl) As the alkoxysilane, a method of using an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with an amino group, a carboxy group, a hydroxyl group, a mercapto group or a glycidyloxy group; and using a (alkyl) alkoxysilane having no of these substituents. After producing the silica particles (B1), the silica particles (B1) are treated with an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with an amino group, a carboxy group, a hydroxyl group, a mercapto group or a glycidyloxy group. Be done.
後者の方法の具体例としては、シリカ粒子（Ｂ１）を、その濃度が溶媒の重量に対して０．１〜５０重量％になるように溶媒に分散し、この分散液にアミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの溶液を添加して、室温で加水分解縮合反応を行う方法等が挙げられる。 As a specific example of the latter method, silica particles (B1) are dispersed in a solvent so that the concentration thereof is 0.1 to 50% by weight based on the weight of the solvent, and the dispersion solution contains amino groups and carboxy groups. , A method of adding a solution of an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with a hydroxyl group, a mercapto group or a glycidyloxy group and carrying out a hydrolysis condensation reaction at room temperature and the like.
この方法における溶媒は、用いるアルキルアルコキシシランの溶解性に応じて適宜選択され、水に可溶なアミノ基、カルボキシ基、水酸基又はメルカプト基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合は、水又は水とアルコールとの混合溶媒等を用いることが好ましく、水に溶解しにくいグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合、酢酸ブチル等を用いることが好ましい。 The solvent in this method is appropriately selected according to the solubility of the alkylalkoxysilane used, and when an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with a water-soluble amino group, carboxy group, hydroxyl group or mercapto group is used, the solvent is used. , Water or a mixed solvent of water and alcohol is preferably used, and when an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with a glycidyloxy group which is difficult to dissolve in water is used, butyl acetate or the like is preferably used.
アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランの使用量は、シリカ粒子（Ｂ１）の重量を基準として０．０００１〜１００００重量％であることが好ましく、０．０００１〜１０００重量％であることが更に好ましく、０．０００１〜１００重量％であることが特に好ましい。
０．０００１重量％以上であると、シリカ粒子（Ｂ１）に十分な量の官能基を導入することができる。また、１００００重量％以下であるとシリカ粒子（Ｂ１）同士が反応して結合することを抑制することができる。
The amount of alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with an amino group, a carboxy group, a hydroxyl group, a mercapto group or a glycidyloxy group shall be 0.0001 to 10000% by weight based on the weight of the silica particles (B1). Is more preferable, 0.0001 to 1000% by weight is more preferable, and 0.0001 to 100% by weight is particularly preferable.
When it is 0.0001% by weight or more, a sufficient amount of functional groups can be introduced into the silica particles (B1). Further, when it is 10,000% by weight or less, it is possible to suppress the reaction and bonding of the silica particles (B1) with each other.
グルタルアルデヒド、カルボジイミド化合物、ストレプトアビジン又はビオチンをシリカ粒子（Ｂ１）に結合させる方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして結合させることができる。
アルデヒド基を有するグルタルアルデヒド及びカルボキシ基を有するビオチンは、アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランが結合したシリカ粒子（Ｂ１）と反応させることで、シリカ粒子（Ｂ１）に結合させることができる。
また、アミノ基を有するストレプトアビジン、及び、カルボジイミド基を有するカルボジイミド化合物は、カルボキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシランが結合したシリカ粒子（Ｂ１）と反応させることで、シリカ粒子（Ｂ１）に結合させることができる。
The method for binding glutaraldehyde, a carbodiimide compound, streptavidin or biotin to the silica particles (B1) is not particularly limited, but for example, it can be bonded as follows.
Glutaraldehyde having an aldehyde group and biotin having a carboxy group are bonded to the silica particles (B1) by reacting with the silica particles (B1) to which the alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with an amino group is bonded. Can be done.
Further, streptavidin having an amino group and a carbodiimide compound having a carbodiimide group are reacted with silica particles (B1) to which an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with a carboxy group is bonded to silica particles (B1). ) Can be combined.
有機化合物（Ｋ）を介して一般式（４）で表される化合物をシリカ粒子（Ｂ１）に結合させる方法としては、一般式（４）で表される化合物の種類（即ちＲ３の種類）に応じて、有機化合物（Ｋ）を適宜選択すればよい。
例えば、ストレプトアビジン骨格を有する一般式（４）で表される化合物を結合させる場合、有機化合物（Ｋ）としてビオチンを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、例えば、ビオチン骨格を有する一般式（４）で表される化合物を結合させる場合、有機化合物（Ｋ）としてストレプトアビジンを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、例えば、アミノ基を有する一般式（４）で表される化合物を結合させる場合、有機化合物（Ｋ）としてグルタルアルデヒドを選択し、公知の方法で固定化することができる。
また、例えば、カルボキシ基を有する一般式（４）で表される化合物を結合させる場合、有機化合物（Ｋ）としてカルボジイミド化合物を選択し、公知の方法で固定化することができる。
The organic compound as the method of binding the general formula via a (K) a compound represented by (4) in the silica particles (B1), the type of the compound represented by formula (4) (i.e., the type of R 3) The organic compound (K) may be appropriately selected according to the above.
For example, when a compound represented by the general formula (4) having a streptavidin skeleton is bound, biotin can be selected as the organic compound (K) and immobilized by a known method.
Further, for example, when a compound represented by the general formula (4) having a biotin skeleton is bound, streptavidin can be selected as the organic compound (K) and immobilized by a known method.
Further, for example, when a compound represented by the general formula (4) having an amino group is bonded, glutaraldehyde can be selected as the organic compound (K) and immobilized by a known method.
Further, for example, when a compound represented by the general formula (4) having a carboxy group is bonded, a carbodiimide compound can be selected as the organic compound (K) and immobilized by a known method.
また、有機化合物（Ｋ）として、官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）を使用する場合、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基に応じて、以下のような一般式（４）で表される化合物を結合させることができる。
例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がアミノ基である場合は、カルボキシ基、カルボニル基及び／又はアルデヒド基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法［塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を用いた方法等］で結合させることができる。
また、例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がカルボキシ基である場合は、アミノ基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法で結合させることができる。
また、例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基が水酸基である場合は、カルボキシ基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法で結合させることができる。
また、例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がメルカプト基である場合は、メルカプト基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法で結合させることができる。
また、例えば、アルキルアルコキシシラン（Ｈ）が有する官能基がグリシジルオキシ基である場合は、アミノ基及び／又は水酸基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法で結合させることができる。
When an alkylalkoxysilane (H) having a functional group is used as the organic compound (K), it is represented by the following general formula (4) depending on the functional group of the alkylalkoxysilane (H). Compounds can be bound.
For example, when the functional group of the alkylalkoxysilane (H) is an amino group, a compound represented by the general formula (4) having a carboxy group, a carbonyl group and / or an aldehyde group can be used by a known method [hydrogen 1 It can be bound by a method using −ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), etc.].
Further, for example, when the functional group of the alkylalkoxysilane (H) is a carboxy group, the compound represented by the general formula (4) having an amino group can be bonded by a known method.
Further, for example, when the functional group of the alkylalkoxysilane (H) is a hydroxyl group, the compound represented by the general formula (4) having a carboxy group can be bonded by a known method.
Further, for example, when the functional group of the alkylalkoxysilane (H) is a mercapto group, the compound represented by the general formula (4) having a mercapto group can be bonded by a known method.
Further, for example, when the functional group of the alkylalkoxysilane (H) is a glycidyloxy group, the compound represented by the general formula (4) having an amino group and / or a hydroxyl group is bonded by a known method. Can be done.
また、有機化合物（Ｋ）に別の化合物を反応させ、それを介して一般式（４）で表される化合物をシリカ粒子（Ｂ１）に固定化してもよい。
例えば、有機化合物（Ｋ）として、アミノ基を有するアルキルアルコキシシランを用いる場合、無水コハク酸と反応させて、カルボキシ基を生成させても良い。この場合、アミノ基を有する一般式（４）で表される化合物を、公知の方法で固定化することができる。
このような方法としては、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を用いた方法等が挙げられる。
Alternatively, the organic compound (K) may be reacted with another compound, and the compound represented by the general formula (4) may be immobilized on the silica particles (B1) through the reaction.
For example, when an alkylalkoxysilane having an amino group is used as the organic compound (K), it may be reacted with succinic anhydride to generate a carboxy group. In this case, the compound represented by the general formula (4) having an amino group can be immobilized by a known method.
Examples of such a method include a method using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS).
また、磁性粒子（Ｂ）に、ポリマー（Ｐ）を結合させる方法としては、以下の方法が挙げられる。
前述の特許第５２５１１２５号に記載のマニュアル固相合成において、固相担体として、アミノ基を導入したシリカ粒子（Ｂ１）を使用して、鎖長反応を実施することで、磁性粒子（Ｂ）にポリマー（Ｐ）が結合した磁性粒子（Ｃ）を直接製造することもできる。（この場合、固相担体からの切り出しは実施しない）
アミノ基を導入したシリカ粒子（Ｂ１）の製造方法としては、前述の「磁性粒子（Ｂ）に官能基を有するアルキルアルコキシシラン（Ｈ）を結合させる方法」において、「アミノ基、カルボキシ基、水酸基、メルカプト基又はグリシジルオキシ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン」として、「アミノ基で置換されたアルキル基を有するアルキルアルコキシシラン」を使用し、アミノ基を導入したシリカ粒子（Ｂ１）を製造する方法等が挙げられる。
Further, as a method of binding the polymer (P) to the magnetic particles (B), the following methods can be mentioned.
In the manual solid-phase synthesis described in the above-mentioned Patent No. 5251125, magnetic particles (B) are obtained by carrying out a chain length reaction using silica particles (B1) having an amino group introduced as a solid-phase carrier. It is also possible to directly produce the magnetic particles (C) to which the polymer (P) is bonded. (In this case, cutting from the solid phase carrier is not performed)
As a method for producing the silica particle (B1) into which an amino group has been introduced, in the above-mentioned "method for binding an alkylalkoxysilane (H) having a functional group to a magnetic particle (B)", "amino group, carboxy group, hydroxyl group". , An alkyl alkoxysilane having an alkyl group substituted with a mercapto group or a glycidyloxy group, "an alkylalkoxysilane having an alkyl group substituted with an amino group" was used, and an amino group was introduced into the silica particles (B1). Examples include a method for producing the above.
次に、本発明の磁性粒子（Ｃ）を用いて、試料（Ｅ）中の核酸を分離する分離精製方法について、以下に説明する。
なお、これらの分離精製方法は、本発明の核酸の分離精製方法でもある。
Next, a separation and purification method for separating the nucleic acid in the sample (E) using the magnetic particles (C) of the present invention will be described below.
These separation and purification methods are also the nucleic acid separation and purification methods of the present invention.
（核酸の分離精製方法）
本発明における核酸の分離精製方法は、核酸を含む試料（Ｅ）から核酸を抽出・精製する方法である。
本発明の分離精製方法は、（１）複合体形成工程、（２）複合体分離工程、及び、（３）解離工程を含む。
以下、各工程について説明する。
(Nucleic acid separation and purification method)
The method for separating and purifying nucleic acid in the present invention is a method for extracting and purifying nucleic acid from a sample (E) containing nucleic acid.
The separation and purification method of the present invention includes (1) a complex forming step, (2) a complex separating step, and (3) a dissociation step.
Hereinafter, each step will be described.
（１）複合体形成工程
本工程では、核酸を含む試料（Ｅ）と磁性粒子（Ｃ）とを接触させ、磁性粒子（Ｃ）と核酸との複合体（Ｆ）を形成する。
接触時のｐＨは、６〜１０であることが好ましい。
また、接触時の温度は、４〜９５℃であることが好ましい。
また、必要に応じて［特にポリマー（Ｐ２）が結合した磁性粒子］を用いる場合等は、６０〜９５℃で３０秒〜２０分保持し、その後、２０〜４０℃で３０秒〜１時間保持し、次いで、４〜２０℃で３０秒〜１時間保持することで、複合体（Ｆ）を形成させても良い。
(1) Complex formation step In this step, the sample (E) containing nucleic acid and the magnetic particles (C) are brought into contact with each other to form a complex (F) of the magnetic particles (C) and the nucleic acid.
The pH at the time of contact is preferably 6 to 10.
The temperature at the time of contact is preferably 4 to 95 ° C.
If necessary, when [particularly magnetic particles to which a polymer (P2) is bonded] is used, the mixture is held at 60 to 95 ° C. for 30 seconds to 20 minutes, and then held at 20 to 40 ° C. for 30 seconds to 1 hour. Then, the complex (F) may be formed by holding at 4 to 20 ° C. for 30 seconds to 1 hour.
（２）複合体分離工程
次に、磁力で複合体（Ｆ）を試料（Ｅ）から分離する。
複合体（Ｆ）は、磁性粒子（Ｃ）を含み、磁性粒子（Ｃ）は、磁性金属酸化物粒子（Ａ）を有するので、複合体（Ｆ）は、磁力により集めることができる。
その後、残りの試料（Ｅ）を除去することにより、複合体（Ｆ）を試料（Ｅ）から分離することができる。
このような方法としては、例えば、反応槽の外側から磁石等の磁力により複合体（Ｆ）を集め、上澄み液（試料（Ｅ）から核酸が除かれた試料（Ｅ１））を排出し、複合体（Ｆ）を分離する方法が挙げられる。
(2) Complex Separation Step Next, the complex (F) is separated from the sample (E) by magnetic force.
Since the complex (F) contains the magnetic particles (C) and the magnetic particles (C) have the magnetic metal oxide particles (A), the complex (F) can be collected by a magnetic force.
The complex (F) can then be separated from the sample (E) by removing the remaining sample (E).
As such a method, for example, the complex (F) is collected from the outside of the reaction vessel by the magnetic force of a magnet or the like, and the supernatant liquid (sample (E1) in which nucleic acid is removed from the sample (E)) is discharged to form the complex. A method of separating the body (F) can be mentioned.
また、複合体（Ｆ）に付着した夾雑物を除去するために、分離後の複合体（Ｆ）を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄操作は１〜１０回繰り返しても良い。
洗浄液としては、エタノール水溶液、生理食塩水及びリン酸緩衝液等を用いることができる。
また、洗浄液には界面活性剤が含まれていても良い。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、炭素数８〜２４の１価のアルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコール及びオレイルアルコール等）のアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドをＡＯと略記）付加物；
炭素数３〜３６の２〜８価のアルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＡＯ付加物；
炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノール（オクチルフェノール及びノニルフェノール等）のＡＯ付加物；
ポリプロピレングリコールのエチレンオキサイド付加物及びポリエチレングリコールのプロピレンオキサイド付加物；
炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）のＡＯ付加物；
前記の炭素数３〜３６の２〜８価のアルコールの脂肪酸エステル及びそのＡＯ付加物［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０等］；
アルキルグルコシド（Ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデカノイルスクロース及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド等）；並びに、
ショ糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド及びこれらのＡＯ付加物（ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド等）等が挙げられる。
これらは、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
前記の非イオン性界面活性剤の説明におけるＡＯとしては、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド及びブチレンオキサイド等が挙げられ、その付加形式はブロック付加であってもランダム付加であってもよい。
また、ＡＯの付加モル数としては、アルコール、フェノール又は脂肪酸１モルあたり、１〜５０モルであることが好ましく、１〜２０モルであることが更に好ましい。
これらの非イオン性界面活性剤の内、水への溶解度及び粘度の観点から、炭素数８〜２４の１価のアルコールのエチレンオキサイド１〜５０モル（好ましくは１〜２０モル）付加物（ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルケニルエーテル等）であることが好ましい。
Further, in order to remove impurities adhering to the complex (F), the separated complex (F) may be washed with a washing liquid. The cleaning operation may be repeated 1 to 10 times.
As the cleaning solution, an aqueous ethanol solution, a physiological saline solution, a phosphate buffer solution, or the like can be used.
In addition, the cleaning liquid may contain a surfactant. As the surfactant, a nonionic surfactant is preferable.
As the nonionic surfactant, an alkylene oxide of a monohydric alcohol having 8 to 24 carbon atoms (decyl alcohol, dodecyl alcohol, coconut oil alkyl alcohol, octadecyl alcohol, oleyl alcohol, etc.) (hereinafter, alkylene oxide is abbreviated as AO). ) Additives;
AO adducts of 2-8 valent alcohols with 3 to 36 carbon atoms (glycerin, trimethylolpropane, pentaerythritol, sorbitol, sorbitol, etc.);
AO adduct of alkylphenols (octylphenol, nonylphenol, etc.) having an alkyl having 6 to 24 carbon atoms;
Ethylene oxide adduct of polypropylene glycol and propylene oxide adduct of polyethylene glycol;
AO adducts of fatty acids with 8 to 24 carbon atoms (decanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, coconut oil fatty acids, etc.);
Fatty acid esters of 2-8 valent alcohols having 3 to 36 carbon atoms and their AO adducts [TWEEN® 20 and TWEEN® 80, etc.];
Alkyl glucosides (N-octyl-β-D-maltoside, n-dodecanoylsucrose and n-octyl-β-D-glucopyranoside, etc.);
Examples thereof include fatty acid esters of sucrose, fatty acid alkanolamides, and AO adducts thereof (polyoxyethylene fatty acid alkanolamides, etc.).
These may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the AO in the above description of the nonionic surfactant include ethylene oxide, propylene oxide and butylene oxide, and the addition form thereof may be block addition or random addition.
The number of moles of AO added is preferably 1 to 50 mol, more preferably 1 to 20 mol, per 1 mol of alcohol, phenol or fatty acid.
Among these nonionic surfactants, from the viewpoint of solubility in water and viscosity, 1 to 50 mol (preferably 1 to 20 mol) of ethylene oxide adduct (poly) of a monohydric alcohol having 8 to 24 carbon atoms. Oxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkenyl ether, etc.) are preferable.
複合体（Ｆ）を試料（Ｅ）から分離する操作は、前記の（１）複合体形成工程及び（２）複合体分離工程の操作を１〜１０回繰り返すことが好ましい。この操作を繰り返すことにより、試料（Ｅ）から多くの複合体（Ｆ）を分離することができる。 The operation of separating the complex (F) from the sample (E) preferably repeats the above-mentioned operations of (1) complex formation step and (2) complex separation step 1 to 10 times. By repeating this operation, many complexes (F) can be separated from the sample (E).
（３）解離工程
次に、複合体（Ｆ）から核酸を解離させて核酸を得る。
複合体（Ｆ）から核酸を解離させる方法としては、特に限定されないが、温度差により核酸を解離させる方法、及び、磁性粒子（Ｃ）と核酸との結合を阻害する物質を加えることにより、核酸を解離させる方法等が挙げられる。
磁性粒子（Ｃ）と核酸との結合を阻害する物質としては、ｐＨ差、塩濃度差及び界面活性剤の作用により結合を阻害する物質等が挙げられる。
磁性粒子（Ｃ）と核酸との結合を阻害する物質として、具体的には、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ等を用いることができる。
なお、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが１０〜５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウムが３〜２０ｍＭのものであることが好ましい。
(3) Dissociation Step Next, the nucleic acid is dissociated from the complex (F) to obtain the nucleic acid.
The method for dissociating the nucleic acid from the complex (F) is not particularly limited, but the nucleic acid can be dissociated by a temperature difference or by adding a substance that inhibits the binding between the magnetic particles (C) and the nucleic acid. A method of dissociating the nucleic acid and the like can be mentioned.
Examples of the substance that inhibits the binding between the magnetic particles (C) and the nucleic acid include a substance that inhibits the binding due to a pH difference, a salt concentration difference, and the action of a surfactant.
Specifically, Tris-EDTA Buffer or the like can be used as a substance that inhibits the binding between the magnetic particles (C) and the nucleic acid.
The Tris-EDTA Buffer preferably contains 10 to 50 mM of tris (hydroxymethyl) aminomethane and 3 to 20 mM of tetrasodium ethylenediaminetetraacetate.
以上の工程を経て、核酸を分離精製することができる。 Nucleic acid can be separated and purified through the above steps.
本発明における核酸の分離精製方法では、（３）解離工程の後、磁性粒子（Ｃ）を回収する磁性粒子回収工程を行ってもよい。
上記（３）解離工程において、磁性粒子（Ｃ）と核酸とは解離している。
このような磁性粒子（Ｃ）を回収することにより、再利用可能となる。
そのため、回収工程の後、回収された磁性粒子（Ｃ）を用いて、上記（１）複合体形成工程、（２）複合体分離工程及び（３）解離工程を繰り返し行ってもよい。
前記の磁性粒子（Ｃ）の再利用において、再び接触させる試料（Ｅ）は、前記の試料（Ｅ１）であって、核酸が残存している試料であっても良い。
磁性粒子（Ｃ）を再利用することにより、核酸の分離精製のコストを抑えることができる。
In the method for separating and purifying nucleic acid in the present invention, after the (3) dissociation step, a magnetic particle recovery step for recovering the magnetic particles (C) may be performed.
In the above (3) dissociation step, the magnetic particles (C) and the nucleic acid are dissociated.
By recovering such magnetic particles (C), they can be reused.
Therefore, after the recovery step, the above-mentioned (1) complex formation step, (2) complex separation step, and (3) dissociation step may be repeated using the recovered magnetic particles (C).
In the reuse of the magnetic particles (C), the sample (E) to be brought into contact again may be the sample (E1) and the sample in which nucleic acid remains.
By reusing the magnetic particles (C), the cost of separating and purifying nucleic acid can be suppressed.
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、部は重量部を示す。 Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto. Hereinafter, unless otherwise specified, parts indicate parts by weight.
製造例１：シリカ粒子（Ｂ−１）の作成
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、更にアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、体積平均粒子径が１５ｎｍの磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を得た。
Production Example 1: Preparation of silica particles (B-1) <Preparation of magnetic metal oxide particles (A)>
186 parts of iron (III) chloride hexahydrate, 68 parts of iron (II) chloride tetrahydrate and 1288 parts of water are charged in a reaction vessel and dissolved to raise the temperature to 50 ° C., and the temperature under stirring is 50 to 55. While maintaining the temperature at ° C., 280 parts of 25 wt% aqueous ammonia was added dropwise over 1 hour to obtain magnetite particles in the water. 64 parts of oleic acid as a dispersant was added to the obtained magnetite particles, and stirring was continued for 2 hours. After cooling to room temperature, the magnetite particles adsorbed with oleic acid obtained by solid-liquid separation by decantation were washed with 1000 parts of water three times, and further washed with 1000 parts of acetone twice. By drying at ° C. for 2 days, magnetic metal oxide particles (A-1) having a volume average particle diameter of 15 nm were obtained.
＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞
磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（Ｄ１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５重量％アンモニア水溶液３５００部、エマルミン２００（三洋化成工業（株）製）４００部を加えてクリアミックス（エムテクニック（株）製）を用いて混合し溶液（Ｄ２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（Ｄ１）を溶液（Ｄ２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上澄み液を除き、シリカ粒子（ＰＢ−１）を得た。
<Preparation of silica particles (PB)>
80 parts of the magnetic metal oxide particles (A-1) were added to 240 parts of tetraethoxysilane and dispersed to prepare a dispersion liquid (D1). Next, 5050 parts of water, 3500 parts of a 25 wt% ammonia aqueous solution, and 400 parts of Emulmin 200 (manufactured by Sanyo Chemical Industries, Ltd.) are added to the reaction vessel and mixed using Clearmix (manufactured by M-Technique Co., Ltd.) to form a solution. (D2) was obtained. After raising the temperature to 50 ° C., the dispersion liquid (D1) was added dropwise to the solution (D2) over 1 hour while stirring the clear mix at a rotation speed of 6,000 rpm, and then reacted at 50 ° C. for 1 hour. After the reaction, the mixture was centrifuged at 2,000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant liquid in which fine particles were present, and silica particles (PB-1) were obtained.
＜シリカ粒子（ＰＢ）の分級工程＞
得られたシリカ粒子（ＰＢ−１）を含有する固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２８００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上澄み液を除く操作を４回行った（遠心分離工程１）。
続いて、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を回収することで、沈降した大きな粒子径の粒子を除去する操作を１回行った（遠心分離工程２）。
更に、磁石を用いて粒子を集磁し上澄み液を除去した。その後、水５０００部を加えてシリカ粒子を分散させた後に、磁石を用いて粒子を集磁し、上澄み液を除去する操作を１０回（洗浄工程１）行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を８３重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−１）を得た。
<Classification process of silica particles (PB)>
After adding 5000 parts of water to the solid phase containing the obtained silica particles (PB-1) to disperse the particles and centrifuging at 2800 rpm for 1 minute, the operation of removing the supernatant liquid in which the fine particles were present was performed four times (). Centrifugation step 1).
Subsequently, 5000 parts of water is added to the obtained solid phase to disperse the particles, and the particles are centrifuged at 600 rpm for 1 minute, and the supernatant liquid is collected to remove the precipitated particles having a large particle size once. (Centrifugation step 2).
Further, the particles were collected using a magnet to remove the supernatant liquid. Then, after adding 5000 parts of water to disperse the silica particles, the operation of collecting the particles using a magnet and removing the supernatant liquid was performed 10 times (cleaning step 1), and the magnetic metal oxide particles (A-). Silica particles (B-1) containing 83% by weight of 1) were obtained.
次に、磁性粒子（Ｂ）に結合させる「一般式（４）で表される化合物」である化合物６並びにポリマー（Ｐ２−１）の製造方法を、製造例２〜１１にて説明する。
なお、後述のポリマー（Ｐ２−１）、（Ｐ１−１）及び（Ｐ１−２）は、化合物１０を必須構成単量体として有するポリマーであり、化合物１０の合成スキームを以下に記載する。
Next, a method for producing the compound 6 and the polymer (P2-1), which are “compounds represented by the general formula (4)” to be bonded to the magnetic particles (B), will be described with reference to Production Examples 2 to 11.
The polymers (P2-1), (P1-1) and (P1-2) described later are polymers having compound 10 as an essential constituent monomer, and the synthesis scheme of compound 10 is described below.
製造例２：１−ヒドロキシエチル−６−アミノウラシル（化合物１）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた２００ｍＬナス型フラスコに、無水エタノール９０ｍＬを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム２．８ｇ（１２０ｍｍｏｌ）を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、２−ヒドロキシエチルウレア６．３ｇ（６０ｍｍｏｌ）とシアノ酢酸エチル６．４ｍＬ（６０ｍｍｏｌ）を加え、７時間還流させた。得られた反応溶液をろ過した後、エタノールで洗い、水に溶解させて１．０Ｍ希塩酸で中和した後にろ過をし、得られる白色固体を水で再結晶させることにより、白色結晶として化合物１（６．１ｇ，３５．６ｍｍｏｌ，収率５９．４％）を得た。なお、化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートは以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ３．５４（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２，９．６Ｈｚ），３．８３（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ，９．６Ｈｚ），４．５７（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＣＮＨ２），５．０９（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），６．６１（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２），１０．３２（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）：δ４４．１３（ＮＣＨ２ＣＨ２），５９．２８（ＣＨ２ＯＨ），７６．５２（ＣＨＣＮＨ２），１５１．８７，１５７．０４，１６２，８９
Production Example 2: Synthesis of 1-hydroxyethyl-6-aminouracil (Compound 1) 2.8 g of metallic sodium while stirring in an ice bath with 90 mL of absolute ethanol added to a 200 mL eggplant-shaped flask equipped with a fluororesin-coated stirrer. (120 mmol) was added carefully and stirred until completely dissolved. Then, 6.3 g (60 mmol) of 2-hydroxyethylurea and 6.4 mL (60 mmol) of ethyl cyanoacetate were added, and the mixture was refluxed for 7 hours. The obtained reaction solution is filtered, washed with ethanol, dissolved in water, neutralized with 1.0 M dilute hydrochloric acid, filtered, and the obtained white solid is recrystallized from water to form compound 1 as white crystals. (6.1 g, 35.6 mmol, yield 59.4%) was obtained. The 1 H-NMR spectrum chart and the 13 C-NMR spectrum chart of Compound 1 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d 6,400 MHz): δ3.54 (t, 2H, NCH 2 CH 2 , 9.6 Hz), 3.83 (t, 2 H, CH 2 OH, 9.6 Hz), 4.57 (Br, 1H, CHCNH 2 ), 5.09 (br, 1H, OH), 6.61 (br, 2H, NH 2 ), 10.32 (br, 1H, NH)
13 C-NMR (DMSO-d6,100 MHz): δ44.13 (NCH 2 CH 2 ), 59.28 (CH 2 OH), 76.52 (CHCNH 2 ), 151.87, 157.04, 162,89
製造例３：１−（２−ｔ−ブチルジフェニルシラニロキシ）エチル−６−アミノウラシル（化合物２）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた５０ｍＬナス型フラスコに、化合物１（１．０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）、ｔ−ブチルジフェニリルクロロシラン（１．７ｍＬ，６．４ｍｍｏｌ）、イミダゾール（８７５ｍｇ，１２．８ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド６ｍＬを加え、６０℃で１．５時間反応させた後、撹拌している水１Ｌの中に、パスツールピペットを用いてゆっくり滴下した。しばらく撹拌した後、ろ過をし、乾燥させることにより、白色固体として化合物２（２．２ｇ，５．４ｍｍｏｌ，収率９２．０％）を得た。なお、化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートは以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ０．９６（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ３）３），３．７６（ｂｒ，２Ｈ，ＮＣＨ２），４．０４（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），４．６０（ｂｒ，１Ｈ，ＣＨＣＮＨ２），６．７０（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ２），７．４１（ｍ，６Ｈ），７．５８（ｍ，４Ｈ），１０．３２（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）：δ１９．１１（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），２６．９２（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），４２．０６（ＮＣＨ２ＣＨ２），６１．５５（ＮＣＨ２ＣＨ２），７６．１５（ＣＨＣＮＨ２），１２７．９６，１２８．３３，１３０．３３，１３０．０８，１３４．９４，１３５．４８，１５１．８５，１５８．７５，１６２．９４
Production Example 3: Synthesis of 1- (2-t-butyldiphenylsilaniloxy) ethyl-6-aminouracil (Compound 2) Compound 1 (1.0 g) was placed in a 50 mL eggplant-shaped flask equipped with a fluororesin-coated stir bar. , 5.8 mmol), t-butyldiphenylylchlorosilane (1.7 mL, 6.4 mmol), imidazole (875 mg, 12.8 mmol), and 6 mL of dimethylformamide were added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 1.5 hours. It was slowly added dropwise to 1 L of stirring water using a fluoropolymer. After stirring for a while, the mixture was filtered and dried to obtain Compound 2 (2.2 g, 5.4 mmol, yield 92.0%) as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart and the 13 C-NMR spectrum chart of Compound 2 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d6,400 MHz): δ0.96 (s, 9H, C (CH 3 ) 3 ), 3.76 (br, 2H, NCH 2 ), 4.04 (br, 2H, CH 2) OH), 4.60 (br, 1H, CHCNH 2 ), 6.70 (br, 2H, NH 2 ), 7.41 (m, 6H), 7.58 (m, 4H), 10.32 (br) , 1H, NH)
13 C-NMR (DMSO-d6,100 MHz): δ19.11 (SiC (CH 3 ) 3 ), 26.92 (SiC (CH 3 ) 3 ), 42.06 (NCH 2 CH 2 ), 61.55 ( NCH 2 CH 2 ), 76.15 (CHCNH 2 ), 127.96, 128.33, 130.33, 130.08, 134.94, 135.48, 151.85, 158.75, 162.94
製造例４：（６−アミノ−１−［２−（ｔ−ブチルジフェニルシラニロキシ）−エチル］−２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボニル）カルバミン酸エチルエステル（化合物３）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた１００ｍＬナス型フラスコに、化合物２ １３．７ｇ（３３．３ｍｍｏｌ）とジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）を加え、室温下で撹拌しながら滴下漏斗で５３．９ｇ（３３．９ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。その後、室温で２４時間撹拌し、減圧濃縮し、減圧乾燥させ、酢酸エチルで洗浄することにより白色固体として化合物３（７．０ｇ，１３．３ｍｍｏｌ，収率４０．１％）を得た。なお、化合物３の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートは以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ０．９４（ｓ，９Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）３），１．２２（ｔ，３Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ３，７．２Ｈｚ），３．８１（ｂｒ，２Ｈ，ＮＣＨ２，４．８Ｈｚ），４．１２（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ３，４．８Ｈｚ），４．１８（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２，４．８Ｈｚ），７．４２（ｍ，６Ｈ），７．５３（Ｍ，４Ｈ），８．３６（ｂｒ，１Ｈ），１０．８５（ｂｒ，１Ｈ），１１．３５（ｂｒ，１Ｈ），１２．３９（ｂｒ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）：δ１４．６８（ＯＣＨ２ＣＨ３），１９．０５（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），２６．８９（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），４３．１２（ＮＣＨ２），６０．６１（ＯＣＨ２ＣＨ３），６１．１２（ＮＣＨ２ＣＨ２），８１．０６（ＣＯＣＣＯ），１２８．３０，１３０．３９，１３２．９４，１３５．４２，１４８．７７，１５０．７７，１５９．９４，１６４．４５，１６６．２３
Production Example 4: (6-amino-1- [2- (t-butyldiphenylsilaniloxy) -ethyl] -2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carbonyl) carbamate Synthesis of Ethyl Ester (Compound 3) To a 100 mL eggplant-shaped flask equipped with a fluororesin-coated stirrer, 13.7 g (33.3 mmol) of Compound 2 and dimethylformamide (40 mL) were added, and a dropping funnel was added while stirring at room temperature. 53.9 g (33.9 mmol) was added dropwise over 30 minutes. Then, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours, concentrated under reduced pressure, dried under reduced pressure, and washed with ethyl acetate to obtain Compound 3 (7.0 g, 13.3 mmol, yield 40.1%) as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart and the 13 C-NMR spectrum chart of Compound 3 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d 6,400 MHz): δ0.94 (s, 9H, Si (CH 3 ) 3 ), 1.22 (t, 3H, OCH 2 CH 3 , 7.2 Hz), 3.81 ( br, 2H, NCH 2 , 4.8Hz), 4.12 (q, 2H, OCH 2 CH 3 , 4.8Hz), 4.18 (t, 2H, NCH 2 CH 2 , 4.8Hz), 7. 42 (m, 6H), 7.53 (M, 4H), 8.36 (br, 1H), 10.85 (br, 1H), 11.35 (br, 1H), 12.39 (br, 1H) )
13 C-NMR (DMSO-d 6,100 MHz): δ14.68 (OCH 2 CH 3 ), 19.05 (SiC (CH 3 ) 3 ), 26.89 (SiC (CH 3 ) 3 ), 43.12 ( NCH 2 ), 60.61 (OCH 2 CH 3 ), 61.12 (NCH 2 CH 2 ), 81.06 (COCCO), 128.30, 130.39, 132.94, 135.42, 148.77 , 150.77, 159.94, 164.45, 166.23
製造例５：１−［２−（ｔ−ブチルジフェニルシラニロキシ）−エチル］−１Ｈ，８Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２，４，５，７−テトラオン（化合物４）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた５０ｍＬナス型フラスコに、無水エタノール２０ｍＬを加え氷浴中撹拌しながら金属ナトリウム６０ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）を注意深く加え、完全に溶解するまで撹拌した。その後、化合物３ ６００ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）を加え、１７時間還流させた。得られた反応溶液をろ過することにより得られる固体を１．０Ｍ希塩酸で洗い、減圧乾燥させることにより、白色固体として化合物４（５００ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ，収率９１．６％）を得た。なお、化合物４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャートは以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ０．９４（ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３），３．８３（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２），４．２３（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＨ２），７．３８（ｍ，６Ｈ），７．５７（ｍ，４Ｈ），９．７９（ｂｒ，１Ｈ），１０．５３（ｂｒ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）：δ１９．１６（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），２７．０３（ＳｉＣ（ＣＨ３）３），４２．２７（ＮＣＨ２），６１．１２（ＮＣＨ２ＣＨ２），８６．０４（ＣＯＣＣＯ），１２８．２６，１３０．１４，１３３．５６，１３５．４３，１５１．５６，１５７．８６，１６１．６２，１６２．６０，１６４．７８
Production Example 5: 1- [2- (t-butyldiphenylsilaniloxy) -ethyl] -1H, 8H-pyrimid [4,5-d] pyrimidin-2,4,5,7-tetraone (Compound 4) To a 50 mL eggplant-shaped flask equipped with a synthetic fluororesin-coated stirrer, 20 mL of absolute ethanol was added, and 60 mg (2.6 mmol) of metallic sodium was carefully added while stirring in an ice bath, and the mixture was stirred until completely dissolved. Then, 600 mg (1.1 mmol) of compound 3 was added, and the mixture was refluxed for 17 hours. The solid obtained by filtering the obtained reaction solution was washed with 1.0 M dilute hydrochloric acid and dried under reduced pressure to obtain Compound 4 (500 mg, 1.0 mmol, yield 91.6%) as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart and the 13 C-NMR spectrum chart of Compound 4 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d6,400 MHz): δ0.94 (s, 9H, SiC (CH 3 ) 3 ), 3.83 (t, 2H, NCH 2 CH 2 ), 4.23 (t, 2H, NCH 2 CH 2 ), 7.38 (m, 6H), 7.57 (m, 4H), 9.79 (br, 1H), 10.53 (br, 1H)
13 C-NMR (DMSO-d6,100 MHz): δ19.16 (SiC (CH 3 ) 3 ), 27.03 (SiC (CH 3 ) 3 ), 42.27 (NCH 2 ), 61.12 (NCH 2) CH 2 ), 86.04 (COCCO), 128.26, 130.14, 133.56, 135.43, 151.56, 157.86, 161.62, 162.60, 164.78
製造例６：１−ヒドロキシエチル−１Ｈ，８Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２，４，５，７−テトラオン（化合物５）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた１０ｍＬふた付きプラスチック容器に、化合物４ １．７ｇ（３．６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン三フッ化水素酸５ｍＬ（３０．７ｍｍｏｌ）を加え、室温下で２４時間撹拌させた。得られた反応溶液を、２Ｍ ＫＯＨ水溶液の中に、酸性にならないように注意深く加え、最終的に２Ｍ ＨＣｌ水溶液で中和した後にろ過、ジエチルエーテルで洗浄することにより、白色固体として化合物５（７００ｍｇ，２．９ｍｍｏｌ，収率８２．１％）を得た。なお、化合物５の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャート及びＭａｓｓスペクトルチャート（ＥＳＩ）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ３．４９（ｂｒ，２Ｈ，ＮＣＨ２），４．０２（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），４．８８（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），９．４４（ｂｒ，１Ｈ），１０．２０（ｂｒ，１Ｈ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）：δ４０．０４（ＮＣＨ２），５８．８４（ＣＨ２ＯＨ），８６．０５（ＣＯＣＣＯ），１５１．４７，１５７．８７，１６１．３０，１６２．６９，１６４．４５
ＭＳ（ＥＳＩ＋）２４１．０６（Ｍ＋Ｈ＋ｃａｌｃｄ２４１．０５）
Production Example 6: Synthesis of 1-hydroxyethyl-1H, 8H-pyrimid [4,5-d] pyrimidin-2,4,5,7-tetraone (Compound 5) with a 10 mL lid with a fluororesin-coated stir bar To a plastic container, 1.7 g (3.6 mmol) of compound 4 and 5 mL (30.7 mmol) of triethylamine hydrofluoric acid were added, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The obtained reaction solution was carefully added to a 2M KOH aqueous solution so as not to become acidic, and finally neutralized with a 2M HCl aqueous solution, filtered, and washed with diethyl ether to form Compound 5 (700 mg) as a white solid. , 2.9 mmol, yield 82.1%). The 1 H-NMR spectrum chart, 13 C-NMR spectrum chart and Mass spectrum chart (ESI) of Compound 5 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d6,400 MHz): δ3.49 (br, 2H, NCH 2 ), 4.02 (br, 2H, CH 2 OH), 4.88 (br, 1H, OH), 9. 44 (br, 1H), 10.20 (br, 1H)
13 C-NMR (DMSO-d6,100 MHz): δ40.04 (NCH 2 ), 58.84 (CH 2 OH), 86.05 (COCCO), 151.47, 157.87, 161.30, 162. 69,164.45
MS (ESI +) 241.06 (M + H + calcd241.05)
製造例７：２，４，５，７−テトラオキソ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジ−１−ニル酢酸（化合物６）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた１００ｍＬ三つ口フラスコに、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニロキシ，フリーラジカル０．７０ｇ（４．２ｍｍｏｌ）と臭化ナトリウム０．９２ｇ（８．４ｍｍｏｌ）を０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液５ｍＬに加えた。得られた懸濁液に、化合物５ １．０ｇ（４．２ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。反応液に次亜塩素酸ナトリウム１１体積％水溶液５．４ｍＬを加えて２５℃で１．５時間攪拌した。析出した白色固形物を蒸留水３０ｍＬに溶かした水溶液に、０℃でｐＨが１になるまで２Ｍ塩酸を加えた。析出した白色固体を減圧乾燥させ、白色固体として化合物６（０．５３ｇ，収率５０％）を得た。なお、化合物６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルチャート及びＭａｓｓスペクトルチャート（ＥＳＩ）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：δ４．５６（ｂｒ）
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１００ＭＨｚ）：δ４４．６１（ＮＣＨ２），８７．７９（ＣＯＣＣＯ），１５１．８９，１５９．０７，１６１．９７，１６２．４０，１６５．１０，１７４．３０
ＭＳ（ＥＳＩ＋）２５５．０４（Ｍ＋Ｈ＋ｃａｌｃｄ２５５．０３）
Production Example 7: Synthesis of 2,4,5,7-tetraoxo-3,4,5,6,7,8-hexahydro-2H-pyrimid [4,5-d] pyrimidi-1-nylacetic acid (Compound 6) In a 100 mL three-necked flask equipped with a fluororesin-coated stir bar, 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy, 0.70 g (4.2 mmol) of free radicals and 0.92 g (8) of sodium bromide. .4 mmol) was added to 5 mL of a 0.4 M aqueous sodium hydroxide solution. To the obtained suspension, 1.0 g (4.2 mmol) of Compound 5 was added and stirred. 5.4 mL of an 11% by volume aqueous solution of sodium hypochlorite was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 1.5 hours. 2M Hydrochloric acid was added to an aqueous solution prepared by dissolving the precipitated white solid in 30 mL of distilled water at 0 ° C. until the pH became 1. The precipitated white solid was dried under reduced pressure to obtain Compound 6 (0.53 g, yield 50%) as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart, 13 C-NMR spectrum chart and Mass spectrum chart (ESI) of Compound 6 were as follows.
1 H-NMR (D 2 O , 400MHz): δ4.56 (br)
13 C-NMR (D 2 O , 100MHz): δ44.61 (NCH 2), 87.79 (COCCO), 151.89,159.07,161.97,162.40,165.10,174.30
MS (ESI +) 255.04 (M + H + calcd255.03)
製造例８：ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエチル］−Ｎ−［（２，４，５，７−テトラオキソ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジ−１−ニル酢酸（化合物９）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた５０ｍＬナス型フラスコに、上記で得た化合物６（７２３ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−［２−（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエチル］グリシネート（化合物７）１．１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（化合物８）１．１ｇ（５．６ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ（ナカライテスク（株）製）中室温で２４時間撹拌した。得られた反応溶液を減圧濃縮した後、水を加えろ過することにより得られる白色固体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することにより、白色固体としてブチルエステル体（化合物９）（１．３ｇ，２．１ｍｍｏｌ，収率７３．５％）を得た。なお、化合物９の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及びＭａｓｓスペクトルチャート（ＥＳＩ）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ１．３７−１．４５（ｍ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ３）３），３．０９−３．４２（ｍ，４Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ），３．８９−３．９２（ｂｒ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｈ９），４．１４−４．３３（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２ＣＯＯ ａｎｄ Ｆｍｏｃ−ＣＨ２Ｏ），４．７３−４．９４（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＯＮ），７．３０−７．４１（ｍ，５Ｈ，ＮＨＣＯＯ ａｎｄ Ｆｍｏｃ−Ｈ３，Ｈ４，Ｈ５，Ｈ６），７．６６−７．６８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｈ２，Ｈ７），７．８６−７．８８（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−１Ｈ，８Ｈ），１０．１１−１０．９５（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）６３３．２９（Ｍ＋Ｈ＋ｃａｌｃｄ６３３．２３）
Production Example 8: tert-butyl N- [2- (N-9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminoethyl] -N-[(2,4,5,7-tetraoxo-3,4,5,6,7) , 8-Synthesis of 8-hexahydro-2H-pyrimid [4,5-d] pyrimidi-1-nylacetic acid (Compound 9) Compound 6 (723 mg) obtained above was placed in a 50 mL eggplant-shaped flask equipped with a fluororesin-coated stirrer. , 2.8 mmol), tert-butyl N- [2- (N-9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminoethyl] glycinate (Compound 7) 1.1 g (2.8 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) ) -3-Ethylcarbodiimide hydrochloride (Compound 8) 1.1 g (5.6 mmol) was added, and the mixture was stirred in DMF (manufactured by Nakaraitesk Co., Ltd.) at room temperature for 24 hours. The obtained reaction solution was concentrated under reduced pressure and then concentrated. , Water is added and the white solid obtained by filtration is purified by silica gel chromatography to obtain a butyl ester compound (Compound 9) (1.3 g, 2.1 mmol, yield 73.5%) as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart and Mass spectrum chart (ESI) of Compound 9 were as follows.
1 1 H-NMR (DMSO-d 6,500 MHz): δ1.37-1.45 (m, 9H, C (CH 3 ) 3 ), 3.09-3.42 (m, 4H, NHCH 2 CH 2 N) , 3.89-3.92 (br, 1H, Fmoc-H9), 4.14-4.33 (m, 4H, NCH 2 COO and Fmoc-CH 2 O), 4.73-4.94 (m) , 2H, NCH 2 CON), 7.30-7.41 (m, 5H, NHCOO and Fmoc-H3, H4, H5, H6), 7.66-7.68 (m, 2H, Fmoc-H2, H7) ), 7.86-7.88 (m, 2H, Fmoc-1H, 8H), 10.11-10.95 (br, 2H, NH)
MS (ESI +) 633.29 (M + H + calcd633.23)
製造例９：Ｎ−［２−（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエチル］−Ｎ−［（２，４，５，７−テトラオキソ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−２Ｈ−ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジ−１−ニル酢酸（化合物１０）の合成
フッ素樹脂コートした撹拌子を備えた１００ｍＬナス型フラスコに、上記で得た化合物９（１．９ｇ，３．０ｍｍｏｌ）とジクロロメタン１０ｍＬを入れ撹拌しながらトリフルオロ酢酸２０ｍＬ（２５０ｍｍｏｌ）を加え室温で２４時間撹拌した。得られた反応溶液を減圧濃縮した粗生成物をメタノール−ジエチルエーテルで再沈澱させることにより、白色固体として化合物１０（１．５ｇ，２．６ｍｍｏｌ，収率８６．７％）を得た。なお、化合物１０の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルチャート及びＭａｓｓスペクトルチャート（ＥＳＩ）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）：δ３．１０−３．６４（ｍ，４Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ），３．９９（ｂｒ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｈ９），４．２３−４．３７（ｍ，４Ｈ，ＮＣＨ２ＣＯＯ ａｎｄ Ｆｍｏｃ−ＣＨ２Ｏ），４．７９−４．９７（ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ２ＣＯＮ），７．２８−７．４６（ｍ，５Ｈ，ＮＨＣＯＯ ａｎｄ Ｆｍｏｃ−Ｈ３，Ｈ４，Ｈ５，Ｈ６），７．６５−７．６９（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｈ２，Ｈ７），７．８７−７．９１（ｍ，２Ｈ，Ｆｍｏｃ−１Ｈ，８Ｈ），１０．６８（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），１１．１６（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），１２．６６（ｂｒ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）５７７．１９（Ｍ＋Ｈ＋ｃａｌｃｄ５７７．１７）
Production Example 9: N- [2- (N-9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminoethyl] -N-[(2,4,5,7-tetraoxo-3,4,5,6,7,8-) Synthesis of Hexahydro-2H-pyrimid [4,5-d] pyrimidi-1-nylacetic acid (Compound 10) Compound 9 (1.9 g, 1.9 g, obtained above) was placed in a 100 mL eggplant-shaped flask equipped with a fluororesin-coated stir bar. (3.0 mmol) and 10 mL of dichloromethane were added, 20 mL (250 mmol) of trifluoroacetic acid was added with stirring, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The crude product obtained by concentrating the obtained reaction solution under reduced pressure was reprecipitated with methanol-diethyl ether. As a result, compound 10 (1.5 g, 2.6 mmol, yield 86.7%) was obtained as a white solid. The 1 H-NMR spectrum chart and Mass spectrum chart (ESI) of compound 10 are as follows. there were.
1 1 H-NMR (DMSO-d 6,400 MHz): δ3.10-3.64 (m, 4H, NHCH 2 CH 2 N), 3.99 (br, 1H, Fmoc-H9), 4.23-4. 37 (m, 4H, NCH 2 COO and Fmoc-CH 2 O), 4.79-4.97 (m, 2H, NCH 2 CON), 7.28-7.46 (m, 5H, NHCOO and Fmoc-) H3, H4, H5, H6), 7.65-7.69 (m, 2H, Fmoc-H2, H7), 7.87-7.91 (m, 2H, Fmoc-1H, 8H), 10.68 (Br, 1H, NH), 11.16 (br, 1H, NH), 12.66 (br, 1H, COOH)
MS (ESI +) 577.19 (M + H + calcd577.17)
次に、製造例９で合成した化学式（１）で表される１価の基を有するＰＮＡモノマー（化合物１０）及び天然核酸塩基を有するＰＮＡモノマーとして下式のＰＮＡ−Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ（アプライドバイオシステムズジャパン社製、ＰＮＡ−Ａ：ＧＥＮ０６３０１４，ＰＮＡ−Ｇ：ＧＥＮ０６３０１６，ＰＮＡ−Ｃ：ＧＥＮ０６３０１５，ＰＮＡ−Ｔ：ＧＥＮ０６３０１７）（以下「ＰＮＡモノマー」という。）を用いて、下記の製造例１０に従ってポリマー（Ｐ２−１）を、下記の実施例２に従ってポリマー（Ｐ１−１）を結合してなる磁性粒子を、下記の実施例３に従ってポリマー（Ｐ１−２）を結合してなる磁性粒子をそれぞれ合成した。
Ｆｍｏｃ：ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Ｂｈｏｃ：ｂｅｎｚｙｌｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ
Next, PNA monomer (Compound 10) having a monovalent group represented by the chemical formula (1) synthesized in Production Example 9 and PNA-A, G, C and T of the following formulas as PNA monomers having a natural nucleic acid base. (Manufactured by Applied Biosystems Japan, PNA-A: GEN063014, PNA-G: GEN063016, PNA-C: GEN063015, PNA-T: GEN063017) (hereinafter referred to as "PNA monomer"), the following production example 10 The magnetic particles formed by binding the polymer (P2-1) according to the following Example 2, the magnetic particles formed by binding the polymer (P1-1) according to the following Example 2, and the magnetic particles formed by binding the polymer (P1-2) according to the following Example 3. Each was synthesized.
Fmoc: fluorenylmethyloxycarbonyl
Bhoc: benzylhydroxycarbonyl
製造例１０：ポリマー（Ｐ２−１）の合成
ユニバーサル塩基含有オリゴマーを、マニュアル固相合成法にて合成し、固相担体はＴＥＮＴＡ ＧＥＬ Ｓ ＲＡＭ（渡辺化学工業株式会社製、Ａ００２１３、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。合成オリゴマーの溶解性の向上と自己会合の抑制を図るためにリシンを導入した。固相担体を３０体積％ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ／ＤＭＦ処理後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（渡辺化学工業株式会社製、Ｋ００４４３）（１０ｅｑｕｉｖ）、ＰｙＢＯＰ（（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙ）ｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製０１−６２−００１６）（１０ｅｑｕｉｖ）、ＨＯＢｔ（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製１８５１３−２４）（１０ｅｑｕｉｖ）、Ｎメチルモルホリン（ＮＭＭ，２０ｅｑｕｉｖ）をあらかじめジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、富士フィルム和光純薬株式会社製）中で反応させておいたものを用いてカップリングさせることにより、リシンを導入した。反応の進行はＫａｉｓｅｒ ｔｅｓｔにより確認した。（Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ： ｎｅｇａｔｉｖｅ）
Production Example 10: Synthesis of polymer (P2-1) A universal base-containing oligomer is synthesized by a manual solid-phase synthesis method, and the solid-phase carrier is TENTA GEL SRAM (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd., A00213, 0.27 mmol / g) was used. Lysine was introduced to improve the solubility of synthetic oligomers and suppress self-association. After treating the solid phase carrier with 30% by volume piperidine / DMF, Fmoc-Lys (Boc) -OH (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd., K00443) (10equiv), PyBOP ((benzotriazol-1-yloxy) tripylorolidino-phosphophophophophosphionum) 01-62-0016) (10equiv), HOBt (1-hydroxybenzotriazole, Nacalai Tesque 18513-24) (10equiv), N-methylmorpholine (NMM, 20equiv) in advance with dimethylacetamide (DMA, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Ricin was introduced by coupling using what had been reacted in (manufactured by Co., Ltd.). The progress of the reaction was confirmed by Kaiser test. (Kaiser test: negative)
続く固相合成は表１に従って行った。反応は全て室温（２５℃）で行った。 Subsequent solid phase synthesis was carried out according to Table 1. All reactions were carried out at room temperature (25 ° C.).
表１におけるｓｔｅｐ１〜６を繰り返す（８サイクル）ことにより鎖長反応を行った。この鎖長反応において、ＰＮＡモノマー（ＰＮＡ ｍｏｎｏｍｅｒ）として、１−２サイクル目は上記化合物１０を、３サイクル目は、上記ＰＮＡ−Ｃを、４サイクル目は上記ＰＮＡ−Ｇを、５−６サイクル目は上記ＰＮＡ−Ａを、７サイクル目は上記ＰＮＡ−Ｔを、８サイクル目は上記ＰＮＡ−Ａを使用した。 The chain length reaction was carried out by repeating steps 1 to 6 in Table 1 (8 cycles). In this chain length reaction, as a PNA monomer, the compound 10 is used in the 1-2nd cycle, the PNA-C is used in the 3rd cycle, and the PNA-G is used in the 4th cycle for 5-6 cycles. The PNA-A was used for the eyes, the PNA-T was used for the 7th cycle, and the PNA-A was used for the 8th cycle.
各反応の進行は、ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔにより確認した。最後のモノマーを導入・Ｆｍｏｃ基の除去後、Ｎ末端アミノ基のアシル転位からの環状アミド生成による自己崩壊を防ぐために、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社製、０４−１２−１００１）（１０ｅｑｕｉｖ）、ＰｙＢＯＰ（１０ｅｑｕｉｖ）、ＨＯＢｔ（１０ｅｑｕｉｖ）、ＮＭＭ（２０ｅｑｕｉｖ）を用いてグリシンを導入した。固相担体から切り出した後の合成オリゴマーの精製を容易にするために、グリシンのＦｍｏｃ基はそのままにしておいた。
固相担体からの切り出しにはトリフルオロ酢酸を用い、切り出し反応を２時間実施した。これによりＣ末端のリシンのアミノ基を保護しているＢｏｃ基も除去できた。得られたオリゴマーを、逆相分取カラムＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−３００ を用いることにより精製し、構成単位（Ｘ１）及び構成単位（Ｘ２）を必須構成単位として有するポリマー（Ｐ２−１）［Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ−Ｘ１Ｘ１ＣＧＡＡＴＡ−Ｇｌｙ−ＮＨＦｍｏｃ］を得た。
The progress of each reaction was confirmed by the kaiser test. Introducing the last monomer ・ After removing the Fmoc group, Fmoc-Gly-OH (manufactured by NovaBiochem, 04-12-1001) (10equiv) to prevent self-disintegration due to cyclic amide formation from the acyl rearrangement of the N-terminal amino group. , PyBOP (10equiv), HOBt (10equiv), NMM (20equiv) were used to introduce glycine. The Fmoc group of glycine was left intact to facilitate purification of the synthetic oligomer after excision from the solid phase carrier.
Trifluoroacetic acid was used for cutting out from the solid-phase carrier, and the cutting-out reaction was carried out for 2 hours. As a result, the Boc group protecting the amino group of C-terminal lysine could also be removed. The obtained oligomer is purified by using a reverse phase preparative column COSMOSIL 5C 18- AR-300, and a polymer (P2-1) having a structural unit (X 1 ) and a structural unit (X 2) as essential structural units. [H 2 N-Lys-X 1 X 1 CGAATA-Gly-NHFmoc] was obtained.
実施例１：シリカ粒子（Ｃ−１）の作製
１重量％３−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後のシリカ粒子（Ｂ−１）５０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行い、シリカ粒子（Ｂ−１−１）［重量は５０ｍｇであった］を得た。
次いで、化合物６を０．５重量％含有するＤＭＦ溶液１０ｍＬが入った蓋付きポリエチレン瓶に加えた後、０．５重量％塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．５重量％Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）含有水溶液４０ｍＬを加え、２５℃で１時間反応させた。反応後の溶液を、上記で得た洗浄済のシリカ粒子（Ｂ−１−１）の入った蓋付きポリエチレン瓶に加えて、２５℃で３時間反応させた。反応後、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去するシリカ粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行い、シリカ粒子（Ｃ−１）［化学式（１）で表される１価の基が、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（アミド基を除く炭素数：４）を介して結合している磁性粒子］を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 1: Preparation of silica particles (C-1) 50 mg of classified silica particles (B-1) was added to a polyethylene bottle with a lid containing 40 mL of an aqueous solution containing 1 wt% 3-aminopropyltriethoxysilane, and the temperature was 25 ° C. After reacting with the above for 1 hour and collecting the particles with a magnet, the liquid was sucked and removed with an aspirator. Next, 40 mL of deionized water was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This washing operation was performed 4 times to obtain silica particles (B-1-1) [weight was 50 mg].
Then, after adding to a polyethylene bottle with a lid containing 10 mL of a DMF solution containing 0.5% by weight of compound 6, 0.5% by weight 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) hydrochloride And 40 mL of an aqueous solution containing 0.5 wt% N-hydroxysuccinimide (NHS) was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour. The solution after the reaction was added to a polyethylene bottle with a lid containing the washed silica particles (B-1-1) obtained above, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 3 hours. After the reaction, the particles were collected with a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator.
Next, 20 mL of 25 mM morpholinoetan sulfonic acid buffer (pH 5.0) was added to redisperse the particles, and then the particles were collected again with a magnet and the liquid was sucked and removed with an aspirator. did. This washing operation is performed three times, and the silica particle (C-1) [monovalent group represented by the chemical formula (1) may have an amide group in the middle of the chain. Magnetic particles bonded via the number of carbon atoms excluded: 4)] were obtained. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例２：シリカ粒子（Ｃ−２）の作成
製造例１０において、固相担体としてＴＥＮＴＡ ＧＥＬ Ｓ ＲＡＭに代えて、実施例１で製造したシリカ粒子（Ｂ−１−１）を用い、鎖長反応における１−８サイクル目で使用するＰＮＡモノマーを全て化合物１０に変更し、固相担体からの切り出しを実施しなかった以外は、製造例１０と同様にして実施し、構成単位（Ｘ１）を必須構成単位として有するポリマー（Ｐ１−１）が結合してなるシリカ粒子を得た。その後、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去するシリカ粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行い、ポリマー（Ｐ１−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−２）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 2: Preparation of silica particles (C-2) In Production Example 10, the silica particles (B-1-1) produced in Example 1 were used instead of the TENTA GEL SRAM as the solid phase carrier, and the chain length was used. PNA monomers for use in the 1-8 cycle in the reaction was changed to all compounds 10, except that no exemplary cut out from the solid support was performed in the same manner as in preparation example 10, the structural unit (X 1) Silica particles formed by binding a polymer (P1-1) having the above as an essential constituent unit were obtained. Then, after collecting the particles with a magnet, the liquid was attracted and removed with an aspirator.
Next, 20 mL of 25 mM morpholinoetan sulfonic acid buffer (pH 5.0) was added to redisperse the particles, and then the particles were collected again with a magnet and the liquid was sucked and removed with an aspirator. did. This washing operation was performed three times to obtain silica particles (C-2) to which the polymer (P1-1) was bonded. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例３：シリカ粒子（Ｃ−３）の作成
製造例１０において、固相担体としてＴＥＮＴＡ ＧＥＬ Ｓ ＲＡＭに代えて、実施例１で製造したシリカ粒子（Ｂ−１−１）を用い、鎖伸長反応（表１におけるｓｔｅｐ１〜６）を繰り返す回数を、８サイクルから、２２サイクルに変更し、鎖長反応における１−２２サイクル目で使用するＰＮＡモノマーを全て化合物１０に変更し、固相担体からの切り出しを実施しなかった以外は、製造例１０と同様にして実施し、構成単位（Ｘ１）を必須構成単位として有するポリマー（Ｐ１−２）が結合してなるシリカ粒子を得た。その後、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去するシリカ粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行い、ポリマー（Ｐ１−２）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−３）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 3: Preparation of Silica Particles (C-3) In Production Example 10, the silica particles (B-1-1) produced in Example 1 were used instead of the TENTA GEL SRAM as the solid phase carrier, and the chain was extended. The number of repetitions of the reaction (steps 1 to 6 in Table 1) was changed from 8 cycles to 22 cycles, all PNA monomers used in the 1st to 22nd cycles in the chain length reaction were changed to compound 10, and the solid phase carrier was used. The silica particles formed by binding the polymer (P1-2) having the constituent unit (X 1 ) as an essential constituent unit were obtained by carrying out the same procedure as in Production Example 10 except that the cutout was not carried out. Then, after collecting the particles with a magnet, the liquid was attracted and removed with an aspirator.
Next, 20 mL of 25 mM morpholinoetan sulfonic acid buffer (pH 5.0) was added to redisperse the particles, and then the particles were collected again with a magnet and the liquid was sucked and removed with an aspirator. did. This washing operation was performed three times to obtain silica particles (C-3) to which the polymer (P1-2) was bonded. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例４：シリカ粒子（Ｃ−４）の作成
製造例１の＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞において、水１０００部洗浄する操作と、アセトン１０００部で洗浄する操作との間に、イソプロピルアルコール１０００部を加えて遠心分離８００ｒｐｍで１分処理し上澄みを回収する操作を追加した（回収した上澄みについて、前記のアセトン１０００部で洗浄する操作を実施した）以外は、製造例１の＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞と同様に実施して、体積平均粒子径が８ｎｍの磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を得た。
製造例１のその後の操作において、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）に代えて、磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を用いた以外は、製造例１と同様に実施して、磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を８０重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−２）［シリカ粒子（ＰＢ−２）から得た磁性粒子］を得た。
次に、実施例１において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−２）を用いた以外は、実施例１と同様に実施して、シリカ粒子（Ｃ−４）［化学式（１）で表される１価の基が、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（アミド基を除く炭素数：４）を介して結合している磁性粒子］を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 4: Preparation of Silica Particles (C-4) In <Preparation of Magnetic Metal Oxide Particles (A)> of Production Example 1, between the operation of washing 1000 parts of water and the operation of washing with 1000 parts of acetone. , 1000 parts of isopropyl alcohol was added and treated at 800 rpm for 1 minute for centrifugation to recover the supernatant (the collected supernatant was washed with 1000 parts of acetone described above). The same procedure as <Preparation of Magnetic Metal Oxide Particles (A)> was carried out to obtain magnetic metal oxide particles (A-2) having a volume average particle diameter of 8 nm.
In the subsequent operation of Production Example 1, the same procedure as in Production Example 1 was carried out except that the magnetic metal oxide particles (A-2) were used instead of the magnetic metal oxide particles (A-1). Silica particles (B-2) [magnetic particles obtained from silica particles (PB-2)] containing 80% by weight of metal oxide particles (A-2) were obtained.
Next, in Example 1, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the silica particles (B-2) were used instead of the silica particles (B-1), and the silica particles (C-4) [ Magnetic particles in which the monovalent group represented by the chemical formula (1) is bonded via a hydrocarbon chain (the number of carbon atoms excluding the amide group: 4) which may have an amide group in the middle of the chain] Got This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例５：シリカ粒子（Ｃ−５）の作成
製造例１の＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞において、水１０００部洗浄する操作と、アセトン１０００部で洗浄する操作との間に、イソプロピルアルコール１０００部を加えて遠心分離８００ｒｐｍで１分処理し沈降部を回収する操作を追加した（回収した沈降部について、前記のアセトン１０００部で洗浄する操作を実施した）以外は、製造例１の＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の作製＞と同様に実施して、体積平均粒子径が２８ｎｍの磁性金属酸化物粒子（Ａ−３）を得た。
製造例１のその後の操作において、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）に代えて、磁性金属酸化物粒子（Ａ−３）を用いた以外は、製造例１と同様に実施して、磁性金属酸化物粒子（Ａ−３）を８２重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−３）［シリカ粒子（ＰＢ−３）から得た磁性粒子］を得た。
次に、実施例１において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−３）を用いた以外は、実施例１と同様に実施して、シリカ粒子（Ｃ−５）［化学式（１）で表される１価の基が、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（アミド基を除く炭素数：４）を介して結合している磁性粒子］を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 5: Preparation of Silica Particles (C-5) In <Preparation of Magnetic Metal Oxide Particles (A)> of Production Example 1, between the operation of washing 1000 parts of water and the operation of washing with 1000 parts of acetone. , 1000 parts of isopropyl alcohol was added and treated at 800 rpm for 1 minute for centrifugation to recover the sedimented portion (the recovered sedimented portion was washed with 1000 parts of acetone described above). The same procedure as in <Preparation of Magnetic Metal Oxide Particles (A)> in 1 was carried out to obtain magnetic metal oxide particles (A-3) having a volume average particle diameter of 28 nm.
In the subsequent operation of Production Example 1, the same procedure as in Production Example 1 was carried out except that the magnetic metal oxide particles (A-3) were used instead of the magnetic metal oxide particles (A-1). Silica particles (B-3) [magnetic particles obtained from silica particles (PB-3)] containing 82% by weight of metal oxide particles (A-3) were obtained.
Next, in Example 1, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the silica particles (B-3) were used instead of the silica particles (B-1), and the silica particles (C-5) [ Magnetic particles in which the monovalent group represented by the chemical formula (1) is bonded via a hydrocarbon chain (the number of carbon atoms excluding the amide group: 4) which may have an amide group in the middle of the chain] Got This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例６：シリカ粒子（Ｃ−６）の作成
製造例１の＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞において、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）８０部に代えて、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）６５部用いた以外は、製造例１の以降の操作と同様に実施して、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を６５重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−４）［シリカ粒子（ＰＢ−４）から得た磁性粒子］を得た。
次に、１重量％３−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後のシリカ粒子（Ｂ−４）５０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行い、シリカ粒子（Ｂ−４−１）［重量は５０ｍｇであった］を得た。
次に、実施例２において、シリカ粒子（Ｂ−１−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−４−１）を用いた以外は、実施例２と同様に実施して、ポリマー（Ｐ１−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−６）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 6: Preparation of Silica Particles (C-6) In <Preparation of Silica Particles (PB)> of Production Example 1, instead of 80 parts of the magnetic metal oxide particles (A-1), the magnetic metal oxide particles ( A-1) Silica particles (B-4) [silica] containing 65% by weight of magnetic metal oxide particles (A-1) were carried out in the same manner as in the subsequent operations of Production Example 1 except that 65 parts were used. Magnetic particles obtained from particles (PB-4)] were obtained.
Next, 50 mg of the classified silica particles (B-4) were added to a polyethylene bottle with a lid containing 40 mL of a 1 wt% 3-aminopropyltriethoxysilane-containing aqueous solution, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and the particles were magnetized. After magnetizing, the liquid was sucked and removed with an aspirator. Next, 40 mL of deionized water was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This washing operation was performed 4 times to obtain silica particles (B-4-1) [weight was 50 mg].
Next, in Example 2, the same procedure as in Example 2 was carried out except that silica particles (B-4-1) were used instead of silica particles (B-1-1), and the polymer (P1-1) was used. Silica particles (C-6) formed by binding 1) were obtained. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例７：シリカ粒子（Ｃ−７）の作成
製造例１の＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞において、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）８０部に代えて、前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）９０部用いた以外は、製造例１の以降の操作と同様に実施して、磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を９０重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−５）［シリカ粒子（ＰＢ−５）から得た磁性粒子］を得た。
次に、１重量％３−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後のシリカ粒子（Ｂ−５）５０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行い、シリカ粒子（Ｂ−５−１）［重量は５０ｍｇであった］を得た。
次に、実施例２において、シリカ粒子（Ｂ−１−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−５−１）を用いた以外は、実施例２と同様に実施して、ポリマー（Ｐ１−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−７）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 7: Preparation of Silica Particles (C-7) In <Preparation of Silica Particles (PB)> of Production Example 1, the above-mentioned magnetic metal oxide was used instead of 80 parts of the magnetic metal oxide particles (A-1). Silica particles (B-5) containing 90% by weight of magnetic metal oxide particles (A-2) were carried out in the same manner as in the subsequent operations of Production Example 1 except that 90 parts of the particles (A-2) were used. [Magnetic particles obtained from silica particles (PB-5)] were obtained.
Next, 50 mg of the classified silica particles (B-5) were added to a polyethylene bottle with a lid containing 40 mL of a 1 wt% 3-aminopropyltriethoxysilane-containing aqueous solution, reacted at 25 ° C. for 1 hour, and the particles were magnetized. After magnetizing, the liquid was sucked and removed with an aspirator. Next, 40 mL of deionized water was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This washing operation was performed 4 times to obtain silica particles (B-5-1) [weight was 50 mg].
Next, in Example 2, the same procedure as in Example 2 was carried out except that silica particles (B-5-1) were used instead of silica particles (B-1-1), and the polymer (P1-) was used. Silica particles (C-7) formed by binding 1) were obtained. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例８：シリカ粒子（Ｃ−８）の作成
製造例１の＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞で得られたシリカ粒子（ＰＢ−１）を含有する固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２８００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上澄み液を回収する操作を４回行った（遠心分離工程１’）。
その後、水５０００部を加えてシリカ粒子を分散させた後に、磁石を用いて粒子を集磁し、上澄み液を除去する操作を１０回（洗浄工程１）行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）を８０重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−６）を得た。
次に、実施例１において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−６）を用いた以外は、実施例１と同様に実施して、シリカ粒子（Ｃ−８）［化学式（１）で表される１価の基が、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（アミド基を除く炭素数：４）を介して結合している磁性粒子］を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 8: Preparation of silica particles (C-8) 5000 parts of water is added to the solid phase containing the silica particles (PB-1) obtained in <Preparation of silica particles (PB)> of Production Example 1 to add particles. Was dispersed and centrifuged at 2800 rpm for 1 minute, and then the operation of collecting the supernatant liquid in which the fine particles were present was performed four times (centrifugation step 1').
Then, after adding 5000 parts of water to disperse the silica particles, the operation of collecting the particles using a magnet and removing the supernatant liquid was performed 10 times (cleaning step 1), and the magnetic metal oxide particles (A-). Silica particles (B-6) containing 80% by weight of 1) were obtained.
Next, in Example 1, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the silica particles (B-6) were used instead of the silica particles (B-1), and the silica particles (C-8) [ Magnetic particles in which the monovalent group represented by the chemical formula (1) is bonded via a hydrocarbon chain (the number of carbon atoms excluding the amide group: 4) which may have an amide group in the middle of the chain] Got This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例９：シリカ粒子（Ｃ−９）の作成
製造例１の＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞において、磁性金属酸化物粒子（Ａ−１）に代えて、前記の磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を用いたこと以外は、製造例１の＜シリカ粒子（ＰＢ）の作製＞と同様に実施して、シリカ粒子（ＰＢ−２）［実施例３におけるシリカ粒子（ＰＢ−２）と同じ］を得た。
得られたシリカ粒子（ＰＢ−２）を含有する固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて２８００ｒｐｍで１分間遠心分離後、微粒子の存在する上澄み液を除く操作を４回行った（遠心分離工程１）。
続いて、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上澄み液を除去することで、沈降した大きな粒子径の粒子を回収する操作を１回行った（遠心分離工程２’）。
その後、水５０００部を加えてシリカ粒子を分散させた後に、磁石を用いて粒子を集磁し、上澄み液を除去する操作を１０回（洗浄工程１）行い、磁性金属酸化物粒子（Ａ−２）を８０重量％含有するシリカ粒子（Ｂ−７）を得た。
次に、実施例１において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、シリカ粒子（Ｂ−７）を用いた以外は、実施例１と同様に実施して、シリカ粒子（Ｃ−９）［化学式（１）で表される１価の基が、鎖の途中にアミド基を有していても良い炭化水素鎖（アミド基を除く炭素数：４）を介して結合している磁性粒子］を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 9: Preparation of Silica Particles (C-9) In <Preparation of Silica Particles (PB)> of Production Example 1, the above-mentioned magnetic metal oxide particles (A-1) are replaced with the magnetic metal oxide particles (A-1). Except for the use of A-2), the same procedure as <Preparation of silica particles (PB)> in Production Example 1 was carried out, and the silica particles (PB-2) [Silica particles (PB-2) in Example 3) were carried out. Same as] was obtained.
5000 parts of water was added to the solid phase containing the obtained silica particles (PB-2) to disperse the particles, and the particles were centrifuged at 2800 rpm for 1 minute, and then the supernatant liquid containing the fine particles was removed four times (). Centrifugation step 1).
Subsequently, 5000 parts of water is added to the obtained solid phase to disperse the particles, and the particles are centrifuged at 600 rpm for 1 minute to remove the supernatant liquid, thereby recovering the precipitated particles having a large particle size once. (Centrifugation step 2').
Then, after adding 5000 parts of water to disperse the silica particles, the operation of collecting the particles using a magnet and removing the supernatant liquid was performed 10 times (cleaning step 1), and the magnetic metal oxide particles (A-). Silica particles (B-7) containing 80% by weight of 2) were obtained.
Next, in Example 1, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the silica particles (B-7) were used instead of the silica particles (B-1), and the silica particles (C-9) [ Magnetic particles in which the monovalent group represented by the chemical formula (1) is bonded via a hydrocarbon chain (the number of carbon atoms excluding the amide group: 4) which may have an amide group in the middle of the chain] Got This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例１０：シリカ粒子（Ｃ−１０）の作成
１重量％３−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に分級後のシリカ粒子（Ｂ−１）５ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
次いで、この洗浄後のシリカ粒子を０．５重量％無水コハク酸含有エタノール溶液１０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のシリカ粒子を０．５重量％塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．５重量％Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。
次に、２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０ｍＬ加えて粒子を再分散させた後、再び磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去する粒子の洗浄操作を実施した。この洗浄操作を３回行った。
更にこの洗浄後のシリカ粒子を、ポリマー（Ｐ２−１）を２０μｇ／ｍＬの濃度で含むジメチルスルホキシド溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で３時間反応させた。反応後、磁石で粒子を集磁し、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで２５ｍＭモルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を２０ｍＬ加えてシリカ粒子を分散させ、磁石で粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去してシリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行い、ポリマー（Ｐ２−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−１０）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 10: Preparation of silica particles (C-10) 5 mg of the classified silica particles (B-1) were added to a polyethylene bottle with a lid containing 40 mL of an aqueous solution containing 1 wt% 3-aminopropyltriethoxysilane, and the temperature was 25 ° C. After reacting with the above for 1 hour and collecting the particles with a magnet, the liquid was sucked and removed with an aspirator. Next, 40 mL of deionized water was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This cleaning operation was performed four times.
Then, the washed silica particles were added to a polyethylene bottle with a lid containing 10 mL of an ethanol solution containing 0.5 wt% succinic anhydride, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 2 hours. Next, 40 mL of deionized water was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This cleaning operation was performed three times.
Next, the washed silica particles were mixed with 40 mL of an aqueous solution containing 0.5 wt% 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and 0.5 wt% N-hydroxysuccinimide (NHS). In addition to a polyethylene bottle with a lid containing, the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour. Then, after collecting the particles with a magnet, the liquid was attracted and removed with an aspirator.
Next, 20 mL of 25 mM morpholinoetan sulfonic acid buffer (pH 5.0) was added to redisperse the particles, and then the particles were collected again with a magnet and the liquid was sucked and removed with an aspirator. .. This cleaning operation was performed three times.
Further, the washed silica particles were added to a polyethylene bottle with a lid containing 40 mL of a dimethyl sulfoxide solution containing a polymer (P2-1) at a concentration of 20 μg / mL, and reacted at 25 ° C. for 3 hours. After the reaction, the particles were collected with a magnet and the liquid was attracted and removed with an aspirator. Next, 20 mL of 25 mM morpholinoetan sulfonic acid buffer (pH 5.0) was added to disperse the silica particles, the particles were collected by a magnet, and the liquid was attracted and removed with an aspirator to wash the silica particles. This washing operation was performed three times to obtain silica particles (C-10) to which the polymer (P2-1) was bonded. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例１１：シリカ粒子（Ｃ−１１）の作成
実施例１０において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、前記のシリカ粒子（Ｂ−２）を用いた以外は、実施例１０と同様に実施して、ポリマー（Ｐ２−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−１１）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 11: Preparation of silica particles (C-11) In Example 10, the same as in Example 10 except that the silica particles (B-2) were used instead of the silica particles (B-1). This was carried out to obtain silica particles (C-11) to which the polymer (P2-1) was bonded. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
実施例１２：シリカ粒子（Ｃ−１２）の作成
実施例１０において、シリカ粒子（Ｂ−１）に代えて、前記のシリカ粒子（Ｂ−３）を用いた以外は、実施例１０と同様に実施して、ポリマー（Ｐ２−１）が結合してなるシリカ粒子（Ｃ−１２）を得た。これを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに浸漬し４℃で保存した。
Example 12: Preparation of silica particles (C-12) In Example 10, the same as in Example 10 except that the silica particles (B-3) were used instead of the silica particles (B-1). This was carried out to obtain silica particles (C-12) to which the polymer (P2-1) was bonded. This was immersed in 50 mL of 0.02 M phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Corporation) and stored at 4 ° C.
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の体積平均粒子径の測定方法＞
走査型電子顕微鏡（型番：ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名：日本電子株式会社）を用いて、任意の２００個の磁性金属酸化物粒子（Ａ）を観察して粒子径を測定し、体積平均粒子径を求めた。結果は表２に記載した。
<Measuring method of volume average particle diameter of magnetic metal oxide particles (A)>
Using a scanning electron microscope (model number: JSM-7000F, manufacturer name: JEOL Ltd.), observe and measure the particle size of any 200 magnetic metal oxide particles (A), and measure the volume average particle size. Asked. The results are shown in Table 2.
＜磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合の測定方法＞
各製造例及び実施例で得たシリカ粒子（Ｂ）の任意の２０個について、走査型電子顕微鏡（型番：ＪＳＭ−７０００Ｆ、メーカー名：日本電子株式会社）で観察し、エネルギー分散型Ｘ線分光装置（型番ＩＮＣＡ Ｗａｖｅ／Ｅｎｅｒｇｙ、メーカー名オックスフォード社）により磁性金属酸化物粒子（Ａ）の含有量を測定してその平均値を含有量Ｓとした。また、同測定にてシリカの含有量を測定しその平均値を含有量Ｔとした。以下の計算式にて、磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合を求めた。結果は表２に記載した。
磁性金属酸化物粒子（Ａ）の重量割合（重量％）＝［（Ｓ）／（Ｓ＋Ｔ）］×１００
<Measuring method of weight ratio of magnetic metal oxide particles (A)>
Arbitrary 20 silica particles (B) obtained in each production example and example were observed with a scanning electron microscope (model number: JSM-7000F, manufacturer name: JEOL Ltd.), and energy dispersive X-ray spectroscopy was performed. The content of the magnetic metal oxide particles (A) was measured by an apparatus (model number INCA Wave / Energy, manufacturer name Oxford), and the average value was taken as the content S. Further, the silica content was measured by the same measurement, and the average value thereof was taken as the content T. The weight ratio of the magnetic metal oxide particles (A) was determined by the following formula. The results are shown in Table 2.
Weight ratio (weight%) of magnetic metal oxide particles (A) = [(S) / (S + T)] × 100
＜シリカ粒子（Ｂ）の体積平均粒子径の測定方法＞
シリカ粒子（Ｂ）の体積平均粒子径は、各製造例及び実施例で得たシリカ粒子（Ｂ）５ｍｇを０．１重量％のＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ ＣＥ５１０（ＪＳＲ（株）製）を含有する０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＬに分散させた液を試料とし、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）を用いて測定した。結果は表２に記載した。
<Measuring method of volume average particle size of silica particles (B)>
The volume average particle size of the silica particles (B) is 0.02 M phosphorus containing 5 mg of the silica particles (B) obtained in each production example and the example and 0.1% by weight of Blockmaster CE510 (manufactured by JSR Co., Ltd.). A solution dispersed in 50 mL of an acid buffer (pH 7.2) was used as a sample, and measurement was performed using a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (“Microtrack MT3300” manufactured by Microtrack Bell Co., Ltd.). The results are shown in Table 2.
＜シリカ粒子（Ｃ）の体積平均粒子径の測定方法＞
シリカ粒子（Ｃ）の体積平均粒子径は、各実施例で得たシリカ粒子（Ｃ）を含有するリン酸緩衝液を試料とし、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル株式会社製「マイクロトラックＭＴ３３００」）を用いて測定した。結果は表２及び表３に記載した。
<Measuring method of volume average particle size of silica particles (C)>
The volume average particle size of the silica particles (C) is determined by using a phosphate buffer solution containing the silica particles (C) obtained in each example as a sample, and a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (Microtrac Bell Co., Ltd.). It was measured using a company-made "Microtrack MT3300"). The results are shown in Tables 2 and 3.
＜実施例１３〜２１及び比較例１：シリカ粒子（Ｃ）を用いたＤＮＡの分離＞
上記の実施例で得たシリカ粒子（Ｃ−１）〜（Ｃ−９）、又は、シリカ粒子（Ｂ−１）［比較用の粒子（Ｃ’−１）として用いた］を用いて、以下の方法で、試料（Ｅ）中の核酸の分離を実施した。
<Examples 13 to 21 and Comparative Example 1: Separation of DNA using silica particles (C)>
Using the silica particles (C-1) to (C-9) obtained in the above examples, or the silica particles (B-1) [used as comparative particles (C'-1)], the following The nucleic acid in the sample (E) was separated by the method of.
［シリカ粒子（Ｃ）の回収］
１）各実施例で得たシリカ粒子（Ｃ）を含有するリン酸緩衝液から、磁石により回収したシリカ粒子（Ｃ）２９６ｍｇをガラス製容器に入れ、１０ｍＬの純水をサンプル瓶に加えた後にボルテックス・ミキサーで撹拌することで、シリカ粒子（Ｃ）の分散液を得た。
２）１．５ｍＬマイクロチューブに３４０μＬのシリカ粒子（Ｃ）の分散液を採取し、マイクロチューブの外側から磁石を接触させることにより、粒子を集磁し、そのまま上澄み液を除去した。
[Recovery of silica particles (C)]
1) From the phosphate buffer solution containing the silica particles (C) obtained in each example, 296 mg of the silica particles (C) recovered by a magnet is placed in a glass container, and 10 mL of pure water is added to the sample bottle. A dispersion of silica particles (C) was obtained by stirring with a vortex mixer.
2) A dispersion of 340 μL of silica particles (C) was collected in a 1.5 mL microtube, and the particles were collected by bringing a magnet into contact with the outside of the microtube, and the supernatant was removed as it was.
［複合体形成工程］
３）ＤＮＡ水溶液〔ＤＮＡ［デオキシリボ核酸、サケ***由来、富士フィルム和光純薬（株）製］を４００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌ及びＢＳＡ水溶液〔ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を４００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌの混合液を試料（Ｅ）［分離精製の対象となる核酸及び不純物としてのＢＳＡを含有する試料］として、２）で得たマイクロチューブに加えた。
また、比較例１においてのみ、カオトロピック塩水溶液〔表２に記載した種類のカオトロピック塩を６Ｍとなるように、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］で溶解させた水溶液〕９００μｌを、上記の操作で得たマイクロチューブに追加で加えた。
４）振とう培養器を用いて、３）で得たマイクロチューブを振とうし（３７℃、３５０ｒｐｍ、２．０時間）、室温にて０．５時間静置した後に複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を得た。
[Complex formation step]
3) Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 10 mM, ethylenediamine tetraacetic acid] containing an aqueous DNA solution [DNA [deoxyribonucleic acid, derived from salmon semen, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] at a concentration of 400 μg / ml. Aqueous solution dissolved in tetrasodium: 2 mM, pH 7.86] 150 μl and BSA aqueous solution [BSA (bovine serum albumin) at a concentration of 400 μg / ml] Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 10 mM, ethylenediamine A mixed solution of 150 μl of an aqueous solution dissolved in tetrasodium tetraacetate: 2 mM, pH 7.86] was obtained as sample (E) [sample containing nucleic acid to be separated and purified and BSA as an impurity] in 2). Added to microtubes.
Further, only in Comparative Example 1, an aqueous solution of chaotropic salt [Tris-EDTA Buffer [(Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 10 mM, tetrasodium ethylenediaminetetraacetate: 10 mM, so that the chaotropic salt of the type shown in Table 2 is 6 M): An aqueous solution [2 mM, pH 7.86] dissolved] 900 μl was additionally added to the microtube obtained by the above procedure.
4) Using a shaking incubator, shake the microtube obtained in 3) (37 ° C., 350 rpm, 2.0 hours), allow it to stand at room temperature for 0.5 hours, and then the complex (C-DNA). ) Was obtained.
［複合体分離工程］
５）４）で得たマイクロチューブの外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去した。次いで、７０体積％エタノール水溶液９００μＬを加えて粒子を分散させた後に、容器の外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去する洗浄操作を１０回繰り返した。これにより、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）を回収した。
[Complex separation step]
5) By contacting a magnet from the outside of the microtube obtained in 4), the complex (C-DNA) was magnetized and the supernatant was removed as it was. Next, 900 μL of a 70% by volume ethanol aqueous solution was added to disperse the particles, and then a magnet was brought into contact with the particles from the outside of the container to collect the complex (C-DNA) and remove the supernatant as it was. Repeated 10 times. As a result, the complex (C-DNA) was recovered.
［解離工程］
実施例１３〜２１においては、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：１０ｍＭ、ｐＨ７．８６］を、５）で得たマイクロチューブに４００μＬ加え、振とう培養器を用いて、マイクロチューブを振とうし（７０℃、３５０ｒｐｍ、１０分）複合体（Ｃ−ＤＮＡ）からＤＮＡ等を解離させた。その後、磁石でシリカ粒子（Ｃ）を集磁し、上澄み液をピペットで取り出し、ＤＮＡ等を含有する溶液を回収した。
また、比較例１においては、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：１０ｍＭ、ｐＨ７．８６］を、５）で得たマイクロチューブに４００μＬ加え、５分ごとに１５秒間ボルテックス・ミキサーで撹拌する操作を３回繰り返すことで、複合体（Ｃ−ＤＮＡ）からＤＮＡ等を解離させた。その後、磁石でシリカ粒子（Ｃ）を集磁し、上澄み液をピペットで取り出し、ＤＮＡ等を含有する溶液を回収した。
[Dissociation process]
In Examples 13 to 21, 400 μL of Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 50 mM, tetrasodium ethylenediaminetetraacetate: 10 mM, pH 7.86] was added to the microtube obtained in 5) and shaken. Using an incubator, the microtube was shaken (70 ° C., 350 rpm, 10 minutes) to dissociate DNA and the like from the complex (C-DNA). Then, the silica particles (C) were collected with a magnet, the supernatant was taken out with a pipette, and the solution containing DNA and the like was recovered.
Further, in Comparative Example 1, 400 μL of Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 50 mM, tetrasodium ethylenediaminetetraacetate: 10 mM, pH 7.86] was added to the microtube obtained in 5) for 5 minutes. DNA and the like were dissociated from the complex (C-DNA) by repeating the operation of stirring with a vortex mixer for 15 seconds each time. Then, the silica particles (C) were collected with a magnet, the supernatant was taken out with a pipette, and the solution containing DNA and the like was recovered.
＜ＤＮＡ濃度及びＢＳＡ濃度の測定＞
［測定前処理］
［解離工程］の操作で回収した溶液１００μＬを、脱塩・バッファー交換用自然落下カラム（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア社製）に全量滴下した後、純水を溶出液として用いて、ＤＮＡ濃度測定用及びＢＳＡ濃度測定用の試料を得た。
具体的には、まず、［解離工程］の操作で回収した溶液１００μＬを前記のカラムに添加した。その後、溶出液として純水１，１００μＬをカラムに添加し、自然落下して得られる溶出液を、マイクロチューブで回収する操作を６回繰り返した。なお、回収に用いるマイクロチューブは毎回交換した。
ＤＮＡが溶出される３〜６回目の操作時に得られるマイクロチューブ中の溶液を、２００μＬずつ抜き取り、等積混合を行って得られたＤＮＡ溶液の濃度を以下の方法で測定した。
同様に、ＢＳＡが溶出される３〜６回目の操作時に得られるマイクロチューブ中の溶液２００μＬずつを抜き取り、等積混合を行って得られたＢＳＡ溶液の濃度を以下の方法で測定した。
<Measurement of DNA concentration and BSA concentration>
[Measurement pretreatment]
After dropping 100 μL of the solution recovered by the operation of [Dissociation step] onto a natural drop column (PD-10, manufactured by GE Healthcare) for desalination / buffer replacement, pure water is used as an eluate to concentrate the DNA. Samples for measurement and BSA concentration measurement were obtained.
Specifically, first, 100 μL of the solution recovered by the operation of [Dissociation step] was added to the above column. Then, 1,100 μL of pure water was added to the column as an eluate, and the operation of collecting the eluate obtained by free fall with a microtube was repeated 6 times. The microtube used for recovery was replaced every time.
200 μL of the solution in the microtube obtained during the 3rd to 6th operations in which the DNA was eluted was withdrawn, and equal volume mixing was performed, and the concentration of the obtained DNA solution was measured by the following method.
Similarly, 200 μL of each solution in the microtube obtained during the 3rd to 6th operations in which BSA was eluted was extracted, and equal volume mixing was performed, and the concentration of the obtained BSA solution was measured by the following method.
［ＤＮＡ濃度の測定］
紫外可視分光光度計ＵＶ−１８００（株式会社島津製作所製）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
濃度既知のＤＮＡ［デオキシリボ核酸、サケ***由来、富士フィルム和光純薬（株）製］標準液を用いた場合のＤＮＡ濃度と吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記ＤＮＡの濃度を求めた。この値を元に、［解離工程］の操作で回収した溶液中のＤＮＡ濃度を換算して求めた値を表２に記載する。
[Measurement of DNA concentration]
The absorbance at 260 nm was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer UV-1800 (manufactured by Shimadzu Corporation).
A calibration curve showing the relationship between the DNA concentration and the absorbance when a standard solution of DNA with a known concentration [deoxyribonucleic acid, derived from salmon semen, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] was prepared, and the calibration curve was used. The concentration of the above DNA was determined. Based on this value, Table 2 shows the value obtained by converting the DNA concentration in the solution recovered by the operation of [Dissociation step].
［ＢＳＡ濃度の測定］
Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液とＲｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液とＲｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液とを２５：２４：１の比率で混合し、混合液（Ｍ）を得た。
ＢＳＡ溶液１００μＬに混合液（Ｍ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、静置後の混合物を９６穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１穴につき１００μＬを分注し、次いで５６２ｎｍの吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＡ−３２）を用いて吸光度を測定した。
濃度既知のＢＳＡ標準液を用いた場合の吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記ＢＳＡの濃度を求めた。この値を元に、［解離工程］の操作で回収した溶液中のＢＳＡ濃度を換算して求めた値を表２に記載する。
また、以下の計算で求めた純度（％）についても、表２に記載した。
純度（％）＝ＤＮＡ濃度／（ＤＮＡ濃度＋ＢＳＡ濃度）×１００
[Measurement of BSA concentration]
A reagent A solution, a reagent B solution and a reagent C solution of Micro BCATM protein assay kit (manufactured by THERMO Fisher Scientific) were mixed at a ratio of 25:24: 1 to obtain a mixed solution (M).
100 μL of the mixed solution (M) was added to 100 μL of the BSA solution, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours.
After 2 hours, the mixture after standing was dispensed into a 96-well plate (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) at 100 μL per hole, and then a plate reader (MTA-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) was used with an absorbance of 562 nm. The absorbance was measured.
A calibration curve showing the relationship with the absorbance when a BSA standard solution having a known concentration was used was prepared, and the concentration of the BSA was determined using the calibration curve. Based on this value, Table 2 shows the value obtained by converting the BSA concentration in the solution recovered by the operation of [Dissociation step].
The purity (%) obtained by the following calculation is also shown in Table 2.
Purity (%) = DNA concentration / (DNA concentration + BSA concentration) x 100
表２の通り、本発明の方法では、カオトロピック塩等の添加物を使用しなくても、核酸の分離精製が可能であった。更に、本発明の方法で得た核酸を含む溶液は、比較用の粒子でカオトロピック塩を使用する方法で得た核酸を含む溶液と比較して、核酸以外の物質（ＢＳＡ）の含有量が少なく、純度の高い溶液であることがわかる。 As shown in Table 2, in the method of the present invention, nucleic acid separation and purification was possible without using additives such as chaotropic salts. Furthermore, the nucleic acid-containing solution obtained by the method of the present invention has a lower content of substances other than nucleic acid (BSA) as compared with the nucleic acid-containing solution obtained by the method using a chaotropic salt with comparative particles. , It can be seen that it is a highly pure solution.
＜実施例２２〜２４：シリカ粒子（Ｃ）を用いたマイクロＲＮＡの分離＞
上記の実施例で得たシリカ粒子（Ｃ−１０）、（Ｃ−１１）又は（Ｃ−１２）を用いて、以下の方法で、２種類の試料（Ｅ）それぞれに対して核酸［ＲＮＡ］の分離を実施した。
以下に、試料（Ｅ）に含有させるＲＮＡについて説明する。
２種類の試料（Ｅ）の内、標的核酸を含有する試料（Ｅ）に用いるＲＮＡとしては、製造例１０で合成したポリマー（Ｐ２−１）と相補的な配列を有する２２塩基のオリゴＲＮＡ（標的核酸、配列番号１の配列を有するＲＮＡ）を用いた。
２種類の試料（Ｅ）の内、非標的核酸を含有する試料（Ｅ）に用いるＲＮＡとしては、製造例１０で合成したポリマー（Ｐ２−１）と相補的な配列を有さない２２塩基のオリゴＲＮＡ（非標的核酸、配列番号２の配列を有するＲＮＡ）を用いた。
<Examples 22 to 24: Separation of microRNA using silica particles (C)>
Using the silica particles (C-10), (C-11) or (C-12) obtained in the above example, nucleic acid [RNA] was used for each of the two types of samples (E) by the following method. Was separated.
The RNA contained in the sample (E) will be described below.
Of the two types of samples (E), the RNA used for the sample (E) containing the target nucleic acid is a 22-base oligo RNA having a sequence complementary to the polymer (P2-1) synthesized in Production Example 10 ( The target nucleic acid, RNA having the sequence of SEQ ID NO: 1) was used.
Of the two types of sample (E), the RNA used for the sample (E) containing the non-target nucleic acid is 22 bases that do not have a sequence complementary to the polymer (P2-1) synthesized in Production Example 10. OligoRNA (non-target nucleic acid, RNA having the sequence of SEQ ID NO: 2) was used.
［複合体形成工程］
１）１．５ｍＬマイクロチューブに６００μＬのシリカ粒子（Ｃ）の分散液［実施例１２の１）と同様の操作で得た分散液］を採取し、マイクロチューブの外側から磁石を接触させることにより、粒子を集磁し、そのまま上澄み液を除去した。
２）ＲＮＡ水溶液〔上記のＲＮＡの内１種を、蒸留水にて３０ｎｇ／μｌの濃度になるようにＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌ及びＢＳＡ水溶液〔ＢＳＡを３０ｎｇ／μｌの濃度で、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：１０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：２ｍＭ、ｐＨ７．８６］に溶解させた水溶液〕１５０μｌの混合液［分離精製の対象となる核酸及び不純物としてのＢＳＡを含有する試料］を、試料（Ｅ）として、１）で得たマイクロチューブに加えた。
３）２）で得たマイクロチューブを６５℃で１０分間保温し、その後３５℃で２時間保持し、１５℃にて０．５時間静置して複合体（Ｃ−ＲＮＡ）を得た。
[Complex formation step]
1) By collecting a dispersion of 600 μL of silica particles (C) in a 1.5 mL microtube [dispersion obtained by the same operation as in 1 of Example 12] and contacting a magnet from the outside of the microtube. , The particles were collected and the supernatant was removed as it was.
2) Aqueous RNA solution [Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 10 mM, tetrasodium ethylenediamine tetraacetate: 2 mM, so that one of the above RNAs has a concentration of 30 ng / μl in distilled water. Aqueous solution dissolved in pH 7.86] 150 μl and BSA aqueous solution [BSA at a concentration of 30 ng / μl, Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 10 mM, tetrasodium ethylenediamine tetraacetate: 2 mM, pH 7.86] ] 150 μl of a mixed solution [a sample containing a nucleic acid to be separated and purified and BSA as an impurity] was added to the microtube obtained in 1) as a sample (E).
3) The microtube obtained in 2) was kept warm at 65 ° C. for 10 minutes, then kept at 35 ° C. for 2 hours, and allowed to stand at 15 ° C. for 0.5 hours to obtain a complex (C-RNA).
［複合体分離工程］
４）３）で得たマイクロチューブの外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ−ＲＮＡ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去した。次いで、７０体積％エタノール水溶液４５０μＬを加えて粒子を分散させた後に、容器の外側から磁石を接触させることにより、複合体（Ｃ−ＲＮＡ）を集磁し、そのまま上澄み液を除去する洗浄操作を１０回繰り返した。これにより、複合体（Ｃ−ＲＮＡ）を回収した。
[Complex separation step]
4) By contacting a magnet from the outside of the microtube obtained in 3), the complex (C-RNA) was magnetized and the supernatant was removed as it was. Next, after adding 450 μL of a 70% by volume ethanol aqueous solution to disperse the particles, a magnet is brought into contact with the outside of the container to collect the complex (C-RNA) and remove the supernatant as it is. Repeated 10 times. As a result, the complex (C-RNA) was recovered.
［解離工程］
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン：５０ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム：１０ｍＭ、ｐＨ７．８６］を、４）で得たマイクロチューブに１５０μＬ加え、振とう培養器を用いて、マイクロチューブを振とうし（７０℃、３５０ｒｐｍ、１０分）複合体（Ｃ−ＲＮＡ）からＲＮＡ等を解離させた。その後、磁石でシリカ粒子（Ｃ）を集磁し、上澄み液をピペットで取り出し、ＲＮＡ等を含有する溶液を回収した。
[Dissociation process]
Add 150 μL of Tris-EDTA Buffer [Tris (hydroxymethyl) aminomethane: 50 mM, tetrasodium ethylenediaminetetraacetate: 10 mM, pH 7.86] to the microtube obtained in 4), and use a shaking incubator to microtube. Was shaken (70 ° C., 350 rpm, 10 minutes) to dissociate RNA and the like from the complex (C-RNA). Then, the silica particles (C) were collected with a magnet, the supernatant was taken out with a pipette, and the solution containing RNA and the like was recovered.
［ＲＮＡ濃度の測定］
［解離工程］で得たＲＮＡ等を含有する溶液について、紫外可視分光光度計ＵＶ−１８００（株式会社島津製作所製）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
３０ｎｇ／μＬのＲＮＡ水溶液及びその希釈液を用いた場合のＲＮＡ濃度と吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記回収後のＲＮＡの濃度を求めた。この値を元に、［解離工程］で回収した溶液中のＲＮＡ濃度を換算して求めた値を表３に記載する。
[Measurement of RNA concentration]
The absorbance at 260 nm of the solution containing RNA and the like obtained in the [dissociation step] was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer UV-1800 (manufactured by Shimadzu Corporation).
A calibration curve showing the relationship between the RNA concentration and the absorbance when a 30 ng / μL RNA aqueous solution and a diluted solution thereof were used was prepared, and the RNA concentration after recovery was determined using the calibration curve. Based on this value, the value obtained by converting the RNA concentration in the solution recovered in the [dissociation step] is shown in Table 3.
［ＢＳＡ濃度の測定］
Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＲｅａｇｅｎｔ Ａ溶液とＲｅａｇｅｎｔ Ｂ溶液とＲｅａｇｅｎｔ Ｃ溶液とを２５：２４：１の比率で混合し、混合液（Ｍ）を得た。
［解離工程］で得たＲＮＡ等を含有する溶液１００μＬに混合液（Ｍ）を１００μＬ加え、３７℃で２時間静置した。
２時間後に、静置後の混合物を９６穴プレート（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１穴につき１００μＬを分注し、次いで５６２ｎｍの吸光度でプレートリーダー（コロナ電気株式会社製ＭＴＡ−３２）を用いて吸光度を測定した。
濃度既知のＢＳＡ標準液を用いた場合の吸光度との関係を示す検量線を作製し、検量線を用いて、上記ＢＳＡの濃度を求めた。この値を元に、［解離工程］の操作で回収した溶液中のＢＳＡ濃度を換算して求めた値を表３に記載する。
また、以下の計算で求めた純度（％）についても、表３に記載した。
純度（％）＝ＲＮＡ濃度／（ＲＮＡ濃度＋ＢＳＡ濃度）×１００
[Measurement of BSA concentration]
A reagent A solution, a reagent B solution and a reagent C solution of Micro BCATM protein assay kit (manufactured by THERMO Fisher Scientific) were mixed at a ratio of 25:24: 1 to obtain a mixed solution (M).
100 μL of the mixed solution (M) was added to 100 μL of the solution containing RNA and the like obtained in the [dissociation step], and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours.
After 2 hours, the mixture after standing was dispensed into a 96-well plate (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.) at 100 μL per hole, and then a plate reader (MTA-32 manufactured by Corona Electric Co., Ltd.) was used with an absorbance of 562 nm. The absorbance was measured.
A calibration curve showing the relationship with the absorbance when a BSA standard solution having a known concentration was used was prepared, and the concentration of the BSA was determined using the calibration curve. Based on this value, the value obtained by converting the BSA concentration in the solution recovered by the operation of [Dissociation step] is shown in Table 3.
The purity (%) obtained by the following calculation is also shown in Table 3.
Purity (%) = RNA concentration / (RNA concentration + BSA concentration) x 100
表３の通り、本発明の磁性粒子（Ｃ）の内、ポリマー（Ｐ２）を有する磁性粒子（Ｃ）は、試料（Ｅ）中に標的核酸が存在しない場合は、十分なシグナルが検出されなかった（検出限界以下であった）。一方、試料中に標的核酸が存在する場合は、標的核酸の分離が可能であった。よって、ポリマー（Ｐ２）を有する磁性粒子（Ｃ）は、ポリマー（Ｐ２）の配列に応じた核酸を、配列特異的に回収し、分離精製できることが確認できた。 As shown in Table 3, among the magnetic particles (C) of the present invention, the magnetic particles (C) having the polymer (P2) do not detect a sufficient signal when the target nucleic acid is not present in the sample (E). (It was below the detection limit). On the other hand, when the target nucleic acid was present in the sample, the target nucleic acid could be separated. Therefore, it was confirmed that the magnetic particles (C) having the polymer (P2) can recover the nucleic acid corresponding to the sequence of the polymer (P2) in a sequence-specific manner and can be separated and purified.
本発明の磁性粒子を用いた核酸の分離方法は、生物由来の試料等から、簡便に純度の高い核酸を分離精製することができるため、有用である。 The method for separating nucleic acids using magnetic particles of the present invention is useful because it is possible to easily separate and purify highly pure nucleic acids from biological samples and the like.
Claims (9)
前記ポリマー（Ｐ）が、一般式（２）で表される構成単位（Ｘ１）を必須構成単位として有し、一般式（３）で表される構成単位（Ｘ２）を構成単位として有さないポリマー（Ｐ１）並びに／又は一般式（２）で表される構成単位（Ｘ１）及び一般式（３）で表される構成単位（Ｘ２）を必須構成単位として有するポリマー（Ｐ２）である請求項１又は２に記載の磁性粒子。
［一般式（２）において、Ｙ１は、鎖の途中にカルボニル基を有していてもよい炭素数１〜１８の炭化水素鎖を表す。］
The polymer (P) has a structural unit (X 1 ) represented by the general formula (2) as an essential structural unit, and has a structural unit (X 2 ) represented by the general formula (3) as a structural unit. is not a polymer (P1) and / or formula (2) structural units represented by (X 1) and the general formula polymer having as essential constituent units a structural unit (X 2) represented by (3) (P2) The magnetic particle according to claim 1 or 2.
[In the general formula (2), Y 1 represents a hydrocarbon chain having 1 to 18 carbon atoms which may have a carbonyl group in the middle of the chain. ]
磁力で前記複合体（Ｆ）を前記試料から分離する複合体分離工程と、
前記複合体（Ｆ）から核酸を解離させる解離工程とを含む核酸の分離精製方法。 A complex forming step of contacting a sample containing nucleic acid with the magnetic particles according to any one of claims 1 to 7 to form a complex (F).
A complex separation step of separating the complex (F) from the sample by magnetic force,
A method for separating and purifying nucleic acid, which comprises a dissociation step of dissociating nucleic acid from the complex (F).
The method for separating and purifying nucleic acid according to claim 8, further comprising a magnetic particle recovery step of recovering the magnetic particles after the dissociation step.
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