JP2021024836A - Composition for hippocampal neurogenesis and memory improving composition - Google Patents

Abstract

To provide a composition for hippocampal neurogenesis, or a composition that exhibits treatment, improvement, and recovery effects on a disease associated with a deterioration of hippocampal functions, and a deterioration of memory.SOLUTION: A composition for hippocampal neurogenesis contains at least one substance selected from deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明は、海馬神経の新生作用を有し、海馬機能の低下を抑制または改善し、記憶改善効果を発揮する組成物に関する。 The present invention relates to a composition having a hippocampal nerve neoplastic action, suppressing or ameliorating a decrease in hippocampal function, and exerting a memory improving effect.

成熟した哺乳動物では、神経細胞が***能を持っていない。神経とは、このような特殊な細胞からなる組織である。そのため神経が一旦傷害を受けると長期にわたって障害が続く。特に脳や脊髄といった中枢神経系では全く再生能がないと言われてきた。しかし、記憶に関わる重要な脳内領域の１つである海馬において、成熟後も神経細胞の新生が持続していることが近年確認され、注目が集まっている。 In mature mammals, nerve cells do not have the ability to divide. A nerve is a tissue composed of such special cells. Therefore, once the nerve is injured, the injury continues for a long time. It has been said that there is no regenerative ability, especially in the central nervous system such as the brain and spinal cord. However, in the hippocampus, which is one of the important areas in the brain involved in memory, it has been confirmed in recent years that nerve cell renewal continues even after maturation, and it has attracted attention.

海馬は、学習記憶に重要な脳領域の１つである。ヒトを含む多くの動物種において、記憶獲得後、ある種の記憶の想起は、最初は海馬の働きを必要とし、時間経過に伴い徐々にその海馬依存性が減少する。例えば、齧歯類においては、数週間後には海馬の働きを必要とせずに記憶想起できるようになり、記憶の依存する脳領域が大脳皮質へと移行する。
大脳皮質に比べて海馬は非常に小さい脳領域で、記憶を蓄える能力は小さいと想定されているが、脳は生涯、海馬を通して新しい経験を記憶として蓄えることが可能であると考えられている。これは、海馬における神経新生が仲介することによるものである。 The hippocampus is one of the important brain regions for learning memory. In many animal species, including humans, after memory acquisition, certain memory recalls initially require hippocampal activity, and their hippocampal dependence gradually diminishes over time. For example, in rodents, after a few weeks, memory can be recalled without the need for hippocampal function, and the brain region on which memory depends shifts to the cerebral cortex.
The hippocampus is a very small brain region compared to the cerebral cortex, and it is assumed that the ability to store memory is small, but it is thought that the brain can store new experiences as memory throughout the hippocampus. This is due to the mediation of neurogenesis in the hippocampus.

海馬の機能低下は、様々な疾患において認められている。このような海馬の機能低下を伴う疾患としては、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、頭部外傷、脳卒中、脳虚血症、脳炎、健忘症、外傷性脳損傷、海馬硬化症、脳老衰症、痴呆、前頭側頭葉変性、脳血管性疾患、脳神経疾患、軽度認知障害、認知欠乏及び学習障害などがある。特に老化に伴う海馬の萎縮は、認知症を伴うため社会問題にもなっている。
海馬機能の回復によって、これらの疾患や、疾患に伴う記憶の低下が抑制可能となると考えられている。 Hippocampal dysfunction has been observed in a variety of diseases. Diseases associated with such hypofunction of the hippocampus include aging, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Kreuzfeld-Jakob's disease, head trauma, stroke, cerebral ischemia, encephalitis, amnesia, and trauma. There are sexual brain injury, hippocampus, cerebral senility, dementia, frontotemporal lobar degeneration, cerebrovascular disease, neurological disease, mild cognitive impairment, cognitive deficiency and learning impairment. In particular, hippocampal atrophy associated with aging has become a social problem because it is accompanied by dementia.
It is believed that recovery of hippocampal function can suppress these diseases and the deterioration of memory associated with the diseases.

非特許文献１には、Ｘ線照射によって海馬の神経新生が消失した動物では、高頻度電気刺激（ｒＨＦＳ）を与えて獲得させる記憶を獲得できないこと、一方、Ｘ線照射をせずに運動可能環境下で海馬神経新生が促進されるようにした動物では、ｒＨＦＳ刺激に対する記憶が獲得できたことから、海馬神経新生が記憶獲得に重要な役割を果たすことが記載されている。また、非特許文献１では、日々新しい記憶が海馬に蓄えられるにもかかわらず、神経新生の働きにより古い記憶は大脳皮質に転送されるため、海馬の記憶容量は飽和することなく新しい記憶を蓄えることができるとしている。また、非特許文献１は海馬の神経新生が、記憶の増強につながることを動物試験によって明らかにしている。 Non-Patent Document 1 states that in animals in which hippocampal neurogenesis has disappeared due to X-ray irradiation, it is not possible to acquire the memory acquired by applying high-frequency electrical stimulation (rHFS), while exercise is possible without X-ray irradiation. It is described that hippocampal neurogenesis plays an important role in memory acquisition because memory for rHFS stimulation was acquired in animals in which hippocampal neurogenesis was promoted in the environment. Further, in Non-Patent Document 1, although new memory is stored in the hippocampus every day, old memory is transferred to the cerebral cortex by the action of neurogenesis, so that the memory capacity of the hippocampus is not saturated and new memory is stored. It is said that it can be done. In addition, Non-Patent Document 1 has clarified by animal tests that hippocampal neurogenesis leads to enhancement of memory.

海馬神経新生は、神経再生の重要な形態であり、生物はこれにより、記憶の増強が可能となり、生涯を通して環境変化に適応できるものと考えられている。そのため、動物において神経新生を増強する組成物や神経新生増強方法が必要とされている。また海馬神経の新生によって、海馬機能の低下の抑制、または回復、増強も可能となると考えられている。 Hippocampal neurogenesis is an important form of nerve regeneration, which is thought to allow organisms to enhance memory and adapt to environmental changes throughout their lives. Therefore, there is a need for compositions and methods for enhancing neurogenesis in animals. It is also believed that the neoplasia of the hippocampal nerve can suppress, recover, or enhance the decline in hippocampal function.

このような観点から、海馬神経の新生や再生を促す薬剤や組成物が注目されている。
特許文献１には、中枢神経系に薬剤を投与することで、神経細胞内のｃＡＭＰレベルを上昇させ、海馬を含めた中枢神経系の発生を促進する方法及び記憶増強方法が提案されている。
特許文献２には、海馬を含めた神経系の神経突起伸長を誘導しＣＲＥＢ経路を活性化させる物質の探索方法が記載されている。そして海馬神経新生物質としてフォルスコリンが提案されている。
特許文献３には、選択的α７アゴニストを投与することで海馬をはじめとする中枢神経再生を促進する方法が提案されている。そして複数の化合物が、海馬をはじめとする中枢神経の新生に有効であることが記載されている。
特許文献４には、経口投与したホスファチジルセリンが海馬神経の新生を誘導することが記載されており、ホスファチジルセリンを有効成分とする海馬神経新生剤が提案されている。
特許文献５には、メトキシヒドロキノンまたは３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル基を有する化合物がラット胎仔の海馬から取り出した神経幹／前駆細胞マーカーを有する神経細胞を増加させることが記載されている。
特許文献６には、不飽和脂肪酸と、一酸化窒素放出化合物と、ビタミンＢと、抗酸化物質を含む組成物を動物に投与することで、海馬神経新生を増強できることが記載されている。またこの組成物を、短期記憶喪失、学習速度の低下、学習能力の低下、問題解決能力の低下、集中力の持続時間の低下、運動能力の低下、混乱の増加、又は認知症等の記憶低下症状に投与して治療することが記載されている。
特許文献７には、アラキドン酸及び／又はアラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物を有効成分として含有して成る神経再生剤および神経疾患の治療薬が記載されている。
特許文献８には、カロテノイドの一種であるアスタキサンチンを運動療法と併用することで認知機能を回復させ、海馬機能を増強する方法が記載されている。 From this point of view, drugs and compositions that promote the renewal and regeneration of hippocampal nerves are attracting attention.
Patent Document 1 proposes a method of increasing cAMP levels in nerve cells and promoting the development of the central nervous system including the hippocampus and a method of enhancing memory by administering a drug to the central nervous system.
Patent Document 2 describes a method for searching for a substance that induces neurite outgrowth of the nervous system including the hippocampus and activates the CREB pathway. Forskolin has been proposed as a hippocampal neurogenesis substance.
Patent Document 3 proposes a method of promoting central nervous system regeneration including the hippocampus by administering a selective α7 agonist. It has been described that a plurality of compounds are effective for the neoplasia of the central nervous system including the hippocampus.
Patent Document 4 describes that orally administered phosphatidylserine induces hippocampal nerve neoplasia, and proposes a hippocampal neurogenesis agent containing phosphatidylserine as an active ingredient.
Patent Document 5 describes that a compound having a methoxyhydroquinone or a 3-methoxy-4-hydroxyphenyl group increases nerve cells having a nerve stem / progenitor cell marker taken from the hippocampus of a rat fetal.
Patent Document 6 describes that the hippocampal neurogenesis can be enhanced by administering a composition containing an unsaturated fatty acid, a nitric oxide-releasing compound, vitamin B, and an antioxidant to an animal. In addition, this composition may be used for short-term memory loss, decreased learning speed, decreased learning ability, decreased problem-solving ability, decreased duration of concentration, decreased motor ability, increased confusion, or decreased memory such as dementia. It is described to administer and treat the symptoms.
Patent Document 7 describes a nerve regenerating agent and a therapeutic agent for a neurological disorder, which contain arachidonic acid and / or a compound containing arachidonic acid as a constituent fatty acid as an active ingredient.
Patent Document 8 describes a method of recovering cognitive function and enhancing hippocampal function by using astaxanthin, which is a kind of carotenoid, in combination with exercise therapy.

このように 現在まで様々な物質について研究が進められている。そして、海馬神経再生や新生を促進し、記憶の増強や、海馬の神経新生阻害に由来する疾患に対する治療のための組成物、食品、薬剤に有用な物質の提供が希求されている。 In this way, research on various substances has been carried out to date. There is a need to provide substances useful for compositions, foods, and drugs for promoting hippocampal nerve regeneration and neoplasia, enhancing memory, and treating diseases caused by inhibition of hippocampal nerve neoplasia.

特表２００６−５１４６３０号公報Special Table 2006-514630 特表２０１１−５１１６２１号公報Japanese Patent Publication No. 2011-511621 特表２０１２−５０８２５４号公報Special Table 2012-508254 特開２０１４−１８９５４９号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-189549 特開２０１５−０６７６０１号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-067601 特表２０１８−５２８１６０号公報Special Table 2018-528160 特開２０１６−０６５０９７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-065097 特開２０１７−２１８４２４号公報JP-A-2017-218424

The Journal of Neuroscience,August 1,2018・38(31):6854-6863The Journal of Neuroscience, August 1, 2018 ・ 38 (31): 6854-6863

本発明の課題は、海馬神経新生用組成物及び、海馬機能の低下に伴う疾患や、記憶の低下に対して治療、改善、回復効果を発揮する組成物を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a composition for hippocampal neurogenesis and a composition that exerts a therapeutic, ameliorating, and recovering effect on diseases associated with a decrease in hippocampal function and a decrease in memory.

本発明者らは、様々な物質について試験した結果、デオキシヌクレオチド化合物に好ましい海馬神経新生活性を見出した。中でもデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンに強い活性があることが判明した。この知見に基づき、本発明をなしたものである。 As a result of testing various substances, the present inventors have found a favorable hippocampal neurogenesis activity for deoxynucleotide compounds. Among them, it was found that deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine have strong activity. Based on this finding, the present invention has been made.

すなわち、本発明は、次の構成からなる。
（１）デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンのいずれか１以上を有効成分として含有する海馬神経新生用組成物。
（２）デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンのいずれか１以上を有効成分として含有する海馬機能低下の治療または海馬機能低下による記憶低下改善用組成物。
（３）海馬機能の低下の原因となる疾患または異常が、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、頭部外傷、脳卒中、脳虚血症、脳炎、健忘症、外傷性脳損傷、海馬硬化症、脳老衰症、痴呆、前頭側頭葉変性、脳血管性疾患、脳神経疾患、軽度認知障害、認知欠乏及び学習障害、Ｘ照射のいずれかである（２）に記載の、海馬機能低下の治療または海馬機能低下による記憶低下改善用組成物。
（４）経口投与用である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。 That is, the present invention has the following configuration.
(1) A composition for hippocampal neurogenesis containing any one or more of deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient.
(2) A composition for treating hippocampal dysfunction or improving memory dysfunction due to hippocampal dysfunction, which contains any one or more of deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient.
(3) Diseases or abnormalities that cause a decline in hippocampal function include aging, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Kreuzfeld-Jakob's disease, head trauma, stroke, cerebral ischemia, encephalitis, amnesia. Disease, traumatic brain injury, hippocampus, cerebral senility, dementia, frontotemporal lobar degeneration, cerebrovascular disease, neurological disease, mild cognitive impairment, cognitive deficiency and learning impairment, X-irradiation (2) ) For the treatment of hippocampal dysfunction or the composition for improving amnesia due to hippocampal dysfunction.
(4) The composition according to any one of (1) to (3) for oral administration.

本発明により、新たな海馬神経新生用の組成物が提供される。さらにまた本発明の組成物は、経口投与によって神経新生作用を発揮する。そのため海馬神経新生のための経口投与の医薬、飲食品や健康食品として利用することが可能である。さらに、海馬の萎縮や機能低下に伴って発生する様々な障害や疾患の予防、治療剤或いは記憶改善用の組成物とすることができる。 The present invention provides a novel composition for hippocampal neurogenesis. Furthermore, the compositions of the present invention exert a neurogenesis effect by oral administration. Therefore, it can be used as an orally administered medicine, food and drink, and health food for hippocampal neurogenesis. Further, it can be used as a preventive, therapeutic agent or a composition for improving memory of various disorders and diseases caused by hippocampal atrophy and functional deterioration.

本発明の組成物に含有される有効成分が作用する海馬部位の模式図である。図の下部が拡大図である。図中顆粒細胞層の細胞が***し海馬神経新生をもたらす。It is a schematic diagram of the hippocampal part where the active ingredient contained in the composition of this invention acts. The lower part of the figure is an enlarged view. In the figure, the cells of the granule cell layer divide and cause hippocampal neurogenesis. 本発明の剤を投与した動物の海馬切片の顕微鏡観察画像である。矢印は、抗ＢｒｄＵ抗体で染色された細胞が***している箇所を蛍光で確認できていることを示す。It is a microscopic observation image of a hippocampal section of an animal to which the agent of this invention was administered. The arrows indicate that the cells stained with the anti-BrdU antibody can be confirmed by fluorescence at the division site. 動物試験における海馬歯状回のＢｒｄＵ陽性細胞数（***細胞数）を示すグラフである。It is a graph which shows the number of BrdU positive cells (the number of dividing cells) of the hippocampal dentate gyrus in an animal test.

本発明の有効成分であるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンはすべて既知の化合物であり、それぞれ市販品を使用することができる。このようなデオキシリボヌクレオチドは、遊離の形態でも塩の形態であってもよい。そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩などの各種金属塩を例示することができる。本発明に関わるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンまたはこれらのいずれかを含む組成物は動植物の高含有組織から抽出してもよいし、微生物発酵によって得ることもできる。また化学的方法で合成してもよい。 The active ingredients of the present invention, deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine, are all known compounds, and commercially available products can be used for each. Such deoxyribonucleotides may be in free form or in salt form. Examples of such salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, and various metal salts such as alkaline earth metal salts such as calcium salt. The composition containing deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxyuridine or any of these according to the present invention may be extracted from a high content tissue of animals and plants, or may be obtained by microbial fermentation. It may also be synthesized by a chemical method.

本発明のデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンから選択される１以上の物質を有効成分として含有する組成物としては、医薬組成物あるいは飲食品組成物またはサプリメントなどの健康食品組成物である。ヒトを含む動物に経口的に摂取あるいは投与される。 The composition containing one or more substances selected from deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine of the present invention as an active ingredient is a health food composition such as a pharmaceutical composition, a food or drink composition, or a supplement. Orally ingested or administered to animals, including humans.

たとえば、医薬品製剤または医薬組成物の形態をとる場合、その調製法はいずれも医薬製剤の常法に従って調製することができ、たとえば、ドリンク、シロップなどの液体の形態、錠剤、カプセル、顆粒などの固体の形態などの各種経口摂取の形態で採用することができる。調製の際に配合される担体、賦形剤およびその他の添加剤は、特に限定されない。例えば乳糖、結晶セルロース、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、デンプンなどの固体状のもの、水、グリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールなどの液体状のものをあげることができる。 For example, when taking the form of a pharmaceutical preparation or a pharmaceutical composition, the preparation method can be prepared according to the conventional method of the pharmaceutical preparation, for example, in the form of a liquid such as a drink or syrup, tablets, capsules, granules, etc. It can be adopted in various forms of oral ingestion such as solid form. The carriers, excipients and other additives blended in the preparation are not particularly limited. Examples include solids such as lactose, crystalline cellulose, talc, agar, pectin, stearic acid and starch, and liquids such as water, glycerin, peanut oil, polyvinylpyrrolidone, ethanol, benzyl alcohol and propylene glycol. it can.

また、飲食物の形態をとる場合、対象となる飲食物は、各種病院食、栄養補強食などはもとより日常食する飲食物の形態であってもよく、粉末状、顆粒状、固形状、液状、半液状など食品の種類および形態は特に限定されない。これらの各種飲食物は、たとえば製造時あるいは飲食時に、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンより選択された少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを有効成分として、適宜添加することによって作用発現に必要な量の有効成分を適宜摂取できる。 In addition, when taking the form of food and drink, the target food and drink may be in the form of food and drink that is eaten daily as well as various hospital foods and nutritionally supplemented foods, and may be in the form of powder, granules, solid, or liquid. , Semi-liquid, etc. The type and form of food is not particularly limited. These various foods and drinks are prepared by appropriately adding at least one deoxyribonucleotide selected from deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient at the time of production or eating and drinking, in an amount necessary for exerting the action. Can be taken as appropriate.

またサプリメント等の健康食品とする場合は、錠剤、カプセル、顆粒などの固体の形態などの各種経口摂取の形態、あるいは液状のドリンク剤の形態を採用することができる。 調製の際使用される担体、賦形剤およびその他の添加剤は特に限定されない。 In the case of health foods such as supplements, various forms of oral ingestion such as solid forms such as tablets, capsules and granules, or liquid drinks can be adopted. The carriers, excipients and other additives used in the preparation are not particularly limited.

本発明におけるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンより選択された少なくとも１成分の摂取量または投与量は、健康状態、年齢、体重、性別などにより異なるが、成人で１日あたり１ｍｇ〜５０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜１ｇを目安として適宜増減して単回あるいは複数回に分けて摂取または投与すればよい。 The intake or dose of at least one component selected from deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine in the present invention varies depending on the health condition, age, body weight, sex, etc., but is preferably 1 mg to 50 g per day for adults. The dose may be appropriately increased or decreased from 1 mg to 10 g, more preferably 10 mg to 1 g, and taken or administered in a single dose or in a plurality of doses.

以下に実施例、試験例を示し、本発明をさらに説明する。 Examples and test examples are shown below, and the present invention will be further described.

＜海馬神経新生確認試験例＞
試験は、特許文献４に記載された手法に基づき実施した。
１．動物種、系統、及び性別
ラット、Ｓｌｃ：Ｗｉｓｔａｒ、雄
２．週齢
投与開始時：９週齢 <Hippocampal nerve neoplasia confirmation test example>
The test was carried out based on the method described in Patent Document 4.
1. 1. Animal species, lineage, and sex Rats, Slc: Wistar, male 2. Week age At the start of administration: 9 weeks old

３．馴化
入荷時に種、系統、週齢、動物数及び性別を確認し、一般状態および外観を観察するとともに体重を測定した。馴化期間は７日間とした。
４．群分け
投与開始前日に体重を測定し１群６匹に群分けした。
５．個体識別方法
個体識別は尾部に番号を記すことで行った。群分け後の動物は３匹ずつケージに収容し、群、動物番号および個体識別番号を明記したラベルをケージ前面に付けた。 3. 3. At the time of arrival, the species, lineage, age, number of animals and sex were confirmed, and the general condition and appearance were observed and the body weight was measured. The habituation period was 7 days.
4. Grouping The body weight was measured the day before the start of administration, and the animals were grouped into 6 animals per group.
5. Individual identification method Individual identification was performed by marking the tail with a number. Three animals after grouping were housed in cages and labeled on the front of the cage with the group, animal number and individual identification number.

６．飼育環境
設定温度：２３℃（許容範囲２１〜２５℃）、設定湿度：５５％（許容範囲４０〜７０％）、照明：午前６時点灯、午後６時消灯の１２時間、換気回数：１７回／時に維持された動物飼育室コンベンショナル区域内の飼育室で動物を飼育した。動物はＴＰＸ製エコンケージを用いて飼育し、床敷はパルソフト（オリエンタル酵母工業株式会社）を使用して週に１回以上の頻度で交換した。 6. Breeding environment Set temperature: 23 ° C (allowable range 21-25 ° C), set humidity: 55% (allowable range 40-70%), lighting: 6:00 am on, 6:00 pm off for 12 hours, ventilation frequency: 17 times / Occasionally maintained animal breeding room Animals were bred in a breeding room within the conventional area. The animals were bred using a TPX eco-cage, and the bedding was changed at least once a week using Palsoft (Oriental Yeast Co., Ltd.).

７．飼料
コントロール群（ＮＣ群）はAIN-93M固形飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）、陽性対照（ＰＣ群）としてフェルラ酸を用いた。試験群は被験物質をAIN-93Mに混合した固形飼料（αコーンスターチと置換；オリエンタル酵母工業株式会社）を給餌器に入れて自由に摂取させた。なお評価対象の各々の被験物質は、飼料中に0.1質量％になるように配合した。 7. AIN-93M solid feed (Oriental Yeast Co., Ltd.) was used as the feed control group (NC group), and ferulic acid was used as the positive control (PC group). In the test group, a solid feed (replaced with α-cornstarch; Oriental Yeast Co., Ltd.) in which the test substance was mixed with AIN-93M was placed in a feeder and allowed to be freely ingested. Each test substance to be evaluated was blended in the feed so as to be 0.1% by mass.

８．被験物質
デオキシアデノシン（ＣＡＳ：958-09-8 東京化成工業株式会社）
デオキシグアノシン（ＣＡＳ：961-07-9 東京化成工業株式会社）
デオキシウリジン（ＣＡＳ：951-78-0 東京化成工業株式会社）
フェルラ酸（陽性対照）（ＣＡＳ：537-98-4 TSUNO RICE FINE CHEMICALS） 8. Test substance Deoxyadenosine (CAS: 958-09-8 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Deoxyguanosine (CAS: 961-07-9 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Deoxyuridine (CAS: 951-78-0 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Ferulic acid (positive control) (CAS: 537-98-4 TSUNO RICE FINE CHEMICALS)

９．飲料水
フィルター孔５μｍのカートリッジフィルターを通過させた塩酸水（ｐＨ：４〜６）を給水瓶で与えた。
１０．投与量
被験物は、飼料中に０．１質量％を混入した。ラット体重３００ｇ、１日摂餌量１５ｇとして投与量を設定した。 9. Drinking water Hydrochloric acid water (pH: 4 to 6) passed through a cartridge filter having a filter hole of 5 μm was given in a water bottle.
10. Dosage The test substance was mixed with 0.1% by mass in the feed. The dose was set with a rat body weight of 300 g and a daily food intake of 15 g.

１１．体重・摂餌量測定
投与期間中、週に２〜３回、体重および摂餌量の測定を行った。
１２．神経新生確認方法
Bromo‐2'‐deoxyuridine (BrdU)の投与によって神経新生の確認を行った。BrdUはDNA合成のときチミジンのアナログとして取り込まれる。BrdUを取り込んだDNAは、BrdUに特異的な抗体で検出することができ、これを使うと***期（S期）の細胞核をラベルできる。すなわちBrdUを投与すれば、投与期間内に***した細胞を検出することができ、海馬の神経新生を評価することができる。
灌流操作の5日前から1日1回5日間，BrdU（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を50mg/10mL/kg腹腔内投与した。投与は午前9時から12時の間に行った。 11. Body weight and food intake measurement During the administration period, body weight and food intake were measured 2-3 times a week.
12. How to confirm neurogenesis
Neural neoplasia was confirmed by administration of Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU is incorporated as an analog of thymidine during DNA synthesis. DNA that incorporates BrdU can be detected with an antibody specific for BrdU, which can be used to label mitotic (S phase) cell nuclei. That is, when BrdU is administered, cells that have divided within the administration period can be detected, and hippocampal neurogenesis can be evaluated.
BrdU (Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) was intraperitoneally administered at 50 mg / 10 mL / kg once a day for 5 days from 5 days before the perfusion operation. Administration was performed between 9 am and 12 am.

１３．採血、灌流および臓器摘出
ＰＢＳ（−）を用いて，心臓から全身灌流を行った。その後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（４％ＰＦＡ；富士フイルム和光純薬株式会社）にて灌流固定を行い、脳を摘出した。４％ＰＦＡに一晩浸漬後（４℃）、１５％スクロース溶液に置き換え、さらに一晩浸漬後（４℃）、３０％スクロース溶液に置換え保存した。
１４．凍結切片の作製および切出
スクロース保存した脳を凍結し、クライオミクロトームを用いて凍結切片（３０μｍ）を作製した。切出した脳切片は、０．１％アジ化ナトリウムＰＢＳに浸漬し、４℃で保存した。 13. Blood sampling, perfusion and organ removal PBS (-) was used to perform systemic perfusion from the heart. Then, perfusion fixation was performed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (4% PFA; Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the brain was removed. After immersion in 4% PFA overnight (4 ° C.), it was replaced with a 15% sucrose solution, and after further immersion in overnight (4 ° C.), it was replaced with a 30% sucrose solution and stored.
14. Preparation and excision of frozen sections The sucrose-preserved brain was frozen, and frozen sections (30 μm) were prepared using a cryomicrotome. The excised brain sections were immersed in 0.1% sodium azide PBS and stored at 4 ° C.

１５．免疫組織染色
切出した脳切片を６枚取出し、免疫組織染色に供した。染色方法は酵素抗体法（ＤＡＢ染色）を用いた。 15. Immunohistochemical staining Six excised brain sections were taken out and subjected to immunohistochemical staining. As a staining method, an enzyme antibody method (DAB staining) was used.

１６．試薬および試薬の調製
PBST
0.1M Phosphate buffer（37244-35; ナカライテスク株式会社） 1000mL
NaCl 90g
10% Triton 300mL
Diluted water 10L

Normal rabbit serum（S-5000, Vector）
200倍の濃度になるようPBSTに希釈した（Blocking）。

Rat anti-BrdU（OBT0030S; AbD serotec）
100倍の濃度になるようPBSTに希釈した（一次抗体）。

Biotinylated anti-rat IgG（BA-4001; Vector labolatories）
200倍の濃度になるようPBSTに希釈した（二次抗体）。

AB Reagent VECTASTAIN(R) standard kit（PK-4000； 株式会社フナコシ）
用時調製とし、反応開始の30分前に準備した。
10mL PBSTにA液およびB液を1滴ずつ添加した（AB反応）。

DAB Tris tablet, pH7.6（047-27011; 富士フイルム和光純薬株式会社）
用時調製とした。反応開始の1時間前に10mL PBSTに対してDAB tabletを2錠入れ、反応直前にH₂O₂を0.01%となるよう添加した（DAB反応）。 16. Reagents and reagent preparation
PBST
0.1M Phosphate buffer (37244-35; Nacalai Tesque, Inc.) 1000mL
NaCl 90g
10% Triton 300mL
Diluted water 10L

Normal rabbit serum (S-5000, Vector)
Diluted in PBST to a concentration of 200 times (Blocking).

Rat anti-BrdU (OBT0030S; AbD serotec)
Diluted in PBST to 100-fold concentration (primary antibody).

Biotinylated anti-rat IgG (BA-4001; Vector labolatories)
Diluted in PBST to a concentration of 200 times (secondary antibody).

AB Reagent VECTASTAIN (R) standard kit (PK-4000; Funakoshi Co., Ltd.)
It was prepared at the time of use and prepared 30 minutes before the start of the reaction.
Solution A and solution B were added drop by drop to 10 mL PBST (AB reaction).

DAB Tris tablet, pH7.6 (047-27011; Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Prepared at the time of use. Two DAB tablets were added to 10 mL PBST 1 hour before the start of the reaction, and H ₂ O ₂ was added to 0.01% immediately before the reaction (DAB reaction).

１７．ＤＡＢ染色
以下の方法でＤＡＢ染色を行う。
反応時間 温度
2N HCl 45min 37℃
0.1M Boric acid (pH8.5) 10min RT
PBST 10min RT ×3回
Soaking 1% H₂O₂ in PBST 10min RT
PBST 10min RT ×3回
Blocking 30min RT
一次抗体 Overnight 4℃
PBST 10min RT ×3回
二次抗体 3h RT
PBST 10min RT ×3回
AB反応 1h RT
PBST 10min RT ×3回
DAB反応 11min RT
PBST
RT: room temperature 17. DAB staining Perform DAB staining by the following method.
Reaction time temperature
2N HCl 45min 37 ℃
0.1M Boric acid (pH8.5) 10min RT
PBST 10min RT x 3 times
Soaking 1% H ₂ O ₂ in PBST 10min RT
PBST 10min RT x 3 times
Blocking 30min RT
Primary antibody Overnight 4 ℃
PBST 10min RT x 3 times Secondary antibody 3h RT
PBST 10min RT x 3 times
AB reaction 1h RT
PBST 10min RT x 3 times
DAB reaction 11min RT
PBST
RT: room temperature

１８．マウントおよび封入
MASコートされたスライドガラス(スーパーフロスト,S0944; 松浪硝子株式会社)に脳切片を6枚のせ、一晩置いて乾燥させた。
次いで以下の方法で脱水・脱脂を行い、封入剤を数滴たらしカバーガラスで封入した。
70% EtOH 2min
80% EtOH 2min
90% EtOH 2min
95% EtOH 2min
99.5% EtOH 5min
99.5% EtOH 5min
99.5% EtOH 5min
100% EtOH 10min
100% EtOH 10min
ティッシュクリア 15min ×3回
キシレン ∞(封入まで) 18. Mount and encapsulation
Six brain sections were placed on MAS-coated glass slides (Super Frost, S0944; Matsunami Glass Co., Ltd.) and left overnight to dry.
Next, dehydration and degreasing were carried out by the following method, and a few drops of the mounting medium were added and sealed with a cover glass.
70% EtOH 2min
80% EtOH 2min
90% EtOH 2min
95% EtOH 2min
99.5% EtOH 5min
99.5% EtOH 5min
99.5% EtOH 5min
100% EtOH 10min
100% EtOH 10min
Tissue clear 15min x 3 times xylene ∞ (until encapsulation)

１９.神経新生作用の評価
脳切片を2N HClに37℃で30分間反応させた後、PBST(Tween20/Phosphate Buffered Saline)で洗浄した。洗浄後、0.1M Boric acid(pH8.5)に室温で10分間反応させ、PBSTで洗浄した。洗浄後、BrdU抗体に4℃でover night反応させ、PBSTで洗浄した後、適切な二次抗体を添加し、室温で2-3時間インキュベーションした。二次抗体を除去したのち、PBSTで洗浄し、ABC試薬を添加し、室温で30分間反応させた。PBSTで洗浄した後、封入剤で封入を行い、IN Cell Analyzer2200(GE Healthcare)で観察した。
上記方法で免疫組織染色を行った後、実体顕微鏡下で図1に示す海馬歯状回顆粒層下帯に存在するBrdU陽性細胞(矢印の細胞)の数をそれぞれカウントした。対照群(非投与郡NC)に比べBrdU陽性細胞数が多い場合を、神経新生作用を有するものと評価した。 19. Evaluation of neurogenesis effect Brain sections were reacted with 2N HCl at 37 ° C for 30 minutes and then washed with PBST (Tween 20 / Phosphate Buffered Saline). After washing, the mixture was reacted with 0.1 M Boric acid (pH 8.5) at room temperature for 10 minutes and washed with PBST. After washing, the BrdU antibody was reacted overnight at 4 ° C., washed with PBST, an appropriate secondary antibody was added, and the mixture was incubated at room temperature for 2-3 hours. After removing the secondary antibody, the cells were washed with PBST, ABC reagent was added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. After washing with PBST, the cells were encapsulated with an encapsulant and observed with IN Cell Analyzer 2200 (GE Healthcare).
After immunohistochemistry was performed by the above method, the number of BrdU-positive cells (cells indicated by arrows) present in the subzone of the dentate gyrus granulosum shown in FIG. 1 was counted under a stereomicroscope. When the number of BrdU-positive cells was larger than that in the control group (NC in the non-administered group), it was evaluated as having a neurogenesis effect.

２０．統計解析
結果はすべて平均値±標準誤差で示した。対照群との比較はDunnett’s testを用い、いずれも両側検定で有意水準を5%とした。 20. All statistical analysis results are shown as mean ± standard error. The Dunnett's test was used for comparison with the control group, and the significance level was set to 5% in both tests.

＜結果および評価＞
評価対象は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンである。また海馬神経新生に有効性を示す陽性対照化合物としてフェルラ酸（ＦＡ）を選択した。
BrdU陽性細胞数の測定結果を下記の表１および図３に示した。 <Results and evaluation>
The evaluation targets are deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine. Ferulic acid (FA) was selected as a positive control compound showing efficacy in hippocampal neurogenesis.
The measurement results of the number of BrdU-positive cells are shown in Table 1 and FIG. 3 below.

表１および図３から明らかなようにデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンは、経口投与によって海馬の神経新生作用を示すことが確認できた。特にデオキシアデノシン、デオキシグアノシンは、表１および図３に示すとおり、コントロール群に対して統計的有意な神経新生作用を示した。なお、コントロール群、フェルラ酸群、被験物投与群のいずれも、大きな体重の変動や毒性の兆候などの変化は観察されなかった。
したがって、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンのいずれかを含有する経口組成物は、海馬神経新生作用を有する安全なものであることが、本試験で明らかとなった。
デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンは、海馬機能低下に伴う種々の疾患や、脳機能障害の治療または海馬機能低下による記憶低下改善用組成物として使用することができる。 As is clear from Table 1 and FIG. 3, it was confirmed that deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine exhibited hippocampal neurogenesis by oral administration. In particular, deoxyadenosine and deoxyguanosine showed statistically significant neurogenesis effects on the control group, as shown in Table 1 and FIG. No significant changes in body weight or signs of toxicity were observed in any of the control group, ferulic acid group, and subject administration group.
Therefore, it was revealed in this study that an oral composition containing any of deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine is safe with a hippocampal neurogenesis effect.
Deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine can be used as a composition for treating various diseases associated with hippocampal dysfunction, treating brain dysfunction, or improving memory loss due to hippocampal dysfunction.

Claims (4)

デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンのいずれか１以上を有効成分として含有する海馬神経新生用組成物。 A composition for hippocampal neurogenesis containing any one or more of deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient. デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンのいずれか１以上を有効成分として含有する海馬機能低下の治療または海馬機能低下による記憶低下改善用組成物。 A composition for treating hippocampal dysfunction or improving memory deficiency due to hippocampal dysfunction, which contains any one or more of deoxyadenosine, deoxyguanosine, and deoxyuridine as an active ingredient. 海馬機能の低下の原因となる疾患または異常が、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、頭部外傷、脳卒中、脳虚血症、脳炎、健忘症、外傷性脳損傷、海馬硬化症、脳老衰症、痴呆、前頭側頭葉変性、脳血管性疾患、脳神経疾患、軽度認知障害、認知欠乏及び学習障害、Ｘ照射のいずれかである請求項２に記載の、海馬機能低下の治療または海馬機能低下による記憶低下改善用組成物。 Diseases or abnormalities that cause reduced hippocampal function include aging, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Kreuzfeld-Jakob's disease, head trauma, stroke, cerebral ischemia, encephalitis, amnesia, trauma. The second aspect of claim 2, which is any of sexual brain injury, hippocampal sclerosis, cerebral senility, dementia, frontotemporal lobar degeneration, cerebrovascular disease, neurological disease, mild cognitive impairment, cognitive deficiency and learning impairment, and X irradiation. A composition for treating or improving memory loss due to hippocampal dysfunction. 経口投与用である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 3, which is for oral administration.