JP2021023256A - オートファジー促進用組成物、オートファジーを促進する方法、細菌の感染を抑制するための組成物、及び、細菌の感染を抑制する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、オートファジーを促進する作用を有する組成物、細胞においてオートファジーを促進する方法、オートファジーを促進することで細菌の感染を抑制するための組成物、並びに、オートファジーを促進して細菌の感染を抑制する方法を提供する。【解決手段】本発明は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む、オートファジー促進用組成物に関する。本発明はまた、前記化合物を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。本発明はまた、前記化合物を含有し、前記化合物が細胞の周囲に０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度で送達されるように動物又は植物に投与される、生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物に関する。本発明はまた、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度の前記化合物を細胞に接触させることを含む、細胞への細菌を抑制する方法に関する。【選択図】図４
Description
本発明は、飲食品、医薬、培地、培地添加物等の形態であることのできるオートファジー促進用組成物に関する。
本発明はまた、培養細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌の感染を抑制するための組成物に関する。
本発明はまた、細胞への細菌の感染を抑制する方法に関する。
本発明はまた、培養細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌の感染を抑制するための組成物に関する。
本発明はまた、細胞への細菌の感染を抑制する方法に関する。
Ｌ−エルゴチオネイン（本明細書では「ＥＧＴ」と表記する場合がある）は含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。
例えば非特許文献１では、ＥＧＴが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とアジュバントとからなるガンワクチンによる免疫治療の効果を向上させる作用を有することが記載されている。特許文献１では、ＥＧＴが細菌による感染症を治療する作用を有することが記載されている。特許文献１の実験１では、５ｍＭ及び５０ｍＭのＥＧＴが大腸菌の増殖を抑制することが確認されていることから、特許文献１に記載の細菌の感染症抑制は、ＥＧＴが細菌の増殖を直接に抑制することによるものだと理解できる。
非特許文献２では、トールライク受容体リガンドによる刺激条件下でのマウス骨髄由来マクロファージによるサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０）の生産が、１０ｍＭのＥＧＴにより促進され、１ｍＭのＥＧＴでは促進されないこと、及び、Ｆ４／８０マクロファージとＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養において、ＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７極性化が３０ｍＭのＥＧＴにより促進されることが記載されている。このように非特許文献２では、１０ｍＭ以上の高濃度のＥＧＴがマクロファージを活性化させることが記載されている。
非特許文献３は、ＥＧＴの生理活性についての総説である。非特許文献３ではＥＧＴは動物及び植物の体内に吸収・蓄積されることが記載されている。
一方、オートファジーは細胞が、細胞内のタンパク質やオルガネラを分解・代謝する細胞現象である。オートファジーは細胞の機能維持のために重要な役割を担っており、飢餓ストレス等で誘導される生体防御機構の一つと考えられている。オートファジーは外来物質の侵入や変性タンパク質が生成した場合等にも誘導され、細胞内浄化に関与することから、様々な疾病との関わりが注目されている。
特許文献２では、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物等がオートファジーを誘導する作用を有することが開示されている。
非特許文献４には、植物においてもオートファジーが細胞死や免疫応答に関与すること、オートファジーが植物の生存に必要であることが記載されている。
Ｓ． Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：６７１（２０１９）
ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（１）：ｅ０１６９３６０
玉川大学農学部研究教育紀要第１号：１７−４１（２０１６）
Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１１）１８，１２５７−１２６２
動物、植物、微生物等の細胞でのオートファジーを促進することで様々な疾患又は症状を改善することができる。また細胞のオートファジーを促進することができれば、オートファジーの研究において有益である。
そこで本発明は、オートファジーを促進する作用を有する組成物、細胞においてオートファジーを促進する方法、オートファジーを促進することで細菌の感染を抑制するための組成物、並びに、オートファジーを促進して細菌の感染を抑制する方法を提供する。
本発明者は鋭意検討し、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が細胞におけるオートファジーを促進する作用を有することを見出し、以下の発明を完成した。
本発明の第一の態様は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む、オートファジー促進用組成物である。
本発明の第一の態様は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む、オートファジー促進用組成物である。
本発明の第二の態様は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法である。
本発明の第三の態様は、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されることを特徴とする組成物である。
本発明の第四の態様は、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させることを含む方法である。
本発明の第一の態様に係る組成物は、生体内又は生体外で、細胞のオートファジーを促進することができる。
本発明の第二の態様に係る方法によれば、培養細胞においてオートファジーを促進することができる。
本発明の第三の態様に係る組成物は、動物又は植物の生体内に存在する細胞への、細菌による感染を抑制することができる。
本発明の第四の態様に係る方法によれば、細胞への細菌の感染を抑制することができる。
本発明の第二の態様に係る方法によれば、培養細胞においてオートファジーを促進することができる。
本発明の第三の態様に係る組成物は、動物又は植物の生体内に存在する細胞への、細菌による感染を抑制することができる。
本発明の第四の態様に係る方法によれば、細胞への細菌の感染を抑制することができる。
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体
Ｌ−エルゴチオネインは、ヒスチジン誘導体（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−２−チオヒスチジン）であり、その構造は次式で表される。
Ｌ−エルゴチオネインは、ヒスチジン誘導体（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−２−チオヒスチジン）であり、その構造は次式で表される。
Ｌ−エルゴチオネイン類縁体とは、Ｌ−エルゴチオネインと同等機能を有する化合物であれば良く、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−２−チオヒスチジンが例示でき、その構造は次式で表される。
本発明で用いるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体は、遊離体の形態であってもよく、塩の形態であってもよい。塩は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体のカルボキシル基で形成された塩であってもよいし、トリメチルアミノ基又はジメチルアミノ基で形成された塩であってもよい。また、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体は水和物等の溶媒和物であってもよい。
本発明において「Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体」とは、Ｌ−エルゴチオネイン及びＬ−エルゴチオネイン類縁体から選択される少なくとも１種を指し、複数種の組み合わせも包含する。
オートファジー
オートファジーは、自食作用とも呼ばれ、細胞内の主要な分解経路である。
オートファジーは、自食作用とも呼ばれ、細胞内の主要な分解経路である。
オートファジーは、細胞質中の一部で不要なタンパク質とリン脂質とが集まりオートファゴソームと呼ばれる二重膜構造を形成することと、オートファゴソームにライソソームが融合ししてオートライソソームを形成し、オートライソソームの内部でライソソームに由来する分解酵素の働きで不要なタンパク質が消化されることを含む。
本発明において、オートファジーの促進は、オートファゴソームに特徴的なＬＣ３Ｂ−ＩＩ（ＬＣ３Ｂ−Ｉにフォスファチジルエタノールアミンが結合したもの）の細胞内での増加を指標として評価してもよいし、オートライソソームの増加を指標として評価してもよい。細胞内のＬＣ３Ｂ−ＩＩ量の測定方法は特に限定されないが、例えば、細胞の溶解液中のＬＣ３Ｂ−ＩＩを、抗ＬＣ３Ｂ抗体を用いた免疫学的方法により定量する方法が例示できる。細胞内のオートライソソーム量の測定方法は特に限定されないが、例えば、生細胞内のオートライソソームを特異的に染色することができる試薬（例えばＤＡＬＧｒｅｅｎ）を用いて定量する方法が例示できる。
オートファジー促進用組成物
本発明のオートファジー促進用組成物は、生体内又は生体外において、細胞のオートファジーを促進する作用を有する。
本発明のオートファジー促進用組成物は、生体内又は生体外において、細胞のオートファジーを促進する作用を有する。
本発明のオートファジー促進用組成物が投与又は適用される対象は、動物又は植物の生体、動物又は植物に由来する細胞、或いは、酵母等のオートファジーの機能を有する微生物の細胞であることができる。動物はヒト又は非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）であることができる。
オートファジー促進用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでいても良い。
オートファジー促進用組成物は、医薬組成物、飲食品組成物、肥料組成物、植物生長調節用組成物、飼料組成物、細胞培養用の培地、細胞培養用の培地に添加するための培地添加用組成物等の形態であることができる。
オートファジー促進用組成物が医薬組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、医薬として許容される他の成分、例えば賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。
医薬組成物の剤形は限定されない。医薬組成物の剤形は、例えば、注射剤、輸液剤、経口液剤、ローション等の液体であってもよいし、クリーム、パスタ、軟膏等の半固体であってもよいし、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、座薬等の固体であってもよいし、用時調製可能な乾燥粉末の形態であってもよい。
医薬組成物の投与経路は限定されないが、例えば、経口投与、皮下注射、筋肉注射、皮内注射、静脈注射、輸液、経皮投与、経粘膜投与、経肛門投与等が挙げられる。
医薬組成物におけるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、投与された対象の体内でオートファジーを促進することのできる有効量が投与される含有量であればよい。投与された対象の体内でオートファジーを促進することのできる有効量としては、望まれるオートファジーの促進の程度、投与部位、投与経路等に応じて適宜決定することができるが、例えば、成人に投与する場合は１日あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇであり得る。
医薬組成物は、１日１回〜数回投与されてもよいし、毎日或いは数日に一度の間隔で投与されてもよい。
オートファジー促進用組成物が飲食品組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、飲食品として許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。
飲食品組成物は一般食品のほか、健康食品、特定保健食品、栄養機能食品、機能性表示食品等を包含する。飲食品組成物はサプリメントとして提供されてもよい。
飲食品組成物の形態は特に限定されないが、例えば、既存の飲食品組成物にＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を添加したものであってもよいし、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、キャンディー、飲料、調味料等の形態であってもよい。
飲食品組成物におけるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、摂取したヒトの体内でオートファジーを促進することのできる有効量となる含有量であればよい。摂取したヒトの体内でオートファジーを促進することのできる有効量としては、望まれるオートファジーの促進の程度等に応じて適宜決定することができるが、例えば、成人が経口摂取する場合は１日あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇであり得る。
飲食品組成物は、１日１回〜数回摂取されてもよいし、毎日或いは数日に一度の間隔で摂取されてもよい。
オートファジー促進用組成物が肥料組成物又は植物生長調節用組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、植物への施用が許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。
オートファジー促進用組成物が飼料組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、非ヒト動物への施用が許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。
オートファジー促進用組成物が細胞培養用の培地である場合、培地は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地として使用される成分、例えば基礎培地の成分や、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を含むことができる。
培地中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、例えば０．０００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜２．０ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭが例示できる。
培地は液体、半固形、固体等のいずれの形態であってもよく、特に限定されない。培地はまた、水等の媒体によって希釈することにより所望の成分濃度となる濃縮液又は粉末等の形態であってもよい。
オートファジー促進用組成物が細胞培養用の培地に添加するための培地添加用組成物である場合、培地添加用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地に添加される他の成分、例えば、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を更に含んでもよい。
培地添加用組成物は、培地の調製時に添加されるものであってもよいし、調製済み培地に添加されるものであってもよいし、培養途中の培地に添加されるものであってもよい。
培地添加用組成物中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、培地へ添加された場合に所望のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の濃度となるような量であればよい。培地中の所望の濃度は上記の通りである。
培地添加用組成物の形態はいずれの形態であってもよく、粉末、顆粒、タブレット等の固体、ペースト等の半固体、或いは濃縮液等の液体であってもよい。
オートファジーを促進する方法
本発明はまた、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
本発明はまた、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
本発明の方法が対象とする細胞は、オートファジーの機能を有する細胞であればよく特に限定されないが、例えば、ヒトに由来する細胞、非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）に由来する細胞、植物に由来する細胞、酵母細胞、その他の真核生物細胞等が例示できる。
本発明の方法で用いる培地は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地として使用される成分、例えば基礎培地の成分や、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を含むことができる。培地中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、例えば、０．０００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜２．０ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭが例示できる。
細胞培養のための培養温度、培養時間、培養中の撹拌の有無、継代の有無等の培養条件は、培養しようとする細胞の種類や培養スケールに応じて適宜決定することができる。
細胞への細菌の感染を抑制するための組成物
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、
前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されること
を特徴とする組成物に関する。
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、
前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されること
を特徴とする組成物に関する。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物の生体内の、細菌の感染を抑制しようとする細胞においてオートファジーを促進することを通じて細菌の感染を抑制することができる。特許文献１では、５ｍＭ及び５０ｍＭのＥＧＴが大腸菌の増殖を直接抑制することが記載されているが、特許文献１に記載されている結果からは、より低濃度２．０ｍＭ以下の低濃度のＥＧＴでは大腸菌の増殖を直接抑制することはできない蓋然性が高い。本実施形態は、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭという低濃度のＥＧＴが細胞のオートファジーを促進することを通じて細菌の感染を抑制することを利用するものであり、従来公知の、ＥＧＴによる細菌感染の抑制とは機構及び動物又は植物への投与量が異なる。
前記濃度は好ましくは０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭであり、更に好ましくは０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、最も好ましくは０．１ｍＭ〜０．５ｍＭである。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物の生体における細菌による感染を抑制しようとする細胞の周囲に、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されるものであればよい。本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物に含まれるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、対象となる動物又は植物の種類、体の大きさ、投与経路、投与部位等に応じて適宜調節することができる。例えば、本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、成人に投与する場合は、１日の投与量あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇのＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有するものであることができる。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物が投与される動物又は植物の種類は特に限定されない。動物はヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。植物は単子葉植物であってもよいし双子葉植物であってもよい。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでいても良い。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでいても良い。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、医薬組成物、飲食品組成物、肥料組成物、植物生長調節用組成物、飼料組成物等の形態であることができる。これらの組成物の好ましい形態は、オートファジー促進用組成物について詳述した形態と同様の範囲から選択できる。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物が細菌と接触する前に予め動物又は植物に投与されるものであることが好ましい。
細胞への細菌の感染を抑制する方法
本発明はまた、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させることを含む方法に関する。
本発明はまた、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させることを含む方法に関する。
本実施形態に係る細菌感染抑制方法によれば、生体内又は生体外に存在する細胞への細菌の感染を抑制することができる。前記濃度は好ましくは０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭであり、更に好ましくは０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、最も好ましくは０．１ｍＭ〜０．５ｍＭである。
本実施形態に係る細菌感染抑制方法の対象となる細胞は、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞であればよく、例えば、生体外に存在するヒトに由来する細胞、生体内又は生体外に存在する非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）に由来する細胞、生体内又は生体外に存在する植物に由来する細胞、酵母細胞、その他の真核生物細胞等が例示できる。
前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を細胞に接触させる方法としては、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有する培地中で細胞を培養することや、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有する溶液（緩衝液であってよい）を、細菌感染を抑制しようとする細胞を含む生体内の部位に投与することが例示できる。
前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を細胞に接触させる際の時間は特に限定されないが、好ましくは３〜１６８時間であり、より好ましくは１２〜９６時間である。
本実施形態に係る細菌感染抑制方法は、好ましくは、細胞が細菌と接触するよりも前に行われる。
実験１
６ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい２ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、各試験の細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間又は３時間培養した後に、細胞を、氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液のサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
６ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい２ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、各試験の細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間又は３時間培養した後に、細胞を、氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液のサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
図１は、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での１時間培養及び３時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液をサンプルとした、ウェスタンブロッティングにおけるＰＶＤＦ膜上のＬＣ３Ｂ−Ｉ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩ、βアクチンの染色像を示す。
図２Ａは、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での１時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液のウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＮＴ試験での染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。
図２Ｂは、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での３時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液のウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＮＴ試験での染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。
エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞中のＬＣ３Ｂ−ＩＩ量が増大した。ＬＣ３Ｂ−ＩＩの量の増大は、オートファゴソームの形成が促進されていることを示すことから、本実験の結果は、エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートファゴソームの形成が促進されていることを裏付ける。
実験２
２４ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１．０ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい０．４ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい０．４ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、培地を除去し、１μＭのオートライソソーム染色試薬ＤＡＬＧｒｅｅｎ（同仁化学研究所製）を含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（０．２ｍＬ）を添加した。３０分間培養しＤＡＬＧｒｅｅｎを細胞内に取り込ませた。その後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬで２回洗浄した後、透析処理したＦＢＳ（ＧＢＣＯ社製）を１％含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を０．２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間培養した後に細胞を蛍光顕微鏡（エクリプスＴｓ２ ニコン社製）でランダムに５か所撮影し、オートライソソーム染色像を得た。撮影したオートライソソーム染色像をフォトショップ（アドビー社製）で解析し蛍光強度を数値化した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１．０ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい０．４ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい０．４ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、培地を除去し、１μＭのオートライソソーム染色試薬ＤＡＬＧｒｅｅｎ（同仁化学研究所製）を含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（０．２ｍＬ）を添加した。３０分間培養しＤＡＬＧｒｅｅｎを細胞内に取り込ませた。その後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬで２回洗浄した後、透析処理したＦＢＳ（ＧＢＣＯ社製）を１％含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を０．２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間培養した後に細胞を蛍光顕微鏡（エクリプスＴｓ２ ニコン社製）でランダムに５か所撮影し、オートライソソーム染色像を得た。撮影したオートライソソーム染色像をフォトショップ（アドビー社製）で解析し蛍光強度を数値化した。
図３は、ＮＴ試験及びＥＧＴ試験で培養したＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光染色像である。
図４は、ＮＴ試験及びＥＧＴ試験で培養したＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光染色像での蛍光強度を数値化し、ＮＴ試験での蛍光強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。
エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光強度が増大した。ＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光強度の増大は、オートライソソームの形成が促進されていることを示すことから、本実験の結果は、エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートライソソームの形成が促進されていることを裏付ける。また、実験１の結果との組み合わせから、エルゴチオネインは細胞のオートファジーを促進することが示された。
実験３
６ウェルプレートに、エルゴチオネインを含まない１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）、あるいは、エルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を０．２ｍＭもしくは１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、あるいは、エルゴチオネインを０．１ｍＭもしくは０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換した。２４時間後、細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内では１時間培養した後に細胞を氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られたサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にサンプルをかけた。電気泳動して得られたポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
６ウェルプレートに、エルゴチオネインを含まない１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）、あるいは、エルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を０．２ｍＭもしくは１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、あるいは、エルゴチオネインを０．１ｍＭもしくは０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換した。２４時間後、細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内では１時間培養した後に細胞を氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られたサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にサンプルをかけた。電気泳動して得られたポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
図５は、上記の、エルゴチオネイン（ＥＧＴ）濃度が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭの培地中で培養したＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液サンプルのウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＥＧＴ濃度が０ｍＭの培地中で培養したＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液サンプルでの染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。
０．１ｍＭという低濃度のエルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートファゴソームの形成が促進されたことが示された。
Claims (4)
- Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む、オートファジー促進用組成物。
- Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法。
- 動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、
前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されること
を特徴とする組成物。 - ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、
前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させること
を含む方法。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2022230493A1 (ja) * | 2021-04-26 | 2022-11-03 | サントリーホールディングス株式会社 | 白血球及び／又は好塩基球増加用組成物 |
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| JP2003231626A (ja) * | 2002-02-06 | 2003-08-19 | Noevir Co Ltd | Ａｔｐ産生促進剤 |
| JP2017218431A (ja) * | 2016-06-09 | 2017-12-14 | 株式会社スリービー | 免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進剤 |
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2019
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