JP2020530266A - T7 rnaポリメラーゼバリアント - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、操作されたT7 RNAポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始においてGTPを超えてm7G(5’)ppp(5’)m7Gキャップアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書で提供されるバリアントを使用するための方法を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
配列表、表またはコンピュータープログラムへの言及
配列表の公式の写しは、ASCIIフォーマットのテキストファイルとしてEFS−Webを介して本明細書と同時に提出される(ファイル名「CX8−168CUSP1_ST25.txt」、作成日2017年7月5日、およびサイズ184,320バイト)。EFS−Webを介して提出された配列表は、明細書の一部であり、その全体において本明細書に参考として援用される。
T7 RNAポリメラーゼ(E.C. 2.7.7.6)は、5’から3’の方向においてRNAの形成を触媒する、モノマーの、バクテリオファージによってコードされるDNA指向性RNAポリメラーゼである。転写開始のプロセスにおいて、T7 RNAポリメラーゼは、特異的プロモーター配列(すなわち、T7プロモーター)を認識する。天然に存在するT7 RNAポリメラーゼは、883アミノ酸を含む。それは、T3 RNAポリメラーゼに高度に相同性であり、SP6 RNAポリメラーゼに幾分相同性である。T7は、多数のドメイン(N末端ドメイン、「thumb」、「palm」および「fingers」が挙げられる)から構成される(例えば、Sousa and Mukherjee, Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 73:1−41 [2003]、および米国特許第9,193,959号を参照のこと)。N末端ドメインのコンホメーションは、機能している酵素の開始相と伸長相との間で変化する。
T7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングおよび発現は、記載されている(例えば、米国特許第4,952,496号を参照のこと)。そのプロモーター特異性および高いRNAポリメラーゼ活性に起因して、T7は、種々の適用に使用されている。それはまた、E.coliにおける組換え遺伝子の高レベル発現のために有用である(Studier and Moffat, J. Mol. Biol., 18:113−130 [1986]を参照のこと)。T7はまた、種々の核酸増幅法(診断法において使用されるものを含む)において使用される。安定性および熱安定性はしばしば、診断法の構成要素の開発において重要な行旅事項であることから、T7の熱安定性および安定性を改善することに関する研究が報告されてきた(例えば、米国特許第9,193,959号、同第8,551,752号、および同第7,507,567号などを参照のこと)。にも関わらず、天然に存在する酵素と比較した場合、改善された特性を示すバリアントT7酵素が、当該分野で未だに必要である。
本発明は、操作されたT7 RNAポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始においてGTPを超えて対称的にキャップされたGTPアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書で提供されるバリアントを使用するための方法を提供する。本発明はさらに、本明細書で提供される組成物の使用を提供する。
本発明は、操作されたT7 RNAポリメラーゼバリアントおよびその組成物を提供する。これらのバリアントは、インビトロ転写の開始において、GTPを超えてm7G(5’)ppp(5’)m7Gキャップアナログを選択的に組み込むために考案された。本発明はまた、本明細書に提供されるバリアントを使用する方法を提供する。本発明は、本明細書に提供される組成物の使用をさらに提供する。
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下で記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。このような技術は周知であり、多くのテキストおよび当業者に周知の参照研究の中で記載される。標準的な技術、またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。本明細書で言及される全ての特許、特許出願、文献および刊行物(上記および下記ともに)は、本明細書に明示的に参考として援用される。
いくつかの実施形態において、改善された特性を示す、操作されたT7 RNAポリメラーゼは、配列番号4および/または15と少なくとも約85%、少なくとも約88%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または約100% アミノ酸配列同一性、配列番号4および/もしくは15と比較した場合に、1またはこれより多くのアミノ酸位置(例えば、配列番号4および/もしくは15と比較して、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、14個、15個、20個もしくはこれより多くのアミノ酸位置)においてアミノ酸残基差異、または配列番号4および/もしくは15と少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくはこれより大きなアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態において、配列番号4と比較した場合に、1またはこれより多くの位置におけるその残基差異は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはこれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、その操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドは、表5.3、表5.5、および/または表5.6に列挙されるポリペプチドである。いくつかの実施形態において、その操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドは、配列番号4、15、17、19、21、23、25、27、29、32、33、35、37、および/または39から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号15と比較した場合に、1またはこれより多くの位置における残基差異は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはこれより多くの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、その操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドは、表5.4に列挙されたポリペプチドである。いくつかの実施形態において、その操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドは、配列番号4、15、17、19、21、23、25、27、29、32、33、35、37、および/または39から選択される。
本発明は、本明細書で記載される操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドは、そのポリペプチドを発現し得る組換えポリヌクレオチドを作製するために遺伝子発現を制御する1またはこれより多くの異種調節配列に作動可能に連結される。その操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、その相当するT7 RNAポリメラーゼポリペプチドを発現するために適切な宿主細胞へと導入され得る。
本発明は、種々の組成物および形式(以下で記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない)を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、診断目的で組成物における使用に適した操作されたT7 RNAポリメラーゼポリペプチドを提供する。
以下の実施例は、達成された実験および結果を含め、例証目的で提供されるに過ぎず、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
T7 RNAポリメラーゼ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
野生型(WT)T7 RNAポリメラーゼ酵素(配列番号2)は、バクテリオファージ T7のゲノム(配列番号1)によってコードされる。T7 RNAポリメラーゼの6−ヒスチジンタグ化バージョン(配列番号4)をコードする合成遺伝子(配列番号3)を構築し、Escherichia coli発現ベクターpCK100900iへとサブクローニングした(例えば、米国特許第7,629,157号および米国特許出願公開2016/0244787(ともに参考として援用される)を参照のこと)。これらのプラスミド構築物を、W3110に由来するE.coli株へと形質転換した。当業者によって一般に公知の指向性進化技術を、これらのプラスミドから遺伝子バリアントのライブラリーを生成するために使用した(例えば、米国特許第8,383,346号およびWO 2010/144103(これらはともに、参考として援用される)を参照のこと)。本明細書で記載される酵素バリアントにおける置換は、示されるように、6His標的化WT T7 RNAポリメラーゼ酵素(すなわち、配列番号4)またはそのバリアントを参照して示される。
ハイスループット(HTP)でのT7 RNAポリメラーゼ発現および精製
この実施例では、T7 RNAポリメラーゼバリアントのT7 RNAポリメラーゼ発現および精製で行われる実験が記載される。
形質転換されたE.coli細胞を、1% グルコースおよび30μg/ml クロラムフェニコールを含むLBアガープレート上にプレートすることによって選択した。37℃で一晩インキュベートした後、コロニーを、180μl/ウェル LB培地(1% グルコースおよび30μg/ml クロラムフェニコールを補充)を満たした96ウェル浅平底NUNCTM(Thermo−Scientific)プレートのウェルへと入れた。その培養物を、18〜20時間にわたって振盪機(200rpm、30℃、および85% 相対湿度; Kuhner)において一晩増殖させた。一晩増殖サンプル(20μL)を、380μLのTerrific Broth(30μg/ml クロラムフェニコールを補充)を満たしたCostar 96ウェルディーププレートに移した。そのプレートを、120分間、振盪機(250rpm、30℃、および85% 相対湿度; Kuhner)において、OD600が0.4〜0.8の間に達するまでインキュベートした。次いで、その細胞を、40μLの、滅菌水中10mM IPTGで誘導し、18〜20時間にわたって一晩、振盪機(250rpm、30℃、および85% 相対湿度; Kuhner)においてインキュベートした。その細胞をペレットにし(4000rpm×20分間)、その上清を廃棄し、その細胞を、分析する前に−80℃において凍結した。
細胞ペレットを、400μLの溶解緩衝液(20mM Tris pH7.5、1mM MgSO4、1mg/ml リゾチーム、および0.5mg/ml ポリミキシンB硫酸)中に再懸濁し、その混合物を、1.5時間室温において撹拌した。次いで、溶解物をペレットにし(4000rpm×5分間)、その清澄にした上清を精製のためにとっておいた。
T7RNAPを、清澄にしたE.coli溶解物から、His−−Select((登録商標)高キャパシティ(HC)ニッケルコーティングされたプレート(Sigma)を使用する金属−アフィニティークロマトグラフィーによって、製造業者の説明書に従って精製した。His−Select(登録商標)プレートを、1ウェルあたり合計800μlの洗浄緩衝液(50mM リン酸ナトリウム pH7.5、300mM NaCl、25mM イミダゾール、0.1% v/v TWEEN−20(登録商標)試薬[Sigma])で平衡化した。次いで、T7RNAPを含む200μlのHTP溶解物と200μlの洗浄緩衝液を混合し、プレートに装填し、1分間、2000相対遠心力(rcf)および4℃において遠心分離した。そのプレートを、600μlの洗浄緩衝液/ウェルで2回洗浄した(各洗浄に関して、3000rcfおよび4℃において3分間の遠心分離)。酵素サンプルを、4℃において、3000rcfで1分間の遠心分離によって、200μl 溶離緩衝液(50mM リン酸ナトリウム pH7.5、300mM NaCl、250mM イミダゾール、0.1% v/v TWEEN(登録商標)−20試薬)を添加して溶離した。
T7 RNAポリメラーゼの振盪フラスコ発現および精製
この実施例では、T7RNAPの振盪フラスコ発現および精製を含む実験を記載する。
実施例2に記載されるように増殖させた、選択されたHTP培養物を、1% グルコースおよび30μg/ml クロラムフェニコールを有するLBアガープレート上にプレートし、37℃で一晩増殖させた。各培養物からの単一コロニーを、1% グルコースおよび30μg/ml クロラムフェニコールを有する6mlのLBブロスに移した。その培養物を、18時間、30℃、250rpmにおいて増殖させ、30μg/mlのクロラムフェニコールを有する250mlのTerrific Brothへとおよそ1:10の希釈で0.2の最終OD600へと継代した。その培養物をおよそ3時間、30℃、250rpmにおいて、0.6〜0.8のOD600へとインキュベートし、次いで、1mMの最終濃度においてIPTGを添加して誘導した。その誘導した培養物を、20時間、30℃、250rpmにおいてインキュベートした。そのインキュベーション期間の後、その培養物を4000rpm×10分間で遠心分離した。その培養上清を廃棄し、そのペレットを、35ml 溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、pH7.5、500mM NaCl、0.1% Tween−20、10mM イミダゾール)中に再懸濁した。この細胞懸濁物を、アイスバスの中で冷却し、Microfluidizer細胞破砕機(Microfluidics M‐110L)を使用して溶解した。その粗製溶解物を、遠心分離(16,000rpmで60分間、4℃)によってペレットにし、次いで、その上清を、0.2μm PES膜を通じて濾過して、その溶解物をさらに清澄にした。
T7RNAP溶解物を、AKTA Start精製システムおよびAC Step HiF設定(実行パラメーターは、以下に提供される)を使用する5ml HisTrap FFカラム(GE Healthcare)を使用して精製した。そのSF洗浄緩衝液を、50mM リン酸ナトリウム pH7.5、500mM NaCl、0.1% v/v TWEEN−20(登録商標)試薬(Sigma)、および25mM イミダゾールから構成した。そのSF溶離緩衝液を、50mM リン酸ナトリウム pH7.5、500mM NaCl、0.1% v/v TWEEN−20(登録商標)試薬(Sigma)、および300mM イミダゾールから構成した。
転写反応
転写反応を、キャップアナログ α,γ−ビス (N7−メチルグアノシン)トリホスフェート(「m7G(5’)ppp(5’)m7G」、「キャップされたGTP」、または「キャップ」ともいわれる)で組み立てた(Grudzien et. al., RNA, 10:1479−87 [2004]を参照のこと)。操作された転写DNAテンプレートGlmS−16A(配列番号5)は、Bacillus anthracis GlmSリボスイッチのコード配列(配列番号6)に連結されたT7RNAPプロモーター配列を含む。そのリガンド、グルコサミン−6−ホスフェートで誘導すると、GlmSリボスイッチは自己切断し、16マーRNAヌクレオチド(配列番号7)をその転写物の5’末端から放出し、これは、キャップ構造またはキャップされていない5’ホスフェートを含む。この小さな16マーRNAオリゴヌクレオチド切断産物は、キャップされた種およびキャップされていない種を区別するために使用した、イオン化およびLC−MSによる分析を施すことができた。
LC−MS活性アッセイ
この実施例はより短いキャップされた5’−およびキャップされていない5’ よりホスフェート切断生成物の分析のために、、Thermo LTQ MSシステムを使用してより小さなRNAフラグメントの分離のために開発されたLC−MS法を記載する。
RNA収量の決定
インビトロ転写反応を、ルシフェラーゼテンプレート(配列番号10)を使用することを除いて、実施例4に記載されるとおりに行った。インビトロ転写反応からのmRNA収量を、Quant−iT RNA Assayキット(広範囲、Q−33140, Thermo Fisher)に関する製造業者のプロトコルに従って行った。mRNA存在量を、アッセイキットに伴って提供されるmRNA標準に関して導出される標準曲線を使用して計算した。
T7RNAPバリアント転写忠実度の決定
ポリメラーゼ忠実度を、バリアントポリメラーゼから転写されたmRNAに由来する多数のRT−PCRクローンを直接配列決定することに基づいて測定した。インビトロ転写反応を、0.5mM m7G(5’)ppp(5’)m7G、5.5mM GTPを使用し、グルコサミン−6−ホスフェートを省略して、実施例4に記載されるとおりに行った。m7G(5’)ppp(5’)m7Gを含めることは、プロセス関連条件下で、WTおよびバリアントポリメラーゼのエラー率へのこのキャップアナログ(あるとすれば)の寄与の測定を可能にした。1.7kb ルシフェラーゼテンプレートDNA(配列番号8)は、全長mRNA転写物を生成するために、野生型およびバリアントT7 RNAPを使用する転写のためのDNAテンプレートとして働いた。RNAを、Zymo RNA Clean and concentrator−25キット(Zymo Research)を使用して単離し、残留DNAを、DNA非含有DNAase Iキット(Ambion/ Thermo Fisher)での2連続処理によって、RNAサンプルから除去した。サンプルを、オリゴ−(dT)25プライマー(配列番号40)を使用してAccuprime Reverse Transcriptase(Agilent)で逆転写し、そのルシフェラーゼテンプレート上のポリ(A)テールにアニールした。次いで、そのRT反応を、HF緩衝液(New England Biolabs)を使用して、PCRを介してPHUSION(登録商標)高忠実度DNAポリメラーゼを使用して増幅して、1675−bpアンプリコンを、ルシフェラーゼコード配列にアニールする遺伝子特異的プライマー(配列番号12、配列番号13)を使用して生成した。増幅したフラグメントを、BglI(New England Biolabs)で消化し、クローニングベクターへとライゲーションし、形質転換して、E.coliにおいて単一クローンを生成した。
Claims (28)
- 配列番号4および/もしくは15の参照配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはこれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的フラグメントを含む操作されたRNAポリメラーゼであって、ここで該操作されたRNAポリメラーゼは、少なくとも1個の置換または該ポリペプチド配列における置換セットを含み、ここで該ポリペプチド配列のアミノ酸置換は、配列番号4もしくは15を参照して番号付けされる、操作されたRNAポリメラーゼ。
- 少なくとも1個の置換または置換セットは、397/513/635、397/513/635/660、513/660/664、513/635/660、513/635/664、513/660/664、および660/664、ならびに/またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号4を参照して番号付けされる、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 少なくとも1個の置換または置換セットは、397、397/513、397/513/635、397/513/635、397/513/635/656、397/513/635/656/660、397/513/635/656/660/664、397/513/635/656/664、397/513/635/660、397/513/635/660/664、397/513/635/664、397/513/656/660、397/513/660、397/513/660/664、397/513/664、397/513、397/635、397/635/656/660/664、397/635/656/664、397/635/660、397/635/664、397/635/664/850、397/660、397/664、および/またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号4を参照して番号付けされる、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 少なくとも1個の置換または置換セットは、113/137/513、136/357/404/514、136/357/514、136/394/404/446、136/401、136/401/404、136/404/446、136/404/514、136/446、136/514、137、137/401、137/401/513、137/401/513、137/513、137/513/621、137/635、137/656、357/394/401/404/514、357/394/446/514、357/514、394/446/514、401/404、401/404/514、401/513/635、401/635、513/635、513/635/656、513/660、635/656、635/660、および660、ならびに/またはこれらの任意の組み合わせから選択され、ここで該アミノ酸位置は、配列番号15を参照して番号付けされる、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたRNAポリメラーゼは、表5.3、表5.4、表5.5、および/または表5.6に示される少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたRNAポリメラーゼは、表5.3、表5.4、表5.5、および/または表5.6で提供されるバリアントの操作されたポリメラーゼである、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたRNAポリメラーゼは、配列番号4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、および/または39に示される少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼバリアントの配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはこれより高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたRNAポリメラーゼは、配列番号4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、または39に示されるバリアントの操作されたポリメラーゼを含む、請求項1に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたポリメラーゼは、野生型T7 RNAポリメラーゼと比較して、少なくとも1つの改善された特性を示す、請求項1〜8のいずれかに記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記少なくとも1つの改善された特性は、転写開始の間のGTPに対するキャップアナログの改善された選択性、改善されたタンパク質発現、貯蔵緩衝液中の改善された安定性、および反応条件下での改善された安定性から選択される、請求項9に記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記ポリメラーゼは、RNA収量、転写忠実度、熱安定性、タンパク質発現、−20℃での安定性、または野生型T7 RNAポリメラーゼに等しい反応条件での安定性を維持する、請求項1〜10のいずれかに記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 前記操作されたポリメラーゼは、精製されている、請求項1〜11のいずれかに記載の操作されたRNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜12のいずれかに記載の少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列。
- 配列番号4および/もしくは15の参照配列と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはこれより高い配列同一性を含む少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼ、またはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列であって、ここで該操作されたRNAポリメラーゼは、1またはこれより多くのアミノ酸位置において少なくとも1個の置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
- 配列番号4、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37および/もしくは39と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはこれより高い配列同一性を含む少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼ、またはその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列。
- 少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、ここで該ポリヌクレオチド配列は、配列番号3、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、および/もしくは38と少なくとも85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはこれより高い配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結される、請求項13〜16のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
- 前記ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化される、請求項13〜16のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
- 請求項13〜18のいずれかに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 少なくとも1つの請求項19に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 操作されたRNAポリメラーゼを宿主細胞において生成するための方法であって、該方法は、請求項20に記載の宿主細胞を適切な培養条件下で培養する工程であって、少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼを生成する工程を包含する方法。
- 前記培養物および/または宿主細胞から少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼを回収する工程をさらに包含する、請求項21に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの操作されたRNAポリメラーゼを精製する工程をさらに包含する、請求項21および/または22に記載の方法。
- 少なくとも1つの請求項1〜12のいずれかに記載の操作されたRNAポリメラーゼを含む組成物。
- キャップされたRNA転写物を生成するための方法であって、該方法は、i)少なくとも1つの請求項1〜12のいずれかに記載の操作されたRNAポリメラーゼ、ジヌクレオチドキャップアナログ、およびii)DNAテンプレートを含む組成物を提供する工程;該DNAテンプレートを該組成物に、該操作されたRNAポリメラーゼがキャップされたRNA転写物を生成するような条件下で曝す工程を包含する方法。
- 前記ジヌクレオチドキャップアナログは、α,γ−ビス(N7−メチルグアノシン)トリホスフェート(m7G(5’)ppp(5’)m7G)またはアンチリバースキャップアナログ3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)Gである、請求項25に記載の方法。
- 前記ジヌクレオチドキャップアナログは、α,γ−ビス(N7−メチルグアノシン)トリホスフェートである、請求項25および/または26に記載の方法。
- 無機ピロホスファターゼの添加をさらに包含する、請求項25〜27のいずれかに記載の方法。
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