JP2020528893A - グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇ６ｐｄ）調節剤及びｇ６ｐｄ欠乏症の治療方法 - Google Patents

グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇ６ｐｄ）調節剤及びｇ６ｐｄ欠乏症の治療方法 Download PDF

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Abstract

本開示の態様は、Ｇ６ＰＤ調節剤及びかかる調節剤を用いる試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の調節方法を含む。Ｇ６ＰＤ調節剤は二量体であってもよく、リンカーを介して結合した２つの末端炭素環または複素環基を含んでいてもよい。場合によっては、上記調節剤はジアミノを含有するリンカーを含む。特定の場合において、上記調節剤は２つのアミノ置換基を含む。対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病の治療方法であって、対象に、有効量のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異体Ｇ６ＰＤを選択的に活性化し、上記対象を治療することを含む上記方法も提供される。本主題の方法を実施するためのキット及び組成物も提供される。

Description

相互参照
本出願は、２０１７年７月２５日出願の米国仮特許出願第６２／５３６，９２５号の優先権を主張し、該出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された、契約ＨＤ０８４４２２及びＴＲ００１０８５に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
我々の体の細胞には、抗酸化物質を産生することによって酸化ストレスに対抗するいくつかの機序がある。抗酸化物質の天然源の１つは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）として知られる酵素の活性によって生じる。Ｇ６ＰＤはペントースリン酸経路の最初の且つ律速の段階を触媒し、該段階において還元ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が生成する。次にＮＡＤＰＨは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の供給を維持するために使用され、ＧＳＨは抗酸化物質のバランスを調節し、延いては細胞を酸化的損傷から保護する上で重要な役割を果たす。特に、ミトコンドリアが存在しない赤血球は、ＮＡＤＰＨを生成する他の手段をもたず、抗酸化物質の生成を専らＧ６ＰＤに依存している。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠乏症は、２番目に多いヒトの遺伝的障害であり、Ｇ６ＰＤの１６０を超える異なる点変異によって引き起こされる。これらの変異は、局所的な構造的完全性を乱し、それにより酵素の活性及び／もしくは安定性が完全にまたは部分的に失われ、延いては生理学的な抗酸化物質のバランスを崩し、それに伴ってＮＡＤＰＨ及びＧＳＨレベルが著しく低下し、その結果として細胞における酸化ストレスに対する脆弱性が増加する。Ｇ６ＰＤ欠乏症の個体は、酸化ストレスに対して保護されていないことから、治療を受けないでいると、溶血性貧血、新生児黄疸、及び核黄疸（ビリルビン誘導性脳損傷）に非常に罹患しやすくなる。現時点では、かかる転帰にもかかわらず、酸化ストレス因子の回避及び／または対症療法以外に、Ｇ６ＰＤ欠乏症を治療するために利用可能な薬剤はなく、したがって、Ｇ６ＰＤ欠乏症を治療することができる化合物及び治療方法は大きな関心事である。
本開示の態様は、Ｇ６ＰＤ調節剤及びかかる調節剤を用いる試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の調節方法を含む。Ｇ６ＰＤ調節剤は二量体であってもよく、リンカーを介して結合した２つの末端炭素環または複素環式基を含んでいてもよい。場合によっては、上記調節剤はジアミノを含有するリンカーを含む。特定の場合において、上記調節剤は２つのアミノ置換基を含む。対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病の治療方法であって、対象に、有効量のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異体Ｇ６ＰＤを選択的に活性化し、上記対象を治療することを含む上記方法も提供される。本主題の方法を実施するためのキット及び組成物も提供される。
図１Ａ〜図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ（広東）Ｇ６ＰＤ（Ｒ４５９Ｌ）変異体がＷＴ（野生型）Ｇ６ＰＤとは生化学的に異なることを示す図である。図１ＡはＧ６ＰＤ活性の酵素スキームを示す。図１Ｂは、表示した対象である一般的な変異体を含む、Ｇ６ＰＤドメイン構造のリニアマップを示す。図１Ｃは、組み換えＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の触媒活性のグラフを、動力学的パラメータと共に示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図１Ｄは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の熱安定性のグラフを示す（ｎ＝３、Ｐ＝０．００２）。図１Ｅは、キモトリプシンと共に１時間インキュベートした後のＧ６ＰＤタンパク質レベル及び残存Ｇ６ＰＤ活性（ＮＴ（未処理）の各酵素に対して規格化）を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＝０．００４６、＊Ｐ＝０．０２３７）。図１Ｆは、対応する対象に由来するリンパ球における、ｄｅ ｎｏｖｏタンパク質生合成を遮断するシクロヘキシミド処理（５０μｇ／ｍＬ）によるタンパク質の安定性評価を表すグラフを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０２５５）。タンパク質レベルは０時間（未処理）における各酵素のレベルに対して規格化した。図１Ｇは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中でＧ６ＰＤ活性がより低かったことを表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含むリンパ球が生成するＧＳＨがより少なく、生成する活性酸素種（ＲＯＳ）がより多く、且つ生存度がより低いことを表すデータのグラフを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．００８；ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０４２１；ｎ＝４、＊＃Ｐ＝０．００６１）。誤差棒は平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図１Ａ〜図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ（広東）Ｇ６ＰＤ（Ｒ４５９Ｌ）変異体がＷＴ（野生型）Ｇ６ＰＤとは生化学的に異なることを示す図である。図１ＡはＧ６ＰＤ活性の酵素スキームを示す。図１Ｂは、表示した対象である一般的な変異体を含む、Ｇ６ＰＤドメイン構造のリニアマップを示す。図１Ｃは、組み換えＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の触媒活性のグラフを、動力学的パラメータと共に示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図１Ｄは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の熱安定性のグラフを示す（ｎ＝３、Ｐ＝０．００２）。図１Ｅは、キモトリプシンと共に１時間インキュベートした後のＧ６ＰＤタンパク質レベル及び残存Ｇ６ＰＤ活性（ＮＴ（未処理）の各酵素に対して規格化）を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＝０．００４６、＊Ｐ＝０．０２３７）。図１Ｆは、対応する対象に由来するリンパ球における、ｄｅ ｎｏｖｏタンパク質生合成を遮断するシクロヘキシミド処理（５０μｇ／ｍＬ）によるタンパク質の安定性評価を表すグラフを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０２５５）。タンパク質レベルは０時間（未処理）における各酵素のレベルに対して規格化した。図１Ｇは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中でＧ６ＰＤ活性がより低かったことを表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含むリンパ球が生成するＧＳＨがより少なく、生成する活性酸素種（ＲＯＳ）がより多く、且つ生存度がより低いことを表すデータのグラフを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．００８；ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０４２１；ｎ＝４、＊＃Ｐ＝０．００６１）。誤差棒は平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図１Ａ〜図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ（広東）Ｇ６ＰＤ（Ｒ４５９Ｌ）変異体がＷＴ（野生型）Ｇ６ＰＤとは生化学的に異なることを示す図である。図１ＡはＧ６ＰＤ活性の酵素スキームを示す。図１Ｂは、表示した対象である一般的な変異体を含む、Ｇ６ＰＤドメイン構造のリニアマップを示す。図１Ｃは、組み換えＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の触媒活性のグラフを、動力学的パラメータと共に示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図１Ｄは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の熱安定性のグラフを示す（ｎ＝３、Ｐ＝０．００２）。図１Ｅは、キモトリプシンと共に１時間インキュベートした後のＧ６ＰＤタンパク質レベル及び残存Ｇ６ＰＤ活性（ＮＴ（未処理）の各酵素に対して規格化）を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＝０．００４６、＊Ｐ＝０．０２３７）。図１Ｆは、対応する対象に由来するリンパ球における、ｄｅ ｎｏｖｏタンパク質生合成を遮断するシクロヘキシミド処理（５０μｇ／ｍＬ）によるタンパク質の安定性評価を表すグラフを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０２５５）。タンパク質レベルは０時間（未処理）における各酵素のレベルに対して規格化した。図１Ｇは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中でＧ６ＰＤ活性がより低かったことを表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含むリンパ球が生成するＧＳＨがより少なく、生成する活性酸素種（ＲＯＳ）がより多く、且つ生存度がより低いことを表すデータのグラフを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．００８；ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０４２１；ｎ＝４、＊＃Ｐ＝０．００６１）。誤差棒は平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図１Ａ〜図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ（広東）Ｇ６ＰＤ（Ｒ４５９Ｌ）変異体がＷＴ（野生型）Ｇ６ＰＤとは生化学的に異なることを示す図である。図１ＡはＧ６ＰＤ活性の酵素スキームを示す。図１Ｂは、表示した対象である一般的な変異体を含む、Ｇ６ＰＤドメイン構造のリニアマップを示す。図１Ｃは、組み換えＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の触媒活性のグラフを、動力学的パラメータと共に示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図１Ｄは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の熱安定性のグラフを示す（ｎ＝３、Ｐ＝０．００２）。図１Ｅは、キモトリプシンと共に１時間インキュベートした後のＧ６ＰＤタンパク質レベル及び残存Ｇ６ＰＤ活性（ＮＴ（未処理）の各酵素に対して規格化）を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＝０．００４６、＊Ｐ＝０．０２３７）。図１Ｆは、対応する対象に由来するリンパ球における、ｄｅ ｎｏｖｏタンパク質生合成を遮断するシクロヘキシミド処理（５０μｇ／ｍＬ）によるタンパク質の安定性評価を表すグラフを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０２５５）。タンパク質レベルは０時間（未処理）における各酵素のレベルに対して規格化した。図１Ｇは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中でＧ６ＰＤ活性がより低かったことを表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図１Ｈ、図１Ｉ、及び図１Ｊは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を含むリンパ球が生成するＧＳＨがより少なく、生成する活性酸素種（ＲＯＳ）がより多く、且つ生存度がより低いことを表すデータのグラフを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．００８；ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０４２１；ｎ＝４、＊＃Ｐ＝０．００６１）。誤差棒は平均値±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）を表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図２Ａ〜図２Ｄは共に、Ｃａｎｔｏｎ変異（Ｒ４５９Ｌ）が本質的なヘリックス間相互作用を損ねることを示す図である。図２ＡはＷＴ Ｇ６ＰＤ（緑色）とＣａｎｔｏｎ変異体（橙色）との構造の重なり合い（ｏｖｅｒｌａｙ）を示す。構造ＮＡＤＰ＋は球として示し、矢印及び円はＧ６Ｐ結合部位及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位を示す（Ｇ６Ｐ及び触媒ＮＡＤＰ＋は本発明者らの構造中には観測されなかった）。図２Ｂは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ中のαｎヘリックス上のＲ４５９、ならびに隣接するヘリックス（αｅ）上のＤ１８１及びＮ１８５の側鎖を介したヘリカル間相互作用を示す（左側の図）。Ｃａｎｔｏｎ変異によってかかる相互作用は喪失し、上記ヘリックス（αｅ）及び該ヘリックスに先行するＫ１７１、Ｐ１７２、Ｆ１７３、Ｇ１７４、及びＲ１７５を含むループを生じる（右側の図）。図２Ｃは、上記αｅヘリックス上のＲ４５９相互作用残基の変異がＣａｎｔｏｎ変異様活性及び熱安定性を示したことを表すデータを示し（ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、図２Ｄは、キモトリプシン処理に対する感受性を表すデータを示す（ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＝０．０００６、＊Ｐ＝０．０２３）。誤差棒は平均値±ＳＥＭを表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図２Ａ〜図２Ｄは共に、Ｃａｎｔｏｎ変異（Ｒ４５９Ｌ）が本質的なヘリックス間相互作用を損ねることを示す図である。図２ＡはＷＴ Ｇ６ＰＤ（緑色）とＣａｎｔｏｎ変異体（橙色）との構造の重なり合い（ｏｖｅｒｌａｙ）を示す。構造ＮＡＤＰ＋は球として示し、矢印及び円はＧ６Ｐ結合部位及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位を示す（Ｇ６Ｐ及び触媒ＮＡＤＰ＋は本発明者らの構造中には観測されなかった）。図２Ｂは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ中のαｎヘリックス上のＲ４５９、ならびに隣接するヘリックス（αｅ）上のＤ１８１及びＮ１８５の側鎖を介したヘリカル間相互作用を示す（左側の図）。Ｃａｎｔｏｎ変異によってかかる相互作用は喪失し、上記ヘリックス（αｅ）及び該ヘリックスに先行するＫ１７１、Ｐ１７２、Ｆ１７３、Ｇ１７４、及びＲ１７５を含むループを生じる（右側の図）。図２Ｃは、上記αｅヘリックス上のＲ４５９相互作用残基の変異がＣａｎｔｏｎ変異様活性及び熱安定性を示したことを表すデータを示し（ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、図２Ｄは、キモトリプシン処理に対する感受性を表すデータを示す（ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＝０．０００６、＊Ｐ＝０．０２３）。誤差棒は平均値±ＳＥＭを表す。ＮＴ：未処理、Ｃｈｙ：キモトリプシン。 図３Ａ〜図３Ｋは、例示的な化合物ＡＧ１（Ｇ６ＰＤの活性化剤）がＣａｎｔｏｎ変異体における生化学的変化を誘発することを示す図である。図３Ａは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の活性を７０％増加させたことを表すグラフを示す。図３Ｂは、約３μＭのＥＣ５０のＡＧ１による活性化のグラフを示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＝０．０００２）。ＡＧ１はＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの動力学的パラメータを変化させた（以下の実験項中の表５を参照のこと）。図３Ｃは、ＡＧ１が用量依存的にＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの二量体化を促進したことを示す（ｎ＝３）。図３Ｄは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのタンパク質分解感受性を低下させたことを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０１７７）。上記タンパク質レベルは、未処理（ＮＴ）条件における酵素のレベルに対して規格化した。図３Ｅは、ＡＧ１がシクロヘキシミド追跡アッセイにおいてＣａｎｔｏｎ変異体を保有するリンパ球におけるタンパク質安定性を軽度に増加させたことを示す（ｎ＝３）。タンパク質レベルは、時間０における各酵素のレベルに対して規格化した。図３Ｆ、図３Ｇ、及び図３Ｈは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中のＧ６ＰＤ活性を増加させ、培養物中のＧＳＨレベルを軽度に高め、ＲＯＳレベルを軽度に低下させたことを表すデータを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＝０．００３１）。図３Ｉは、ＡＧ１が、Ｃａｎｔｏｎ変異体を保有するリンパ球の生存度をわずかに増加させたことを表すデータを示す（ｎ＝４）。図３Ｊは、ＡＧ１がそれぞれＡ−（Ｖ６８Ｍ、Ｎ１２６Ｄ）、Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ（地中海）（Ｓ１８８Ｆ）、及びＫａｉｐｉｎｇ（開平）（Ｒ４６３Ｈ）変異体を含む他の主要なＧ６ＰＤ変異体も活性化したことを表すデータを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＝０．０１１）。図３Ｋは、ＡＧ１が他の主要なＧ６ＰＤ変異体の二量体化を促進したことを示すデータを示す（ｎ＝３）。イン・ビトロアッセイには１００μＭのＡＧ１を使用し、細胞ベースのアッセイには１μＭのＡＧ１を使用した。５％ＤＭＳＯをビヒクル（Ｖｅｈ）として使用した。細胞を４８時間血清飢餓に供した。誤差棒は平均値±ＳＥＭを表す。ＭＷ：分子量、ＮＴ：未処理。 図３Ａ〜図３Ｋは、例示的な化合物ＡＧ１（Ｇ６ＰＤの活性化剤）がＣａｎｔｏｎ変異体における生化学的変化を誘発することを示す図である。図３Ａは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素の活性を７０％増加させたことを表すグラフを示す。図３Ｂは、約３μＭのＥＣ５０のＡＧ１による活性化のグラフを示す（ｎ＝５、＊＊＊Ｐ＝０．０００２）。ＡＧ１はＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの動力学的パラメータを変化させた（以下の実験項中の表５を参照のこと）。図３Ｃは、ＡＧ１が用量依存的にＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの二量体化を促進したことを示す（ｎ＝３）。図３Ｄは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのタンパク質分解感受性を低下させたことを示す（ｎ＝３、＊Ｐ＝０．０１７７）。上記タンパク質レベルは、未処理（ＮＴ）条件における酵素のレベルに対して規格化した。図３Ｅは、ＡＧ１がシクロヘキシミド追跡アッセイにおいてＣａｎｔｏｎ変異体を保有するリンパ球におけるタンパク質安定性を軽度に増加させたことを示す（ｎ＝３）。タンパク質レベルは、時間０における各酵素のレベルに対して規格化した。図３Ｆ、図３Ｇ、及び図３Ｈは、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ変異体を含む細胞溶解物中のＧ６ＰＤ活性を増加させ、培養物中のＧＳＨレベルを軽度に高め、ＲＯＳレベルを軽度に低下させたことを表すデータを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＝０．００３１）。図３Ｉは、ＡＧ１が、Ｃａｎｔｏｎ変異体を保有するリンパ球の生存度をわずかに増加させたことを表すデータを示す（ｎ＝４）。図３Ｊは、ＡＧ１がそれぞれＡ−（Ｖ６８Ｍ、Ｎ１２６Ｄ）、Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ（地中海）（Ｓ１８８Ｆ）、及びＫａｉｐｉｎｇ（開平）（Ｒ４６３Ｈ）変異体を含む他の主要なＧ６ＰＤ変異体も活性化したことを表すデータを示す（ｎ＝４、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＝０．０１１）。図３Ｋは、ＡＧ１が他の主要なＧ６ＰＤ変異体の二量体化を促進したことを示すデータを示す（ｎ＝３）。イン・ビトロアッセイには１００μＭのＡＧ１を使用し、細胞ベースのアッセイには１μＭのＡＧ１を使用した。５％ＤＭＳＯをビヒクル（Ｖｅｈ）として使用した。細胞を４８時間血清飢餓に供した。誤差棒は平均値±ＳＥＭを表す。ＭＷ：分子量、ＮＴ：未処理。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図４Ａ〜図４Ｊは、例示的な化合物ＡＧ１がＧ６ＰＤ依存的にＲＯＳ誘発性心膜浮腫を減少させることを示す図である。図４Ａは、２４ｈｐｆ（受精後時間）において、クロロキンを含む及び含まない１μＭ ＡＧ１（ＣＱ；５０μｇ／ｍｌ）で処理し、３２ｈｐｆにおいてスコア付けしたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。胚の向きは前部が左側である側面像である。スケールバー：３００μｍ。図４Ｂは、３つの独立した一腹卵由来の個々のＷＴ胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。胚を２４ｈｐｆにおいて５時間処理した後にＲＯＳを測定した。誤差棒は平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ多重比較検定、Ｄｕｎｎの検定を用いて調整したＰ値：＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない、Ｐ＞０．９９）。図４Ｃは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図４Ｄは、ｇ６ｐｄのエクソン１０を標的とするｓｇＲＮＡ（ガイド単独）またはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質（ガイド＋Ｃａｓ９）のいずれかを注射し、Ｇ６ＰＤ Ｆ０ ｃｒｉｓｐａｎｔを生成させたゼブラフィッシュ胚の画像を示す。左側の図に代表的な表現型の画像を示す。処理条件は図４Ａに関して説明したものと同一である。図４Ｅは、ｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９タンパク質を注射した個々の胚におけるＲＯＳレベルのグラフを示す。処理条件及び統計的処理は図４Ｂに関して説明したものと同一である（＊Ｐ＝０．０２６７、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝統計的に有意ではない）。図４Ｆは、プールした胚の溶解物を用いて測定したＧ６ＰＤ活性及びＮＡＤＰＨレベルのグラフを示す。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤを表す（＊Ｐ＜０．０５）。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル。図４Ｇは、ヒト赤血球のクロロキンに誘発された溶血がＡＧ１（１μＭ）処理によって救済されたことを示す（ｎ＝３、Ａ〜Ｃは３つの独立した試料を表す）。図４Ｈは、ＡＧ１が冷蔵温度での赤血球の貯蔵を改善するかどうかを、２８日間の溶血を監視することにより調べたことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。溶血の表現型画像を示した。図４Ｉは、赤血球の膜損傷を調べるために赤血球からのタンパク質漏出を測定したことを示す（ｎ＝９、＊Ｐ＜０．０５）。図４Ｊは、ＡＧ１の存在下でヒト溶血物中のＧ６ＰＤ活性が測定したことを示す（ｎ＝１５、＊Ｐ＜０．０５）。誤差棒は繰り返し測定の平均値±ＳＤ（ゼブラフィッシュにおけるアッセイ）またはＳＥＭ（赤血球のアッセイ）を表す。ＣＱ：クロロキン、Ｖｅｈ：ビヒクル、ＫＯ：ノックアウト。 図５Ａ〜図５Ｈは、ＡＧ１が酸化ストレス因子への曝露に際しての溶血を低減することを示す図である。図５Ａは、ＡＧ１が、光線下で４時間、１ｍＭクロロキン（ＣＱ）、または３７℃で４時間、１ｍＭジアミドのいずれかで処理した５％赤血球懸濁液の溶血の程度を低下させたことを示す（ｎ＝７の独立した血液試料、＊Ｐ＝０．０３７２、＊＊Ｐ＝０．００１９、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ〜図５Ｄは、５％赤血球懸濁液を１ｍＭクロロキンまたはジアミドのいずれかに３７℃で３時間暴露した場合に、ＡＧ１が有意に、ＧＳＨレベルを増加させ、ＲＯＳレベルを低下させたことを示し（ｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、このことは、Ｇ６ＰＤ活性の増加と整合した（クロロキン処理試料のアッセイについてはｎ＝９、ジアミド処理試料のアッセイについてはｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｅは、５％赤血球懸濁液をクロロキンで処理した場合にバンド３タンパク質がクラスター化された（ｃバンド３）ことを示し、これはＡＧ１処理により緩和された。各レーンは１種の個別の試料を表す。図５Ｆ〜図５Ｈは、ＡＧ１（１μΜ）が、２８日間の溶血及び付随するタンパク質漏出を低減することにより、冷蔵温度での赤血球（５％懸濁液）の貯蔵が改善されたことを示し（ｎ＝１３の独立した血液試料、＊Ｐ＜０．０５）、このことはＧ６ＰＤ活性の増加に対応する（ｎ＝４、＊Ｐ＝０．０３２３、＊＊＊Ｐ＝０．０００３）。各試料をＡＧ１で毎週再処理した。代表的な溶血表現型画像を示す。誤差棒は平均値±ＳＤを表す。ＮＴ：未処理、ＣＱ：クロロキン、ｃバンド３：クラスター化バンド３タンパク質。 図５Ａ〜図５Ｈは、ＡＧ１が酸化ストレス因子への曝露に際しての溶血を低減することを示す図である。図５Ａは、ＡＧ１が、光線下で４時間、１ｍＭクロロキン（ＣＱ）、または３７℃で４時間、１ｍＭジアミドのいずれかで処理した５％赤血球懸濁液の溶血の程度を低下させたことを示す（ｎ＝７の独立した血液試料、＊Ｐ＝０．０３７２、＊＊Ｐ＝０．００１９、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ〜図５Ｄは、５％赤血球懸濁液を１ｍＭクロロキンまたはジアミドのいずれかに３７℃で３時間暴露した場合に、ＡＧ１が有意に、ＧＳＨレベルを増加させ、ＲＯＳレベルを低下させたことを示し（ｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、このことは、Ｇ６ＰＤ活性の増加と整合した（クロロキン処理試料のアッセイについてはｎ＝９、ジアミド処理試料のアッセイについてはｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｅは、５％赤血球懸濁液をクロロキンで処理した場合にバンド３タンパク質がクラスター化された（ｃバンド３）ことを示し、これはＡＧ１処理により緩和された。各レーンは１種の個別の試料を表す。図５Ｆ〜図５Ｈは、ＡＧ１（１μΜ）が、２８日間の溶血及び付随するタンパク質漏出を低減することにより、冷蔵温度での赤血球（５％懸濁液）の貯蔵が改善されたことを示し（ｎ＝１３の独立した血液試料、＊Ｐ＜０．０５）、このことはＧ６ＰＤ活性の増加に対応する（ｎ＝４、＊Ｐ＝０．０３２３、＊＊＊Ｐ＝０．０００３）。各試料をＡＧ１で毎週再処理した。代表的な溶血表現型画像を示す。誤差棒は平均値±ＳＤを表す。ＮＴ：未処理、ＣＱ：クロロキン、ｃバンド３：クラスター化バンド３タンパク質。 図５Ａ〜図５Ｈは、ＡＧ１が酸化ストレス因子への曝露に際しての溶血を低減することを示す図である。図５Ａは、ＡＧ１が、光線下で４時間、１ｍＭクロロキン（ＣＱ）、または３７℃で４時間、１ｍＭジアミドのいずれかで処理した５％赤血球懸濁液の溶血の程度を低下させたことを示す（ｎ＝７の独立した血液試料、＊Ｐ＝０．０３７２、＊＊Ｐ＝０．００１９、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ〜図５Ｄは、５％赤血球懸濁液を１ｍＭクロロキンまたはジアミドのいずれかに３７℃で３時間暴露した場合に、ＡＧ１が有意に、ＧＳＨレベルを増加させ、ＲＯＳレベルを低下させたことを示し（ｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、このことは、Ｇ６ＰＤ活性の増加と整合した（クロロキン処理試料のアッセイについてはｎ＝９、ジアミド処理試料のアッセイについてはｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｅは、５％赤血球懸濁液をクロロキンで処理した場合にバンド３タンパク質がクラスター化された（ｃバンド３）ことを示し、これはＡＧ１処理により緩和された。各レーンは１種の個別の試料を表す。図５Ｆ〜図５Ｈは、ＡＧ１（１μΜ）が、２８日間の溶血及び付随するタンパク質漏出を低減することにより、冷蔵温度での赤血球（５％懸濁液）の貯蔵が改善されたことを示し（ｎ＝１３の独立した血液試料、＊Ｐ＜０．０５）、このことはＧ６ＰＤ活性の増加に対応する（ｎ＝４、＊Ｐ＝０．０３２３、＊＊＊Ｐ＝０．０００３）。各試料をＡＧ１で毎週再処理した。代表的な溶血表現型画像を示す。誤差棒は平均値±ＳＤを表す。ＮＴ：未処理、ＣＱ：クロロキン、ｃバンド３：クラスター化バンド３タンパク質。 図５Ａ〜図５Ｈは、ＡＧ１が酸化ストレス因子への曝露に際しての溶血を低減することを示す図である。図５Ａは、ＡＧ１が、光線下で４時間、１ｍＭクロロキン（ＣＱ）、または３７℃で４時間、１ｍＭジアミドのいずれかで処理した５％赤血球懸濁液の溶血の程度を低下させたことを示す（ｎ＝７の独立した血液試料、＊Ｐ＝０．０３７２、＊＊Ｐ＝０．００１９、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ〜図５Ｄは、５％赤血球懸濁液を１ｍＭクロロキンまたはジアミドのいずれかに３７℃で３時間暴露した場合に、ＡＧ１が有意に、ＧＳＨレベルを増加させ、ＲＯＳレベルを低下させたことを示し（ｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）、このことは、Ｇ６ＰＤ活性の増加と整合した（クロロキン処理試料のアッセイについてはｎ＝９、ジアミド処理試料のアッセイについてはｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図５Ｅは、５％赤血球懸濁液をクロロキンで処理した場合にバンド３タンパク質がクラスター化された（ｃバンド３）ことを示し、これはＡＧ１処理により緩和された。各レーンは１種の個別の試料を表す。図５Ｆ〜図５Ｈは、ＡＧ１（１μΜ）が、２８日間の溶血及び付随するタンパク質漏出を低減することにより、冷蔵温度での赤血球（５％懸濁液）の貯蔵が改善されたことを示し（ｎ＝１３の独立した血液試料、＊Ｐ＜０．０５）、このことはＧ６ＰＤ活性の増加に対応する（ｎ＝４、＊Ｐ＝０．０３２３、＊＊＊Ｐ＝０．０００３）。各試料をＡＧ１で毎週再処理した。代表的な溶血表現型画像を示す。誤差棒は平均値±ＳＤを表す。ＮＴ：未処理、ＣＱ：クロロキン、ｃバンド３：クラスター化バンド３タンパク質。 図６Ａ〜図６Ｅは、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのＧ６Ｐ結合部位及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位に、ＷＴ Ｇ６ＰＤと比較して、いくらかの残留障害が見られることを示す図である。図６Ａは、それぞれ緑色及び橙色で示すＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの構造において、構造ＮＡＤＰ＋結合部位が十分に保存されていることを示す。ＮＡＤＰ＋への結合に関与する残基の側鎖を棒で示す。Ｇ６Ｐ結合部位（図６Ｂ）及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位（図６Ｃ）の周りの必須残基（丸で囲んだ）の側鎖の配向。図６Ｄは、Ｋ１７１Ａ及びＰ１７２Ｇ変異酵素の触媒活性を表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊Ｐ＝０．０００１）。図６Ｅは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ、ならびにＲ４５９相互作用残基、Ｄ１８１、及びＮ１８５の変異酵素の熱不活性化曲線のグラフを示す。Ｔ１／２値を図１Ｄ及び図２Ｃにまとめる。 図６Ａ〜図６Ｅは、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのＧ６Ｐ結合部位及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位に、ＷＴ Ｇ６ＰＤと比較して、いくらかの残留障害が見られることを示す図である。図６Ａは、それぞれ緑色及び橙色で示すＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの構造において、構造ＮＡＤＰ＋結合部位が十分に保存されていることを示す。ＮＡＤＰ＋への結合に関与する残基の側鎖を棒で示す。Ｇ６Ｐ結合部位（図６Ｂ）及び触媒ＮＡＤＰ＋結合部位（図６Ｃ）の周りの必須残基（丸で囲んだ）の側鎖の配向。図６Ｄは、Ｋ１７１Ａ及びＰ１７２Ｇ変異酵素の触媒活性を表すグラフを示す（ｎ＝４、＊＊＊Ｐ＝０．０００１）。図６Ｅは、ＷＴ Ｇ６ＰＤ、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ、ならびにＲ４５９相互作用残基、Ｄ１８１、及びＮ１８５の変異酵素の熱不活性化曲線のグラフを示す。Ｔ１／２値を図１Ｄ及び図２Ｃにまとめる。 図７Ａは、Ｇ６ＰＤ二量体界面及びＧ６ＰＤ調節化合物の提唱する結合部位に焦点を合わせた、Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の拡大図を示す。補因子ＮＡＤＰ＋（構造ＮＡＤＰ＋とも呼ばれる）は黒い棒で示す。図７Ｂは、構造ＮＡＤＰ＋（黒）の近傍の提唱する結合部位に結合した例示的な化合物ＡＲ３−０６９（青緑色）を伴うＧ６ＰＤ二量体界面に焦点を合わせた、Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の拡大図を示す。化合物ＡＲ３−０６９の結合した構造（Ｇ６ＰＤの残基５０９は除去されている）は、推定される受容体部位をサポートする。 着目する薬理原子（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）間の概略の距離の測定値を含む、例示的なＧ６ＰＤ調節化合物ＡＲ３−０６９の構造を示す図である。 図９Ａは、Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の空間充填表示の、２つの互いに反対側の面の図を示す。残基は二量体界面の両側上で変異していた。上側の図は、化合物が結合する部位に位置する種々の変異（赤色、青色）を示す。上側の図は、Ｇ６ＰＤ酵素の反対側の面上の種々の変異（緑色、黄色、及び青緑色）の位置を示す。図９Ｂは、例示的な化合物ＡＲ３−０６９のＧ６ＰＤ活性に対する、Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体の種々の点変異の影響を表すグラフを示す。グラフの着色した棒は、図３Ａの構造に示した変異に対応している。推定される結合部位における残基のみが本主題の化合物の結合に影響を与える一方で、反対側のＡＣ５０（ＥＣ５０も）には影響がなかった。
定義
例示的な実施形態をさらに詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語の意味及び範囲を例示及び定義するために、以下の定義を明記する。定義されない用語はいずれも、当分野で認められている意味を有する。
開示の化合物の合成に有用な一般に公知の化学的合成スキーム及び条件を提供している多くの一般的な参照文献が利用可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；またはＶｏｇｅｌ，Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｌｏｎｇｍａｎ，１９７８を参照されたい）。
本明細書に記載の化合物が、１つまたは複数のキラル中心及び／または二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、エナンチオマーまたはジアステレオマーを含む場合、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋またはジアステレオ異性的に純粋）ならびにエナンチオマー及び立体異性混合物を含む、化合物のすべての起こり得るエナンチオマー及び立体異性体が、本明細書の化合物の記載に含まれる。当業者に公知の分離技術またはキラル合成技術を使用して、エナンチオマー及び立体異性混合物をそれらの構成成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分割することができる。化合物はまた、エノール形態、ケト形態及びそれらの混合物を含む、いくつかの互変異性形態で存在し得る。したがって、本明細書に示す化学構造は、説明する化合物のすべての可能な互変異性形態を包含する。記載の化合物はまた、１個または複数の原子が、自然界で通常見出される原子質量と異なる原子質量を有する同位体標識化合物も含む。本明細書に開示の化合物に組み込むことができる同位体の例には、これに限定されないが、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏなどが含まれる。化合物は、不溶媒和形態、さらには水和形態を含む溶媒和形態で存在し得る。一般に、化合物は水和化または溶媒和化されていてよい。特定の化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在し得る。一般に、すべての物理的形態が、本明細書で企図される用途について同等であり、本開示の範囲内にあることが意図される。
別段に示されていない限り、「リンカー」、「連結基」、「連結」及び「連結鎖」という用語は、２つの基を結合する連結部分を指し、かつ１００個以下の原子長さからなる主鎖を有する。リンカーまたは連結は、２つの基を結合する共有結合または１〜１００個の原子長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０または５０個の原子（例えば、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳ原子）長さからなる鎖であってよく、その際、リンカーは、直鎖、分枝、環式または単一の原子であってよい。特定の場合において、リンカー主鎖の１個、２個、３個、４個または５個以上の炭素原子は、硫黄、窒素または酸素ヘテロ原子で任意選択で置換されていてよい。主鎖原子間の結合は飽和または不飽和であってよく、通常、１つ、２つ、または３つ以下の不飽和結合がリンカー主鎖に存在するであろう。リンカーは、例えば、アルキル、アリールまたはアルケニル基での１個または複数の置換基を含んでよい。リンカーには、限定ではないが、ポリ（エチレングリコール）単位（複数可）（例えば、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）−）；エーテル、チオエーテル、アミン、直鎖または分枝であってよいアルキル（例えば、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル）、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）などが含まれ得る。リンカー主鎖は、環式基、例えば、アリール、複素環またはシクロアルキル基を含んでよく、その際、環式基の２個以上の原子、例えば、２、３または４個の原子が主鎖に含まれる。リンカーは、切断可能または切断不可能であってよい。
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、例えば、１〜６個の炭素原子、または１〜５個、または１〜４個、または１〜３個の炭素原子を有する一価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語には、例として、直鎖及び分枝ヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、及びネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）が含まれる。
「置換アルキル」という用語は、アルキル鎖中の１個または複数の炭素原子がヘテロ原子、例えば、−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ここで、ｎは、０〜２である）、−ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素またはアルキルである）で任意選択で置き換えられており、かつアルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及び−ＮＲａＲｂ（ここで、Ｒ’及びＲ”は、同じでも、または異なってもよく、かつ水素、任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及び複素環式から選択される）からなる群から選択される１〜５つの置換基を有する、本明細書で定義するとおりのアルキル基を指す。
「アルキレン」は、好ましくは、直鎖または分枝のいずれかである１〜６個、より好ましくは１〜３個の炭素原子を有し、かつ−Ｏ−、−ＮＲ１０−、−ＮＲ１０Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１０−などから選択される１個または複数の基で任意選択で中断されている二価脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語には、例として、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−）、（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２−）、（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、（−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）などが含まれる。
「置換アルキレン」は、下の「置換（されている）」の定義において炭素のために記載されているとおりの置換基で置き換えられている１〜３個の水素を有するアルキレン基を指す。
「アルカン」という用語は、本明細書で定義するとおりのアルキル基及びアルキレン基を指す。
「アルキルアミノアルキル」、「アルキルアミノアルケニル」及び「アルキルアミノアルキニル」という用語は、Ｒ’ＮＨＲ”−基を指し、ここで、Ｒ’は、本明細書で定義するとおりのアルキル基であり、かつＲ”は、本明細書で定義するとおりのアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基である。
「アルカリール」または「アラルキル」という用語は、−アルキレン−アリール及び−置換アルキレン−アリール基を指し、ここで、アルキレン、置換アルキレン及びアリールは本明細書で定義される。
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指し、ここで、アルキルは、本明細書で定義するとおりである。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどが含まれる。「アルコキシ」という用語はまた、アルケニル−Ｏ−、シクロアルキル−Ｏ−、シクロアルケニル−Ｏ−、及びアルキニル−Ｏ−基を指し、ここで、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアルキニルは、本明細書で定義するとおりである。
「置換アルコキシ」という用語は、置換アルキル−Ｏ−、置換アルケニル−Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｏ−、置換シクロアルケニル−Ｏ−、及び置換アルキニル−Ｏ−基を指し、ここで、置換アルキル、置換アルケニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル及び置換アルキニルは、本明細書で定義するとおりである。
「アルコキシアミノ」という用語は、−ＮＨ−アルコキシ基を指し、ここで、アルコキシは、本明細書で定義するとおりである。
「ハロアルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−基を指し、ここで、アルキル基上の１個または複数の水素原子は、ハロ基で置換されており、これには例として、トリフルオロメトキシなどの基が含まれる。
「ハロアルキル」という用語は、上記のとおりの置換アルキル基を指し、ここで、アルキル基上の１個または複数の水素原子がハロ基で置換されている。そのような基の例には、限定ではないが、フルオロアルキル基、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロエチルなどが含まれる。
「アルキルアルコキシ」という用語は、−アルキレン−Ｏ−アルキル、アルキレン−Ｏ−置換アルキル、置換アルキレン−Ｏ−アルキル、及び置換アルキレン−Ｏ−置換アルキル基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルキレン及び置換アルキレンは、本明細書で定義するとおりである。
「アルキルチオアルコキシ」という用語は、基−アルキレン−Ｓ−アルキル、アルキレン−Ｓ−置換アルキル、置換アルキレン−Ｓ−アルキル及び置換アルキレン−Ｓ−置換アルキルを指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルキレン及び置換アルキレンは、本明細書で定義するとおりである。
「アルケニル」は、２〜６個の炭素原子及び好ましくは２〜４個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つ、好ましくは１〜２つの二重結合不飽和の部位を有する直鎖または分枝ヒドロカルビル基を指す。この用語には、例として、ビ−ビニル、アリル、及びブタ−３−エン−１−イルが含まれる。シス及びトランス異性体またはこれらの異性体の混合物は、この用語の範囲内に含まれる。
「置換アルケニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール及び−ＳＯ２−ヘテロアリールから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基を有する本明細書で定義するとおりのアルケニル基を指す。
「アルキニル」は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜３個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つ、好ましくは１〜２つの不飽和の部位を有する直鎖または分枝一価ヒドロカルビル基を指す。そのようなアルキニル基の例には、アセチルエニル（−Ｃ≡ＣＨ）、及びプロパルギル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が含まれる。
「置換アルキニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、及び−ＳＯ２−ヘテロアリールから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基を有する本明細書で定義するとおりのアルキニル基を指す。
「アルキニルオキシ」は、−Ｏ−アルキニル基を指し、ここで、アルキニルは、本明細書で定義するとおりである。アルキニルオキシには、例として、エチニルオキシ、プロピニルオキシなどが含まれる。
「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−、及び置換ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。例えば、アシルには、「アセチル」基ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−が含まれる。
「アシルアミノ」は、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）アルキル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換アルキル、ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換シクロアルキル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）シクロアルケニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換シクロアルケニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換アルケニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換アルキニル、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）アリール、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換アリール、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換ヘテロアリール、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）複素環式、及び−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）置換複素環式を指し、ここで、Ｒ２０は、水素またはアルキルであり、かつアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「アミノカルボニル」または「アミノアシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ２２基を指し、ここで、Ｒ２１及びＲ２２は独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式からなる群から選択され、かつＲ２１及びＲ２２は、それに結合している窒素と任意選択で一緒になって、複素環式または置換複素環式基を形成しており、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「アミノカルボニルアミノ」は、−ＮＲ２１Ｃ（Ｏ）ＮＲ２２Ｒ２３基を指し、ここで、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３は、水素、アルキル、アリールまたはシクロアルキルから独立に選択されるか、または２つのＲ基は一緒になって、ヘテロシクリル基を形成している。
「アルコキシカルボニルアミノ」という用語は、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここで、各Ｒは独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルは、本明細書で定義するとおりである。
「アシルオキシ」という用語は、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及びヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルは、本明細書で定義するとおりである。
「アミノスルホニル」は、基−ＳＯ２ＮＲ２１Ｒ２２を指し、ここで、Ｒ２１及びＲ２２は独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ２１及びＲ２２は、それに結合している窒素と任意選択で一緒になって、複素環式または置換複素環式基を形成しており、かつアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「スルホニルアミノ」は、−ＮＲ２１ＳＯ２Ｒ２２基を指し、ここで、Ｒ２１及びＲ２２は独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式からなる群から選択され、かつＲ２１及びＲ２２は、それらが結合している原子と任意選択で一緒になって、複素環式または置換複素環式基を形成しており、かつアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「アリール」または「Ａｒ」は、単一の環（フェニル基に存在しているものなど）、または複数の縮合環を有する環系（このような芳香族環系の例には、ナフチル、アントリル及びインダニルが含まれる）を有する６〜１８個の原子の一価の芳香族炭素環基を指し、この縮合環は芳香族であってもなくてもよいが、但し、結合点は芳香族環の原子を介する。この用語には、例として、フェニル及びナフチルが含まれる。アリール置換基のための定義によって別段に束縛されない限り、そのようなアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール及びトリハロメチルから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基で任意選択で置換されていてよい。
「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリール基を指し、ここで、アリールは、本明細書で定義するとおりであり、例として、フェノキシ、ナフトキシなどを含み、同じく本明細書で定義されているとおりの任意選択で置換されているアリール基を含む。
別段に示されていない限り、「アミノ」は、−ＮＨ２基を指す。
「置換アミノ」という用語は、基−ＮＲＲを指し、ここで、各Ｒは、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルからなる群から独立に選択されるが、但し、少なくとも１つのＲは水素ではない。
「アジド」という用語は、基−Ｎ３を指す。
「カルボキシル」、「カルボキシ」または「カルボキシラート」は、−ＣＯ２Ｈまたはその塩を指す。
「カルボキシルエステル」または「カルボキシエステル」または「カルボキシアルキル」または「カルボキシルアルキル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、及び−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環式基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「（カルボキシルエステル）オキシ」または「カルボナート」は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環式基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「シアノ」または「ニトリル」は、−ＣＮ基を指す。
「シクロアルキル」は、縮合、架橋、及びスピロ環系を含む単一または複数の環式環を有する３〜１０個の炭素原子の環式アルキル基を指す。適切なシクロアルキル基の例には、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどが含まれる。そのようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどの単一の環構造、アダマンタニルなどの多環構造を含む。
「置換シクロアルキル」という用語は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール及び−ＳＯ２−ヘテロアリールから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基を有するシクロアルキル基を指す。
「シクロアルケニル」は、単一または複数の環を有し、かつ少なくとも１つの二重結合、好ましくは１〜２つの二重結合を有する３〜１０個の炭素原子の非芳香族環式アルキル基を指す。
「置換シクロアルケニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール及び−ＳＯ２−ヘテロアリールから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基を有するシクロアルケニル基を指す。
「シクロアルキニル」は、単一または複数の環を有し、かつ少なくとも１つの三重結合を有する５〜１０個の炭素原子の非芳香族シクロアルキル基を指す。
「シクロアルコキシ」は、−Ｏ−シクロアルキルを指す。
「シクロアルケニルオキシ」は、−Ｏ−シクロアルケニルを指す。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を指す。
「ヘテロアリール」は、環内の１〜１５個の炭素原子、例えば、１〜１０個の炭素原子及び酸素、窒素、及び硫黄からなる群から選択される１〜１０個のヘテロ原子の芳香族基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環（ピリジニル、イミダゾリルまたはフリルなど）または環系で複数の縮合環（例えば、インドリジニル、キノリニル、ベンゾフラン、ベンズイミダゾリルまたはベンゾチエニルなどの基においてのように）を有することができ、ここで、少なくとも環系内の１つの環は、芳香族であり、かつ環系内の少なくとも１つの環は、芳香族であるが、但し、結合点は、芳香族環の原子を介している。特定の実施形態において、ヘテロアリール基の窒素及び／または硫黄環原子（複数可）は、任意選択で酸化されていて、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分をもたらしている。この用語には、例として、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、及びフラニルが含まれる。ヘテロアリール置換基の定義によって別段に束縛されない限り、そのようなヘテロアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール及び−ＳＯ２−ヘテロアリール、及びトリハロメチルから選択される１〜５つの置換基、または１〜３つの置換基で任意選択で置換されていてよい。
「ヘテロアラルキル」という用語は、−アルキレン−ヘテロアリール基を指し、ここで、アルキレン及びヘテロアリールは、本明細書で定義される。この用語には、例として、ピリジルメチル、ピリジルエチル、インドリルメチルなどが含まれる。
「ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−ヘテロアリールを指す。
「複素環」、「複素環式」、「ヘテロシクロアルキル」、及び「ヘテロシクリル」は、縮合、架橋及びスピロ環系を含む単一の環または複数の縮合環を有し、かつ１〜１０個のヘテロ原子を含む３〜２０個の環原子を有する飽和または不飽和基を指す。これらの環原子は、窒素、硫黄、または酸素からなる群から選択され、ここで、縮合環系において、環の１つまたは複数は、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであってよいが、但し、結合点は、非芳香族環を介する。特定の実施形態において、複素環式基の窒素及び／または硫黄原子（複数可）は、任意選択で酸化されていて、Ｎ−オキシド、−Ｓ（Ｏ）−、または−ＳＯ２−部分をもたらしている。
複素環及びヘテロアリールの例には、これに限定されないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも称される）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが含まれる。
複素環式置換基のための定義によって別段に束縛されない限り、そのような複素環式基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及び縮合複素環から選択される１〜５個、または１〜３つの置換基で任意選択で置換されていてよい。
「ヘテロシクリルオキシ」は、−Ｏ−ヘテロシクリル基を指す。
「ヘテロシクリルチオ」という用語は、複素環式−Ｓ−基を指す。
「ヘテロシクレン」という用語は、本明細書で定義するとおりの複素環から形成されるジラジカル基を指す。
「ヒドロキシアミノ」という用語は、−ＮＨＯＨ基を指す。
「ニトロ」は、−ＮＯ２基を指す。
「オキソ」は、（＝Ｏ）原子を指す。
「スルホニル」は、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２−置換アルキル、ＳＯ２−アルケニル、ＳＯ２−置換アルケニル、ＳＯ２−シクロアルキル、ＳＯ２−置換シクロアルキル、ＳＯ２−シクロアルケニル、ＳＯ２−置換シクロアルケニル、ＳＯ２−アリール、ＳＯ２−置換アリール、ＳＯ２−ヘテロアリール、ＳＯ２−置換ヘテロアリール、ＳＯ２−複素環式、及びＳＯ２−置換複素環式基を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。スルホニルには、例として、メチル−ＳＯ２−、フェニル−ＳＯ２−、及び４−メチルフェニル−ＳＯ２−が含まれる。
「スルホニルオキシ」は、基−ＯＳＯ２−アルキル、ＯＳＯ２−置換アルキル、ＯＳＯ２−アルケニル、ＯＳＯ２−置換アルケニル、ＯＳＯ２−シクロアルキル、ＯＳＯ２−置換シクロアルキル、ＯＳＯ２−シクロアルケニル、ＯＳＯ２−置換シクロアルケニル、ＯＳＯ２−アリール、ＯＳＯ２−置換アリール、ＯＳＯ２−ヘテロアリール、ＯＳＯ２−置換ヘテロアリール、ＯＳＯ２−複素環式、及びＯＳＯ２置換複素環式を指し、ここで、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、及び置換複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「アミノカルボニルオキシ」という用語は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ基を指し、ここで、各Ｒは独立に、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、または複素環式であり、この際、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環式は、本明細書で定義するとおりである。
「チオール」は、−ＳＨ基を指す。
「チオキソ」または「チオケト」という用語は、（＝Ｓ）原子を指す。
「アルキルチオ」または「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキル基を指し、ここで、アルキルは、本明細書で定義するとおりである。特定の実施形態において、硫黄は、−Ｓ（Ｏ）−に酸化されていてよい。スルホキシドは、１種または複数の立体異性体として存在し得る。
「置換チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−置換アルキル基を指す。
「チオアリールオキシ」という用語は、アリール−Ｓ−基を指し、ここで、アリール基は、同じく本明細書で定義される任意選択で置換されているアリールを含めて、本明細書で定義するとおりである。
「チオヘテロアリールオキシ」という用語は、ヘテロアリール−Ｓ−基を指し、ここで、ヘテロアリール基は、同じく本明細書で定義される任意選択で置換されているアリールを含めて、本明細書で定義するとおりである。
「チオヘテロシクロオキシ」という用語は、基ヘテロシクリル−Ｓ−を指し、ここで、ヘテロシクリル基は、同じく本明細書で定義される任意選択で置換されているヘテロシクリル基を含めて、本明細書で定義するとおりである。
本明細書における開示に加えて、「置換（置換されている）」という用語は、指定の基またはラジカルを修飾するために使用される場合、指定の基またはラジカルの１個または複数の水素原子がそれぞれ、相互に独立に、以下に定義するとおり同じか、または異なる置換基で置き換えられていることも意味し得る。
本明細書において個別の用語に関して開示した基に加えて、指定の基またはラジカルにおける飽和炭素原子上の１個または複数の水素（単一の炭素上の任意の２個の水素を置換するための置換基は、＝Ｏ、＝ＮＲ７０、＝Ｎ−ＯＲ７０、＝Ｎ２または＝Ｓで置き換えられていてよい）を置き換えるための置換基は、別段に指定されていない限り、−Ｒ６０、ハロ、＝Ｏ、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ７０、−ＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＳＯ２ＯＲ７０、−ＯＳＯ２Ｒ７０、−ＯＳＯ２Ｏ−Ｍ＋、−ＯＳＯ２ＯＲ７０、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０ＣＯ２ −Ｍ＋、−ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、ここで、Ｒ６０は、任意選択で置換されているアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール及びヘテロアリールアルキルからなる群から選択され、各Ｒ７０は独立に、水素またはＲ６０であり；各Ｒ８０は独立に、Ｒ７０であるか、または別法では２つのＲ８０’は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１〜４個の同じか、または異なる追加のヘテロ原子を任意選択で含んでよく、そのＮが−ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル置換を有してよい５−、６−または７員ヘテロシクロアルキルを形成しており；かつ各Ｍ＋は、正味で１の正電荷を有する対イオンである。各Ｍ＋は独立に、例えばアルカリイオン、例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋；アンモニウムイオン、例えば＋Ｎ（Ｒ６０）４；またはアルカリ土類金属イオン、例えば［Ｃａ２＋］０．５、［Ｍｇ２＋］０．５、または［Ｂａ２＋］０．５であってよい（下付文字の０．５は、そのような二価アルカリ土類金属イオンのための対イオンの一方が本発明の化合物のイオン化形態であってよく、かつ他方が典型的な対イオン、例えばクロリドであってよいか、または本明細書に開示の２種のイオン化化合物がそのような二価アルカリ土類金属イオンのための対イオンとして役立ち得るか、または本発明の二重にイオン化された化合物がそのような二価アルカリ土類金属イオンのための対イオンとして役立ち得ることを意味する）。具体的な例として、−ＮＲ８０Ｒ８０は、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−ピペラジニル、４Ｎ−メチル−ピペラジン−１−イル及びＮ−モルホリニルを含むことが意味される。
本明細書における開示に加えて、「置換」アルケン、アルキン、アリール及びヘテロアリール基における不飽和炭素原子上の水素のための置換基は、別段に指定されていない限り、−Ｒ６０、ハロ、−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−Ｓ−Ｍ＋、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｒ７０、−ＳＯ３ −Ｍ＋、−ＳＯ３Ｒ７０、−ＯＳＯ２Ｒ７０、−ＯＳＯ３ −Ｍ＋、−ＯＳＯ３Ｒ７０、−ＰＯ３ −２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−ＣＯ２ −Ｍ＋、−ＣＯ２Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣＯ２ −Ｍ＋、−ＯＣＯ２Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０ＣＯ２ −Ｍ＋、−ＮＲ７０ＣＯ２Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、ここで、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０及びＭ＋は、先に定義されたとおりであるが、但し、置換アルケンまたはアルキンの場合、置換基は、−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、または−Ｓ−Ｍ＋ではない。
本明細書において個別の用語に関して開示した基に加えて、「置換」ヘテロアルキル及びシクロヘテロアルキル基における窒素原子上の水素のための置換基は、別段に指定されていない限り、−Ｒ６０、−Ｏ−Ｍ＋、−ＯＲ７０、−ＳＲ７０、−Ｓ−Ｍ＋、−ＮＲ８０Ｒ８０、トリハロメチル、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７０、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−Ｍ＋、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７０、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ７０、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−Ｍ＋、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７０、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２（Ｍ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）Ｏ−Ｍ＋、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ７０）（ＯＲ７０）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｓ）Ｒ７０、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＯＣ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）Ｒ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｓ）ＯＲ７０、−ＮＲ７０Ｃ（Ｏ）ＮＲ８０Ｒ８０、−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）Ｒ７０及び−ＮＲ７０Ｃ（ＮＲ７０）ＮＲ８０Ｒ８０であり、ここで、Ｒ６０、Ｒ７０、Ｒ８０及びＭ＋は、先に定義されたとおりである。
本明細書における開示に加えて、特定の実施形態において、置換されている基は、１、２、３、または４つの置換基、１、２、または３つの置換基、１または２つの置換基、または１つの置換基を有する。
上記において定義のすべての置換されている基において、それ自体がさらなる置換基を有する置換基を定義することによりもたらされるポリマー（例えば、置換アリール基などによってさらに置換されている置換アリール基によりそれ自体が置換されている置換基として置換アリール基を有する置換アリール基）は、本明細書において含まれることは意図されていないことが理解される。このような事例において、そのような置換の最大の数は３である。例えば、本明細書において具体的に企図される置換アリール基の逐次的置換は、置換アリール−（置換アリール）−置換アリールに制限される。
別段に示されていない限り、本明細書において明確に定義されていない置換基の命名は、官能基の末端部分、続いて、結合点に向かって隣接する官能基を命名することによりなされる。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、基（アリール）−（アルキル）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−を指す。
１個または複数の置換基を含有する本明細書に開示の基のいずれかに関して、むろん、そのような基は、立体的に実現不可能ではない、及び／または、合成的に実行不可能である置換または置換パターンのいずれをも含有しないことが理解される。加えて、本化合物は、これらの化合物の置換によってもたらされるすべての立体化学異性体を含む。
「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳類などの患者に対する投与に許容される塩を意味する（所与の投与量レジメンについて許容される哺乳類に安全性を有する対イオンを伴う塩）。そのような塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基に、及び、薬学的に許容される無機または有機酸に由来し得る。「薬学的に許容される塩」は化合物の薬学的に許容される塩を指し、これらの塩は、当技術分野において周知の様々な有機及び無機対イオンに由来し、それらには、例にすぎないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどが含まれ；かつ分子が塩基性官能基を含有する場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などの有機または無機酸の塩が含まれる。
「薬学的有効量」及び「治療有効量」は、所望の治療効果（例えば、指定の障害もしくは疾患またはその症状の１つまたは複数の治療及び／または疾患または障害の発症の予防）を誘導するために十分な化合物の量を指す。ポリグルタミン病に関して、薬学的または治療有効量には、とりわけ、対象の脳内においてタンパク質沈着物を予防する、またはその減少をもたらすために十分な量が含まれる。
「その塩」という用語は、金属カチオンまたは有機カチオンなどのカチオンによって酸のプロトンが置き換えられる場合に形成される化合物を意味する。適切である場合、塩は薬学的に許容される塩であるが、これは、患者への投与が意図されない中間体化合物の塩について要求されるものではない。例として、本化合物の塩には、化合物が無機または有機酸によってプロトン化されてカチオンが形成され、無機または有機酸の複合塩基を塩のアニオン成分として伴うものが含まれる。
「溶媒和物」は、溶媒分子と溶質の分子またはイオンとが組み合わされることによって形成される複合体を指す。溶媒は、有機化合物、無機化合物、または両方の混合物であってよい。溶媒の一部の例には、これに限定されないが、メタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及び水が含まれる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。
「立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）」及び「立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓ）」は、連結している原子は同一であるが、空間中における原子配列が異なる化合物を指す。立体異性体には、シス−トランス異性体、Ｅ及びＺ異性体、エナンチオマー、ならびに、ジアステレオマーが含まれる。
「互変異性体」は、エノール−ケト及びイミン−エナミン互変異性体、または、ピラゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、トリアゾール及びテトラゾールなどの−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−ＮＨ−環原子配列を含有するヘテロアリール基の互変異性形態などの原子の電子結合及び／またはプロトンの位置のみが異なる分子の交互形態を指す。当業者は、他の互変異環原子配列が可能であることを認識するであろう。
「またはその塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体」という用語は、本化合物の立体異性体の薬学的に許容される塩の溶媒和物などの、塩、溶媒和物及び立体異性体のすべての並び替えを含むことが意図されることは分かるであろう。
プロドラッグも、方法の実施形態で使用するための活性薬剤として重要である。そのようなプロドラッグは一般に、インビボで必要な化合物に容易に変化し得る本化合物の機能的誘導体である。したがって、本開示の方法では、「投与する」という用語は、具体的に開示した化合物、または具体的に開示することはできなかったが、それを必要とする対象に投与した後にインビボで指定の化合物に変化する化合物を投与することを包含する。適切なプロドラッグ誘導体を選択及び調製するための従来の手順は、例えば、Ｗｅｒｍｕｔｈ，”Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ” ｉｎ Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄ． Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ Ｅｄ．，ｐｐ． ５６１−５８６ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００３）に記載されている。プロドラッグには、インビボで（例えば、ヒト体内で）加水分解されて本開示の方法及び組成物のために適切な本明細書に記載の化合物を生成するエステルが含まれる。適切なエステル基には、限定ではないが、各アルキルまたはアルケニル部分が６個以下の炭素原子を有する、薬学的に許容される脂肪族カルボン酸、特に、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸及びアルカン二酸から誘導されるものが含まれる。エステルの実例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステル、クエン酸エステル、コハク酸エステル、エチルコハク酸エステルが含まれる。
本明細書で使用する場合の「試料」という用語は、必ずしもではないが典型的には、目的の１種または複数の成分を含有する液体、すなわち、水性形態での、物質または物質の混合物に関する。試料は、様々な供給源、例えば、食料品、環境物質、生物試料もしくは固体、例えば個体から単離された組織又は流体（これに限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、***、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、及び泌尿生殖器管の外部切片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器）、ならびにインビトロ細胞培養構成成分の試料（例えば、これに限定されないが、細胞培養培地での細胞の増殖の結果得られる馴化培地、ウィルスに感染されたと推定される細胞、組換え細胞、及び細胞成分を含む）に由来し得る。方法の特定の実施形態において、試料は細胞を含む。方法の一部の事例において、細胞はインビトロである。方法の一部の事例において、細胞はインビボである。
「患者」は、ヒト及び非ヒト対象、特に、哺乳類対象を指す。
本明細書で使用する場合の「治療すること」または「治療」という用語は、哺乳類（特に、ヒト）などの患者において疾患または病状を治療することまたは治療を意味し、これは、（ａ）疾患または病状の発生を予防すること、例えば、対象の予防的治療；（ｂ）疾患または病状の寛解、例えば、患者における疾患または病状を除去すること、またはその退縮をもたらすこと；（ｃ）例えば、患者における疾患または病状の発生を遅延させる、または停止させることによって、疾患または病状を抑制すること；または（ｄ）患者における疾患または病状の症状を緩和することを含む。
用語の他の定義が、本明細書を通じて現れ得る。
本発明をさらに詳細に記載する前に、本発明は記載されている特定の実施形態に限定されず、これらは当然のように様々であり得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなるため、本明細書において使用する専門用語は特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定的であることは意図されていないことも理解されるべきである。
値が範囲で提供されている場合、その範囲の上限と下限との間に存在するそれぞれの値（文脈において明確に指定されている場合を除き、下限の１０分の１の単位まで）、かつ、規定されている範囲における、規定されているか間に存在する他の値のいずれかが、本発明に包含されることが理解される。これらのより狭い範囲の上限及び下限は独立に、このより狭い範囲に包含され得、また、これらの上限及び下限も、規定されている範囲においていずれかの具体的に排除される限界点を除いて、本発明に包含される。規定されている範囲にこれらの限界点の一方もしくは両方が含まれる場合、これらの包含される限界点のいずれかもしくは両方が排除された範囲もまた本発明に包含される。
本明細書において数値を伴って提示される一定の範囲は、用語「約」の後に続く。「約」という用語は、本明細書において、その後に続く正確な数字、さらには、この用語に続く数字に近いまたは近似する数字に対する文字による根拠を提供するために用いられる。具体的に言及された数字に対してある数字が近いかまたは近似しているかどうかの決定において、近いまたは近似した言及されていない数字は、提示されている文脈において、具体的に言及された数字と実質的に同等である数字であり得る。
別段に定義されていない限り、本明細書において使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野において当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似または等しい方法及び材料のいずれも本発明の実施またはテストにおいて使用され得るが、代表的な方法の実例及び材料がここに記載されている。
本明細書において引用されている刊行物及び特許はすべて、それぞれ個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により援用されると明示されている場合と同様に、参照によって本明細書に援用され、また、引用されている刊行物と関連して方法及び／または材料を開示し、記載するために本明細書において参照により援用されている。いずれかの刊行物の引用は出願日に先行する開示のためであり、先行発明のためにこのような刊行物に先行する資格が本発明にないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供されている刊行物の日付は実際の刊行日とは異なる場合があり、これらは独立して確認が必要であり得る。
本明細書において使用する場合、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明らかにそうではない場合を除き、複数の言及を含むことに注意されたい。特許請求の範囲は、いずれの任意選択の要素も排除されるよう草稿されてもよいことにさらに注目されたい。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の言及に関する「単に」、「のみ」などのそのような排他的な用語法の使用、または「否定的な」限定の使用に対する先行詞とされることが意図される。
本開示を読めば当業者には明らかであろうとおり、本明細書に記載及び説明されている個別の実施形態はそれぞれ、別個の構成成分及び特徴を有し、それらを、本発明の範囲及び意図から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離する、またはそれらと組み合わせることができる。言及されているいずれの方法も、言及されているイベントの順番で、または、論理的に可能であるいずれかの他の順番で実施することができる。
詳細な説明
上記においてまとめたとおり、本開示の態様は、Ｇ６ＰＤ酵素を活性化及び／または安定化し得るＧ６ＰＤ調節剤及びそのような調節剤を使用して試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）を調節する方法を含む。対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療するための方法であって、対象に、有効量のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異Ｇ６ＰＤを選択的に活性化し、対象を治療することを含む方法も提供する。
本開示は、酵素活性の低下をもたらす酵素内の構造的にゆがんだ領域を同定するためのＸ線結晶構造解析による、最も一般的なＧ６ＰＤ変異酵素の１つであるＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの特性解析を記載する。この酵素及びハイスループットスクリーニング法を使用して、酵素を活性化させるための活性化因子（例えば、シャペロン）として作用し得る、及び／または細胞内での酵素の安定性を（例えば、本明細書に記載のとおり）上昇させ得る一群のＧ６ＰＤ調節化合物が同定された。本Ｇ６ＰＤ調節化合物は、様々な一般的なＧ６ＰＤ変異酵素で広域な活性を実証し、本化合物及び方法を、Ｇ６ＰＤ酵素を活性化及び／または安定化するための薬剤として使用することができることを示す。まとめると、本調節剤及び方法は、Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病及び疾患を治療するための治療戦略を提供する。
Ｇ６ＰＤ調節剤
本開示の態様は、Ｇ６ＰＤ調節剤を含む。Ｇ６ＰＤ調節剤は、二量体であってよく、かつリンカー、例えば、ジアミノ含有リンカーを介して結合されている２つの末端炭素環または複素環式基を含む。本調節剤は、ホモ二量体（例えば、対称）またはヘテロ二量体（例えば、１つの非対称リンカー及び／または２つの異なる末端基を含む）であり得る。末端炭素環または複素環式基は、アリール、ヘテロアリール、飽和または部分不飽和炭素環及び飽和または部分不飽和複素環から独立に選択される１〜４つの環（例えば、縮合環）を含み得る。一部の場合において、末端基は、単環式または二環式基（例えば、縮合二環式または架橋二環式）である。一部の事例において、末端炭素環基は、アリール、置換アリール基、シクロアルキル及び置換シクロアルキルから選択される。一部の事例において、末端複素環式基は、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール基、飽和複素環及び置換飽和複素環から選択される。
調節剤は、ジアミノ−化合物、すなわち、相互に約４〜１５オングストローム離れて構成されていて標的Ｇ６ＰＤ酵素結合部位との望ましい結合相互作用を提供する２つのアミノ基を含む化合物であり得る。アミノ基は、分子の任意の便利な位置に、例えば、リンカー内に、またはリンカーまたは末端基に付属する置換基の一部として位置し得る。一部の場合において、２つのアミノ基は、それぞれ脂肪族アミン（例えば、第一級、第二級、第三級または第四級脂肪族アミノ基）であり、それらは、二量体調節剤の対向側で相互に望ましい距離で構成されている。特定の場合において、２つのアミノ基は、末端炭素環または複素環基に連結している置換基中に含まれる。一部の場合において、２つのアミノ基はリンカー内に位置して、末端炭素環または複素環基を結合する原子上の主鎖の一部を形成している。したがって、一部の場合において、調節剤は、ジアミノ含有リンカーを含む。
「ジアミノ含有リンカー」は、２つの部分を結合する二価リンカーを指し、それ自体が２つのアミノ基を含む。２つのアミノ基は、約２〜２０個の原子長さ（例えば、２〜１８、２〜１６、２〜１４、２〜１２、４〜１２または４〜８個の原子長さ）の主鎖を有する連結によって相互に離れて位置する第一級、第二級、第三級または第四級脂肪族アミノ基であり得る。一部の場合において、ジアミノ含有リンカーは、リンカーの主鎖中に２つの第二級アミノ−Ｎ（Ｒ）−基を含み、ここで、Ｒは、水素、アルキルまたは置換アルキルである。一部の場合において、ジアミノ含有リンカーは、２つのアミノ含有置換基をリンカーへの付属物として含む。本リンカーの２つのアミノ基は相互に、例えば、連結基を介して、または空間によって、約４〜１５オングストローム（例えば、５〜１０または６〜８オングストローム、例えば、約７オングストローム）離れて位置してよく、標的Ｇ６ＰＤ酵素結合部位との望ましい結合相互作用を提供する（例えば、図７Ｂを参照されたい）。ジアミノ含有リンカーは、追加のアミノ基（複数可）を任意の便利な位置に含み得ることが理解される。
一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式（Ｉ）：
Ｚ１−Ｙ−Ｚ２ （Ｉ）
（式中、Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、任意選択で、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、アミノ基を含むアミノ含有置換基で置換されており、Ｙは、任意選択で、リンカーを介して分離された２つのアミノ基を含む中央の連結単位である）のジアミノ化合物であって、この際、前記調節剤は、Ｇ４ＰＤ酵素への結合を提供するために約４〜１５オングストローム離れて構成された少なくとも２つのアミノ基を含む。
アミノ含有置換基は、Ｚ１またはＺ２に連結している第一級、第二級、第三級または第四級アミノ基を含み得る。一部の場合において、アミノ含有置換基は、連結された第一級アミノ基（−ＮＨ２）である。式（Ｉ）の一部の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、アミノ−アルキル、置換アミノ−アルキル、アミノ−アルコキシ及び置換アミノ−アルコキシから選択されるアミノ含有置換基で置換されている。
式（Ｉ）の一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式（Ｉａ）：
Ｚ１−Ｔ１−Ｙ−Ｔ２−Ｚ２ （Ｉａ）
（式中、Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、Ｙは２つのアミノ基を含む中央の連結単位（すなわち、ジアミノ含有リンカー）である）のＧ６ＰＤ調節剤である。式（Ｉａ）の特定の実施形態において、Ｙの２つのアミノ基は、中央の連結単位に組み込まれており、リンカーによって分離している。式（Ｉａ）の特定の実施形態において、Ｙの２つのアミノ基は、中央の連結単位に付属するアミノ含有置換基の一部である。
式（Ｉａ）の特定の実施形態において、Ｙは、以下の構造：
（式中、各Ｒは独立に、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、ｎは０〜６（例えば、１、２または３）である）の１種を含む。Ｙの一部の事例において、ｎは１である。Ｙの特定の場合において、ｎは２である。Ｙの特定の場合において、各ＲはＨである。
式（Ｉ）〜（Ｉａ）の一部の実施形態において、Ｙは、ジアミノ含有リンカーであり、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式（ＩＩａ）：
Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋−Ｔ２−Ｚ２ （ＩＩａ）
（式中、Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合または連結鎖であり、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、Ｌ１は中央のリンカーであり、ｘ及びｙは独立に１もしくは２であり、但しｘが１の場合、ｐは０であり、ｘが２の場合、ｐは１であり、ｙが１の場合、ｑは０あり、ｙが２の場合ｑは１である）のＧ６ＰＤ調節剤である。
式（ＩＩａ）の一部の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ１であり、調節剤は、式：Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）−Ｔ２−Ｚ２の１種である。一部の事例において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＨである。式（ＩＩａ）の一部の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ２であり、２つのアミノ基は、第四級アミノ基である。
式（ＩＩａ）の一部の事例において、Ｌ１は、２〜２０個の原子長さ（例えば、２〜１６、２〜１２、３〜１２、４〜１２または４〜１０個、例えば、４、５、６、７、８、９または１０個の原子長さ）の主鎖を有するリンカーであり、このリンカーは、直鎖、分枝であってよいか、または炭素環または複素環式基を含む。特定の場合において、リンカーは直鎖アルキルまたは置換アルキルであり、主鎖の１個または２個以上の炭素原子は、硫黄または酸素ヘテロ原子で任意選択で置換されている。式（ＩＩａ）の特定の実施形態において、調節剤は、以下の構造：
（式中、各Ｒは独立に、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、ｒは、０、１または２であり、ｓは、０〜１２（例えば、１〜６または２〜６、例えば、２、３、４、５または６）である）の１種のジアミノ含有リンカーを含む。
式（ＩＩａ）の一部の事例において、Ｌ１は、任意選択でさらに置換されていて、かつ直接的に、またはＣ１〜Ｃ６アルキルまたは置換アルキルリンカーを介して隣接するアミノ基に連結している二価炭素環または複素環基を含むリンカーである。Ｌ１で使用される目的の二価炭素環または複素環基には、これに限定されないが、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ナフタレン、キノリン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾイソオキサゾール、及びその置換された変種が含まれる。式（ＩＩａ）の特定の実施形態において、調節剤は、以下の構造：
（式中、各Ｒは独立に、Ｈ、アルキルまたは置換アルキルであり、各ｔは、０〜６（例えば、１、２または３）であり、各Ｒ２１は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモまたはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミドまたはカルボキシアミドから選択される１つまたは複数の置換基である）の１種のジアミノ含有リンカーを含む。
式（Ｉ）の一部の実施形態において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、アミノ含有置換基で置換されており、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式（Ｉｂ）：
Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋
（Ｉｂ）
（式中、Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、飽和炭素環、置換飽和炭素環、複素環及び置換複素環から選択され、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、Ｌ２は中央のリンカーであり、ｘ及びｙは独立に２または３であり、但し、ｘが２の場合、ｐは０であり、ｘが３の場合、ｐは１であり、ｙが２の場合、ｑは０あり、ｙが３の場合、ｑは１である）のＧ６ＰＤ調節剤である。
式（Ｉｂ）の一部の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ２であり、調節剤は、式：
Ｎ（Ｒ１）２−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）２の調節剤である。
式（Ｉｂ）の一部の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ３であり、２つのアミノ基は第四級アミノ基である。
式（Ｉｂ）の一部の事例において、Ｌ２は、２〜２０個の原子長さ（例えば、２〜１６、２〜１２、３〜１２、４〜１２または４〜１０個、例えば、４、５、６、７、８、９または１０個の原子長さ）の主鎖を有するリンカーであり、リンカーは、直鎖、分枝であってよいか、または炭素環または複素環式基を含む。特定の場合において、リンカーは直鎖アルキルまたは置換アルキルであり、主鎖の１個または２個以上の炭素原子は、硫黄または酸素ヘテロ原子で任意選択で置換されている。式（Ｉｂ）の一部の場合において、Ｌ２は、２〜１２原子長さである。特定の場合において、リンカーＬ２は、アルキルまたは置換アルキルリンカーである。特定の場合において、リンカーＬ２は、直鎖アルキルまたは置換アルキルであり、主鎖の１個または２個以上の炭素原子は、硫黄または酸素ヘテロ原子で任意選択で置換されている。一部の事例において、Ｌ２は、アミノ基を含まない。
Ｌ２は、Ｚ１とＺ２との間の強固な連結構造のためのコモノマー基から構成される共役リンカーであってよく、２個のアミノ基の望ましい分離を提供する。式（Ｉｂ）の一部の事例において、Ｌ２は、コモノマー基、例えば、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、ビニレン、エチニレンなどから構成されるパイ共役主鎖を有する。一部の場合において、Ｌ２は、１〜６（例えば、２〜６または２〜４つ、例えば２、３または４つ）の１，４−フェニレン、１，３−フェニレン、２，５−ピリジル、２，６−ピリジル、フルオレン、ビニレン、エチニレン、カルバゾール、Ｃ２〜Ｃ１２アルキンから選択されるパイ共役コモノマー基から構成される共役リンカーである。特定の場合において、Ｌ２は、アリーレン−エチニレン、ヘテロアリーレン−エチニレン、エチニレン及び／または４，４’−ビフェニルを含む。一部の場合において、Ｌ２は、４，４’−ビフェニル、エチニレン−１，４−フェニレン−エチニレン、１，４−フェニレン−エチニレン−１，４−フェニレン及びその置換変種から選択される。
式（Ｉａ）の一部の実施形態において、Ｙの２つのアミノ基は、中央の連結単位の置換基であり、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式（ＩＩｂ）：
Ｚ１−Ｔ１−（ＮＨｅｔＮ）−Ｔ２−Ｚ２
（ＩＩｂ）
（式中、−（ＮＨｅｔＮ）−は、１〜４の環（例えば、スピロ、縮合または共役配置で連結している５及び／または６員飽和または不飽和環）を有し、それぞれＴ１及びＴ２に連結している２個の連結末端Ｎ原子（例えば、Ｔ１に結合した第１の第三級アミノ基及びＴ２に結合した第２の第三級アミノ基）を含む２価の複素環式連結環系である）のＧ６ＰＤ調節剤である。式（ＩＩｂ）の一部の事例において、−（ＮＨｅｔＮ）−は、以下の構造：
式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の実施形態において、Ｚ１及びＺ２は同じ基である。調節剤は、対称ホモダイマー、例えば、Ｃ２対称ホモダイマーであってよい。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の実施形態において、Ｚ１及びＺ２は、異なる基である。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール及び置換ヘテロアリールから独立に選択される。Ｚ１及びＺ２は、芳香族または部分不飽和である単環式、二環式または三環式基であり得る。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は、インドール、置換インドール、ベンゾフラン、置換ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、置換ベンゾチオフェン、フェニル、置換フェニル、キノリン、置換キノリン、１，３−ベンゾジオキソール、置換１，３−ベンゾジオキソール、チオフェン、置換チオフェン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、置換２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、ピリジル及び置換ピリジルから独立に選択される。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、インドールまたは置換インドールである。一部の場合において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、３−インドリルまたは置換３−インドリルである。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、ベンゾフランまたは置換ベンゾフランである。一部の場合において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、置換ベンゾフラン−３−イルまたはベンゾフラン−３−イルである。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、フェニルまたは置換フェニルである。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、キノリンまたは置換キノリンである。式（Ｉ）〜（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、１，３−ベンゾジオキソールまたは置換１，３−ベンゾジオキソールである。
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は、以下から独立に選択される：４−ピリジル、置換４−ピリジル（例えば、Ｒ２１置換）、３−ピリジル、置換３−ピリジル（例えば、Ｒ２１置換）、３−ピリジル、置換３−ピリジル（例えば、Ｒ２１置換）、２−チオフェニル、置換２−チオフェニル（例えば、Ｒ２１置換）、
（式中、Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、ｓは０〜４であり（例えば、０、１または２）、それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモまたはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルである）。
式（Ｉ）及び（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は、以下から独立に選択される：
（式中、Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、ｓは０〜４であり（例えば、０、１または２）、それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモまたはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルである）。Ｚ１及びＺ２の場合において、ｘは２であり、ｐは０である。Ｚ１及びＺ２の場合において、それぞれのＲ１はＨである。Ｚ１及びＺ２の場合において、それぞれのＲ１は低級アルキルである。
式（Ｉ）及び（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は、以下から独立に選択される：
（式中、ｎは０〜６（例えば、１、２または３）である）。Ｚ１及びＺ２の一部の事例において、ｎは１である。Ｚ１及びＺ２の特定の場合において、ｎは２である。
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は以下から独立に選択される：
式（ＩＩａ）では、基−Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋−は、ジアミノ含有リンカーを定義し得る。式（ＩＩｂ）では、基Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｔ１−及び−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋がアミノ含有置換基を定義し得る。式（Ｉａ）では、Ｙが２つのアミノ含有置換基で置換されている場合、それらの置換基はそれぞれ、式Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｔ１−及び−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋によって定義され得る（例えば、本明細書で定義するとおり）。式（Ｉ）〜（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｔ１及びＴ２はそれ自体それぞれ独立に、２〜２０原子長さのリンカーである。式（Ｉ）〜（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に、低級アルキルまたは置換低級アルキル、例えば、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである。式（Ｉ）〜（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に、任意選択でさらに置換されている（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、例えば、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキルまたは（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルである。式（Ｉ）〜（Ｉｂ）の特定の事例において、Ｔ１及びＴ２は同じである。式（Ｉ）〜（Ｉｂ）の特定の場合において、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に、−（ＣＨ２）ｍ−であり、ｍは、１〜６、例えば１、２、３、４、５または６である。特定の場合において、ｍは１、２または３である。一部の事例において、ｍは２〜６、例えば２または３である。一部の事例において、ｍは１である。
式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）の一部の実施形態において、Ｚ１−Ｔ１−及びＺ２−Ｔ２−はそれぞれ、以下から独立に選択される：
ジアミノ含有リンカーのアミノ基の一方または両方は、一部の場合において、第二級アミノ基であってよい。したがって、式（Ｉ）の特定の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ、１であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｈである。ジアミノ含有リンカーのアミノ基の一方または両方は、一部の場合において、第三級アミノ基であってよい。したがって、式（Ｉ）の特定の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ１であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれアルキルまたは置換アルキルである。第二級または第三級アミノ基は、例えば生理学的または水性条件下でさらにプロトン化されてよいことが理解される。ジアミノ含有リンカーのアミノ基の一方または両方は、一部の場合において、第四級アミノ基であってよい。したがって、式（Ｉ）の特定の実施形態において、ｘ及びｙはそれぞれ、２であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれアルキルまたは置換アルキルである。式（Ｉ）の特定の実施形態において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＨである。式（Ｉ）の特定の事例において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、アルキルまたは置換アルキルである。式（Ｉ）の特定の事例において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に、低級アルキルまたは置換低級アルキルである。式（Ｉ）の特定の事例において、Ｒ１及びＲ２はそれぞれメチルである。
式（Ｉ）の一部の事例において、Ｌは、２〜２０原子長さである主鎖を有する中央のリンカーである。特定の場合において、Ｌは、２〜１２原子長さ、例えば２〜６、３〜２０、３〜１２、３〜６、４〜２０、４〜１２または４〜６原子長さの主鎖を有する。特定の事例において、Ｌは、長さ４〜１５オングストローム、例えば５〜１０または６〜８オングストローム、例えば、約７オングストロームの２個のアミノ基の窒素原子間の分子内空間を提供するリンカーである。図８は、例示的化合物を図示しており、リンカーの２つのアミノ基の間のおよその分子内距離が図示されている。
式（ＩＩａ）の一部の実施形態において、Ｌ１は、式（ＩＩＩ）：
−Ｌ１１−Ｚ３−Ｌ１２−
（ＩＩＩ）
（式中、Ｌ１１及びＬ１２は独立に、アルキル、置換アルキルまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、Ｚ３は、共有結合、ヘテロ原子、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、二環式炭素環、キュバン、アルケニル、アレニル、アルキニル及び切断可能な基から選択される）のものである。
式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｌ１１及びＬ１２は独立に、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルまたは置換（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキルである。式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｌ１１及びＬ１２は独立に、（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキルまたは置換（Ｃ２〜Ｃ１２）アルキル、例えば（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルまたは置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルキルである。式（ＩＩＩ）の特定の場合において、Ｌ１１及びＬ１２はそれぞれ独立に、−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは、２〜６、例えば２、３、４、５または６である。式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｌ１１及びＬ１２は独立に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−または−ＯＣＨ２ＣＨ２−である。
式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｚ３は共有結合であり、Ｌ１１及びＬ１２は一緒に、単一のリンカー、例えば、アルキルリンカーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを定義している。式（ＩＩａ）の特定の事例において、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは、２〜１２である。式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｚ３は、ヘテロ原子、例えば、−Ｏ−または−Ｓ−である。式（ＩＩａ）の一部の事例において、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−であり、Ｘは、ＯまたはＳであり、ｎ及びｍはそれぞれ独立に、２〜６、例えば２、３、４、５または６である。式（ＩＩＩ）の一部の事例において、Ｚ３は、シクロアルキルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、シクロヘキシル、例えば、１，４−シクロヘキシルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、シクロペンチル、例えば、１，３−シクロペンチルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、シクロブチル、例えば、１，３−シクロブチルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、アリールまたは置換アリールである。式（ＩＩＩ）の特定の場合において、Ｚ３は、フェニルまたは置換フェニル、例えば１，４−フェニル、１，３−フェニルまたは１，２−フェニルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、ピリジル、例えば、２，６−ピリジルである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、二環式炭素環、例えば、ナフタレニル、インドールまたはビシクロ［１，１，１］ペンタンである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、キュバンである。式（ＩＩＩ）の一部の場合において、Ｚ３は、任意選択で置換されているアルケニル、アレニルまたはアルキニルである。
式（ＩＩＩ）の一部の実施形態において、Ｚ３は、切断可能な基を含む。任意の便利な切断可能な基を、本リンカーで使用するために適合させることができる。一部の場合において、Ｚ３は、刺激、例えば、化学的またはレドックス試薬、光量子または酵素）との接触を適用することを介して切断されて、化合物の性質を変化させ、標的Ｇ６ＤＰとのその結合特性を変更し得る切断可能な基である。目的の切断可能な基には、これに限定されないが、化学的に切断可能な部分、酵素切断可能な部分、プロテアーゼ切断可能な部分、酸化切断可能な部分、及び光切断可能な部分が含まれる。特定の事例において、Ｚ３は、エステル、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。特定の事例において、Ｚ３は、ジスルフィド、例えば、−ＳＳ−である。
式（ＩＩａ）の特定の事例において、Ｌ１は、以下から選択される：
式（ＩＩａ）の特定の実施形態において、Ｌ１は、以下の構造：
（式中、それぞれのｔは０〜６（例えば、１、２または３）であり、それぞれのＲ２１は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモまたはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミドまたはカルボキシアミドから選択される１つまたは複数の置換基である）の１種から選択される。
式（ＩＩａ）の特定の事例において、Ｚ１及びＺ２は、以下の組み合わせ：
上の実施形態のいずれか１つの特定の事例において、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に、−（ＣＨ２）ｍ−であり、但し、ｍは、１〜６、例えば１、２、３、４、５または６などであり；かつｘ及びｙはそれぞれ、１であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、Ｈである。
一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式：
一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式：
一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、式：
一部の事例において、調節剤は、表１〜４のうちの１つ、例えば、化合物１〜４７のうちの１つの化合物である
一部の実施形態において、Ｇ６ＰＤ調節剤は、２−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］エタンチオール（ＡＧ１）ではない。
本開示の態様は、Ｇ６ＰＤ調節剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）、その塩（例えば、薬学的に許容される塩）、及び／またはその溶媒和物、水和物及び／またはプロドラッグ形態を含む。加えて、１つまたは複数のキラル中心を有する本明細書に記載のいずれの化合物においても、絶対立体化学が明示されていない場合、それぞれの中心は独立に、Ｒ配置またはＳ配置またはその混合物であってよいことが理解される。塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ及び立体異性体のすべての並び替えが本発明に包含されると意図されることが認識されるであろう。
一部の実施形態において、本Ｇ６ＰＤ調節剤、またはそのプロドラッグ形態を薬学的に許容される塩の形態で提供する。アミンまたは窒素含有ヘテロアリール基を含有する化合物は、本質的に塩基性であり得、したがって、任意の数の無機及び有機酸と反応させて、薬学的に許容される酸付加塩を形成し得る。このような塩を形成するために一般に使用される酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、さらにはパラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸、ならびに関連の無機酸及び有機酸が含まれる。したがって、そのような薬学的に許容される塩には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプリル酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオアート、ヘキシン−１，６−ジオアート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、ヒプル酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩などが含まれる。特定の具体的な実施形態において、薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸及び臭化水素酸などの鉱酸と形成されたもの、ならびにフマル酸及びマレイン酸などの有機酸と形成されたものが含まれる。
一部の実施形態において、本Ｇ６ＰＤ調節剤をプロドラッグ形態で提供する。「プロドラッグ」は、活性薬剤を放出するためには身体内での変換を必要とする、活性薬剤の誘導体を指す。特定の実施形態において、変換は、酵素的変換である。プロドラッグは、必ずしもではないが往々にして、活性薬剤に変換されるまでは薬理学的に不活性である。「プロ部分」は、活性薬剤内の官能基をマスクするために使用された場合に、活性薬剤をプロドラッグに変換する保護基の形態を指す。一部の場合において、プロ部分は、酵素的または非酵素的手段によってインビボで切断される結合（複数可）を介して薬物に結合されるであろう。例えば、Ｒａｕｔｉｏ ｅｔ ａｌ．によって記載されたストラテジー及び方法（“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７，２５５−２７０ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８））に従って、本化合物の任意の便利なプロドラッグ形態を調製することができる。
一部の実施形態において、本Ｇ６ＰＤ調節剤、そのプロドラッグ、立体異性体または塩を溶媒和物（例えば、水和物）の形態で提供する。本明細書で使用する場合の「溶媒和物」という用語は、１つまたは複数の溶質の分子、例えばプロドラッグまたはその薬学的許容される塩、及び１つまたは複数の溶媒分子によって形成される複合体または凝集物を指す。そのような溶媒和物は典型的には、実質的に固定されたモル比の溶質及び溶媒を有する結晶質固体である。代表的な溶媒には、例として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが含まれる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は、水和物である。
医薬製剤
医薬製剤も提供する。医薬製剤は、薬学的に許容されるビヒクル中に存在するＧ６ＰＤ調節剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）（例えば、単独か、または１種または複数の追加の活性薬剤の存在下の１種または複数の本化合物）を含む組成物である。「薬学的に許容されるビヒクル」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されるか、またはヒトなどの哺乳類での使用について米国薬局方または他の一般に認識された薬局方に記載されているビヒクルであってよい。「ビヒクル」という用語は、本開示の化合物が哺乳類に投与するためにそれと共に製剤化される希釈剤、補助剤、賦形剤、または担体を指す。そのような薬学的ビヒクルは、石油、動物、植物性または合成由来のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む水及び油などの液体であってよい。医薬ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであってよい。加えて、補助剤、安定化剤、増ちょう剤、滑沢剤及び着色剤を使用してよい。
哺乳類に投与する場合、本開示の化合物及び組成物ならびに薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、または希釈剤は無菌であり得る。一部の事例において、本化合物を静脈内投与する場合、水、生理食塩水、及び水性デキストロース及びグリセロール溶液などの水性媒体をビヒクルとして使用する。
医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、ロゼンジ剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、もしくはその持続放出製剤の形態、または哺乳類への投与に適切な任意の他の形態をとり得る。一部の事例において、医薬組成物を、ルーチン的な手順に従って投与するために、ヒトへの経口または静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化する。適切な薬学的ビヒクル及びその配合方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８６，８７，８８，９１，ａｎｄ ９２に記載されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。一部では、特定の化合物によって、さらには組成物を投与するために使用される特定の方法によって、賦形剤の選択を決定する。したがって、本医薬組成物の広範な適切な製剤が存在する。
本Ｇ６ＰＤ調節剤の投与は、全身的または局所的であってよい。特定の実施形態において、哺乳類への投与は、本開示の化合物の全身放出をもたらす（例えば、血流へ）。投与方法には、腸内経路、例えば、経口、頬側、舌下、及び直腸；局所投与、例えば、経皮及び皮内；ならびに非経口投与が含まれ得る。適切な非経口経路には、皮下針またはカテーテルによる注射、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳室内、髄腔内、及び腔内注射及び非注射経路、例えば膣内、直腸、または経鼻投与が含まれる。特定の実施形態において、本開示の化合物及び組成物を皮下投与する。特定の実施形態において、本開示の化合物及び組成物を経口投与する。特定の実施形態において、１種または複数の本開示の化合物を、治療を必要とする領域に局所投与することが望ましいことがある。これは、例えば、外科手術中の局所注入、局所施与によって、例えば、外科手術後の創傷包帯と併せて、注射によって、カテーテルを用いることによって、坐剤を用いることによって、またはインプラントを用いることによって達成され得、前記インプラントは、シラスティック膜などの膜、または線維を含む多孔性、非多孔性、またはゲル状物質である。
化合物を、それらを水性または非水性溶媒、例えば植物性または他の同様の油状物、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール中に；所望の場合において、従来の賦形剤、例えば、溶解補助剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤及び防腐剤と共に溶解、懸濁または乳化させることによって、注射用の製剤に製剤化することができる。
本Ｇ６ＰＤ調節剤を経口投与のために製剤化することもできる。経口医薬製剤では、適切な賦形剤には、医薬グレードの担体、例えば、マンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、デンプン、セルロース、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、及び／または炭酸マグネシウムが含まれる。経口液体製剤で使用するために、組成物を、液剤、懸濁剤、乳剤、またはシロップ剤として調製することができ、例えば、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、またはエタノール、好ましくは水または生理食塩水などの水性担体中での水和に適切な固体または液体形態のいずれかで供給する。所望の場合には、組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、または緩衝剤を含有してもよい。一部の実施形態において、経口投与に適切な製剤は、（ａ）溶液、例えば、希釈剤、例えば水、または生理食塩水中に溶解した有効量の化合物；（ｂ）それぞれ所定の量の活性成分、固体または顆粒剤を含有するカプセル剤、サシェ剤または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；及び（ｄ）適切な乳剤を含むことができる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、及び薬理学的に適合性な賦形剤の１種または複数を含み得る。ロゼンジ形態は、活性成分を香味剤、通常はスクロース及びアラビアゴムまたはトラガカント中に含んでよく、さらには香錠は、活性成分を不活性な基剤、例えばゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシア、エマルジョン、ゲルなど中に含み、活性成分に加えて、本明細書に記載のような賦形剤を含有する。
本製剤を、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤に作製することができる。これらのエアロゾル製剤を許容される加圧噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン窒素などに入れることができる。これらをまた、噴霧器またはアトマイザーなどで使用するための非加圧製剤のための医薬品として製剤化することができる。
一部の実施形態において、非経口投与に適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び溶質を含有してよく、製剤を意図されているレシピエントの血液と等張性にする水性及び非水性等張性滅菌注射液ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含んでよい水性及び非水性滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を単位用量または多回用量密閉容器、例えばアンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体賦形剤、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵することができる。即時注射液剤及び懸濁剤を以前に記載された種類の滅菌散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
局所投与に適切な製剤を、活性成分に加えて、適切であるような担体を含有するクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、またはフォーム剤として提供することができる。一部の実施形態において、局所製剤は、構造化剤、増粘剤またはゲル化剤、及び皮膚軟化剤または滑沢剤から選択される１種または複数の成分を含有する。往々にして使用される構造化剤には、長鎖アルコール、例えばステアリルアルコール、及びグリセリルエーテルまたはエステル及びオリゴ（エチレンオキシド）エーテルまたはそのエステルが含まれる。増粘剤及びゲル化剤には、例えば、アクリル酸またはメタクリル酸及びそのエステルのポリマー、ポリアクリルアミド、及び天然に存在する増粘剤、例えば寒天、カラゲナン、ゼラチン、及びガーゴムが含まれる。皮膚軟化剤の例には、トリグリセリドエステル、脂肪酸エステル及びアミド、蝋、例えば蜜蝋、鯨蝋、またはカルナウバ蝋、リン脂質、例えばレシチン、及びステロール及びその脂肪酸エステルが含まれる。局所製剤はさらに、他の成分、例えば、収れん剤、香料、顔料、皮膚透過増強剤、サンスクリーン剤（例えば、日焼け止め剤）などを含んでよい。
経口または直腸投与のための単位剤形、例えばシロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤を提供することができ、その際、各投薬単位、例えば、茶さじ量、テーブルスプーン量、錠剤または坐剤は、所定の量の、１種または複数の阻害薬を含有する組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、阻害薬（複数可）を組成物で、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として含み得る。
本明細書で使用する場合の「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルに関連して所望の作用をもたらすために十分な量で計算された所定の量の本開示の化合物を含有する。本開示の新規の単位剤形のための仕様は、使用される特定の化合物及び達成される作用、ならびに宿主において各化合物と関連する薬力学に依存する。薬学的投薬形態において、化合物を遊離塩基、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与することができるか、または単独で、または適切な会合で、さらには他の薬学的に活性な化合物との組み合わせで使用することもできる。
用量レベルを、具体的な化合物、送達ビヒクルの性質などに関連して変化させることができる。所与の化合物での所望の投薬量を、様々な手段によって容易に決定することができる。本開示の文脈において動物、とくにヒトに投与される用量は、例えば、本明細書にさらに詳細に記載されているような合理的な時間枠にわたって、動物において予防または治療反応をもたらすために十分であるべきである。投薬量は、使用される特定の化合物の強さ、動物の状態、及び動物の体重、さらには疾患の重症度及び疾患の段階を含む様々な因子に依存することとなる。用量のサイズも、特定の化合物の投与に伴い得る何らかの有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されることとなる。
Ｇ６ＰＤの調節方法
本開示の態様は、試料をＧ６ＰＤ調節剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）と接触させることによって、試料においてグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）を調節する方法を含む。Ｇ６ＰＤ調節剤は、Ｇ６ＰＤを安定化する、及び／またはＧ６ＰＤ酵素を調節する（例えば、活性化する）ように作用し得る。一部の場合において、本調節剤は、酵素のＮＡＤＰ＋結合部位でＧ６ＰＤに結合し、それによって、酵素を構造的に安定化する。図７Ａ及び７Ｂは、本調節剤のＧ６ＰＤ二量体界面及び提案された結合部位に焦点を当てたＧ６ＰＤのＣａｎｔｏｎバリアント（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の展開図を図示しており、この際、ＮＡＤＰ＋構造は、黒色の棒（図７Ａ）として示されており、例示的化合物はシアン色で示されている（図７Ｂ）。重度または軽度欠乏症をもたらす大部分のＧ６ＰＤバリアントは主に、酵素のこれらの機能的領域に位置し／変異しており、酵素の活性及び安定性を障害する。
特定の実施形態において、本方法によって減少する有害な影響は、Ｇ６ＰＤの機能の喪失であり得る。これらの実施形態のいくつかでは、バリアントＧ６ＰＤが構造的に不安定化されているので、Ｇ６ＰＤの野生型または正常な活性が、完全ではなくとも少なくとも部分的に損なわれている。これらの事例では、機能の喪失が、完全ではなくとも少なくとも部分的に、本調節剤の結合によって逆転される。標的Ｇ６ＰＤの所望の機能が、統計的に有意な量によって、適切な対照、例えば、目的の調節剤と接触していない試料または細胞と比較して増強され得、その際、所望の活性の増強規模は、１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはさらに上回り得る。
「構造的に安定化すること」とは、本化合物の結合が、増強された安定性（例えば、酵素的分解に対して増強された熱安定性及び／または増強された安定性）を有するＧ６ＰＤタンパク質の折り畳まれた状態をもたらし、これが、酵素の１つまたは複数の特性を変化させ得ることを意味する。一部の場合において、Ｇ６ＰＤの構造的安定化は、Ｇ６ＰＤ変異体の活性を復活させる、または酵素の触媒活性を増加させる（例えば、Ｇ６ＰＤを活性化させる）。
「熱安定性の増強」とは、Ｇ６ＰＤ酵素がその触媒活性（Ｔ１／２）の半分を維持する温度が、調節剤と接触していない対照Ｇ６ＰＤと比べて、統計的に有意な量ほど、一部の場合において２摂氏温度以上ほど、例えば３度以上、４度以上、５度以上、６度以上、８度以上、１０度以上、１５度以上、２０度以上、またはさらに上回るほど上昇することを意味する。
「酵素的分解に対する安定性の増強」とは、キモトリプシン分解に対するＧ６ＰＤの半減期が、調節剤と接触していない対照Ｇ６ＰＤと比べて、１０％以上、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはさらに上回るほど増加することを意味する。
「Ｇ６ＰＤを活性化する」とは、Ｇ６ＰＤの酵素活性のレベル（例えば、図１Ａを参照されたい）が、調節剤と接触していない対照Ｇ６ＰＤと比べて、統計的に有意な量ほど、一部の場合において１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、またはさらに上回るほど増強することを意味する。Ｇ６ＰＤの酵素活性のレベルは、直接的に（例えば、基質の消費または酵素反応生成物の生成を介して）または間接的に（例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）、ＮＡＤＰＨ、及び／または細胞に対する酸化ストレスの尺度のレベルを介して）測定することができることが理解される。
特定の実施形態において、本方法はさらに、試料におけるＧ６ＰＤの活性のレベルを評価するステップを含む。任意の便利なアッセイを使用して、対照、例えば、目的の化合物と接触していない試料と比べて、本調節剤を使用する試料におけるＧ６ＰＤの安定性または活性化の増強を決定することができ、この際、変化の規模は、１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、５０％以上、１００％以上、例えば２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはさらに上回るほどであり得る。したがって、調節剤がＧ６ＰＤを活性化させる場合、活性レベルは、対照、例えば、調節剤と接触していない試料と比較して、調節剤と接触していない対照Ｇ６ＰＤと比べて、１１０％以上、例えば、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１５０％以上、１５０％以上、１５０％以上、１５０％以上、１５０％以上、またはさらに上回り得る。任意の便利な直接的から間接的なＧ６ＰＤ活性のマーカー、及び任意の簡便なアッセイを利用して、試料において目的のＧ６ＰＤの機能または活性のレベルを決定することができる。
一部の場合において、Ｇ６ＰＤは、酵素の活性及び安定性を障害するＧ６ＰＤバリアントまたは変異体である。任意の便利なＧ６ＰＤバリアントを、本方法に従って標的化することができる。そのような場合、本調節剤は、Ｇ６ＰＤの安定性及び／または活性を維持する、または対応する野生型Ｇ６ＰＤのものに復帰させることができる。したがって、これらの実施形態において、本方法は、有害な変異が存在するにも関わらず、標的Ｇ６ＰＤの生理学的に望ましい活性（例えば、野生型Ｇ６ＰＤ活性）を維持する、または復帰させることができる。特定の場合において、標的Ｇ６ＰＤの正常な対立遺伝子の活性が試料において維持され、例えば、本調節剤と接触していない対照試料の対応する活性の２０％以内（例えば１０％以内、５％以内、２％以内または１％以内）である活性を有する。
特定の実施形態において、Ｇ６ＰＤは、活性に影響を及ぼす位置、例えば、本明細書に記載されていて、図９Ａ及び９Ｂに図示されているＸ線構造回折において同定されるとおりの位置の１つまたは複数に変異を含む変異Ｇ６ＰＤである。一部の場合において、変異は、Ｒ４５９、Ｖ６８、Ｎ１２６、Ｓ１８８、Ｒ４６３及び／またはＰ１７２に位置する。特定の場合において、変異Ｇ６ＰＤは、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ変異体である。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ変異体は、Ｒ４５９Ｌ変異及び任意選択で１つまたは複数の追加の変異を含むＧ６ＰＤを指す。特定の場合において、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ変異体は、Ｒ４５９Ｌのみを含むバリアントである。
方法の特定の実施形態において、バリアントＧ６ＰＤの有害な影響は、酸化的損傷に対する、例えば、細胞に対する易損性の上昇である。したがって、一部の事例において、本方法は、酸化的損傷または酸化的損傷に対する感受性の低下をもたらし、これは、標的Ｇ６ＰＤバリアントに寄与し得、その際、低下の規模は様々であり得、一部の事例において、例えば適切な対照、例えば、目的の調節剤と接触していない細胞と比較して、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、またはさらに上回る。下記でより詳細に記載するとおり、酸化的損傷は、特定のＧ６ＰＤに依存し得るいくつかの異なる方法で減少し得る。酸化的損傷は、直接的または間接的に評価することができる（例えば、細胞におけるＮＡＤＰＨ及び／またはＧＳＨのレベル）。一部の場合において、試料は、細胞試料であり、本方法は、対照と比べて細胞生存度の上昇、例えば、５％以上、例えば１０％以上、例えば１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、またはさらに上回る上昇をもたらす。一部の事例において、酸化的損傷は、試料、例えば、細胞において所望のレベルのＮＡＤＰＨ及び／またはＧＳＨを維持することによって減少する。ＮＡＤＰＨ及び／またはＧＳＨのレベルは、下の実験セクションに記載の任意の便利なプロトコルを使用してアッセイすることができる。
特定の実施形態において、本調節剤は、適切な対照と比較して、細胞生存度アッセイによって決定した場合、例えば、細胞に対して細胞を本開示の化合物と接触させ、かつ均質法、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを使用して培養物中の生細胞の数を決定することによって決定した場合に、細胞の生存度を上昇させる。
「試料」という用語は、一部の場合において、必ずしもではないが、目的の１種または複数の成分を含有する液体、すなわち、水性形態での、物質または物質の混合物に関する。試料は、様々な供給源、例えば、食料品、環境物質、生物試料もしくは固体、例えば個体から単離された組織又は流体（これに限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、***、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管、及び泌尿生殖器管の外部切片、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、臓器）、ならびにインビトロ細胞培養構成成分の試料（これに限定されないが、細胞培養培地での細胞の増殖の結果得られる馴化培地、ウィルスに感染されたと推定される細胞、組換え細胞、及び細胞成分を含む）に由来し得る。
一部の場合において、試料は、細胞試料である。任意の便利な細胞が、本方法で使用するための標的であってよい。一部の事例において、化合物が活性を示す細胞の種類は、標的Ｇ６ＰＤ、例えば、バリアントＧ６ＰＤを含むものである。方法の一部の実施形態において、細胞は、動物細胞または酵母細胞である。特定の事例において、細胞は、哺乳類細胞である。
特定の実施形態によって方法を実施する際には、有効量の化合物、例えば、Ｇ６ＰＤ調節剤を標的細胞または細胞に与える。一部の事例において、有効量の化合物を、細胞を化合物と接触させることによって細胞において与える。細胞と調節剤との接触を任意の便利なプロトコルを使用して行うことができる。プロトコルは、標的細胞の位置に応じて、調節剤と標的細胞とのインビトロまたはインビボ接触をもたらし得る。一部の事例において、細胞はインビトロである。特定の事例において、細胞はインビボである。接触は細胞への化合物の侵入を含んでも、または含まなくてもよい。例えば、標的細胞が単離細胞である場合、調節剤を、標的細胞の生存を可能にする細胞培養条件下で細胞に直接的に導入することができる。方法の選択は一般に、接触させる細胞の種類及び化合物の性質、及び形質転換が行われる状況（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。
別法では、標的細胞または細胞が多細胞生物の一部である場合、調節剤を生体または対象に、化合物が標的細胞（複数可）と接触し得るような手法で、例えば、インビボまたはエクスビボプロトコルを介して投与することができる。「インビボ」とは、調節剤を動物の生体に投与することを意味する。「エクスビボ」とは、細胞または器官を身体の外側で変更することを意味する。そのような細胞または器官を一部の場合において、生体に戻す。
特定の実施形態において、方法は、それを必要とする対象に、変異Ｇ６ＰＤを選択的に活性化させ、対象をＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療する有効量の本Ｇ６ＰＤ調節剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を投与することを含むインビボ方法である。本明細書で使用する場合の「治療すること」または「治療」という用語は、患者、例えば哺乳類（ヒトなど）において疾患または病状を治療すること、または治療を意味し、これは：（ａ）疾患または病状の発生の予防、例えば、対象の予防的治療；（ｂ）疾患または病状の寛解、例えば、患者における疾患または病状の除去または退縮の惹起；（ｃ）例えば、患者において疾患または病状の発生を減速または停止させることによる、疾患または病状の抑制；または（ｄ）患者における疾患または病状の症状の緩和を含む。
本明細書で使用する場合、「宿主」、「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、互換的に使用され、開示の方法によるそのような治療を必要とする任意の哺乳類を指す。そのような哺乳類には、例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、及びラットが含まれる。特定の実施形態において、対象は非ヒト哺乳類である。一部の実施形態において、対象は家畜である。他の実施形態において、対象はペットである。一部の実施形態において、対象は哺乳類である。特定の場合において、対象はヒトである。他の対象には、家庭内ペット（例えば、イヌ及びネコ）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット、例えば、疾患の動物モデルにおいてなど）、さらには非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、及びサル）が含まれ得る。
投与される化合物の量は、任意の便利な方法を使用して、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルに関連して所望の作用をもたらすために十分な量であるように決定することができる。本開示の新規の単位剤形のための仕様は、使用される特定の化合物及び達成される作用、ならびに宿主において各化合物と関連する薬力学に依存する。
一部の実施形態において、有効量の本化合物は、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約８００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約７００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約６００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ〜約８５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約９００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約８００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約７００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約６００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、または約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ）の範囲である量である。
一部の実施形態において、本化合物の有効量は、約１０ｐｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約１０ｐｇ〜約５０ｐｇ、約５０ｐｇ〜約１５０ｐｇ、約１５０ｐｇ〜約２５０ｐｇ、約２５０ｐｇ〜約５００ｐｇ、約５００ｐｇ〜約７５０ｐｇ、約７５０ｐｇ〜約１ｎｇ、約１ｎｇ〜約１０ｎｇ、約１０ｎｇ〜約５０ｎｇ、約５０ｎｇ〜約１５０ｎｇ、約１５０ｎｇ〜約２５０ｎｇ、約２５０ｎｇ〜約５００ｎｇ、約５００ｎｇ〜約７５０ｎｇ、約７５０ｎｇ〜約１μｇ、約１μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１５０μｇ、約１５０μｇ〜約２５０μｇ、約２５０μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約７５０μｇ、約７５０μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲である量である。量は、単回用量であってよいか、または合計１日量であってよい。合計１日量は、１０ｐｇ〜１００ｍｇであってよいか、または１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲であってよいか、または５００ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であってよい。
一部の実施形態において、本化合物の単回用量を投与する。他の実施形態において、本化合物の複数の用量を投与する。複数の用量をある期間にわたって投与する場合、Ｇ６ＰＤ調節化合物をある期間にわたって１日２回（ｑｉｄ）、１日１回（ｑｄ）、１日おき（ｑｏｄ）、３日ごと、週３回（ｔｉｗ）、または週２回（ｂｉｗ）投与する。例えば、化合物を１日から約２年以上にわたってｑｉｄ、ｑｄ、ｑｏｄ、ｔｉｗ、またはｂｉｗで投与する。例えば、化合物を、様々な因子に応じて、上述の頻度のいずれかで、１週間、２週間、１か月、２か月、６か月、１年、または２年以上にわたって投与する。
様々な方法のいずれかを使用して、治療方法が有効であるかどうかを決定することができる。例えば、本方法で治療されている個体から得られた生体試料をＧ６ＰＤ酵素活性及び／またはＧＳＨ及び／またはＮＡＤＰＨのレベルについてアッセイすることができる。対象に対する治療方法の有効性の評価には、任意の便利な方法を使用しての治療前、その間及び／またはその後の対象の評価が含まれ得る。本方法の態様はさらに、治療に対する対象の治療反応を評価するステップを含む。
一部の実施形態において、方法は、治療される目的の疾患または疾病（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）と関連する対象の１つまたは複数の症状を診断または評価することを含む、対象の疾病を評価することを含む。一部の実施形態において、方法は、対象から生体試料を得るステップ、及び試料を、例えば、Ｇ６ＰＤ酵素活性及び／またはＧＳＨ及び／またはＮＡＤＰＨのレベルについて、または治療される目的の疾患または疾病（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）と関連する細胞の存在についてアッセイするステップを含む。試料は、細胞試料であり得る。本方法の評価ステップ（複数可）を、任意の便利な方法を使用して、本化合物の投与前、その間及び／またはその後に１回または複数回行うことができる。特定の場合において、評価ステップは、変異Ｇ６ＰＤを含む細胞の同定を含む。特定の場合において、対象の評価は、対象が目的のＧ６ＰＤ関連疾患または疾病を有するかどうかの診断を含む。
一部の事例において、方法は、疾患と関連する症状の発生を遅延させる。特定の事例において、方法は、疾患と関連する症状の程度を縮小させる。目的の疾患状態には、Ｇ６ＰＤ不全欠乏症と関連するもの、例えば酸化ストレスに関連する疾病が含まれる。一部の場合において、Ｇ６ＰＤ欠乏症と関連する疾病は、倦怠、背部痛、貧血、及び／または黄疸によって特徴づけられ得る急性溶血として症状発現される。加えて、複数の臨床的障害、例えば糖尿病、心筋梗塞または激しい運動は、Ｇ６ＰＤ欠乏症の個体において溶血を誘発し得る。「進行を変更する」という用語は、進行速度の減少（例えば、疾患状態の１つまたは複数の症状の発生の遅延で現れるような）、さらには疾患状態の治癒を含む進行の逆転（例えば、疾患状態の１つまたは複数の症状の程度の減少で現れるような）の両方を包含するために使用される。本発明の方法及び組成物を使用することができる具体的な疾患状態には、これに限定されないが、上記の導入セクションで列挙されているもの、及びクラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩ Ｇ６ＰＤ不全欠乏症に関連する酸化ストレスに関連する疾病、急性溶血、溶血性貧血、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸）、慢性非球状赤血球溶血性貧血、間欠的溶血エピソード、神経疾病、浮腫、腎臓損傷及び白内障が含まれる。特定の場合において、疾病は、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸）から選択される。
様々な異なるマーカーを使用して、疾患状態及びそれに対する治療の効果をモニターすることができる。方法の実施形態の実行は、使用される特定の試験において測定されるパラメータの改善をもたらし得、その際、改善は、一部の事例において、５％以上、例えば１０％以上、及び一部の事例において、１００％、またはさらにそれを上回り得る。一部の事例において、患者の血液、組織及び体液から採取された試料を代理マーカーについて分析する。これらのマーカーは様々であってよく、その際、そのようなマーカーの例には、血清中で見出される分析物または物理的測定値、例えば、ｐＨまたは血液体積が含まれる。体液及び組織中のそのようなマーカーの濃度、レベル、または定量的測定値は多くの場合に、疾患症状の出現と対応することが見出されている。加えて、疾患についての代理マーカーは、撮影マーカー、例えば、神経イメージング及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって得られるマーカーであり得る。イメージングを使用して、萎縮の体積、レベル、及び脳の領域全体にわたる白質及び灰白質における活性についての情報を得る。
本方法では、化合物（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）は、所望の活性をもたらし得る任意の便利な投与プロトコルを使用して、標的化細胞に投与することができる。したがって、本化合物を、治療用投与のための様々な製剤、例えば、薬学的に許容されるビヒクルに組み込むことができる。
上記の方法は、様々な異なる適用で使用することができる。特定の適用を次の有用性のセクションで概説する。
有用性
本方法及び化合物組成物を、標的Ｇ６ＰＤ酵素の安定化及び／または活性化が望ましい様々な適用で使用する。したがって、本発明の態様は、それを必要とする任意の対象、例えば、対象において上記の結果の１つまたは複数をもたらすことによって治療され得るＧ６ＰＤ不全欠乏症に関連する疾病と診断されている対象において、本明細書に記載のような本調節剤を使用して、変異Ｇ６ＰＤを活性化することを含む。Ｇ６ＰＤ不全欠乏症に関連する疾病と関連する疾患状態の進行を変更するための本方法及び組成物の使用は重要である。「進行を変更する」という語句は、進行速度の減少（例えば、疾患状態の１つまたは複数の症状の発生の遅延で現れるようなもの）、さらには疾患状態の治癒を含む進行の逆転（例えば、疾患状態の１つまたは複数の症状の程度の減少で現れるような）の両方を包含するために使用される。本発明の方法及び組成物を使用することができる具体的な疾患状態には、これに限定されないが、クラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩ Ｇ６ＰＤ不全欠乏症に関連する酸化ストレス関連疾病、急性溶血、溶血性貧血、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸）、慢性非球状赤血球溶血性貧血、間欠的溶血エピソード、神経疾病、浮腫、腎臓損傷及び白内障が含まれる。
クラスＩ Ｇ６ＰＤバリアントを有する患者は、慢性溶血性貧血と関連する重度の酵素欠乏（例えば、正常な＜１０パーセント）を有し得る。クラスＩＩバリアントを有する患者も、重度の酵素欠乏（例えば、正常な＜１０パーセント）を有するが、通常、典型的には、ソラマメ曝露または特定の薬物の摂取などのオキシダントストレスへの暴露での間欠的溶血のみが存在する。地中海Ｇ６ＰＤが一例である。クラスＩＩバリアントを有する患者は、中程度の酵素欠乏（例えば、正常の１０〜６０パーセント）を典型的には有意なオキシダントストレスと関連する間欠的溶血と共に有する。Ｇ６ＰＤ Ａ−が一例である。
一部の事例において、本方法の実行は、疾患状態についての対象の治療をもたらす。治療とは、少なくとも、対象を苦しめる疾患状態と関連する１つまたは複数の症状の改善を意味し、その際、寛解は、広い意味で、少なくとも、治療される病状と関連するパラメータ、例えば、症状の程度の減少、例えば認知機能の低下などを指すために使用される。したがって、治療はまた、病状、または少なくともそれと関連する症状が完全に阻害されて、例えば、出来が予防されて、または停止されて、例えば、終了されて、対象が病状、または少なくとも、病状を特徴づける症状にもはや罹患していないようにする状況を含む。治療はまた、例えば、上記のとおりの疾患状態の代理マーカーの変化の形態で現れ得る。
様々な宿主を本方法によって治療することができる。一般に、そのような宿主は、「哺乳類」または「哺乳動物」であり、この際、これらの用語は、哺乳類の範囲内の生物を広く指すために使用され、食肉類（例えば、イヌ及びネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモット及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー及びサル）を含む。一部の実施形態において、宿主はヒトである。
本調節剤、製剤、キット及び方法は、経時的な細胞の溶血の程度を減少させ、赤血球貯蔵中の保存を改善することによって、細胞試料、例えば、赤血球細胞の保存で使用される。一部の場合において、調節剤は、細胞試料の貯蔵安定性をもたらす。一部の場合において、保存製剤が、血液貯蔵及び輸血法及び適用と併せて使用される。
併用療法
本化合物を、単独で、または追加の、すなわち、第２の活性薬剤と組み合わせて対象に投与することができる。したがって、一部の場合において、本方法はさらに、対象に少なくとも１つの追加の治療または化合物を投与することを含む。一般にＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病または酸化ストレスに関連する疾病を治療するために有用な化合物を含む任意の便利な薬剤を利用することができる。一部の場合において、本化合物を投与して、対象が摂取する酸化ストレスをもたらす薬物の作用を無効にする。そのような薬物は、Ｇ６ＰＤ欠乏個体において溶結を誘発することが公知である。一部の場合において、本調節剤の投与は、酸化ストレスをもたらす薬物での継続的な治療をもたらし得る。
「薬剤」、「化合物」、及び「薬物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。例えば、選択的Ｇ６ＰＤ調節剤化合物を単独で、または１種または複数の他の薬物、例えば、酸化ストレス関連疾患の治療で用いられる薬物と併せて使用することができる。一部の実施形態において、方法はさらに、第２の薬物を同時に、または連続して同時投与することを含む。一部の実施形態において、方法はさらに、対象で輸血（例えば、交換輸血）を行うことを含む。
「同時投与」及び「と組み合わせて」という用語は、２種以上の治療薬を具体的ではない期限内で同期で、同時に、または順に投与することを含む。一実施形態において、薬剤は、細胞内、または対象の身体内に同時に存在するか、または同時にそれらの生物学的または治療効果を発揮する。一実施形態において、治療薬は、同じ組成物または単位剤形中にある。他の実施形態において、治療薬は、別々の組成物または単位剤形中にある。特定の実施形態において、第１の薬剤を、第２の治療薬を投与する前に（例えば、数分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前に）、それと同時に、またはその後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週後に）投与することができる。
本開示の医薬組成物との公知の治療薬の「随伴投与」は、公知の薬物及び本発明の組成物の両方が治療効果を有するであろう時間での化合物及び第２の薬剤の投与を意味する。そのような随伴投与は、本化合物の投与に関して薬物の投与と同時（すなわち同じ時間）、その前、またはその後の投与を伴い得る。２種の薬剤の投与経路は様々であってよく、その際、代表的な投与経路を下記においてより詳細に記載する。当業者は、特定の薬物及び本開示の化合物のための投与の適切なタイミング、順序及び投薬量の決定において何ら困難を有さないであろう。
一部の実施形態において、化合物（例えば、本化合物及び少なくとも１種の追加の化合物）を対象に、相互に２４時間以内に、例えば相互に１２時間以内に、相互に６時間以内に、相互に３時間以内に、または相互に１時間以内に投与する。特定の実施形態において、化合物を相互に１時間以内に投与する。特定の実施形態において、化合物を実質的に同期で投与する。実質的に同期で投与するとは、化合物を対象に、相互に約１０分以下内に、例えば相互に５分以下、または１分以下内に投与することを意味する。
本化合物及び第２の活性薬剤の医薬製剤も提供する。医薬剤形では、化合物をそれらの薬学的に許容される塩の形態で投与することができるか、またはそれらを単独で、または適切な会合で、さらに他の薬学的活性化合物と組み合わせて使用することもできる。
１日あたり約０．０１ｍｇ〜約１４０ｍｇ／体重ｋｇの規模の投薬量レベルが代表的な実施形態において有用であり、または別法では患者１人あたり１日あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇである。当業者であれば、用量レベルが、具体的な化合物、症状の重症度及び副作用に対する対象の罹患性を関数として変動し得ることが容易に分かるであろう。所与の化合物での投薬量は、当業者によって様々な手段によって容易に決定され得る。
単一剤形を生産するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与様式に応じて変動する。例えば、ヒトの経口投与が意図されている製剤は、組成物全体の約５〜約９５パーセントで変動し得る適切で便利な量の担体物質と配合された活性薬剤０．５ｍｇ〜５ｇを含有し得る。投薬単位形態は一般に、活性成分約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇを含有することとなる。
しかしながら、いずれかの特定の患者のための具体的な用量レベルは、年齢、体重、全身健康、性別、食事、投与時間、投与経路、***速度、薬物の組み合わせ及び治療を施される特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することとなることは理解されるであろう。
したがって、経口または直腸投与のための単位剤形、例えば、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤を提供することができ、その際、各投薬単位、例えば、茶さじ量、テーブルスプーン量、錠剤または坐剤は、所定の量の、１種または複数の阻害薬を含有する組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、阻害薬（複数可）を組成物で、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として含み得る。本明細書で使用する場合の「単位剤形」という用語は、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルに関連して所望の作用をもたらすために十分な量で計算された所定の量の本開示の化合物を含有する。本開示の新規の単位剤形のための仕様は、使用される特定のペプチド模倣化合物及び達成される作用、ならびに宿主において各化合物と関連する薬力学に依存する。当業者は、用量レベルを、具体的な化合物、送達ビヒクルの性質などに関連して変化させることができることは容易に認識されるであろう。所与の化合物または薬剤のための好ましい投薬量は、当業者によって様々な手段によって容易に決定され得る。
キット及びシステム及び他の組成物
上記のとおり記載されるものなどの方法の実施形態の実行において使用されるキット及びシステムも提供する。本明細書において用いる場合の「システム」という用語は、本方法の実行を目的として一緒にされた単一または異なる組成物で存在する２種以上の異なる活性薬剤の集まりを指す。キットという用語は、包装された活性薬剤または薬剤を指す。一部の実施形態において、本システムまたはキットは、本化合物（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の用量及び第２の活性薬剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）の用量を、対象のＧ６ＰＤ欠乏症と関連する疾患または疾病を治療するために有効な量で含む。
経時的な細胞の溶血の程度を減少させることによって赤血球貯蔵の保存を改善することによって、細胞試料、例えば、赤血球細胞のための保存剤として使用される保存で使用される保存製剤及びキットも提供する。一部の場合において、製剤は、細胞試料の貯蔵安定性をもたらす。保存製剤は、Ｇ６ＰＤ調節剤（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）（例えば、本化合物の１種または複数）を単独で、または１種または複数の追加の成分、例えば、細胞の安定化または貯蔵で使用される任意の便利な成分の存在下で含む組成物である。一部の場合において、保存製剤を採血管または細胞保存管と併せて使用する。一部の場合において、管は、試料収集または輸送を容易にするために排気に適切である。
本方法を実行するためのキット及びシステムは、１種または複数の医薬製剤を包含し得る。したがって、特定の実施形態において、キットは、１つまたは複数の単位投薬量として存在する単一の医薬組成物を含んでよく、その際、組成物は、１種または複数のヌクレオシド化合物（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）を含んでよい。一部の実施形態において、キットは、それぞれ異なる活性薬剤を含有し、そのうちの少なくとも１種がヌクレオシド化合物（例えば、本明細書に記載のとおりのもの）である２種以上の別々の医薬組成物を含んでよい。
例えば、上記のとおりの本方法で使用されるキット及びシステムも重要である。そのようなキット及びシステムは、本方法の１種または複数の成分、例えば、抗酸化剤、細胞、酵素基質、色素、緩衝剤などを含み得る。様々なキット成分は、容器、例えば、滅菌容器内に存在してよく、その際、成分は、同じか、または異なる容器内に存在し得る。
上述の成分に加えて、本キットは、例えば、本方法を実行するために、キットの成分を使用するための指示書をさらに含んでよい。指示書は一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示書は、基材、例えば紙またはプラスチックなどの上に印刷されていてよい。したがって、指示書は、キット内に添付文書として、キットまたはその成分（すなわち、包装またはサブ包装に付随して）の容器のラベルなどで存在してよい。他の実施形態において、指示書は、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、ポータブルフラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。また他の実施形態において、実際の指示書はキット内に存在しないが、離れた情報源、例えばインターネットを介してから指示書を得るための手段が提供されている。この実施形態の例は、指示書を見ることができる、及び／または指示書をそこからダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段も、適切な基材上に記録されている。
以下の例は、制限ではなく例示として提供されている。
実施例１
材料及び方法
細胞培養
正常対象に由来するリンパ球（ＨＧ００８６６）及びＧ６ＰＤにＣａｎｔｏｎ変異体を有するＧ６ＰＤ欠損対象に由来するリンパ球（ＨＧ０２３６７）をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入し、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞株を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ−１２ ５０／５０混合物中で培養した。Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ変異体を有するＧ６ＰＤ欠損対象由来神経芽細胞の細胞株及び対照としての正常線維芽細胞の細胞株をＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＧＭ０１１５２）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃ０１３５Ｃ）からそれぞれ購入し、１５％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充された最小必須培地中で培養した。細胞株の全てを、５％のＣＯ２及び９５％の空気の雰囲気を有する加湿インキュベーター内で３７℃で維持した。
プラスミド構築及び部位特異的変異誘発
野生型（ＷＴ型）Ｇ６ＰＤをコードする遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＮｄｅＩ及びＳａｌＩ制限部位を使用してｐＥＴ−２８ａベクターに挿入した。Ｇ６ＰＤ変異体を生成するための部位特異的変異誘発は、製造者のガイドライン（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従って適切なプライマーセットを使用して実施した。全ての構築物をシーケンスによって検証した。
タンパク質発現及び精製
Ｇ６ＰＤ及びその変異体はＥ．ｃｏｌｉＣ４３（ＤＥ３）で発現した。培養密度が０．５〜０．６のＯＤ６００に達したとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導した。培養物を３７℃でさらに４〜５時間増殖させ、次いで遠心分離によって採取した。５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．４ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｐ８３４０）を含有する緩衝液中で超音波処理によってペレットを溶解した。次いで、上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのイミダゾールを含有する１ベッドボリュームの平衡緩衝液で平衡化したＴＡＬＯＮ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂と共にインキュベートすることによってＧ６ＰＤを精製した。樹脂を、重力流カラム中で５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び２０ｍＭのイミダゾールを含有する５ベッドボリュームの洗浄緩衝液で洗浄し、５ｍｌのゲル濾過クロマトグラフィの平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。１００単位のウシトロンビンを樹脂に添加し、これを続いて穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。タグレスＧ６ＰＤを溶出し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇゲル濾過クロマトグラフィに適用した。Ｇ６ＰＤを含有する画分をプールし、１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して濃縮した。Ｇ６ＰＤの最終濃度をブラッドフォード法によって決定し、タンパク質を−８０℃で４０％グリセロール及び１ｍＭのＥＤＴＡ中で貯蔵した。
酵素アッセイ及び速度論的測定
酵素活性は、レサズリンを蛍光レゾルフィン（５６５ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光）に転化するジアホラーゼと結合したＮＡＤＰＨの生成の監視によって測定した；それ故、蛍光シグナルはＧ６ＰＤ活性に比例した。アッセイは、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、３．３ｍＭのＭｇＣｌ２、１Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ、０．１ｍＭのレサズリンを含有する緩衝液中で２５℃で実施し、５分間実行した。１０ｎｇの組換え酵素または１０μｇの細胞溶解物を、補因子として１０μＭのＮＡＤＰ＋（Ｓｉｇｍａ）及び基質として１００μＭのＧ６Ｐ（Ｓｉｇｍａ）を用いるアッセイに使用した。定常状態の速度論的パラメータは、一定濃度のＧ６Ｐ（１００μＭ）でＮＡＤＰ＋の濃度（０〜１０μＭ）を変化させることによって得られ、同様にＧ６Ｐ（０〜１００μＭ）の場合も１０ｎｇの組換え酵素で一定濃度のＮＡＤＰ＋（１０μＭ）で得られた。データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ．６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ＵＳＡ）を使用して実施した。速度論的パラメータは、データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ方程式に当てはめることによって得られた。
ハイスループットスクリーニングアッセイ
上述したジアホラーゼ結合酵素アッセイを使用して小分子活性化物質のための化合物のライブラリーをスクリーニングした。Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃピンツールと統合されたＴｗｉｓｔｅｒ ＩＩロボット及びＳｃｉｃｌｏｎｅ ＡＬＨ３０００（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ ＵＳＡ）を有するＣａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｔａｃｃａｔｏシステムを使用して、化合物を１６．６７μＭの最終濃度でＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素反応混合物に添加し、続いて３時間インキュベートした。次いでＧ６Ｐの添加により反応が開始し、これを２．５分間実行した。蛍光シグナルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＡｎａｌｙｓｔＧＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ ＵＳＡ）を使用して実行中に４回記録した。酵素の３０％の活性化を示す任意の化合物を用量依存的手法（０〜３０μＭ、二重）で再スクリーニングして潜在的命中を同定した。
熱安定性アッセイ
１０ｎｇの組換え酵素を２５〜６５℃の範囲の様々な温度で２０分間インキュベートし、活性を上述したように測定した。０と１００の間のデータを正規化した後、ボルツマンシグモイド方程式を使用して、酵素が元の活性の半分を保持する温度であるＴ１／２値を計算した。
インビトロタンパク質分解アッセイ
２００ｎｇの組換え酵素を１μＬの１０ｎｇ／μＬのキモトリプシンと共に室温で１時間インキュベートした。１００μＭの化合物をいくつかの反応条件に添加した。以下のタンパク質レベルをウェスタンブロットによって調べた。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ変異体の過剰発現
ＳＨ−ＳＨ５Ｙ細胞を使用する細胞ベースのアッセイの前に、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ変異体の過剰発現の持続時間を、１２ウェルプレートに播種した細胞をトランスフェクションすることによって調べた。ヒトＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ変異体をコードする遺伝子をまずＰＣＲ増幅し、次いでこれをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入した。０．５μｇのｃＤＮＡ及び１．５μｇのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地にそれぞれ希釈し、５分間インキュベートした。希釈したＤＮＡを希釈したリポフェクタミンと組み合わせ、続いて細胞に添加する前に２０分間インキュベートした。
トランスフェクションした細胞を種々の時点（最大７２時間）で収集し、過剰発現したＧ６ＰＤレベルをウェスタンブロットによって調べた。トランスフェクションは血清飢餓細胞で行った。発現の持続期間が確認されると、他の細胞ベースのアッセイを実施した。
シクロヘキシミドチェイスアッセイ
５０，０００細胞（ＳＨ−ＳＨ５Ｙ細胞または線維芽細胞）または１００，０００細胞（リンパ球）を１２ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。細胞を血清飢餓（５０〜７５％）に４８時間供し、種々の時点（０〜４８時間）で５０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドで処理した。細胞をシクロヘキシミドと共に化合物（１μＭ）で４８時間処理した。次いで細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル及び１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中に収集し、４℃で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１０μｇの総タンパク質をＳＤＳさらなるＰＡＧＥゲルに装填し、タンパク質レベルをウェスタンブロットによって調べた。
グルタチオン（ＧＳＨ）測定
総グルタチオンレベルは、製造者の指示に従って総グルタチオン定量キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用して測定した。アッセイは、グルタチオンと反応して黄色の生成物である５−メルカプト−２−ニトロ安息香酸を生成するＤＴＮＢ（５，５’−ジチオ−ビスさらなる（２−ニトロ安息香酸））を利用した。細胞を血清飢餓（５０〜７５％）に４８時間供して酸化ストレスを誘発し、測定前に化合物で２４時間処理した。吸光度を４１２ｎｍで読み取った。
細胞生存度アッセイ
細胞生存度は、製造者の指示に従って、ＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩を利用して、細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）を使用して測定した。細胞を、測定前の４８時間、血清飢餓に供した。ウェル当たり１００μＬの培地中の細胞を１０μＬのＣＣＫ−８溶液で処理し、３７℃で２時間インキュベートした。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。リンパ球の生存度は、緩衝等張塩溶液（ｐＨ７．２）中の０．４％トリパンブルー溶液で染色することによって測定した。生存度は、生存細胞（染料によって染色されていない）の数を血球計のグリッド内の総細胞数で除したものとして計算した。細胞を、測定の２４時間前に１μＭの化合物で処理した。
細胞性活性酸素種（ＲＯＳ）の測定
９６ウェルプレート内の細胞を、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）中の５μＭの最終濃度でクロロメチル−２’，７’さらなるジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１０，０００の希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で処理して核を染色し、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ中で洗浄し、蛍光を４８５／５２５ｎｍでの励起／発光で分析した。細胞を血清飢餓（５０〜７５％）に４８時間供して酸化ストレスを誘発し、測定前の２４時間化合物で処理した。シグナルを核染色に正規化した（３５０／４７０ｎｍでの励起／発光）。
ネイティブゲル電気泳動
２００ｎｇの組換え酵素を化合物（アッセイで変わる）と共に室温で１０分間インキュベートした。ネイティブＰＡＧＥゲルにおけるストリーキング及びアーチファクトを防止するために、ネイティブ状態（試料が沸騰せず、試料緩衝液中に還元剤が存在しない）の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動した。架橋アッセイを、０．１％のグルタルアルデヒド及び種々の濃度のＮＡＤＰ＋（０、１０、１００、１０００μＭ）またはＭｇＣｌ２（０、１、１０、１００ｍＭ）を有するＰＢＳ中で５００ｎｇの組換え酵素をインキュベートすることによって開始した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、続いて１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を最終濃度で添加して反応を停止させた。試料を上述したように電気泳動した。
Ｇ６ＰＤ ｓｉＲＮＡノックダウンアッセイ
内因性Ｇ６ＰＤを各細胞株において次のようにノックダウンさせた；２ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ Ｇ６ＰＤ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び０．５μｇのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中にそれぞれ希釈し、５分間インキュベートした。希釈したｓｉＲＮＡを、希釈したリポフェクタミンと組み合わせ、続いて９６ウェルプレートにおいて細胞への添加前に２０分間のさらなるインキュベートを行った。
ゼブラフィッシュの飼育
成体ゼブラフィッシュ（ＡＢ株；３〜１８ヶ月齢）を飼育し、胚を自然交配により得て、標準プロトコルに従って段階分けした。成体ｔｂｘ１６ｂ１０４／＋を得た。全ての動物処置は、ＮＩＨガイドラインに従って実施した。胚は、２８．５℃でＥ３培地中で成長させた。
ゼブラフィッシュクリスパント（ｃｒｉｓｐａｎｔ）
ｇ６ｐｄのエクソン１０に対するｓｇＲＮＡをＣＨＯＰＣＨＯＰを使用して設計し、標準プロトコルに従ってインビトロで転写した。遺伝子特異的オリゴ配列は：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号：／／）であった。ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９蛋白質（ＮＥＢ）を混合し、一細胞期胚に微量注入した。各注入クラッチについて、１０個の個々の胚をシーケンスのために２４ｈｐｆで単離してエクソン１０におけるＣＲＩＳＰＲ媒介インデルの導入を確認した。
ゼブラフィッシュ化合物処理
胚を受精後２４時間（ｈｐｆ）でプロナーゼで脱コリン化し、５０μｇ／ｍｌのクロロキン及び／またはＡＧ１を用いて化合物をウェルに直接添加することによって処理した。ＲＯＳ測定のために、胚を化合物と共に２時間インキュベートし、次いでＲＯＳ検出試薬（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）を５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でウェルに５時間の合計処理時間で添加した。１つの胚を黒色の不透明な９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。蛍光を４８５／５２５ｎｍでの励起／発光で分析した。ＲＯＳアッセイの後、約３２ｈｐｆで胚をプールし、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＮＰ−４０、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する緩衝液中で溶解し、続いて液体窒素中で凍結及び解凍のサイクルを３回行った。溶解物を１４，０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。上清（総溶解物）中の総タンパク質濃度をブラッドフォード法によって決定した。５０μｇの総溶解物を１０％のＳＤＳさらなるＰＡＧＥゲルに装填し、タンパク質レベルを抗Ｇ６ＰＤ抗体（Ａｂｃａｍ（Ｇ６ＰＤ：ＡＢ８７２３０））を使用してウェスタンブロットによって調べた。１０μｇの総溶解物を酵素アッセイに使用した。５０μｇの溶解物を使用して製造者の指示に従ってＮＡＤＰＨ定量キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用してＮＡＤＰＨレベルを測定した。
ゼブラフィッシュの撮像
生きた胚を麻酔し、３％メチルセルロースに封入した。１．０ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ対物レンズ及びＳＰＯＴ Ｆｌｅｘカメラが装着されたＬｅｉｃａ Ｍ２０５ＦＡ顕微鏡、またはＱＩｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ−ＳＲＶカメラが装着されたＬｅｉｃａ ＤＭ４５００Ｂ複合顕微鏡を用いて胚を撮像した。ヘモグロビン染色では、固定胚を先に報告されたように（１０）、ｏ−ジアニシジンで染色し、洗浄し、１００％のグリセロールに封入し、１．０ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ対物レンズ及びＳＰＯＴ Ｆｌｅｘカメラが装着されたＬｅｉｃａ Ｍ２０５ＦＡ顕微鏡で撮像した。全ての画像をＳＰＯＴまたはＭｅｔａＭｏｒｐｈ撮像ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．）を使用してキャプチャし、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ）で処理した。調整は、輝度レベル及びトリミングに限定した。分析は、実験条件を知らない観察者によって実行された。
血液試料アッセイ
匿名化血液試料をＳｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。試料をセルローススラリーを通して濾過して血小板及び白血球を除去することによって収集し、次いで生理食塩水で洗浄した。Ｇ６ＰＤ活性を測定した（Ｂｅｕｔｌｅｒ Ｅ．Ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ （３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｇｒｕｎｅ ＆ Ｓｔｒａｔｔｏｎ（１９８４））。この研究で使用された全ての試料の活性は、正常範囲（５〜９Ｕ／ｇＨｂ）にあり、対象がＷＴ Ｇ６ＰＤを有することを示唆している。５％の赤血球懸濁液を１〜５μΜのＡＧ１と４℃で一晩事前インキュベートし、続いて１ｍＭのクロロキン（ＣＱ）または１ｍＭのジアミドのいずれかを用いて（または用いずに）３７℃で３〜４時間処理した（クロロキンでの溶血アッセイの場合、混合物を光下でインキュベートした）。次いで１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。５４０ｎｍで吸光度を測定することによって上清中のヘモグロビン放出を監視した。生理食塩水を陰性対照（０％の溶血）として使用し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した試料を陽性対照（１００％の溶血）として使用した。ＲＯＳ測定のため、処理後に遠心分離によって赤血球混合物を生理食塩水で洗浄し、生理食塩水中に５μＭの最終濃度でクロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）と３７℃で１５分間インキュベートした。洗浄後、試料を０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（最終濃度）で溶解し、４８５／５２５ｎｍでの励起／発光で蛍光を分析した。ＧＳＨ測定は、Ｃａｙｍａｎグルタチオンアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、７０３００２）を使用して決定した。簡潔には、５０μｌの希釈した赤血球溶解物試料を、グルタチオン還元酵素、５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）及びＮＡＤＰＨを含むアッセイ試薬１５０μｌと混合し、室温で２５分間インキュベートした。吸光度を４１２ｎｍで読み取った。貯蔵アッセイのため、５％の赤血球懸濁液を１μＭのＡＧ１を用いてまたは用いずに４℃で貯蔵し、溶血及びＧ６ＰＤ活性を２８日間毎週監視してＡＧ１が経時的に赤血球の保存を改善するかどうかを調べた。２８０ｎｍで試料の上清の吸光度を測定することによってタンパク質漏出も調べた。試料をＡＧ１で毎週再処理した。
統計的分析
ほとんどのアッセイを少なくとも３つの独立した実験で繰り返した。インビトロ及び細胞データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として示される。
平均値間の統計的差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してスチューデントのｔ検定によって計算した。ヒト赤血球を用いたアッセイでは、各試料をそれ自体の対照として利用し、アッセイパラメータを処理の前後で比較した；それ故、無作為化は必要なかった。全てのゼブラフィッシュ実験について、別々の系統から３〜４匹の雄及び４〜５匹の雌をそれぞれ含有する少なくとも２つの繁殖タンクを設置して胚を発生させた。各タンクからの胚を、試験した条件にわたって無作為に分配した。条件ごとの試料サイズを決定するための統計的方法は使用されなかった。表現型分析では、各条件についての粗計数をカイ二乗分析または期待値に基づくフィッシャーの正確確率検定に使用した。全ての表現型分析について、スコアラーは処理条件を知らされていなかった。ＲＯＳアッセイについて、各分布の正規性を評価し、非正規と決定した。ダンの二次検定を伴うクラスカル−ウォリス検定を使用して全ての条件間の差を決定した。Ｐ値を多重比較試験用に修正した。Ｐ値及び胚の数は図の凡例内に示されており、Ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなされた。
実施例２
小分子活性化物質でのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１（Ｇ６ＰＤ）欠乏症の修正
単細胞生物から真核生物まで、ＡＴＰを生成するために酸素を使用すると、損傷を与える酸素フリーラジカル生成物が生じる。これらは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）などの細胞性抗酸化物質によって拮抗される。酸化性物質損傷に対する防御の細胞的第一線を提供するＧＳＨは、主にペントースリン酸経路及びその律速酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ；図１Ａ）を介して生成されるＮＡＤＰＨによって維持される。したがって、Ｇ６ＰＤ活性または安定性を損なうミスセンスＤＮＡ変異は、酸化ストレスの増大及び、最も一般的には溶血性貧血を特徴とし、集合的にＧ６ＰＤ欠乏症と呼ばれる一連の疾患表現型をもたらす（Ａ．Ｍｉｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （Ｇ６ＰＤ） ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄａｔａｂａｓｅ：ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ‘‘ｏｌｄ’’ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ，ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＆ ｄｉｓｅａｓｅｓ ４８，１５４−１６５ （２０１２））。Ｇ６ＰＤは全ての組織で発現する普遍的な酵素であるが、それは赤血球の完全性を保つのに特に不可欠であり、その理由は、それらはミトコンドリアを欠き、酸化ストレスに対して保護する抗酸化物質の他の供給源を有さないからである。Ｇ６ＰＤ欠乏症は、世界で推定４億人が罹患している。症状は、所定の食物、薬、または感染によって誘発される酸化ストレスによって誘発され得る。Ｇ６ＰＤ欠乏症は、特に新生児において、生命を脅かす場合があり、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸）に至り、死に至ることさえある。
Ｇ６ＰＤは、二量体または四量体として機能的に活性である（Ｐ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８，８−１５（１９６９））。各単量体は、触媒ＮＡＤＰ＋結合ドメイン及びβ＋αドメインを有し、酵素を構造的に安定化するＮＡＤＰ＋のための追加の結合部位を含有している（図１Ｂ）。Ｇ６Ｐ結合部位は、これらの２つのドメインの間に位置している（図１Ｂ）。重度または軽度の欠乏症を引き起こす変異体の大部分は、主に酵素のそれらの機能的領域に位置し、酵素の活性及び安定性を妨げる（Ａ．Ｄ．Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ａ．Ｃｏｌａｖｉｎ，Ｋ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｇ６ＰＤ Ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １８，２５９２−２５９９（２０１７））。
β＋αドメイン（図１Ｂ）に位置するＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）の生化学的メカニズムを理解するための努力を行った。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤは、中国及び東南アジアで流行しており［変異体の５０〜６０％（１５、１６）］、重度の欠乏症を引き起こす。組換えＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素は、ＮＡＤＰ＋及びＧ６Ｐの両方についてより低いＫＭで通常のＧ６ＰＤ活性（８８４μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１）の１８％（１６０μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１）しか示さなかった（図１Ｃ）。これは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を有する対象に由来する血液試料を使用して分析された生化学的特徴と一致している（Ｎ．Ｓａｈａ，Ｓ．Ｈ．Ｈｏｎｇ，Ｐ．Ｓ．Ｌｏｗ，Ｊ．Ｓ．Ｔａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ２６９ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｎ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ．Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ４５，２５３−２５７（１９９５））。０．１％のグルタルアルデヒドによって架橋した場合、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤは、野生型（ＷＴ）Ｇ６ＰＤと比べて、四量体形成を促進する補因子であるＮＡＤＰ＋またはＭｇＣｌ２の上昇した濃度の存在下で四量体を形成する能力の低下を示した。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのこの低下したオリゴマー化状態は、ＷＴ酵素と比べてその低下した酵素活性の一因となり得る。さらに、Ｃａｎｔｏｎ変異体は熱安定性がより低く；そのＴ１／２、すなわち、酵素がその触媒活性の半分を保持する温度は、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤでは正常ＷＴ酵素と比べて４．５度低かった（図１Ｄ）。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤはまた、ＷＴ酵素と比べてキモトリプシンによる分解を受けやすく、これは大幅に低下した酵素活性に対応していた（図１Ｅ）。これは、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤがより高いコンフォメーション変動を受け、低下した熱安定性及びプロテアーゼへのより高いアクセス性につながり得ることを示唆している。Ｃａｎｔｏｎ変異体はまた、Ｇ６ＰＤにＣａｎｔｏｎ変異体を有する対象に由来するリンパ球においてＷＴ Ｇ６ＰＤよりも安定性が低く；デノボタンパク質の生合成を阻害するシクロヘキシミド処理（５０μｇ／ｍｌ）の２４時間後、Ｃａｎｔｏｎ変異体タンパク質のレベルは、ＷＴ Ｇ６ＰＤよりも約３３％低かった（図１Ｆ）。Ｃａｎｔｏｎ変異体を有する細胞の溶解物におけるＧ６ＰＤ活性は、正常リンパ球におけるＧ６ＰＤ活性よりも約９０％低く（図１Ｇ）、これは低いレベルの総ＧＳＨ及び上昇したレベルの活性酸素種（ＲＯＳ）と一致していた（図１Ｈ及び図１Ｉ）。
その上、Ｃａｎｔｏｎ変異体８２を有するリンパ球の生存度は、酸化ストレスを誘発するために血清の非存在下で４８時間培養した場合、正常リンパ球と比べて約５０％低かった（図１Ｊ）。同じ結果が、ＷＴ Ｇ６ＰＤまたはＣａｎｔｏｎ変異体（Ｈｉｓタグ付き）を一時的に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞で観察された。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤタンパク質レベルは、シクロヘキシミド処理の２４時間以内に、ＷＴ Ｇ６ＰＤの２０％の減少と比較して、５０％低下した。Ｃａｎｔｏｎ変異体を発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はまた、溶解物におけるより低い酵素活性及びより低いレベルのＧＳＨを示し、ｓｉＲＮＡによるＧ６ＰＤのノックダウンが細胞生存度を抑制し、Ｇ６ＰＤ欠乏症を再現している。
次に、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの構造メカニズムを調査してその低下した代謝機能を理解し、そのために我々は、それぞれ１．９Å及び２．６Åの分解能でＷＴ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの結晶構造を調べた。ＷＴ Ｇ６ＰＤは、結晶の非対称単位に１つの分子を含有するＦ２２２空間群で結晶化された。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ結晶は、結晶の非対称単位に８分子のＧ６ＰＤタンパク質を有するＰ２１２１２１空間群に属していた。ＮＡＤＰ＋は、結晶化前にタンパク質溶液に添加されなかったが、両方の結晶構造は、第２のＮＡＤＰ＋結合部位（構造的ＮＡＤＰ＋結合部位）でＮＡＤＰ＋を含有していた（図６Ａ）。ＷＴ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの全体的コンフォメーションは、Ｃα原子の重ね合わせについて０．６Åの平均二乗偏差によって示されるように、非常に似ていた（図２Ａ）。しかしながら、Ｃａｎｔｏｎ 変異体（Ｒ４５９Ｌ）を含有するヘリックス（αｎ）と隣接するヘリックス（αｅ）との間に緩いらせん相互作用が認められ（図２Ｂ、左パネル）、これは先に報告された構造には記載されていなかった（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８，２９３−３０３ （２０００））。ＷＴ Ｇ６ＰＤでは、Ｒ４５９は、隣接するヘリックス（αｅ）上のＤ１８１及びＮ１８５と静電的及び水素結合相互作用を形成する一方で、Ｃａｎｔｏｎ変異は形成せず、ヘリックス（αｅ）の緩いらせん間相互作用及び変位ならびにヘリックス（αｅ）上のＲ４５９相互作用残基から数アミノ酸離れたＫ１７１、Ｐ１７２、Ｆ１７３、Ｇ１７４、及びＲ１７５からなる進展ループをもたらす（図２Ｂ、右パネル）。特に、Ｋ１７１及びＰ１７２は、それらの結合ポケットにおけるＧ６Ｐ及びＮＡＤＰ＋の位置決定に関与する重要な残基である。
それ故、Ｃａｎｔｏｎ変異体における緩いらせん間相互作用は、ループを位置決定し、それ故これらの残基の配向を変化させるための主要な推進力である可能性が高い。Ｃａｎｔｏｎ変異体構造の非対称単位中の８分子のうち７分子では、トランスコンフォメーションでＰ１７２が観察され、したがって、Ｋ１７１の側鎖は、触媒ＮＡＤＰ＋及びＧ６Ｐ結合ポケットから離れて配向していた（図２Ｂ、右パネル、図６Ｂ及び６Ｃ）。Ｋ１７１Ａ及びＰ１７２Ｇの変異は、触媒活性を完全に無効にし、触媒作用におけるこれらの残基の重要性を示した（図６Ｄ）。
αｎヘリックス上のＲ４５９とαｅヘリックス上のその相互作用残基との間のらせん間相互作用が酵素の活性及び安定性に不可欠であるかどうかを決定するために、相互作用残基をＷＴ Ｇ６ＰＤでアラニンに変異させ、これらの点変異タンパク質がＣａｎｔｏｎ変異体と生化学的に類似していることを見出し；それらは、ＮＡＤＰ＋及びＧ６Ｐの両方についてより低いＫＭならびにより低いＴ１／２値で正常活性の約２０％を示した（図２Ｃ）。これらの変異体はまた、ＷＴ Ｇ６ＰＤと比べて、キモトリプシンによるタンパク質分解消化を受けやすかった（図２Ｄを図１Ｅと比較されたい）。まとめると、これらのデータは、触媒活性及び安定性についてＲ４５９及びＤ１８１及びＮ１８５の間のらせん間相互作用の重要性を支持している。実際に、Ｐ１７２Ｓ（クラスＩ；＜１０％の酵素活性）、Ｆ１７３Ｌ（クラスＩＩ；＜１０％の酵素活性）、及びＤ１８１Ｖ（クラスＩＩＩ；１０〜６０％の酵素活性）などのこのらせん相互作用部位の周囲に位置するヒト変異は、中等度から重度のＧ６ＰＤ欠乏症を引き起こし、その理由はおそらく、それらが、我々の観察に基づけば、同様のコンフォメーションの変化を受けると予測されるからである。
これらの生化学的及び構造的研究は、Ｇ６ＰＤ変異体のＧ６ＰＤ活性を薬剤で回復（修正）することが、Ｇ６ＰＤ欠乏症を有する患者に関係する病状のリスクを低下させる治療的アプローチを提供し得ることを示している。この目的のために、Ｇ６ＰＤのアゴニスト（ＡＧ）のためのスクリーニングは、ハイスループットスクリーニングによって組換えＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ酵素を使用して実施した。２−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］エタンチオール（ＡＧ１、Ｍｒ＝２２０．３４）を含むいくつかのアゴニスト化合物が同定された。ＡＧ１は、Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの活性をＥＣ５０≒３μＭで最大１．７倍まで上昇させ、ＷＴ Ｇ６ＰＤは基礎活性に対して約２０％上昇させたことが確認された（図３Ａ及びＢ）。ＡＧ１は軽度の活性化物質であったが、それはＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの速度論的パラメータを変化させ、ＡＧ１がＮＡＤＰ＋及びＧ６Ｐの酵素への結合の改善を促進し得ることを示している（表５）。
ＡＧ１はまた、ネイティブゲル電気泳動によって決定されるように、活性二量体の形成を促進した（図３Ｃ）。単量体Ｇ６ＰＤの分子量の増加は、ＡＧ１によるいくらかの修飾または二量体状態への平衡シフトのいずれかによる可能性がある。ＡＧ１は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ３Ａ１（ＡＬＤＨ３Ａ１）を含むいくつかの他のＮＡＤまたはＮＡＤＰ＋依存性二量体または四量体酵素の二量体化または活性に影響を及ぼさなかった。１μＭのＡＧ１はＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存度を２０％上昇させた一方で、Ｇ６ＰＤがｓｉＲＮＡによってノックダウンされた場合には効果がなく、Ｇ６ＰＤに対するＡＧ１の選択性を支持している。ＡＧ１はまた、タンパク質分解に対するＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの感受性を低下させ；ＡＧ１の存在下では、タンパク質の５０％が残存したのに対し、その非存在下では２５％であった（図３Ｄ）。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの安定性は、リンパ球のＡＧ１処理によって改善され；シクロヘキシミド処理後の２４時間で、Ｃａｎｔｏｎタンパク質のレベルは、ビヒクル処理でのレベルと比べてＡＧ１処理（１μＭ）では４８％高かった（図３Ｆ）。Ｃａｎｔｏｎ変異体を有するリンパ球溶解物における酵素活性（正常活性の約１０％）は、ＡＧ１の存在下で７８％１５０増加した（図３Ｆ）。ＧＳＨのレベルは、ＡＧ１で２４時間処理した後わずかに上昇し、これは、Ｃａｎｔｏｎ変異体を有するリンパ球における低下したＲＯＳレベル及び改善した生存度と一致していた（図３Ｇ〜３Ｉ）。ＡＧ１処理はまた、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの安定性を上昇させた。Ｇ６ＰＤ活性及びこれらの細胞の生存度も軽度に上昇した。最後に、予測されたように、生成された変異を模倣するＣａｎｔｏｎ変異体（図２Ｃ及び２Ｄ）、Ｄ１８１Ａ及びＮ１８５Ａは、上昇した活性及びタンパク質分解安定性によって測定されるように、ＡＧ１によって同様に影響を受け、ＡＧ１が構造的欠陥を修正し得ることを示唆している。
Ｇ６ＰＤは協調的な折り畳みを示し、ＡＧ１はＧ６ＰＤの二量体化を増大させるため、酵素の安定化部位（複数可）へのＡＧ１の結合が、Ｃａｎｔｏｎ変異の周囲のらせん間相互作用部位の外側の他の点変異含有Ｇ６ＰＤ変異体を修正し得る可能性を調べた。軽度から重度の欠乏症を世界で引き起こす１６４の非重複領域で最も一般的な３つのヒト変異体であるＡ−（Ｖ６８Ｍ及びＮ１２６Ｄ）、Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ（Ｓ１８８Ｆ）、及びＫａｉｐｉｎｇ（Ｒ４６３Ｈ）Ｇ６ＰＤ（それぞれアフリカ、地中海及び東南アジア）に焦点を当てた。ＡＧ１は、これらの全ての変異体を最大で２倍活性化し、それらの二量体化を促進した（図３Ｊ及び３Ｋ）。ＡＧ１はまた、シクロヘキシミド処理でＧ６ＰＤにおけるＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ変異体を有する対象に由来する線維芽細胞におけるＧ６ＰＤを安定化した。Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ変異体を有するヒト線維芽細胞の溶解物は、対照ヒト線維芽細胞の２２％の活性しか有していなかったが、ＡＧ１はその活性を５０％上昇させた。Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ変異体を有する線維芽細胞はまた、対照対象の線維芽細胞と比べて、ストレス条件下での生存度が低かったが、ＡＧ１はそれらの生存度を２２％改善した。ＭｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎＧ６ＰＤ発現がｓｉＲＮＡによってノックダウンされた場合、生存度はさらに２３％低下し、ＡＧ１はそれを救済せず、Ｇ６ＰＤについてのＡＧ１の１７３の効果の選択性を示している。まとめると、これらのデータは、Ｇ６ＰＤの二量体化状態及び酵素活性を上昇させることによって、ＡＧ１がＣａｎｔｏｎ様変異だけでなく、ヒトにおける他の最も一般的なＧ６ＰＤ欠乏症のいくつかを治療する薬物のためのリード化合物を代表することを示唆している。
インビボでのＡＧ１の効果も調べた。酸化促進物質への曝露が心臓性浮腫及び活発な溶血を引き起こすモルホリノベースのＧ６ＰＤ欠乏ゼブラフィッシュモデルを使用した（Ｐａｔｒｉｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｌ．Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｃ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｔ．Ｃ．Ｌｕｎｄ，Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ４１，６９７−７１０ ｅ６９２（２０１３））。ゼブラフィッシュの胚を使用して、ＡＧ１がそれらの正常な発達に影響を与えるかどうかをまず決定した。受精後２４時間（ｈｐｆ）でＡＧ１で処理され、３２または４８ｈｐｆで表現型でスコア付けされた胚は、＜１０μＭのＡＧ１濃度で正常に発達し（図４Ａ）、ＡＧ１はゼブラフィッシュの胚の発達に対して毒性がないことを示している。Ｇ６ＰＤ欠損ヒトにおける発症の一般的な誘発物である抗マラリア薬であるクロロキンを、ゼブラフィッシュの胚において酸化的課題を誘発するために使用し、２４ｈｐｆでのクロロキン（５０μｇ／ｍｌ）処理が心膜性浮腫及び上昇したＲＯＳをもたらすことを見出した（図４Ａ及び４Ｂ）。上昇したＲＯＳが循環赤血球の減少をもたらすかどうかを決定するために胚を染色したが、ヘモグロビン染色はクロロキン処理で有意に変化しなかった。ＡＧ１は、ＲＯＳレベルを低下させ、心膜性浮腫を示す胚の減少をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。プールされたＡＧ１処理胚の溶解物において、Ｇ６ＰＤ活性のわずかな上昇及びＮＡＤＰＨレベルの大幅な上昇も観察された（図４Ｃ）。予想されたように、ｔｂｘ１６変異体における中胚葉欠陥に起因する心膜性浮腫はＡＧ１処理によって修正されなかったので、心膜性浮腫の減弱はＧ６ＰＤ欠乏症に特異的であった。
インビボでＡＧ１の特異性を確認するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して機能喪失Ｆ０胚（クリスパント）を生成した。ｇ６ｐｄのクリスパント胚は、より低いＧ６ＰＤレベル、５１％高いレベルのＲＯＳ、６７％低いレベルのＧ６ＰＤ活性及び１９６ ５８％低いＮＡＤＰＨレベル、ならびに増大した心膜性浮腫を有していた（図４Ｄ〜４Ｆ）。１μＭのＡＧ１での処理は、ｇ６ｐｄのクリスパントにおけるこれらのパラメータに有意な影響を及ぼさなかった（図４Ｄ〜４Ｆ）。低減したヘモグロビン染色を示すクリスパント胚の数がわずかに増加したことも留意されたい。
ヒトでは、溶血（赤血球溶解）の防止におけるＧ６ＰＤの役割に加えて、Ｇ６ＰＤの抗酸化特性は、腎障害、心不全及び白内障を含む様々な他の病状の発症に関連し得、Ｇ６ＰＤ欠乏症が複数のヒトの病理に対する過小評価された危険因子であり得ることを示唆している。ＡＧ１は、いくつかの一般的なＧ６ＰＤ変異体の低下した活性を上昇させたので、この研究は、ＡＧ１などの単一の薬剤がいくつかの主要なＧ６ＰＤ酵素病に対する治療を提供し得ることを示唆している。そのような薬剤はまた、Ｇ６ＰＤ欠乏症の後遺症を予防または軽減するのに及び／または核黄疸のための照明などの他の緩和治療との相乗効果を与えるのに役立ち得る。Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する他の多くの病状は、そのような治療によって同様に影響を受け得る。ＡＧでの治療はまた、抗マラリア薬（プリマキン及びクロロキン）のような溶血発症誘発薬の使用が依然として一般的である開発途上国におけるＧ６ＰＤ欠乏集団に有益であり得る。ＡＧ１様薬物は、酸化ストレスの増大に関連する他の疾患を有するＷＴ Ｇ６ＰＤを有する対象に有用となる。ヒトの研究は、少なくとも溶血発症によって反映されるように、Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する臨床病状が、正常（ＷＴ）変異体と比べて＜６０％の活性を有する変異体を有する対象で生じることを実証している（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＷＨＯ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ６７，６０１−６１１（１９８９））。そのため、最適なＡＧ化合物が改善されて、Ｇ６ＰＤ欠損対象における触媒活性が正常の少なくとも６０％に上昇し得る。対象化合物は、Ｇ６ＰＤ欠乏対象を治療する用途を見出し得る。
実施例３
ＡＧ１はヒト赤血球の溶血を低減する
次に、ＡＧ１が赤血球を酸化ストレスから保護するかどうかを決定した。７人の健康な対象のヒト赤血球を使用した予備研究は、赤血球懸濁液（５％）が１ｍＭのクロロキン（ＣＱ）またはジアミド（ＧＳＨ酸化性物質）のいずれかに曝露された場合、ＡＧ１（５μＭ）が溶血の程度を低減することが示し、ＡＧ１の抗溶血潜在性を示唆している（図５Ａ）。これを支持して、ＡＧ１は、これらの薬物誘発酸化ストレス下でＧ６ＰＤ活性を上昇させると共に、ＧＳＨレベルを上昇させ、ＲＯＳレベルを低減した（図５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ）。酸化ストレスは、ヘモグロビンの初期酸化を通じて赤血球膜の完全性を損ない、ハインツ小体の沈殿及びバンド３（主要な赤血球膜タンパク質）のクラスター化につながる；それ故、バンド３のクラスター化は、赤血球除去の不可欠な分子マーカーとして機能する（Ｓｈｉｍｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂａｎｄ ３ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １１，ｅ１００４２１０（２０１５））。９〜１１種の個々の全血試料から単離された赤血球を使用して、バンド３タンパク質がクロロキン（ＣＱ）またはジアミドのいずれかの処理で凝集し、これはＡＧ１処理によって軽減されたことが確認され（図５Ｅ）、ＡＧ１が赤血球膜の安定化に寄与することを示唆している。赤血球輸血は一般的に臨床治療に使用されるが、貯蔵中の赤血球の構造的及び機能的変化は、集合的に保存損傷と称され、輸血の実施における懸念事項のままである。ＲＯＳの経時的な増加及び酸化的バイオマーカーの蓄積によって証明されるように、従来の条件下での貯蔵は、赤血球にとって酸化的ストレスとみなされる。それ故、２８日間にわたって溶血の程度を監視することによってＡＧ１が冷蔵貯蔵中の保存を改善し得るかどうかを決定した。ＡＧ１（１μＭ）は、２８日目において平均で１２％経時的に溶血を低減する（図５Ｆ）。したがって、処理された赤血球からのタンパク質漏出が同様に減少し（図５Ｇ）、これはＧ６ＰＤ活性の上昇に対応していた（図５Ｈ）。これらのデータは、ＡＧ１様化合物が赤血球の長期貯蔵のための新規保存剤として機能し得、Ｇ６ＰＤ欠損患者だけでなく、より広範な集団に影響を与え得ることを示唆している。
実施例４
Ｇ６ＰＤタンパク質結晶化
ＷＴ Ｇ６ＰＤの結晶を２０％ｗ／ｖのＰＥＧ３３５０、０．２Ｍのギ酸カリウム（ｐＨ７．３）を含有するシッティングドロップ中で成長させた。スラミン（Ｇ６ＰＤ阻害剤）を結晶化の前にタンパク質溶液に添加した（ドロップ中の最終濃度は０．５ｍＭであった）。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤを２０％ｗ／ｖのＰＥＧ３３５０、０．２Ｍの三塩基性クエン酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を含有するシッティングドロップ中で結晶化させた。３０％のＤＭＳＯ中に溶解したＡＧ１化合物を結晶化の前にタンパク質に添加してドロップ中で０．５ｍＭの最終濃度に到達させた。スラミンまたはＡＧ１化合物のいずれも、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの電子密度マップでは不可視であった；しかしながら、それらは結晶の回折の質を著しく改善した。ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤのＸ線回折データを、それぞれ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）のビームライン１２−２及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）のビームライン５．０．２において１００Ｋで収集した。２０％グリセロールの溶液を凍結保護剤として使用した。ＷＴ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤの結晶はそれぞれ１．９Å及び２．６Åの分解能に回折した。データは、ｉＭＯＳＦＬＭを使用して処理し、ＰＯＩＮＴＬＥＳＳによるデータのさらなる分析は、ＷＴ Ｇ６ＰＤ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ結晶についてそれぞれＦ２２２及びＰ２１２１２１の空間群を示した。ＷＴ Ｇ６ＰＤ構造は、ＭＯＬＲＥＰで探索モデルとして使用されるＰＤＢ：２ＢＨＬからの単量体Ｇ６ＰＤ構造との分子置換を使用して解明された。Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ構造は、この研究で既に解決されたＷＴ Ｇ６ＰＤ構造を使用して解明された。分子モデルをＣｏｏｔでさらに構築し、ＲＥＦＭＡＣ５を使用して洗練した。原子座標及び構造因子は、ＰＤＢデータベースにおいて、ＷＴ Ｇ６ＰＤについてはアクセッションコードＰＤＢ：５ＶＦＬ及びＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤについてはＰＤＢ：５ＶＧ５で寄託されている。全ての構造図はＰｙＭＯＬで作成した。
化合物設計
Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）では、Ｘ線結晶構造解析によって構造摂動が同定され、これは、酵素の活性部位領域に伝播し、触媒効率を低下させる。この酵素を使用して、活性化物質（シャペロン）のための１００，０００種以上の分子についてスクリーニングすることで、酵素を少なくとも１．７倍活性化し、細胞内での酵素の安定性を大幅に上昇させた潜在的分子（以降ＡＧ１と称する）が同定された。ＡＧ１は、他の一般的なＧ６ＰＤ変異酵素も同様に活性化し、それがＧ６ＰＤ欠乏症の一般的な治療であり得ることを示唆している。さらに、ＡＧ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＧ６ＰＤ欠乏症を再現するゼブラフィッシュにおける酸化ストレス誘発表現型を軽減した。本明細書に記載の研究は、単一の薬剤がいくつかのＧ６ＰＤ変異体の機能の十分な増大を提供して関連する臨床的問題を軽減し得ることを示唆している。
図７Ａは、Ｇ６ＰＤ二量体界面及びＧ６ＰＤ調節化合物の提案された結合部位に焦点を当てたＧ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の拡大図を示している。補因子ＮＡＤＰ＋（構造的ＮＡＤＰ＋とも称される）は黒い棒で示されている。
構造的ＮＡＤＰ＋結合部位の近くの二量体界面は、対象化合物（例えば、化合物１、図７Ｂ）を補完する残基の配列を有する。第一に、トリプトファン５０９は、ＮＡＤＰｆピリジニウムイオンとパイ・スタッキングしており、アスパラギン酸４２１から５オングストロームだけ離れている。化合物は、カチオン性窒素から６オングストローム離れたインドール基を含有する。これらの基は、２つの４２１残基を８オングストロームの距離で配置するＧ６ＰＤの二量体界面について反映されている。この距離は、リガンドのリンカー部分の７オングストロームの距離に近い（図８）。
図９Ａは、Ｇ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体（Ｒ４５９Ｌ）のＸ線結晶構造の空間充填描写の反対の面の２つの図を示している。残基は、二量体界面の両側で変異していた。上のパネルは、化合物結合部位に位置する様々な変異（赤、青）を示している。上のパネルは、Ｇ６ＰＤ酵素の反対の面での様々な変異（緑、黄及びシアン）の位置を示している。
図９Ｂは、例示的化合物ＡＲ３−０６９のＧ６ＰＤ活性に対するＧ６ＰＤのＣａｎｔｏｎ変異体の様々な点変異の影響を示すグラフを示している。グラフの色付きのバーは、図３Ａの構造に図示されている変異に対応している。推定される結合部位でのみ、残基は、対象化合物の結合に影響を及ぼし、その一方でＡＣ５０（ＥＣ５０も）に対する影響はなかった。
例示的化合物ＡＧ１及びＧ６ＰＤの共結晶構造は、本明細書に記載の分析を確認する本明細書に記載の方法を使用して得られた。ＷＴ Ｇ６ＰＤと複合したＡＧ１の結晶構造は、変異誘発実験及びドッキングを通して発展した仮説と一致する結合様式を明らかにしている。Ｘ線構造では、リガンドは２つの構造的ＮＡＤＰ＋分子間の二量体界面に位置する。ＡＧ１のインドールは、リガンドのないＸ線構造のＷ５０９と同様の様式で構造的ＮＡＤＰ＋ピリジニウムイオンとのパイ・スタッキング相互作用を提供する。カチオン性アミノ基は、およそ８オングストロームの平均距離で分離されたいずれかの単量体上のＤ４２１／Ｅ４１９に近接している。２つのカチオン性アミンをこれらのアニオン性残基に近接して配置するリンカーは、両方の単量体の構造的ＮＡＤＰ＋へのパイ・スタッキングを依然として可能にしつつ、二量体Ｇ６ＰＤの安定化及び活性化を提供する。ＡＧ１の結合構造は、このクラスの化合物で観察されたＳＡＲとよく一致している。
化合物活性
化合物ＡＧ１の予備結果に基づいて、対象となる様々な化合物を調製し、本明細書に記載の方法に従ってＧ６ＰＤ酵素活性化アッセイで評価した。
上述の発明を、理解を明確にするために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、上記例示及び実施例に対して特定の変更及び修正を行い得ることは、本発明の教示に照らして容易に明らかである。
添付の特許請求の範囲にもかかわらず、本明細書に示した開示は、以下の条項によっても記述される。
第１項 式（Ｉ）：
Ｚ１−Ｙ−Ｚ２
（Ｉ）
（式中、 Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、飽和炭素環、置換飽和炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、任意選択で、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、アミノ基を含むアミノ含有置換基で置換されており、Ｙは、任意選択で、リンカーを介して分離された２つのアミノ基を含む中央の連結単位である）Ｇ６ＰＤ調節剤であって、約４〜１５オングストローム離れて構成された少なくとも２つのアミノ基を含む上記Ｇ６ＰＤ調節剤、またはその塩。
第２項 式（Ｉａ）：
Ｚ１−Ｔ１−Ｙ−Ｔ２−Ｚ２
（Ｉａ）
（式中、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、Ｙは中央の連結単位であり、２つのアミノ基を含む）のＧ６ＰＤ調節剤である、第１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第３項 式（ＩＩａ）：
Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）ｘ Ｐ＋−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋−Ｔ２−Ｚ２
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、Ｌ１は中央のリンカーであり、ｘ及びｙは独立に１もしくは２であり、但しｘが１の場合、ｐは０であり、ｘが２の場合、ｐは１であり、ｙが１の場合、ｑは０あり、ｙが２の場合、ｑは１である）のＧ６ＰＤ調節剤である、第１項または第２項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第４項 式：
Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）−Ｔ２−Ｚ２
のＧ６ＰＤ調節剤である、第３項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５項 Ｒ１及びＲ２がそれぞれＨである、第４項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６項 Ｌ１が、長さが２〜２０原子である骨格を有するリンカーである、第３項〜第５項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第７項 式：
式（Ｉｂ）：
Ｎ（Ｒ１）ｘ Ｐ＋−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋
（Ｉｂ）
（式中、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、Ｌ２は中央のリンカーであり、ｘ及びｙは独立に２または３であり、但し、ｘが２の場合、ｐは０であり、ｘが３の場合、ｐは１であり、ｙが２の場合、ｑは０あり、ｙが３の場合、ｑは１である）のＧ６ＰＤ調節剤である、第１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第８項 式：
Ｎ（Ｒ１）２−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）２
のＧ６ＰＤ調節剤である、第７項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第９項 Ｒ１及びＲ２がそれぞれＨである、第８項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１０項 Ｌ２が、長さが２〜１２原子である骨格を有するリンカーである、第７項〜第９項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１１項 式（ＩＩｂ）：
Ｚ１−Ｔ１−（ＮＨｅｔＮ）−Ｔ２−Ｚ２
（ＩＩｂ）
（式中、
−（ＮＨｅｔＮ）−は、１〜４の環を有し、Ｔ１に結合した第１の第三級アミノ基及びＴ２に結合した第２の第三級アミノ基を含む２価の複素環式連結環系である）
のＧ６ＰＤ調節剤である、第１項または第２項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１２項 −（ＮＨｅｔＮ）−が、以下の構造：
第１３項 Ｌ１が式：
−Ｌ１１−Ｚ３−Ｌ１２−
（式中、Ｌ１１及びＬ１２は独立に、アルキル、置換アルキル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、Ｚ３は、共有結合、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、二環式炭素環、キュバン、アルケニル、アレニル、アルキニル、及び切断可能な基から選択される）のＬ１である、第６項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。

第１４項 Ｌ１が、
第１５項 Ｌが−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは２〜１２である）である、第６項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１６項 Ｌ２が、４，４’−ビフェニル、エチニレン−１，４−フェニレンエチニレン、及び１，４−フェニレンエチニレン−１，４−フェニレンから選択される、第１０項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１７項 Ｔ１及びＴ２が独立に低級アルキルまたは置換低級アルキルである、第２項〜第１６項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１８項 Ｚ１及びＺ２が同一である、第１項〜第１７項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第１９項 Ｚ１及びＺ２が異なる、第１項〜第１７項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２０項 Ｚ１及びＺ２が独立に、インドール、置換インドール、ベンゾフラン、置換ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、置換ベンゾチオフェン、フェニル、置換フェニル、キノリン、置換キノリン、１，３−ベンゾジオキソール、置換１，３−ベンゾジオキソール、チオフェン、置換チオフェン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、置換２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、ピリジル、及び置換ピリジルから選択される、第１項〜第１９項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２１項 Ｚ１及びＺ２が独立に、以下：
４−ピリジル、置換４−ピリジル、３−ピリジル、置換３−ピリジル、３−ピリジル、置換３−ピリジル、２−チオフェニル、置換２−チオフェニル、
（式中、Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、ｓは０〜４であり、それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルである）の１種から選択される、第１項〜第２０項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２１項 Ｚ１及びＺ２が独立に、以下：
（式中、Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、ｓは０〜４（例えば、０、１、または２）であり、それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモ、またはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルであり、いくつかのＺ１及びＺ２の場合、ｘは２であり、ｐは０である）から選択される、第７項〜第１０項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２２項 Ｔ１が低級アルキルまたは置換低級アルキルである、第２０項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２３項 薬剤が表１〜４の１つの化合物である、第１項〜第２２項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第２４項 第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤を含む赤血球保存組成物。
第２５項 第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
第２６項 第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤と薬学的に許容される賦形剤とを含む、Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾患または疾病の治療に使用するための医薬組成物。
第２７項 試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の調節方法であって、
Ｇ６ＰＤを含む試料を第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤と接触させて、上記試料中の上記Ｇ６ＰＤの活性を調節することを含む上記方法。
第２８項 上記Ｇ６ＰＤが変異体Ｇ６ＰＤである、第２７項に記載の方法。
第２９項 上記変異体Ｇ６ＰＤがＣａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ変異体、第２８項に記載の方法。
第３０項 上記Ｃａｎｔｏｎ Ｇ６ＰＤ変異体がＣａｎｔｏｎ単一変異体（Ｒ４５９Ｌ）である、第２９項に記載の方法。
第３１項 上記試料中の上記Ｇ６ＰＤの活性のレベルを評価することを更に含む、第２７項〜第３０項のいずれか１項に記載の方法。
第３２項 上記調節剤が上記Ｇ６ＰＤを構造的に安定化して、上記Ｇ６ＰＤの触媒活性を向上させる、第２７項〜第３１項のいずれか１項に記載の方法。
第３３項 上記調節剤が上記Ｇ６ＰＤを１１０％以上のレベルに活性化する、第２７項〜第３２項のいずれか１項に記載の方法。
第３４項 上記試料が細胞試料である、第２７項〜第３３項のいずれか１項に記載の方法。
第３５項 上記胞試料が赤血球細胞を含み、上記調節剤が溶血を低減する、第３４項に記載の方法。
第３６項 上記調節剤が細胞中のグルタチオンのレベルを維持するもしくは増加させる、第３４項または第３５項に記載の方法。
第３７項 上記調節剤が赤血球細胞の試料の貯蔵安定性を高める、第３５項に記載の方法。
第３８項 上記試料がインビトロである、第２７項〜第３７項のいずれか１項に記載の方法。
第３９項 上記試料がインビボである、第２７項〜第３６項のいずれか１項に記載の方法。
第４０項 対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病の治療方法であって、
上記方法を必要とする対象に、有効量の第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異体Ｇ６ＰＤを活性化し、上記対象の上記Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療することを含む上記方法。
第４１項 上記対象がクラスＩ〜ＩＩＩのＧ６ＰＤ欠乏症を有する、第４０項に記載の方法。
第４２項 上記疾病が、酸化ストレスに関連する疾病、慢性非球状赤血球溶血性貧血、間欠的溶血エピソード、神経学的疾病、浮腫、腎臓損傷、及び白内障から選択される、第４０項〜第４１項のいずれか１項に記載の方法。
第４３項 上記疾病が、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸））から選択される、第４０項〜第４２項のいずれか１項に記載の方法。
第４４項 上記対象が、Ｇ６ＰＤ欠乏症の個体において溶血を誘発する薬物による治療を受けている、第４０項〜第４３項のいずれか１項に記載の方法。
第４５項 Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療または予防するための薬剤の製造のための、第２５項に記載の医薬組成物の使用。
第４６項 Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療または予防するための薬剤の製造のための、第１項〜第２３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤の使用。
第４７項 上記疾病がＧ６ＰＤのクラスＩ〜ＩＩＩ欠乏症に関連する、第４５項〜第４６項のいずれか１項に記載の使用。
第４８項 上記疾病が、酸化ストレスに関連する疾病、慢性非球状赤血球溶血性貧血、間欠的溶血エピソード、神経学的疾病、浮腫、腎臓損傷、及び白内障から選択される、第４５項〜第４７項のいずれか１項に記載の使用。
第４９項 上記疾病が、ビリルビン誘導性神経損傷及びビリルビン脳症（核黄疸））から選択される、第４５項〜第４８項のいずれか１項に記載の方法。
第５１項 式：
Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）ｘ ｐ＋−Ｌ−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋−Ｔ２−Ｚ２
（式中、Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、飽和炭素環、置換飽和炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合または連結鎖であり、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、Ｌは中央のリンカーであり、ｘ及びｙは独立に１または２であり、但しｘが１の場合、ｐは０であり、ｘが２の場合、ｐは１であり、ｙが１の場合、ｑは０あり、ｙが２の場合、ｑは１である）のＧ６ＰＤ調節剤。
第５２項 ｘ及びｙがそれぞれ１である、第５１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５３項 ｘ及びｙがそれぞれ２である、第５１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５４項 Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立にＨである、第５１項〜第５３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５５項 Ｌが、長さが２〜２０原子である骨格を有するリンカーである、第５１項〜第５４項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５６項 Ｌが、式：
−Ｌ１−Ｚ３−Ｌ２−
（式中、Ｌ１及びＬ２は独立に、アルキル、置換アルキル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、Ｚ３は、共有結合、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、二環式炭素環、キュバン、アルケニル、アレニル、アルキニル、及び切断可能な基から選択される）のＬである、第５５項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５７項 Ｌが、
から選択される、第５６項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５８項 Ｌが−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは２〜１２である）である、第５６項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第５９項 Ｚ１及びＺ２が同一である、第５１項〜第５８項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６０項 Ｚ１及びＺ２が異なる、第５１項〜第５８項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６１項 Ｚ１及びＺ２が独立に、インドール、置換インドール、ベンゾフラン、置換ベンゾフラン、フェニル、置換フェニル、キノリン、置換キノリン、１，３−ベンゾジオキソール、及び置換１，３−ベンゾジオキソールから選択される、第５１項〜第６０項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６２項 Ｚ１及びＺ２が独立に、
から選択される、第５１項〜第６１項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６３項 Ｔ１及びＴ２がそれぞれ独立に低級アルキルまたは置換低級アルキルである、第５１項〜第６２項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６４項 Ｚ１−Ｔ１−及びＺ２−Ｔ２−がそれぞれ独立に、
から選択される、第５１項〜第６３項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
第６５項 試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の調節方法であって、Ｇ６ＰＤを含む試料をＧ６ＰＤ調節剤と接触させて、上記Ｇ６ＰＤを活性化する及び／または上記Ｇ６ＰＤを安定化することを含む上記方法。
第６６項 上記Ｇ６ＰＤ調節剤が二量体であり、ジアミノを含有するリンカーを介して結合する２つの炭素環基または複素環式基を含む、第６５項に記載の方法。
第６７項 上記Ｇ６ＰＤ調節剤が第５１項〜第６４項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤である、第６６項に記載の方法。
第６８項 対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病の治療方法であって、上記方法を必要とする対象に、有効量のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異体Ｇ６ＰＤを活性化し、上記対象の上記Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療することを含む上記方法。
第６９項 上記Ｇ６ＰＤ調節剤が第５１項〜第６４項のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤である、第６８項に記載の方法。
したがって、上記は、単に本発明の原理を例示しているに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に説明または示されてはいないが、本発明の原理を具体化し、本発明の趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を考案できることが理解されよう。更に、本明細書に挙げられる全ての例及び条件付き言語は、主に読者が本発明の原理及び本発明者らが本技術を進めることに貢献する概念を理解するのを助けることを意図し、かかる具体的に挙げられる例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにそれらの特定の例を挙げる本明細書の全ての記述は、それらの構造的及び機能的均等物の両方を包含することを意図している。また、かかる均等物には、現在公知の均等物と、将来開発される均等物、すなわち、構造に関係なく同一の機能を実行する開発される要素の両方が含まれることが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され説明される例示的な実施形態に限定されることを意図せず、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

Claims (20)

  1. 式（Ｉ）：
    Ｚ１−Ｙ−Ｚ２
    （Ｉ）
    （式中、
    Ｚ１及びＺ２は独立に、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、炭素環、置換炭素環、複素環、及び置換複素環から選択され、任意選択で、Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立に、アミノ基を含むアミノ含有置換基で置換されており、
    Ｙは、任意選択で、リンカーを介して分離された２つのアミノ基を含む中央の連結単位である）
    のＧ６ＰＤ調節剤であって、
    約４〜１５オングストローム離れて構成された少なくとも２つのアミノ基を含む前記Ｇ６ＰＤ調節剤、
    またはその塩。
  2. 式（Ｉａ）：
    Ｚ１−Ｔ１−Ｙ−Ｔ２−Ｚ２
    （Ｉａ）
    （式中、
    Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、
    Ｙは中央の連結単位であり、２つのアミノ基を含む）
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項１に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  3. 式（ＩＩａ）：
    Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）ｘ Ｐ＋−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋−Ｔ２−Ｚ２
    （式中、
    Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、
    Ｌ１は中央のリンカーであり、
    ｘ及びｙは独立に１もしくは２であり、但し
    ｘが１の場合、ｐは０であり、
    ｘが２の場合、ｐは１であり、
    ｙが１の場合、ｑは０あり、
    ｙが２の場合ｑは１である）
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項１または２に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  4. 式：
    Ｚ１−Ｔ１−Ｎ（Ｒ１）−Ｌ１−Ｎ（Ｒ２）−Ｔ２−Ｚ２
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項３に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  5. 式（Ｉｂ）：
    Ｎ（Ｒ１）ｘ Ｐ＋−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）ｙ ｑ＋
    （Ｉｂ）
    （式中、
    Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立に共有結合またはリンカーであり、
    Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、
    Ｌ２は中央のリンカーであり、
    ｘ及びｙは独立に２または３であり、但し、
    ｘが２の場合、ｐは０であり、
    ｘが３の場合、ｐは１であり、
    ｙが２の場合、ｑは０あり、
    ｙが３の場合、ｑは１である）
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項１に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  6. 式：
    Ｎ（Ｒ１）２−Ｔ１−Ｚ１−Ｌ２−Ｚ２−Ｔ２−Ｎ（Ｒ２）２
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項５に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  7. 式（ＩＩｂ）：
    Ｚ１−Ｔ１−（ＮＨｅｔＮ）−Ｔ２−Ｚ２
    （ＩＩｂ）
    （式中、
    −（ＮＨｅｔＮ）−は、１〜４の環を有し、Ｔ１に結合した第１の第三級アミノ基及びＴ２に結合した第２の第三級アミノ基を含む２価の複素環式連結環系である）
    のＧ６ＰＤ調節剤である、請求項１または２に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  8. −（ＮＨｅｔＮ）−が、以下の構造：
    の１種から選択される、請求項７に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  9. Ｌ１が式：
    −Ｌ１１−Ｚ３−Ｌ１２−
    （式中、
    Ｌ１１及びＬ１２は独立に、アルキル、置換アルキル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分であり、
    Ｚ３は、共有結合、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、二環式炭素環、キュバン、アルケニル、アレニル、アルキニル、及び切断可能な基から選択される）
    のＬ１である、請求項６に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  10. Ｌ１が−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは２〜１２である）である、請求項３または４に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  11. Ｌ２が、４，４’−ビフェニル、エチニレン−１，４−フェニレンエチニレン、及び１，４−フェニレンエチニレン−１，４−フェニレンから選択される、請求項５または６に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  12. Ｚ１及びＺ２が独立に、インドール、置換インドール、ベンゾフラン、置換ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、置換ベンゾチオフェン、フェニル、置換フェニル、キノリン、置換キノリン、１，３−ベンゾジオキソール、置換１，３−ベンゾジオキソール、チオフェン、置換チオフェン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、置換２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、ピリジル、及び置換ピリジルから選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  13. Ｚ１及びＺ２が独立に、以下：
    ４−ピリジル、置換４−ピリジル、３−ピリジル、置換３−ピリジル、３−ピリジル、置換３−ピリジル、２−チオフェニル、置換２−チオフェニル、
    （式中、
    Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、
    ｓは０〜４であり、
    それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、
    Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルである）
    の１種から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  14. Ｚ１及びＺ２が独立に、以下：
    （式中、
    Ｚ１１はＯ、Ｓ、またはＮＲであり、但し、Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキルであり、
    ｓは０〜４（例えば、０、１、または２）であり、
    それぞれのＲ２１は独立に、アルキル、置換アルキル、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモ、またはフルオロ）、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、シアノ、ニトロ、ホルミル（−ＣＨＯ）、スルホン酸、カルボン酸、スルホンアミド、またはカルボキシアミドであり、
    Ｒ１１は、水素、アルキル、または置換アルキルであり、
    いくつかのＺ１及びＺ２の場合、ｘは２であり、ｐは０である）
    から選択される、請求項５〜６のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤を含む赤血球保存組成物。
  16. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
  17. 試料中のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の調節方法であって、
    Ｇ６ＰＤを含む試料を請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤と接触させて、前記試料中の前記Ｇ６ＰＤの活性を調節することを含む、前記方法。
  18. 前記調節剤が赤血球細胞の試料の貯蔵安定性を高める、請求項１７に記載の方法。
  19. 対象のＧ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病の治療方法であって、
    前記方法を必要とする対象に、有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＧ６ＰＤ調節剤を投与して、変異体Ｇ６ＰＤを活性化し、前記対象の前記Ｇ６ＰＤ欠乏症に関連する疾病を治療することを含む前記方法。
  20. 前記対象が、Ｇ６ＰＤ欠乏症の個体において溶血を誘発する薬物による治療を受けている、請求項１９記載の方法。
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