JP2020517657A - アルブミン融合タンパク質の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)溶液中のアルブミン融合タンパク質を発現するステップ、および
(ii)カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むカラムに前述の融合タンパク質溶液をロードする工程と、(ii)増加するCa2+濃度のグラジエントによりカラムから融合タンパク質を溶出するステップを含む。
本明細書におけるアルブミン融合タンパク質は、アルブミンタンパク質、および場合によりリンカーによって分離された少なくとも一つの異なるタイプのタンパク質またはペプチドを元々コードした二つ以上のDNA配列のインフレーム結合を通して作製されるタンパク質である。融合タンパク質DNA配列の翻訳は、元のタンパク質またはペプチドの各々から誘導された機能的特性を有しうる単一のタンパク質配列をもたらす。得られた融合タンパク質DNA配列は、標準宿主生物における異種融合タンパク質発現を支持する適切な発現ベクターに挿入されてもよい。
イオン交換クロマトグラフィーは、イオンおよび極性分子をイオン交換器への親和性に基づいて溶液中で分離するクロマトグラフィープロセスである。水溶性の荷電分子は、不溶性の固定相への非共有結合を形成することによって、反対の荷電部分に結合する。カラム内の平衡化された固定相は、カラムを通して溶液を通過する間に分離される標的分子が結合できるイオン化可能な官能基を含む。
本発明の方法は、アルブミン融合タンパク質溶液からの黄色不純物および宿主細胞タンパク質(HCP)などの不純物の含有量を低減することにおいて効率的である。
ロードの前処理:タンパク質溶液を、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後に、約pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
ロードの前処理:タンパク質溶液を、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後に、約pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
ロードの前処理:タンパク質溶液を、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後に、約pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
上述の通り実施された方法は、目視評価において黄色と同様の減少をもたらした。
ロードの前処理:タンパク質溶液を、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後に、約pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
アニオン交換カラム(GiGacap Q 650M)から部分的に精製された明確な黄色の試料42mlを、30Kの分子量カットオフでAmicon Ultraフィルター上で、約5倍、9mlに濃縮した。試料を500mM NaCl、20mM トリス、15mM HCl(pH7.7)を含むバッファ中に溶解した。透過物は無色であり、一方で保持物は濃度に応じてより色を増した。11mM酢酸を用いてpH4.5に調節後、実験を繰り返した。また、この条件では、黄色の色の除去は観察されなかった。
ロードの前処理:タンパク質溶液を、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後に、約pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
Claims (13)
- アルブミン融合タンパク質水溶液を精製する方法であって、前記方法が、(i)カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むカラムに前記融合タンパク質溶液をロードするステップと、(ii)カチオン含有グラジエントで溶出バッファを使用して前記カラムから前記融合タンパク質を溶出するステップと、を含む、方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質がMIC−1ヒト血清アルブミン融合タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 前記カチオン含有グラジエントがNa+、Mg2+ NH4 +、K+またはCa2+含有グラジエントである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記カチオン含有グラジエントがCa2+含有グラジエントである、請求項3に記載の方法。
- 前記溶出バッファが4.0〜5.0のpHを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出バッファが4.2のpHを有する、請求項5に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質が、20Mm 酢酸、11mM NaOHおよび500mM CaCl2を含むpH4.2の溶出バッファグラジエントを用いて前記カチオン交換カラムから溶出され、pH4.2で前記溶出バッファ中の前記CaCl2の含有量を徐々に500mMに増加させる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質溶液のアニオン交換精製ステップが、請求項1〜7のいずれか一項に記載の精製方法を実施する前に実施される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルブミン融合タンパク質が、エタノールおよびCa2+を含む洗浄後、pH7.7のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中にアニオン交換カラムから溶出される、請求項8に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の精製方法の後、pH4.6の20mM 酢酸、10mM NaOH、および100mM NaClを含むバッファを用いて、前記カラムを洗浄するステップが行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、470nm〜280nmの吸光度比で測定して、黄色不純物の含有量を少なくとも3分の1に減少させる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、ELISAで測定して、HCP不純物の含有量を少なくとも3分の1に減少させる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質溶液を精製する方法を含む、アルブミン融合タンパク質の製造方法。
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