JP2020514704A - レンズレス撮像によるサンプル内の粒子の計数方法 - Google Patents
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Abstract
Description
当該方法は、
a)前記サンプルに向かって伝播する入射光波を発する光源を用いて、前記サンプルを照明するステップと、
b)当該照明の影響下で、暴露波として知られている光波に曝される画像センサを用いて、前記光源と前記画像センサの間に配置された前記サンプルの画像であって、検出面に形成され、前記光波を表す画像を取得するステップと、を含む。
c)ステップb)中に取得した前記画像に基づいて、伝播演算子を適用して、前記検出面の反対側に延びる再構成面に沿って、前記暴露波の複素式を計算するステップと、
d)前記再構成面に沿った前記複素式の絶対値又は位相の分布を表す再構成画像として知られる画像を形成するステップと、
e)互いに離間し、全て又は一部が少なくとも1つの対象粒子に関連付けられた関心領域を含むセグメンテーション画像を取得するために、ステップd)中に形成された前記画像のセグメンテーションを行うステップと、
f)関心領域のサイズを決定すると共に、
当該関心領域に単一の対象粒子が含まれるクラスと、当該関心領域に1より大きい整数の対象粒子が含まれるクラスとの少なくとも1つによるサイズの関数として当該関心領域を分類するステップと、
g)ステップf)中に分類された対象粒子を計数するステップと、を含んでもよい。
各関心領域の少なくとも1つの形態学的基準を決定し、
前記形態学的基準の関数として関心領域(ROI)を選択し、
選択された関心領域を分類してもよい。
fi)所定の対象粒子の数に対応する第1の基準サイズの関数として実行される関心領域を分類するサブステップ(第1の分類)と、
fii)前記第1の分類の後、サブステップfi)中に分類された関心領域に基づいて、事前に定義された数の対象粒子を含むとして、第2の基準サイズを決定するサブステップと、
fiii)サブステップfii)で決定された第2の基準サイズ(Sref−2)の関数として実行される、関心領域を分類するサブステップ(第2の分類)と、を含んでもよい。
いくつかの関心領域の信号ノイズ比を計算し、
例えば閾値との比較に基づいて、各関心領域に対して計算された前記信号ノイズ比の関数としての関心領域を選択し、
選択された関心領域を分類してもよい。
ci)前記画像センサによって取得された前記画像に基づいて、前記検出面内の前記サンプルの初期画像を定義するサブステップと、
cii)サブステップci)中に定義された前記サンプルの初期画像、又は前の反復の結果である前記検出面での前記サンプルの画像に対し、伝播演算子を適用することにより、再構成面における前記サンプルの複素画像を決定するサブステップと、
ciii)サブステップcii)で決定された前記複素画像に基づいて、当該複素画像に影響する再構成ノイズに依存するノイズ指標を計算するサブステップと、
civ)前記画像のピクセルの位相値に従って、サブステップciii)中に計算された前記指標の変化の関数として、前記位相値を調整することによって、前記検出面における前記サンプルの画像を更新するサブステップと、
cv)前記検出面及び前記再構成面における前記サンプルの複素画像を取得するために、収束基準に達するまでサブステップcii)〜civ)を繰り返すサブステップと、を含んでもよい。
一実施形態によれば、ステップd)中において、
前記対象粒子は赤血球又は白血球であり、前記再構成画像は、前記再構成面に沿った複素式の絶対値の分布を表しているか、
前記対象粒子は血小板であり、前記再構成画像は、前記再構成面に沿った複素式の位相の分布を表している。
当該装置は、
サンプルに向かって伝搬する入射光波を放射できる光源と、
サンプルを光源と画像センサとの間に保持するように設計された支持体と、
画像センサによって取得されたサンプルの画像を受け取り、本願に記載の方法のステップc)〜g)を実行するように設計されたプロセッサと、を含む。
・サンプルの各粒子による入射光波12の回折から生じる成分13。
・サンプルによる入射光波12の透過から生じるコンポーネント12’。
このステップ中、サンプルは光源11によって照らされる。
この画像はホログラムを形成する。図1A又は1Bに示すように、レンズレス構成の興味深い特徴の1つは、広い観察野であり、大量のサンプルを同時に処理できる。観察野はセンサのサイズに依存するが、センサとサンプルとの間隔を設けるため、センサの検出面よりわずかに小さくなる。観察野は一般に10mm2さらには20mm2より大きい。
複素画像は、画像センサ16が曝される暴露波14の位相と振幅に関する情報を運ぶ。再構成面は、サンプルの拡張面P10である。ステップ120は、取得された画像I0から生じる画像に前述の伝播演算子hを適用することにより実行され得る。ただし、取得した画像に伝播演算子を適用すると、多くの場合、ツイン画像として知られる実質的な再構成ノイズを含む複素画像Azが生成され得る。再構成ノイズを制限して、使用可能な複素画像を取得するために、反復アルゴリズムを実行できる。これらのアルゴリズムの1つを、図4A及び4Bを参照して以下に説明する。
ステップ120中に形成された画像は、粒子に対応する関心領域ROIを分離するためにセグメンテーションにかけられる。画像のセグメンテーションとは、例えば強度の関数として、ピクセルを再グループ化するための画像の分割を意味する。画像セグメンテーションの結果、セグメンテーション画像Iz *が生成される。この画像では、互いに離間した関心領域ROIが区切られる。各関心領域は、以下に説明するように、粒子又は粒子のクラスターに対応する。セグメント化の異なる方法は、当業者に知られている。例えば、画像のヒストグラムから強度閾値の値を決定することからなる大津閾値処理を適用できる。この閾値は、2つのクラス(関心領域を表すピクセルのクラスと画像の背景を表すピクセルのクラス)に従ってピクセルの最適な分離を可能にする。図2Cは、大津アルゴリズムに従って閾値処理を適用することにより、図2Bの画像を分割した結果を示している。得られた画像は2値化され、画像の背景を表すピクセルは暗く(最小グレーレベル)、各関心領域ROIを表すピクセルは明るい(最大グレーレベル)。
このステップ中、前のステップでモルフォロジーに応じて、つまり面積、形状、サイズなどの形態学的基準に応じて決定された関心領域の選択が行われる。これにより、計数したい対象粒子に対応する関心領域を選択できる。
例えば、図2Dに関連して、
・関心領域のサイズが基準サイズSrefの0.5〜1.5倍の場合、ROI1と付された関心領域のように、関心領域はシングルレットに対応する単一の対象粒子を表す。図2Dでは、シングレットは白い点で表されている。
・関心領域のサイズが基準サイズSrefの1.5〜2.5倍の場合、関心領域は2つの対象粒子を表すと見なされる。図2Dでは、ダブレットに対応するこのような関心領域ROI2は、白い楕円形の輪郭で表されている。
・関心領域のサイズが基準サイズSrefの2.5〜3.5倍の場合、関心領域は3つの粒子を表すと見なされる。図2Dでは、このような関心領域ROI3は白い枠で表されている。
・ステップ141:対象粒子を表す直径範囲(赤血球の場合は3〜12μmなど)、及び形状基準に従って、各関心領域ROIをフィルタリングする。
・ステップ142:このフィルタリングから生じる関心領域の平均サイズを計算する。この平均サイズは第1の基準サイズSref−1を構成する。
・ステップ143:整数n個の粒子を各関心領域ROInに割り当てるために、第1の基準サイズSref−1に基づいてセグメンテーション画像の各関心領域ROIを分類する。
・ステップ144:シングレットとみなされる各関心領域ROI1の信号ノイズ比を計算する。
・ステップ145:閾値よりも大きい十分な信号ノイズ比を有するシングレットの平均サイズROI1を計算する。閾値はおそらく1.5に等しく、この平均サイズは第2の基準サイズSref−2を構成する。
・ステップ146:ステップ145から得られた第2の基準サイズSref−2に基づいて、セグメンテーション画像の各関心領域ROIを分類する。
・ステップ147:分類中に決定された多数の粒子nを各関心領域ROIに割り当てる。
このステップ中、ステップ140中に選択された関心領域、すなわち粒子の代表であると考えられる領域を、それらの各々におそらく割り当てられた多くの粒子を考慮して計数する。
・αkは整数で、「ステップ」として示され、距離を表す。
・pkは次元(Npix,1)の方向ベクトルで、各項p(x,y)は指標εkの勾配∇εkの方向を形成する。
・∇εkは次元(Npix,1)の勾配ベクトルで、その各項は問題の未知数(すなわちベクトルφ0 kの項)の自由度のそれぞれの関数として指標εkの変化を表す。
・pk−1は、前の反復中に確立された方向ベクトルである。
・βkは、方向ベクトルpk−1に適用されるスケール係数である。
・サンプル10:厚さ100μmのCountess(登録商標)流体チャンバに含まれる希釈血液であって、検査された容量は3mm3、又は3μlである。
・光源11:発光ダイオードCree MC-E Color、スペクトル帯域Δλが、450〜465nm、520〜535nm、630〜640nmでそれぞれ発光する3つの発光ダイオードで構成される。この例では、各照明中に単一のダイオードがアクティブになる。また、図1Bに示される実施形態によれば、405nmの波長で放射するレーザーダイオードが使用された。
・画像センサ:CMOS IDS μEyeモノクロセンサ、3840×2748ピクセル、各ピクセルのサイズは1辺1.67μm、検出面は約30mm2
・光源11とサンプル10の間の距離D:光源11が発光ダイオードの場合は8cm、光源がレーザーダイオードの場合は15cm
・サンプル10と画像センサ16間の距離d:1500μm
・流体室15の厚さe:100μm
・光源11が発光ダイオードである場合の空間フィルター18の開口の直径:150μm
・球状化試薬で1/600に希釈。
・10μlの希釈血液のサンプルを採取し、画像センサの反対側に配置された流体チャンバに注入する。
・450〜465nmのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・520〜535nmのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・630〜640nmのスペクトル帯域で発光する発光ダイオード
・レーザーダイオード
・y=1.017x−0.04(r2=0.98)
・y=1.019x−0.07(r2=0.98)
・y=1.017x−0.07(r2=0.98)
・y=1.027x−0.11(r2=0.98)
・ばらつき指標δ(dp)が所定の最大ばらつき指標δmaxを超える場合、デジタルフォーカシングは無効になる。この場合、集束距離は、以前に分析されたk個のサンプルの記憶された集束距離dkに基づいて確立された平均集束距離dmeanに等しいと考えられる。例えば、平均集束距離dmeanは、最後に分析されたk個のサンプルを考慮した移動平均によって計算され得る。kは、例えば2〜100の間の整数である。dmeanは、最後に分析されたk個の各サンプルの集束距離dkの中央値でもよい。
・ばらつき指標δ(dp)が最大ばらつき指標δmaxより小さい場合、集束距離は、各ゾーンでそれぞれ取得された集束距離dpの平均dp −(又は中央値)と見なされる。
次に、
・総面積Aが定義済みの最大面積Amaxを超える場合、ステップ110で取得した画像は無効になる。
・総面積Aが最大面積Amaxより小さいが近い場合、セグメンテーション画像Iz *の信号ノイズ比SNR(Iz *)に基づいて、補助基準Q’を計算する。最大面積に近いということは、Amaxは、最大面積と最大面積の80%又は90%などの最大面積Amaxの割合との間を意味する。
したがって、
・セグメンテーションステップ130の終了時の関心領域の数。
・選択ステップ140の終了時の関心領域の数。
・そのサイズを超えると拒否される関心領域の最大サイズSmaxを考慮する。
・拒否された関心領域の数を決定する。
・対象粒子の計数が有効化又は無効化される関数として、許容レベルLmaxを考慮し、拒否された関心領域の数と許容レベルとを比較する。
Claims (20)
- サンプル(10)内に配置された対象粒子(10a)の計数方法であって、
a)前記サンプル(10)に向かって伝播する入射光波(12)を発する光源(11)を用いて、前記サンプル(10)を照明するステップと、
b)当該照明の影響下で、暴露波として知られている光波(14)に曝される画像センサ(16)を用いて、前記光源(11)と前記画像センサ(16)の間に配置された前記サンプル(10)の画像であって、検出面(P0)に形成され、前記光波(14)を表す画像(I0)を取得するステップと、を含み、
さらに、
c)ステップb)中に取得した前記画像(I0)に基づいて、伝播演算子(h)を適用して、前記検出面(P0)の反対側に延びる再構成面(Pz)に沿って、前記暴露波(14)の複素式(Az)を計算するステップと、
d)前記再構成面に沿った前記複素式の絶対値又は位相の分布を表す再構成画像として知られる画像(Iz、Mz、φz)を形成するステップと、
e)互いに離間し、全て又は一部が少なくとも1つの対象粒子に関連付けられた関心領域(ROI)を含むセグメンテーション画像(Iz *)を取得するために、ステップd)中に形成された前記画像のセグメンテーションを行うステップと、
f)関心領域のサイズを決定すると共に、
当該関心領域に単一の対象粒子が含まれるクラスと、当該関心領域に1より大きい整数の対象粒子が含まれるクラスとの少なくとも1つによるサイズの関数として当該関心領域を分類するステップと、
g)ステップf)中に分類された前記関心領域に基づいて対象粒子を計数するステップと、を含むことを特徴とする、
方法。 - ステップf)において、分類の前に、
各関心領域の少なくとも1つの形態学的基準を決定し、
前記形態学的基準の関数として関心領域(ROI)を選択し、
選択された関心領域を分類する、
請求項1に記載の方法。 - 少なくとも1つの形態学的基準が、各関心領域の直径、サイズ、又は形状因子の中から選択される、
請求項2に記載の方法。 - ステップf)が、所定数の対象粒子を表す基準サイズ(Sref)を考慮することを含み、前記基準サイズの関数として分類する、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - ステップf)は、
fi)所定の対象粒子の数に対応する第1の基準サイズ(Sref−1)の関数として実行される関心領域を分類するサブステップ(第1の分類)と、
fii)前記第1の分類の後、サブステップfi)中に分類された関心領域に基づいて、事前に定義された数の対象粒子を含むとして、第2の基準サイズ(Sref−2)を決定するサブステップと、
fiii)サブステップfii)で決定された第2の基準サイズ(Sref−2)の関数として実行される、関心領域を分類するサブステップ(第2の分類)と、を含む、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - ステップf)において、分類の前に、
いくつかの関心領域(ROI)の信号ノイズ比(S/N)を計算し、
各関心領域に対して計算された前記信号ノイズ比(S/N)の関数としての関心領域(ROI)を選択し、
選択された関心領域を分類する、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 対象粒子(10a)の形状を修正して球形にするために、ステップb)の前にサンプルを球状化試薬と混合する、
請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - ステップc)は、
ci)前記画像センサによって取得された前記画像(I0)に基づいて、前記検出面内の前記サンプルの初期画像(A0 k=0)を定義するサブステップと、
cii)サブステップci)中に定義された前記サンプルの初期画像(A0 k=1)、又は前の反復(k−1)の結果である前記検出面での前記サンプルの画像(A0 k−1)に対し、伝播演算子を適用することにより、再構成面(Pz)における前記サンプルの複素画像(Az k)を決定するサブステップと、
ciii)サブステップcii)で決定された前記複素画像(Az k)に基づいて、当該複素画像(Az k)に影響する再構成ノイズに依存するノイズ指標(εk)を計算するサブステップと、
civ)前記画像のピクセルの位相値(φ0 k(x,y))に従って、サブステップciii)中に計算された前記指標の変化の関数として、前記位相値を調整することによって、前記検出面(P0)における前記サンプルの画像(A0 k)を更新するサブステップと、
cv)前記検出面(P0)及び前記再構成面(Pz)における前記サンプル(10)の複素画像を取得するために、収束基準に達するまでサブステップcii)〜civ)を繰り返すサブステップと、を含む、
請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - 前記サンプル(10)と前記画像センサ(16)との間に画像形成光学素子が配置されていない、
請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 対象粒子が血球である、
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。 - ステップd)中において、
前記対象粒子(10a)は赤血球又は白血球であり、前記再構成画像は、前記再構成面(Pz)に沿った複素式(Az)の絶対値の分布を表しているか、
前記対象粒子(10a)は血小板であり、前記再構成画像は、前記再構成面(Pz)に沿った複素式(Az)の位相の分布を表している、
請求項10に記載の方法。 - ステップc)が、前記再構成面(Pz)が延びる再構成の距離に対応する集束距離を決定するために、デジタルフォーカシングアルゴリズムを適用することを含む、
請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - ステップc)中に、ステップb)中に取得された画像が、互いに異なるゾーンに分割され、デジタルフォーカシングアルゴリズムが各ゾーンに適用され、それぞれのために集束距離(dp)を取得し、
さらに、ステップc)において、
最大ばらつき指標(δmax)を考慮に入れ、
得られた集束距離(dp)のばらつきを表すばらつき指標(δ(dp))を計算し、
計算されたばらつき指標(δ(dp))と前記最大ばらつき指標(δmax)とを比較し、
比較の関数として、
各ゾーンで得られた集束距離(dp)の平均又は中央値(dp −)を計算し、ステップc)中に使用される前記集束距離を形成するか、
又は、ステップc)中に使用される前記集束距離(dmean)を確立するために、記憶された集束距離を考慮する、
請求項12に記載の方法。 - 前記ばらつき指標(δ(dp))は、最大集束距離(dp−max)と最小集束距離(dp−min)との差、又は得られた集束距離(dp)の分散又は標準偏差である、
請求項13に記載の方法。 - ステップc)中に、ステップb)中に取得された画像が、互いに異なるゾーンに分割され、デジタルフォーカシングアルゴリズムが各ゾーンに適用され、それぞれのために集束距離(dp)を取得し、
さらに、ステップc)において、
フォーカシング下限(dinf)を考慮に入れ、
フォーカシング上限(dsup)を考慮に入れ、
各集束距離(dp)と前記フォーカシング下限(dinf)及び前記フォーカシング上限(dsup)とを比較し、
比較の関数として、
前記集束距離が前記フォーカシング下限(dinf)と前記フォーカシング上限(dsup)との間にある場合、各ゾーンで得られた集束距離(dp)の平均又は中央値(dp −)を計算し、ステップc)で使用される集束距離を形成し、
前記集束距離(dp)が前記フォーカシング下限(dinf)以下又は前記フォーカシング上限(dsup)以上の場合、ステップc)中に使用される前記集束距離(dmean)を確立するために、記憶された集束距離を考慮する、
請求項12に記載の方法。 - ステップe)において、
前記再構成画像の最大ピクセル数の強度に対応する前記再構成画像(Iz,Mz,φz)のヒストグラムのモードを決定し、
再構成画像のセグメンテーションが行われるセグメンテーション閾値を取得するために、大津閾値処理を実行し、
前記セグメンテーション閾値が前記ヒストグラムのモードの90%を超える場合、セグメンテーション閾値は前記ヒストグラムのモードの80〜85%のパーセンテージに設定されるように、前記ヒストグラムのモードとセグメンテーション閾値とを比較する、
請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。 - ステップe)において、
所定の最大面積(Amax)を考慮に入れ、
前記セグメンテーション画像(Iz *)の全ての関心領域(ROI)の面積(A)を決定し、
全ての関心領域の面積(A)と最大面積(Amax)とを比較し、
前記セグメンテーション画像(Iz *)の比較、拒否又は検証の関数として、
前記セグメンテーション画像(Iz *)の品質(Q)の基準の決定する、
請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。 - 前記セグメンテーション画像(Iz *)が有効化され、関心領域の面積(A)が最大面積(Amax)の近くに位置する場合、
所定の最小信号ノイズ比(SNRmin)を考慮し、
前記関心領域(ROI)における平均強度又は中央値強度(IROI)と前記関心領域外における前記セグメンテーション画像のノイズレベル(Nout)との比の形式で、前記セグメンテーション画像(Iz *)の信号ノイズ比(SNR(Iz *))を計算し、
前記セグメンテーション画像の前記信号ノイズ比(SNR(Iz *))と前記最小信号ノイズ比(SNRmin)とを比較し、
前記セグメンテーション画像(Iz *)の比較、拒否又は検証の関数として、
品質の補助的な基準(Q’)を決定する、
請求項17に記載の方法。 - ステップf)中に、サイズが所定の最大サイズ(Smax)を超える関心領域が拒否され、
ステップf)中に拒否された関心領域の数を決定し、
所定の許容レベル(Lmax)を考慮に入れ、
ステップf)中に拒否された関心領域の数と、ステップg)で実行された対象粒子の計数が有効化又は無効化される関数としての許容レベル(Lmax)とを比較する、
請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - サンプル(10)内に配置された対象粒子(10a)を計数するための装置であって、
サンプル(10)に向かって伝搬する入射光波(12)を放射できる光源(11)と、
サンプル(10)を光源(11)と画像センサ(16)との間に保持するように設計された支持体(10s)と、
画像センサ(16)によって取得されたサンプルの画像を受け取り、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法のステップc)〜g)を実行するように設計されたプロセッサ(20)と、を含む、
装置。
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