JP2020513024A - リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物 - Google Patents

リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2020513024A
JP2020513024A JP2019555188A JP2019555188A JP2020513024A JP 2020513024 A JP2020513024 A JP 2020513024A JP 2019555188 A JP2019555188 A JP 2019555188A JP 2019555188 A JP2019555188 A JP 2019555188A JP 2020513024 A JP2020513024 A JP 2020513024A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cancer
mas
inhibitor
cells
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2019555188A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7016883B2 (ja
Inventor
スヨル キム
スヨル キム
Original Assignee
ナショナル キャンサー センター
ナショナル キャンサー センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63792756&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2020513024(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ナショナル キャンサー センター, ナショナル キャンサー センター filed Critical ナショナル キャンサー センター
Publication of JP2020513024A publication Critical patent/JP2020513024A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7016883B2 publication Critical patent/JP7016883B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/11—Aldehydes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/194—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having two or more carboxyl groups, e.g. succinic, maleic or phthalic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/336—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having three-membered rings, e.g. oxirane, fumagillin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を癌治療剤として使用する技術に関し、より具体的には、ＭＡＳ抑制剤であるフェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）およびフタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、または前記ＭＡＳおよび抗癌剤の混合物を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。【選択図】図３ａ

Description

本出願は、２０１７年０４月１４日に出願された韓国特許出願第１０−２０１７−００４８５５８号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を癌治療剤として使用する技術に関し、より具体的には、ＭＡＳ抑制剤、または前記ＭＡＳおよび抗癌剤の混合物を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
癌とは、個体の必要に応じて規則的でかつ節制した増殖と抑制をすることができる正常細胞とは異なって、組織内で必要な状態を無視し、無制限に増殖する未分化細胞から構成された細胞塊であって、腫瘍とも言う。このような無制限に増殖する癌細胞は、周囲の組織に浸潤し、さらに深刻な場合は、身体の他の器官に転移を起こして、深刻な苦痛を伴い、結局には、死を招く難病である。
癌は、血液癌と固形癌に大きく分類され、すい臓癌、乳癌、口腔癌、肝癌、子宮癌、食道癌、皮膚癌など身体のほぼすべての部位で発生し、これらの治療方法として、最近、グリベックまたはハーセプチンのような少数の標的治療剤が特定癌の治療に利用されているが、現在までは、手術や放射線療法および細胞増殖を抑制する化学療法剤を利用した抗癌剤治療が主な方法である。しかしながら、標的治療剤でないので、従来化学療法剤の最も大きな問題は、細胞毒性による副作用と薬剤耐性であって、抗癌剤による初期の成功した反応にもかかわらず、結局は、治療が失敗することになる主な要因である。したがって、このような化学療法剤の限界を克服するためには、抗癌作用の機序が明確な標的治療剤の開発が持続的に必要である。
正常細胞と癌細胞においてＡＴＰを合成する経路は異なっている。正常細胞では、ブドウ糖が吸収されると、糖化作用により分解した糖が、ミトコンドリアの内部でＴＣＡサイクルを通じてＮＡＤＨを生産し、これを利用してミトコンドリア膜電位でＡＴＰを生産して細胞がこれを使用することができる。これに対し、癌細胞では、糖化作用を起こさないため、ＬＤＨにより乳酸が生産されて細胞の外部に排出され、その代わりに、ＡＬＤＨが過発現して、ＡＴＰの生産に関与することになる。したがって、癌細胞だけを死滅しようとする場合、ＡＬＤＨの発現または活性を抑制して、細胞内でＡＴＰの欠乏を誘導し、これに伴い、細胞の増殖が遮断されることによって、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することをターゲットとする薬物が開発されている。
このような細胞内経路を使用した抗癌化合物としてゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）およびフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）が知られている（韓国特許登録第１０−１５７９３７１号公報、韓国特許登録第１０−１４５８０６号公報）。
ゴシポールは、粗綿実油（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐ．）から誘導される天然的に存在する二重ビフェノール性化合物である。生体内でＡｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ）の抑制剤として知られていて、これを利用した治療用途について研究されている。男性避妊剤としてのゴシポールの人体実験は、これら化合物の長期間投与の安全性を示すものと報告されたことがある。
フェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）は、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）のようなビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系の薬物であって、糖尿病治療剤として知られている。しかしながら、フェンホルミンのようなビグアニド系薬物が、炭水化物代謝と脂質代謝を生理的に調節する核心酵素であるＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）を活性化させて、ｐ５３遺伝子が欠如した癌の治療に効果的なものであることが知られ始めることによって、フェンホルミン薬物の抗癌効果に関する研究が進行され、フェンホルミンは、ミトコンドリアの膜電位を減少させてＮＡＤＨがＡＴＰに転換される経路を遮断することを通じてＡＴＰ欠乏を誘導して抗癌効果を示すことが立証された。
一方、ミトコンドリア内膜の外部から内部に物質の移動通路として関与する構造体をリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（Ｍａｌａｔｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）という。ＭＡＳは、ミトコンドリア内膜に発現した通路タンパク質ＭＡＴおよびＧＡＴを通じてリンゴ酸とアスパラギン酸の移動に関与し、この際、ＮＡＤＨの移動を助ける役割をする。ＭＡＳは、多様な腫瘍細胞で発生することが公知となっているが、公知の内容によれば、腫瘍細胞株でミトコンドリアのＮＡＤＨ酸化−還元にＭＡＳが関与することができて、癌細胞の細胞質では、糖化過程を通したＮＡＤＨ酸化が減少し、ＭＡＳを通したミトコンドリア内ＮＡＤＨ酸化が現れることが公知となっている（Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ，Ｗａｌｔｅｒ ＶＶ，ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６．４（１９７６）：１３９２−１３９６）。
したがって、本発明者らは、ＭＡＳを遮断してミトコンドリアの内部にＮＡＤＨが流入することを遮断する場合、ゴシポールまたはフェンホルミンの処理を通した癌細胞内ＡＴＰ欠乏現象でより顕著な効果を誘導できるものと期待し、ＭＡＳ抑制剤をゴシポールまたはフェンホルミンと併用処理して肺癌および黒色腫細胞株で細胞死滅が増加することを確認して、本発明を完成した。
これより、本発明者らは、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を投与したとき、細胞内ＡＴＰ生産を抑制し、細胞増殖を抑制する効果を示すことができることを確認した。また、ＭＡＳ抑制剤をゴシポールまたはフェンホルミンと混合処理したとき、癌細胞増殖抑制および死滅誘導効果においてシナジー効果を示すことができることを確認することによって、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、癌の予防および治療用薬学的組成物を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物および抗癌剤を含む、癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、有効な量のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
また、本発明は、有効な量のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
また、本発明は、癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を含む薬学的組成物の用途を提供する。
さらに、本発明は、癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を含む薬学的組成物の用途を提供する。
本発明の好ましい一実施例において、前記ＭＡＳ抑制剤は、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性を抑制するものであり得る。この際、前記ＭＡＳに含まれるタンパク質は、リンゴ酸−アルファ−ケトグルタル酸輸送体（ＭＡＴ；ｍａｌａｔｅ−ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体（ＧＡＴ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ １）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上のものであり得る。また、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；または配列番号３で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡまたは配列番号４で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；のうちいずれか一つであり、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号５で表される塩基配列または配列番号６で表される塩基配列のうちいずれか一つであり得る。
また、前記ＭＡＳ抑制剤は、フェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）フタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート（Ｍｅｔｈｙｌ ３−（３−（４−（２，４，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ）− ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＷ６，２−テノイル−トリフルオロアセトン（２−Ｔｈｅｎｏｙｌ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、クロロトリシン（ｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｃｉｎ）、アミノオキシ酢酸（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＯＡ）、ヒドラジノコハク酸（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２−アミノ−３−ブテン酸（２−ａｍｉｎｏ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびマーキュアリアル化合物（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
本発明の好ましい一実施例において、前記癌は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上のものであり得る。
本発明の好ましい一実施例において、前記抗癌剤は、ゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）およびエトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得、抗癌剤およびＭＡＳ抑制剤は、１：１０〜５００のモル比率で混合するものであり得る。
したがって、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤；またはＭＡＳ抑制剤および抗癌剤の混合された薬物を有効成分として含む癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤をゴシポールまたはフェンホルミンのような抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際して、ＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。この際、正常細胞に対しては、有意的な細胞死滅を示さない反面、癌細胞に対しては、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤のシナジー効果を通じてこれらをそれぞれ単独処理する場合に比べて上昇された癌治療効果を示すことができるので、本発明の組成物は、癌の治療に効果的に使用することができる。
図１は、癌細胞株においてリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）に含まれたタンパク質の発現を抑制したときの細胞増殖抑制効果を示す：図１ａは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＭＡＳに含まれるタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現抑制による細胞増殖抑制効果を確認した図である。 図１ｂは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現抑制による細胞死滅を確認した図である。 図１ｃは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを通したＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現レベルの減少を確認した図である。 図２は、癌細胞株においてＭＡＳを抑制したとき、細胞内ＡＴＰ生産阻害効果を示す：図２ａは、癌細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制によるＡＴＰ発現レベルの減少を確認した図である。 図２ｂは、癌細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制による細胞内代謝過程関与タンパク質の発現レベルの変化を確認した図である。 図３は、肺癌動物モデルにおいてＭＡＳ抑制による腫瘍成長抑制効果を示す：図３ａは、ＳＬＣ２５Ａ１１の発現が抑制されるに伴って肺癌細胞株が移植されたマウスにおいて腫瘍サイズの変化を確認した図である。 図３ｂは、ＳＬＣ２５Ａ１１の発現が抑制されるに伴って肺癌細胞株が移植されたマウスの腫瘍重量を比較した図である。 図４は、ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認を示し、ａは、フェニルコハク酸（ＰＳＡ）を肺癌細胞株に処理したとき、癌細胞の生長抑制効果を確認した図であり；ｂは、ＰＳＡを黒色腫細胞株に処理したとき、癌細胞の生長抑制効果を確認した図であり；およびｃは、ＰＳＡを処理した正常対照群細胞の細胞増殖率を比較した図である。 図５は、ＭＡＳ抑制剤の処理による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果を確認した図である。 図６は、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理を通した癌細胞死滅のシナジー効果を示す：図６ａは、癌細胞株にＭＡＳ抑制剤であるＰＳＡまたはＰＡをゴシポールと併用処理したとき、細胞増殖抑制および細胞死滅誘導効果を確認した図である。 図６ｂは、癌細胞株にＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを併用処理したとき、細胞内ＡＴＰ欠乏のシナジー効果を確認した図である。 図６ｃは、癌細胞株にＭＡＳ抑制剤であるＮＰＭをゴシポールと併用処理したとき、細胞増殖抑制および細胞死滅誘導効果を確認した図である。 図７ａおよび図７ｂは、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用投与を通したミトコンドリア膜電位減少のシナジー効果を確認した結果である。 図８ａおよび図８ｂは、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を確認した結果である。 図９ａ、図９ｂおよび図９ｃは、ＭＡＳ抑制剤およびフェンホルミンの併用投与を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果を確認した結果である。 図１０は、ＭＡＳ抑制剤およびエトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）の併用投与を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果を確認した結果である。 図１１は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの過程を示す模式図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
上述したように、本発明者らは、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）を遮断してミトコンドリアの内部にＮＡＤＨが流入することを遮断する場合、ゴシポールまたはフェンホルミンの処理を通した癌細胞内ＡＴＰ欠乏現象でより顕著な効果を誘導できるものと期待した。
本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤をゴシポールまたはフェンホルミンのような抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際して、ＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して、生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。
したがって、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を含む癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物において、前記「ＭＡＳ抑制剤」は、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性抑制剤であることが好ましい。
本発明において、前記「ＭＡＳに含まれるタンパク質」は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの構成要素として当業界に公知となったタンパク質をいう。具体的に、図１１に示されたように、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルには、総６種のタンパク質が含まれていて、これらのうち一つ以上のタンパク質に対して活性を抑制できるものと当業者に理解され得ると、制限なしに含まれてもよい。より具体的に、前記「ＭＡＳに含まれるタンパク質」は、リンゴ酸−アルファ−ケトグルタル酸輸送体（ＭＡＴ；ｍａｌａｔｅ−ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体（ＧＡＴ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１；ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２；ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１；ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ １）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ＧＯＴ２；ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。前記ＭＡＴは、ヒトＳＬＣ２５Ａ１１遺伝子で暗号化される輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）であって、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ／ｍａｌａｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとも称することができる。前記ＧＡＴは、ヒトＳＬＣ２５Ａ１２遺伝子で暗号化される輸送タンパク質であって、Ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒａｌａｒ１とも称することができる。前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼにおいて、ＭＤＨ１は、細胞質に存在し（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｏｒｍ）、ＭＤＨ２は、ミトコンドリアの内部に存在する（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍ）。また、前記グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼにおいて、ＧＯＴ１は、細胞質に存在し、ＧＯＴ２は、ミトコンドリアの内部に存在する。前記ＧＯＴ１およびＧＯＴ２は、それぞれアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＡＳＴ１；ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）およびＡＳＴ２とも称することができる。
本発明による「ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性抑制剤」は、具体的にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用してＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制したり、ＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物を使用することができる。
前記「ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用してＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制」することにおいて、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；または配列番号３で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡまたは配列番号４で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；のうちいずれか一つであり、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号５で表される塩基配列または配列番号６で表される塩基配列のうちいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されず、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制するために通常の技術者により選択され得るｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであると、制限なしに使用することができる。
前記「ＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物」として、フェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）フタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート（Ｍｅｔｈｙｌ ３−（３−（４−（２，４，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ）− ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＷ６、２−テノイル−トリフルオロアセトン（２−Ｔｈｅｎｏｙｌ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、クロロトリシン（ｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｃｉｎ）、アミノオキシ酢酸（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＯＡ）、ヒドラジノコハク酸（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２−アミノ−３−ブテン酸（２−ａｍｉｎｏ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびマーキュアリアル化合物（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上を使用することが好ましいが、これに限定されず、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性を抑制するものであって、通常の技術者に選択されて使用される物質であると、制限なしに使用することができる。具体的に、上述したＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物において、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート、ＬＷ６、２−テノイル−トリフルオロアセトン、クロロトリシンは、ＭＤＨ酵素の抑制剤として公知となっている（Ｎａｉｋ，Ｒａｖｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０．２０（２０１７）：８６３１−８６４６；Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉａｄｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０．５（２０１５）：１９５９−１９６６；Ｇｕｔｍａｎ，Ｍｅｎａｃｈｅｍ，ａｎｄ Ｅｓｔｅｒ Ｈａｒｔｓｔｅｉｎ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ４９．２（１９７４）：１７０−１７３．；ＳＣＨＩＮＤＬＥＲ，Ｐｅｔｅｒ Ｗ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ５１．２（１９７５）：５７９−５８５．）。また、ＡＯＡ、ヒドラジノコハク酸、２−アミノ−３−ブテン酸は、ＧＯＴ酵素の抑制剤として公知となっている（Ｗａｎｇ，Ｃａｉｘｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ ３７８．１（２０１６）：１−７．；Ｙａｍａｄａ，Ｒｙｏ−Ｈｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ８０１．１（１９８４）：１５１−１５４．；Ｒａｎｄｏ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３．１９（１９７４）：３８５９−３８６３．）。また、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミドを含むマレイミド系の化合物およびマーキュアリアル系の化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１１の抑制剤であることが公知となっている（Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ，Ｌｏｒｅｄａｎａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５．２７（１９９６）：８９７４−８９８０．）。
本発明の薬学的組成物において、前記「癌」は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。
本発明の薬学的組成物において、前記「抗癌剤」は、癌細胞内ミトコンドリアの膜電位を調節したり、これに伴い、癌細胞内ＡＴＰの欠乏を誘導できる抗癌剤を使用する場合に、ＭＡＳ抑制剤とともに使用して癌治療のシナジー効果を示すことができる。具体的に、前記抗癌剤は、ゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）およびエトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
前記「ゴシポール」は、細胞内でＡＬＤＨの発現抑制剤および活性抑制剤として役割を有する。具体的に、ゴシポールは、細胞内ｓｅｒｉｎｅ−ｆｏｌａｔｅ機序でＡＬＤＨがＮＤＡＨを生成してこれからＡＴＰが生成される細胞機序で、ゴシポールがＡＬＤＨ発現および活性抑制剤として作用して細胞内ＡＴＰ欠乏を誘発することによって、癌細胞が死滅され得る。前記ゴシポールは、下記［化学式１］の構造を有する：
［化学式１］
本発明において提供する組成物の「フェンホルミン」は、細胞内でミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤の役割をする。具体的に、フェンホルミンは、ミトコンドリア複合体Ｉの活性抑制を通じてミトコンドリア膜電位を減少させることができ、結果的に細胞内ＡＴＰの合成が低下するので、癌細胞が効果的に死滅され得る。前記フェンホルミンは、下記［化学式２］の構造を有する：
［化学式２］
本発明において提供する組成物の「エトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）」は、細胞内でｂ−酸化（ｂ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を抑制する役割をする。具体的に、エトモキシルは、ミトコンドリア内膜の外部に位置するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１；ＣＰＴ−１）の活性を非可逆的に抑制することができ、これを通じて細胞質からミトコンドリア膜の内部に脂肪酸アシル環が移動することを遮断して、脂肪酸酸化を通したＡＰＴ生成を阻害する役割をする。前記エトモキシルは、下記［化学式３］の構造を有する：
［化学式３］
本発明の薬学的組成物において、前記「ＭＡＳ抑制剤」は、抗癌剤とともに併用処理するために混合された形態で提供することがより好ましい。混合において、ＭＡＳ抑制剤は、抗癌剤と１０：１〜５００：１のモル比率で混合することが好ましく、具体的に３０：１〜４５０：１のモル比率で混合することがより好ましく、より具体的に４０：１〜４００：１のモル比率で混合することが最も好ましいが、これに限定されない。
より具体的に、本発明の薬学的組成物は、ＭＡＳ抑制剤を０．１〜１０ｍＭの濃度で含むことができ、この際、抗癌剤は、上述した混合比率で混合することができるので、０．２μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１μＭ〜５００μＭ、より好ましくは１０μＭ〜１００μＭの濃度範囲で通常の技術者により選択的に使用可能である。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、まず、ＭＡＳ発現を抑制することによる癌治療効果を示すことができるかを確認しようとした。本発明においてＭＡＳに含まれたタンパク質としては、ＧＡＴを対象とし、ＭＡＳタンパク質の発現を抑制するためにＧＡＴの亜型であるＳＬＣ２５Ａ１１に対する発現を抑制するためにｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを肺癌細胞株および黒色腫細胞株に導入した。その結果、ＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、正常対照群に比べて細胞内ＡＴＰの生産が阻害されて、細胞の増殖率が有意的に減少することを確認した（図１および図２）。また、本発明者らは、ＭＡＳタンパク質の発現を抑制したとき、生体内でも腫瘍の生長を抑制できるかを確認するために、癌細胞株を異種移植したマウスで形成された腫瘍の成長程度を確認した結果、ＭＡＳタンパク質の発現が抑制された癌細胞を移植したマウスで腫瘍生長程度が微小であることを確認した（図３）。
ＭＡＳタンパク質の発現だけでなく、活性を遮断する場合でも、同じ癌治療効果を示すことができるかを確認するために、ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果を確認した。ＭＡＳ活性抑制剤としては、フェニルコハク酸（ＰＳＡ）を培地に添加して癌細胞株を培養した結果、ＭＡＳタンパク質の活性を抑制したとき、細胞内ＡＴＰ生産が阻害されて（図５）、細胞増殖も抑制されることを確認した（図４）。
また、本発明者らは、ＭＡＳ抑制剤が癌細胞のミトコンドリア内膜でＡＴＰ生成を抑制することを通じて癌細胞の増殖を抑制することができることを確認したので、これに伴い、ミトコンドリア膜電位および細胞内ＡＴＰ生産を調節できる抗癌剤薬物をＭＡＳ抑制剤とともに処理したとき、有意的な癌治療効果を示すかを確認しようとした。これより、ＭＡＳ抑制剤であるＰＳＡまたはフタロン酸（ＰＡ）を、抗癌剤であるゴシポールと共に混合して処理したとき、ミトコンドリア膜電位減少で単独処理に比べて上昇されたシナジー効果を示すことができることを確認した（図７）。これと共に、癌細胞増殖抑制だけでなく、増加した細胞死滅効果を確認して、癌の成長を抑制すると共に、癌死滅効果を一緒に示すことができることを確認した（図６および図８）。ＭＡＳ抑制剤とフェンホルミンを混合して併用投与した場合にも、癌細胞増殖抑制のシナジー効果を有意的に示すことができることを確認した（図９）。これに比べて、ＭＡＳ抑制剤および前記抗癌剤を混合して正常細胞に処理する場合には、細胞増殖抑制および細胞死滅誘導が現れないことを確認して、本発明のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤の混合処理によって癌細胞だけを特異的に死滅できる効果を示すことができることを確認した。
したがって、本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤をゴシポールまたはフェンホルミンのような抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際してＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して、生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。この際、正常細胞に対しては、有意的な細胞死滅を示さない反面、癌細胞に対しては、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤のシナジー効果を通じてこれらをそれぞれ単独処理する場合に比べて上昇された癌治療効果を示すことができるので、本発明の組成物は、癌の治療に効果的に使用することができる。
また、本発明の癌の予防および治療用薬学的組成物には、抗癌剤を追加でさらに含むことができる。この際、使用可能な抗癌剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン及びカルムスチンよりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。より好ましくは、前記抗癌剤は、ゴシポールのようなＡＬＤＨ抑制活性を有するか、またはフェンホルミンのようなビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系の薬物であり得る。
本発明の組成物を医薬品で使用する場合、ゴシポールおよびフェンホルミンを含む薬学的組成物は、臨床投与時に多様な下記の経口または非経口投与形態で製剤化されて投与され得るが、これに限定されるものではない。
経口投与用剤形としては、例えば錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール）を含有している。錠剤は、また、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によって、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤または共沸混合物および／または吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含有することができる。
本発明のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を含む薬学的組成物は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射を注入する方法による。この際、非経口投与用剤形に製剤化するためにゴシポールおよびフェンホルミンを安定剤または緩衝剤とともに水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアル単位投与型で製造することができる。前記組成物は、滅菌され／されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤、およびその他治療的に有用な物質を含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
また、本発明のＭＡＳ抑制剤またはこれをゴシポールおよび／またはフェンホルミンと混合した薬物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって変わることができ、体重が６０ｋｇである成人患者を基準とするとき、一般的に０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師または薬剤師の判断によって一定の時間間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。
また、本発明のＭＡＳ抑制剤またはこれをゴシポールおよび／またはフェンホルミンと混合した薬物を含む薬学的組成物において、前記ＭＡＳ抑制剤、ゴシポールおよびフェンホルミンは、これらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒化物を有効成分として含む、経口投与製剤を提供することができる。
本発明の経口投与製剤は、徐放性または制御放出性製剤であり得る。徐放性製剤の場合には、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤が同時放出され得、制御放出性製剤の場合には、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤、または抗癌剤およびＭＡＳ抑制剤が順次に放出され得るように調節することができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。
［実施例１］ＭＡＳ抑制による癌細胞の生長抑制効果の確認
＜１−１＞ ＭＡＳ抑制による肺癌および黒色腫細胞の生長抑制効果の確認
リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）に含まれるタンパク質であるＧＡＴの亜型であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、癌細胞に対して増殖抑制効果を示すことができるかを確認しようとした。
具体的に、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、Ｈ５２２細胞、Ｈ２２６細胞、Ｈ２３細胞またはＥＫＶＸ細胞；または黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、ＵＡＣＣ２５７細胞、Ａ３７５細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞またはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞を１００ｍｌの容量で培養してそれぞれの細胞株の倍加時間によって５，０００〜２０，０００細胞／ｍｌの濃度範囲で９６−ウェルプレートに接種した。その後、細胞を接種したプレートに２０μＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、２週間ＣＯ２培養器で培養した。培養を終結し、ＳＲＢ分析を行うために、冷却させた５０％ＴＣＡ水溶液を各ウェルに最終濃度１０％になるように添加し、４℃冷蔵状態で６０分間培養して細胞を固定した。培養後、上澄み液を除去し、水道水で５回洗浄した後、乾燥させた。乾燥した試料に、０．４％スルホローダミンＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）が含まれた１％酢酸水溶液をそれぞれのウェルに添加し、１０分間室温で放置して細胞を染色した。染色の後に、着色されていない染色剤は、１％酢酸溶液で洗浄して除去した後、さらにプレートを乾燥させた。着色された染色剤は、１０ｍＭのトリズマ塩基溶液で溶解させた後、５１５ｎｍで吸光度を測定した。
ｓｉＲＮＡの形質導入の他にも、細胞内でｓｈＲＮＡを発現させてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制を誘導した。ＳＬＣ２５Ａ１１を標的するｓｈＲＮＡ発現ベクターを対象癌細胞株に形質導入した後、細胞をクリスタルバイオレット染色して生存細胞の数を観察し、細胞を破砕し、ウェスタンブロットを行って、発現量を比較した。
その結果、図１に示されたように、肺癌および黒色腫細胞株でＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、ＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現が正常対照群に比べて有意的に減少し（図１ｃ）、これに伴い、生存細胞が減少し、細胞増殖率が有意的に減少することを確認した（図１ａおよび図１ｂ）。
＜１−２＞ ＭＡＳ抑制による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果の確認
癌細胞株でＭＡＳタンパク質の発現を抑制したとき、細胞生長が抑制されることを確認したので、細胞内ＡＴＰ生産レベルを確認した。
具体的に、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、ＩＭＲ９０細胞、Ｈ２３細胞、Ｈ２２６細胞、Ｈ５２２細胞またはＥＫＶＸ細胞；または黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞、Ａ３５７細胞、Ｍ１４細胞またはＵＡＣＣ２５７細胞をそれぞれ培養した。培養した細胞に４０ｎＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、４８時間の間ＣＯ２培養器で培養した後、ＡＴＰ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ分析キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造社の提供するプロトコルによって細胞内ＡＴＰレベルを確認した。前記培養した細胞を１×１０６細胞に分けて１００μｌのＡＴＰ分析緩衝溶液を加えて細胞を溶解した後、４℃で１５，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。分離した上澄み液２〜５０μｌを９６ウェルプレートに移した後、最終体積がウェル当たり５０μｌになるようにＡＴＰ分析緩衝溶液を加えた。その後、４４μｌ ＡＴＰ分析緩衝溶液、２μｌ ＡＴＰプローブ、２μｌ ＡＴＰコンバータおよび２μｌ展開剤混合物を含むＡＴＰ反応混合物を前記９６ウェルプレートの各ウェル当たり５０μｌずつ加えて混合した。混合後、暗室で３０分間プレートを室温放置した後、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ ｎｍで吸光度を測定した。測定した値で相対的なＡＴＰレベルを比較するために、ゴシポールおよびフェンホルミンを添加しない癌細胞に対する吸光度の値を基準とし、それぞれの薬物を処理した場合の相対的な吸光度の値を比較して、細胞内ＡＴＰレベルを比較した。
ＵＡＣＣ６２細胞に対して、ＡＴＰだけでなく、ＭＡＳタンパク質の発現抑制に伴って多様な代謝経路の代謝物質の発現レベルも比較した。ＵＡＣＣ６２細胞に４０ｎＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析でＴＣＡ回路代謝経路（ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）およびペントースリン酸化経路（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｈａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の代謝物質発現レベルを確認した。
その結果、図２に示されたように、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを処理してＭＡＳを抑制した癌細胞株において未処理対照群に比べて細胞内ＡＴＰレベルが減少することを確認し（図２ａ）、代謝経路の代謝物質の発現レベルも、有意的に減少することを確認した（図２ｂ）。
［実施例２］肺癌動物モデルでＭＡＳ抑制による腫瘍成長抑制効果の確認
ＭＡＳタンパク質の発現レベルを抑制することを通じて癌細胞の生長抑制効果を示すことができることを細胞レベルで確認したので、以後、生体内レベルでも癌生長抑制効果を示すことができるかを確認した。
まず、癌マウスモデルを作るために６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕマウス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ，Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）を準備した。また、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡをＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞に導入して培養し、５．０×１０６のそれぞれの細胞を前記準備したマウスに１ｍｌシリンジーで皮下注射した。２週間マウスを飼育してそれぞれのマウスで腫瘍サイズを確認した。癌細胞の注入後、初期腫瘍のサイズは、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して測定した。腫瘍の体積は、下記［数式１］を使用して求めた。
［数式１］
その結果、図３に示されたように、肺癌細胞株を移植して形成された腫瘍にＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入したマウスモデルでは、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入しない対照群マウスモデルに比べて腫瘍体積の増加レベルも低いことを確認した（図３ａ）。飼育の終了後、マウスを犠牲にして腫瘍サイズおよび重さを比較したときにも、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入したモデル群において対照群（ＰＬＫＯ）より腫瘍重さおよびサイズの増加レベルが顕著に減少することを確認した（図３ｂ）。
［実施例３］ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認
＜３−１＞フェニルコハク酸（ＰＳＡ）の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを利用してＭＡＳの発現を抑制したとき、試験管内および生体内の両方で癌の成長を抑制することができることを確認したが、癌細胞株の生長および腫瘍の成長を完全に抑制しないことを確認した。これより、ＭＡＳ抑制剤を処理する場合では、効果的に癌を抑制することができるか否かを確認しようとした。
具体的に、Ａ５４９細胞（肺癌細胞株）、ＵＡＣＣ６２細胞（黒色腫細胞株）またはＩＭＲ９０細胞（正常対照群、肺線維芽細胞）をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に２、４、６、８または１０ｍＭの濃度でＳＬＣ２５Ａ１１抑制剤であるフェニルコハク酸（ｐｈｅｎｙｌ ｓｕｃｃｉｃｉｃ ａｃｉｄ，ＰＳＡ）を添加し、１００ｍｌの容量で４８時間の間培養した後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認した。
その結果、図４に示されたように、肺癌および黒色腫細胞株においてＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の抑制剤であるＰＳＡを処理したとき、ＰＳＡの添加濃度に依存的に癌細胞株の増殖レベルが減少する反面（図４ａおよび図４ｂ）、正常細胞株であるＩＭＲ９０では、ＰＳＡを処理しても、有意的な癌細胞の増殖抑制が現れないことを確認した（図４ｃ）。
＜３−２＞ＭＡＳ抑制剤の処理による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果の確認
ＭＡＳ抑制剤を処理したとき、癌細胞株の増殖を有意的に抑制できることを確認したので、ＭＡＳ抑制剤の処理によって癌細胞内でＡＴＰレベルが減少するかを確認した。
具体的に、Ａ５４９細胞（肺癌細胞株）またはＵＡＣＣ６２細胞（黒色腫細胞株）をそれぞれ培養した。培養した細胞に２、４、６、８または１０ｍＭのＰＳＡまたはフタロン酸（ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＰＡ）を添加し、４８時間の間培養した後、前記実施例＜１−２＞と同じ方法を行って、細胞内ＡＴＰレベルを確認した。
その結果、図５に示されたように、ＰＳＡまたはＰＡを処理してＭＡＳの活性を抑制した癌細胞株において未処理対照群に比べて細胞内ＡＴＰレベルが減少することを確認した（図５）。
［実施例４］ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果確認
＜４−１＞ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理を通した癌細胞死滅のシナジー効果確認
癌細胞にＭＡＳ抑制剤を処理したとき、癌細胞の増殖を抑制することができることを確認したが、２〜１０ｍＭの濃度でＰＳＡまたはＰＡを処理したとき、完全な抗癌効果を示さないことを確認した。これより、本発明者らは、癌細胞内でＡＴＰ生成抑制を通じて癌細胞の増殖を抑制できる抗癌剤であるゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）をＭＡＳ抑制剤と併用処理して癌細胞の増殖をより効果的に抑制することができるか否かを確認しようとした。
具体的に、肺癌細胞株であるＥＫＶＸ細胞、Ａ５４９細胞、またはＨＯＰ−６２細胞；黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、ＵＡＣＣ２５７細胞またはＡ３７５細胞；または正常対照群の肺線維芽細胞であるＩＭＲ９０細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に４ｍＭのＰＳＡ、４ｍＭのＰＡまたは２５μＭのＮＰＭ（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を１０μＭのゴシポールと混合して培地に添加し、４８時間の間追加培養した。その後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認し、前記実施例＜１−２＞と同じ方法を行って、細胞内ＡＴＰレベルを確認した。
その結果、図６に示されたように、ＭＡＳ抑制剤であるＰＳＡおよびＰＡをそれぞれ４ｍＭの濃度で単独処理したことに比べて１０μＭのゴシポールを単独で処理した場合、細胞内ＡＴＰの生産レベルの顕著な差異は確認されないが（図６ｂ）、細胞増殖レベルは、ゴシポールを処理した場合に、より有意的に減少することを確認した（図６ａ）。また、ＭＡＳ抑制剤であるＮＰＭを２５μＭの濃度で処理したことに比べてゴシポールを単独で処理する場合に、細胞増殖レベルの抑制効果が高いレベルで現れることを確認した（図６ｃ）。しかしながら、ＭＳＡ抑制剤およびゴシポールを混合して併用処理した実験群においてより顕著な細胞増殖抑制効果を示すことを確認し、細胞の増殖が抑制されると共に、細胞死滅を示して、癌細胞株の数が減少することを確認した（図６ａおよび図６ｃ）。これに対し、正常細胞対照群であるＩＭＲ９０細胞株では、細胞増殖の減少が一部現れるが、同一濃度のＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを処理したことと比較したときは、細胞増殖減少レベルが微小であることを確認した（図６ａ）。
＜４−２＞ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理を通したミトコンドリア膜電位減少のシナジー効果確認
ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを併用処理したとき、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールをそれぞれ単独で処理したことに比べて顕著に増加したレベルで癌細胞の増殖が抑制され、細胞数が減少すると共に、癌細胞の死滅が顕著なレベルで現れることを確認し、細胞内ＡＴＰレベルも有意的に減少することを確認したところ、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを併用処理したことによってミトコンドリア膜電位レベルに変化があるかを確認した。
具体的に、Ａ５４９細胞、ＵＡＣＣ６２細胞および正常細胞であるＩＭＲ９０細胞を培養した。培養した細胞に４ｍＭのＭＡＳ抑制剤であるＳＬＣ２５Ａ１１抑制剤（ＰＳＡまたはＰＡ）および１０μＭゴシポールを混合した混合薬物、またはこれらの単独薬物をそれぞれの細胞に処理して同一に４８時間の間培養した後、それぞれの細胞培養液をチャンバースライド（蛍光顕微鏡分析用）または６−ウェルプレート（フローサイトメーター分析用）に分注した。分注した培養液に、蛍光プローブである１００ｎＭのテトラメチルローダミンエステル（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｏｄａｍｉｎｅ ｅｓｔｅｒ，ＴＭＲＥ）を処理し、２０分間反応した。反応後、冷却されたＰＢＳで細胞を洗浄し、ａ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で細胞の蛍光発色度を測定した。これと共に５８５ｎｍ（ＦＬ−２）チャネルを利用してフローサイトメーターで蛍光強度を分析した。
その結果、図７に示されたように、４８時間の間薬物を処理して細胞を培養した結果、ＩＭＲ９０細胞（正常対照群）では、ＭＡＳ抑制剤またはゴシポールを単独処理したり、併用処理することと関係なく、ミトコンドリア膜電位が有意的に変化しないことに比べて、Ａ５４９細胞およびＵＡＣＣ６２細胞では、ミトコンドリア膜電位の変化を示すことを確認した。前記変化と関連して、Ａ５４９細胞では、ＭＡＳ抑制剤であるＰＳＡおよびＰＡをそれぞれ単独処理した場合に、有意的にミトコンドリア膜電位が変化しないことに比べて、ゴシポールを単独処理した対照群では、膜電位が有意的に減少することを確認し、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを混合処理した実験群も、ミトコンドリア膜電位レベルの有意的な減少を確認した（図７ａおよび図７ｂ）。
＜４−３＞ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールの併用処理による細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の確認
ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを併用処理したとき、細胞増殖の抑制だけでなく、細胞死滅においても有意的なシナジー効果を示すことができるかを確認するために、細胞死滅活性を確認した。
まず、Ａ５４９細胞、ＵＡＣＣ６２細胞および正常細胞であるＩＭＲ９０細胞を培養した。培養した細胞に４ｍＭのＭＡＳ抑制剤であるＳＬＣ２５Ａ１１抑制剤（ＰＳＡまたはＰＡ）および１０μＭのゴシポールを混合した混合薬物、またはこれらの単独薬物をそれぞれの細胞に処理して同一に４８時間の間培養した。培養した細胞は、培地を除去して冷たいＰＢＳで２回洗浄し、１，４００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で結合緩衝溶液を加えた。そして、１００μＭの緩衝溶液を５−ｍＬの培養チューブに移して、アネクシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をそれぞれ５μｌずつ加えた。チューブをゆっくりボルテックスにかけて混合した後、室温の暗室で１５分間培養した。培養後、結合緩衝溶液（４００μｌ）を加え、フローサイトメーターを用いて細胞死滅の増加程度を確認した。
その結果、図８に示されたような４８時間の間薬物を処理して細胞を培養した結果、ＩＭＲ９０細胞（正常対照群）では、ＭＡＳ抑制剤またはゴシポールを単独処理したり、併用処理することと関係なく、有意的に細胞死滅が現れない反面、Ａ５４９細胞およびＵＡＣＣ６２細胞では、ＭＡＳ抑制剤またはゴシポールを単独処理する場合、微小な細胞死滅が現れることを確認した。しかしながら、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを混合して処理する場合に、単独処理に比べて細胞死滅レベルが顕著に増加することを確認した（図８ａおよび図８ｂ）。このような細胞死滅の効果は、ＭＡＳ抑制剤およびゴシポールを混合したとき、それぞれの薬物を単独で処理する場合に比べて細胞増殖をより高いレベルで抑制すると共に、細胞死滅においてもシナジー効果を示すことができるので、癌細胞の死滅において効果的であることを示す。
［実施例５］ＭＡＳ抑制剤およびフェンホルミンの併用処理を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果確認
ＭＡＳ抑制剤をゴシポールと併用処理したとき、癌細胞の増殖抑制においてシナジー効果を示して、効果的に癌増殖を抑制し、細胞死滅を誘導することができることを確認したところ、ミトコンドリア複合体Ｉの抑制剤としてＡＴＰ欠乏を誘導できる抗癌剤として知られているフェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）ともシナジー効果を示すことができるかを確認しようとした。
具体的に、Ａ５４９細胞、ＵＡＣＣ６２細胞、ＨＯＰ−６２細胞、Ｈ２２６細胞、ＵＡＣＣ６２細胞およびＡ３７５細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に４ｍＭのＰＳＡ、４ｍＭのＰＴＡまたは２５〜５０μＭのＮＰＭを１００μＭのフェンホルミンと混合して培地に添加し、４８時間の間追加培養した。その後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認した。
その結果、図９に示されたように、ＭＡＳ抑制剤またはフェンホルミンを併用処理した時に比べて、ＰＳＡ，ＰＴＡまたはＮＰＭ；およびフェンホルミンを混合処理した場合に、細胞増殖抑制効果が有意的に上昇することを確認した（図９）。
［実施例６］ＭＡＳ抑制剤およびエトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）併用処理を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果確認
他の抗癌剤として、ｂ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎを標的して癌細胞の増殖を抑制するものと知られているエトモキシルとＭＡＳ抑制剤のシナジー効果の有無を確認した。エトモキシルは、ミトコンドリア内膜の外部に位置するＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）などの酵素に対する活性抑制剤として知られている。
具体的に、肝癌細胞株であるＨｕｈ７、悪性膠芽腫細胞株であるＳＮＢ１９細胞、黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、胃癌細胞株であるＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞、または正常対照群の肺線維芽細胞であるＩＭＲ９０細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に２５μＭのＮＰＭおよび１００μＭのエトモキシルを混合して培地に添加し、２４時間の間追加培養した。その後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認した。
その結果、図１０に示されたように、ＭＡＳ抑制剤であるＮＰＭを処理したとき、悪性膠芽腫細胞株であるＳＮＢ１９細胞以外の癌細胞株に対して癌細胞の増殖抑制効果を示すことができることを確認した。これに加えて、エトモキシルおよびＮＰＭを混合して併用処理したとき、それぞれを単独処理した実験群に比べて顕著に増加した細胞増殖抑制効果を示すことを確認し、肝癌細胞株であるＨｕｈ７細胞の場合、細胞の増殖が抑制されると共に、細胞死滅を示して、癌細胞株の数が減少することを確認した（図１０）。
本出願は、２０１７年０４月１４日に出願された韓国特許出願第１０−２０１７−００４８５５８号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。
本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を癌治療剤として使用する技術に関し、より具体的には、ＭＡＳ抑制剤、または前記ＭＡＳおよび抗癌剤の混合物を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
癌とは、個体の必要に応じて規則的でかつ節制した増殖と抑制をすることができる正常細胞とは異なって、組織内で必要な状態を無視し、無制限に増殖する未分化細胞から構成された細胞塊であって、腫瘍とも言う。このような無制限に増殖する癌細胞は、周囲の組織に浸潤し、さらに深刻な場合は、身体の他の器官に転移を起こして、深刻な苦痛を伴い、結局には、死を招く難病である。
癌は、血液癌と固形癌に大きく分類され、すい臓癌、乳癌、口腔癌、肝癌、子宮癌、食道癌、皮膚癌など身体のほぼすべての部位で発生し、これらの治療方法として、最近、グリベックまたはハーセプチンのような少数の標的治療剤が特定癌の治療に利用されているが、現在までは、手術や放射線療法および細胞増殖を抑制する化学療法剤を利用した抗癌剤治療が主な方法である。しかしながら、標的治療剤でないので、従来化学療法剤の最も大きな問題は、細胞毒性による副作用と薬剤耐性であって、抗癌剤による初期の成功した反応にもかかわらず、結局は、治療が失敗することになる主な要因である。したがって、このような化学療法剤の限界を克服するためには、抗癌作用の機序が明確な標的治療剤の開発が持続的に必要である。
正常細胞と癌細胞においてＡＴＰを合成する経路は異なっている。正常細胞では、ブドウ糖が吸収されると、糖化作用により分解した糖が、ミトコンドリアの内部でＴＣＡサイクルを通じてＮＡＤＨを生産し、これを利用してミトコンドリア膜電位でＡＴＰを生産して細胞がこれを使用することができる。これに対し、癌細胞では、糖化作用を起こさないため、ＬＤＨにより乳酸が生産されて細胞の外部に排出され、その代わりに、ＡＬＤＨが過発現して、ＡＴＰの生産に関与することになる。したがって、癌細胞だけを死滅しようとする場合、ＡＬＤＨの発現または活性を抑制して、細胞内でＡＴＰの欠乏を誘導し、これに伴い、細胞の増殖が遮断されることによって、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することをターゲットとする薬物が開発されている。
一方、ミトコンドリア内膜の外部から内部に物質の移動通路として関与する構造体をリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（Ｍａｌａｔｅ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）という。ＭＡＳは、ミトコンドリア内膜に発現した通路タンパク質ＭＡＴおよびＧＡＴを通じてリンゴ酸とアスパラギン酸の移動に関与し、この際、ＮＡＤＨの移動を助ける役割をする。ＭＡＳは、多様な腫瘍細胞で発生することが公知となっているが、公知の内容によれば、腫瘍細胞株でミトコンドリアのＮＡＤＨ酸化−還元にＭＡＳが関与することができて、癌細胞の細胞質では、糖化過程を通したＮＡＤＨ酸化が減少し、ＭＡＳを通したミトコンドリア内ＮＡＤＨ酸化が現れることが公知となっている（Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ，Ｗａｌｔｅｒ ＶＶ，ａｎｄ Ａｌｂｅｒｔ Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６．４（１９７６）：１３９２−１３９６）。
したがって、本発明者らは、ＭＡＳを遮断してミトコンドリアの内部にＮＡＤＨが流入することを遮断する場合、抗癌剤の処理を通した癌細胞内ＡＴＰ欠乏現象でより顕著な効果を誘導できるものと期待し、ＭＡＳ抑制剤を抗癌剤と併用処理して肺癌および黒色腫細胞株で細胞死滅が増加することを確認して、本発明を完成した。
これより、本発明者らは、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を投与したとき、細胞内ＡＴＰ生産を抑制し、細胞増殖を抑制する効果を示すことができることを確認した。また、ＭＡＳ抑制剤を抗癌剤と混合処理したとき、癌細胞増殖抑制および死滅誘導効果においてシナジー効果を示すことができることを確認することによって、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、癌の予防および治療用薬学的組成物を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物および抗癌剤を含む、癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、有効な量のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
また、本発明は、有効な量のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
また、本発明は、癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を含む薬学的組成物の用途を提供する。
さらに、本発明は、癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を含む薬学的組成物の用途を提供する。
本発明の好ましい一実施例において、前記ＭＡＳ抑制剤は、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性を抑制するものであり得る。この際、前記ＭＡＳに含まれるタンパク質は、リンゴ酸−アルファ−ケトグルタル酸輸送体（ＭＡＴ；ｍａｌａｔｅ−ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体（ＧＡＴ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ １）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上のものであり得る。また、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；または配列番号３で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡまたは配列番号４で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；のうちいずれか一つであり、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号５で表される塩基配列または配列番号６で表される塩基配列のうちいずれか一つであり得る。
また、前記ＭＡＳ抑制剤は、フェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）フタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート（Ｍｅｔｈｙｌ ３−（３−（４−（２，４，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ）− ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＷ６，２−テノイル−トリフルオロアセトン（２−Ｔｈｅｎｏｙｌ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、クロロトリシン（ｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｃｉｎ）、アミノオキシ酢酸（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＯＡ）、ヒドラジノコハク酸（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２−アミノ−３−ブテン酸（２−ａｍｉｎｏ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびマーキュアリアル化合物（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であり得る。
本発明の好ましい一実施例において、前記癌は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上のものであり得る。
本発明の好ましい一実施例において、前記抗癌剤は、エトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）であり得、抗癌剤およびＭＡＳ抑制剤は、１：１０〜５００のモル比率で混合するものであり得る。
したがって、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤；またはＭＡＳ抑制剤および抗癌剤の混合された薬物を有効成分として含む癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤を抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際して、ＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。この際、正常細胞に対しては、有意的な細胞死滅を示さない反面、癌細胞に対しては、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤のシナジー効果を通じてこれらをそれぞれ単独処理する場合に比べて上昇された癌治療効果を示すことができるので、本発明の組成物は、癌の治療に効果的に使用することができる。
図１は、癌細胞株においてリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）に含まれたタンパク質の発現を抑制したときの細胞増殖抑制効果を示す：図１ａは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＭＡＳに含まれるタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現抑制による細胞増殖抑制効果を確認した図である。 図１ｂは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現抑制による細胞死滅を確認した図である。 図１ｃは、肺癌細胞株および黒色腫細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを通したＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現レベルの減少を確認した図である。 図２は、癌細胞株においてＭＡＳを抑制したとき、細胞内ＡＴＰ生産阻害効果を示す：図２ａは、癌細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制によるＡＴＰ発現レベルの減少を確認した図である。 図２ｂは、癌細胞株においてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制による細胞内代謝過程関与タンパク質の発現レベルの変化を確認した図である。 図３は、肺癌動物モデルにおいてＭＡＳ抑制による腫瘍成長抑制効果を示す：図３ａは、ＳＬＣ２５Ａ１１の発現が抑制されるに伴って肺癌細胞株が移植されたマウスにおいて腫瘍サイズの変化を確認した図である。 図３ｂは、ＳＬＣ２５Ａ１１の発現が抑制されるに伴って肺癌細胞株が移植されたマウスの腫瘍重量を比較した図である。 図４は、ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認を示し、ａは、フェニルコハク酸（ＰＳＡ）を肺癌細胞株に処理したとき、癌細胞の生長抑制効果を確認した図であり；ｂは、ＰＳＡを黒色腫細胞株に処理したとき、癌細胞の生長抑制効果を確認した図であり；およびｃは、ＰＳＡを処理した正常対照群細胞の細胞増殖率を比較した図である。 図５は、ＭＡＳ抑制剤の処理による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果を確認した図である。 図６は、ＭＡＳ抑制剤およびエトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）の併用投与を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果を確認した結果である。 図７は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの過程を示す模式図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
上述したように、本発明者らは、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）を遮断してミトコンドリアの内部にＮＡＤＨが流入することを遮断する場合、抗癌剤の処理を通した癌細胞内ＡＴＰ欠乏現象でより顕著な効果を誘導できるものと期待した。
本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤を抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際して、ＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して、生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。
したがって、本発明は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を含む癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の薬学的組成物において、前記「ＭＡＳ抑制剤」は、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性抑制剤であることが好ましい。
本発明において、前記「ＭＡＳに含まれるタンパク質」は、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの構成要素として当業界に公知となったタンパク質をいう。具体的に、図１１に示されたように、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトルには、総６種のタンパク質が含まれていて、これらのうち一つ以上のタンパク質に対して活性を抑制できるものと当業者に理解され得ると、制限なしに含まれてもよい。より具体的に、前記「ＭＡＳに含まれるタンパク質」は、リンゴ酸−アルファ−ケトグルタル酸輸送体（ＭＡＴ；ｍａｌａｔｅ−ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体（ＧＡＴ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＤＨ１；ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ＭＤＨ２；ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１；ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ １）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ＧＯＴ２；ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。前記ＭＡＴは、ヒトＳＬＣ２５Ａ１１遺伝子で暗号化される輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）であって、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ／ｍａｌａｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎとも称することができる。前記ＧＡＴは、ヒトＳＬＣ２５Ａ１２遺伝子で暗号化される輸送タンパク質であって、Ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｒａｌａｒ１とも称することができる。前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼにおいて、ＭＤＨ１は、細胞質に存在し（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｆｏｒｍ）、ＭＤＨ２は、ミトコンドリアの内部に存在する（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｏｒｍ）。また、前記グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼにおいて、ＧＯＴ１は、細胞質に存在し、ＧＯＴ２は、ミトコンドリアの内部に存在する。前記ＧＯＴ１およびＧＯＴ２は、それぞれアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ１（ＡＳＴ１；ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）およびＡＳＴ２とも称することができる。
本発明による「ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性抑制剤」は、具体的にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用してＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制したり、ＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物を使用することができる。
前記「ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用してＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制」することにおいて、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；または配列番号３で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡまたは配列番号４で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；のうちいずれか一つであり、前記ｓｈＲＮＡは、配列番号５で表される塩基配列または配列番号６で表される塩基配列のうちいずれか一つ以上であってもよいが、これに限定されず、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現を抑制するために通常の技術者により選択され得るｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであると、制限なしに使用することができる。
前記「ＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物」として、フェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）フタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート（Ｍｅｔｈｙｌ ３−（３−（４−（２，４，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ）− ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＷ６、２−テノイル−トリフルオロアセトン（２−Ｔｈｅｎｏｙｌ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、クロロトリシン（ｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｃｉｎ）、アミノオキシ酢酸（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＯＡ）、ヒドラジノコハク酸（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２−アミノ−３−ブテン酸（２−ａｍｉｎｏ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびマーキュアリアル化合物（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上を使用することが好ましいが、これに限定されず、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性を抑制するものであって、通常の技術者に選択されて使用される物質であると、制限なしに使用することができる。具体的に、上述したＭＡＳタンパク質の活性を抑制する化合物において、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート、ＬＷ６、２−テノイル−トリフルオロアセトン、クロロトリシンは、ＭＤＨ酵素の抑制剤として公知となっている（Ｎａｉｋ，Ｒａｖｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６０．２０（２０１７）：８６３１−８６４６；Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉａｄｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０．５（２０１５）：１９５９−１９６６；Ｇｕｔｍａｎ，Ｍｅｎａｃｈｅｍ，ａｎｄ Ｅｓｔｅｒ Ｈａｒｔｓｔｅｉｎ．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ４９．２（１９７４）：１７０−１７３．；ＳＣＨＩＮＤＬＥＲ，Ｐｅｔｅｒ Ｗ．Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ５１．２（１９７５）：５７９−５８５．）。また、ＡＯＡ、ヒドラジノコハク酸、２−アミノ−３−ブテン酸は、ＧＯＴ酵素の抑制剤として公知となっている（Ｗａｎｇ，Ｃａｉｘｉａ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒｓ ３７８．１（２０１６）：１−７．；Ｙａｍａｄａ，Ｒｙｏ−Ｈｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ８０１．１（１９８４）：１５１−１５４．；Ｒａｎｄｏ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３．１９（１９７４）：３８５９−３８６３．）。また、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミドを含むマレイミド系の化合物およびマーキュアリアル系の化合物は、ＳＬＣ２５Ａ１１の抑制剤であることが公知となっている（Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ，Ｌｏｒｅｄａｎａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５．２７（１９９６）：８９７４−８９８０．）。
本発明の薬学的組成物において、前記「癌」は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。
本発明の薬学的組成物において、前記「抗癌剤」は、癌細胞内ミトコンドリアの膜電位を調節したり、これに伴い、癌細胞内ＡＴＰの欠乏を誘導できる抗癌剤を使用する場合に、ＭＡＳ抑制剤とともに使用して癌治療のシナジー効果を示すことができる。具体的に、前記抗癌剤は、エトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）であり得る。
本発明において提供する組成物の「エトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）」は、細胞内でｂ−酸化（ｂ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を抑制する役割をする。具体的に、エトモキシルは、ミトコンドリア内膜の外部に位置するカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１；ＣＰＴ−１）の活性を非可逆的に抑制することができ、これを通じて細胞質からミトコンドリア膜の内部に脂肪酸アシル環が移動することを遮断して、脂肪酸酸化を通したＡＰＴ生成を阻害する役割をする。前記エトモキシルは、下記［化学式３］の構造を有する：
［化学式３］
本発明の薬学的組成物において、前記「ＭＡＳ抑制剤」は、抗癌剤とともに併用処理するために混合された形態で提供することがより好ましい。混合において、ＭＡＳ抑制剤は、抗癌剤と１０：１〜５００：１のモル比率で混合することが好ましく、具体的に３０：１〜４５０：１のモル比率で混合することがより好ましく、より具体的に４０：１〜４００：１のモル比率で混合することが最も好ましいが、これに限定されない。
より具体的に、本発明の薬学的組成物は、ＭＡＳ抑制剤を０．１〜１０ｍＭの濃度で含むことができ、この際、抗癌剤は、上述した混合比率で混合することができるので、０．２μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１μＭ〜５００μＭ、より好ましくは１０μＭ〜１００μＭの濃度範囲で通常の技術者により選択的に使用可能である。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、まず、ＭＡＳ発現を抑制することによる癌治療効果を示すことができるかを確認しようとした。本発明においてＭＡＳに含まれたタンパク質としては、ＧＡＴを対象とし、ＭＡＳタンパク質の発現を抑制するためにＧＡＴの亜型であるＳＬＣ２５Ａ１１に対する発現を抑制するためにｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを肺癌細胞株および黒色腫細胞株に導入した。その結果、ＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、正常対照群に比べて細胞内ＡＴＰの生産が阻害されて、細胞の増殖率が有意的に減少することを確認した（図１および図２）。また、本発明者らは、ＭＡＳタンパク質の発現を抑制したとき、生体内でも腫瘍の生長を抑制できるかを確認するために、癌細胞株を異種移植したマウスで形成された腫瘍の成長程度を確認した結果、ＭＡＳタンパク質の発現が抑制された癌細胞を移植したマウスで腫瘍生長程度が微小であることを確認した（図３）。
ＭＡＳタンパク質の発現だけでなく、活性を遮断する場合でも、同じ癌治療効果を示すことができるかを確認するために、ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果を確認した。ＭＡＳ活性抑制剤としては、フェニルコハク酸（ＰＳＡ）を培地に添加して癌細胞株を培養した結果、ＭＡＳタンパク質の活性を抑制したとき、細胞内ＡＴＰ生産が阻害されて（図５）、細胞増殖も抑制されることを確認した（図４）。
したがって、本発明のＭＡＳ抑制剤は、細胞内ＡＴＰ生成を抑制して癌細胞の生長を抑制することができる。また、前記ＭＡＳ抑制剤を抗癌剤とともに癌細胞に処理する場合、癌細胞に特異的に細胞内ＡＴＰ欠乏を誘導するので、細胞増殖を抑制するに際してＭＡＳ抑制剤と前記抗癌剤がシナジー効果を示して、細胞増殖を抑制して腫瘍成長を抑制すると共に、有意的に癌細胞死滅効果を示して、生成された癌を死滅させるのに効果的になり得る。この際、正常細胞に対しては、有意的な細胞死滅を示さない反面、癌細胞に対しては、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤のシナジー効果を通じてこれらをそれぞれ単独処理する場合に比べて上昇された癌治療効果を示すことができるので、本発明の組成物は、癌の治療に効果的に使用することができる。
また、本発明の癌の予防および治療用薬学的組成物には、抗癌剤を追加でさらに含むことができる。この際、使用可能な抗癌剤は、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキシマブ、エルロチニブ、ネラチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レスタウルチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスカムアルバム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシン、オテラシル、アザシチジン、メトトレキサート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、フルタミド、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモフール、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テムシロリムス、テモゾロミド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカルバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトール、ロイコボリン、トレトニン、エキセメスタン、アミノグルテチミド、アナグレリド、オラパリブ、ナベルビン、ファドロゾール、タモキシフェン、トレミフェン、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、ボロゾール、ビカルタミド、ロムスチン及びカルムスチンよりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。
本発明の組成物を医薬品で使用する場合、抗癌剤を含む薬学的組成物は、臨床投与時に多様な下記の経口または非経口投与形態で製剤化されて投与され得るが、これに限定されるものではない。
経口投与用剤形としては、例えば錠剤、丸剤、硬質／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール）を含有している。錠剤は、また、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によって、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤または共沸混合物および／または吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含有することができる。
本発明のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を含む薬学的組成物は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射を注入する方法による。この際、非経口投与用剤形に製剤化するために抗癌剤を安定剤または緩衝剤とともに水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアル単位投与型で製造することができる。前記組成物は、滅菌され／されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤、およびその他治療的に有用な物質を含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法によって製剤化することができる。
また、本発明のＭＡＳ抑制剤またはこれを抗癌剤と混合した薬物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって変わることができ、体重が６０ｋｇである成人患者を基準とするとき、一般的に０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師または薬剤師の判断によって一定の時間間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。
また、本発明のＭＡＳ抑制剤またはこれを抗癌剤と混合した薬物を含む薬学的組成物において、前記ＭＡＳ抑制剤、抗癌剤は、これらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒化物を有効成分として含む、経口投与製剤を提供することができる。
本発明の経口投与製剤は、徐放性または制御放出性製剤であり得る。徐放性製剤の場合には、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤が同時放出され得、制御放出性製剤の場合には、ＭＡＳ抑制剤および抗癌剤、または抗癌剤およびＭＡＳ抑制剤が順次に放出され得るように調節することができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。
［実施例１］ＭＡＳ抑制による癌細胞の生長抑制効果の確認
＜１−１＞ ＭＡＳ抑制による肺癌および黒色腫細胞の生長抑制効果の確認
リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）に含まれるタンパク質であるＧＡＴの亜型であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、癌細胞に対して増殖抑制効果を示すことができるかを確認しようとした。
具体的に、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、Ｈ５２２細胞、Ｈ２２６細胞、Ｈ２３細胞またはＥＫＶＸ細胞；または黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、ＵＡＣＣ２５７細胞、Ａ３７５細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞またはＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞を１００ｍｌの容量で培養してそれぞれの細胞株の倍加時間によって５，０００〜２０，０００細胞／ｍｌの濃度範囲で９６−ウェルプレートに接種した。その後、細胞を接種したプレートに２０μＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、２週間ＣＯ２培養器で培養した。培養を終結し、ＳＲＢ分析を行うために、冷却させた５０％ＴＣＡ水溶液を各ウェルに最終濃度１０％になるように添加し、４℃冷蔵状態で６０分間培養して細胞を固定した。培養後、上澄み液を除去し、水道水で５回洗浄した後、乾燥させた。乾燥した試料に、０．４％スルホローダミンＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）が含まれた１％酢酸水溶液をそれぞれのウェルに添加し、１０分間室温で放置して細胞を染色した。染色の後に、着色されていない染色剤は、１％酢酸溶液で洗浄して除去した後、さらにプレートを乾燥させた。着色された染色剤は、１０ｍＭのトリズマ塩基溶液で溶解させた後、５１５ｎｍで吸光度を測定した。
ｓｉＲＮＡの形質導入の他にも、細胞内でｓｈＲＮＡを発現させてＳＬＣ２５Ａ１１の発現抑制を誘導した。ＳＬＣ２５Ａ１１を標的するｓｈＲＮＡ発現ベクターを対象癌細胞株に形質導入した後、細胞をクリスタルバイオレット染色して生存細胞の数を観察し、細胞を破砕し、ウェスタンブロットを行って、発現量を比較した。
その結果、図１に示されたように、肺癌および黒色腫細胞株でＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の発現を抑制したとき、ＳＬＣ２５Ａ１１タンパク質の発現が正常対照群に比べて有意的に減少し（図１ｃ）、これに伴い、生存細胞が減少し、細胞増殖率が有意的に減少することを確認した（図１ａおよび図１ｂ）。
＜１−２＞ ＭＡＳ抑制による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果の確認
癌細胞株でＭＡＳタンパク質の発現を抑制したとき、細胞生長が抑制されることを確認したので、細胞内ＡＴＰ生産レベルを確認した。
具体的に、肺癌細胞株であるＡ５４９細胞、ＩＭＲ９０細胞、Ｈ２３細胞、Ｈ２２６細胞、Ｈ５２２細胞またはＥＫＶＸ細胞；または黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞、Ａ３５７細胞、Ｍ１４細胞またはＵＡＣＣ２５７細胞をそれぞれ培養した。培養した細胞に４０ｎＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、４８時間の間ＣＯ２培養器で培養した後、ＡＴＰ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ分析キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造社の提供するプロトコルによって細胞内ＡＴＰレベルを確認した。前記培養した細胞を１×１０６細胞に分けて１００μｌのＡＴＰ分析緩衝溶液を加えて細胞を溶解した後、４℃で１５，０００×ｇで２分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。分離した上澄み液２〜５０μｌを９６ウェルプレートに移した後、最終体積がウェル当たり５０μｌになるようにＡＴＰ分析緩衝溶液を加えた。その後、４４μｌ ＡＴＰ分析緩衝溶液、２μｌ ＡＴＰプローブ、２μｌ ＡＴＰコンバータおよび２μｌ展開剤混合物を含むＡＴＰ反応混合物を前記９６ウェルプレートの各ウェル当たり５０μｌずつ加えて混合した。混合後、暗室で３０分間プレートを室温放置した後、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ ｎｍで吸光度を測定した。測定した値で相対的なＡＴＰレベルを比較するために、抗癌剤を添加しない癌細胞に対する吸光度の値を基準とし、それぞれの薬物を処理した場合の相対的な吸光度の値を比較して、細胞内ＡＴＰレベルを比較した。
ＵＡＣＣ６２細胞に対して、ＡＴＰだけでなく、ＭＡＳタンパク質の発現抑制に伴って多様な代謝経路の代謝物質の発現レベルも比較した。ＵＡＣＣ６２細胞に４０ｎＭのＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを添加し、２４時間の間ＣＯ２培養器で培養した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析でＴＣＡ回路代謝経路（ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）およびペントースリン酸化経路（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｈａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の代謝物質発現レベルを確認した。
その結果、図２に示されたように、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｉＲＮＡを処理してＭＡＳを抑制した癌細胞株において未処理対照群に比べて細胞内ＡＴＰレベルが減少することを確認し（図２ａ）、代謝経路の代謝物質の発現レベルも、有意的に減少することを確認した（図２ｂ）。
［実施例２］肺癌動物モデルでＭＡＳ抑制による腫瘍成長抑制効果の確認
ＭＡＳタンパク質の発現レベルを抑制することを通じて癌細胞の生長抑制効果を示すことができることを細胞レベルで確認したので、以後、生体内レベルでも癌生長抑制効果を示すことができるかを確認した。
まず、癌マウスモデルを作るために６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕマウス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ，Ｈｉｇｈｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）を準備した。また、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡをＡ５４９細胞またはＨ２２６細胞に導入して培養し、５．０×１０６のそれぞれの細胞を前記準備したマウスに１ｍｌシリンジーで皮下注射した。２週間マウスを飼育してそれぞれのマウスで腫瘍サイズを確認した。癌細胞の注入後、初期腫瘍のサイズは、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して測定した。腫瘍の体積は、下記［数式１］を使用して求めた。
［数式１］
その結果、図３に示されたように、肺癌細胞株を移植して形成された腫瘍にＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入したマウスモデルでは、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入しない対照群マウスモデルに比べて腫瘍体積の増加レベルも低いことを確認した（図３ａ）。飼育の終了後、マウスを犠牲にして腫瘍サイズおよび重さを比較したときにも、ＳＬＣ２５Ａ１１ ｓｈＲＮＡを導入したモデル群において対照群（ＰＬＫＯ）より腫瘍重さおよびサイズの増加レベルが顕著に減少することを確認した（図３ｂ）。
［実施例３］ＭＡＳ活性抑制剤の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認
＜３−１＞フェニルコハク酸（ＰＳＡ）の処理による癌細胞の生長抑制効果の確認
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを利用してＭＡＳの発現を抑制したとき、試験管内および生体内の両方で癌の成長を抑制することができることを確認したが、癌細胞株の生長および腫瘍の成長を完全に抑制しないことを確認した。これより、ＭＡＳ抑制剤を処理する場合では、効果的に癌を抑制することができるか否かを確認しようとした。
具体的に、Ａ５４９細胞（肺癌細胞株）、ＵＡＣＣ６２細胞（黒色腫細胞株）またはＩＭＲ９０細胞（正常対照群、肺線維芽細胞）をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に２、４、６、８または１０ｍＭの濃度でＳＬＣ２５Ａ１１抑制剤であるフェニルコハク酸（ｐｈｅｎｙｌ ｓｕｃｃｉｃｉｃ ａｃｉｄ，ＰＳＡ）を添加し、１００ｍｌの容量で４８時間の間培養した後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認した。
その結果、図４に示されたように、肺癌および黒色腫細胞株においてＭＡＳタンパク質であるＳＬＣ２５Ａ１１の抑制剤であるＰＳＡを処理したとき、ＰＳＡの添加濃度に依存的に癌細胞株の増殖レベルが減少する反面（図４ａおよび図４ｂ）、正常細胞株であるＩＭＲ９０では、ＰＳＡを処理しても、有意的な癌細胞の増殖抑制が現れないことを確認した（図４ｃ）。
＜３−２＞ＭＡＳ抑制剤の処理による細胞内ＡＴＰ生産阻害効果の確認
ＭＡＳ抑制剤を処理したとき、癌細胞株の増殖を有意的に抑制できることを確認したので、ＭＡＳ抑制剤の処理によって癌細胞内でＡＴＰレベルが減少するかを確認した。
具体的に、Ａ５４９細胞（肺癌細胞株）またはＵＡＣＣ６２細胞（黒色腫細胞株）をそれぞれ培養した。培養した細胞に２、４、６、８または１０ｍＭのＰＳＡまたはフタロン酸（ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＰＡ）を添加し、４８時間の間培養した後、前記実施例＜１−２＞と同じ方法を行って、細胞内ＡＴＰレベルを確認した。
その結果、図５に示されたように、ＰＳＡまたはＰＡを処理してＭＡＳの活性を抑制した癌細胞株において未処理対照群に比べて細胞内ＡＴＰレベルが減少することを確認した（図５）。
［実施例６］ＭＡＳ抑制剤およびエトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）併用処理を通した癌細胞増殖抑制のシナジー効果確認
他の抗癌剤として、ｂ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎを標的して癌細胞の増殖を抑制するものと知られているエトモキシルとＭＡＳ抑制剤のシナジー効果の有無を確認した。エトモキシルは、ミトコンドリア内膜の外部に位置するＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）などの酵素に対する活性抑制剤として知られている。
具体的に、肝癌細胞株であるＨｕｈ７、悪性膠芽腫細胞株であるＳＮＢ１９細胞、黒色腫細胞株であるＵＡＣＣ６２細胞、乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、胃癌細胞株であるＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞、または正常対照群の肺線維芽細胞であるＩＭＲ９０細胞をそれぞれ培養した。それぞれの細胞の培養培地に２５μＭのＮＰＭおよび１００μＭのエトモキシルを混合して培地に添加し、２４時間の間追加培養した。その後、前記実施例＜１−１＞と同じ方法を行って、ＳＲＢ分析を通じて細胞の増殖レベルを確認した。
その結果、図１０に示されたように、ＭＡＳ抑制剤であるＮＰＭを処理したとき、悪性膠芽腫細胞株であるＳＮＢ１９細胞以外の癌細胞株に対して癌細胞の増殖抑制効果を示すことができることを確認した。これに加えて、エトモキシルおよびＮＰＭを混合して併用処理したとき、それぞれを単独処理した実験群に比べて顕著に増加した細胞増殖抑制効果を示すことを確認し、肝癌細胞株であるＨｕｈ７細胞の場合、細胞の増殖が抑制されると共に、細胞死滅を示して、癌細胞株の数が減少することを確認した（図１０）。

Claims (15)

  1. リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル（ｍａｌａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｓｈｕｔｔｌｅ，ＭＡＳ）抑制剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物。
  2. 前記ＭＡＳ抑制剤は、ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現または活性抑制剤であることを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  3. 前記ＭＡＳに含まれるタンパク質は、リンゴ酸−アルファ−ケトグルタル酸輸送体（ＭＡＴ；ｍａｌａｔｅ−ａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、グルタミン酸−アスパラギン酸輸送体（ＧＡＴ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ２（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ １）およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２（ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ２）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  4. 前記ＭＡＳに含まれるタンパク質の発現抑制剤は、ＭＡＳに含まれるタンパク質に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのうちいずれか一つまたは二つともであることを特徴とする、請求項２に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  5. 前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡおよび配列番号２で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；または配列番号３で表される塩基配列である正方向ｓｉＲＮＡまたは配列番号４で表される塩基配列である逆方向ｓｉＲＮＡ；のうちいずれか一つであり、
    前記ｓｈＲＮＡは、配列番号５で表される塩基配列または配列番号６で表される塩基配列のうちいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  6. 前記ＭＡＳに含まれるタンパク質の活性抑制剤は、フェニルコハク酸（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｃｃｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルマロン酸（Ｍｅｔｈｙｌ Ｍａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｎ−（１−ピレニル）マレイミド（Ｎ−（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）フタロン酸（Ｐｈｔｈａｌｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）、メチル３−（３−（４−（２，４，４−トリメチルペンタン−２−イル）フェノキシ）−プロパンアミド）ベンゾエート（Ｍｅｔｈｙｌ ３−（３−（４−（２，４，４−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ）− ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＬＷ６、２−テノイル−トリフルオロアセトン（２−Ｔｈｅｎｏｙｌ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、クロロトリシン（ｃｈｌｏｒｏｔｈｒｉｃｉｎ）、アミノオキシ酢酸（ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＯＡ）、ヒドラジノコハク酸（ｈｙｄｒａｚｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、２−アミノ−３−ブテン酸（２−ａｍｉｎｏ−３−ｂｕｔｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびマーキュアリアル化合物（ｍｅｒｃｕｒｉａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  7. 前記癌は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  8. 請求項１に記載の薬学的組成物および抗癌剤を含む、癌の予防および治療用薬学的組成物。
  9. 前記抗癌剤は、ゴシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）、フェンホルミン（ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）およびエトモキシル（ｅｔｏｍｏｘｉｒ）よりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  10. 前記癌の予防および治療用薬学的組成物は、抗癌剤およびＭＡＳ抑制剤を１：１０〜５００のモル比率で混合することを特徴とする、請求項８に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  11. 前記癌は、肺癌、黒色腫、子宮癌、乳癌、胃癌、脳癌、直腸癌、大腸癌、皮膚癌、血液癌、肝癌、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌およびすい臓癌よりなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の癌の予防および治療用薬学的組成物。
  12. 有効な量のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
  13. 有効な量のＭＡＳ抑制剤および抗癌剤を、必要とする個体に投与する段階を含む、癌の治療方法。
  14. 癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤を含む薬学的組成物の用途。
  15. 癌の予防および治療に使用するための、リンゴ酸−アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を含む薬学的組成物の用途。
JP2019555188A 2017-04-14 2018-04-13 リンゴ酸－アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物 Active JP7016883B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0048558 2017-04-14
KR20170048558 2017-04-14
PCT/KR2018/004344 WO2018190676A1 (ko) 2017-04-14 2018-04-13 말산-아스파르트산 왕복수송 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020513024A true JP2020513024A (ja) 2020-04-30
JP7016883B2 JP7016883B2 (ja) 2022-02-07

Family

ID=63792756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019555188A Active JP7016883B2 (ja) 2017-04-14 2018-04-13 リンゴ酸－アスパラギン酸シャトル抑制剤および抗癌剤を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200263184A1 (ja)
EP (1) EP3610866A4 (ja)
JP (1) JP7016883B2 (ja)
KR (1) KR102041042B1 (ja)
CN (1) CN110636841A (ja)
WO (1) WO2018190676A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020076124A1 (ko) * 2018-10-12 2020-04-16 국립암센터 말산-아스파르트산 왕복수송 억제제 및 카르니틴 아실카르니틴 운반자 수송 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN116212053B (zh) * 2023-04-14 2023-10-17 徐州医科大学 Eaat1/slc1a3抑制剂在制备治疗肝癌药物的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2812206B2 (ja) 1994-07-26 1998-10-22 日本電気株式会社 腕時計型無線選択呼出受信機
US20110301153A1 (en) * 2008-11-17 2011-12-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating cancer
US9539323B2 (en) * 2010-08-06 2017-01-10 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods and compositions for malic enzyme 2 (ME2) as a target for cancer therapy
US20130287791A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 C. Wilson Xu Modulation of histone h2b monoubiquitination and treatment of cancer
WO2014009222A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-16 Basilea Pharmaceutica Ag Combination therapy for the treatment of cancer and immunosuppression
KR101579371B1 (ko) 2014-02-27 2015-12-22 국립암센터 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물
BR112017004369A2 (pt) 2014-09-05 2017-12-05 Hyperfine Res Inc configuração automática de um sistema de formação de imagem por ressonância magnética de campo baixo
WO2018164549A1 (ko) * 2017-03-09 2018-09-13 동국대학교 산학협력단 말릭산 탈수소효소 저해 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102082504B1 (ko) * 2017-03-09 2020-02-28 동국대학교 산학협력단 말릭산 탈수소효소 저해 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMISTRY, vol. 35, JPN6021020571, 1996, pages 8974 - 8980, ISSN: 0004517460 *
CELL DEATH AND DISEASE (2016) 7, E2511, JPN6020036735, pages 10 - 1038, ISSN: 0004517458 *
PLOS ONE 11(3): E0150675, JPN6020036738, 2016, ISSN: 0004517459 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110636841A (zh) 2019-12-31
US20200263184A1 (en) 2020-08-20
EP3610866A1 (en) 2020-02-19
JP7016883B2 (ja) 2022-02-07
EP3610866A4 (en) 2020-12-23
KR102041042B1 (ko) 2019-11-05
WO2018190676A1 (ko) 2018-10-18
KR20180116160A (ko) 2018-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10183035B2 (en) Etoposide and prodrugs thereof for use in targeting cancer stem cells
US10420814B2 (en) Composition for treating cancer stem cells
JP2017506655A (ja) 有効成分としてゴシポール及びフェンホルミンを含有するがん治療のための医薬組成物
JP5890043B2 (ja) 抗癌活性を有する２−デオキシ単糖の新規なアセテート
UA119538C2 (uk) Лікування злоякісної пухлини дигідропіразинопіразинами
KR102011105B1 (ko) 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102041042B1 (ko) 말산-아스파르트산 왕복수송 억제제 및 항암제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
JP2022516535A (ja) 免疫チェックポイント抑制剤を含む抗がん用組成物
AU2015240775B2 (en) Sigma-2 receptor ligand drug conjugates as antitumor compounds, methods of synthesis and uses thereof
CN101940569B (zh) 含有索拉非尼和青蒿素及青蒿素类衍生物的药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用
JP2024023269A (ja) 抗腫瘍剤及び配合剤
JP7357386B2 (ja) 化合物又はその薬学的に許容される塩、二量体又は三量体のがん治療用医薬品の調製における応用
JP7381115B2 (ja) 組成物及びがん治療用医薬品の調製におけるその応用
WO2017114261A1 (zh) N-芳基、苄基色胺酮及其衍生物在制备hIDO2抑制剂中的用途
KR102656587B1 (ko) 암의 기원 세포의 사멸용 약학적 조성물
EP4327811A1 (en) Anticancer composition inducing cell senescence and cell death
KR20230152480A (ko) 췌장암 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
KR20210036299A (ko) Yap-tead 상호작용 저해제 및 혈당 강하제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN112118840A (zh) 用于预防或治疗实体癌或血癌的包含1,2-萘醌衍生化合物的药物组合物
US20120245117A1 (en) Methods of treating squamous cell lung cancer with 4-iodo-3-nitrobenzamide in combination with gemcitabine and carboplatin

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191008

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200207

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200929

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201228

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210601

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210825

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220111

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220126

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7016883

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350