JP2020512000A - 胎児の染色体異常を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、胎児の染色体異常を検出する新規な方法に関するものであり、特に、本発明は、約100bp〜約150bpの分析される断片サイズの富化を含む、21トリソミー(ダウン症候群)の検出に関する。本発明は、前記方法を実施するためのキットにも関する。本発明は、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法にも関する。【選択図】図１
Description
(発明の分野)
本発明は、胎児の染色体異常を検出する新規な方法に関するものであり、特に、本発明は、約100bp〜約150bpの分析される断片サイズの富化を含む、21トリソミー(ダウン症候群)の検出に関する。本発明は、前記方法を実施するためのキットにも関する。本発明は、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法にも関する。
本発明は、胎児の染色体異常を検出する新規な方法に関するものであり、特に、本発明は、約100bp〜約150bpの分析される断片サイズの富化を含む、21トリソミー(ダウン症候群)の検出に関する。本発明は、前記方法を実施するためのキットにも関する。本発明は、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法にも関する。
(発明の背景)
ダウン症候群は、800出生数あたり約1人が発症する、比較的よくある遺伝性障害である。この症候群は、過剰な21番染色体全体(21トリソミー、T21)、又は頻度は低いがこの染色体の過剰な実質的部分の存在によって引き起こされる。他の常染色体に関与するトリソミー(すなわちT13又はT18)も、出生児において存在するが、T21よりも稀である。
ダウン症候群は、800出生数あたり約1人が発症する、比較的よくある遺伝性障害である。この症候群は、過剰な21番染色体全体(21トリソミー、T21)、又は頻度は低いがこの染色体の過剰な実質的部分の存在によって引き起こされる。他の常染色体に関与するトリソミー(すなわちT13又はT18)も、出生児において存在するが、T21よりも稀である。
一般に、過剰な染色体又は染色体の欠損に起因する胎児の異数性が存在する状態は、検出可能な母体のセルフリー血漿DNAにおける胎児DNA分子の集団の不均衡をもたらす。
胎児の染色体異常の出生前診断のための信頼できる方法を開発することは、生殖医療における長期目標であった(Puszykらの文献、2008年、Prenat Diagn 28,1-6)。羊水穿刺又は絨毛検査によって胎児性材料を得ることに基づく方法は、侵襲的であり、熟練の臨床医の手によってでさえ、妊娠に対する無視できないリスクを伴う。現在の医療では、こうした侵襲的診断法は、母体年齢という理由による、又は生化学的テスト又は超音波検査を使用する事前スクリーニングを介した、ダウン症候群妊娠の可能性の増大の徴候が存在する場合に通常利用される。信頼性が高く、最初の三半期に適用可能であり、結果の返却が早く、費用のかからない非侵襲的出生前診断(NIPD)の方法の必要性が存在する。
この目標の達成に向けた進展は、妊婦の血漿中のセルフリーDNAに、胎児起源の成分が含まれる(Loらの文献、1997年、Lancet 350,485-487)という知見を利用することによって成し遂げられてきた。セルフリー血漿DNA(以下では「血漿DNA」と呼ぶ)は、主として、典型的にはその5％〜20％が胎児起源であり、残りが母体起源である短いDNA分子(80〜200bp)からなる(Birchらの文献、2005年、Clin Chem 51,312-320; Fanらの文献、2010年、Clin Chem 56,1279-1286)。血漿DNA分子の細胞起源、並びに血漿DNA分子が血液に入り、続いて血液循環から除去される機構は、十分に分かっていない。しかし、胎児性成分が、主に、胎盤内のアポトーシス細胞死の結果であることが広く信じられている(Bianchiの文献、2004年、Placenta 25,S93-S101)。胎児起源である血漿DNA分子の割合は、かなりの個人差を伴って、事例ごとに異なる。この個人差に、妊娠期間が増すにつれて増大する胎児性成分に関する一般的傾向が重ね合わされる(Birchらの文献、2005年、上記; Galbiatiらの文献、2005年、Hum Genet 117,243-248)。胎児性成分は、妊娠初期に、典型的には早ければ第8週で、容易に検出可能である。
原理上は、血漿中のセルフリー胎児DNAが、母体成分によって薄められなければ、T21を特徴付ける過剰な染色体は、正常妊娠に比べて50％過剰の、該染色体に由来するDNA分子をもたらすと期待されるであろう。しかし、胎児起源であるセルフリー血漿DNAの成分について10％という典型的な値を考慮すると、生じる不均衡は、わずか5％、すなわち21番染色体由来の断片の数の、正常妊娠の1.00に対して1.05という値への相対的増大に過ぎないと期待される。血漿DNAの胎児性成分が、10％の値よりも小さい又は大きい状況では、母体血漿中の分子の集団における21番染色体由来の分子の数の不均衡は、それに対応して小さく又は大きくなる。
したがって、T21に対する診断テストの基礎は、母体血漿由来のDNA分子に関するヌクレオチド配列データを得ること(「DNAシークエンシング」)である。いったん、個々のDNA分子から、部分的又は完全なヌクレオチド配列情報が得られれば、最も簡単にはリファレンスヒトゲノム又はゲノム群との比較によって、個々の分子をそれらが由来する染色体に割り当てるために、バイオインフォマティクス技術が適用されなければならない。T21を有する胎児を懐胎している妊娠の場合、分子の集団のわずかな不均衡が、正常妊娠から期待される数に対する21番染色体由来の分子の数の過剰として検出可能である。
21番染色体が、ヒトゲノムのほんの少しの部分(2％未満)を構成するに過ぎないという事実を考慮すると、信頼できる診断のために十分な数をその染色体から収集するために、母体血漿由来の多数のDNA分子が、ランダムにサンプリングされ、シークエンシングされ、バイオインフォマティクスによって、特定の染色体に割り当てられなければならない。(1)そこから得られるヌクレオチド配列情報で特徴付けられ、かつ、次いで(2)染色体上の位置に高信頼性で割り当てられるために必要とされる血漿DNA分子の総数は、胎児のゲノムのすべて又はほとんどをサンプリングするのに必要とされる数よりも少ないが、少なくとも数十万分子である。必要とされる最小数は、母体のセルフリー血漿DNA分子の集団の胎児性成分を構成する血漿DNAの割合の関数である。典型的には、この数は、百万から数百万分子である。
この方法を適用する問題は、小さくはない。何故なら、特定の染色体上の位置由来のDNA分子を数える際に、高い定量的正確度が必要とされるからである。さらに、母体血漿由来のDNAは、ゲノムの混合物であり、そのうちの胎児性成分はごく一部である。この定量的な技術的課題は、DNAサンプル内の特定の遺伝子座の変異を特定することとは質的に異なる。
十分に大きい数の血漿DNAについていくらかのヌクレオチド配列データを得ることができると仮定すれば、かつ、バイオインフォマティクス的方法が、十分に大きい数をその染色体起源に割り当てるために高信頼性で適用できると仮定すれば、統計的方法を適用して、血漿DNA分子の集団における染色体の不均衡の存在又は非存在を統計的信頼性を伴って決定することができる。
母体血漿由来のDNA断片のランダムなサンプルをシークエンシングするというこの考えは、該サンプルが、完全なゲノムのほんの一部分のみを構成するに過ぎないものの、Fanらの文献、2008年、Proc Natl Acad Sci U S A 105,16266-16271及びChiuらの文献、2008年、Proc Natl Acad Sci U S A 105,20458-20463に記載されているNIPD手法の基礎である。
シークエンシングデータを利用するための自明な方法は、特定範囲の外のすべての断片を除外し、したがってインシリコで胎児性の割合を増大させることであろう。しかし、このアプローチは、シークエンシングデータの大部分を使用できなくするであろうし、処理されシークエンシングされるサンプルの量のかなりの増大を必要とするであろう。そのため、デジタル富化は、高価で非効率的であり、ルーチンの実験室環境における使用には非実用的であろうと考えられ得た。
代替的な解決策は、シークエンシングに先立って胎児起源のDNAの比率を富化することであろう。このような富化は、約200bp以上の断片を除去するサイズ選択法を介して既に典型的に利用されている。このような方法は、限定された感度及び胎児性の画分を富化する能力を有する。これまでに、生体サンプルからの胎児性のDNAの高度に正確かつ精密な富化を可能にするであろう方法は記載されていなかった。
したがって、胎児の染色体異常を検出するために、生体サンプルからの胎児性のDNAを富化するための高度に正確で非侵襲性かつ簡便な方法に対する必要性が存在する。このような方法は、13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミーのようなよくある染色体異常についての非侵襲的な出生前テストの性能を強化するであろう。それはまた、現在、より普通にみられる染色体異常に対して相対的に性能が非常に劣る、微小欠失のようなはるかに小さい染色体異常を検出する能力も有意に改善するであろう。
(発明の概要)
本発明の第1の態様によれば、胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ;
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
本発明の第1の態様によれば、胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ;
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
本発明の第2の態様によれば、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか否か、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか否か、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
(図面の簡単な説明)
図1：135bp標的断片サイズ(± 10bp)での21番染色体比。
図2：135bp標的断片サイズ(± 10bp)での胎児画分の概算。
図3：135bp標的断片サイズ(± 10bp)でのX染色体比。
図4：135bp標的断片サイズ(± 10bp)での断片サイズプロフィール。及び比較的小さい母体ピーク。
図5：135bp標的断片サイズ(± 10bp)での反復率データ。
図6：135bp標的断片サイズ(± 5bp)での21番染色体比。
図7：135bp標的断片サイズ(± 20bp)での21番染色体比。
図8：120bp標的断片サイズ(± 10bp)での21番染色体比。
図9：170bp標的断片サイズ(± 10bp)での21番染色体比。
図10：いくつかの標的断片サイズ及び範囲での胎児画分の概算。
図11：いくつかの標的断片サイズ及び範囲での胎児画分の概算。
図12:所定のサイズの断片が胎児起源であるモデル化された確率、及び典型的な母体断片サイズ分布(10％胎児画分)。
図13：所定のサイズの断片が胎児性である確率を表すグラフィカルな表現。
図14：常染色体比の比較、サイズ加重対非加重(21番染色体)。
図15：常染色体比の比較、サイズ加重対非加重(18番染色体)。
図16：常染色体比の比較、サイズ加重対非加重(13番染色体)。
図17：非加重分析法及び加重分析法についてのT21罹患サンプル群及び非罹患サンプル群の分布。
図18：非加重分析法及び加重分析法についてのT18罹患サンプル群及び非罹患サンプル群の分布。
図19：非加重分析法及び加重分析法についてのT13罹患サンプル群及び非罹患サンプル群の分布。
図20：非加重分析法及びサイズ加重分析法の両方についての分析での有効胎児画分。
図21：非加重分析法及びサイズ加重分析法間の、分析でのトリソミー罹患サンプルについての有効胎児画分の比較。
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様によれば、胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ;
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
本発明の第1の態様によれば、胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ;
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
そこで言及され得る本開示の1つの態様によれば、胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b)約80bpから約150bpのサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b)約80bpから約150bpのサイズを有する核酸断片を単離するステップ;
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ;
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ;
(e)前記比又は差に基づいて前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む方法が提供される。
胎児の染色体異常の検出において、可能な限り、誤った結果が決定されないことを確保することが重要である。特に、偽陰性の結果が決定される確率を低減することが特に望ましい。しかし、データが効率的に使用されること、及び許容され得る数の症例又はテストにおいて陽性かつ正確な結果が生成されることを確保することも重要である。テストに関連する1以上のパラメーターのために結果に信頼性がないことを示すテストではなく、テスト結果は、理想的には、可能な場合には宣言されるべきである。
胎児起源のセルフリーDNAの比率は、胎児サンプルにおける染色体異常の検出のための決定的なパラメーターである。DNAの最小比率は、他の要因との組み合わせで、正確な検出のために必要である。特に、微小欠失のようなより小さい染色体異常は、検出可能となるためには、より大きい比率の胎児起源のDNAを必要とする。本発明の発明者らは、驚くべきことに、本明細書において提示するデータによって支持されるように、約80bpから約150bpの断片サイズに胎児材料を富化することが、このようなテストの正確性及び性能を有意に改善することを同定した。さらに、本発明の方法は、有意に低い量のシークエンシングデータを生成し、したがって、より時間効率的及びコスト効率的な胎児の染色体異常の検出法をもたらす。
2004年(すなわち、EP 2 728 014)以降の多数の刊行物は、母体の血液循環における母体及び胎児のセルフリーDNA断片が異なるサイズ分布を持つことを示してきた。それに加えて、非侵襲性出生前検査(NIPT)のための分析においてこの差を利用することができる可能性があることが、文献において注記されてきた。しかし、これまでに、混合母体/胎児cfDNAサンプルから抽出されたDNA断片のサイズと、該断片が胎児又は母体を起源とする確率との間の、直接的な決定論的な理論的関係は、文献に発表されていない。このようなモデルは、NIPT分析に供するべきサンプル中の胎児DNAの画分を有効に富化するためのサイズ選択に基づくプロセスにおける使用のための最適サイズ範囲を決定できるために必要であり、許容されるサイズ範囲に関する機器関連の実際的な考慮事項が作用する範囲の選択を知らせるのに特に有用である。
本発明を支持するために、図12は、以前に発表されたサイズ分布データを利用して本発明者らにより構築されたこのようなモデルを示す。実線は、所定のサイズの断片が胎児起源であるというモデル化された確率を表し、リファレンスのために、点線は、合計胎児画分が10％の（つまり、サイズとは無関係に、胎児からの任意の所定の断片が胎児由来である合計確率は0.1である）サンプルについてのサイズごとの断片の合計分布を表す。
図12において実線によって描かれたモデルは、可能な限り大きな確率値を最大化するサイズ範囲を選択することにより、胎児DNAについて最適にNIPTサンプルを富化するためのサイズ画分の選択を知らせるために直接使用してもよい。サイズ範囲に関する他の任意の考慮事項とは関係なく、典型的な最適範囲は、例えば、120±10bp(確率のピークのみを含むため)であることができるが、実際的な実施目的のために、胎児DNAについてなお有効に富化する代替的な範囲、たとえば：
・使用中の特定のサイズ選択技術がある種のサイズパラメーター内でのみ作動できる、又は最良に作動する場合、135±10bp；及び
・例えば、使用中の技術が大きいサイズ範囲を必要とする場合、80〜150bp(すなわち、115±35bp)
を選択してもよい。
・例えば、使用中の技術が大きいサイズ範囲を必要とする場合、80〜150bp(すなわち、115±35bp)
を選択してもよい。
図12の確率モデルは、実際、母体及び胎児の断片全体(すなわち、サイズに関わらずに)がサンプル中に存在する可能性が等しい場合のために構築されている。この全体的なバランスは、もちろん実際のサンプルで変化し、胎児画分は約3％及び25％の間の範囲にわたるが、それでも、サイズに応じた母体と胎児の断片の相対濃度は、全体的な胎児画分に関係なく、なお同じプロフィールに従うであろう。
さらに、本発明の方法は、もたらされるシークエンシングの効率の有意な改善を可能にする。例えば、分析に先立っての胎児画分パーセンテージの増大は、胎児の染色体異常の正確な検出のために必要とされるデータ量の有意な低減を可能にする。
「20bp以内」という用語は、＋／−20bp、すなわち、40bpの核酸断片の合計範囲を指すことは理解されるであろう。一実施態様では、ステップ(b2)における単離は、10bp以内(すなわち、20bpの断片の合計範囲)の核酸断片のそれである。さらなる実施態様では、ステップ(b2)における単離は、5bp以内(すなわち、10bpの断片の合計範囲)の核酸断片のそれである。
本発明者らは、本明細書で提示され考察されるデータに示されているように、100bp〜155bpの任意の40bpの「ウィンドウ」が最適な結果を提供することを同定した。したがって、分析に先立って、120bp〜135bpの任意の値が選ばれる(本明細書において記載されるステップ(b1))。本発明者らは、驚くべきことに、胎児の染色体の断片の大部分がこのサイズのものであろうから、これらの範囲間の任意の値が最適の胎児画分を提供することを見出した。一実施態様では、ステップ(b1)で選択される値は、120bp、又は121bp、又は122bp、又は123bp、又は124bp、又は125bp、又は126bp、又は127bp、又は128bp、又は129bp、又は130bp、又は131bp、又は132bp、又は133bp、又は134bp、又は135bpである。
本発明の一重要態様は、ユーザーが、ステップ(b1)で上述の任意の値を選択するだけではなく、次にこのサイズに密接に近似する範囲のサイズが次に分析されることも確保しなければならないという承認である。ステップ(b1)で任意の値として125bpが選択され、このサイズを有する断片のみが同定されたならば、リードの数は、有意な、かつ最も重要なことに十分に正確な結果を生じるためには十分でなくなるであろうため、これは重要である。したがって、ステップ(b1)で選択されたサイズの20bp又は10bp又は5bp(すなわち、40bp又は20bp又は10bpの合計核酸断片範囲)以内のすべての断片を分析することは、より多数のほとんど胎児性の染色体断片を提供し、結果の感度及び正確度を有意に改善することになる。したがって、まとめると、ステップ（b1）が最大胎児濃度のための最適サイズ値を提供し、ステップ（b2）の範囲が胎児性の断片の総数を最大化するというように、ステップ（b1）と（b2）との間に相乗効果がある。
胎児の染色体異常
本明細書において「胎児の染色体異常」へのリファレンスは、胎児の染色体内のあらゆる遺伝的変異を指し、該胎児のネイティブの、非突然変異体の、又は野生型の遺伝暗号の任意の変異を含むことは理解されるであろう。このような遺伝的変異の例としては、異数性、重複、転座、突然変異(例えば、点突然変異)、置換、欠失、一塩基多型(SNP)、染色体異常、コピー数多型(CNV)、エピジェネティック変化、及びDNA逆位が挙げられる。
本明細書において「胎児の染色体異常」へのリファレンスは、胎児の染色体内のあらゆる遺伝的変異を指し、該胎児のネイティブの、非突然変異体の、又は野生型の遺伝暗号の任意の変異を含むことは理解されるであろう。このような遺伝的変異の例としては、異数性、重複、転座、突然変異(例えば、点突然変異)、置換、欠失、一塩基多型(SNP)、染色体異常、コピー数多型(CNV)、エピジェネティック変化、及びDNA逆位が挙げられる。
本明細書において「一塩基多型(SNP)」という用語へのリファレンスは、所定の遺伝子における単一のヌクレオチドがある種のメンバー間、又はある個体の対になる染色体間で相違する場合に生じるDNA配列変異を指すことを意図している。
一実施態様では、遺伝的変異は、機能的突然変異、すなわち、臨床的に関連のある胎児の疾患又は障害の原因となるものである。このような疾患又は障害の例としては、脆弱X症候群のような断片長障害に加えて、サラセミア及び嚢胞性線維症が挙げられる。突然変異は、それらがアミノ酸のコード化に影響することにおいて、又は調節エレメントの破壊によって、機能的であることができる(例えば、遺伝子発現を調節してもよく、又はスプライシングの調節に関与する(エキソン又はイントロンであり得る)配列の破壊によってでもよい)。
本発明が検出における有用性を見いだした、好適な染色体異常の例としては、以下が挙げられる:ダウン症候群(21トリソミー)、エドワーズ症候群(18トリソミー)、パトー症候群(13トリソミー)、9トリソミー、Warkany症候群(8トリソミー)、ネコ眼症候群(4コピーの22番染色体)、22トリソミー、及び16トリソミー。
さらに又は或いは、遺伝子、染色体又は染色体の一部、コピー数の異常の検出は、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群(4p-)、ネコなき症候群(5p-)、ウィリアムス-ボイレン症候群(7-)、ヤコブセン症候群(11-)、ミラー・ディッカー症候群(17-)、スミス・マゲニス症候群(17-)、22q11.2欠失症候群(口蓋心臓顔面症候群、ディジョージ症候群、円錐動脈幹異常顔貌症候群、先天性胸腺無形成症、及びストロング症候群(Strong Syndrome)としても公知である)、アンジェルマン症候群(15-)、及びプラダー・ウィリー症候群(15-)を含む群から選択される状態の検出及び/又は診断を含むことができる。
さらに又は或いは、染色体コピー数の異常の検出は、ターナー症候群(ウルリッヒ−ターナー症候群又はXモノソミー)、クラインフェルター症候群、47,XXY又はXXY症候群、48,XXYY症候群、49,XXXXY症候群、トリプルX症候群、XXXX症候群(テトラソミーX、四重X、又は48,XXXXとも呼ばれる)、XXXXX症候群(ペンタソミーX又は49,XXXXXとも呼ばれる)、及びXYY症候群を含む群から選択される状態の検出及び/又は診断を含むことができる。
一実施態様では、標的染色体は、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体、又はY染色体である。
一実施態様では、胎児の染色体異常は、胎児の染色体異数性である。さらなる実施態様では、胎児の染色体異数性は、13トリソミー、18トリソミー、又は21トリソミーである。一層さらなる実施態様では、胎児の染色体異数性は、21トリソミー(ダウン症候群)である。この実施態様では、当業者は、本発明の手法が、胎児が21番染色体の染色体全体ではなく実質的部分を有する症例の診断に適用可能であることを容易に理解することとなる。
一実施態様では、胎児の染色体異常は、例えば、1Mbまで、5Mbまで、10Mbまで、又は20Mbまで又は20Mb超の、染色体の挿入又は欠失である。
サンプル抽出
サンプルは、慣例的な手順に従って、妊娠中の女性被験者から得ることができるということを理解されるであろう。一実施態様では、生体サンプルは、母体の血液、血漿、血清、尿、又は唾液である。さらなる実施態様では、生体サンプルは、母体血漿である。
サンプルは、慣例的な手順に従って、妊娠中の女性被験者から得ることができるということを理解されるであろう。一実施態様では、生体サンプルは、母体の血液、血漿、血清、尿、又は唾液である。さらなる実施態様では、生体サンプルは、母体血漿である。
母体血漿を得るステップは、典型的に、妊娠中の女性被験者から(典型的に静脈穿刺によって)抜き取られる5〜20mlの血液サンプル(典型的に末梢血液サンプル)を含むこととなる。したがって、こうしたサンプルを得ることは、胎児の空間に非侵襲性であるとみなされ、母体にとっても侵襲性が最小限である。血漿は、遠心分離による細胞性材料の除去後に、従来の手段によって調製される(Maronらの文献、2007年、Methods Mol Med 132,51-63)。
DNAは、血漿DNAのヌクレオチド配列に関して偏りのない従来の手法によって、母体血漿から抽出される(Maronらの文献、2007年、上記)。血漿DNA分子の集団は、典型的に、胎児起源である画分と、母体起源である画分とを含むこととなる。
生体サンプル内からの核酸の単離
一実施態様では、ステップ(a)における単離のステップは、核酸断片のライブラリーの調製を含む。単離、断片化及びライブラリー調製のステップは、当業者に周知の慣例的な手順に従って行ってもよいことは理解されるであろう。さらなる実施態様では、ライブラリー調製は、DNA末端修復、アダプターライゲーション、クリーンアップ及びPCRの逐次的なステップを含む。好適な核酸ライブラリーをどのようにして調製し得るかの完全な実験の詳細は、本明細書の方法のセクション、特にステップ1〜49に記載されている。
一実施態様では、ステップ(a)における単離のステップは、核酸断片のライブラリーの調製を含む。単離、断片化及びライブラリー調製のステップは、当業者に周知の慣例的な手順に従って行ってもよいことは理解されるであろう。さらなる実施態様では、ライブラリー調製は、DNA末端修復、アダプターライゲーション、クリーンアップ及びPCRの逐次的なステップを含む。好適な核酸ライブラリーをどのようにして調製し得るかの完全な実験の詳細は、本明細書の方法のセクション、特にステップ1〜49に記載されている。
富化
一実施態様では、単離ステップ(b2)は、ステップ(b1)で選択された断片サイズ値の10bp以内、例えばステップ(b1)で選択された断片サイズ値の5bp以内のサイズを有する核酸断片の富化を含む。
一実施態様では、単離ステップ(b2)は、ステップ(b1)で選択された断片サイズ値の10bp以内、例えばステップ(b1)で選択された断片サイズ値の5bp以内のサイズを有する核酸断片の富化を含む。
本開示の一実施態様では、単離ステップ(b2)は、115±35bp(すなわち、80〜150bp)、例えば115±30bp、115±25bp、115±20bp、115±15bp、115±10bp、120±10bp、110±10bp、135±10bp、140±10bp、115±5bp、又は115bpのサイズを有する核酸断片の富化を含む。
さらなる実施態様では、単離ステップ(b2)は、120±10bp、110±10bp、135±10bp、140±10bp、115±5bp又は115bpのサイズを有する核酸断片の富化を含む。
このような富化ステップは、当業者に周知の慣例的な手順に従って行ってもよいことは理解されるであろう。一実施態様では、単離ステップ(b2)は、サイズ選択を使用する富化を含む。さらなる実施態様では、単離ステップ(b2)は、ゲルベースのサイズ選択を使用する富化を含む。さらなる実施態様では、単離ステップ(b2)は、自動化されたゲルベースのサイズ選択を使用する富化を含む。
このような自動化されたゲルベースのサイズ選択の一例としては、Coastal Genomics社のRanger Technology（商標）が挙げられる。
Ranger Technology（商標）は、分析に対する光の影響を防止するために暗環境を作り出す単離されたボックスを利用する。現在、そのカセットは、他の自動化フットプリントとマッチするためのSSIDではなく自社開発のサイズのものである。カセットは、使用のための12個のチャンネルを有する形成されたアガロースゲルを含有する。
サンプルは、標準的な電気泳動法に従って処理され、それにより、カセットの末端で生成された電荷によってサイズ(及びこのような電荷)に応じたDNA断片の移動及び分離が引き起こされる。ラダーは使用されないが、サンプル内でサイジングが実施されることを確保するために下側及び上側のマーカーの混合物が提供される。アウトプットは、電気泳動図又はゲル画像フォーマットで提示させてもよい。
必要なサイズのサンプルは、除去のために同定されたウェル中に含有される溶液中に、処理され出されることになり、Rangerソフトウェアによって通知される回数だけ、容量全体が除去及び補充されることになるのはここである。
Ranger Technology（商標）は、青及び赤の光の移動過程の間を通してゲルの画像を取得し、この青及び赤の光は、その光（各々、正しくないマーカー同定に関連する正しくない結果を低減する、それら自体の蛍光を有する）の存在下で励起する関連する染料に基づいてサンプル及びマーカーに視認性を提供する。Ranger Technology（商標）の完全な詳細は、http://coastalgenomics.com/で見ることができる。
言及してもよい代替実施態様では、本発明の方法は、低融点アガロースに基づく方法を包含してもよい。この実施態様は、好適なアガロースゲル上に流され、次に手動の手段を使用してゲルから切り出される、サンプルからのDNA断片(例えば、使い捨てのナイフを使用して切られたゲルの細いバンド)を必要とする。
言及してもよい代替実施態様では、本発明の方法は、ゲルベースのサイズ選択の代わりにビーズベースのサイズ選択を包含してもよい。この実施態様は、DNA断片をそれらの塩基対でのサイズに基づいて非常に高度の正確度及び精度まで選択するビーズベースの方法を必要とする。
言及してもよい代替実施態様では、本発明の方法は、PCRベースの方法を包含してもよい。この実施態様は、PCRを、特定した塩基対長より長い断片は増幅できない(又ははるかに低減した効率で増幅する)ようにセットアップすることを必要とする。
言及してもよい代替実施態様では、本発明の方法は、酵素消化に基づく方法を包含してもよい。この実施態様は、特定した長さより長くDNA断片を消化(又は優先的に消化)するために酵素の使用を必要とする。
本明細書における前述の実施態様のいくつかは、DNA断片のサイズに基づく物理的分離を利用しており、それは、望まない断片から所望のサイズの断片を精製するための後続のステップを必要とする。これは、既知のサイズのDNA断片の挙動に基づいて標準曲線を作成し、次にこの標準曲線を使用して目的の断片を含有するサイズ分離された断片の領域を単離することによって、達成することができる。
あるいは、サイズ分離法に供された場合に目的のDNA断片と同様の挙動をとる1以上の標識された分子を構築することができる。これらの標識された分子は、サイズ分離されるべきDNAと混合することができ、次に、分離プロセスの後、標識された断片を含有する領域は目的のDNA断片をも含有することになる。
分離の後、サイズ分離された目的のDNA断片のセットを単離することが必要である。
必要とされるサイズ範囲のDNA断片を単離するための多くの相違するアプローチがある。一つの方法では、標準曲線は、既知のサイズのDNA断片を使用して作成され、次に目的のDNA断片を単離するために使用される。
断片アラインメント
本発明の方法のステップ(c)は、アラインメント又はマッチング分析を実行する。このような分析は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片内の1以上の標的配列の存在の測定、又はあるいはこの断片のシークエンシングを必要とすることになる。したがって、一実施態様では、ステップ(c)は、最初、アラインメントに先立って、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシング、又はこの断片をデジタルPCR又はSNPベースの手法に供することを含む。
本発明の方法のステップ(c)は、アラインメント又はマッチング分析を実行する。このような分析は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片内の1以上の標的配列の存在の測定、又はあるいはこの断片のシークエンシングを必要とすることになる。したがって、一実施態様では、ステップ(c)は、最初、アラインメントに先立って、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシング、又はこの断片をデジタルPCR又はSNPベースの手法に供することを含む。
シークエンシング
さらなる実施態様では、ステップ(c)は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシングを含む。本発明は、富化された断片をシークエンシングし、配列データを得るために、いかなる特定の技術にも限定されないことは当業者に理解されるであろう。一実施態様では、配列データは、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含むシークエンシングプラットフォームによって得られる。さらなる実施態様では、配列データは、次世代シークエンシングプラットフォームを使用して得られる。こうしたシークエンシングプラットフォームは、以下の文献:Lomanらの文献(2012年) Nature Biotechnology 30(5),434-439; Quailらの文献(2012年) BMC Genomics 13,341; Liuらの文献(2012年) Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012,1-11; 及びMeldrumらの文献(2011年) Clin Biochem Rev. 32(4): 177-195に広範に考察及び概説されている(これらの中のシークエンシングプラットフォームを参照によって本明細書に組み込む)。
さらなる実施態様では、ステップ(c)は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシングを含む。本発明は、富化された断片をシークエンシングし、配列データを得るために、いかなる特定の技術にも限定されないことは当業者に理解されるであろう。一実施態様では、配列データは、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含むシークエンシングプラットフォームによって得られる。さらなる実施態様では、配列データは、次世代シークエンシングプラットフォームを使用して得られる。こうしたシークエンシングプラットフォームは、以下の文献:Lomanらの文献(2012年) Nature Biotechnology 30(5),434-439; Quailらの文献(2012年) BMC Genomics 13,341; Liuらの文献(2012年) Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012,1-11; 及びMeldrumらの文献(2011年) Clin Biochem Rev. 32(4): 177-195に広範に考察及び概説されている(これらの中のシークエンシングプラットフォームを参照によって本明細書に組み込む)。
適切な次世代シークエンシングプラットフォームの例としては、以下のもの:Roche 454(すなわちRoche 454 GS FLX)、Applied Biosystems社のSOLiDシステム(すなわちSOLiDv4)、Illumina社のGAIIx、HiSeq 2000、及びMiSeqシークエンサー、Life Technologies社のIon Torrent半導体に基づくシークエンシング機器、Pacific Biosciences社のPacBio RS、及びSanger社の3730xlが挙げられる。
Roche社の454プラットフォームはそれぞれ、化学発光シグナルが、塩基取り込みを示し、かつ、シグナルの強度が、ホモポリマーリードを通して取り込まれた塩基の数と相関する、パイロシークエンシングを用いる。
一実施態様では、富化された断片は、半導体に基づくシークエンシング手法の使用を含むシークエンシングプラットフォームによってシークエンシングされる。半導体に基づくシークエンシング手法の長所は、その機器、チップ、及び試薬が、非常に安く製造でき、シークエンシングプロセスが、(emPCRによって差し引かれるものの)高速であり、そのシステムが拡張可能であることであるが、これは、emPCRのために使用されるビーズサイズによっていくらか制限される可能性がある。
一実施態様では、富化された断片は、合成によるシークエンシングの使用を含むシークエンシングプラットフォームによってシークエンシングされる。Illumina社の合成によるシークエンシング(SBS)技術は、現在、世界的に見て、成功し、かつ広く採用されている次世代シークエンシングプラットフォームである。TruSeq技術は、成長するDNA鎖に取り込まれる単一の塩基の検出を可能にする自社開発の可逆ターミネーターに基づく方法を使用して、大量並列シークエンシングを補助する。蛍光標識されたターミネーターは、各dNTPが添加され、次いで切断されて次の塩基の取り込みが可能になる時に画像化される。各シークエンシングサイクル中に、4つすべての可逆ターミネーター結合dNTPが存在するので、自然な競争によって、取り込みの偏りが最小限になる。
一実施態様では、富化された断片は、ナノポアに基づくシークエンシング手法の使用を含むシークエンシングプラットフォームによってシークエンシングされる。さらなる実施態様では、ナノポアに基づく手法は、Oxford Nanopore Technologies社によって使用される技術におけるような、生きている細胞における細胞膜及びタンパク質チャンネルの状況を模倣する有機タイプのナノポアの使用を含む(例えば、Branton D、Bayley Hらの文献(2008年) Nature Biotechnology 26(10),1146-1153)。一層さらなる実施態様では、ナノポアに基づく手法は、金属、ポリマー、又はプラスチック材料から構築されるナノポアの使用を含む。
一実施態様では、次世代シークエンシングプラットフォームは、Life Technologies社のIon Torrentプラットフォーム又はIllumina社のMiSeqから選択される。この実施態様のこれらの次世代シークエンシングプラットフォームは、どちらもサイズが小さく、速い回転率を特徴とするが、データ処理量が限られる。
さらなる実施態様では、次世代シークエンシングプラットフォームは、Life Technologies社のIon Torrent Personal Genome Machine(Ion Torrent PGM)であるパーソナルゲノムマシン(PGM)である。Ion Torrent装置は、合成によるシークエンシング(SBS)と同様の戦略を使用するが、ヌクレオチド取り込み中のDNAポリメラーゼの活性に起因する水素イオンの放出によるシグナルを検出する。本質的に、Ion Torrentチップは、非常に高感度なpHメーターである。各イオンチップは、複数のシークエンシング反応の並行検出を可能にする、何百万ものイオン感受性電界効果トランジスタ(ISFET)センサーを含有する。ISFET装置の使用は、当業者に周知であり、かつ、十分に、本発明の方法によって必要とされる配列データを得るために使用することができる技術の範囲内である(Prodromakisらの文献(2010年) IEEE Electron Device Letters 31(9),1053-1055; Purushothamanらの文献(2006年) Sensors and Actuators B 114,964-968; Toumazou及びCassの文献(2007年) Phil. Trans. R. Soc. B,362,1321-1328; WO 2008/107014(DNA Electronics Ltd社); WO 2003/073088(Toumazou); US 2010/0159461(DNA Electronics Ltd社);それぞれのシークエンシング手法を、参照によって本明細書に組み込む)。
一実施態様では、富化された断片は、水素イオンなどのイオンの放出の使用を含むシークエンシングプラットフォームによってシークエンシングされる。この実施態様は、いくつかの重要な利点を提供する。例えば、Ion Torrent PGMは、市販品のうち最も安価な(すなわち約＄80,000)パーソナルゲノムマシンとして、Quailらの文献(2012年;上記)に記載されている。さらに、Lomanらの文献(2012年;上記)は、最速の処理量(80〜100Mb/h)及び最短の実行時間(〜3h)をもたらすものとして、Ion Torrent PGMを記載している。
Ion Torrent装置の後続する世代も、本発明における有用性を見いだす可能性があり、例えば、一実施態様では、配列データは、例えば、PI又はPII Chipを備えるIon Protonなどの、Life Technologies社のIon Torrentプラットフォーム、及びそのさらなる派生的な装置及び成分に基づく、多重の可能な反復によって得られることは理解されるであろう。
デジタルPCR
さらなる実施態様では、ステップ(c)は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片をデジタルPCRに供することを含む。本発明は、富化された断片のデジタルPCR及びデータの入手についていかなる特定の技術にも限定されないことを当業者は理解するであろう。デジタルPCRは胎児画分が少なくとも20％である場合に最適に作動し、本発明はこのようなレベルの胎児画分を提供することができる手法を提供するので、本発明は、断片分析法としてデジタルPCRの使用に特に適している。デジタルPCRをどのように母体血漿サンプルに実施し得るかの好適な手法は、EP 1 981 995に記載されている。好適なデジタルPCRシステムの例としては、以下のもの:Quant studioデジタルPCRシステム(ThermoFisher)及びRainDrop PlusデジタルPCRシステム(RainDance technologies)から選択されるデジタルPCRシステムが挙げられる。
さらなる実施態様では、ステップ(c)は、最初に、ステップ(b2)で単離された断片をデジタルPCRに供することを含む。本発明は、富化された断片のデジタルPCR及びデータの入手についていかなる特定の技術にも限定されないことを当業者は理解するであろう。デジタルPCRは胎児画分が少なくとも20％である場合に最適に作動し、本発明はこのようなレベルの胎児画分を提供することができる手法を提供するので、本発明は、断片分析法としてデジタルPCRの使用に特に適している。デジタルPCRをどのように母体血漿サンプルに実施し得るかの好適な手法は、EP 1 981 995に記載されている。好適なデジタルPCRシステムの例としては、以下のもの:Quant studioデジタルPCRシステム(ThermoFisher)及びRainDrop PlusデジタルPCRシステム(RainDance technologies)から選択されるデジタルPCRシステムが挙げられる。
アラインメント分析
このようなマッチング分析は、典型的には、好適なソフトウェアを使用して実施され、かつ、所定の染色体(すなわち、標的又はリファレンス染色体)の各断片についてのヒットを、その断片がその染色体と整列するか、又はその染色体から由来したと認められるかに基づいて割り当てる、バイオインフォマティクス分析を包含する。
このようなマッチング分析は、典型的には、好適なソフトウェアを使用して実施され、かつ、所定の染色体(すなわち、標的又はリファレンス染色体)の各断片についてのヒットを、その断片がその染色体と整列するか、又はその染色体から由来したと認められるかに基づいて割り当てる、バイオインフォマティクス分析を包含する。
一実施態様では、アラインメントは、IONA(登録商標)ソフトウェア(Premaitha Helath plc)、Bowtie2、又はBWA-SW(Li及びDurbinの文献(2010年)Bioinformatics, Epub)アラインメントソフトウェア、又はBWA-MEM(lh3lh3.users.sourceforge.net/download/mem-poster.pdf)もしくはCUSHAW2(http://cushaw2.sourceforge.net/)ソフトウェアのようなMaximal Exact Matching技術を用いるアラインメントソフトウェアを使用して実行される。さらなる実施態様では、アラインメントは、Bowtie2ソフトウェアを使用して実行される。一層さらなる実施態様では、Bowtie2ソフトウェアは、Bowtie2 2.0.0-beta7である。
代替実施態様では、アラインメントは、BWA-MEM(lh3lh3.users.sourceforge.net/download/mem-poster.pdf)もしくはCUSHAW2(http://cushaw2.sourceforge.net/)ソフトウェアのようなMaximal Exact Matching(MEM)技術を用いるアラインメントソフトウェアを使用して実行される。MEMアルゴリズムは、より高い正確度を提供する利点を有すると信じられている。
最大の正確度のためには、配列は、ユニークな（唯一の）染色***置にマッピングされるか、整列されるべきであることは理解されるであろう。例えば、ある断片が標的染色体の標的領域とさらなる染色体との両方にマッピングされる場合、それは標的染色体の標的領域にユニークに整列されると認めることができないので、分析から排除されるべきである。一実施態様では、方法は、付加的に、アラインメントステップ(c)に先立って得られた配列データから重複するリードを圧縮する（collapsing）ステップを含む。
したがって、一実施態様では、ステップ(c)は、標的染色体の標的領域にユニークに整列される該断片の第1の数を決定すること、及びリファレンス染色体内の1以上の標的領域内にユニークに整列される該断片の第2の数を決定することを含む。
本明細書において「標的領域」へのリファレンスは、その標的及び／又はリファレンス染色体の部分又は全部を指すことは理解されるであろう。
一実施態様では、標的染色体は、染色体内の領域であり、リファレンス染色体は、標的染色体としての同じ染色体内の領域である。一実施態様では、方法は、付加的に、胎児の染色体異常を含有することが疑われるゲノムの領域についてのサンプルの富化を含む。このような実施態様は、典型的には、ハイブリダイゼーションに基づく技術を通じた選択のプロセスを利用することになり、シークエンシングに先立って予め選択された標的配列を維持するか又は除去するかの予備選択を可能にする。
配列をユニークな染色体上の位置へマッピングするために、この分析では、インデル/ミスマッチコストの加重を、低くなるようにパラメーター化しなければならない。これらの前提条件を用いて、厳密ではない断片長マッチを決定する。このバイオインフォマティクス的手法を使用すると、典型的には約95％のサンプルリードがゲノムにマッピングされる。リードは、ゲノム内のユニークな位置とマッチする場合にのみ、染色体上の位置に割り当てられるものとしてカウントし、典型的には、ユニークにマッチし、続いて、染色体割り当てについてカウントされたサンプルリードの比率は、約50％になる。
一実施態様では、アラインメントは、染色体全体について実施され、したがって、例えば、この分析は、過剰量の所定の染色体を検出することを含むであろう。代替実施態様では、アラインメントは、前記染色体の一部について実施され、例えば、マッチは、ある染色体の予め決定した特定の領域に関してのみ分析されることとなる。本発明のこの実施態様は、染色体の特異的領域を標的にするおかげで、より感度の高いマッチング技術を提供すると信じられている。
サイズ加重
本明細書で記載された任意の方法(すなわち、異常検出法及び性別予測法)の一実施態様では、付加的なサイズ加重ステップを実行してもよい。したがって、一実施態様では、方法は、付加的に：
(i) 標的染色体の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii) 1以上のリファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii) ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv) ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v) ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi) 前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児の異常の存在を決定するステップ、を含む。
本明細書で記載された任意の方法(すなわち、異常検出法及び性別予測法)の一実施態様では、付加的なサイズ加重ステップを実行してもよい。したがって、一実施態様では、方法は、付加的に：
(i) 標的染色体の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii) 1以上のリファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii) ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv) ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v) ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi) 前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児の異常の存在を決定するステップ、を含む。
妊娠中の女性の胎盤を起源とするセルフリーDNA断片のサイズ分布(そして、それゆえ大多数の症例において胎児又は胎児たちの核型を反映する)は、妊娠中の女性自体を起源とする(すなわち、胎盤以外の組織からの)断片からのそれとは有意に相違するプロフィールに従うことが知られている。最も基本的に、胎児DNA断片は、平均して母体DNA断片よりも短いことが見いだされている。
胎児のゲノムにフォーカスした分析において、サイズ分布の相違は、胎児性である可能性がより高いシークエンシングされた断片を優先的に選択することにより、感度を改善するために利用してもよい。既に公知のバイオインフォマティクスのアプローチは、所定の（より短い）サイズ範囲の断片のみをさらなる分析に進めることを包含する。しかし、このナイーブなアプローチは、分析において胎児DNAの相対的な富化をもたらすものの、カウントされる断片の大部分の喪失ももたらし、したがって、分析に有意に多い不確実性ももたらす；これは、次に、胎児DNAについての富化の感度の利益の多くを打ち消す。
本発明者らは、分析されるすべての断片をよりよく利用する代替的なアプローチを開発した。これは、胎児及び母体のDNA分子間の断片サイズプロフィールの公知の相違を利用して、断片が母体の核型よりも胎児の核型を反映するより高い確率を有する場合、分析において優先的に加重し(すなわち、優先を割り当てる)、かつ、反対に、胎盤以外の母体組織を起源とするより高い確率を有する断片の寄与を弱める。
重要なことに、標的サイズ範囲の外の断片をカウントから捨てるよりも、この新規な分析は、カウントプロセスにおいてすべての断片を考慮に入れ続ける。したがって、それは、正倍数体母体を起源とする断片の希釈効果を低減しながら、同時に大きい比率のDNA断片をカウントすることにより与えられる統計学的パワーを保持する。
図13及び表Aに提供されるデータは、母体血漿から抽出されたセルフリーDNA断片が胎児起源である確率を、断片のサイズの関数として表す。この関係は、胎児起源又は母体起源のいずれかであることが既知の断片の相対頻度を表すデータから算出されている(Chandranandaらの文献(2015年)、BMC medical genomics 8.1: 29)。
本発明に従って採用されるバイオインフォマティクスのアプローチの全体像は以下のとおりである。従前の手法は、各染色体cについて断片カウント値Ncを生成し、ここで、各断片は、1の値を与える。したがって、Ncは、単に、染色体cにマッピングされることが見いだされた断片の数である。
各断片のサイズ加重化を利用する本発明の改良された方法においては、各断片は、代わりにw[s]の値を与え、ここで、wは、加重関数であり、sは、ヌクレオチドでの断片のサイズであり、これはシークエンシングプロセスの一部として決定される。ここで使用される加重関数wは、図13にプロットされるように、断片が胎児起源である確率であり、表Aに示される特異的確率(w)値に外挿される。染色体cに割り当てられた合計加重カウント、Ncは、次に、その染色体に対して整列することが見いだされたすべての断片についてのw[s]値のすべてを合計することによりもたらされる。
標的染色体ctargetに対して整列することが見いだされたすべての断片についてのw[s]値のすべてを合計することによりもたらされる合計加重カウント、Ncは、ここではNctargetとして知られる。したがって、一実施態様では、ステップ(i)及び(ii)で胎児起源である各断片サイズ(s)の確率(w)を算出するステップは、各々の整列された断片のサイズ(s)の同定、及び表Aに提示される値に基づいた前記断片についてのw値の割り当てを含む。
一実施態様では、Nctarget値は、(従前の手法におけるように)GC補正ステップに供され、サンプル中のこの染色体からの断片の存在の正規化された測定値が算出される；これは、すべての常染色体に対するカウントされた断片の比率を形成することによって標的染色体ctargetについて行われる(この比率は、すべての常染色体について算出されるNc値の合計に対するものである；これらのNc値もまた、GC補正ステップに供されている)。
この比、すなわち、ステップ(v)での「常染色体比」の算出は、Rctarget値の算出と呼ばれる：
この常染色体比は、次に、ステップ(vi)において算出される最終テスト結果を生み出すためのトリソミーの確率を概算する統計的モデルへのインプットとして使用される。
表A: 各断片のサイズ加重値
表A: 各断片のサイズ加重値
妊娠中の女性の胎盤又は胎盤群を起源とする(及びそれゆえ、大多数の症例において胎児又は胎児群の核型を反映する)セルフリーDNA断片のサイズ分布は、妊娠中の女性自体を起源とする(すなわち、胎盤以外の組織からの)断片のそれとは有意に相違するプロフィールに従うことが知られている。この現象は本発明の方法において活用される。
断片サイズプロフィールのこれらの公知の相違を利用して、これらが母体の核型よりも胎児の核型を反映するより高い確率を有する場合は染色体比計算のために優先的に断片を加重し、反対に、胎盤以外の母体組織を起源とするより高い確率を有する断片の寄与を弱めることも可能である。
サイズ加重化の具体的で非限定的な一方法は、以下のように記載される：
方法
以下の静的データ項目を、ソフトウェアのコンフィギュレーションデータに含める必要がある：
・ 断片サイズカウント加重化マップ、w[s]、ここで、sは、包括的範囲CountWeightFragSizeMin(smin)〜CountWeightFragSizeMax(smax)における整数の断片サイズ値である。この範囲限界は、コンフィギュレーションデータの一部として特定されるためにも必要である。加重化マップ値は、(IEEE-754:1985によって定義されるように)「シングル精度」フォーマットのそれと同等又はそれ以上の精度を有する実数タイプに保存されるべきである。
・ 各断片のサイズ加重化有効化/無効化フラグ(ブール)、CountWeightFragSizeEnable。
・ 「ミッシング断片サイズ」操作(列挙された)、CountWeightFragSizeMissingAction。これは、Ignore（無視）又はIntegrate（統合）の値をとり得る。
以下の静的データ項目を、ソフトウェアのコンフィギュレーションデータに含める必要がある：
・ 断片サイズカウント加重化マップ、w[s]、ここで、sは、包括的範囲CountWeightFragSizeMin(smin)〜CountWeightFragSizeMax(smax)における整数の断片サイズ値である。この範囲限界は、コンフィギュレーションデータの一部として特定されるためにも必要である。加重化マップ値は、(IEEE-754:1985によって定義されるように)「シングル精度」フォーマットのそれと同等又はそれ以上の精度を有する実数タイプに保存されるべきである。
・ 各断片のサイズ加重化有効化/無効化フラグ(ブール)、CountWeightFragSizeEnable。
・ 「ミッシング断片サイズ」操作(列挙された)、CountWeightFragSizeMissingAction。これは、Ignore（無視）又はIntegrate（統合）の値をとり得る。
方法は、任意のユニーク断片アラインメント事象について、以下のように進行し、カウント増分uを生成する。
CountWeightFragSizeEnableが偽である場合、加重操作は行われず、すなわち、
u＝1
。
CountWeightFragSizeEnableが偽である場合、加重操作は行われず、すなわち、
u＝1
。
CountWeightFragSizeEnableが真である場合、カウント増分は断片サイズ及び加重化マップを参照して以下のように生成される。
最初に、カウント当たりの累積値を初期化する：
W←0
Ncontrib←0
。
最初に、カウント当たりの累積値を初期化する：
W←0
Ncontrib←0
。
次に、シングルカウント事象に圧縮された(すなわち、アラインメントの後に重複であると考えられた)リードのセットにおける各リードについて、
1. 断片サイズ測定値(s)を得るための試みを行う。これを得る精密な方式は、使用する特定のシークエンシングプラットフォームに依存するが、例えば、シングルエンド形シークエンシングプロトコールを用いるThermo Fisher Ion Torrent ファミリーシークエンシングシステムの場合には、Basecaller BAMファイルにリードと共に保存してもよいZAタグの含量か、又はペアエンド形シークエンシングプロトコールが使用された場合、配列アラインメントステップから抽出された値であり得る。当業者は、多数の他の可能な機構がサイズ値を得るために存在し得ること、方法は使用中のシークエンシングプラットフォーム及びプロトコールに適合させ得ることを理解するであろう。sの値が得られる場合、それを加重マップで調べる試みをする：その値sが加重マップ境界内(すなわち、smin≦s≦smax)である場合、カウント当たりの累積値は以下のように更新される：
W←W＋w[s]
Ncontrib←Ncontrib＋1
。
W←W＋w[s]
Ncontrib←Ncontrib＋1
。
あるいは、s＜smin又はs＞smaxの場合、累積値は更新されない。
2. ZAタグがリードに関連しなかった場合、とられる動作は以下のようにCountWeightFragSizeMissingActionの値に依存する：
a. CountWeightFragSizeMissingActionがIntegrateの値をとる場合、断片(l)についてのシークエンシングリードの長さが、サイズ範囲の下限境界として使用され、その範囲の上限境界はCountWeightFragSizeMaxである。統合された加重が、サイズ範囲にわたって平均することにより次に算出され、累積値が更新される：
b. CountWeightFragSizeMissingAction がIgnoreの値をとる場合、その断片は捨てられ、累積値は更新されない。
カウント事象に寄与するすべてのリードが考慮され終えたら、次に、カウント増分が以下のように生成される：
uに対して最終的に決定された値は、整列することが見いだされた染色体の累積整列断片カウント（Nc）に最後に加算される。この方法で決定された、累積され、加重された整列断片カウントは、従来の手法におけるように、GC含量に応じた補正に供され、次に、補正された値が、トリソミー可能性モデル(Rin値)、胎児画分概算(Rx)及び性別決定(Rx及び場合によりRYも)へのインプットのために常染色体及び他の染色体の比の計算に使用される。これには一つの例外がある：Run Control妥当性チェックの一部として使用されるべき染色体比は、断片サイズに従った加重化の対象とするべきではない(しかし、それでもGC補正の対象とはするべきである)。
常染色体又は染色体断片のカウントが、常染色体又は他の染色体比の計算以外の任意の目的のために使用されるべき場合には、このカウントは、断片サイズに従った加重化の対象とするべきではない。
比の算出
本明細書に定義した断片アラインメント分析に従って、ヒットの総数が所定の染色体に割り当てられたら、典型的には、次にヒットを共通の数に正規化する。1以上のリファレンス染色体に対するヒットと比較した標的染色体の標的領域についての各ヒットの比を、次にシンプルな数学に従って算出する。
本明細書に定義した断片アラインメント分析に従って、ヒットの総数が所定の染色体に割り当てられたら、典型的には、次にヒットを共通の数に正規化する。1以上のリファレンス染色体に対するヒットと比較した標的染色体の標的領域についての各ヒットの比を、次にシンプルな数学に従って算出する。
先に言及したとおりの共通の数への正規化に加えて、典型的には、胎児起源である母体血漿DNAの割合を概算できることが有用である。これによって、母体血漿DNAのサンプル中に、胎児の染色体異常を検出するのに十分な胎児DNAが存在することが確認されることとなる。例えば、一実施態様では、本発明の方法は、サンプル内の胎児DNAの量に基づいて、マッチしたヒットの数を正規化又は調整するステップを付加的に含む。
統計的有意性
本発明の診断テストを統計基準に準拠させるために、本発明の方法は、他の染色体に対するヒットと比較した場合の標的染色体の標的領域についての各ヒットの比の統計的有意性を算出するステップを付加的に含む。一実施態様では、統計的有意性のテストは、低減したカウントデータの従来の統計的分析によるｚ−スコアの算出を含む。しかし、他の統計的方法も適用することができるということを、当業者は理解するであろう。
本発明の診断テストを統計基準に準拠させるために、本発明の方法は、他の染色体に対するヒットと比較した場合の標的染色体の標的領域についての各ヒットの比の統計的有意性を算出するステップを付加的に含む。一実施態様では、統計的有意性のテストは、低減したカウントデータの従来の統計的分析によるｚ−スコアの算出を含む。しかし、他の統計的方法も適用することができるということを、当業者は理解するであろう。
カウント比「標的染色体/1以上のリファレンス染色体」におけるエラーの分布が、ほぼ正規であると仮定される場合、ｚ−スコアは、エレメントの平均からの標準偏差がいくつであるかを示す。
ｚ−スコアは、以下の式から算出することができる:
ｚ＝（Ｘ−μ）／σ
ｚ＝（Ｘ−μ）／σ
式中、ｚはｚ−スコアであり、Xはエレメントの値であり、μは集団平均であり、σは、集団値の標準偏差である。本発明に従って21トリソミーの存在についてテストする場合、カウント比についての2.0以上のｚ−スコア値は、カウント比値が21トリソミー妊娠を示す約98％の確率を示す。
一実施態様では、ステップ(e)は、標的染色体についての胎児の染色体異常の徴候であり、かつ、典型的には、胎児画分、上述のｚ−スコアなどの多数の因子に基づいている尤度比の算出を含む。尤度比をどのようにして算出し得るかの完全な詳細は、WO 2014/033455に記載されている。
性別を予測する方法
胎児の父親から遺伝する、Y染色体DNAの存在は、男性胎児の診断マーカーである。本発明のさらなる態様は、Y染色体配列の存在によって示される、胎児の性別の検出である。
胎児の父親から遺伝する、Y染色体DNAの存在は、男性胎児の診断マーカーである。本発明のさらなる態様は、Y染色体配列の存在によって示される、胎児の性別の検出である。
胎児が女児である場合、Y染色体成分の使用は除外されるが、父親から遺伝するY染色体の代わりに、父親由来である遺伝子アレルを検出することが可能である。これらのうちの一つは、母体血漿DNAにおけるDNA配列の微量成分として存在するアレルとして明白である胎児SNP(一塩基多型)である(Dhallanらの文献、Lancet 369,474-481)。本発明がそうであるように、胎児ゲノムのある割合のみがシークエンシングされる場合、胎児の父親から遺伝する、かつ比較的に豊富な母体アレルとは異なるバリアントとして検出される、こうしたアレルの数は、胎児性である血漿DNAの割合の関数である。これによって、胎児起源である母体血漿DNAの割合を概算するための、性別に依存しない代替方法が提供される。
本発明の第2の態様によれば、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法であって:
(a) 妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1) 最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2) ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c) 性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d) 前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e) 前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
(a) 妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1) 最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2) ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c) 性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d) 前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e) 前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
言及してもよい本開示のさらなる態様によれば、妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法であって:
(a) 妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b) 約80bp〜約150bpのサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c) 性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d) 第1の数及び第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e) 前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
(a) 妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b) 約80bp〜約150bpのサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c) 性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d) 第1の数及び第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e) 前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む方法が提供される。
一実施態様では、方法は、付加的に：
(i) 性染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii) 1以上のリファレンス染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii) ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv) ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v) ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi) 1以上の前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む。
(i) 性染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii) 1以上のリファレンス染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii) ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv) ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v) ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi) 1以上の前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む。
本明細書において性染色体、すなわち異質染色体（allosome）へのリファレンスは、X又はY染色体のいずれかを含む。
実施態様において、リファレンス染色体は、常染色体(すなわち、非性染色体)から選択される。
前記リファレンス染色体と比較してX染色体に整列する過剰の断片は、女性の性別予測(すなわち、XX)の徴候であることは理解されるであろう。
前記リファレンス染色体と比較してX染色体に整列する等価の断片は、男性の性別予測(すなわち、XY)の徴候であることは理解されるであろう。
Y染色体に整列する断片の存在は、男性の性別予測(すなわち、XY)の徴候であることは理解されるであろう。
Y染色体に整列する断片の非存在は、男性の性別予測(すなわち、XX)の徴候であることは理解されるであろう。
本発明の第1の態様に適用される実施態様の各々が、本発明の第2の態様の性別予測方法に等しく適用されることは理解されるであろう。
キット
本発明のさらなる態様によれば、本明細書において記載される任意の方法に従ったキットの使用のための指示を含む、本明細書において記載される任意の方法を実施するためのキットが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書において記載される任意の方法に従ったキットの使用のための指示を含む、本明細書において記載される任意の方法を実施するためのキットが提供される。
一実施態様では、キットは、本明細書において定義される1以上の試薬及び／又は1以上の消耗品を付加的に含む。
本発明のさらなる態様によれば、妊娠中の女性被験者内の胎児の染色体異常を検出する方法、又は妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法における、本明細書において定義されるキットの使用が提供される。
以下の研究は本発明を説明する。
（材料及び方法）
本明細書において記載される方法は、http://www.premaitha.com/the-iona-testで見ることができるIONA(登録商標)テストを使用して実行してもよいことは理解されるであろう。しかし、以下の詳細なプロトコールは、本発明の方法をどのようにして実施することができるかに関してのガイダンスを提供する。
本明細書において記載される方法は、http://www.premaitha.com/the-iona-testで見ることができるIONA(登録商標)テストを使用して実行してもよいことは理解されるであろう。しかし、以下の詳細なプロトコールは、本発明の方法をどのようにして実施することができるかに関してのガイダンスを提供する。
材料
IONA(登録商標) Library Preparation Kitで提供される試薬に加えて、手動プロトコールを使用するDNAライブラリー調製のために以下のものが必要である：
＞ フリーザー
＞ 冷蔵庫
＞ ピペット
＞ ピペットチップ
＞ 50mLチューブ
＞ ボルテックス（Vortex）
＞ プレート遠心機
＞ 微量遠心機、0.2mL及び1.5mLチューブに使用するのに好適なもの
＞ 微量遠心チューブ− 0.2mL及び1.5mL、低DNA結合能
＞ 磁性ラック/プレート
＞ サーマルサイクラー、96ウェルPCRプレートに使用するのに好適なもの
＞ ヌクレアーゼ無含有水
＞ 分子生物学等級エタノール
＞ Bioanalyser機器、例えば、Perkin Elmer LabChip(登録商標) GX, Agilent 2100 Bioanalyser(登録商標)
＞ Bioanalyser(登録商標)試薬、例えば、HT DNA 1K/ 12K/ High Sensitivity LabChip(登録商標)及びHT DNA Hi Sensitivity Reagent Kit(カタログ番号760517 & CLS760672; Perkin Elmer) Agilent High Sensitivity DNA Analysis Kit(カタログ番号5067-4626; Agilent Technologies)
IONA(登録商標) Library Preparation Kitで提供される試薬に加えて、手動プロトコールを使用するDNAライブラリー調製のために以下のものが必要である：
＞ フリーザー
＞ 冷蔵庫
＞ ピペット
＞ ピペットチップ
＞ 50mLチューブ
＞ ボルテックス（Vortex）
＞ プレート遠心機
＞ 微量遠心機、0.2mL及び1.5mLチューブに使用するのに好適なもの
＞ 微量遠心チューブ− 0.2mL及び1.5mL、低DNA結合能
＞ 磁性ラック/プレート
＞ サーマルサイクラー、96ウェルPCRプレートに使用するのに好適なもの
＞ ヌクレアーゼ無含有水
＞ 分子生物学等級エタノール
＞ Bioanalyser機器、例えば、Perkin Elmer LabChip(登録商標) GX, Agilent 2100 Bioanalyser(登録商標)
＞ Bioanalyser(登録商標)試薬、例えば、HT DNA 1K/ 12K/ High Sensitivity LabChip(登録商標)及びHT DNA Hi Sensitivity Reagent Kit(カタログ番号760517 & CLS760672; Perkin Elmer) Agilent High Sensitivity DNA Analysis Kit(カタログ番号5067-4626; Agilent Technologies)
注： 手動ライブラリー調製プロトコールのために96ウェルプレートマグネットを使用する場合、IONA(登録商標) Plastics Consumables Kitで提供される消耗品を使用することができる。
DNA抽出
IONA(登録商標)テストは、分析のためのインプットサンプルとして、全血の血漿画分から由来するセルフリーDNA(cfDNA)を利用する。IONA(登録商標)テストワークフローにおける使用について手動DNA抽出プロトコールを実施する場合、血漿からのcfDNAの抽出において使用するために検証されたDNA抽出キットを使用しなければならない。
IONA(登録商標)テストは、分析のためのインプットサンプルとして、全血の血漿画分から由来するセルフリーDNA(cfDNA)を利用する。IONA(登録商標)テストワークフローにおける使用について手動DNA抽出プロトコールを実施する場合、血漿からのcfDNAの抽出において使用するために検証されたDNA抽出キットを使用しなければならない。
サンプル処理は、DNA抽出キット製造業者によって提供された指示に従って、又は当業者に公知の確立された手順に従って、実施すべきである。
DNAライブラリー調製
IONA(登録商標)テストにおけるDNAライブラリー調製のための手動プロトコールは、IONA(登録商標)Library Preparation Kitにおいて提供される試薬を利用する。サンプルのバッチ処理は、IONA(登録商標)Library Preparation Kitについて手動プロトコールを使用する場合は、自動化されたプロトコールと比較して低減したサンプル処理量（スループット）を回避するために推奨される。
IONA(登録商標)テストにおけるDNAライブラリー調製のための手動プロトコールは、IONA(登録商標)Library Preparation Kitにおいて提供される試薬を利用する。サンプルのバッチ処理は、IONA(登録商標)Library Preparation Kitについて手動プロトコールを使用する場合は、自動化されたプロトコールと比較して低減したサンプル処理量（スループット）を回避するために推奨される。
1. DNAを、フリーザーから取り出し(必要であれば)、周囲温度(15〜25℃)で30分間解凍する。
2. IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1を、フリーザーから取り出し、周囲温度(15〜25℃)で30分間解凍する。
3. IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 2を、冷蔵庫から取り出し、最低30分間、周囲温度(15〜25℃)に平衡化する。
4. IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1及び2を、プレート遠心機で5秒間パルス遠心し、試薬をプレートの底に集める。
注： IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 2は、後続のステップで必要になるまで実験台上に周囲温度に置く。
5. IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1及び2の試薬レイアウトを、以下に表1及び2に記載する。
表1:IONA(登録商標)テストプレート１のプレートレイアウト
＊ IONA Library Preparation Kit HTは126μLを含有する。
表２:IONA(登録商標)テストプレート２のプレートレイアウト
6. テストのための51μLの各DNAサンプルを、確認されたサーマルサイクラーに好適な個別の微量遠心チューブ中又は96ウェルプレート中に調製する。
7. IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1(表2)のカラム1のEnd Repair Buffer I及び位置A2のEnd Repair Enzyme Iを、ピペットで10回上下させることにより混合する。注： 使用すべきいかなる試薬についても十分にこれを実施することが重要である。
8. 反応を調製するために、各サンプルに、以下の容量のEnd Repair反応の各試薬を添加する。
表３:End Repair 反応容量
注： 複数のDNAサンプルをテストする場合には、End Repair試薬のマスターミックスを、このステップのために調製することができる。少なくとも1反応の余剰が推奨される。IONA(登録商標) Library Preparation Kitを使用してテストすることができるサンプルの数は、この方法を使用する場合は低減し得る。
9. 各サンプルについて、End Repair反応をピペットで10回上下させて混合し、適切な卓上遠心機を使用して5秒間パルス遠心する。
10. IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1を、Adaptor Ligation反応のために必要となるまで、冷蔵庫に保存する。
11. 各サンプルチューブ(又は96ウェル反応プレート)をサーマルサイクラーに移し、End Repair反応を実施する。サーマルサイクラーを、以下のサイクル条件に設定し、End Repair反応を実行する：
表４:End Repair 温度サイクル
12. End Repair反応が完了したら、Adaptor Ligation反応の調製のために、サンプルをサーマルサイクラーから実験台上へ移す。
13. IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1を冷蔵庫から取り出す。IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1(表2)のカラム3のAdaptor Ligation Buffer I(ALB I)、カラム4のAdaptor Ligation Enzyme I(ALE I)、及び位置A5のAdaptor Ligation Enzyme II(ALE II)を、ピペットで10回上下させて混合する。
注： 使用しようとするいかなる試薬についても、十分にこれを実施すること。
14. 以下の容量のAdaptor Ligation反応の各試薬を、End Repair反応からの各サンプルに直接添加する:
表５:End Repair 温度サイクル
注： 複数のDNAサンプルをテストする場合には、End Repair試薬のためのマスターミックスを、このステップのために調製することができる。少なくとも1つの反応の余剰が推奨される。IONA(登録商標) Library Preparation Kitを使用してテストすることができるサンプルの数は、この方法を使用する場合は低減し得る。
15. IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1(表2)のカラム6〜9のバーコードアダプターをピペットで10回上下させて混合する。
注： 適切な数の調製するサンプルについてこれを実施する。1サンプルにつき1つのバーコードアダプターを使用すること。
16. 8μLの、適切なサンプルに割り当てられたバーコードアダプターを、そのサンプルについてのAdaptor Ligation反応に添加する。Adaptor Ligation反応の容量は100μLである。
注： 各サンプルは後続のステップでその個別のバーコードに従って分析されることになるため、各サンプルについて使用されるバーコードアダプターの番号(表2;カラム6〜9)を記録しなければならない。
17. 各サンプルについて、Adaptor Ligation反応をピペットで10回上下させて混合し、適切な卓上遠心機を使用して5秒間パルス遠心する。
18. IONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 1を、Library PCR反応に必要とされるまで、冷蔵庫に保存する。
19. 各サンプルを確認されたサーマルサイクラーに移し、Adaptor Ligation反応を実施する。サーマルサイクラーを、以下のサイクル条件に設定し、Adaptor Ligation反応を実行する：
表６:アダプターライゲーションサイクル
注：反応のための容量が100μLに設定されていることを確保する。
20. Adaptor Ligation反応が完了したら、Adaptor Ligation反応のクリーンアップのために、サンプルをサーマルサイクラーから実験台上に移す。
21. (必要であれば)各サンプルを、サンプルクリーンアップのために利用可能な磁性プレート/ラックでの使用のために適切な容器に移す。
22. 40mLの100％エタノールを10mLのヌクレアーゼ無含有水と混合することにより、80％エタノールの溶液(合計容量50mL)を調製する。
23. 周囲温度(15〜25℃)で保存されたIONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 2(表3)中のビーズを、ピペットで25回上下させて混合する。
注： これを、ビーズを採取するあらゆるウェルに実施する。ビーズの適当な混合が重要である。
24. 100μLのビーズを、Adaptor Ligation反応からの各サンプルに直接添加し、ピペットで10回上下させて混合する。
25. 各サンプルを周囲温度(15〜25℃)で5分間インキュベートする。
26. サンプルを、適切な卓上遠心機で5秒間、パルス遠心する。
27. (1.5mLチューブ又は96ウェルプレート中の)サンプルを、磁性プレート/ラックに2分間移す。
28. サンプルを磁性プレート/ラック上に保持する一方、上清を除去し捨てる。ペレットを壊さないように注意する。
29. 各サンプルに80％エタノールを添加する。ビーズペレット全体が浸漬することを確保する。
注： 96ウェルプレートを使用する場合、200μLの80％エタノールが推奨される。1.5mLチューブを使用する場合、500μLの80％エタノールが推奨される。
30. 各サンプルを80％エタノール中で30秒間インキュベートする。
31. サンプルを、磁性プレート/ラック上に保持する。上清を除去し、捨てる。ペレットを壊さないように注意する。
32. ステップ29〜31を繰り返す。
33. 各サンプルを、磁性プレート/ラック上で周囲温度(15〜25℃)で5分間風乾する。
注： 1.5mLチューブを使用する場合、チューブのキャップが開いていることを確保する。
34. 各サンプルを磁性プレート/ラックから降し、43μLのヌクレアーゼ無含有水中にビーズペレットを再懸濁する。
注： すべてのビーズが懸濁液中にあることを確保する。ビーズペレット全体を回収するために、磁石に対してビーズが保持されたプレートウェル/チューブの側面に沿ってピペッティングする。
35. 各サンプルを、周囲温度(15〜25℃)で3分間インキュベートする。
36. サンプルを、適切な卓上遠心機で5秒間、パルス遠心する。
37. サンプルを、磁性プレート/ラックに2分間移す。
38. 40μLの上清を、ライブラリーPCRのために新鮮なプレートウェル/チューブに移す。
39. IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1を、冷蔵庫から取り出す。IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1の位置10A/B中のPCR Primer Mix I、及びカラム11及び12中のPCR Master Mix Iをピペッティングする。
40. ピペットで10回上下させて混合する。
注： これを、使用すべきあらゆる試薬ウェルについて実施する。
41. 以下の容量のLibrary PCR反応の各試薬を、Adaptor Ligation反応のクリーンアップからの各サンプルに直接添加する。
表７
注： 複数のDNAサンプルをテストする場合には、Library PCR 試薬のためのマスターミックスを、このステップのために調製することができる。少なくとも1つの反応の余剰が推奨される。IONA(登録商標) Library Preparation Kitを使用してテストすることができるサンプルの数は、この方法を使用する場合、低減し得る。
42. 各サンプルについて、Library PCR反応をピペットで10回上下させて混合し、適切な卓上遠心機を使用して5秒間パルス遠心する。
注： IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 1を、保存のためにフリーザーに戻す。
43. 各サンプルをサーマルサイクラーに移し、Library PCR反応を実施する。サーマルサイクラーを、以下のサイクル条件に設定し、Library PCR反応を実行する：
表８
注：反応のための容量が100μLに設定されていることを確保する。
44. Library PCR反応が完了したら、ライブラリー定量のために、サンプルをサーマルサイクラーから実験台上に移す。
注： PCR増幅したライブラリーは、フリーザー(−15〜−25℃)中に保存することができ、ワークフローは20営業日以内に完了することができる。IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 2は、必要とされるまで保存のために冷蔵庫に戻す。
注： PCR増幅したライブラリーは、フリーザー(−15〜−25℃)中に保存することができ、ワークフローは20営業日以内に完了することができる。IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 2は、必要とされるまで保存のために冷蔵庫に戻す。
注： フリーザー(−15〜−25℃)中でのPCR増幅したライブラリーの保存後にこのポイントからワークフローを開始する場合、後続するステップに先立って、ライブラリーを30分間解凍する。IONA(登録商標)Library Preparation Kit Plate 2は、後続するステップのために冷蔵庫での30分間の保存から取り出すことを確認する。
45. DNAアナライザープラットフォーム(例えば、Perkin Elmer LabChip(登録商標) GX, Agilent 2100 Bioanalyser(登録商標))を使用して、サンプルライブラリーの各々について、製造業者の指示に従って定量を実施する。
注： PCR増幅されたライブラリーは、濃縮され過ぎて、ある種のDNAアナライザープラットフォームでは希釈せずに実行できない可能性がある。定量すべき各ライブラリーの1/5希釈を調製することが推奨される。
注： 各ライブラリーの濃度は、シークエンシングに先立って、後続の正規化及び多重化のためにモル濃度で記録しなければならない。必要とされる場合、希釈係数について濃度を補正する。
注： 定量される任意のライブラリーの濃度が、使用されるDNAアナライザープラットフォームの検出限界内であることを確保する。
46. 以下のステップを使用して、サイズ選択に先立ってサンプルの正規化及び多重化を実施する。8個までのサンプルを、単一の実行においてシークエンシングのために多重化することができる。同じバーコードアダプター番号を有するサンプルライブラリーを、同じ多重化プールに添加しないことを確保する。
47. 8個までのサンプル及び定量からのそれらの相当する濃度(モル濃度;nM)を選択する。最低濃度を有するサンプルを同定する―この値は、すべてのサンプルを正規化することになる標的濃度である。
48. プールされるべき各サンプルについて以下の計算を使用して、ライブラリーの多重化に必要とされる容量を決定する：
サンプルライブラリー容量：
標的濃度(nM)×20μLサンプルライブラリー濃度(nM)
標的濃度(nM)×20μLサンプルライブラリー濃度(nM)
水容量:
20μL−サンプルライブラリー容量
20μL−サンプルライブラリー容量
例えば、サンプル5＝最低濃度＝標的濃度
例において下線を付した容量は添加すべき最終容量を示す。
例において下線を付した容量は添加すべき最終容量を示す。
表９
49. 1.5mLチューブ中で、水、及び多重化されるべきすべてのサンプルの正規化について算出されたサンプルライブラリー容量を一緒にする。
注： 最小容量100μLのプールされたサンプルが、後続のステップに必要となる。多重化されるべきものが5サンプルより少ない場合、上記の計算に示された20μL容量は、必要に応じて増大することができる。
サイズ選択を使用する富化(Ranger Technology（商標）を使用する)
準備
− サンプルのために適切なDual-Dye Loading Buffer(ローディング容量に依存する)及びアガロースカセットを選択する。
− Dual-Dye Loading Buffer及びサンプルを、単一の0.2ml微量遠心チューブ中で一緒にする。
− サイズ選択(28.5μｌ容量)：3.5μｌローディングバッファー＋25μｌサンプル
− サイズ選択(50μｌ容量)：6μｌローディングバッファー＋44μｌサンプル
− ピペットで混合し、チューブを遠心して下に集める。
− 以下のものを使用してカセットをプライムし較正する：
− 28.5μｌ容量カセット＝15μｌ(ローディングウェル)＋75μｌ(抽出ウェル)の[TBE]
− 50μｌ容量カセット＝25μｌ(ローディングウェル)＋75μｌ(抽出ウェル)の[TBE]
− カセットをデッキに置く
− ソフトウェアを開始する
− プロンプトが表示されたら、クリーニングステップをスキップする
− ローディング容量にかかわらず、4×50μｌ抽出をプロンプトし、抽出ウェルから抽出する。
準備
− サンプルのために適切なDual-Dye Loading Buffer(ローディング容量に依存する)及びアガロースカセットを選択する。
− Dual-Dye Loading Buffer及びサンプルを、単一の0.2ml微量遠心チューブ中で一緒にする。
− サイズ選択(28.5μｌ容量)：3.5μｌローディングバッファー＋25μｌサンプル
− サイズ選択(50μｌ容量)：6μｌローディングバッファー＋44μｌサンプル
− ピペットで混合し、チューブを遠心して下に集める。
− 以下のものを使用してカセットをプライムし較正する：
− 28.5μｌ容量カセット＝15μｌ(ローディングウェル)＋75μｌ(抽出ウェル)の[TBE]
− 50μｌ容量カセット＝25μｌ(ローディングウェル)＋75μｌ(抽出ウェル)の[TBE]
− カセットをデッキに置く
− ソフトウェアを開始する
− プロンプトが表示されたら、クリーニングステップをスキップする
− ローディング容量にかかわらず、4×50μｌ抽出をプロンプトし、抽出ウェルから抽出する。
ソフトウェア
− Ranger Softwareを開く
− 適切なデッキレイアウトを選択する(File＞New＞Run＞)
− ソースプレートの内容を定義する(ソースプレート画像をクリックする)
− 各カセットのアガロースタイプを定義する(各カセットを完全に囲い（lasso）、次に右クリックしてゲルタイプを選択する)
− サンプルタイプマネージャー；100〜300bpマーカー、標的塩基対範囲(205〜227bp)を特定、100％スピード。
− カセットのアガロースパーセンテージタイプ、例えば、2％、3％、を定義する
− デッキを視覚的に検査し、機器のドアを閉める。
− ソフトウェアの「Start」ボタンをクリックし、実行を開始する。
− 実行の間中、画面上のプロンプトに従い、適切な洗浄及び抽出を完了する。
Ranger Technology（商標）の実行を完了し、サンプルを取り出す。
− Ranger Softwareを開く
− 適切なデッキレイアウトを選択する(File＞New＞Run＞)
− ソースプレートの内容を定義する(ソースプレート画像をクリックする)
− 各カセットのアガロースタイプを定義する(各カセットを完全に囲い（lasso）、次に右クリックしてゲルタイプを選択する)
− サンプルタイプマネージャー；100〜300bpマーカー、標的塩基対範囲(205〜227bp)を特定、100％スピード。
− カセットのアガロースパーセンテージタイプ、例えば、2％、3％、を定義する
− デッキを視覚的に検査し、機器のドアを閉める。
− ソフトウェアの「Start」ボタンをクリックし、実行を開始する。
− 実行の間中、画面上のプロンプトに従い、適切な洗浄及び抽出を完了する。
Ranger Technology（商標）の実行を完了し、サンプルを取り出す。
200μLのサイズ選択したサンプルライブラリーを、Ranger Technology（商標）から移す。2×100μｌの反応に分割し、各々を、サンプルのクリーンアップのために700μｌのビーズと混合する。
周囲温度(15〜25℃)で保存されたIONA(登録商標) Library Preparation Kit Plate 2中のビーズを、ピペットで25回上下させて混合する。
注： これを、使用すべきあらゆる試薬ウェルについて実施する。
表１０:IONA(登録商標)テストプレート２のプレートレイアウト
サンプルを、周囲温度(15〜25℃)で5分間インキュベートする。
サンプルを、適切な卓上遠心機で5秒間パルス遠心する。
サンプルを、磁性プレート/ラックに2分間移す。
サンプルを磁性プレート/ラックに保持しながら。上清を除去し、捨てる。ビーズペレットを壊さないように注意する。
80％エタノールをサンプルに添加する。ビーズペレット全体が浸漬されることを確保する。
注： 96ウェルプレートを使用する場合、200μLの80％エタノールが推奨される。1.5mLチューブを使用する場合、500μLの80％エタノールが推奨される。
サンプルを、80％エタノール中で30秒間インキュベートする。
サンプルを磁性プレート/ラックに保持しながら。上清を除去し、捨てる。ビーズペレットを壊さないように注意する。
ステップ56〜58を繰り返す。
サンプルを、磁性プレート/ラック上で周囲温度(15〜25℃)で5分間風乾する。
注： 1.5mLチューブを使用する場合、チューブキャップが開いていることを確保する。
サンプルを磁性プレート/ラックから取り出し、ビーズペレットを18μLのヌクレアーゼ無含有水に再懸濁する。
注： すべてのビーズが懸濁液中にあることを確保する。ビーズペレット全体を回収するために、ビーズが磁石に対して保持されていたプレートウェル/チューブの側面に沿ってピペッティングする。
サンプルを、周囲温度(15〜25℃)で3分間インキュベートする。
サンプルを、適切な卓上遠心機で5秒間パルス遠心する。
サンプルを、磁性プレート/ラックに2分間移す。
2×15μLの上清を、新鮮なプレートウェル/チューブに移す。
DNAアナライザープラットフォーム(例えば、Perkin Elmer LabChip(登録商標)GX, Agilent 2100 Bioanalyser(登録商標))を使用して、サイズ選択された、多重化されたサンプルの定量を、製造業者の指示に従って実施する。
注： サイズ選択された、多重化されたサンプルは、DNAアナライザープラットフォーム上で希釈せずに実行してもよい。サンプルの濃度が、使用されているDNAアナライザープラットフォームの検出限界内であることを確保する。サンプルは、必要に応じて希釈し、再定量してもよい。
注： 各ライブラリーの濃度は、シークエンシングのための後続の希釈のためにモル濃度で記録しなければならない。必要とされる場合、濃度を、希釈係数について補正する。
DNAアナライザーからのサイズ選択された、多重化サンプルプールについて決定された濃度を使用して、使用されるべき次世代シークエンシングプラットフォームについて必要とされるインプット濃度への希釈を実施する。
IONA(登録商標)テストは、最終のサイズ選択された、多重化サンプルプールについて40pM(Ion PI V2チップを使用する場合は50pM)のインプット濃度を使用して、 Ion Chef（商標）機器及びIon Proton（商標）次世代シークエンシングプラットフォーム(Thermo Fisher)を使用して検証されている。以下の計算を使用して、サンプル希釈に必要とされる容量を決定する：
サンプルライブラリー容量：
標的濃度＝40pM(又は50pM) × (120μL) × サンプルライブラリーに必要なμL
Sample Library濃度
標的濃度＝40pM(又は50pM) × (120μL) × サンプルライブラリーに必要なμL
Sample Library濃度
Run Control 1/25調製：
2μL Stock Run Control＋48μL水＝50μLの1/25 Run Control
2μL Stock Run Control＋48μL水＝50μLの1/25 Run Control
シークエンシングのためのサンプル調製：
サンプルライブラリーに必要なx μL ＋22.2μL 1/25 Run Control
水で120μLの合計容量の最終容量にする。
サンプルライブラリーに必要なx μL ＋22.2μL 1/25 Run Control
水で120μLの合計容量の最終容量にする。
注： この希釈は、使用すべき次世代シークエンシングプラットフォームのための反応準備の直前に実施することが推奨される。
注： 可能性がある凍結/解凍サイクルの影響は低濃度のDNAにはより悪いものであるため、希釈された多重化されたサンプルを凍結することは避ける。シークエンシングのための反応準備の前の24時間までの冷蔵庫における希釈されたサンプルの保存は実施してもよい。
次世代シークエンシング反応準備
次世代シークエンシング反応は、半自動化又は全自動化されたプロトコールを使用して実施することができる。
次世代シークエンシング反応は、半自動化又は全自動化されたプロトコールを使用して実施することができる。
IONA(登録商標)テストは、Ion Chef（商標）機器及びIon Proton（商標）次世代シークエンシングプラットフォーム(Thermo Fisher)を使用して検証されている。この自動DNAライブラリープロトコールのためのワークフローを以下に記載する。
注： 代替的なプロトコールについては、製造業者のプロトコールに従ってサンプルを調製する。
以下の消耗品は、Ion Chef（商標）及びIon Proton（商標）機器を使用する次世代シークエンシングのために必要とされる：
＞ Ion PI V2 BCのIon PI Chip Kit V3(カタログ番号A26771又は4484270; Thermo Fisher)
＞ Ion PI Hi-Q Chefキット又はIon PI IC 200 Kit(カタログ番号A27198又は4488377; Thermo Fisher)
＞ 水酸化ナトリウム溶液(例えば、カタログ番号10488790; Fisher Scientific)
Ion PI V2 BCチップ(例えば、カタログ番号11388461; Fisher Scientific)を使用する場合は、イソプロパノール、分子生物学等級
＞ Ion PI V2 BCのIon PI Chip Kit V3(カタログ番号A26771又は4484270; Thermo Fisher)
＞ Ion PI Hi-Q Chefキット又はIon PI IC 200 Kit(カタログ番号A27198又は4488377; Thermo Fisher)
＞ 水酸化ナトリウム溶液(例えば、カタログ番号10488790; Fisher Scientific)
Ion PI V2 BCチップ(例えば、カタログ番号11388461; Fisher Scientific)を使用する場合は、イソプロパノール、分子生物学等級
Ion Chef（商標）及びIon Proton（商標）プラットフォームのための自動プロトコールを使用する、次世代シークエンシング実行は、IC 200 KitユーザーガイドのIon PI（商標） Hi-Q Chefに概要を述べられているプロトコールに従って実施する。
既に調製済でない場合、テストすべきサイズ選択された、多重化されたサンプルを、手動ライブラリー調製プロトコールのステップ88に記載される、必要とされるインプット濃度に希釈する。
製造業者の指示に従って、実施すべきIon Chef（商標）/Ion Proton（商標）実行を計画する。
注： 実行準備中のシークエンシングチップ上のバーコードのスキャンニングは、正しい多重化されたライブラリーサンプルプールを正しいチップとの対にするために実施する。サンプルIDとの適切なアダプターバーコードの割り当ては、IONA(登録商標) Analysisソフトウェアによって実施する。
注： 代替的な次世代シークエンシングプロトコール又はプラットフォームを使用している場合、正しいサンプルIDが正しいアダプターバーコードに割り当てられることを確保する。
注： 2回のシークエンシング反応及び実行を、Ion Chef（商標）及びIon Proton（商標）機器の各準備のために調製する。ワークフローは、2日に渡って起こる。Ion Chef（商標）反応のための完了時間は、反応を一晩実施することを可能にするために、予め選択することができる。
Ion Proton（商標）シークエンシング実行が完了したら、データは、IONA(登録商標)ソフトウェアで分析されるために直接移され、すべてのテストされたサンプルについて調べられたトリソミーについての尤度ステータスが決定される。
注： シークエンシング後のデータ移送及び分析は、最大6時間かかることがある。この時間は、Ion Proton（商標）機器又はIONA(登録商標)ソフトウェアワークステーションPCを切らないこと。
データ分析―IONAソフトウェア
要約すると、以下のステップが実行される：
− サンプルの脱多重化；
− リードの整列及び染色体へのビニング；
− リードのGC補正；及び
− 染色体比の算出、FF％概算の算出。
要約すると、以下のステップが実行される：
− サンプルの脱多重化；
− リードの整列及び染色体へのビニング；
− リードのGC補正；及び
− 染色体比の算出、FF％概算の算出。
メインのバイオインフォマティクスパイプラインの実行は、IONA（登録商標）ソフトウェアの使用を通して以下のように進行する：8個のサンプルの各シークエンシング実行について、多重化された配列リードを、マップされていないBAMファイルの形態でシークエンシングプラットフォームから取り出す。多重物をさらなる処理のために個々のサンプルに対するリードに分割するために、リードの多重化されたアセンブリーを、最初、バーコード分類ステップに供し、ここでバーコード化された5'アダプターを同定し、予め定義されたセットに対してマッチングする。
少数の非常に短いリードを除去するための初期フィルタリングステップの後に、ギャップ許容リードアラインメントモジュールを使用して、断片を、「hg19」ヒトゲノムリファレンスにマッピングする。アラインメント結果の後期フィルタリングを、次に実施して、5'末端が他のリードと同じ位置でリファレンスにマッピングされるものとして決定される、テストワークフローのPCR段階で生じる重複リードを除去する。
ゲノムリファレンスにユニークに整列していると決定された断片を、次に、常染色体によってビニングし、得られるカウントを較正ステップに供し、GC含量に相関するシークエンシングのカバレッジバイアスを補正する；これは、ゲノムリファレンス全体でビニングされた場合の平均GC含量に従って、断片の過剰又は過少表示のレベルを最初に特徴付けし、次に、反転し、染色体当たりの断片カウントへの補正加重として適用することにより、達成される。
最後に、得られる断片カウントデータを、13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミーテストについてのトリソミー罹患及び非罹患仮説下の期待値の分布を取り込む混合モデルのセットへのインプットとして使用する。各モデルは、母体年齢由来のトリソミーの前確率と共に、次に使用されるテスト尤度比を生成し、年齢及び相当するDNAテスト結果の両方を考慮に入れて各トリソミーの確率を定量する。
IONA(登録商標)ソフトウェアは、内部妥当性チェックも実施する。ワークフローデータ品質チェックを行い、これは、シークエンシング及びアラインメントマトリックスを使用して、配列データがさらなる分析を行うために十分な品質のものであることを確保する。それに加えて、常染色体当たりの断片カウントの生成に続いて、実行妥当性チェックを行う。このステップは、最初に、約10％胎児画分を有する21トリソミー陽性サンプルを模倣するように設計されたIn-Run Controlのシークエンシングから由来する断片を単離し、次に、ソフトウェアコンフィギュレーションに予めセットしたリファレンス範囲を使用して、21番染色体に対して整列したこれらの断片からのカウントの比率を比較する。この比率がリファレンス基準を充足する場合、 実行妥当性チェックは通過する。
別個の妥当性チェックも、各サンプルについて行う。これらは、整列された断片カウントが使用されるべき尤度混合モデルに十分であること、及び胎児起源のサンプル中のcfDNAの割合が報告されるべき結果に十分であることを確保する。この最後のチェックのために、胎児画分は、(可能な場合には、すなわち、男性胎児の症例では)X染色体表示の測定、及びX染色体表示が胎児画分についての情報を与えない場合、胎児について富化されたサイズ領域において材料の相対量を評価する方法の組み合わせを使用して、最初に独立して定量される。
1. 富化の結果
本書類に記載した結果は、母体バックグラウンドDNA含量に対する胎児DNAの実質的な富化を実証する。
本書類に記載した結果は、母体バックグラウンドDNA含量に対する胎児DNAの実質的な富化を実証する。
図1は、21番染色体比に対して断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。非罹患(正倍数体)サンプルについての比(四角)は、期待値周辺にクラスターを作る；すなわち、リファレンス結果に関して変化がなく、一方、21トリソミーサンプル(三角)についての21番染色体比は、リファレンス結果に対して有意に増大する。富化法は、最大比を有する正倍数体サンプルと最小比を有するT21サンプルとの間の21番染色体比の差を有意に増大している。これは、正倍数体及びトリソミーサンプルの間を区別する能力を大きく改善する。図1で生成されたデータは、胎児性成分の富化を通じてのみ起こることができる21番染色体 DNAの富化を実証する。このデータセットにおいて、21個のサンプルのうち20は、このようにして富化され、1個のT21サンプルが富化されていない。富化されたデータは、シークエンシングステップ中に多重化する32個のサンプルを使用して生成されたが、一方、リファレンスデータは、8〜16個のサンプルの多重化であった。32重化データは、（サンプル当たりのデータ量の低減により）T21及び非罹患サンプル間の区別が劣ることを示すはずであると予想されるが、結果は、富化によりそれが改善されることを実証している。
図2は、男性サンプル中の胎児画分概算に対して断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。データは、胎児を起源とするDNAの比率が、リファレンス結果に対して、本明細書に記載する方法によって実質的に富化されることを実証する。図2で生成されたデータは、1個を除くすべてのサンプルで富化により胎児画分が増大し、平均増大率は約2〜2.5倍であったことを実証する。この富化は、より高い多重化及び／又は改良された性能(感度/特異度)を可能にし、低減した失敗率も期待される。富化は、胎児画分がより低い、妊娠のより初期でのNIPTも可能にする。理論に縛られることなく、富化されない1個のサンプルは、実際に富化されていなかったか、又は、単に偶々、リファレンス結果が過大に概算され、富化された胎児画分％が若干過小に概算されたということであり得ると考えられる。このような富化は、微小欠失(Mdel)テストについての性能を有意に改善する効果を有する可能性があるであろう。これまで、陽性的中率(PPV)は、MdelについてNIPTにおいては比較的劣っている。胎児画分の富化は、この劣った性能を補正し、PPVを改善し得る。
図3は、X染色体比に対して断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。女性胎児サンプルについてのX染色体比は、期待値周辺にクラスターを作る；すなわち、リファレンス結果に関しては変化がなく、一方、X染色体比は、リファレンス結果に対して有意に低減している。男性サンプルについての図3に示す結果は、1個を除いてすべてが、富化法を使用してX染色体比の低減を示すことを実証する。これは、男性胎児サンプルにおける胎児画分の増大が、相当するY染色体比の増大をもたらし、したがって、サンプルのX染色体比の低減をもたらすであろうことから、予想されたとおりである。1個のサンプルは、X染色体比のわずかな増大(すなわち、したがって富化されていない)を示す。女性サンプルについての図3に示す結果は、6個のうち5個は、図の右上のリファレンス線上に位置する、すなわち、富化法は(予想されたとおり)女性胎児サンプルにおけるX比に影響しないことを実証する。1個のサンプルは、いくつかの富化を示す。この1個は、そもそも実際には低い胎児画分の男性サンプルであり、誤って女性サンプルと標識された可能性がある。したがって、データは、富化法は性別決定テストの正確度を改善するために利用し得ることも実証する。
単離において、図1、2、又は3のデータは、非常に狭い所望の範囲へのサンプルのサイズ選択に起因するアーティファクトの結果によるものである可能性がある。組み合わせにおいて、T21サンプルにおける21番染色体比の増大(正倍数体サンプルには影響しない)を通じて、男性サンプルにおけるX染色体比の低減及び女性サンプルにおけるX染色体比に対する最小限の影響は、胎児画分の概算における相当する増大と共に、これらのサンプルにおける胎児DNAの実質的な富化を実証する。
図4は、典型的な全ゲノムシークエンシング実行(上部)の断片サイズプロフィール、及びRanger Technology（商標）を使用して処理されたサンプルのプロフィールを説明する。富化法を使用した後、シークエンシングされたサンプルの断片サイズ分布は、有意に狭くなり、135bp DNAサンプル断片サイズの標的周辺を中心に、ほとんどの断片が20〜30bpの範囲内に収まる。注： 断片サイズは、13bpのアダプター配列をも含む。
図5は、富化法の反復可能性を示す。同じセットのサンプルを、同じ手法を使用して、135bp＋／−10bpの標的範囲に3回処理した(図中、左手の3つの分布)。3つすべてのケースにおいて、胎児画分値は、実験を横断的に同等であり、リファレンスコントロールよりも高かった(図中、右手の分布)。
図6は、135bp標的(＋／−5bp)周辺のより狭いサイズ選択範囲を使用する21番染色体比に対する、断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。非罹患(正倍数体)サンプルについての比は、期待値周辺にクラスターを作る；すなわち、リファレンス結果に関して変化がなく、一方、21番染色体比は、リファレンス結果に対して有意に増大する。
図7は、135bp＋／−20bpのより広いサイズ選択範囲を使用する21番染色体比に対する断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。非罹患(正倍数体)サンプルについての比は、期待値周辺にクラスターを作る;すなわち、リファレンス結果に関して変化がなく、一方、21番染色体比は、リファレンス結果に対して有意に増大する。しかし、非罹患(正倍数体)及びトリソミーサンプル間の染色体比の差はリファレンス結果に対して増大するが、この差は、＋／−5又は＋／−10bpの標的捕獲範囲を使用した場合よりも、差はわずかに少ないように見える。それでも、富化はリファレンステスト法に対してなお明確に明らかである。
図8は、代替的なサイズ選択範囲(120bp＋／−10bp)を使用する21番染色体比に対する断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。非罹患(正倍数体)サンプルについての比は、期待値周辺にクラスターを作る；すなわち、リファレンス結果に関して変化はなく、一方、21番染色体比は、135bp＋／−10bp標的領域に匹敵する方式で、リファレンス結果に対して有意に増大する。これらの結果は、80bpの低さまで、及び150bpの高さまで、断片サイズを標的化することが、等価の結果を提供すると妥当に期待されることを実証する。
図9は、より高い塩基対標的値(170bp＋／−10bp)を使用する21番染色体比に対する断片サイズ富化法を使用する富化の効果を説明する。トリソミーサンプルについての21番染色体比は、リファレンス結果と比較して相対的に不変である。しかし、正倍数体サンプルは、よりばらつきのある結果を提示し、そのことは、正倍数体及びトリソミーサンプル間の染色体比の差を低減する効果を有する。したがって、この断片サイズでの富化は、正倍数体及びトリソミーサンプル間を区別する能力に対して不利な影響を有するように見える。
図10は、リファレンス結果に対するいくつかの断片サイズ標的及び範囲での胎児画分の概算を示す。120bp標的及び135bp標的は、すべて実質的な胎児画分の富化を提示する。170bp標的は、胎児画分に対する影響の幅広いばらつきを示し、いくつかのサンプルは増大した胎児画分を示すが、他は低減した胎児画分を示す。この図のデータは、図6〜9で観察された染色体比に対する影響を支持する。
図11は、図10に提示したデータの異なる提示方式であり、いくつかの断片サイズ標的及び範囲での胎児画分の概算を箱ひげ図に示す。120bp標的及び135bp標的は、すべてリファレンス結果に対する実質的な胎児画分の富化を提示する。170bp標的は、リファレンス結果に匹敵するデータを示す。この図のデータは、図6〜9で観察された染色体比に対する影響を支持する。
2. 断片サイズ法実施態様の評価
IONA(登録商標)臨床性能評価研究において以前利用されたサンプルを使用して、更新されたサイズ加重分析法を、この方法下での13番染色体、18番染色体及び21番染色体についての常染色体比値と、以前のソフトウェアリリースで利用されたベースライン非加重法からのそれらとを比較することにより、評価した。これらのサンプルは、IONA Studyサンプルコレクション及び他のPremaitha Healthサンプルコレクションから抽出された。
IONA(登録商標)臨床性能評価研究において以前利用されたサンプルを使用して、更新されたサイズ加重分析法を、この方法下での13番染色体、18番染色体及び21番染色体についての常染色体比値と、以前のソフトウェアリリースで利用されたベースライン非加重法からのそれらとを比較することにより、評価した。これらのサンプルは、IONA Studyサンプルコレクション及び他のPremaitha Healthサンプルコレクションから抽出された。
合計405個サンプルが、(配列データ品質及び一貫性、断片カウント密度及び胎児画分について)IONA(登録商標)Software妥当性チェックを通過し、これを比較分析で使用するために先に進めた。トリソミーステータスに関しては、これらのサンプルは、表11に掲載するとおりに分布していた。
表11. 本研究におけるサンプルのトリソミーステータス
これらのサンプルに相当するシークエンシングデータセットを、データ保管庫から抽出し、2種のバイオインフォマティクス分析パイプラインを使用して分析した：
1. 検証されたIONA(登録商標)Softwareリリース1.6(非加重カウントを伴う)において使用されたパイプライン；
2. 更新されたIONA(登録商標)Softwareリリース1.7.0(断片サイズ加重カウントを伴う)において施行された更新されたパイプライン。
1. 検証されたIONA(登録商標)Softwareリリース1.6(非加重カウントを伴う)において使用されたパイプライン；
2. 更新されたIONA(登録商標)Softwareリリース1.7.0(断片サイズ加重カウントを伴う)において施行された更新されたパイプライン。
13番染色体、18番染色体、及び21番染色体の各症例について生成された常染色体比を比較して、非罹患群及びトリソミー罹患群の間の分離の増大を測定し、また、分析の点での有効胎児画分のあらゆる変化も評価した。
2.1 結果
図14、15、及び16は、それぞれ3つの21番染色体、18番染色体、及び13番染色体の各々についての、各サンプルについての非加重分析及びサイズ加重分析の両方によって生成された常染色体比に関する散布図である。これらは、それぞれ21トリソミー、18トリソミー、及び13トリソミーについてのテストに相当する。各プロットは、非加重分析法及び加重分析法の間の等しい常染色体比を通る点線をも含有する。
図14、15、及び16は、それぞれ3つの21番染色体、18番染色体、及び13番染色体の各々についての、各サンプルについての非加重分析及びサイズ加重分析の両方によって生成された常染色体比に関する散布図である。これらは、それぞれ21トリソミー、18トリソミー、及び13トリソミーについてのテストに相当する。各プロットは、非加重分析法及び加重分析法の間の等しい常染色体比を通る点線をも含有する。
各症例において、トリソミー非罹患サンプルについての常染色体比が「効果なし」線周辺にクラスターを作ったままであり、非罹患サンプルの分布は変化しないことを示す一方、トリソミー罹患サンプルについて算出された常染色体比は、ベースラインの非加重法と比較してサイズ加重法について増大することがわかる。それに加えて、この増大は、より大きい常染色体比について、より小さいものについてよりも大きくなり、サイズ加重法がトリソミー罹患常染色体比に対してスケーリング（増幅）効果を付与することを示すことがわかる。
データの代替的な表現を図17、18、及び19として示す；これらは、トリソミー非罹患群及び罹患群について、別個に、経験的分布関数（カーネル密度概算）を、寄与するプロットされた常染色体比値と共に示す。断片サイズ加重法の下では、罹患サンプル群分布は、非加重法の症例に対して上方にシフトし、スケーリングされる一方、非罹患サンプル群はその元の位置に留まることを、明確に見ることができる。
2.1.1 性能に対する効果
トリソミー決定は、その集団について期待される非罹患群分布及びトリソミー群分布に適合させた統計的モデルを使用して、IONA(登録商標)Softwareにおいて成される。IONA(登録商標)テストのようなシステムについての感度及び特異度の性能測定値は、正しく分類された真の非罹患及び罹患症例の数、及び結果を決定するために使用された統計的モデル又はカットオフの関数である。そういうものとして、非罹患及び罹患データ間の分離の増大は、全体的な性能の改善の効果を有することになる。逆に言えば、分離の低減は、全体的な性能に対して不利な効果を有するであろう。この研究において、ベースライン非加重法と(すなわち、新しい方法及び現行法の間で)比較した場合、断片サイズ加重法の下で、非罹患群及び罹患群についての常染色体比値の間で、一貫して増大する分離が観察された。この増大は、13トリソミー、18トリソミー、及び21トリソミーの症例について起こった。したがって、トリソミー決定について使用された統計的モデルを再適合させた後、13トリソミー、18トリソミー、及び21トリソミーについてのテストの感度及び特異度の改善が長期的に期待される。特に、これは、サンプル結果を＜1の尤度比から＞1の尤度比へ調整することによって、そうでなければ失敗したテスト又は偽陰性結果をもたらし得た、低い胎児画分を有する13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミーサンプルの、改善された検出を可能にするであろう。性染色体異数性及び微小欠失のような他の異常の検出に関しても、改善された感度及び特異度が期待される。
トリソミー決定は、その集団について期待される非罹患群分布及びトリソミー群分布に適合させた統計的モデルを使用して、IONA(登録商標)Softwareにおいて成される。IONA(登録商標)テストのようなシステムについての感度及び特異度の性能測定値は、正しく分類された真の非罹患及び罹患症例の数、及び結果を決定するために使用された統計的モデル又はカットオフの関数である。そういうものとして、非罹患及び罹患データ間の分離の増大は、全体的な性能の改善の効果を有することになる。逆に言えば、分離の低減は、全体的な性能に対して不利な効果を有するであろう。この研究において、ベースライン非加重法と(すなわち、新しい方法及び現行法の間で)比較した場合、断片サイズ加重法の下で、非罹患群及び罹患群についての常染色体比値の間で、一貫して増大する分離が観察された。この増大は、13トリソミー、18トリソミー、及び21トリソミーの症例について起こった。したがって、トリソミー決定について使用された統計的モデルを再適合させた後、13トリソミー、18トリソミー、及び21トリソミーについてのテストの感度及び特異度の改善が長期的に期待される。特に、これは、サンプル結果を＜1の尤度比から＞1の尤度比へ調整することによって、そうでなければ失敗したテスト又は偽陰性結果をもたらし得た、低い胎児画分を有する13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミーサンプルの、改善された検出を可能にするであろう。性染色体異数性及び微小欠失のような他の異常の検出に関しても、改善された感度及び特異度が期待される。
2.1.2 有効胎児画分の増大の評価
トリソミーサンプルについてのトリソミー分析の慣例法によって、その常染色体比から直接分かる、有効胎児画分を算出することが可能である。所定のトリソミーサンプルにおける分析中の胎児画分は、そのサンプルについての常染色体比及び非罹患サンプルについて見られる期待値(平均)常染色体比の間の差に比例し、したがって以下のようになる：
トリソミーサンプルについてのトリソミー分析の慣例法によって、その常染色体比から直接分かる、有効胎児画分を算出することが可能である。所定のトリソミーサンプルにおける分析中の胎児画分は、そのサンプルについての常染色体比及び非罹患サンプルについて見られる期待値(平均)常染色体比の間の差に比例し、したがって以下のようになる：
式中、
・ ctargetは、テスト下のトリソミーについての染色体であり(ここではc=13、18又は21)、
・ Rctargetは、テスト トリソミー罹患サンプルについての分析からの常染色体比であり、
・ E[Rcunaff]は、トリソミー非罹患サンプルについての常染色体比の期待値(平均)であり、及び
・ Feffは、分析段階によって見られる算出された有効胎児画分である。
・ ctargetは、テスト下のトリソミーについての染色体であり(ここではc=13、18又は21)、
・ Rctargetは、テスト トリソミー罹患サンプルについての分析からの常染色体比であり、
・ E[Rcunaff]は、トリソミー非罹患サンプルについての常染色体比の期待値(平均)であり、及び
・ Feffは、分析段階によって見られる算出された有効胎児画分である。
Feffの値は、存在する非加重法及び新規のサイズ加重分析法の両方を使用して常染色体比を生成した、研究データセット中の54個のトリソミー罹患サンプルについて計算された。図20は、分析で見られた、算出された胎児画分値の分布の箱ひげ図を含有する。中央値胎児画分(FF)の増大を見ることができる(非加重中央値FF：11.1％；サイズ加重中央値FF：12.6％)。それに加えて、サイズ加重症例における値の分布は、非加重症例におけるものよりも広く、改善されたサイズ加重分析法によって達成される有効胎児画分のスケーリングが実証される。図21は、各断片のサイズ加重の包含による胎児画分スケーリング効果をさらに実証する。このプロットは、元の非加重及び新規のサイズ加重分析症例について、それらの常染色体比から算出される個別のトリソミー罹患サンプルについての分析中の胎児画分値に関する。含まれるすべてのトリソミー罹患サンプルについての、改善されたカウントスキームによるトリソミー分析段階で見られる胎児画分における平均比例増大は、13.2％である。
2.2 結論
トリソミー決定の性能の強化のため、又は同様に、所定の性能レベルに必要とされるシークエンシングの密度を低減するために、IONA(登録商標)Softwareへの取り込みのための方法が開発された。本明細書における本文は、更新されたソフトウェアルーティンを評価するために実行される検証演習を記載しており、それがこれらの要件を充足することを確認する。
トリソミー決定の性能の強化のため、又は同様に、所定の性能レベルに必要とされるシークエンシングの密度を低減するために、IONA(登録商標)Softwareへの取り込みのための方法が開発された。本明細書における本文は、更新されたソフトウェアルーティンを評価するために実行される検証演習を記載しており、それがこれらの要件を充足することを確認する。
本研究は、IONA(登録商標)テストプロセスを使用し、現行の(非加重)カウント分析法、及び断片サイズによる加重を取り入れた新規のカウント分析法の両方を使用して、トリソミー罹患サンプル及びトリソミー非罹患サンプルを分析することによって生成された常染色体比の分布間の分離を調べた。
トリソミー非罹患、及び13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミー罹患症例の混合からなる405個の臨床サンプルからのデータを、本研究において考慮した。ベースライン非加重法と(すなわち、新規及び現行法の間で)比較した場合、断片サイズ加重法の下で、非罹患群及び罹患群についての常染色体比値間で、一貫して増大した分離が観察された。この増大は、13トリソミー、18トリソミー、及び21トリソミー症例で起こった。したがって、トリソミー決定のために使用された統計的モデルを再適合させた後、所定のシークエンシング密度レベルについて、13トリソミー、18トリソミー及び21トリソミーについてのテストの感度及び特異度の改善が、長期的に期待される。
さらなる調査により、新規のサイズ加重法の使用による非罹患及びトリソミー罹患常染色体比間の分離の増大は、現行法と比較して、トリソミー分析の点で13.2％のトリソミーサンプル胎児画分の有効増幅に相当することが実証された。
Claims (26)
- 胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ；
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e)前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児の異常の存在を決定するステップ、を含む、前記方法。 - 前記胎児の染色体異常が、異数性、重複、転座、突然変異(例えば、点突然変異)、置換、欠失、一塩基多型(SNP)、染色体異常、コピー数多型(CNV)、エピジェネティック変化、及びDNA逆位から選択される遺伝的変異である、請求項1記載の方法。
- 前記標的染色体が、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体、又はY染色体である、請求項1記載の方法。
- 前記胎児の染色体異常が、胎児の染色体異数性である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記胎児の染色体異数性が、13トリソミー、18トリソミー、又は21トリソミーである、請求項4記載の方法。
- 前記胎児の染色体異数性が、21トリソミー(ダウン症候群)である、請求項5記載の方法。
- 前記胎児の染色体異常が、例えば、1Mbまで、5Mbまで、10Mbまで、又は20Mbまで、あるいは20Mb超の、染色体挿入又は欠失である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 前記標的染色体が、染色体内の領域であり、前記リファレンス染色体が、該標的染色体と同じ染色体内の領域である、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 前記胎児の染色体異常を含有する疑いがあるゲノムの領域についてのサンプルの富化ステップを付加的に含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の方法であって、付加的に:
(i)標的染色体の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii)1以上のリファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii)ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv)ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v)ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi)前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む、前記方法。 - 妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法であって：
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c)性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e)前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む、前記方法。 - 付加的に：
(i)性染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii)1以上のリファレンス染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii)ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv)ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v)ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi)1以上の前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む、請求項11記載の方法。 - 前記生体サンプルが、母体の血液、血漿、血清、又は尿である、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記生体サンプルが、母体血漿である、請求項13記載の方法。
- 前記ステップ(a)における単離のステップが、核酸断片のライブラリーの調製を含む、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
- 前記ライブラリーの調製が、DNA末端修復、アダプターライゲーション、クリーンアップ、及びPCRの逐次的なステップを含む、請求項15記載の方法。
- 単離ステップ(b2)が、ステップ(b1)において選択した断片サイズ値の5bp以内のような、ステップ(b1)において選択した断片サイズ値の10bp以内のサイズを有する核酸断片についての富化を含む、請求項1〜16のいずれか1項記載の方法。
- 単離ステップ(b2)が、ゲルベースのサイズ選択、特に自動ゲルベースサイズ選択のような、サイズ選択を使用する富化を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
- 単離ステップ(b2)が、インシリコのサイズ選択を使用する富化を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(c)が、アラインメントに先立って、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシング、又は前記断片をデジタルPCRに供するステップを最初に含む、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
- 前記シークエンシングが、以下のものから選択される次世代シークエンシングシステム：Life Technologies社のIon Torrent Personal Genome Machine (Ion Torrent PGM)、又はPIもしくはPIIチップを用いるIon Proton、及びさらにそれらの派生的装置及びコンポーネント；又は、Roche 454(すなわち、Roche 454 GS FLX)、Applied Biosystems社のSOLiDシステム(すなわち、SOLiDv4)、Illumina社のNextSeq, GAIIx, HiSeq 2000 及びMiSeqシークエンサー、Pacific Biosciences社のPacBio RS及びSanger社の3730xl及びQIAGEN社のGeneReaderを含む、請求項20記載の方法。
- 前記シークエンシングが、Quant studioデジタルPCRシステム(ThermoFisher)及びRainDrop PlusデジタルPCRシステム(RainDance technologies)から選択されるデジタルPCRシステムを含む、請求項20記載の方法。
- アラインメントステップ(c)に先立って、得られた配列データからの重複リードを圧縮するステップを付加的に含む、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(c)が、標的染色体の領域にユニークに整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域にユニークに整列する前記断片の第2の数を決定することを含む、請求項23記載の方法。
- 前記アラインメントステップ(c)を、IONA(登録商標)、Bowtie2又はBWA-SWソフトウェア、又はMaximal Exact Matching技術を利用するソフトウェア、例えばBWA-MEM又はCUSHAW2ソフトウェアによって実行する、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法。
- 前記サンプル内の胎児DNAの量に基づいて、マッチしたヒットの数を正規化又は調整するステップを付加的に含む、請求項1〜25のいずれか1項記載の方法。
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| CLINICAL CHEMISTRY, vol. 63, no. 2, JPN7022000026, February 2017 (2017-02-01), pages 495 - 502, ISSN: 0005091592 * |
| PREGNANT DIAGNOSIS, vol. 35, no. 8, JPN7022000027, 2015, pages 810 - 815, ISSN: 0005091593 * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMIY OF SCIENCES, vol. 111, no. 23, JPN7022000028, 2014, pages 8583 - 8588, ISSN: 0005091591 * |
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