JP2020510424A - 改変ａａｖカプシドおよびその使用 - Google Patents

改変ａａｖカプシドおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、変更されたカプシドタンパク質を含む改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、改変ＡＡＶビリオンは、眼に投与されると、網膜細胞のより高い感染性を示し、静脈内に投与されると、肝細胞のより高い感染性を示す。本開示は、さらに、個体の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法、眼疾患および眼障害を治療する方法、個体の肝臓に遺伝子産物を送達する方法、および肝疾患および肝障害を治療する方法を提供する。【選択図】図１７Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４６４，８７８号の利益を主張するものであり、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＡＶＢＩ＿０１２＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは２２ＫＢであり、２０１８年２月２７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
本開示の実施形態は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む改変ウイルスカプシドタンパク質、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスおよびウイルスベクター、ならびに細胞にポリペプチドを送達するためのこれらのウイルスおよびベクターの使用方法に関する。
遺伝性疾患および他の疾患を治療および予防するための有望なアプローチは、ウイルスベクター等の遺伝子送達ベクターによる治療剤の送達である遺伝子治療に適したウイルスベクターの例示的な例として、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、αウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
ＡＡＶは、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは、非病原性であり、任意の既知の疾患との病因学的関連性を有しないため、ＡＡＶに基づく組換えベクターは、優れた臨床安全性と関連している。加えて、ＡＡＶは、眼、筋肉、肺、および脳を含む多数の組織における高効率の遺伝子送達および持続的な導入遺伝子発現のための能力を提供する。さらに、ＡＡＶは、レーバー先天黒内障の治験を含むヒト臨床試験において有望であることが示されており、この治験において、ｒＡＡＶベクターの単回網膜下投与によって送達された治療薬で治療した患者は、治療開始日から４年以上、治療剤の発現から持続的な治療効果を経験した。
遺伝子治療に使用されるウイルスベクターの設計に関する解決すべきある特定の課題は、ウイルス細胞の指向性および組織特異的送達を最適化することを含む。したがって、選択された哺乳動物の細胞型および組織において遺伝子を発現させるために最適化されたベクターの必要性が存在する。本発明は、所望の細胞および組織へのウイルスベクターの送達に有利な改変ＡＡＶカプシドタンパク質を提供することにより、この必要性に対応する。
本発明は、概して、遺伝子治療の分野に関し、特に、治療剤を含む種々の物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、リボザイム、および触媒ＲＮＡ分子）をコードする核酸セグメントを脊椎動物の選択された細胞および組織に送達するのに有利なウイルスベクターに関する。特に、本発明の態様は、所望の細胞または組織、例えば、網膜または肝臓に薬剤を送達するため、ならびに哺乳動物の疾患、障害、および機能不全を治療するための、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、αウイルス（ＡＶ）、およびＡＡＶベクターを含む遺伝子治療ベクターにおいて有用な改変カプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターはＳｈＨ１０の変異型であり、これは他の多くのＡＡＶ血清型よりも優れた中和抗体プロファイルを有するＡＡＶである。したがって、本発明の変異型ＡＡＶは、異なる指向性、例えば、変更されたヘパラン硫酸結合、網膜特異的指向性、または肝臓特異的指向性を有しながら、この良好な中和抗体プロファイルを保持するという利点を提供する。
開示される組成物は、様々なヒト疾患の予防および治療を含む、様々な研究、診断、および治療計画に利用することができる。
ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のアミノ酸改変を含む非天然の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるアミノ酸またはペプチド挿入を含む。いくつかの実施形態において、改変ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、または少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つのその連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列の断片を含むかまたはそれからなるアミノ酸またはペプチド挿入を含み、挿入は７ｍ８アミノ酸挿入と称される。ある特定の実施形態において、ＡＡＶはＡＡＶＳｈＨ１０であり、７ｍ８アミノ酸挿入は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のアミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９の間に位置する。別段の指示がない限り、本明細書において言及されるカプシドタンパク質のアミノ酸配列はＶＰ１配列である。当業者は、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質のアミノ酸配列に同等の配列が存在し、本開示が任意の改変、例えば、本明細書に記載される挿入を有する改変されたＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質も含むことを理解するであろう。ある特定の実施形態において、ＡＡＶは、異なるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０等であり、７ｍ８アミノ酸挿入は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のアミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９に対応するアミノ酸残基の間のこれらの他のＡＡＶのカプシドタンパク質に位置する。他のＡＡＶの対応する残基は、異なるアミノ酸数を有し得ることを理解されたい。当業者は、配列アラインメント、結晶構造、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン結合部位の位置に基づいて、これらの残基を決定することができる。特定の実施形態において、挿入は、ＨＳＰＧ結合部位に近いが、その活性を完全には妨害しない。ある特定の実施形態において、それはＨＳＰＧ結合に重要であると特定されたアミノ酸残基に隣接している。
関連する実施形態において、本発明は、本明細書に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
本発明のさらなる関連する実施形態は、本明細書に記載の発現ベクターを含む細胞を含む。さらなる実施形態において、細胞は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
別の実施形態は、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を含む組換えウイルスまたはウイルスベクターである。本発明のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶＳｈＨ１０に対するヘパラン硫酸結合の変更された親和性を呈し得る。特定の実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、例えば、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、または約０．４Ｍの塩濃度でヘパラン硫酸カラムから溶出される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、哺乳動物に硝子体内注射されると内境界膜（ＩＬＭ）に結合し、かつそれを横断することができる。ある特定の実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）剤である。特定の実施形態において、治療用タンパク質は、α１アンチトリプシン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｃ１エステラーゼ抑制因子、βグロビン、またはγグロビンである。ある特定の実施形態において、治療用タンパク質は、全身で発現されるとその治療効果を発揮するタンパク質であり、例えば、ウイルスベクターを肝臓に形質導入すると、次いで、治療用タンパク質を産生し、結果としてそれが全身に送達される。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクターは、野生型カプシドタンパク質、すなわち、７ｍ８挿入が存在しない同じカプシドタンパク質を有する対応するウイルスまたはウイルスベクターと比較して、変更された細胞指向性を有する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、網膜細胞または肝細胞に対してより高い指向性を有する。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５６および４５７の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５７および４５８の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５８および４５９の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。
さらなる関連する実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクターを含む薬学的組成物を含む。
本発明はまた、例えば、硝子体内注射によって、本明細書に記載の組換えウイルスもしくはウイルスベクターまたは薬学的組成物を対象の眼に投与することを含む、対象の網膜にタンパク質を提供する関連方法も含み、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。
本発明はまた、対象の肝臓にタンパク質を提供する関連方法であって、本明細書に記載の組換えウイルスもしくはウイルスベクターまたは薬学的組成物を対象に、例えば、静脈内に投与することを含む方法も含み、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。
本発明は、治療用遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）を必要とする対象の網膜に治療用遺伝子産物を提供する方法であって、例えば、硝子体内注射によって、本明細書に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクターを含む薬学的組成物を対象に投与することを含む方法をさらに含み、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、対象は、眼疾患または眼障害を有すると診断されているか、またはそのリスクがあると考えられる。特定の実施形態において、対象は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される１つ以上の状態を有すると診断されているか、または有することが疑われるか、または発症するリスクがある。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。
本発明は、治療用遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）を必要とする対象の肝臓に治療用遺伝子産物を提供する方法であって、本明細書に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクターを含む薬学的組成物を対象に、例えば、静脈内に投与することを含む方法をさらに含み、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、対象は、肝疾患または肝障害を有すると診断されているか、またはそのリスクがあると考えられる。特定の実施形態において、対象は、α１アンチトリプシン欠損症、血友病Ｂ、血友病Ａ、遺伝性血管性浮腫、およびβサラセミアからなる群から選択される１つ以上の状態を有すると診断されているか、または有することが疑われるか、または発症するリスクがある。一実施形態において、組換えウイルスまたはウイルスベクターは、アミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、アミノ酸残基４５８および４５９の間に７ｍ８挿入物を有するＡＡＶＳｈＨ１０カプシドを含む。
本発明は、ウイルスまたはウイルスベクターのカプシドタンパク質、例えば、例えば、アミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、またはアミノ酸残基４５８および４５９のいずれかの間に７ｍ８挿入を導入することを含む、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６ウイルスまたはウイルスベクターの指向性を変化させる方法をさらに提供する。
本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に述べられる。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および付属の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られる。
形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図１Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＡＡＶ．７ｍ８（図１Ｂ）、ＳｈＨ１０（図１Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図１Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図１Ｆ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光画像を示す。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない（図２Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図２Ｂ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図２Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図２Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図２Ｅ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図２Ｆ）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフを提供する。 形質導入していない、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０、ＡＡＶ．７ｍ８、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析から作製されたデータを提供する。図３Ａは、各ウイルスのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセンテージを示し、図３Ｂは、各ウイルスの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図３Ｃは、図３Ａおよび図３Ｂに示される結果を要約した表である。各グラフのエラーバーは、標準偏差を示す。 形質導入していない、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０、ＡＡＶ．７ｍ８、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析から作製されたデータを提供する。図３Ａは、各ウイルスのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセンテージを示し、図３Ｂは、各ウイルスの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図３Ｃは、図３Ａおよび図３Ｂに示される結果を要約した表である。各グラフのエラーバーは、標準偏差を示す。 形質導入していない、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０、ＡＡＶ．７ｍ８、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）ウイルスで形質導入したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析から作製されたデータを提供する。図３Ａは、各ウイルスのＧＦＰ陽性細胞の平均パーセンテージを示し、図３Ｂは、各ウイルスの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図３Ｃは、図３Ａおよび図３Ｂに示される結果を要約した表である。各グラフのエラーバーは、標準偏差を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図４Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図４Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図４Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図４Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＵ８７細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図４Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図４Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図４Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図４Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＵ８７細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図４Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図４Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図４Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図４Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＵ８７細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図４Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図４Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図４Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図４Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＵ８７細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 形質導入していない（図５Ａ）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図５Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図５Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図５Ｄ）、もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図５Ｅ）で形質導入したＵ８７細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図５Ｆ）を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図６Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図６Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図６Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図６Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨｅｐＧ２細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図６Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図６Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図６Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図６Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨｅｐＧ２細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図６Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図６Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図６Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図６Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨｅｐＧ２細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図６Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図６Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図６Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図６Ｄ）ウイルスで３×１０５のＭＯＩで形質導入したＨｅｐＧ２細胞の免疫蛍光画像（左パネル）および光学顕微鏡画像（右パネル）を示す。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図７Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図７Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図７Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図７Ｄ）ウイルスで形質導入したＨｅｐＧ２細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図７Ｅ）を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図７Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図７Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図７Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図７Ｄ）ウイルスで形質導入したＨｅｐＧ２細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図７Ｅ）を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図７Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図７Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図７Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図７Ｄ）ウイルスで形質導入したＨｅｐＧ２細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図７Ｅ）を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図７Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図７Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図７Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図７Ｄ）ウイルスで形質導入したＨｅｐＧ２細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図７Ｅ）を提供する。 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＳｈＨ１０（図７Ａ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図７Ｂ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図７Ｃ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図７Ｄ）ウイルスで形質導入したＨｅｐＧ２細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフ、ならびに各ウイルスについてＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージおよびＭＦＩを要約した表（図７Ｅ）を提供する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ヘパリン結合アッセイを概説し（図８Ａ）、ＡＡＶ．７ｍ８（図８Ｂ）、ＳｈＨ１０（図８Ｃ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）からのヘパラン硫酸カラム画分のドットブロットの結果を示す。溶出液Ｅ１〜Ｅ１０は、０．１Ｍ（Ｅ１）、０．２Ｍ（Ｅ２）、０．３Ｍ（Ｅ３）、０．４Ｍ（Ｅ４）、０．５Ｍ（Ｅ５）、０．６Ｍ（Ｅ６）、０．７Ｍ（Ｅ７）、０．８Ｍ（Ｅ８）、０．９Ｍ（Ｅ９）および１．０Ｍ（Ｅ１０）の増大する塩濃度を有する。 ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ベクターの中和抗体プロファイルを示すグラフである。ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ベクターを、２９３Ｔ細胞の形質導入前に種々の希釈率のＩＶＩＧでインキュベートし、次いで、ＧＦＰの発現を分析する前に３日間インキュベートした。 ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）または親ＳｈＨ１０ウイルスに４×１０４のＭＯＩで感染させてから２週間後のブタ外植片からの網膜細胞の免疫蛍光画像を示す。図１０Ａ〜図１０Ｄは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入し、ＧＦＡＰ（ミュラー細胞を検出するため）（図１０Ａ）、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１０Ｂ）、ＣＨＸ１０（双極細胞を検出するため）（図１０Ｃ）、およびＧＦＰ（図１０Ｄ）について染色したブタ網膜外植片を撮影した単一チャネル免疫蛍光画像を示す。図１０Ｅ〜図１０Ｈは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入し、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１０Ｅ）、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１０Ｆ）、ＣＨＸ１０（双極細胞を検出するため）（図１０Ｇ）、またはＧＦＰ（図１０Ｈ）について染色したブタ網膜外植片を撮影した単一チャネル免疫蛍光画像を示す。図１０Ｉ〜図１０Ｌは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入し、ＴｕＪ１（網膜神経節細胞を検出するため）（図１０Ｉ）、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１０Ｊ）、ＣＨＸ１０（双極細胞を検出するため）（図１０Ｋ）、およびＧＦＰ（図１０Ｌ）について染色したブタ網膜外植片を撮影した単一チャネル免疫蛍光画像を示す。図１０Ｍ〜図１０Ｐは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入し、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１０Ｍ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１０Ｎ）、ＧＦＡＰ（ミュラー細胞を検出するため）（図１０Ｏ）、およびＧＦＰ（図１０Ｐ）について染色したブタ網膜外植片を撮影した単一チャネル免疫蛍光画像を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＧＦＰを発現する２×１０１０ｖｇ／眼の親ＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）ウイルスで形質導入した後のスナネズミ網膜からの網膜細胞の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｂは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＳｈＨ１０（上パネル）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（下パネル）で形質導入したスナネズミ網膜の横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を示しており、細胞はＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１１Ｃ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１１Ｄ）、およびＧＦＰ（図１１Ｅ）について染色されている。 ＧＦＰを発現する２×１０１０ｖｇ／眼の親ＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）ウイルスで形質導入した後のスナネズミ網膜からの網膜細胞の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｂは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＳｈＨ１０（上パネル）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（下パネル）で形質導入したスナネズミ網膜の横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を示しており、細胞はＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１１Ｃ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１１Ｄ）、およびＧＦＰ（図１１Ｅ）について染色されている。 ＧＦＰを発現する２×１０１０ｖｇ／眼の親ＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）ウイルスで形質導入した後のスナネズミ網膜からの網膜細胞の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｂは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＳｈＨ１０（上パネル）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（下パネル）で形質導入したスナネズミ網膜の横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を示しており、細胞はＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１１Ｃ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１１Ｄ）、およびＧＦＰ（図１１Ｅ）について染色されている。 ＧＦＰを発現する２×１０１０ｖｇ／眼の親ＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）ウイルスで形質導入した後のスナネズミ網膜からの網膜細胞の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｂは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＳｈＨ１０（上パネル）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（下パネル）で形質導入したスナネズミ網膜の横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を示しており、細胞はＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１１Ｃ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１１Ｄ）、およびＧＦＰ（図１１Ｅ）について染色されている。 ＧＦＰを発現する２×１０１０ｖｇ／眼の親ＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）ウイルスで形質導入した後のスナネズミ網膜からの網膜細胞の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｂは、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したスナネズミ網膜の蛍光眼底造影を示す。図１１Ｃ〜図１１Ｅは、ＳｈＨ１０（上パネル）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（下パネル）で形質導入したスナネズミ網膜の横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を示しており、細胞はＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１１Ｃ）、ロドプシン（桿体細胞を検出するため）（図１１Ｄ）、およびＧＦＰ（図１１Ｅ）について染色されている。 ＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０（図１２Ａ〜図１２Ｂ）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）の硝子体内投与から１２週間後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓを用いて得られたアフリカミドリザル（ＡＧＭ）網膜のＯＣＴ画像を示す。 ＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０（図１２Ａ〜図１２Ｂ）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）の硝子体内投与から１２週間後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓを用いて得られたアフリカミドリザル（ＡＧＭ）網膜のＯＣＴ画像を示す。 ＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０（図１２Ａ〜図１２Ｂ）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）の硝子体内投与から１２週間後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓを用いて得られたアフリカミドリザル（ＡＧＭ）網膜のＯＣＴ画像を示す。 ＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０（図１２Ａ〜図１２Ｂ）またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）の硝子体内投与から１２週間後にＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓを用いて得られたアフリカミドリザル（ＡＧＭ）網膜のＯＣＴ画像を示す。 ＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から２週間後に抽出したフラットマウントＡＧＭ網膜のライブ蛍光画像を提供する。網膜の中心窩（矢印）および周辺部にロバストな発現を見ることができる。 ＤＩＣ画像（図１４Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の中心窩で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１４Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の中心窩で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１４Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の中心窩で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１４Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の中心窩で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１４Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の中心窩で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１５Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の周辺部で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１５Ｂ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１５Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１５Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の周辺部で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１５Ｂ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１５Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１５Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の周辺部で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１５Ｂ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１５Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１５Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の周辺部で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１５Ｂ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１５Ｅ）についての染色を示す。 ＤＩＣ画像（図１５Ａ）、およびＧＦＰを発現する２×１０１２ｖｇ／眼のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の硝子体内投与から１２週間後にＡＧＭ網膜の周辺部で撮影した横断面の単一チャネル免疫蛍光画像を提供する。単一チャネル画像は、ＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１５Ｂ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１５Ｅ）についての染色を示す。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼのライブ撮像の結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスの染色をそれぞれ示し、図１６Ｄは、１６、１７、１８、１９、２０、２１と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照の異なる時点でのＲＬＵ（反射光量）をプロットしたグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼのライブ撮像の結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスの染色をそれぞれ示し、図１６Ｄは、１６、１７、１８、１９、２０、２１と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照の異なる時点でのＲＬＵ（反射光量）をプロットしたグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼのライブ撮像の結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスの染色をそれぞれ示し、図１６Ｄは、１６、１７、１８、１９、２０、２１と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照の異なる時点でのＲＬＵ（反射光量）をプロットしたグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼのライブ撮像の結果を示す。図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスの染色をそれぞれ示し、図１６Ｄは、１６、１７、１８、１９、２０、２１と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照の異なる時点でのＲＬＵ（反射光量）をプロットしたグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼの染色の結果を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスのライブ撮像をそれぞれ示し、図１７Ｄは、２８〜３３と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照のＲＬＵを示すグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼの染色の結果を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスのライブ撮像をそれぞれ示し、図１７Ｄは、２８〜３３と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照のＲＬＵを示すグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼの染色の結果を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスのライブ撮像をそれぞれ示し、図１７Ｄは、２８〜３３と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照のＲＬＵを示すグラフである。 ウイルスの静脈内投与から２週間、４週間、および６週間後にＣＡＧプロモーターによって駆動したルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルスで形質導入したマウスにおけるルシフェラーゼの染色の結果を示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃは、２週目、４週目、および６週目のマウスのライブ撮像をそれぞれ示し、図１７Ｄは、２８〜３３と番号付けした各個々のマウスおよびビヒクル対照のＲＬＵを示すグラフである。 ルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルス、またはビヒクル対照で形質導入から２週間、４週間、および６週間後のマウスの、総ルシフェラーゼ発現（背側と腹側の発現を合わせた）（図１８Ａ）、またはマウスの背面（図１８Ｂ）および腹面からの発現を示すグラフを提供する。 ルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルス、またはビヒクル対照で形質導入から２週間、４週間、および６週間後のマウスの、総ルシフェラーゼ発現（背側と腹側の発現を合わせた）（図１８Ａ）、またはマウスの背面（図１８Ｂ）および腹面からの発現を示すグラフを提供する。 ルシフェラーゼを発現する１×１０１１ｖｇ／マウスのＳｈＨ１０もしくはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）ウイルス、またはビヒクル対照で形質導入から２週間、４週間、および６週間後のマウスの、総ルシフェラーゼ発現（背側と腹側の発現を合わせた）（図１８Ａ）、またはマウスの背面（図１８Ｂ）および腹面からの発現を示すグラフを提供する。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの形質導入から６週間後のＩＶＩＳ（インビボ撮像システム）に基づいて総ルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた肝臓組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２０Ａは、肝臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２０Ｂは、逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析によって決定されるビヒクルに対する倍変化を示し、図２０Ｃは、肝臓組織試料から抽出したタンパク質において検出されたルシフェラーゼシグナルを示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた肝臓組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２０Ａは、肝臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２０Ｂは、逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析によって決定されるビヒクルに対する倍変化を示し、図２０Ｃは、肝臓組織試料から抽出したタンパク質において検出されたルシフェラーゼシグナルを示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた肝臓組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２０Ａは、肝臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２０Ｂは、逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析によって決定されるビヒクルに対する倍変化を示し、図２０Ｃは、肝臓組織試料から抽出したタンパク質において検出されたルシフェラーゼシグナルを示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた心臓組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２１Ａは、心臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２１Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定されるルシフェラーゼｍＲＮＡのビヒクルに対する倍変化を示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた心臓組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２１Ａは、心臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２１Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定されるルシフェラーゼｍＲＮＡのビヒクルに対する倍変化を示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた脳組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２２Ａは、心臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２２Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定されるルシフェラーゼｍＲＮＡのビヒクルに対する倍変化を示す。 図示したルシフェラーゼを発現するウイルスの注射によって形質導入した動物から得られた脳組織試料中のルシフェラーゼおよび対照ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。これらの図中、「ＳｈＨ１０／７ｍ８」はＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）を指す。図２２Ａは、心臓組織試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、続いてルシフェラーゼまたはＧＡＰＤＨのいずれかに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅してからゲル電気泳動を行った後に得られたＰＣＲ産物を含有する代表的なゲルを示し、図２２Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって決定されるルシフェラーゼｍＲＮＡのビヒクルに対する倍変化を示す。
本開示は、１つ以上の改変または変更されたカプシドタンパク質を有する改変カプシドタンパク質ならびにビリオンおよびウイルスベクターを提供し、種々の実施形態において、ビリオンは、１）網膜細胞または肝細胞の増大した感染性、２）変更された指向性、３）１つ以上の他の細胞または組織と比較して増加した網膜細胞または肝細胞に対する組織特異性、３）へパランもしくはヘパラン硫酸プロテオグリカンおよび／または内境界膜（ＩＬＭ）への結合増加、本明細書に開示される改変カプシドタンパク質の代わりにネイティブまたは野生型カプシドタンパク質を含む対応するビリオンと比較して、硝子体内に投与されたときに感染する能力かつ／またはＩＬＭを横断して治療用遺伝子産物を送達する能力の４）低下および／または５）増加を呈する。また、例えば、疾患または障害の治療または予防のために、個体における細胞、例えば、網膜細胞における遺伝子の発現を促進するために本明細書に開示される組成物のいずれかを使用するための薬学的組成物および方法も提供される。本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により完全に記載されるような組成物および方法の詳細を読むと当業者により明白になるであろう。
定義
本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはそれと会合し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターとして、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、別様に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す等である。
種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列が、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献中にまたはＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベース中に見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ−１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ−１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ−２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ−３）、ＮＣ＿−００１８２９（ＡＡＶ−４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ−４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ−５）、ＡＦ０２８７０４ａｎｄＡＡＢ９５４５０（ＡＡＶ−６）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ−８）、およびＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ−８）を参照されたく、それらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５−３８３；国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい。加えて、カプシドタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列は、コドン最適化配列を含むアミノ酸配列および既知の遺伝暗号に基づいて容易に作製することができる。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には「ｒＡＡＶベクター粒子」、または単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、そのようなベクターはｒＡＡＶ粒子内に含有されるため、ｒＡＡＶ粒子の産生はｒＡＡＶベクターの産生を必ず含む。
本発明のＡＡＶウイルスベクターに関して本明細書で使用される「複製欠損」という用語は、ＡＡＶベクターがそのゲノムを独立して複製およびパッケージングすることができないことを意味する。例えば、対象の細胞をｒＡＡＶビリオンに感染させた場合、感染細胞において異種遺伝子が発現されるが、感染細胞がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、ｒＡＡＶはさらに複製することができない。
本明細書で使用される「ＡＡＶ変異型」または「ＡＡＶ変異体」は、ａ）変異型ＡＡＶカプシドタンパク質（変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含み、ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質に存在するアミノ酸に対応しない）と、任意選択的に、ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸（変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる結合と比較して増加したヘパランまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を付与する）とからなるウイルス粒子を指す。ある特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質は、ａ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増大した網膜細胞の感染性、ｂ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの指向性と比較して変更された細胞指向性、および／またはｃ）対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して増加したＩＬＭに結合するおよび／または横断する能力を付与する。
「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶとは異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための対象となる配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、通常は２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の組み立ておよびカプシド形成を引き起こす一連の細胞内事象を指す。
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書においてＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニア等のポックスウイルスを含む、様々なそのようなＡＡＶのヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類、および鳥類起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含み、これらもまたＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」は、（本明細書に記載の複製およびパッケージングについての他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされる機能（複数可）を指す。本明細書に記載される場合、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を、トランスにおいてプロデューサー細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、１つ以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターとともにプロデューサー細胞にトランスフェクトされる。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、コンピテントに組み立てられたウイルスカプシドを含み、かつ該ウイルス種が指向性である細胞にポリヌクレオチド成分を送達することができるものである。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を暗示するものではない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の別の箇所および当該技術分野において説明されている。ウイルス感染性は、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率として表すことができる。全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率を決定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイについて記載）、およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。また、実施例も参照されたい。
「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）は、感染性であり、かつ感染細胞内で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることも可能な表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは、概して、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子が欠損しているため、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製非コンピテントである。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって複製コンピテントＡＡＶが生成される可能性を最小限に抑えるために、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠損している。多くの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、たとえあったとしてもごくわずかな複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を含有するものである（例えば、１０２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ、１０１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶなし）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の改変ヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る本明細書で使用される際、ポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが分かっているかまたは予想される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の割合の「配列同一性」を有し、すなわち、整列させたときに、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが２つの配列を比較したときに同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを用いて配列を整列させることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）のパッケージから入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．の一部門）Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに記載されている。配列におけるギャップを許容するアラインメントプログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
配列同一性を決定するためのＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）を用いたＢｅｓｔＦｉｔプログラムが興味深い。ギャップ生成ペナルティは、概して、１〜５、通常２〜４の範囲であり、多くの実施形態において３である。ギャップ伸長ペナルティは、概して、約０．０１〜０．２０の範囲であり、多くの場合０．１０である。該プログラムは、比較されるべく入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、該プログラムによって決定されるデフォルトパラメータを用いて決定される。このプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）のパッケージからも入手可能である。
興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに説明されている。配列同一性パーセントは、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、および結合ペナルティ：３０．０。
「遺伝子」は、転写、および時には同様に翻訳された後に、特定の遺伝子産物をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。用語「遺伝子」または「コード配列」は、遺伝子産物をコードするインビトロまたはインビボのヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合において、遺伝子は、コード配列、すなわち、遺伝子産物をコードする配列からなるかまたは本質的になる。他の場合において、遺伝子は、追加の非コード配列を含む。例えば、遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでもまたは含まなくてもよい。
「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現から得られる分子である。遺伝子産物は、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等を含む。特定の実施形態において、「遺伝子産物」は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、もしくは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡである。特定の実施形態において、遺伝子産物は、治療用遺伝子産物、例えば、治療用タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」は、発現させると、それが存在する細胞もしくは組織に対して、または該遺伝子またはタンパク質が発現する哺乳動物に対して有益な効果を付与する治療用遺伝子産物を産生する遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の寛解、状態もしくは疾患の予防もしくは阻害、または所望の特徴の付与が挙げられる。治療用遺伝子には、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損を補正する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、ベクターによって細胞に送達される遺伝子である。
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップの種々の組み合わせ、および天然に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物を得る他の手順の産物であるということを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、最初のポリヌクレオチド構築物の複製、および最初のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。
「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与える可能性があり、本質的に増強または阻害であり得る。当該技術分野で既知の制御エレメントとして、例えば、プロモーターおよびエンハンサー等の転写制御配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼを結合させ、通常、プロモーターから（３’の方向に）下流に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」とは、遺伝子エレメントが並列しており、エレメントが予測された様式でそれらが作動することを可能にする関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、プロモーターはコード領域に作動的に連結される。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。
「発現ベクター」は、対象となる遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、目的の標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために用いられる。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を促進するためにコード領域に作動的に連結された制御エレメントも含む。制御エレメントと、発現のためにそれらが作動可能に結合された１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、時には「発現カセット」と称され、その多くは当該技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な成分から容易に構築することができる。
「異種」は、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。そのネイティブなコード配列から取り出され、天然では連結して見られないコード配列に作動的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶには通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションで改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キット等において必要とされるが、例えば、特許請求の範囲に記載の範囲内で組成物、方法、キット等を形成するために他の要素が含まれていてもよいことを意味する例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて他の要素、例えば、ポリアデニル化配列、エンハンサーエレメント、他の遺伝子、リンカードメイン等を含み得る発現カセットである。
「〜から本質的になる」とは、例えば、組成物、方法、キット等の基本的および新規特徴（複数可）に実質的な影響を与えない特定の材料またはステップに対して記載される、例えば、組成物、方法、キット等の範囲の限界を意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列「から本質的になる」発現カセットは、それらが遺伝子の転写または翻訳に実質的に影響を与えない限り、追加の配列、例えば、リンカー配列を含んでもよい。別の例として、列挙される配列「から本質的になる」変異型、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長ナイーブポリペプチドに基づいて配列の境界に、列挙される配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約１０アミノ酸残基の（例えば、列挙される結合アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１残基少ない、または列挙される結合アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０残基多い）アミノ酸配列を有する。
「〜からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、ステップ、または成分が除外されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結された治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列から「なる」発現カセットは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化配列のみからなる。別の例として、列挙される配列「からなる」ポリペプチドは、列挙される配列のみを含有する。
本明細書で使用される「発現ベクター」は、上で論じられるかまたは当該技術分野で既知のように、対象となる遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソーム等を包含し、目的の標的細胞にける遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を促進するためにコード領域に作動的に連結された制御エレメントも含む。制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的化配列等と、発現のためにそれらが作動可能に結合された１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、時には「発現カセット」と称される。多くのそのような制御エレメントは当該技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な成分から容易に構築することができる。
本明細書で使用される「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を誘導し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列すなわち、転写を誘導するのに十分な最小の配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は遍在性であり得、これは、幅広い細胞、組織、および種において非常に活性であるか、または細胞型特異的、組織特異的、もしくは種特異的であることを意味する。プロモーターは、「構成的」であり得る、すなわち、絶えず活性であってもよいか、または「誘導性」であり得る、すなわち、生物的または非生物的要因の存在または不在によってプロモーターが活性化または非活性化されてもよい。本発明の核酸構築物またはベクターには、プロモーター配列と連続していてもまたはしていなくてもよいエンハンサー配列も含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼし、ネイティブな遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。
本明細書で使用される「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントを包含する。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、コード配列から、および転写される領域の下流の位置から、数キロベース対（ｋｂ）までの距離にわたって、いずれの方向にも機能することができる（すなわち、コード配列と会合することができる）。
本明細書で使用される「終結シグナル配列」は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる任意の遺伝子エレメント、例えば、ポリアデニル化シグナル配列等を包含する。
本明細書で使用される「ポリアデニル化シグナル配列」は、ポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが後に続く、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼ切断に必要な認識領域を包含する。ポリアデニル化シグナル配列は、「ポリＡ部位」、すなわち、転写後ポリアデニル化によってアデニン残基が付加されるＲＮＡ転写物上の部位を提供する。
本明細書で使用される場合、「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列等が並列しており、エレメントが予測された様式でそれらが作動することを可能にする関係にあることを指す例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を補助する場合、プロモーターはコード領域に作動的に連結される。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、それが比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学の技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。別の例として、そのネイティブなコード配列から取り出され、天然では連結して見られないコード配列に作動的に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶには通常含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
ヌクレオチド分子または遺伝子産物に関して本明細書で使用される「内在性」という用語は、宿主ウイルスまたは細胞に天然に存在するかまたはそれに付随する核酸配列、例えば、遺伝子もしくは遺伝子エレメント、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。
本明細書で使用される「ネイティブ」という用語は、野生型ウイルスまたは細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物、例えば、ＲＮＡ、タンパク質を指す。本明細書で使用される「変異型」という用語は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体、すなわち、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して１００％未満の配列同一性を有するものを指す。換言すると、変異型は、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、変異型は、全長ネイティブポリヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、全長ネイティブポリヌクレオチド配列と７５％または８０％以上（８５％、９０％、または９５％以上等）の同一性、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドであり得る。例えば、変異型は、全長ネイティブポリペプチド配列と７０％以上の配列同一性、例えば、全長ネイティブポリペプチド配列と７５％または８０％以上（８５％、９０％、または９５％以上等）の同一性、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであり得る。変異型はまた、参照（例えば、ネイティブ）配列の断片と７０％以上の配列同一性、例えば、ネイティブ配列と７５％または８０％以上（８５％、９０％、または９５％以上等）の同一性、例えば、９８％または９９％の同一性を共有する参照（例えば、ネイティブ）配列の変異型断片も含み得る。
本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物学的に活性な」という用語は、細胞内の特定の生物学的エレメントに起因する活性を指す。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」またはその断片もしくは変異型の「生物活性」は、抗原性決定基に結合し、それによって免疫学的機能を促進する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型の生物活性は、ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異型が、例えば、結合、酵素活性等のネイティブな機能を行う能力を指す。第３の例として、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列等の生物活性は、調節エレメントまたはその機能的断片もしくは変異型が、それが作動可能に連結した遺伝子の発現の翻訳を調節する、すなわち、それぞれ、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。
「投与」または「導入」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え遺伝子またはタンパク質発現のためのベクターを、細胞に、対象の細胞および／もしくは器官に、または対象に送達することを指す。そのような投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われ得る。遺伝子産物の発現のためのベクターは、典型的には、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクションまたはリポフェクション）によって異種ＤＮＡを細胞に挿入することを意味するトランスフェクション；典型的には、感染病原体、すなわち、ウイルスによって導入することを指す感染；または典型的には、ウイルスで細胞を安定的に感染させること、もしくはウイルス剤（例えば、バクテリオファージ）によって１つの微生物から別の微生物に遺伝子材料を移送することを意味する形質導入によって、細胞に導入することができる。
「形質転換」は、典型的には、異種ＤＮＡを含む細菌、または癌遺伝子を発現しており、したがって、腫瘍細胞等の継続的な成長モードに変換された細胞を指すために使用される。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルであり得る。
典型的には、異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）を細胞に投与、導入、または挿入するために用いられる手段に応じて、細胞は、「形質導入した」、「感染させた」、「トランスフェクトした」、または「形質転換した」と称される。「形質導入した」、「トランスフェクトした」、および「形質転換した」という用語は、異種ＤＮＡの導入方法にかかわらず本明細書において互換的に使用され得る。
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターで形質導入した、感染させた、トランスフェクトした、または形質転換した細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に用いられたものであり、当業者には明白であろう。「宿主細胞」という用語は、元の形質導入した、感染させた、トランスフェクトした、または形質転換した細胞、およびその後代を指すことを理解されたい。
「治療」、「治療すること」等の用語は、概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的予防すること、例えば、対象において疾患もしくはその症状が発生する可能性を低減させるという点では予防的であり得、かつ／または、疾患および／もしくは該疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点では治療的であり得る。「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、その間、またはその後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定させるかまたは低減する、進行中の疾患の治療が特に興味深い。そのような治療は、罹患組織における完全な機能喪失の前に行われることが望ましい。主題の治療法は、疾患の症候性段階の間に、ある場合には、疾患の症候性段階の後に施されることが望ましい。
「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、限定されないが、サルおよびヒトを含むヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ等）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコ等）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット等）を含む哺乳動物を指す。
本発明の種々の組成物および方法を以下に記載する。特定の組成物および方法が本明細書において例示されているが、多くの代替的な組成物および方法のいずれも、本発明を実施する際に使用するのに適用可能であり好適であることを理解されたい。また、本発明の発現構築物および方法の評価は、当該技術分野において標準的な手順を用いて行われ得ることも理解されたい。
本発明の実践には、別段の指示がない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、生化学、および免疫学の従来の技法が用いられる。そのような技法は、各々が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏヌクレオチド Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）等の文献に完全に説明されている。
本発明のいくつかの態様が、例示のために例示的な用途を参照して以下に記載される。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解を提供するために記載されていることを理解されたい。しかしながら、本発明は、特定の詳細のうちの１つ以上を用いずに、または他の方法を用いて実施され得ることは、関連技術分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示される行為または事象の順序によって限定されず、いくつかの行為は、他の行為または事象と異なる順序で、かつ／またはそれと同時に行われ得る。さらに、例示される行為または事象の全てが本発明による方法を実行するために必要であるとは限らない。
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の形態も同様に含むことが意図される。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限り、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものであることが意図される。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容誤差範囲内であることを意味し、それは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、１以内のまたは１を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、およびより好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。代替として、特に生体系または生物学的過程に関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内であることを意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、別段の記載がない限り、特定の値について許容誤差範囲内であることを意味する「約」という用語が想定されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が生じる場合には、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも取って代わることを理解されたい。
特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を排除するように立案され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」等の排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。
別段の指示がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施には、当業者の知識の範囲内である微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法が用いられる。
変異型ＡＡＶカプシドポリペプチド
本開示は、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１タンパク質を提供し、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶまたは親ＡＡＶと比較して１つ以上のアミノ酸改変を含む。特定の実施形態において、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質の２つの隣接するアミノ酸残基の間にアミノ酸挿入を含む。特定の実施形態において、変異型ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ−１０）、ＡＡＶ ｒｈ．１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２．５Ｔ／７ｍ８、ＡＡＶ９／７ｍ８、およびＡＡＶ５／７ｍ８のカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１内に挿入を含む。ＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質およびビリオンは、米国特許第９，２３３，１３１号に記載されており、ＶＰ１をコードするＡＡＶ２．５Ｔのアミノ酸配列が配列番号４２および図１０Ａ〜図１０Ｂとして提供されている。ＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質は、米国特許第Ｎｏ．９，１９３，９５６号に記載されている。ＡＡＶ．７ｍ８は、野生型ＡＡＶ２ゲノムのアミノ酸５８７および５８８の間に７ｍ８挿入物を含む。ＡＡＶ２．５Ｔ／７ｍ８カプシドタンパク質は、７ｍ８挿入物をさらに含むＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質に対応する。
ある特定の実施形態において、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質である。米国特許出願公開第２０１２／０１６４１０６号の配列番号３および図８Ａ〜図８Ｃは、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のアミノ酸配列を示しており、それはまたＫｌｉｍｃｚａｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ４（１０）：ｅ７４６７（Ｏｃｔｏｂｅｒ １４，２００９）にも記載されている。ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿０４９５４２（配列番号３１）に見出すことができる。ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＡＢ９５４５０（配列番号３２）に見出すことができる。本明細書では、ＡＡＶＳｈＨ１０ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応するアミノ酸番号を用いてカプシドタンパク質のアミノ酸改変（特異的アミノ酸挿入を含む）に言及しているが、これらのアミノ酸改変のいずれも、例えば、ＡＡＶＳｈＨ１０の位置に対応する位置で、他の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質に導入され得ることを理解されたい。
特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して増大した網膜細胞または肝細胞の感染性を付与する。ある場合には、網膜細胞は、光受容体細胞（例えば、桿体または錐体）である。他の場合には、網膜細胞はＲＧＣである。他の場合には、網膜細胞はＲＰＥ細胞である。他の場合には、網膜細胞はミュラー細胞である。他の網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞を含む。特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の指向性と比較して変更された指向性を付与する。特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、へパランもしくはヘパラン硫酸への結合増加、および／または硝子体内注射後に内境界膜に結合し、かつそれを横断する能力の増加を付与する。
ある特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１は、約５アミノ酸〜約１１アミノ酸長のペプチドの挿入を含む。特定の実施形態において、ペプチドの挿入は、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、または１１アミノ酸の長さを有する。これらの挿入は、集合的に「７ｍ８挿入」と称される。
ある特定の実施形態において、７ｍ８挿入ペプチドは、本明細書に記載される式のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。例えば、挿入ペプチドは５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、その場合、挿入ペプチドは式Ｉ：
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３Ｙ４（配列番号１）のものであり、
式中、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は、独立して、存在しないかまたは存在し、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ１は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ６は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ７は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、ＰｒｏおよびＡｓｎから選択される。
別の例として、７ｍ８挿入ペプチドは５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、その場合、挿入ペプチドは式ＩＩａ：
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３Ｙ４（配列番号２）のものであり、
式中、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は、独立して、存在しないかまたは存在し、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択され、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は任意のアミノ酸であり、
Ｘ５はＴｈｒであり、
Ｘ６はＡｒｇであり、
Ｘ７はＰｒｏである。
別の例として、挿入ペプチドは５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、その場合、挿入ペプチドは式ＩＩｂ：
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３Ｙ４（配列番号３）のものであり、
式中、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は、独立して、存在しないかまたは存在し、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ１は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、ＬｅｕおよびＡｓｎから選択され、
Ｘ２は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、ＧｌｙおよびＧｌｕから選択され、
Ｘ３は、ＧｌｕおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ４は、ＴｈｒおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ５はＴｈｒであり、
Ｘ６はＡｒｇであり、
Ｘ７はＰｒｏである。
別の例として、７ｍ８挿入ペプチドは５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、その場合、挿入ペプチドは式ＩＩＩ：
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３Ｙ４（配列番号４）のものであり、
式中、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は、独立して、存在しないかまたは存在し、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ１は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、Ｌｙｓであり、
Ｘ２は、ＡｌａおよびＡｓｐから選択され、
Ｘ３は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択され、
Ｘ４は、ＧｌｎおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ６は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ７は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、Ａｓｎである。
別の例として、挿入ペプチドは５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、その場合、挿入ペプチドは式ＩＶ：
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３Ｙ４（配列番号５）のものであり、
式中、
Ｙ１〜Ｙ４の各々は、独立して、存在しないかまたは存在し、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ１は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは不変アミノ酸であるか、またはＬｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ２は、負に荷電したアミノ酸もしくは不変アミノ酸であるか、またはＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ３は、負に荷電したアミノ酸もしくは不変アミノ酸であるか、またはＧｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、もしくはＰｒｏから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ５は、極性アミノ酸、アルコール（遊離ヒドロキシル基を有するアミノ酸）、もしくは疎水性アミノ酸であるか、またはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ６は、正に荷電したアミノ酸もしくは不変アミノ酸であるか、またはＡｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ７は、存在しないかまたは存在し、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは不変アミノ酸であるか、またはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、およびＡｒｇから選択される。
非限定的な例として、７ｍ８挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号７）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号８）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号９）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１０）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１１）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号１２）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号１３）から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
ある場合には、７ｍ８挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号７）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号８）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号９）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１０）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１１）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号１２）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号１３）のうちのいずれか１つのアミノ末端および／またカルボキシ末端に１〜４個のスペーサーアミノ酸（Ｙ１〜Ｙ４）を有する。好適なスペーサーアミノ酸は、限定されないが、ロイシン、アラニン、グリシン、セリンを含む。
例えば、ある場合には、７ｍ８挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号１５）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号１６）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号１７）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号１８）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１９）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号２０）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号２１）。別の例として、ある場合には、７ｍ８挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号２２）；ＡＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２３）、ＡＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号２４）、およびＡＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号２５）。さらに別の例として、ある場合には、７ｍ８挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号２６）；ＧＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２７）、ＧＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号２８）、およびＧＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号２９）。別の例として、ある場合には、挿入ペプチドは、ＡＡによってＣ末端上で、かつＡによってＮ末端上で隣接されるＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１０）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１１）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号１２）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号１３）のうちの１つを含むか、または、ＧによってＣ末端上で、かつＡによってＮ末端上で隣接されるＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１０）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１１）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号１２）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号１３）のうちの１つを含む。ある特定の実施形態において、７ｍ８は、５〜１２アミノ酸残基のランダム配列である。
ある特定の実施形態において、７ｍ８アミノ酸挿入物は、以下のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる：ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）。特定の実施形態において、７ｍ８挿入物は、アミノ酸配列：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）、またはその少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つの連続するアミノ酸を含む断片を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態において、７ｍ８挿入物は、アミノ酸配列：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、またはその少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つの連続するアミノ酸を含む断片を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）およびＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むｍ７８挿入を含む。特定の実施形態において、これらの挿入物のいずれかは、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６のアミノ酸残基４５０〜４６４内に存在し、例えば、アミノ酸残基４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、または４６４のＣ末端に直接挿入される。
いくつかの実施形態において、主題の変異型ＡＡＶカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対する７ｍ８挿入以外に、任意の他のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含まない。他の実施形態において、主題の変異型ＡＡＶカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対する７ｍ８挿入に加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して１〜約２５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、主題の変異型カプシドポリペプチドは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ。いくつかの実施形態において、主題の変異型カプシドポリペプチドは、７ｍ８挿入ペプチドに加えて、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ。
いくつかの実施形態において、変異型ＡＡＶカプシドポリペプチドは、キメラカプシドであり、例えば、カプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドの一部と、第２の血清型のＡＡＶカプシドの一部とを含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質に対して７ｍ８挿入を含む。
いくつかの実施形態において、主題の変異型カプシドタンパク質は、野生型または親カプシドタンパク質に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、例えば、ＶＰ１と、対応する野生型または親ＡＡＶカプシドタンパク質に対する７ｍ８挿入とを含む。
いくつかの実施形態において、主題の変異型カプシドタンパク質は、単離される、例えば、精製される。ある場合には、主題の変異型カプシドタンパク質は、同様に提供されるＡＡＶベクターに含まれる。後に詳細に記載されるように、主題の変異型カプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオンに含まれてもよい。
７ｍ８挿入物は、ＡＡＶカプシドタンパク質内の種々の部位に挿入され得る。特定の実施形態において、変異型カプシドタンパク質は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１であり、７ｍ８挿入部位は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質の可変領域ＩＶ内にある。シャッフル（ＳｈＨ）ライブラリからのＡＡＶ６親血清型に由来するＡＡＶＳｈＨ１０は、野生型ＡＡＶ６またはＡＡＶ２と比較して、ミュラー細胞を形質導入するための増大した感染性および効率を有することが示されている。（Ｋｌｉｍｃｚａｋ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ４（１０）：ｅ７４６７（Ｏｃｔｏｂｅｒ １４，２００９））。ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドは、本明細書において代替的に「ＳｈＨ１０」と称され、この用語は互換的に使用される。野生型ＡＡＶ１ウイルスは、ＡＡＶ６と密接に関連しており、５つのアミノ酸置換を除いては同一のカプシドアミノ酸配列を有する。ＡＡＶ１ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＰ＿０４９５４２（配列番号３１）に見出すことができ、ＡＡＶ６ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＡＡＢ９５４５０（配列番号３２）に見出すことができる。ある特定の他の実施形態において、変異型カプシドは、本明細書に記載されるものを含むがそれらに限定されない、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、または任意の他のＡＡＶ血清型もしくはその誘導体であり、存在する場合、７ｍ８挿入は、ＡＡＶＳｈＨ１０の可変領域ＩＶに対応するＡＡＶの領域に存在する。ある特定の実施形態において、７ｍ８挿入は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質の３倍突起部（３−ｆｏｌｄ ｐｒｏｔｕｓｉｏｎ）の先端もしくはその付近、塩基性アミノ酸残基４５９もしくはその付近、またはヘパラン硫酸プロテオグリカン結合部位もしくはその付近、あるいは別のＡＡＶ血清型または誘導体の対応する部位に存在する。特定の実施形態において、「付近」とは、目的のアミノ酸または部位のアミノ酸残基２つ以内、３つ以内、４つ以内、または５つ以内を意味する。例えば、７ｍ８挿入部位は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のアミノ酸４５０〜４６０もしくはアミノ酸４５０〜４６４以内、例えば、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１の４５０および４５１、４５１および４５２、４５２および４５３、４５３および４５４、４５４および４５５、４５５および４５６、４５６および４５７、４５７および４５８、４５８および４５９、４５９および４６０、４６０および４６１、４６１および４６２、４６２および４６３、もしくは４６３および４６４の間から選択される２つの隣接するアミノ酸の間、または、任意の他のＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１の対応するアミノ酸残基の間にあってもよい。特定の実施形態において、挿入は、ＡＡＶＳｈＨ１０のアミノ酸残基４５７および４５８の間（ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７））、４５８および４５９の間（ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８））、または４５９および４６０（ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９））の間である。
特定の実施形態において、改変カプシドタンパク質は、ＵＳ９，４４１，２４４、ＵＳ９，２３３，１３１、ＵＳ２００１６００１７２９５、ＵＳ７，２２０，５７７、ＷＯ２０１５／１６８６６６、ＵＳ７，８６７，４８４、ＵＳ８，８０２，０８０、ＵＳ２０１５／０００５３６９、ＵＳ７，１７２，８９３、ＷＯ２０１５／１３４６４３、ＵＳ６，９６２，８１５、ＵＳ７，７４９，４９２、ＵＳ２０１６／００４０１３７、ＵＳ２００９／０３１７４１７、ＵＳ２０１４／０３３６２４５、ＵＳ７，６２９，３２２、ＷＯ２０１６／１３３９１７、ＷＯ２０１５／１２１５０１、ＵＳ９，４０９，９５３、ＵＳ８，８８９，６４１、またはＵＳ２０１５／０１５２１４２に開示されていない。
本開示はまた、１つ以上の本明細書に記載の変異型カプシドをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは発現ベクターであり、発現ベクターは、プロモーター配列、例えば、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結された本明細書に記載の変異型カプシドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、プロモーター配列は、１つ以上の組織または細胞型、例えば、網膜、肝臓、網膜細胞、または肝実質細胞における発現を優先的に駆動する組織特異的プロモーターである。
本開示は、本明細書に記載の変異型カプシドをコードするポリヌクレオチドまたベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは発現ベクターであり、発現ベクターは、プロモーター配列、例えば、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結された本明細書に記載の変異型カプシドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはベクターは、ｒｅｐタンパク質、例えば、ＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質をコードする配列をさらに含む。ある特定の実施形態において、細胞はヘルパー細胞または宿主細胞であり、例えば、変異型カプシドタンパク質を含むビリオンを産生するために使用され得るＨＥＫ２９３細胞である。主題のｒＡＡＶ組成物の調製において、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、微生物および酵母を含む、ｒＡＡＶビリオンを産生するための任意の宿主細胞が用いられ得る。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が宿主細胞において安定に維持されるパッケージング細胞であってもよいか、またはＡＡＶベクターゲノムが安定に維持およびパッケージングされるプロデューサー細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞およびプロデューサー細胞は、Ｓｆ−９、２９３、Ａ５４９、またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して精製および製剤化される。
組換えビリオンおよびウイルスベクター
本発明は、組換えウイルスまたはビリオン、例えば、本開示の変異型カプシドタンパク質を含む遺伝子送達ベクターまたは遺伝子治療ベクターを含む。
ある特定の実施形態において、ウイルスまたはビリオンは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、αウイルスまたはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））またはレンチウイルスに由来するウイルスベクターである。アデノ随伴ウイルスの使用を包含する実施形態が以下により詳細に記載されているが、当業者は、当該技術分野における同様の知見および技術が非ＡＡＶ遺伝子治療ベクターにも影響を与えるようになり得ることを理解するであろうと予想される例えば、米国特許第７，５８５，６７６号および米国特許第８，９００，８５８号におけるレトロウイルスベクターに関する考察、ならびに例えば、米国特許第７，８５８，３６７号におけるアデノウイルスベクターに関する考察を参照されたく、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、組換えウイルスまたはビリオンは感染性である。ある特定の実施形態において、組換えビリオンまたはウイルスは複製コンピテントである。ある特定の実施形態において、組換えウイルスまたはビリオンは複製非コンピテントである。特定の実施形態において、ビリオンは、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を含むＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６である。
いくつかの実施形態において、組換えビリオンまたはウイルスは、例えば、遺伝子産物、例えば、治療用遺伝子産物をコードする配列を含むポリヌクレオチドカセットをさらに含むＡＡＶである。ある特定の実施形態において、遺伝子産物をコードする配列は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドカセットは、機能的ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列によって５’および３’上で隣接される。「機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに関して意図されるように機能することを意味する。したがって、本発明の遺伝子送達ベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によって変更されてもよいか、または、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０のいずれかに由来してもよい。ある特定のＡＡＶベクターは、全体的または部分的に欠失した野生型ＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子を有するが、機能的な隣接するＩＴＲ配列を保持する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスまたはビリオンは、遺伝子産物、例えば、治療用遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はアプタマーである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的ヌクレアーゼである。
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉは、細胞中のアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉを含む。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低下させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。その遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書において「プロアポトーシス遺伝子」と称され、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「プロアポトーシス遺伝子産物」と称される。プロアポトーシス遺伝子産物は、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、およびＢａｄ遺伝子産物を含む。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。
干渉ＲＮＡは、血管新生産物、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ｃａｎｄ５、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、およびＲｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照のこと）、ＶＥＧＦＲ１（例えば、Ｓｉｒｎａ−０２７、例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：２２５を参照のこと）、またはＶＥＧＦＲ２（Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）にも対抗し得る。米国特許第６，６４９，５９６号、同第６，３９９，５８６号、同第５，６６１，１３５号、同第５，６３９，８７２号、および同第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号および同第７，９１９，４７３号も参照されたい。
遺伝子産物がアプタマーである場合、対象となる例示的アプタマーは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーを含む。例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１８９０２を参照されたい。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’−ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ−３’（配列番号３０）を含むことができる。ＰＤＧＦ特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用に適しており、例えば、Ｎｉ ａｎｄ Ｈｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１、およびＡｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７）を参照されたい。
遺伝子産物がポリペプチドである場合、ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を増強し得る。例示的なポリペプチドとして、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ、およびＮＴＮ）、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照のこと）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ−２受容体等）、メタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）の組織阻害剤、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ）等が挙げられる。好適なポリペプチドとして、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ結合阻害剤、およびソニックヘッジホッグ、ならびにこれらのいずれかの機能的変異型および断片、例えば、これらのポリペプチドのいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する変異型、およびこれらのポリペプチドまたはその変異型のいずれかの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む断片が挙げられる。
好適な光応答性オプシンは、例えば、米国特許公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、ＣｈＲ２；Ｃｈｏｐ２）、米国特許公開第２００１／００８６４２１号、米国特許公開第２０１０／００１５０９５号、およびＤｉｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３８７に記載されるような光応答性オプシンを含む。
好適なポリペプチドはまた、例えば、レチノスキシン、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３を参照のこと）、ペリフェリン−２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ．ｓｕｂ．−０００３１３を参照のこと）、ペリフェリン、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０、およびＭｏｒｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３０８８を参照のこと）、
欠陥があるかまたは欠損するとコロイデレミアを引き起こすポリペプチドであるＣＨＭ（コロイデレミア（Ｒａｂエスコートタンパク質１））、（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７、およびｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照のこと）、および欠陥があるかまたは欠損するとレーバー遺伝性視神経萎縮症および網膜色素変性症を引き起こすポリペプチドであるＣｒｕｍｂｓ相同体１（ＣＲＢ１）（例えば、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＭ２３３２８を参照のこと）も含む。
好適なポリペプチドはまた、欠陥があるかまたは欠損すると色覚障害を引き起こすポリペプチドも含み、そのようなポリペプチドとして、例えば、錐体光受容体細胞ｃＧＭＰゲートチャネルサブユニットα（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２８９、およびＢｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１６０−１６７を参照のこと）、錐体光受容体細胞ｃＧＭＰゲートカチオンチャネルβサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照のこと）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、α形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、およびＡＣＨＭ５、ならびに欠陥があるかまたは欠損すると種々の色盲をもたらすポリペプチド（例えば、Ｌ−オプシン、Ｍ−オプシン、およびＳ−オプシン）が挙げられる。Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６１（７２６５）：７８４−７８７を参照されたい。
ある場合には、対象となる遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、該エンドヌクレアーゼは、網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合、網膜構造タンパク質であり、かつ／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠陥のあるコピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子を標的とし、該欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。
欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡで相同組換えを刺激するために使用することもできるしたがって、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達するために用いることができるとともに、欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーを送達するためにも用いることができ、欠陥のある対立遺伝子の修復をもたらし、それによって、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリン等）の産生をもたらす。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列とを含み、機能的コピーは、機能的網膜タンパク質をコードする。機能的網膜タンパク質は、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質−１、ペリフェリン、ペリフェリン−２等を含む。
使用に適した部位特異的エンドヌクレアーゼとして、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、天然に存在せず、特定の遺伝子を標的化するように改変される。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼを操作して、ゲノム内の特定の位置を切断することができ、次いで、非相同末端結合が、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失する一方で、その破損を修復することができる。次いで、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、タンパク質をフレームから追放し、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている。他の実施形態において、対象となる遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に結合されている。いくつかの場合において、対象となる遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞特異的調節エレメントに作動可能に結合されている。ある特定の実施形態において、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択される。
例えば、いくつかの場合において、対象となる遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体細胞特異的調節エレメント（例えば、光受容体細胞特異的プロモーター）、例えば、光受容体細胞における作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する調節エレメントに作動可能に連結されている。好適な光受容体細胞特異的調節エレメントとして、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）上記参照）、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）上記参照）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）が挙げられる。
例えば、いくつかの場合において、対象となる遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、肝臓または肝実質細胞特異的調節エレメント（例えば、肝臓特異的プロモーター）、例えば、肝細胞、例えば、肝実質細胞において作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する調節エレメントに作動可能に連結されている。好適な肝臓特異的調節エレメントとして、例えば、単独のもしくはヒトα１アンチトリプシンコアプロモーターと組み合わせたアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ−Ｉ肝臓制御領域、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）のコアプロモーターに連結されたα１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つもしくは２つのコピー、またはＫａｔｔｅｎｈｏｒｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６ Ｄｅｃ １；２７（１２）：９４７−９６１に要約されるように、「ＥＴ」と称され、マウストランスサイレチンプロモーターに連結されたランダムに組み立てられた肝実質細胞特異的転写因子結合部位として説明されるプロモーター領域が挙げられる。発現は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含めることによりさらに安定させることができる。
本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質と、任意選択的に本開示の封入ポリヌクレオチドカセットとを含む組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶビリオン）は、標準的な方法を用いて産生することができる。例えば、ｒＡＡＶビリオンの場合、ポリヌクレオチドカセットを含むＡＡＶ発現ベクターをプロデューサー細胞に導入した後に、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶヘルパー構築物を導入してもよく、ヘルパー構築物は、プロデューサー細胞において発現させることが可能なＡＡＶコード領域を含み、ＡＡＶベクターの非存在下でＡＡＶヘルパー機能を補完する。この後、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターがプロデューサー細胞に導入され、ヘルパーウイルスおよび／または追加のベクターは、効率的なｒＡＡＶウイルス産生を支持することが可能なアクセサリー機能を提供する。次いで、プロデューサー細胞を培養してｒＡＡＶを産生させる。これらのステップは、標準的な方法を使用して行われる。本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含む複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を用いて、当該技術分野で既知の標準的な技法によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号、同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号、および同第６，５４８，２８６号に見出すことができ、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる、パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇらの（ＵＳ２００２／０１６８３４２）に記載されている。
添付の実施例に開示されるように、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質は、変異型カプシドタンパク質を含むビリオンに高いまたは変更された細胞指向性を付与する。したがって、所望の細胞型に対するその指向性を高めるために、ウイルスまたはビリオンの指向性を高めるまたは変化させるように変異型カプシドを使用することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、例えば、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含まない対応するビリオンまたはウイルスベクターと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の親和性で、へパランまたはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、例えば、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含まない対応するビリオンまたはウイルスベクターと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の親和性で、ＩＬＭに結合する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、例えば、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含まない対応するビリオンまたはウイルスベクターと比較して、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満低下した免疫原性を有する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、硝子体内注射によって送達されると網膜に遺伝子産物を送達することができ、それらは、例えば、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含まない対応するビリオンまたはウイルスベクターと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の遺伝子産物の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むこれらのビリオンまたはウイルスベクターは、より高いレベルで網膜細胞を選択的に形質導入することが可能であるため、それらは１つ以上の他の眼細胞型を形質導入する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、静脈内注射または注入によって送達されると肝臓に遺伝子産物を送達することができ、それらは、例えば、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含まない対応するビリオンまたはウイルスベクターと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍の遺伝子産物の発現をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むこれらのビリオンまたはウイルスベクターは、より高いレベルで肝細胞を選択的に形質導入することが可能であるため、それらは心臓等の１つ以上の他の器官を形質導入する。
ある特定の実施形態において、添付の実施例に記載されるように、ビリオンまたはウイルスベクターは、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍ、例えば、０．２Ｍ、０．３Ｍ、または０．４Ｍの塩濃度でヘパランカラムから溶出されるような結合親和性でへパランまたはヘパラン硫酸に結合する。
薬学的組成物
本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターと、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む薬学的組成物もまた開示される。主題のビリオンまたはベクターは、一般に安全、無毒性、かつ望ましい製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤、および試薬と組み合わせることができ、霊長類への使用が許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であり得るか、または、エアロゾル組成物の場合には気体であり得る。そのような担体または希釈剤の例として、限定されないが、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。また、補助的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁物として、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化化合物；アセテート、シトレートまたはホスフェート等の緩衝液；凝集を防止するためのＴｗｅｅｎ２０等の洗浄剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧を調整するための化合物を挙げることができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態において、薬学的組成物は無菌である。眼細胞をインビボで接触させる場合、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、眼への送達に適切であるように処理され得る。
薬学的組成物は、滅菌水溶液、または滅菌注射液もしくは分散液を即時調製するための分散液および滅菌粉末をさらに含み得る。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ある場合には、組成物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度まで流体であるべきである。ある特定の実施形態において、組成物は製造および保存条件下で安定であり、また、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護される。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。内部組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
滅菌溶液は、必要に応じて、上に列挙される成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒に、必要とされる量のベクターまたはビリオンを組み込み、その後で濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒、および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
一実施形態において、薬学的組成物は、ビリオンまたはベクターを体からの急速な排出から保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明白であろう。材料は、商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
経口組成物、点眼組成物、または非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために単位剤形に製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象のために単位として用いられる投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のために活性化合物を調合する技術分野に固有の制限によって左右され、かつそれらに直接依存する。
哺乳動物細胞を効率的に形質導入するのに適した任意の濃度のウイルス粒子を調製することができる。例えば、ウイルス粒子は、１０８ベクターゲノム／ｍＬ以上、例えば、５×１０８ベクターゲノム／ｍＬ、１０９ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０９ベクターゲノム／ｍＬ、１０１０ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０１０ベクターゲノム／ｍＬ、１０１１ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０１１ベクターゲノム／ｍＬ、１０１２ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０１２ベクターゲノム／ｍＬ、１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、１．５×１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、３×１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、７．５×１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、９×１０１３ベクターゲノム／ｍＬ、１×１０１４ベクターゲノム／ｍＬ、５×１０１４ベクターゲノム／ｍＬまたはそれ以上であるが、典型的には１×１０１５ベクターゲノム／ｍＬ以下の濃度で製剤化され得る。
主題のウイルスベクターは、限定されないが、１×１０８ベクターゲノム以上、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、または１×１０１３ベクターゲノム以上、ある特定の場合には１×１０１４ベクターゲノムであるが、通常は４×１０１５ベクターゲノム以下を含む好適な単位投薬量に製剤化され得る。ある場合には、単位投薬量は、多くとも約５×１０１５ベクターゲノム、例えば、１×１０１４または５×１０１４ベクターゲノムまたはそれ以下、例えば、１×１０１３、１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０、または１×１０９ベクターゲノムもしくはそれ以下であり、ある特定の場合には１×１０８ベクターゲノムまたはそれ以下であり、典型的には１×１０８ベクターゲノムまたはそれ以上である。ある場合には、単位投薬量は、１×１０１０〜１×１０１１ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位投薬量は、１×１０１０〜３×１０１２ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位投薬量は、１×１０９〜３×１０１３ベクターゲノムを含む。ある場合には、単位投薬量は、１×１０８〜３×１０１４ベクターゲノムを含む。
ある場合には、薬学的組成物の単位投薬量は、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定することができる。ＭＯＩは、核酸が送達され得る細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比率または多重度を意味する。ある場合には、ＭＯＩは１×１０６であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０６〜１×１０７であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０４〜１×１０８であり得る。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは１×１０８〜３×１０１４ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、多くとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。
いくつかの態様において、薬学的組成物の量は、約１×１０８〜約１×１０１５個の組換えウイルス、約１×１０９〜約１×１０１４個の組換えウイルス、約１×１０１０〜約１×１０１３個の組換えウイルス、または約１×１０１１〜約３×１０１２個の組換えウイルスを含む。
薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサー、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに、投与のための指示書とともに含まれてもよい。
本発明の薬学的組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含む動物に投与されると、生物学的に活性な代謝産物もしくはその残渣を（直接的にまたは間接的に）もたらすことが可能な任意の他の化合物を包含する。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒性学的な影響を付与しない塩を指す。様々な薬学的に許容される塩が当該技術分野で既知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（およびその最新版）、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）に記載されている。また、好適な塩に関する概説については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ ｂｙ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）を参照されたい。
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミン等の金属またはアミンとともに形成される。陽イオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等を含む。アミンは、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９を参照のこと）。当該酸性化合物の塩基付加塩は、従来の様式で遊離酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させて塩を生じさせることによって調製される。遊離酸の形態は、従来の様式で塩の形態を酸と接触させ、遊離酸を単離することによって再生することができる。遊離酸の形態は、極性溶媒中の溶解度等のある特定の物理特性においてそれらのそれぞれの塩の形態とは若干異なるが、他の点においては、塩は、本発明の目的のためにそれらのそれぞれの遊離酸と同等である。
主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、組換えウイルス（ビリオン）は、哺乳動物の患者、具体的には霊長類、より具体的にはヒトに投与するために薬学的組成物に組み込むことができる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、ビリオンは、無毒性、不活性の、薬学的に許容される水性担体中に、好ましくは３〜８に及ぶｐＨ、より好ましくは６〜８までに及ぶｐＨで製剤化することができる。そのような無菌組成物は、再構成の際に許容されるｐＨを有する水性緩衝液に溶解した治療分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される薬学的組成物は、治療有効量のベクターまたはビリオンを、薬学的に許容される担体および／または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホスフェート、ならびにアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤、および他のタンパク質との混合物中に含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖等は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル液およびハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、ならびにグリコールである。好ましくは、この製剤は、４℃で少なくとも６カ月間安定である。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される薬学的組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、およびＧｏｏｄらの（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５（２）：４６７に記載されているもの等の当業者に既知の他の緩衝液を含む。特定の実施形態において、緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、および最も好ましくは７．２〜７．４の範囲内であり得る。薬学的組成物は、例えば、眼球送達、硝子体内注射、眼内注射、網膜注射、網膜下注射、非経口投与、静脈内注射または注入、および肝臓への注射を含む、様々な種類の送達のために製剤化され得る。
ウイルス指向性を高めるまたは変更する方法
添付の実施例に開示されるように、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質は、変異型カプシドタンパク質を含むビリオンに高いまたは変更された細胞指向性または組織特異性を付与する。例えば、本明細書に記載のある特定の変異型カプシドタンパク質は、網膜もしくは肝臓の感染性の増大、網膜もしくは肝臓における遺伝子産物の発現レベルの増加、またはＩＬＭへの結合増加と関連している。
所望の細胞型に対するその指向性を高めるために、ウイルスまたはビリオンの指向性を高めるまたは変更するように本明細書に開示される変異型カプシドを使用することができる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、網膜に遺伝子産物を送達するために用いられる。特定の実施形態において、ビリオンは、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）またはミュラー細胞に対して増大した指向性を有する。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、ＩＬＭを横断して遺伝子産物を送達するために用いられる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、例えば、静脈内注射もしくは注入によって、または肝臓内への直接注射によって、肝臓に遺伝子産物を送達するために用いられる。
特定の実施形態において、本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含むビリオンまたはウイルスベクターは、例えば、静脈内注射によって、全身送達を介して肝臓に遺伝子産物を送達するために用いられる。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の位置でウイルスのカプシドタンパク質に１つ以上の７ｍ８挿入を導入することを含む、ウイルス、例えば、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６ウイルスの指向性を変更する方法を提供する。関連する実施形態において、該方法は、ウイルスに本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を組み込むことを含む、ウイルスの指向性を変更する方法を含む。
遺伝子産物を発現させる方法、ならびに疾患および障害を治療する方法
本明細書に記載の変異型カプシドタンパク質を含む本明細書に記載のビリオンおよびウイルスベクターは、細胞、例えば、動物の細胞に導入遺伝子を送達する際に使用することができる。例えば、それらは、例えば、遺伝子が細胞の生存能および／または機能に与える影響を決定するために、研究において使用することができる。別の例として、それらは、例えば、細胞または組織に治療用遺伝子産物を送達することによって、例えば、障害を治療するために、薬物に使用されてもよい。したがって、本発明のいくつかの態様において、細胞を本開示の組成物と接触させることを含む、インビトロまたはインビボでの細胞における遺伝子の発現のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、接触はインビトロで行われる。いくつかの実施形態において、接触はインビボで行われる、すなわち、主題の組成物が対象に投与される。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、非経口的に、例えば、静脈内に、経口的に、または注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、注射によって眼に投与され、例えば、網膜、網膜下、または硝子体に投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、網膜注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、静脈内注射または注入によって、非経口的に投与することができる。ある特定の実施形態において、組成物は、例えば、肝臓への注射を介して、対象となる組織または器官に局所的にまたは直接的に投与される。
哺乳動物細胞を、本明細書に開示される変異型カプシドタンパク質を含む主題のバイロンまたはベクターベクターとインビトロで接触させる特定の実施形態における場合、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来し得る。細胞は、樹立細胞株、例えば、ＷＥＲＩ細胞、６６１Ｗ細胞に由来してもよいか、または初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、対象から誘導されて、培養物の限られた数の継代、すなわち分割のためにインビトロで成長させた細胞および細胞培養物を指すために本明細書において互換的に使用される。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されたが、クライシス期を経るのに十分な回数は継代されていない培養物である。典型的には、本開示の初代細胞株は、インビトロで１０回未満の継代の間維持される。
細胞が初代細胞である場合、任意の好都合な方法、例えば、全外植、生検等によって哺乳動物から細胞を採取することができる。適切な溶液が、採取された細胞の分散または懸濁のために使用され得る。そのような溶液は、概して、低濃度の、通常５〜２５ｍＭの許容される緩衝液とともに、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合よく補充した、平衡塩類溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液等である。好都合な緩衝液として、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。細胞は、直ちに使用されてもよいか、または長期間にわたって凍結保存されてもよく、解凍して再使用することができる。そのような場合、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地、またはそのような凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般に使用されるいくつかの他のそのような溶液中で細胞を凍結させ、凍結させた培養細胞を解凍するための当該技術分野で一般的に知られている様式で解凍する。
ある特定の実施形態において、導入遺伝子の発現を促進するために、変異型カプシドタンパク質を含む主題のバイロンまたは遺伝子送達ベクターを、細胞と約３０分〜２４時間またはそれ以上、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間等接触させる。変異型カプシドタンパク質を含む主題のバイロンまたは遺伝子送達ベクターは、主題の細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回より多く提供されてもよく、各接触事象後のいくらかの時間、例えば、１６〜２４時間、細胞を薬剤（複数可）とともにインキュベートすることができ、その期間後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。細胞を接触させることは、細胞の生存を促進する任意の培養培地において、かつ任意の培養条件下で行われ得る。例えば、細胞は、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清（約５〜１０％）、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ １６４０等の好都合な任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有してもよい。本明細書において定義される増殖因子は、膜貫通受容体に対する特異的な効果を通じて、培養物中またはインタクトな組織中のいずれかで、細胞の生存、成長および／または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。
ある特定の実施形態において、細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために、有効量の、変異型カプシドタンパク質を含むバイロンまたは遺伝子送達ベクターが提供される。特定の実施形態において、有効量は、例えば、導入遺伝子の遺伝子産物の存在またはレベルを検出することによって、細胞の生存能または機能に対する影響を検出すること等によって、経験的に容易に決定することができる。ある特定の実施形態において、有効量の、変異型カプシドタンパク質を含む主題のビリオンまたは遺伝子送達ベクターは、同量の当該技術分野で既知の参照ビリオンまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ２．５ＴまたはＡＡＶ７ｍ８と比べて、細胞における導入遺伝子の等しいまたはより高い発現を促進する。ある特定の実施形態において、発現は、参照または対照バイロンまたはウイルスベクターからの発現と比較して２倍またはそれ以上、例えば、３倍、４倍、または５倍もしくはそれ以上、いくつかの場合において１０倍、２０倍または５０倍もしくはそれ以上、例えば、１００倍増強される。ある特定の実施形態において、発現の増強は、特定の細胞型、例えば、本明細書に記載される癌細胞のいずれかにおいて生じる。
細胞を、本明細書に記載される変異型カプシドタンパク質を含む主題のバイロンまたは遺伝子送達ベクターとインビトロで接触させる場合、対象は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、または霊長類であり得る。本開示の方法および組成物は、少なくとも一部、細胞の遺伝子治療によって対処することができる任意の状態の治療に使用される。したがって、本開示の組成物および方法は、細胞療法を必要とする個体の治療に使用される。細胞は、限定されないが、血管、眼、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、胃、腸管、膵臓、および皮膚を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の組換えビリオンまたはベクターを含む薬学的組成物を眼内注射によって対象に投与することを含む、眼、例えば、対象の網膜に遺伝子産物を提供する方法を提供し、組換えウイルスは、本明細書に開示される変異型カプシドと、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含む。ある特定の実施形態において、網膜細胞は、光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。ある場合には、網膜細胞は光受容体細胞、例えば、桿体細胞または錐体細胞である。いくつかの実施形態において、送達は、硝子体内注射、網膜注射、または網膜下注射による。
ある特定の実施形態において、本開示は、眼疾患または眼障害の治療または予防を必要とする対象において眼疾患または眼障害を治療または予防する方法であって、例えば、硝子体内注射によって、本明細書に記載の組換えビリオンまたはベクターを含む薬学的組成物を患者の眼の一方または両方に投与することを含み、組換えウイルスは、本明細書に開示される変異型カプシドと、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、方法を提供する。治療用遺伝子産物は、限定されないが、本明細書に記載されるもののいずれかを含む任意の治療用遺伝子産物であり得る。
主題の方法を用いて治療することができる眼疾患として、限定されないが、急性黄斑神経網膜症、ベーチェット病、脈絡膜血管新生、糖尿病ブドウ膜炎、ヒストプラスマ症、黄斑変性症、例えば、急性黄斑変性症、非滲出性加齢性黄斑変性症および滲出性加齢性黄斑変性症、浮腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、および糖尿病黄斑浮腫、多巣性脈絡膜炎、後眼部位または後眼位置に影響を与える眼外傷、眼腫瘍、網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病網膜症（増殖性糖尿病網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜炎網膜疾患、交感神経性眼炎、フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、ブドウ膜滲出、眼のレーザー治療によって引き起こされたまたはその影響を受けた後眼部状態、光線力学的療法によって引き起こされたまたはその影響を受けた後眼部状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分岐閉塞症、前部虚血性視神経症、網膜症以外の糖尿病性網膜機能不全、網膜分離症、網膜色素変性症、緑内障、アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病（黄色斑眼底）、遺伝性黄斑変性症、脈絡網膜変性、レーバー先天黒内障、先天性停止夜盲症、脈絡膜欠如、バルデ・ビードル症候群、黄斑毛細血管拡張症、レーバー遺伝性視神経萎縮症、未熟児網膜症、ならびに１色覚、１型２色覚、２型２色覚、および３型２色覚を含む色覚障害が挙げられる。
特定の実施形態において、対象は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される１つ以上の疾患または障害を有すると診断されているか、または有することが疑われる。ある特定の実施形態において、遺伝子産物は、血管新生、例えば、対象の網膜における脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する。多くの細胞因子がＣＮＶ生成の調節において重要な役割を果たすことが分かっており、その中には、限定されないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）および他のサイトカイン、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）が含まれ得る。特定の実施形態において、遺伝子産物は、これらの細胞因子のうちの１つ以上を阻害する。
特定の実施形態において、遺伝子産物は、限定されないが、米国特許第５，７１２，３８０号、同第５，８６１，４８４号、および同第７，０７１，１５９に記載されるＶＥＧＦ結合タンパク質またはその機能的断片、ならびに米国特許第７，６３５，４７４号に記載されるＶＥＧＦ結合融合タンパク質等の抗ＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦアンタゴニストである。抗ＶＥＧＦタンパク質は、米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号に記載されるｓＦＬＴ−１タンパク質も含み得る。
本開示の組換えビリオンおよびウイルスベクターは、抗ＶＥＧＦタンパク質またはＶＥＧＦアンタゴニストをコードする配列を含んでもよく、それはＶＥＧＦの活性または産生を部分的にまたは完全に低減または阻害する物質を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ１６５等の特定のＶＥＧＦの活性または産生を直接的にまたは間接的に低減または阻害することができる。さらに、「アンタゴニスト」の上記定義と一致するＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦリガンドまたはその同族受容体のいずれかに対して作用してＶＥＧＦ関連受容体シグナルを低減または阻害する物質を含む。ＶＥＧＦアンタゴニストの例として、アンチセンス分子、ＶＥＧＦ核酸を標的化するリボザイムまたはＲＮＡｉ；抗ＶＥＧＦアプタマー、ＶＥＧＦ自体もしくはその受容体に対する抗ＶＥＧＦ抗体、またはＶＥＧＦのその同族受容体に対する結合を妨げる可溶性ＶＥＧＦ受容体デコイ；アンチセンス分子、同族ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）核酸を標的化するリボザイムまたはＲＮＡｉ；同族ＶＥＧＦＲ受容体に結合する抗ＶＥＧＦＲアプタマーまたは抗ＶＥＧＦＲ抗体；ならびにＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。
「ＶＥＧＦ」という用語は、血管新生または血管新生プロセスを誘導する血管内皮増殖因子を指す。本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ」という用語は、例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、およびＶＥＧＦ１８９を含むＶＥＧＦ−Ａ／ＶＰＦ遺伝子の選択的スプライシングによって生じる、ＶＥＧＦの種々のサブタイプ（血管透過性因子（ＶＰＦ）およびＶＥＧＦ−Ａとしても知られる）を含む（米国特許出願公開第２０１２／０１００１３６号の図２（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと）。さらに、本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ」という用語は、同族ＶＥＦＧ受容体（すなわち、ＶＥＧＦＲ）を通して作用し、血管新生または血管新生プロセスを誘導するＰＩＧＦ（胎盤成長因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅ等のＶＥＧＦ関連血管新生因子を含む。「ＶＥＧＦ」という用語は、ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、例えば、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）（米国特許出願公開第２０１２／０１００１３６号の図４（Ａ）および（Ｂ）を参照のこと）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）（米国特許出願公開第２０１２／０１００１３６号の図４（Ｃ）および（Ｄ）を参照のこと）、またはＶＥＧＦＲ−３（ＦＬＴ−４）に結合する増殖因子のクラスの任意のメンバーを含む。「ＶＥＧＦ」という用語は、「ＶＥＧＦ」ポリペプチド、または遺伝子もしくは核酸をコードする「ＶＥＧＦ」を指して使用され得る。
一実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストである。
一実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ＫＨ９０２ ＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質、２Ｃ３抗体、ＯＲＡ１０２、ペガプタニブ、ベバシラニブ、ＳＩＲＮＡ−０２７、デクルシン、デクルシノール、ピクロポドフィリン、ググルステロン、ＰＬＧ１０１、エイコサノイドＬＸＡ４、ＰＴＫ７８７、パゾパニブ、アキシチニブ、ＣＤＤＯ−Ｍｅ、ＣＤＤＯ−Ｉｍｍ、シコニン、β−ヒドロキシイソバレリルシコニン、もしくはガングリオシドＧＭ３、ＤＣ１０１抗体、Ｍａｂ２５抗体、Ｍａｂ７３抗体、４Ａ５抗体、４Ｅ１０抗体、５Ｆ１２抗体、ＶＡ０１抗体、ＢＬ２抗体、ＶＥＧＦ関連タンパク質、ｓＦＬＴ０１、ｓＦＬＴ０２、ペプチドＢ３、ＴＧ１００８０１、ソラフェニブ、スニチニブ、Ｇ６−３１抗体、またはそれらの薬学的に許容される塩を含む。
一実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体ラニビズマブまたはその薬学的に許容される塩である（重鎖および軽鎖可変領域の配列については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０６０，２６９号（図１）を参照のこと）。ラニビズマブは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ ＧｒｏｕｐのメンバーであるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）の商標で市販されている。
別の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗体ベバシズマブまたはその薬学的に許容される塩である（重鎖および軽鎖可変領域の配列については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０５４，２９７号図１）を参照のこと）。ベバシズマブは、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ ＧｒｏｕｐのメンバーであるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）の商標で市販されている。
別の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、アフリベルセプトまたはその薬学的に許容される塩である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏ ｅｔ ａｌ．２００９）Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９３：１４４−９）。アフリベルセプトは、Ｅｙｅｌｅａ（登録商標）の商標（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で市販されている。
別の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、米国特許第５，８６１，４８４号に記載されるような天然に存在するタンパク質ｓＦｌｔ−１であり、その配列は配列番号１０９によって説明される。またそれには、限定されないが、その機能的断片も含まれ、ｓＦｌｔ−１ドメイン２の配列、または米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号の配列番号１２１に記載されるもの、および米国特許第７，６３５，４７４号に開示されるＶＥＧＦ結合融合タンパク質等の関連構築物が挙げられる。抗ＶＥＧＦタンパク質は、米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号に記載されるｓＦＬＴ−１タンパク質、その変異型または断片のいずれかを含んでもよい。より具体的には、ＶＥＧＦ結合ドメイン（ドメイン２）、または代替的にｓＦＬＴ−１のドメイン２、およびｓＦＬＴ１のドメイン３、ＫＤＲ、もしくは別のファミリーメンバーが、ＶＥＧＦに結合して不活性化するために使用され得る。そのような機能的断片は、Ｗｉｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｃｅｌｌ，９１：６９５−７０４に記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ｓＦＬＴ−１」および「ｓＦＬＴ−１の機能的断片」という用語は同等であり、本明細書において互換的に使用される。本明細書における「ｓＦＬＴ−１タンパク質」は、ｓＦｌｔ−１タンパク質またはポリペプチドがＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ受容体に結合するように、天然に存在するヒトｓＦＬＴ−１配列に対して少なくとも９０％、またはそれ以上の相同性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を指す。
これらの配列は、当業者に理解される標準的な技法である遺伝暗号を用いて、そのような配列をコードするＤＮＡから発現させることができる当業者には理解され得るように、遺伝暗号の縮重に起因して、抗ＶＥＧＦタンパク質配列は、いくつかの異なるＤＮＡ配列から容易に発現させることができる。
ＶＥＧＦアンタゴニストは、本明細書に記載のＶＥＧＦアンタゴニストのいずれかおよびＶＥＧＦアンタゴニストまたは相同体のいずれかの機能的断片に対して相同性を有する核酸またはポリペプチドをさらに含む。相同性は、２つの配列間のアラインメントの残基の保存％を指し、限定されないが、機能的断片、挿入、欠失、置換、偽断片、偽遺伝子、スプライス変異型、または人工的に最適化した配列を含む。ある場合には、ＶＥＧＦアンタゴニストは、天然に存在するまたは親ＶＥＧＦアンタゴニストに対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％相同であり得る。ある場合には、ＶＥＧＦアンタゴニストは、天然に存在するまたは親配列に対して、多くとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または１００％相同であり得る。
ある特定の実施形態において、ビリオンもしくはウイルスベクターに変更された指向性を付与する変異型カプシドタンパク質を含むビリオンおよびウイルスベクターは、該ビリオンもしくはウイルスベクターの指向性を増大させた細胞、例えば、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞の疾患もしくは障害を治療するために使用されるか、または、ミュラー細胞に治療用遺伝子産物を送達するために使用される。ある特定の実施形態において、ビリオンまたはウイルスベクターは、光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞からなる群から選択される網膜細胞の疾患または障害を治療するために使用される。ある場合には、網膜細胞は光受容体細胞、例えば、桿体細胞または錐体細胞である。
ある特定の実施形態において、本開示は、例えば、静脈内注射によって、本明細書に記載の組換えビリオンまたはベクターを含む薬学的組成物を対象に非経口投与することを含む、対象の肝臓に遺伝子産物を送達する方法を提供し、組換えウイルスは、本明細書に開示される変異型カプシドと、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含む。
ある特定の実施形態において、肝疾患または肝障害の治療または予防を必要とする対象において肝疾患または肝障害を治療または予防する方法であって、本明細書に記載の組換えビリオンまたはベクターを含む薬学的組成物を対象に、例えば、非経口的にまたは静脈内に投与することを含み、組換えウイルスは、本明細書に開示される変異型カプシドと、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、対象は、遺伝性代謝異常、ウイルス性慢性肝炎、肝硬変、原発性および転移性肝癌、α１アンチトリプシン欠損症、血友病Ｂ、血友病Ａ、遺伝性血管性浮腫、またはβサラセミアからなる群から選択される１つ以上の疾患または障害を有すると診断されているか、または有することが疑われる。肝臓への遺伝子移入も、この器官を、肝臓自体に影響を与えない状態を治療するのに必要な分泌タンパク質の工場に変えるために用いることができる。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターまたはビリオンを含む薬学的組成物を、少なくとも３、６、９、１２、１８、２４、または３６ヶ月に１回の頻度で、それを必要とするヒト対象に投与することを提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターまたはビリオンを含む薬学的組成物を、多くとも３、６、９、１２、１８、２４、または３６ヶ月に１回の頻度で、それを必要とするヒト対象に投与することを提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターまたはビリオンを含む薬学的組成物を、３回未満、１年に２回未満、１年に１回未満、２年に１回未満、または３年に１回未満の頻度でヒト対象に投与することを提供する。
本発明はまた、疾患または障害、例えば、眼疾患もしくは眼障害、または肝疾患もしくは肝障害を治療または予防するための方法であって、改変されたカプシドを含み、かつ本明細書に記載の治療用遺伝子産物をコードするウイルスベクターまたはビリオンを、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。
ある特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターは、追加の治療剤と同時に、またはそれと重複する期間の間に投与され、他の実施形態では、ウイルスベクターが最初に投与されるかまたは追加の治療剤が最初に投与されるかのいずれかであり、一定期間が経過してから、次いで、他のウイルスベクターまたは追加の治療剤が投与される。特定の実施形態において、期間は、少なくとも１日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、または少なくとも３年である。
特定の実施形態において、追加の治療剤は、抗ＶＥＧＦ剤または抗ＰＤＧＦ剤、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ＳＦｌｔ０１またはアフリベルセプトである。特定の実施形態において、追加の治療剤は、抗腫瘍剤または抗炎症剤である。
ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、追加の治療剤、すなわち、追加のウイルスベクターまたはビリオンをコードするポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたはビリオンである。ある特定の実施形態において、追加のウイルスベクターまたはビリオンは、カプシドタンパク質、例えば、改変カプシドタンパク質と同じではないＶＰ１、例えば、本発明のウイルスベクターまたはビリオン中に存在するＶＰ１である。そのような方法は、対象がウイルスベクターまたはビリオン（本発明のウイルスベクターもしくはビリオンであるかまたは追加のウイルスベクターもしくはビリオンである）の１回目の投与後に、その中のウイルス粒子またはカプシドタンパク質に対する自然免疫応答または適応免疫応答を発生した場合に望ましくない免疫応答の可能性を低下させるために用いられてもよく、そのため、同じウイルスベクターまたはカプシドタンパク質の２回目の投与が対象において望ましくない免疫応答をもたらす。ある特定の実施形態において、対象は、本明細書に記載のＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８ウイルスベクターを異なるウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ−１０）、ＡＡＶ ｒｈ．１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２．５Ｔ／７ｍ８、ＡＡＶ９／７ｍ８、またはＡＡＶ５／７ｍ８と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態において、対象は、例えば、眼疾患または眼障害を治療するために、本明細書に記載のＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８ウイルスベクターをＡＡＶ２ベクターまたはその変異型と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態において、対象は、例えば、肝臓において１つ以上の治療用タンパク質を発現させるために、本明細書に記載のＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８ウイルスベクターをＡＡＶｒｈ１０ベクターと組み合わせて投与される。
ある特定の実施形態において、本発明は、疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において疾患または障害を治療または予防する方法であって、薬学的に許容される賦形剤と、第１の組換えウイルスまたはウイルスベクターと、を含む、第１の薬学的組成物であって、当該第１のウイルスまたはベクターは、（ａ）第１の改変カプシドタンパク質であって、第１の改変カプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含む改変ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質であり、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）を含み、挿入部位は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のＶＰ１のアミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、もしくはアミノ酸残基４５８および４５９の間、またはＡＡＶ１もしくはＡＡＶ６カプシドタンパク質の対応する残基に位置する、第１の改変カプシドタンパク質と、（ｂ）第１の治療用遺伝子産物をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、を含む、第１の薬学的組成物を、薬学的に許容される賦形剤と、第２の組換えウイルスまたはウイルスベクターと、を含む、第２の薬学的組成物であって、当該第２のウイルスまたはベクターは、（ａ）第２の改変カプシドタンパク質であって、改変カプシドタンパク質は、改変ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質ではない、第２の改変カプシドタンパク質と、（ｂ）第２の治療用遺伝子産物をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含む、第２の薬学的組成物と組み合わせて、対象に投与することを含む、方法を含む。ある特定の実施形態において、第２の改変カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、または改変ＡＡＶ２カプシドタンパク質、任意選択的にＡＡＶ２．７ｍ８カプシドタンパク質である。第１および第２の治療用遺伝子産物は、同じであるかまたは異なる。ある特定の実施形態において、疾患または障害は眼疾患または眼障害であり、第１および第２の薬学的組成物は、眼に、例えば、硝子体内に投与される。特定の実施形態において、第１および第２の治療用遺伝子産物の一方または両方は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）剤である。特定の実施形態において、疾患または障害は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、疾患または障害は、肝疾患または肝障害であり、第１および第２の薬学的組成物は、非経口的に、任意選択的に静脈内に投与される。種々の実施形態において、第１の薬学的組成物および第２の薬学的組成物は、いずれかの順序で逐次的に投与され、逐次投与の間に一定の期間が経過する。例えば、一定の期間は、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、または少なくとも３年であってもよい。特定の実施形態において、第１および第２の治療用遺伝子産物の一方または両方は、α１アンチトリプシン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｃ１エステラーゼ抑制因子、βグロビン、またはγグロビンである。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、α１アンチトリプシン欠損症、血友病Ｂ、血友病Ａ、遺伝性血管性浮腫、またはβサラセミアからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、主題の方法は、障害の発症を予防する、障害の進行を停止する、障害の進行を逆行させる等の治療上の利益をもたらす。いくつかの実施形態において、主題の方法は、治療上の利益が得られたことを検出するステップを含む。当業者は、そのような治療上の利益の指標が改善される特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性を測定するために用いる適切な検出方法を認識するであろう。
いくつかの場合において、遺伝子産物のレベルを測定すること、治療有効性を測定すること等によって検出される導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以内、例えば、投与後４、３、または２週以内、例えば、投与後１週間に観察され得る。導入遺伝子の発現はまた、経時的に持続することが予想される。したがって、いくつかの場合において、遺伝子産物のレベルを測定すること、治療有効性を測定すること等によって検出される導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以上、例えば、４、６、８、または１０ヶ月以上、いくつかの場合において１年以上、例えば、２、３、４、または５年で、ある特定の場合には５年を超えて観察され得る。
特定の実施形態において、対象は、一方の眼にまたは両方の眼の各々に、約１×１０８ベクターゲノム以上、ある場合には、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、または１×１０１３ベクターゲノム以上、ある特定の場合には１×１０１４ベクターゲノムを投与される。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、多くとも約１×１０１５ベクターゲノム、例えば、１×１０１４または５×１０１４ベクターゲノムまたはそれ以下、例えば、１×１０１３、１×１０１２、１×１０１１、１×１０１０、または１×１０９ベクターゲノムもしくはそれ以下であり、ある特定の場合には１×１０８ベクターゲノム、時には１×１０８ベクターゲノムまたはそれ以上である。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０１０〜１×１０１１ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０１０〜３×１０１２ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０９〜３×１０１３ベクターゲノムである。ある場合には、送達されるベクターゲノムの量は、１×１０８〜３×１０１４ベクターゲノムである。
ある場合には、投与される薬学的組成物の量は、感染多重度（ＭＯＩ）を用いて測定することができる。ある場合には、ＭＯＩは、核が送達され得る細胞に対するベクターまたはウイルスベノムの比率または多重度を指し得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０６であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０６〜１×１０７であり得る。ある場合には、ＭＯＩは１×１０４〜１×１０８であり得る。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは１×１０８〜３×１０１４ＭＯＩである。ある場合には、本開示の組換えウイルスは、多くとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、および１×１０１８ＭＯＩである。
いくつかの態様において、薬学的組成物の量は、約１×１０８〜約１×１０１５粒子の組換えバイロンもしくはウイルス、約１×１０９〜約１×１０１４粒子の組換えバイロンもしくはウイルス、約１×１０１０〜約１×１０１３粒子の組換えバイロンもしくはウイルス、または約１×１０１１〜約３×１０１２粒子の組換えバイロンもしくはウイルスを含む。
いくつかの態様において、ビリオンまたはベクターは、当該薬学的組成物の投与後７、１４、２１、または３０日には、ヒト対象の涙、血液、唾液、または尿試料中で検出されない。いくつかの態様において、ウイルスベクターの存在は、当該技術分野で既知のｑＰＣＲまたはＥＬＢＡによって検出される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の治療方法の後に、対象の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）が１、２、３、４、５列以上矯正される。
いくつかの態様において、投与ステップ後にフルオレセイン血管造影（ＦＡ）によって評価される血管新生の減少が認められる。
ある場合には、治療の効果を調べるために網膜の厚さを測定してもよい。ある場合には、ヒト対象の網膜中心の厚さは、本開示の薬学的組成物を用いた治療後１２ヶ月以内に５０ミクロン、１００ミクロン、または２５０ミクロンを超えて増加しない。ある場合には、ヒト対象の網膜中心の厚さは、本開示の薬学的組成物を用いた治療後３ヶ月、６ヶ月、または９ヶ月、１２ヶ月以内に、少なくとも５０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、２５０ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、５００ミクロン、６００ミクロン減少する。ヒト対象の網膜中心の厚さにおける減少は、ある時点での網膜中心の厚さを、本開示の薬学的組成物の投与の１、３、７、または１０日目またはそれ以内に測定されたベースライン測定値と比較して測定され得る。
本明細書において参照されている、かつ／または出願データシートに列挙されている上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
上記から、本発明の特定の実施形態は例示のために本明細書には記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっては限定されない。
以下の実施例は、当業者に本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために示されるのであって、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が行われる全てのまたは唯一の実験であることを意味するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は、大気圧またはその付近である。
分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）等の標準的な教本に見出すことができる（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。本開示において言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈ等の商業的な供給業者から入手可能である。
実施例１
ＳｈＨ１０変異体の構築
部位特異的変異誘発および組換えＤＮＡ技法を用いて、アミノ酸残基４５６および４５７の間（「ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）」）、アミノ酸残基４５７および４５８の間（「ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）」）、またはアミノ酸残基４５８および４５９の間（「ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）」）にＳｈＨ１０ ＶＰ１カプシドタンパク質のＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）からなる７ｍ８挿入物を含むＳｈＨ１０の変異型を作製した。
導入遺伝子に隣接するＩＴＲを有する発現カセット（例えば、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ）を含む第１のプラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコードする第２のプラスミド、およびアデノウイルスヘルパー機能を含む第３のプラスミドで細胞をトリプルトランスフェクションした後、超遠心分離法により空のカプシドと完全なカプシドとを分離することによりＳｈＨ１０変異型を作製した。
ＳｈＨ１０変異型ウイルスを定量ＰＣＲにより特徴付けて力価およびパッケージングを確立し、ウェスタンブロットを行って、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質の正しい比率を確保した。全てのＳｈＨ１０／７ｍ８変異型をパッケージングし、その結果として高い力価（約１Ｅ１４ｖｇ／ｍｌ）を得、ウェスタンブロットはＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の正しい比率を示した。
実施例２
ＨＥＫ２９３、Ｕ８７、およびＨｅｐＧ２細胞の形質導入
ＨＥＫ２９３、Ｕ８７、およびＨｅｐＧ２細胞に、３×１０５のＭＯＩで５日間インビトロ形質導入を行った。形質導入細胞のパーセンテージおよび央蛍光強度を評価するために、試験終了時に画像を取得し、フローサイトメトリーを行った。
ＳｈＨ１０／７ｍ８変異型は、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、およびＵ８７細胞を親ＳｈＨ１０と同様のレベルで形質導入した。これらの試験の結果を図１〜図３（ＨＥＫ２９３細胞）、図４〜図５（Ｕ８７細胞）、および図６〜図７（ＨｅｐＧ２細胞）に示す。
実施例３
ＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８のへパラン結合親和性
ＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８変異型であるＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）、およびＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）がＨＳＰＧに結合する能力を、充填済みＧＥへパランカラムを用いてへパラン結合アッセイを行うことにより決定した。ベクターをカラムにロードし、次いで洗浄し、最終的に（１００ｍＭから１Ｍに）増大する濃度のＮａＣｌで溶出した。ロード画分、フロースルー画分、洗浄画分、および溶出画分を回収し、図８Ａに概説されるようにＢ１抗体を用いてドットブロットにより分析した。
ＡＡＶＳｈＨ１０／７ｍ８変異型は、へパランカラムに対してＡＡＶ．７ｍ８（７ｍ８）および親ＳｈＨ１０と同様のレベルの結合親和性を示した。図８Ｂ〜図８Ｆは、対照ＡＡＶ．７ｍ８およびＳｈＨ１０（図８Ｂおよび８Ｃ）、ならびにＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図８Ｄ）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）（図８Ｅ）、およびＳｈＨ１０／７ｍ８（４５９）（図８Ｆ）のドットブロットにより決定された結合溶出プロファイルを示す。
実施例４
ＩＶＩＧを用いた中和抗体プロファイル
３倍希釈系列の静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を各ＳｈＨ１０／７ｍ８変異型と混合し、次いで２９３Ｔ細胞上に添加した。それらを３日間インキュベートした後、プレートリーダーを用いて導入遺伝子発現（ＧＦＰ）を測定した。ＩＶＩＧの存在下で導入遺伝子発現の５０％阻害が観察されたときのレベルでＩＣ５０値を求めた。
図９は、約５８のＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）のＩＣ５０値を示しているが、これはＡＡＶ．７ｍ８で観察されたもの（約１２５）（データは示さず）よりも良好である。
実施例５
ブタ網膜外植片における発現および指向性
トランスウェル上に維持したエクスビボブタ網膜外植片を、各々がＧＦＰを発現する親ＳｈＨ１０ウイルス、または変異型ウイルスＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で４×１０４のＭＯＩで形質導入した。形質導入後２週間で外植片を凍結切片化し、プローブしてロドプシン（桿体細胞を検出するため）、ＧＦＡＰ（ミュラー細胞を検出するため）、ＴｕＪ１（網膜神経節細胞を検出するため）、ＣＨＸ１０（双極細胞を検出するため）、およびＧＦＰを検出した。ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１０Ａ〜図１０Ｌ）およびＳｈＨ１０（図１０Ｍ〜図１０Ｐ）について免疫蛍光画像を取得した。
ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）は、親ＳｈＨ１０よりも良好に外植片を形質導入した。種々の細胞層をこの変異型により形質導入した。具体的には、Ｓｈｈ１０／７ｍ８（４５７）の形質導入によって媒介された高レベルのＧＦＰ発現がミュラーグリア細胞および光受容体細胞において観察された。発現は、網膜神経節細胞および双極細胞においても観察された。
実施例６
スナネズミ網膜におけるインビボ発現
スナネズミに、ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０またはＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）のいずれかを２×１０１０ｖｇ／眼で硝子体内（ＩＶＴ）注射した。１２週目を含む種々の時点で眼底画像を取得した。１２週目のデータは、親ＳｈＨ１０（図１１Ａ）だけでなくＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）（図１１Ｂ）からも高レベルの導入遺伝子発現を示した。屠殺後、スナネズミ網膜を単離し、形質導入された細胞を決定するために免疫蛍光標識に使用した。免疫蛍光画像は、光受容体細胞、外顆粒層および内顆粒層、ならびにＲＧＣを含む、ＧＦＰを発現する種々の網膜細胞型を示す（図１１Ｃ〜図１１Ｅ）。
実施例７
アフリカミドリザル網膜におけるインビボ発現
ＧＦＰを発現するＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）またはＳｈＨ１０をアフリカミドリザルに２×１０１２ｖｇ／眼で硝子体内注射した。形質導入後４週目、８週目、および１２週目に、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ機を用いてＯＣＴ画像を取得した。ＳｈＨ１０およびＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）の１２週目の画像を図１２Ａ〜図１２Ｂおよび図１２Ｃ〜図１２Ｄにそれぞれ表す。画像の視覚的評価に基づいて、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）は、より多くの導入遺伝子発現につながるより高いレベルの形質導入を媒介すると考えられた。
１２週間後、サルを屠殺し、網膜を除去した。図１３は、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５７）で形質導入したサルのフラットマウント網膜のライブ蛍光画像を提供する。非ヒト霊長類の網膜の中心窩および周辺部の両方においてＧＦＰの発現が顕著であった。ライブ撮像の後、網膜を凍結切片化し、中心窩および周辺部からの切片をＤＡＰＩ（細胞核を検出するため）（図１４Ｂ、図１５Ｂ）、カルビンディン（双極細胞を検出するため）（図１４Ｃ）、Ｓ−オプシン（短波長感受性錐体を検出するため）（図１４Ｄ）、ＰＮＡ（錐体細胞を検出するため）（図１５Ｃ）、ビメンチン（ミュラー細胞を検出するため）（図１５Ｄ）、およびＧＦＰ（図１４Ｅ、図１５Ｅ）についてプローブした。ＧＦＰの発現は、中心窩において主にカルビンディンと、またそれより低い程度でＳ−オプシンと共存していたことから、その領域におけるミュラーグリアに加えて双極細胞および短波長感受性錐体の形質導入が示唆され、周辺部において主にビメンチンと、またそれより低い程度でＰＮＡと共存していたことから、ミュラー細胞および錐体の形質導入が示唆される。
実施例８
全身送達後のマウスにおけるインビボ発現
雄のへアレスＳＫＨ−１マウスに、以下のウイルスのうちの１つを１×１０１１ｖｇの用量で静脈内注射した：ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＳｈＨ１０、２．５Ｔ／７ｍ８（−３）、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）、ＡＡＶ９／７ｍ８、ＡＡＶ５／７ｍ８、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ３。各ベクターは、ユビキタスなＣＡＧプロモーターによって駆動されたルシフェラーゼを発現した。２週目、４週目、および６週目にＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いてインビボライブ撮像を行い、ルシフェラーゼの発現動態を評価した。ＳｈＨ１０およびＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）で処理したマウスのＩＶＩＳ画像を、それぞれ、図１６Ａ〜図１６Ｃおよび図１７Ａ〜図１７Ｃに示し、図１６Ｄおよび図１７Ｄにそれぞれグラフとして表す。各ウイルスの形質導入後６週間のＩＶＩＳ撮像に基づく総ルシフェラーゼ発現を図１９に示す。６週目に動物を屠殺し、ウルトラクリーン手順を用いて血液、肝臓、心臓、脳、肺、脾臓、膵臓、腎臓、四頭筋、および生殖腺を採取した。逆転写酵素定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いて肝臓、脳、および心臓等の組織を分析して、ルシフェラーゼｍＲＮＡのレベルを決定し、最終的にはタンパク質抽出物中のルシフェラーゼ活性レベルを評価した。
種々の時点でのＩＶＩＳデータは、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）が、ＳｈＨ１０親カプシドと比較して約４倍高いレベルのルシフェラーゼ発現を媒介することを示している（図１８Ａ〜図１８Ｃ）。例えば、６週目の平均発現は、ＳｈＨ１０が５．５×１０６ＲＬＵであったのに対し、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）は１．９×１０７ＲＬＵであった。
肝臓におけるＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）媒介ベクターからのルシフェラーゼ導入遺伝子のｍＲＮＡレベルおよびルシフェラーゼタンパク質の発現は、ＳｈＨ１０と比較して約４倍高かった（図２０Ａ〜図２０Ｃ）。
ＳｈＨ１０によって媒介されたルシフェラーゼ発現と比較して、分析した任意の他の組織においてＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）によって媒介された導入遺伝子の極めて低い発現から無発現が観察された（図２１Ａ〜図２１Ｂおよび図２２Ａ〜図２２Ｂ）。このことは、ＳｈＨ１０／７ｍ８（４５８）が、予想外に、特に肝臓に対して、親ＳｈＨ１０よりも組織特異的であることを示している。

Claims (31)

  1. 非天然の改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）またはアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１４）を含み、前記挿入部位は、ＡＡＶＳｈＨ１０のＶＰ１のアミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、もしくはアミノ酸残基４５８および４５９の間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質の対応する位置に位置する、非天然の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
  2. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６である、請求項１に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質。
  3. 請求項１または請求項２に記載の改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  4. 前記改変ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする前記核酸配列は、プロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  5. 請求項４に記載の発現ベクターを含む、細胞。
  6. 治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５に記載の細胞。
  7. ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５または請求項６に記載の細胞。
  8. 請求項１または請求項２に記載の改変カプシドタンパク質を含む、組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  9. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターはＡＡＶである、請求項８に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  10. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６である、請求項９に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  11. 前記組換えウイルスは、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍの塩濃度でヘパランカラムから溶出される、請求項８〜１０のいずれかに記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  12. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターは、哺乳動物に硝子体内注射されると、内境界膜（ＩＬＭ）に結合し、かつそれを横断することができる、請求項８〜１１のいずれかに記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  13. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターは、治療用遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  14. 前記治療用遺伝子産物は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）剤である、請求項１３に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  15. 前記治療用遺伝子産物は、α１アンチトリプシン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｃ１エステラーゼ抑制因子、βグロビン、またはγグロビンである、請求項１３に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  16. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターは、ＡＡＶＳｈＨ１０またはＡＡＶ６と比較して変更された細胞指向性を有する、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  17. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターは、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６と比較して網膜細胞または肝細胞のより高い感染性を有する、請求項８〜１６のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクター。
  18. 薬学的に許容される賦形剤と、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはウイルスベクターと、を含む、薬学的組成物。
  19. 眼疾患の治療または予防を必要とする対象において眼疾患を治療または予防する方法であって、硝子体内注射により請求項１８に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  20. 前記組換えウイルスまたはウイルスベクターは、改変ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において疾患または障害を治療または予防する方法であって、
    （ｉ）薬学的に許容される賦形剤と、第１の組換えウイルスまたはウイルスベクターと、を含む、第１の薬学的組成物であって、
    （ａ）第１の改変カプシドタンパク質であって、前記第１の改変カプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含む改変ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質であり、前記ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号６）を含み、前記挿入部位は、ＡＡＶＳｈＨ１０カプシドタンパク質のＶＰ１のアミノ酸残基４５６および４５７、アミノ酸残基４５７および４５８、もしくはアミノ酸残基４５８および４５９の間、または前記ＡＡＶ１もしくはＡＡＶ６カプシドタンパク質の対応する残基に位置する、第１の改変カプシドタンパク質と、
    （ｂ）第１の治療用遺伝子産物をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、を含む、第１の薬学的組成物と、
    （ｉｉ）薬学的に許容される賦形剤と、第２の組換えウイルスまたはウイルスベクターと、を含む、第２の薬学的組成物であって、
    （ａ）第２の改変カプシドタンパク質であって、前記改変カプシドタンパク質は、前記改変ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ６カプシドタンパク質ではない、第２の改変カプシドタンパク質と、
    （ｂ）第２の治療用遺伝子産物をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含む、第２の薬学的組成物と、を前記対象に投与することを含む、方法。
  22. 前記第２の改変カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、または改変ＡＡＶ２カプシドタンパク質、任意選択的にＡＡＶ２．７ｍ８カプシドタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第１の薬学的組成物および前記第２の薬学的組成物は、いずれかの順序で逐次的に投与され、前記逐次投与の間に一定の期間が経過する、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
  24. 前記一定の期間は、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、または少なくとも３年である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記第１および第２の治療用遺伝子産物は、同じであるかまたは異なる、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記疾患または障害は眼疾患または眼障害であり、前記第１および第２の薬学的組成物は硝子体内に投与される、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記第１および第２の治療用遺伝子産物の一方または両方は、抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）剤である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記疾患または障害は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
  29. 前記疾患または障害は、肝疾患または肝障害であり、前記第１および第２の薬学的組成物は、非経口的に、任意選択的に静脈内に投与される、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
  30. 前記第１および第２の治療用遺伝子産物の一方または両方は、α１アンチトリプシン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｃ１エステラーゼ抑制因子、βグロビン、またはγグロビンである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記疾患または障害は、α１アンチトリプシン欠損症、血友病Ｂ、血友病Ａ、遺伝性血管性浮腫、またはβサラセミアからなる群から選択される、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3119798B1 (en) 2014-03-17 2020-08-05 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
EA201791939A1 (ru) 2015-03-02 2018-01-31 Адверум Байотекнолоджиз, Инк. Композиции и способы интравитреальной доставки полинуклеотидов в колбочки сетчатки
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
WO2018075798A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
AU2018234918B2 (en) 2017-03-17 2023-11-02 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression
CA3079565A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified vegf-trap
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
EP3856913A4 (en) * 2018-09-26 2022-10-26 California Institute Of Technology ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR TARGETED GENE THERAPY
EP3934698A1 (en) * 2019-03-04 2022-01-12 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of aav gene therapy to contralateral eyes
TW202102526A (zh) * 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
US20220195461A1 (en) * 2019-04-15 2022-06-23 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions for transgene expression
CN115960921A (zh) * 2020-07-29 2023-04-14 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一组肝靶向新型腺相关病毒的获得及其应用
CN112961220B (zh) * 2021-04-19 2023-11-17 信念医药科技(上海)有限公司 腺相关病毒衣壳蛋白及包含其的腺相关病毒载体
CN114686448A (zh) * 2022-03-31 2022-07-01 上海勉亦生物科技有限公司 具有肝脏特异靶向性的纯化的腺相关病毒及其应用
CN113121652B (zh) * 2021-04-19 2022-10-11 上海信致医药科技有限公司 视网膜和肌肉高亲和性腺相关病毒衣壳蛋白及相关应用
TW202313096A (zh) 2021-05-28 2023-04-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 衣殼變異的重組腺相關病毒及其應用
CN113564187A (zh) * 2021-07-30 2021-10-29 上海信致医药科技有限公司 基于aav的抗血管生成基因递送***及其用途
CN117143920A (zh) * 2023-08-30 2023-12-01 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物
CN117368466B (zh) * 2023-12-08 2024-03-12 安徽惠邦生物工程有限公司 用生化分析仪测定尿结合珠蛋白的试剂盒及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529098A (ja) * 1998-11-05 2002-09-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞
JP2014518614A (ja) * 2011-04-22 2014-08-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異体キャプシドを有するアデノ関連ウイルスビリオンおよびその使用方法
US20170044504A1 (en) * 2010-10-06 2017-02-16 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201403260D0 (en) * 2014-02-25 2014-04-09 Univ Manchester Treatment of retinal degeneration using gene therapy
CA2942324C (en) * 2014-03-11 2024-05-14 Wayne State University A modified mglur6 promoter and methods of use

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002529098A (ja) * 1998-11-05 2002-09-10 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞
US20170044504A1 (en) * 2010-10-06 2017-02-16 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
JP2014518614A (ja) * 2011-04-22 2014-08-07 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異体キャプシドを有するアデノ関連ウイルスビリオンおよびその使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIFENG CHEN: "Adeno-associated virus vectors for human gene therapy.", WORLD JOURNAL OF MEDICAL GENETICS, vol. 5, no. 3, JPN6021050885, 2015, pages 28 - 45, ISSN: 0004667086 *
HANEN KHABOU, ET AL.: "Insight Into the Mechanisms of Enhanced Retinal Transduction by the Engineered AAV2 Capsid Variant -", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 113, no. 12, JPN6021050886, 2016, pages 2712 - 2724, XP055832410, ISSN: 0004667085, DOI: 10.1002/bit.26031 *
RYAN R. KLIMCZAK, ET AL.: "A Novel Adeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective Intravitreal Transduction of Rat", PLOS ONE, vol. Volume.4, Issue.10, e7467, JPN6021050888, 2009, pages 1 - 10, ISSN: 0004667084 *

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