JP2020509755A - 高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年3月10日に出願された米国仮特許出願第62/470,153号の利益を主張し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、組み換えタンパク質を産生するための方法、及びそのような方法に使用され、且つ方法により産生される組成物、に関する。具体的には、本開示は、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法、ならびに、そのような方法に使用される組み換えベクター、組み換え宿主細胞、及び発酵に関する。
研究、産業、または治療目的のために必要な多くのタンパク質(例えば、酵素、ワクチン、ホルモン、及びバイオ医薬品タンパク質)は、組み換え宿主細胞内で工業的に産生されている。酵母、特に、出芽酵母は、そのような用途に好まれる真核生物の宿主生物である。酵母細胞は、安価な培地中で高細胞密度まで急速に成長し、タンパク質のフォールディング及び翻訳後修飾(例えば、タンパク質分解性成熟、ジスルフィド結合の形成、リン酸化、O結合型及びN結合型グリコシル化)のための細胞機序を含む。組み換えタンパク質の産生に最も一般に使用される酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、及びクライベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)を含む。これらのうち、ピキア・パストリスは、高密度の細胞成長を達成することができるので、特に、組み換えタンパク質がより大きな(例えば、工業用)規模で産生されることになる用途に適する。
定義
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
組み換え宿主細胞及び発酵、ならびに、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するために、そのような組み換え宿主細胞及び発酵を使用する方法が、本明細書で提供される。
本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、組み換えタンパク質の分泌をもたらすために複数の別個の分泌シグナルを用いる宿主細胞である。
分泌されるために、タンパク質は、それを産生する細胞の細胞内分泌経路を通って運ばれる必要がある。タンパク質は、N末端分泌シグナルにより、選ぶべき細胞の行き先ではなく、この経路に向けられる。少なくとも、分泌シグナルは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは通常、N末端の塩基性アミノ酸及びC末端の極性アミノ酸に隣接する13〜36の、主に疎水性アミノ酸で構成されている。シグナルペプチドは、サイトゾルからERの内腔への新生タンパク質の共翻訳もしくは翻訳後移行を媒介するシグナル認識粒子(SRP)または他の輸送タンパク質(例えば、SND、GET)と相互作用する。ERでは、シグナルペプチドは通常、切断され、タンパク質は、フォールディングし、翻訳後修飾を受ける。次に、タンパク質は、ERからゴルジ体に、次に、分泌小胞及び細胞外部に送達される。シグナルペプチドに加えて、本来分泌が予定される新生タンパク質のサブセットは、リーダーペプチドも含む分泌シグナルを保有する。リーダーペプチドは通常、荷電または極性アミノ酸が割り込む疎水性アミノ酸で構成されている。理論に拘束されることを望むものではないが、リーダーペプチドは、タンパク質の輸送を停滞させ、適切なフォールディングを確実にし、且つ/またはERから、リーダーペプチドが通常切断されるゴルジ体へのタンパク質の輸送を促進すると考えられている。
(a)第1の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする、z個のコピーの第1のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Aにより産生される組み換えタンパク質の分泌収量を測定するステップ、
(b)第2の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする、m個のコピーの第1のポリヌクレオチド配列及びn個のコピーの第2のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Bにより産生される組み換えタンパク質の分泌収量を測定するステップ(組み換え宿主細胞A及び組み換え宿主細胞Bは、第1及び第2のポリヌクレオチド配列のコピー数を除いて同一であり、m+n=zであり、第1及び第2の分泌シグナルは同一ではない)、ならびに
(c)組み換え宿主細胞Bにおいて、組み換え宿主細胞Aで達成されるよりも、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%大きい分泌収量の組み換えタンパク質を提供する第1及び第2の分泌シグナルの組み合わせを選択するステップ
を含む。
本明細書で提供される組み換え宿主細胞に含まれる少なくとも2つのポリヌクレオチド配列によりコードされる組み換えタンパク質は、任意のタンパク質であってよい。
{GGY−[GPG−X1]n1−GPS−(A)n2}n3(式1)
X1=SGGQQまたはGAGQQまたはGQGPYまたはAGQQまたはSQ(式2)
Xqr=Xsqr+Xlqr(式3)、
(式中、Xqrは、2〜20の数であり、Xsqrは、短い準反復の数及び1〜(Xqr−1)の数であり、Xlqrは、長い準反復の数及び1〜(Xqr−1)の数である)である。一部の実施形態では、Xqrは、2〜20の数である。反復単位のアミノ酸配列の非限定例が表3に示される。
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つはさらに、タンパク質のC末端に作動可能に連結されているタグペプチドまたはポリペプチドをコードする。そのようなタグペプチドまたはポリペプチドは、組み換えタンパク質の精製に役立ち得る。タグペプチドまたはポリペプチドの非限定例としては、アフィニティータグ(すなわち、ある特定の薬剤またはマトリックスに結合するペプチドまたはポリペプチド)、可溶化タグ(すなわち、タンパク質の適切なフォールディングを助け、沈殿を防ぐペプチドまたはポリペプチド)、クロマトグラフィータグ(すなわち、特定の分離技術に対して異なる解像度を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変更するペプチドまたはポリペプチド)、エピトープタグ(すなわち、抗体により結合されるペプチドまたはポリペプチド)、蛍光タグ、発色タグ、酵素基質タグ(すなわち、特定の酵素反応の基質であるペプチドまたはポリペプチド)、化学基質タグ(すなわち、具体的な化学修飾の基質であるペプチドまたはポリペプチド)、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアフィニティータグの非限定例としては、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、ポリ(His)タグ、SBPタグ、Strepタグ、及びカルモジュリンタグが挙げられる。好適な溶解度タグの非限定例としては、チオレドキシン(TRX)、ポリ(NANP)、MBP、及びGSTが挙げられる。クロマトグラフィータグの非限定例としては、ポリアニオン性アミノ酸(例えば、FLAGタグ)及びポリグルタミン酸タグが挙げられる。エピトープタグの非限定例としては、V5タグ、VSVタグ、Mycタグ、HAタグ、Eタグ、NEタグ、Haタグ、Mycタグ、及びFLAGタグが挙げられる。蛍光タグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン色蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、橙赤色蛍光タンパク質(OFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、及びそれらの誘導体が挙げられる。酵素基質タグの非限定例としては、ビオチン化に適する配列内にリジンを含むペプチドまたはポリペプチドが挙げられる(例えば、AviTag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質[BCCP])。化学基質タグの非限定例としては、FIAsH−EDT2との反応に適する基質が挙げられる。C末端タグの組み換えタンパク質とのペプチドまたはポリペプチドの融合は、(例えば、TEVプロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子、またはエンテロペプチダーゼにより)切断可能であるか、または切断不可能であり得る。
組み換え宿主細胞は、哺乳動物、植物、藻類、真菌、または微生物のものとし得る。好適な真菌の非限定例としては、メチロトローフ酵母、糸状酵母、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニガー 変種アワモリ(Aspergillus niger var.awamori)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、カンジダ・エチェルシー(Candida etchellsii)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・フミリス(Candida humilis)、カンジダ・リポリティカ(Candida lipolytica)、カンジダ・プソイドトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・ユチリス(Candida utilis)、カンジダ・バーサチルス(Candida versatilis)、デバリオミセス・ハンゼニイ(Debaryomyces hansenii)、エンドティア・パラシティカ(Endothia parasitica)、エレモテシウム・アシュビイ(Eremothecium ashbyii)、フサリウム・モニリフォルメ(Fusarium moniliforme)、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クライベロミセス・ラクチス、クライベロミセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クライベロミセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)、モルティエレラ・ヴィナセア 変種ラフィノースウチライザ(Morteirella vinaceae var.raffinoseutilizer)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ムコール・ミエヘイ 変種コーニーエトエマルソン(Mucor miehei var.Cooney et Emerson)、ムコール・プシルス・リント(Mucor pusillus Lindt)、ペニシリウム・ロックフォルティ(Penicillium roqueforti)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア(コマガタエラ)・パストリス(Pichia(Komagataella)pastoris)、ピキア(シェフェルソミセス)・スティピティス(Pichia(Scheffersomyces)stipitis)、リゾプス・ニベウス(Rhizopus niveus)、ロドトルラ属(Rhodotorula sp.)、サッカロミセス・バヤヌス(Saccharomyces bayanus)、サッカロミセス・ベティカス(Saccharomyces beticus)、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・チェバリエリ(Saccharomyces chevalieri)、サッカロミセス・ディアスタティカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・エリプソイデウス(Saccharomyces ellipsoideus)、サッカロミセス・イグジグース(Saccharomyces exiguus)、サッカロミセス・フロレンチヌス(Saccharomyces florentinus)、サッカロミセス・フラギリス(Saccharomyces fragilis)、サッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、サッカロミセス・ポンべ(Saccharomyces pombe)、サッカロミセス・サケ(Saccharomyces sake)、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)、スポリディオボラス・ジョンソニイ(Sporidiobolus johnsonii)、スポリディオボラス・サルモニカラー(Sporidiobolus salmonicolor)、スポロボロミセス・ロゼウス(Sporobolomyces roseus)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesi)、キサントフィロミセス・デンドロロウス(Xanthophyllomyces dendrorhous)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、チゴサッカロミセス・ルーキシィ(Zygosaccharomyces rouxii)、ならびにその誘導体及び交雑種が挙げられる。
本明細書で提供される発酵は、本明細書で提供される組み換え宿主細胞、及び組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培養培地を含む。発酵は、細胞の生存及び/または成長のために組み換え宿主細胞に必要な栄養素を提供する培養培地中で組み換え宿主細胞を培養することにより得られる。そのような培養培地は通常、過剰な炭素源を含有する。好適な炭素源の非限定例としては、単糖類、二糖類、多糖類、アルコール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な単糖類の非限定例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖類の非限定例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、テハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖類の非限定例としては、ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、グリカン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアルコールの非限定例としては、メタノール及びグリコールが挙げられる。
高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法が、本明細書で提供される。方法は一般に、別途指示のない限り、本明細書を通して引用及び考察される当該技術分野で周知の且つ種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法に従って実施される。例えば、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992,and Supplements to 2002);Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1990;Taylor and Drickamer,Introduction to Glycobiology,Oxford Univ.Press,2003;Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp.,Freehold,N.J.;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol I,CRC Press,1976;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins,Vol II,CRC Press,1976;Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999を参照のこと。
GS115(NRRL Y15851)のHIS+誘導体を第1の組み換えベクター及び第2の組み換えベクターで形質転換することにより、シルク様タンパク質を分泌するピキア・パストリス(コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii))組み換え宿主細胞を生成した。
種々の組み換えベクターでGS115(NRRL Y15851)のHIS+誘導体を形質転換することにより、α−アミラーゼまたは緑色蛍光タンパク質のいずれかを分泌するピキア・パストリス(コマガタエラ・ファフィ)組み換え宿主細胞を生成した。
Claims (38)
- 少なくとも2つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする少なくとも2つのポリヌクレオチド配列を含む、組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、シグナルペプチドを含むがリーダーペプチドを含まない、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、シグナルペプチド及びリーダーペプチドを含む、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然分泌シグナル、または天然分泌シグナルと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、組み換え分泌シグナルである、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、表1から選択されるシグナルペプチド、または表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然pro−αMF(sc)であるリーダーペプチド、または配列番号1と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記組み換え分泌シグナルが、配列番号1と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するリーダーペプチド、及び、pre−αMF(sc)を含まないシグナルペプチドを含む、請求項5に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然pre−αMF(sc)/pro−αMF(sc)または配列番号7と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有する機能的変異体であり、かつ前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとももう1つが、天然pro−αMF(sc)または配列番号1と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体及びpre−αMF(sc)ではないシグナルペプチドを含む、組み換え分泌シグナルである、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pre−αMF(sc)/pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、配列番号7と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pre−αMF(sc)/pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸変化を含む天然pre−αMF(sc)/pro−αMF(sc)である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pre−αMF(sc)/pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、配列番号8である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、配列番号1と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸変化を含む天然pro−αMF(sc)である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 天然pro−αMF(sc)の前記機能的変異体が、配列番号2である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記シグナルペプチドが表1から選択されるか、または、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記シグナルペプチドの前記機能的変異体が、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸同一性を有する、請求項16に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記組み換え分泌シグナルが、配列番号9〜12から選択されるか、または、配列番号9〜12から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項9に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記機能的変異体が、配列番号9〜12から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項18に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込まれている、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質である、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記タンパク質が、配列番号13を含む、請求項22に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記タンパク質が、配列番号13の複数のコピーを含む、請求項22に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記プロモーターが、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)のpGCW14プロモーターである、請求項25に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記プロモーターが、ピキア・パストリスのpGAPプロモーターである、請求項25に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項25に記載の組み換え宿主細胞。
- 酵母細胞である、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 出芽酵母細胞である、請求項29に記載の組み換え宿主細胞。
- メチロトローフ酵母細胞である、請求項29に記載の組み換え宿主細胞。
- ピキア種である、請求項30に記載の組み換え宿主細胞。
- ピキア・パストリスである、請求項32に記載の組み換え宿主細胞。
- 前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも30重量%の分泌収量である前記組み換えタンパク質を産生する、請求項1に記載の組み換え宿主細胞。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
- 前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも30重量%を分泌組み換えタンパク質として含む、請求項35に記載の発酵。
- 前記培養培地が、少なくとも0.5g/Lの前記組み換えタンパク質を含む、請求項35に記載の発酵。
- 組み換えタンパク質を産生するための方法であって、
(a)培養培地中で請求項1〜34のいずれか1項に記載の組み換え宿主細胞を培養して、請求項35〜37のいずれかの発酵を得る段階、及び
(b)前記培養培地から前記組み換えタンパク質を抽出する段階
を含む、前記方法。
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