JP2020509748A - 神経変性疾患病理のオプトジェネティク誘発 - Google Patents
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Abstract
本開示は、神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法に関する。一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップを含む方法が本明細書で開示される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2017年3月7日に提出の米国特許仮出願第62/468,065号の利益を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照により本明細書に明白に組み込む。
本出願は、2017年3月7日に提出の米国特許仮出願第62/468,065号の利益を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照により本明細書に明白に組み込む。
本開示は、神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法に関する。
世界は高齢化に向かっている。2050年までには、60歳を超えた個人の割合は2000年の6億500万から20億に倍増している。不運なことに、高齢化は致命的な神経変性疾患を発症する唯一最大の危険因子である。次に、アルツハイマー病(AD)、レビー小体病(LBD)、前頭側頭型認知症(FTD)などの認知症、ならびにパーキンソン病(PD)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの運動障害を抱えた個人の数は著しく増加することになる。合衆国内部でほぼ650万の個人が現在こうした疾患の1つを抱えて生活しており、関連するコストは持続不可能なほどである。
合衆国では、AD、PD、およびALSの現在の経済的負担は年間推定2410億ドルである。ADおよびALS/FTD患者は、年間100,000ドル〜250,000ドル以上の個人医療費を負担することがある。ADでは、2010年の470万人から増えて、2050年までには合衆国の1380万人の個人がそう診断されており、ALS患者の世界規模の数は2040年までに約31%増加すると推定されているが、こうした障害に対して効果的な処置は現在存在しない。種々の遺伝子突然変異がこれら神経変性障害の一因となっているが、既知の単一の原因は存在しない。しかし、このような多様性にもかかわらず、それぞれの疾患内のほぼすべての患者が、細胞内タンパク質凝集塊の形態で一般的神経病理学的特質を示している。これらの神経病理を再現する動物モデルでは、現在、遺伝子突然変異または著しく過剰発現するタンパク質を使用する必要があり、これらは患者の病理を模倣しないことが多い。必要とされているのは、細胞株および動物モデルにおいて神経変性疾患病理を誘発するための新しい改良された方法である。
本明細書で開示される化合物、組成物、および方法はこうしたおよび他の必要に取り組む。
細胞または動物に神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法が本明細書で開示される。発明者らは、遺伝子突然変異または著しく過剰発現している神経変性疾患タンパク質を必要とせずに、細胞および動物に神経変性疾患病理を誘発するための新しい方法を開発した。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターが本明細書で開示される。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞が本明細書で開示される。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインおよび神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むキメラポリペプチドが本明細書で開示される。
一態様では、細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
別の態様では、タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ;
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ;ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ;
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ;ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表2のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcVVDY50Wである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRY2OLIGである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRYPHRである。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRY2PHRドメイン(例えば、CRY2PHR、CRY2OLIG)または光−酸素−電圧−感知(LOV)ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、AsLOV2)からなる群から選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表3から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTDP−43である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTauである。
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。
一実施形態では、青色光は405nm〜499nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約465nmの波長を有する。
添付図は、本明細書に組み込まれその一部を構成するが、下に記載されるいくつかの態様を図解する。
細胞または動物に神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法が本明細書で開示される。発明者らは、遺伝子突然変異または著しく過剰発現している神経変性疾患タンパク質を必要とせずに、細胞および動物に神経変性疾患病理を誘発するための新しい方法を開発した。
今や本発明の実施形態に詳細に言及することとし、その例は図および実施例において説明される。しかし、本発明は多くの異なる形態で具体化してもよく、本明細書で表明される実施形態に限定されると解釈するべきではない。
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「含む(comprising)」およびその変形は、用語「含む(including)」およびその変形と同義に使用され、開かれた非限定的用語である。用語「含む(comprising)」および「含む(including)」は種々の実施形態を記載するのに本明細書では使用されたが、用語「から本質的になる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」は「含む(comprising)」および「含む(including)」の代わりに使用してより具体的な実施形態を提供することが可能であり、開示もされる。
以下の定義は、本明細書で使用される用語の完全な理解のために提供される。
用語法
本明細書で使用されるように、冠詞「1つ(a)」、「1つ(an)」、および「その(the)」は、冠詞が使用されている文脈が他にはっきりと指示していなければ、「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書で使用されるように、冠詞「1つ(a)」、「1つ(an)」、および「その(the)」は、冠詞が使用されている文脈が他にはっきりと指示していなければ、「少なくとも1つ」を意味する。
本明細書で使用される用語「約(about)」は、量、パーセント、および同類のものなどの測定可能な値に言及する場合、測定可能な値から±20%、±10%、±5%、または±1%の変動を包含することを意図している。
本明細書で使用されるように、用語「でもよい(may)」、「任意選択で(optionally)」、および「任意選択ででもよい(may optionally)」は互換的に使用され、状態が起こる場合ならびに状態が起こらない場合を含むことが意図されている。
本明細書で使用される用語「核酸」は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
本明細書で使用される用語「リボ核酸」および「RNA」はリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
本明細書で使用される用語「デオキシリボ核酸」および「DNA」はデオキシリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
用語「オリゴヌクレオチド」は、約2から最長約100ヌクレオチド長の一本または二本鎖ヌクレオチド多量体を表す。適切なオリゴヌクレオチドは、Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981)により記載されるホスホラミダイト法により、またはMatteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981)によるトリエステル法により、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置もしくはVLSIPS(商標)技術を使用する他の化学的方法により調製してもよく、前記両文献は参照により本明細書に組み込む。オリゴヌクレオチドが「二本鎖」と呼ばれる場合、オリゴヌクレオチドの対が、水素結合した、典型的には会合しているらせん状アレイ、例えば、DNAで存在すると、当業者により理解されている。100%相補性形態の二本鎖オリゴヌクレオチドに加えて、本明細書で使用される用語「二本鎖」は、バルジおよびループなどの構造特色を含む形態も指すことが意図されており、Stryer, Biochemistry, Third Ed., (1988)などの生化学テキストにさらに完全に記載され、この文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は本明細書では互換的に使用され、ヌクレオチド単量体で構成された一本または二本鎖ポリマーのことである。
用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で結合された一本鎖のD−もしくはL−アミノ酸またはD−とL−アミノ酸の混合物で作られている化合物のことである。
用語「相補的な」とは、プローブ分子とその標的の相互作用する表面の形態的適合性または互いにぴったり合うことである。したがって、標的とそのプローブは相補的であると言うことが可能であり、さらに、接触表面の特徴は互いに相補的である。
用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の2つまたはそれよりも多い相補鎖の間の非共有結合性の配列特異的相互作用を確立して単一のハイブリッドにする過程のことであり、このハイブリッドは2つの鎖の場合には二重鎖と呼ばれる。
用語「アニールする」とは、熱により分離された(熱的に変性された)相補鎖の再形成(再生)を含む、一本鎖核酸配列が水素結合によって相補的配列に対合し、二本鎖核酸配列を形成する過程のことである。
用語「融解する」とは、高温により二本鎖核酸配列が変性し、鎖間の水素結合を切断することにより二本鎖が分離して2つの一本鎖になることである。
用語「プロモーター」または「調節エレメント」とは、転写開始から上流または下流に位置し、RNAポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与している領域または配列決定因子のことである。本明細書に記載される組成物、方式、または方法においては、プロモーターは細菌起源である必要はなく、例えば、ウイルスまたは他の生物由来のプロモーターを使用可能である。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位(IRES)、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリU配列などの転写終結シグナル)を含むことが意図されている。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節エレメントは、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するエレメントおよびある特定の宿主細胞だけにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するエレメント(例えば、組織特異的調節配列)を含む。組織特異的プロモーターは、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の器官(例えば、肝臓、膵臓)、または特定の細胞型(例えば、リンパ球)などの主に目的の所望の組織において発現を指示してもよい。調節エレメントは、細胞周期依存性または発生段階依存性の様式でなどの時間依存性様式で発現を指示してもよく、その様式は組織または細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、1つもしくは複数のpol IIIプロモーター(例えば、1、2、3、4、5、またはそれよりも多いpol Iプロモーター)、1つもしくは複数のpol IIプロモーター(例えば、1、2、3、4、5、またはそれよりも多いpol IIプロモーター)、1つもしくは複数のpol Iプロモーター(例えば、1、2、3、4、5、またはそれよりも多いpol Iプロモーター)、またはその組合せを含む。pol IIIプロモーターの例は、U6およびH1プロモーターを含むがこれらに限定されない。pol IIプロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター(任意選択でRSVエンハンサーを有する)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(任意選択でCMVエンハンサーを有する)[例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)参照]、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、リン酸グリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、およびEF1αプロモーターを含むがこれらに限定されない。用語「調節エレメント」により、WPREなどのエンハンサーエレメント;CMVエンハンサー;HTLV−IのLTRにおけるR−U5’セグメント(Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988);SV40エンハンサー;およびウサギβグロブリンのエキソン2と3の間のイントロン配列(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981)も包含される。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存することが可能であることは当業者であれば認識する。
用語「組換え」とは、ヒト操作された核酸(例えば、ポリヌクレオチド)またはヒト操作された核酸(例えば、ポリヌクレオチド)のコピーもしくは相補体、あるいは、タンパク質(すなわち、「組換えタンパク質」)に関する場合は、組換え核酸(例えば、ポリヌクレオチド)によりコードされるタンパク質のことである。実施形態では、第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒト操作の結果として(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載される方法により)第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)にとり異種であるプロモーターを含んでいてもよい。別の例では、組換え発現カセットは、核酸(例えば、ポリヌクレオチド)が天然に見出されることが極めてなさそうな方法で組み合わされた核酸(例えば、ポリヌクレオチド)を含んでいてもよい。例えば、ヒト操作制限部位またはプラスミドベクター配列は、第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に隣接しているまたはそれからプロモーターを分離していてもよい。当業者であれば、核酸(例えば、ポリヌクレオチド)は多くのやり方で操作可能であり上の例に限定されないことを認識している。
用語「発現カセット」とは、核酸構築物のことであり、これは宿主細胞中に導入されると、それぞれRANの転写および/またはポリペプチドの翻訳をもたらす。実施形態では、第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、ヒト操作の結果として(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載される方法により)第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)にとり異種であるプロモーターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に作動可能に連結されたターミネーター(または終結配列)を含む発現カセットは、ヒト操作の結果として第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)にとり異種であるターミネーターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、発現カセットは、ヒト操作の結果として第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に作動可能に連結されたプロモーターおよび第2の核酸(例えば、ポリヌクレオチド)に作動可能に連結されたターミネーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは内在性プロモーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは内在性ターミネーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは合成(または非天然)プロモーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは合成(または非天然)ターミネーターを含む。
用語「同一の」またはパーセント「同一性」とは、2つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列という文脈では、下記のデフォルトパラメータを用いてBLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定した場合(例えば、NCBIウェブサイトまたは同類のもの参照)、同じであるまたは同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセント(すなわち、比較窓または指示領域にわたり最大一致を求めて比較し整列させた場合特定の領域にわたって、約60%同一性、好ましくは61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれよりも高い同一性)を有する2つまたはそれよりも多い配列または部分配列のことである。次に、そのような配列は「実質的に同一である」と言われる。この定義は、試験配列の相補体も指し、またはこれに適用してもよい。定義は、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップおよび同類のものを説明することが可能である。好ましくは、同一性は、少なくとも約10アミノ酸もしくは20ヌクレオチド長である領域にわたって、またはさらに好ましくは10〜50アミノ酸もしくは20〜50ヌクレオチド長である領域にわたって存在する。本明細書で使用されるように、パーセント(%)アミノ酸配列同一性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ必要な場合にはギャップを導入した後の、候補配列において参照配列中のアミノ酸に同一であるアミノ酸のパーセントと定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野の技術内にある種々のやり方で、例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することが可能である。比較されている配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法により決定することが可能である。
配列比較では、典型的には1つの配列が参照配列として働き、この配列と試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入れ、必要な場合には、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用可能である、または代替のパラメータを指定することが可能である。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べて試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムはそれぞれAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公開されている。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さWの短いワードを確認することにより先ず高スコアリング配列対(HSP)を確認し、このワードはデータベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、一部の陽性値を持つ閾値スコアーTと適合するまたは満たす。Tは近隣ワードスコアー閾値と呼ばれる(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。これら最初の近隣ワードヒットは、それを含有するもっと長いHSPを見つける探索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアーを増やすことが可能である限りそれぞれの配列に沿って両方向に延ばされる。累積スコアーは、ヌクレオチド配列では、パラメータM(適合残基の対についてのリワードスコアー;常に>0)およびN(不適合残基についてのペナルティースコアー;常に<0)を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアーを計算する。それぞれの方向でのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアーがその最大到達値から量X低下する;1つまたは複数のマイナススコアリング残基アラインメントの蓄積のせいで、累計スコアーがゼロもしくはそれよりも下に下がる;またはどちらかの配列の末端に到達すると停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列では)は、デフォルトとしてワード長(W)11、期待値(E)10、M=5、N=−4および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長3、および期待値(E)10を使用し、ならびにBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照)はアラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=−4、および両方の鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムは2つの配列の類似性の統計解析も実施する(例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起きると考えられる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸の比較での最小合計確率が約0.2未満、さらに好ましくは約0.01未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
語句「コドン最適化された」とは、それが種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する場合、DNAによりコードされるポリペプチドを変更することなく選択された生物の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子またはポリ核酸分子のコード領域におけるコドンの変更のことである。そのような最適化は、少なくとも1つ、または1つよりも多い、または著しい数のコドンの代わりに、その選択された生物の遺伝子において比較的頻繁に使用される1つまたは複数のコドンを使用することを含む。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれると、「作動可能に連結される」。例えば、シグナルペプチドもしくは分泌リーダーのためのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのDNAに作動可能に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されているDNA配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合は、近接していてリーディング相にあることを意味する。しかし、作動可能に連結された核酸(例えば、エンハンサーおよびコード配列)は近接している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。実施形態では、プロモーターは、それがそのコード配列からのタンパク質の発現に影響を及ぼす(例えば、プロモーターの非存在と比べて調節する)ことができる(すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある)場合は、コード配列に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される用語「変異体」または「誘導体」とは、1つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および/または欠失を有する親タンパク質のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列のことである。
キメラ構築物
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターが本明細書で開示される。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターは、プラスミドにまたはウイルスもしくはウイルスベクターに含まれる。プラスミドまたはウイルスベクターは染色体外複製が可能であり、任意選択で、宿主ゲノムに組み込まれることが可能である。本明細書で使用されるように、発現ベクター(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター)に関連して使用される用語「組み込まれる」とは、発現ベクターまたはその部分が宿主細胞の染色体DNA中に組み込まれる(物理的に挿入されるまたはライゲートされる)ことを意味する。本明細書で使用されるように、「ウイルスベクター」とは、真核細胞に実質的な病原性効果を引き起こさずに真核細胞中に導入することが可能な遺伝物質を含有するウイルス様粒子のことである。広範囲なウイルスまたはウイルスベクターが、形質導入に使用することが可能であるが、ウイルスまたはウイルスベクターが形質導入される細胞型に適合するべきである(例えば、低毒性、細胞に進入する能力)。適切なウイルスおよびウイルスベクターは、とりわけ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスを含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターは、ネイキッドDNAであるまたはナノ粒子(例えば、リポソーム小胞、多孔性シリコンナノ粒子、金−DNAコンジュゲート粒子、ポリエチレンイミンポリマー粒子、カチオン性ペプチド、等)に含まれる。
本明細書に開示される発現ベクターは、一部の実施形態では、神経変性疾患病理に関与しているタンパク質の発現レベルを実質的に変更せずに細胞に神経変性疾患病理を誘発する(例えば、タンパク質の凝集を誘発する)ことができる。例えば、および限定せずに、発現ベクターは、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを有するタンパク質の凝集を、同じ低複雑度ドメインを含む内在性標的タンパク質の発現レベルを実質的に増加するまたは減少することなく、誘発することが可能である。したがって、キメラポリペプチドをコードする本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含む細胞は、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない同じ細胞型の細胞と比べた場合、低複雑度ドメインを含む内在性神経変性疾患標的タンパク質の実質的に変化していない発現レベルを有することが可能である。本明細書で使用される用語「実質的に変化していない発現レベル」とは、たとえあるにしても、細胞に神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分からないまたは疑われない程度の発現レベルの変化のことである。
本明細書に開示される発現ベクターは、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインの野生型形態を使用して細胞に神経変性疾患病理を誘発する(例えば、タンパク質の凝集を誘発する)ことができる。したがって、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、野生型配列とは異なっており、細胞に神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分かっているまたは疑われる突然変異を含まない。例えば、および限定せずに、発現ベクターは、ALSを引き起こすまたは関連することが分かっているQ331Kなどの突然変異を含有しない野生型TDP−43タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むことが可能である。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞が本明細書で開示される。
一部の実施形態では、細胞は、神経変性疾患により影響を受けることが可能な細胞である。例えば、細胞はグリア細胞または神経細胞が可能である。
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインおよび神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むキメラポリペプチドが本明細書で開示される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、およびNcLOVからなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表2のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、またはAsLOV2の変異体から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、またはAsLOV2の断片から選択される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcVVDY50Wである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRY2OLIGである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRYPHRである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、VVDタンパク質由来のLOVドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、LOVタンパク質由来のLOVドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはPHRドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRY2タンパク質由来のPHRドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはVfAU1である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはYtvAである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはEL222である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはRsLOVである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはAsLOV2である。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRYPHRに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcVVDに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcVVDY50Wに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcLOVに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRY2OLIGに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはVfAU1に少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはYtvAに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはEL222に少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはRsLOVに少なくとも90%同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはAsLOV2に少なくとも90%同一である。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、およびVfAU1LOVからなる群から選択される光誘発オリゴマー形成ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むことが可能である。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102に少なくとも70%同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードすることが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102を含むことが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号94を含むことが可能である。ヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする野生型核酸配列のヌクレオチド配列が可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は野生型配列から改変されるが、遺伝コードの縮重のせいで、それでも同じアミノ酸配列をコードすることが可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列のうちの1つの変異体である(または変異タンパク質配列をコードする)。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書の核酸のうちの1つの断片である、または本明細書に開示されるアミノ酸のうちの1つの断片をコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている(例えば、発現を改良するために)。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRY2PHRドメイン(例えば、CRY2PHR、CRY2OLIG)または光−酸素−電圧−感知(LOV)ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、AsLOV2)からなる群から選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、およびhnRNPA2B1からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、およびhnRNPA2B1からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の変異体から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の断片から選択される。一実施形態では、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の断片は、それぞれの神経変性疾患標的タンパク質内に低複雑度ドメイン(またはその断片)を含む。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表3から選択される。一実施形態では、低複雑度ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来である。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15に少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、表3から選択される神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群のオルソログから選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15(またはその断片)に少なくとも60%(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTDP−43である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTauである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはFusである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTIA1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはSOD1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはハンチンチンである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアタキシン2である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはhnRNPA1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはhnRNPA2B1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはEWS RNA結合タンパク質1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTATAボックス結合タンパク質因子15である。
一実施形態では、VVD光誘発オリゴマー形成ドメインはTDP−43の低複雑度ドメインに融合される。一実施形態では、VVD光誘発オリゴマー形成は完全長TDP−43(低複雑度ドメインを含む)に融合される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに融合される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはTDP−43の低複雑度ドメインに融合され、TDP−43の低複雑度ドメインの配列は、配列番号95;配列番号96;配列番号97;または配列番号98(またはその断片)を含む。
一実施形態では、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質(蛍光によりタンパク質凝集塊の視覚化を可能にする)などのレポータータンパク質をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。一実施形態では、蛍光タンパク質はmCherry(mCh)である。一部の実施形態では、蛍光タンパク質はGFPまたはYFPである。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質のPHRドメイン(例えば、CRYPHR)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、例えば、配列番号1に開示されている野生型CRYPHRアミノ酸配列を含むことが可能であり、または任意選択により、例えば、配列番号2に開示されている変異CRYPHRアミノ酸配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、変異CRYPHRアミノ酸配列はE490G突然変異を含むことが可能であり、この突然変異は、野生型CRYPHRアミノ酸配列と比べて青色光刺激によりクラスター化する効率を高めることが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号1または配列番号2に少なくとも70%同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号1または配列番号2に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号1または配列番号2のポリペプチド配列を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、ニューロスポラビビド(Neurospora Vivid)タンパク質由来の光−酸素−電圧−感知ドメイン(LOV)(例えば、LOV、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、および/またはAsLOV2)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、例えば、配列番号3;配列番号4;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102に開示される野生型LOVアミノ酸配列を含むことが可能であり、または任意選択で、例えば、配列番号5に開示される変異LOVアミノ酸配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、変異LOVアミノ酸配列はY50W突然変異を含むことが可能であり、この突然変異は野生型LOVアミノ酸配列と比べた場合、二量体化状態からの放散速度を低減することが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102に少なくとも70%同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号92;配列番号93;配列番号99;配列番号100;配列番号101;または配列番号102のポリペプチド配列を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質のPHRドメイン(例えば、CRYPHR)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質のPHRドメイン(例えば、CRYPHR)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、完全長TDP−43(例えば、配列番号6または配列番号7)を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、切り詰め型TDP−43(例えば、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、または配列番号13)を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、切り詰め型TDP−43は、完全長TDP−43アミノ酸配列のアミノ酸105〜414、191〜414、または274〜414を含むまたはからなる。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、CRYPHRを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、または配列番号13に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、または配列番号13に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号6が選択される。一部の実施形態では、配列番号11が選択される。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片(例えば、mCHとも呼ばれるmCherryなどの蛍光タンパク質)をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、CRYPHRを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第3のヌクレオチド配列はmCherryタンパク質をコードすることが可能であり、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、または配列番号25に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、または配列番号25に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号14が選択される。一部の実施形態では、配列番号23が選択される。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、LOV光受容体ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、LOV光受容体ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、完全長TDP−43(例えば、配列番号26または配列番号27)を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、切り詰め型TDP−43(例えば、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、または配列番号33)を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、切り詰め型TDP−43は、完全長TDP−43アミノ酸配列のアミノ酸105〜414、191〜414、または274〜414からなる。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、NcVVDY50Wを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、または配列番号33に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、または配列番号33に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片(例えば、mCherryなどの蛍光タンパク質)をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、NcVVDY50Wを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型TDP−43を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第3のヌクレオチド配列はmCherryタンパク質をコードすることが可能であり、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、または配列番号41に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、または配列番号41に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号34が選択される。一部の実施形態では、配列番号41が選択される。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質のPHRドメイン(例えば、CRY2OLIG)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、CRY2OLIGを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号42または配列番号43に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号42または配列番号43に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片(例えば、mCherryなどの蛍光タンパク質)をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、CRY2OLIGを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第3のヌクレオチド配列はmCherryタンパク質をコードすることが可能であり、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号44、配列番号45、または配列番号46に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号44、配列番号45、または配列番号46に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号44が選択される。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、LOV光受容体ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2)を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、NcVVDY50Wを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号47または配列番号48に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、配列番号47または配列番号48に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片(例えば、mCherryなどの蛍光タンパク質)をコードする第3のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、NcVVDY50Wを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第2のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第3のヌクレオチド配列はmCherryタンパク質をコードすることが可能であり、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号49、配列番号50、または配列番号51に少なくとも75%同一である、少なくとも80%同一である、少なくとも85%同一である、少なくとも90%同一である、少なくとも95%同一である、または少なくとも99%同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第1、第2、および第3のヌクレオチド配列は、配列番号49、配列番号50、または配列番号51に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号51が選択される。
一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は第2のヌクレオチド配列の上流に位置している。一部の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は第2のヌクレオチド配列の下流に位置している。
一部の実施形態では、本明細書に開示される配列がタンパク質の開始点にメチオニンを含有する場合、メチオニンのないタンパク質も開示される。一部の実施形態では、本明細書に開示される配列がタンパク質の開始点にメチオニンを含有しない場合、タンパク質の開始点にメチオニンのあるタンパク質も開示される。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、または配列番号91から選択される配列を含む。
方法
一態様では、細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
一態様では、細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
別の態様では、タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ;
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ;ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
キメラポリペプチドを発現するステップ;
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ;
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ;ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRY2PHRドメイン(例えば、CRY2PHR、CRY2OLIG)または光−酸素−電圧−感知(LOV)ドメイン(例えば、NcVVD、NcVVDY50W、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、AsLOV2)からなる群から選択される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、およびNcLOVからなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表2のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2の変異体から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2の断片から選択される。
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはNcVVDY50Wである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRY2OLIGである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはCRYPHRである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、VVDタンパク質由来のLOVドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、LOVタンパク質由来のLOVドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはPHRドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、CRY2タンパク質由来のPHRドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはVfAU1である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはYtvAである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはEL222である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはRsLOVである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはAsLOV2である。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、およびhnRNPA2B1からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の変異体から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の断片から選択される。一実施形態では、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、またはTATAボックス結合タンパク質因子15の断片は、それぞれの神経変性疾患標的タンパク質内に低複雑度ドメインを含む。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表3から選択される。一実施形態では、低複雑度ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来である。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15に少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表3から選択される神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群のオルソログから選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、Fus、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA1、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15(またはその断片)に少なくとも60%(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%)の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTDP−43である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTauである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはFusである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTIA1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはSOD1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはハンチンチンである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアタキシン2である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはhnRNPA1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはhnRNPA2B1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはEWS RNA結合タンパク質1である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはTATAボックス結合タンパク質因子15である。
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、酵母、昆虫、トリ、魚、虫、両生類、ツメガエル、細菌、藻類および哺乳動物細胞からなる群から選択される。一実施形態では、非ヒトトランスジェニック生物が本明細書で開示され、生物は昆虫、魚、鳥、虫、両生類、ツメガエル、または非ヒト哺乳動物である。
神経変性疾患病理を誘発することとは、神経変性疾患病理を引き起こす行為、または選択された行為の実施を控えることと比べた場合、神経変性疾患病理の表現型、症状、もしくは重症度を増すことである。
神経変性疾患病理は、いずれか1つまたは複数の神経変性疾患に関連していることが分かっているまたは疑われる一連の病理を含むことが可能である。そのような病理の例は、細胞の細胞質におけるタンパク質凝集、例えば、細胞質への核タンパク質の誤局在化、ユビキチンの発現の増加、細胞変性および/もしくは細胞死、細胞外アミロイドベータ(Aβ)凝集、ならびに/またはTauタンパク質の細胞内および/もしくは細胞質凝集を含むがこれらに限定されない。タンパク質凝集塊は、一部の実施形態では、p62タンパク質と共局在化することが可能であり、高リン酸化されることが可能であり、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含む内在性タンパク質(例えば、内在性TDP−43)を含む、またはその組合せが可能である。
ユビキチン化の増加またはユビキチン発現の増加は、神経変性疾患の表現型特色でありうる。ユビキチンは、プロテアソームでの分解のための「タグ付け」タンパク質(例えば、共有結合により)を含む、多数の細胞役割を有する。細胞でのユビキチン発現の増加は典型的には対照と比較される。一部の実施形態では、ユビキチンが増加している細胞は、対照と比べて少なくとも50%ユビキチン発現が増加している。一部の実施形態では、ユビキチンが増加している細胞は、対照と比べて少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%ユビキチン発現が増加している。
細胞中のユビキチン発現は、転写レベル、翻訳レベル、またはその組合せで判定することが可能であり、遺伝子またはポリペプチド発現レベルを測定するのに使用される幅広い方法によって測定可能である。一部の実施形態では、ユビキチン発現は、遺伝子転写レベルで測定可能である。例えば、および限定せずに、ユビキチンmRNA転写物のレベルは、放射線吸収度(例えば、260、280、または230nmでの紫外線吸収)、蛍光色素またはタグ放出の定量化(例えば、臭化エチジウムインターカレーション)、mRNA転写物から生成されるcDNAの定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、サザンブロット分析、遺伝子発現マイクロアレイ、または他の適切な方法により決定することが可能である。mRNA転写物レベルの増加を使用すれば、ポリペプチド発現レベルの増加を推測するまたは見積もることが可能である。一部の実施形態では、ユビキチン発現は翻訳後レベルで測定可能である。例えば、および限定せずに、ユビキチンポリペプチドのレベルは、放射線吸収度(例えば、紫外線)、ビシンコニン酸(BCA)アッセイ、ブラッドフォードアッセイ、ビュレット試験、ローリー法、クマーシーブルー染色、機能的もしくは酵素的アッセイ、免疫検出法および/もしくはウェスタンブロット分析、または他の適切な方法により決定することが可能である。
本明細書で使用されるように、用語「導入する(introducing)」、「導入する(introduce)」、およびその文法的変形とは、発現ベクターを細胞中に導入することに関する場合、発現ベクターを細胞中に移入するのに適した任意の方法のことである。用語は、例として、コンジュゲーション、形質転換/トランスフェクション(例えば、二価カチオン曝露、熱ショック、エレクトロポレーション)、核マイクロインジェクション、リン酸カルシウムポリヌクレオチド沈殿物とのインキュベーション、ポリヌクレオチド被覆マイクロプロジェクタイルを用いた高速銃(例えば、遺伝子銃により)、リポフェクション、カチオンポリマー複合体形成(例えば、DEAEデキストラン、ポリエチレンイミン)、デンドリマー複合体形成、細胞膜の機械的変形(例えば、細胞圧搾(cell-squeezing))、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペールフェクション(impalefection)、流体力学ポリヌクレオチド送達、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換、形質導入(例えば、ウイルスまたはウイルスベクターを用いた形質導入)、天然もしくは人工の形質転換受容性、プロトプラスト融合、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション(nucleofection)、またはその組合せを含むがこれらに限定されない。導入された発現ベクター、またはそれ由来のポリヌクレオチドは遺伝子に組み込まれるまたは染色体外に存在することが可能である。
青色光波長の範囲は開示された方法において使用することが可能である。一実施形態では、青色光は約400nm〜約500nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約405nm〜約499nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約420nm〜約490nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約450nm〜約490nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約460nm〜約495nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約488nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約475nmの波長を有する。一実施形態では、青色光は約465nmの波長を有する。
一実施形態では、青色光は約405nm、約410nm、約415nm、約420nm、約425nm、約430nm、約435nm、約440nm、約445nm、約450nm、約455nm、約460nm、約465nm、約470nm、約475nm、約480nm、約485nm、約490nm、約495nm、または約500nmの波長を有する。
方法は様々な程度の青色光刺激を含むことが可能である。一部の実施形態では、刺激は急性、または任意選択で長時間である。急性刺激は、約0.2〜約60秒の青色光パルスを用いた刺激のことであり、青色光の波長は、本明細書に開示される任意の青色光波長が可能である。一部の実施形態では、急性刺激は、約0.5〜約30秒、約1秒〜約20秒、または約5秒の青色光パルスを含む。青色光は、青色光源または開示された波長についてフィルターをかけた広域分光光源により提供することが可能である。
一部の実施形態では、急性刺激により光誘発オリゴマー形成ドメイン(例えば、細胞質プリオン様ドメイン/LCD/IDDタンパク質断片)が一時的に凝集することがある。一時的凝集は、一部の実施形態では、約20分間未満または、任意選択で、約15分間未満、約10分間未満、もしくは約5分間以下の間本明細書に開示される方法により観察可能なタンパク質凝集を含む。一部の実施形態では、急性刺激によっても20分間またはそれよりも長い間、細胞質プリオン様ドメイン/LCD/IDDタンパク質断片は凝集しない。
一部の実施形態では、急性刺激により、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインと融合された光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集よりも持続時間が短い光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集が生じることが可能である。一部の実施形態では、急性刺激により、神経変性疾患を引き起こすまたは関連することが分かっているアミノ酸突然変異(例えば、TDP−43 Q331K)を有する同じタンパク質の凝集よりも持続時間が短い神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインと融合された光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集が生じることが可能である。
長時間刺激は、約0.1mW/cm2〜8mW/cm2(400nm〜500nm波長内で)で約1分またはそれよりも長い(例えば、少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも10分、少なくとも30分、少なくとも60分、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、またはそれよりも長い)持続時間、約400nm〜約500nmの波長を有する青色光への曝露により定義される。
本明細書に開示される方法は、一部の実施形態では、神経変性疾患病理に関与するタンパク質の発現レベルを実質的に変更せずに、細胞で神経変性疾患病理(例えば、タンパク質の凝集)を誘発することが可能である。例えば、および限定せずに、方法は内在性TDP−43の発現レベルを実質的に増加させるまたは減少させることなく、TDP−43を含むキメラポリペプチドの凝集(内在性TDP−43の凝集を含むことが可能である)を誘発することが可能である。一部のまたはさらなる実施形態では、方法は、神経変性疾患標的タンパク質由来の野生型形態の低複雑度ドメインを使用して細胞で神経変性疾患病理を誘発することが可能である。したがって、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、野生型配列とは異なり、細胞で神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分かっているまたはそれが疑われる突然変異を含まない。例えば、および限定せずに、方法は、野生型TDP−43タンパク質またはその断片を含むキメラポリペプチドの凝集を誘発することが可能であり、このタンパク質はALSを引き起こすまたは関連することが分かっているQ331Kなどの突然変異を含有しない。
以下の実施例は、開示された主題に従って化合物、組成物、方法、および結果を説明するために下に明記される。これらの実施例は、本明細書に開示される主題のすべての態様を含めることを意図しておらず、むしろ代表的な方法および結果を説明することを意図している。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の均等物および変形形態を排除することを意図していない。
[実施例1]
神経変性疾患病理のオプトジェネティク誘発
世界は高齢化に向かっている。2050年までには、60歳を超えた個人の割合は2000年の6億500万から20億に倍増している。不運なことに、高齢化は致命的な神経変性疾患を発症する唯一最大の危険因子である。次に、アルツハイマー病(AD)、レビー小体病(LBD)、前頭側頭型認知症(FTD)などの認知症、ならびにパーキンソン病(PD)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの運動障害を抱えた個人の数は著しく増加することになる。合衆国内部でほぼ650万の個人が現在こうした疾患の1つを抱えて生活しており、関連するコストは持続不可能なほどである。合衆国では、AD、PD、およびALSの現在の経済的負担は年間推定2410億ドルである。ADおよびALS/FTD患者は、年間100,000ドル〜250,000ドル以上の個人医療費を負担することがある。ADでは、2010年の470万人から増えて、2050年までには合衆国の1380万人の個人がそう診断されており、ALS患者の世界規模の数は2040年までに約31%増加すると推定されている。そのうえ、こうした障害に対して効果的な処置は現在存在しない。
神経変性疾患病理のオプトジェネティク誘発
世界は高齢化に向かっている。2050年までには、60歳を超えた個人の割合は2000年の6億500万から20億に倍増している。不運なことに、高齢化は致命的な神経変性疾患を発症する唯一最大の危険因子である。次に、アルツハイマー病(AD)、レビー小体病(LBD)、前頭側頭型認知症(FTD)などの認知症、ならびにパーキンソン病(PD)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの運動障害を抱えた個人の数は著しく増加することになる。合衆国内部でほぼ650万の個人が現在こうした疾患の1つを抱えて生活しており、関連するコストは持続不可能なほどである。合衆国では、AD、PD、およびALSの現在の経済的負担は年間推定2410億ドルである。ADおよびALS/FTD患者は、年間100,000ドル〜250,000ドル以上の個人医療費を負担することがある。ADでは、2010年の470万人から増えて、2050年までには合衆国の1380万人の個人がそう診断されており、ALS患者の世界規模の数は2040年までに約31%増加すると推定されている。そのうえ、こうした障害に対して効果的な処置は現在存在しない。
20年の遺伝子分析により、多くの神経変性疾患関連突然変異が明らかにされてきた。しかし、これらの突然変異は、AD、LBD、FTD、PD、およびALS患者のうちのわずかでしか見つかっていない(表1)。
表1は、神経変性疾患の選択、主症状、中枢神経系(CNS)の罹患領域、患者CNSにおいて観察される凝集神経病理、この病理を示している患者のパーセントおよび疾患のある遺伝成分(ファミリー内の既知のまたは未知の突然変異)を抱える患者のパーセントを記載している。アルツハイマー病(AD)は、海馬および嗅内皮質の変性に起因する記憶消失および錯乱を特徴とする。原因となる遺伝子突然変異を抱えているのは患者のわずか1〜3%であるが、すべての患者が罹患組織において一般的な凝集病理を示している。これは、細胞外アミロイドベータ(Aβ)凝集塊ならびにTauタンパク質の細胞内および細胞質凝集を特徴とする。前頭側頭型認知症(FTD)は、前頭葉および側頭葉の漸進性の変性を特徴とし、患者の20〜25%は疾患の遺伝的原因を抱えることがあるが、患者の80〜75%は家族歴がない。しかし、すべての患者が、TDP−43(症例の45%)、Tau(症例の45%)、またはFUS(症例の5%)タンパク質のいずれかを含むある形態の細胞質タンパク質凝集を示す。パーキンソン病(PD)は、黒質においてドーパミン作動性神経細胞の漸進性の変性を特徴とし、既知の遺伝的原因を有するのは患者の10%だけであるが、ほぼすべての患者(99%)がα−シヌクレインタンパク質の細胞質凝集を示す。筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、患者の麻痺および死亡をもたらす脊髄での運動皮質における運動神経細胞の急速な変性を特徴とする。疾患の家族歴を有するのはALS患者の10%だけであるが、症例のほぼ90%が散発的に発生する。現在まで、ほぼ35の原因となる遺伝子突然変異が種々の遺伝子で同定されている(図1参照)が、このような遺伝的多様性にもかかわらず、ほぼすべてのALS患者が同じ神経病理を示している。ALS患者のほぼ97%が、罹患領域において、主に核にあるTDP−43タンパク質の細胞質誤局在化を示している。SOD1またはFUS遺伝子に突然変異のある患者はこれらのタンパク質の細胞質凝集も示すが、これはすべてのALS症例の、それぞれ2%および1%でしか発生しない。
まとめると、この表から、多くの神経変性疾患の主な統一要因が神経病理学的特質であることが際立つ。これらの神経病理は主に細胞内タンパク質凝集塊の形態で発生し、大多数の症例では、これらの細胞内タンパク質凝集はいかなる既知の遺伝的原因とも無関係に形成される。さらに、これらの神経病理は、それぞれの疾患において最も罹患した領域および細胞型において主に形成される。
興味深いことに、一般的な既知の遺伝的または環境上の原因がないにもかかわらず、これらは、疾患ごとの患者の間で普遍的な神経病理学的特色である。したがって、大多数の患者(疾患に応じてすべての患者の90〜100%)は、既知の遺伝的原因がないにもかかわらず中枢神経系において同じ病理を示している。これらの病理学的特質は中枢神経系において不溶性タンパク質塊または凝集塊の形態で現れる(表1、図1)。
現在まで、ヒト神経病理を模倣する神経変性疾患凝集を正確にモデル化することは可能ではない。神経変性疾患ごとに、高い局所濃度の場合これらのタンパク質凝集を易発性にするタンパク質ドメイン(プリオン様ドメイン、低複雑度ドメイン、本質的に変性しているドメイン、本質的に変性している領域としても知られる)を抱えた細胞内タンパク質凝集塊の主成分が存在する。したがって、これらの神経変性疾患凝集塊をモデル化する現在の方法は、神経変性疾患凝集塊を含むこれらの凝集易発性タンパク質をin vitroまたはin vivoで過剰発現することに頼っている。なぜならば、細胞内での濃度が細胞濃度いと、一部のモデルでは、凝集塊を形成することが可能だからである。さらに、または代わりに、これらの疾患をモデル化するもう1つの方法は、神経変性疾患凝集塊を含むタンパク質の変異型を発現させることである。これらの突然変異は患者のごくわずかな一部で見出され、典型的にはタンパク質の凝集する能力を増強する。不運なことに、これらの方法のどれも患者の細胞環境を再現しない。なぜならば、大多数の患者がいかなる病原突然変異も抱えておらず、凝集塊の成分を著しく過剰発現してもいないからである。実際、これらのタンパク質の著しい過剰発現にもかかわらず、多くのモデルがそれでもヒト神経病理を示していない。患者生物学とモデル系の間がこのように断絶していることは、現在の神経変性疾患モデルから示唆を得ることができない、大きな一因となっていた。
本実施例に記載されているのは、凝集易発性遺伝子を単に過剰発現させるまたはこれらの遺伝子の変異型を発現させることなく、タンパク質凝集塊を空間的におよび時間的に誘発する新規の方法である。したがって、この方法のほうがヒト疾患状態をよく再現する。ここでは、オプトジェネティクスの力を利用する(光を用いてタンパク質機能を制御する)ことによりこのやっかいな生物学的難問に取り組むための革新的なアプローチに着手した。細胞が特定の光刺激に曝露された時だけ患者で観察される神経変性疾患病理を誘発することが可能である一連の新規のDNA配置を構築した。この方法を使用して、細胞が特定の光波長に曝露された後だけ患者で観察される神経病理を模倣しこの病理を誘発するモデル系をin vitroまたはin vivoで創り出す。この新規のアプローチは、神経変性疾患モデル化を変形することが可能であり、変異トランス遺伝子の発現と違って、大多数の患者に適用可能であり時間的におよび空間的に誘発可能である種々の疾患モデルを生成するのに使用可能である。
青色光曝露(表2)に応答して、それぞれクラスター化するまたはホモ二量体化するPHRドメイン(CRY2OLIGまたはCRY2PHR)または光−酸素−電圧−感知(LOV)ドメイン(NcVVD、NcVVDY50W、Vfau1、YtvA、EL222、RsLOV、AsLOV2)および低複雑度ドメイン(LCD)を含有し神経変性疾患タンパク質凝集塊を含むタンパク質をコードする遺伝子のDNA配列(表3)を含む一連のDNA配置を開発した。
表2は、青色光曝露による細胞に神経変性病理をオプトジェネティクに誘発するために用いる光受容体の一覧を示している。シロイヌナズナ(Arabidopsis)植物に見出されるクリプトクロム2タンパク質のPHRドメインの変種は、用いられる光受容体の1ファミリーとなる(本文書ではCRY2PHRおよびCRY2OLIGと名付けられる)。CRY2タンパク質のPHRドメインおよびその変種は、青色光の単一パルス(405〜499nmレンジ内)に曝露されると約5分間クラスター化する/ホモオリゴマー形成する能力を有する。CRY2PHRはシロイヌナズナ(Arabidopsis)に見出される内在性タンパク質配列である。一方、CRY2OLIGは内在性アミノ酸配列であるが、E490G突然変異を有し、青色光刺激によりクラスター化する効率のわずかな増加を示すことが明らかにされている。CRY2PHRおよびCRY2OLIGの自己結合は同じ機構を通じて作用し細胞内FAD+を必要とする。CRY2OLIGと神経病理タンパク質凝集塊を含む標的タンパク質の種々の配置を生成して、主に細胞質にあるタンパク質と主に核にあるタンパク質の両方の神経変性疾患病理を誘発するCRY2OLIGの光誘発クラスター化特性の調節を明らかにした。これは、患者神経病理で観察される核タンパク質の細胞質誤局在化を誘発することを含む。さらに、これらのタンパク質ドメインを使用して、これら神経変性タンパク質の切り詰め型の本質的に変性しているドメイン/プリオン様ドメイン/低複雑度ドメインの凝集を誘発させた。
ビビド(VVD)はパンカビ(Neurospora)生物で産生されるタンパク質であり、青色光(405〜499nmレンジ内)に応答してホモ二量体化する光受容体である。光−酸素−電圧−感知(LOV)ドメインは多くの生物を通して共通であるがこのドメインはこの生物では非常に小さい。NcLOVはVVDタンパク質のLOVドメインにすぎないが、他の種全体を通じて保存されている。NcVVDは、N−term VVDタンパク質の小断片およびVVD LOVドメインを含む。しかし、NcVVDタンパク質配列由来のNcVVDY50Wは、二量体化状態から放散するもっと時間がかかる能力を促進するY50W変化により変更される。LOVドメインの持続性二量体化は、長時間の光を用いて、LCD含有タンパク質に融合されるとオリゴマー形成を誘発することがここで明らかにされた(図6、8)。LOVドメインはオリゴマーを形成するとは報告されていないが、これらの光受容体と特定の標的神経変性疾患タンパク質の特定のタンパク質配置のタンパク質クラスター化を誘発する光刺激パラダイムが本明細書で開発された。本明細書で使用される追加のLOVドメインもVfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2を含む。
表3は、神経変性疾患病理を再現するタンパク質配置を生成するための標的神経変性疾患タンパク質の一覧を記載している。表3に収載され、これら種々の青色光曝露パラダイムに応答して神経変性疾患病理を再現するタンパク質などの神経変性疾患タンパク質に融合されている表2の光受容体の新規の配置は本明細書に開示されている。この技術は、患者における神経病理凝集塊を含む切り詰め型のこれらの成分のプリオン様ドメイン/LCD/IDDを凝集するのにも使用される。本実施例では、TDP−43、α−シヌクレイン、およびTauタンパク質に融合されたCRY2OLIGおよびLOVを用いて研究を実施した。別の実施例では、標的神経変性疾患タンパク質はハンチンチン遺伝子/タンパク質(Accession Ref.NM_002111;NP_002102.4)が可能である。しかし、創り出された光処理パラダイムのおかげで二量体化またはオリゴマー形成能力のある任意の光受容体に適用可能な方法を開発した。この方法の主目的は、LCDを含有し神経変性疾患で凝集するタンパク質の分子内密集を強制しつつ神経変性疾患タンパク質の局所濃度を特定の期間制御することである。それぞれの神経変性疾患タンパク質と光受容体配置は、タンパク質の性質に起因して特定の光刺激パラメータを必要とすることがある。例えば、細胞質タンパク質または切り詰め型の核タンパク質が細胞質に局在するには典型的には(いつもとは限らないが)短い刺激パラダイムを必要とし、一方、主に核にあるタンパク質は長時間刺激を必要とする。なぜならば、タンパク質は翻訳の間に細胞質にトラップされる必要があるからである(例えば、TDP−43、FUS)。刺激パラダイムの詳細は下で考察される。
次に、光曝露はこれらの独特な融合タンパク質配置を強制的に接近させ、長時間または反復光刺激を用いると、完全長タンパク質またはLCD単独の神経変性疾患凝集病理を得ることが可能である。神経変性疾患凝集塊のこのような時間的空間的制御は新規である。なぜならば、この制御は疾患ごとに患者の極一部にしか関連しない過剰発現または突然変異を必要としないからである(表1)。細胞をこれらの凝集易発性タンパク質で満たすのではなく、これらのタンパク質を強制的に相互作用させヒト患者で発生する疾患病理を形成させる。
タンパク質凝集を超えて、この方式は、患者で見出される重要な病理学的特色を模倣する光誘発病理を創り出し、そのためこの方式は過剰発現方式と比べて独特なものになっている。TDP−43タンパク質は、LCDを含有するが、青色光に曝露するとクラスター化し不溶性になって持続性の光処理により凝集するCRY2OLOG光受容体ドメインと組み合わせた。完全長および部分的LCD配列の融合タンパク質を生成して、ALSおよびFTDを抱えた患者で発生する核タンパク質の細胞質誤局在化を含むヒト神経変性疾患病理を再現した。この方式は、種々の青色光刺激パラダイムに細胞を曝露することによって生HEK細胞で神経変性疾患タンパク質凝集塊を誘発することができた(図4〜5)。さらに、ALS、FTD、およびADの生化学的特質(図7)が生成され、細胞が、これらのタグを付加しているにもかかわらず、患者CNSで観察される光誘発凝集塊に応答していることを示している。とりわけ、TDP−43神経病理は模倣するにはさらに複雑な神経病理の1つである。なぜならば、これは、主に核にあるタンパク質であるのに、患者の細胞質に誤局在しているのが見出されるからである。このDNA配置および光刺激方式を例として用いて、ALS、FTD、およびAD患者で観察されるユビキチン化され、切断され、高リン酸化もされている細胞質TDP−43凝集塊が得られた。TDP−43病理はADならびに慢性外傷性脳症(CTE)でも見出され、したがってこの研究の潜在的な疾患関連性を浮き彫りにしている。さらに、α−シヌクレインの凝集(図6)を誘発するタンパク質配置および光刺激パラダイムを開発した。このα−シヌクレインはパーキンソン病およびレビー小体病と診断された患者のCNSで見出される。Cry−PHRおよびLOV光受容体(図7)と持続性青色光刺激の両方を使用してTauタンパク質の細胞内凝集を誘発する方法も開発した。このtau濃縮体は、HEK細胞におけるAD、FTDおよびCTEの病理学的特質である。これらは、病理学的tau封入体に対して開発された特定の抗体を使用して患者で観察される、高リン酸化を含む、タウオパチーの病理学的特質を示している(図7〜8)。最後に、この方法を使用して形成されるTDP−43の凝集塊が内在性TDP−43を動員して病原性神経病理の種を蒔く(図5F、5G)ので、この方法を利用すれば、凝集の種を蒔くことが可能であることが示された。
LCDを含有するタンパク質に融合されたLOVドメインタンパク質を強制的にオリゴマー形成および凝集させる新規の方法も開発した。NcVVDY50Wを含むLOVドメインは、青色光刺激だけで二量体化することが明らかにされている。長時間青色光刺激パラダイム(図3および6〜8に記載されている)を使用すれば、LOV配列に融合されたLCD含有タンパク質のオリゴマー形成および最終的な凝集が誘発される。このアミノ酸配列はCRY2のPHRドメインよりも著しく小さく、CRY2PHRの代替物として作用する場合がある。なぜならば、このアミノ酸配列は内在性標的タンパク質機能を妨害する可能性はもっと低いからである。
一部の実施形態では、LCD断片または表3に収載される完全長神経変性疾患タンパク質(または90%類似性)に融合されたPHRドメイン(CRY2PHRまたはCRY2OLIG)またはLOV光受容体タンパク質(NcVVD、NcVVDY50W、Vfau1、YtvA、EL222、RsLOV、AsLOV2)(または90%類似性)をコードするDNA配置を構築する。一部の実施形態では、青色光曝露処理パラダイムを用いてこれらの神経変性疾患病理を誘発する方法が本明細書で開示される。他の実施形態では、得られたタンパク質凝集塊および細胞生存能は、神経変性疾患薬スクリーニングのための読み出し情報として利用される(図10)。この方式は、神経変性疾患病理形成を薬理学的にまたは遺伝的に軽減することにより使用される、または滞留時間は特定の神経変性疾患の処置のための新規の化合物を同定することが可能である。以下の実施形態も開示される:
1.新規モデル方式の生成:これらの光受容体配列は、神経変性疾患を研究するための新しいモデルとして働くことが可能な種々のin vitroおよびin vivo方式のゲノムに挿入される。in vitro使用のいくつかの例は、ヒトおよび齧歯類細胞株、誘導多能性幹細胞(iPSC)、または酵母を含む。in vivo使用のいくつかの例は、無脊椎動物:キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(ミバエ)、線虫(Caenorhabditis elegans)(カイチュウ)、またはゼブラフィッシュ(Danio rerio)を含む。in vivo使用の他の例は、脊椎動物:マウス、ラット、または非ヒト霊長類を含む。
2.これらの化合物、方法、および編集されたゲノムを有する方式(iPSCなどの)は高スループット薬物スクリーニングシステムで使用される。これを達成するため、細胞を光で刺激することにより神経変性疾患病理が誘発される。次に、化合物ライブラリーの存在下で細胞生存能ならびにタンパク質凝集塊/病理の形成および滞留時間が調べられる。さらに、アッセイは、光を用いた誘発に続くin vivoモデルの生存および神経病理を用いることも含む。
1.新規モデル方式の生成:これらの光受容体配列は、神経変性疾患を研究するための新しいモデルとして働くことが可能な種々のin vitroおよびin vivo方式のゲノムに挿入される。in vitro使用のいくつかの例は、ヒトおよび齧歯類細胞株、誘導多能性幹細胞(iPSC)、または酵母を含む。in vivo使用のいくつかの例は、無脊椎動物:キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(ミバエ)、線虫(Caenorhabditis elegans)(カイチュウ)、またはゼブラフィッシュ(Danio rerio)を含む。in vivo使用の他の例は、脊椎動物:マウス、ラット、または非ヒト霊長類を含む。
2.これらの化合物、方法、および編集されたゲノムを有する方式(iPSCなどの)は高スループット薬物スクリーニングシステムで使用される。これを達成するため、細胞を光で刺激することにより神経変性疾患病理が誘発される。次に、化合物ライブラリーの存在下で細胞生存能ならびにタンパク質凝集塊/病理の形成および滞留時間が調べられる。さらに、アッセイは、光を用いた誘発に続くin vivoモデルの生存および神経病理を用いることも含む。
配列
光受容体ツールのアミノ酸配列
シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質の光回復酵素相同領域(PHR)ドメインのアミノ酸配列:
配列番号1 クリプトクロム2PHRドメイン;Cry2PHR
光受容体ツールのアミノ酸配列
シロイヌナズナ(Arabidopsis)クリプトクロム2タンパク質の光回復酵素相同領域(PHR)ドメインのアミノ酸配列:
配列番号1 クリプトクロム2PHRドメイン;Cry2PHR
配列番号3 VVD LOVドメインのみ:
1.Cry2olig融合タンパク質アミノ酸配列:
A)完全長TDP−43タンパク質レポーターなし
配列番号6 Cry2olig−TDP−43:
配列番号8 TDP−43(AA274〜414)−Cry2olig:
配列番号14 Cry2olig−TDP−43−mCherry:
配列番号17 TDP−43(AA274〜414)−Cry2olig−mCherry:
A)完全長TDP−43タンパク質レポーターなし
配列番号26 NcVVDY50W−TDP−43
配列番号28 TDP−43(AA105〜414)−NcVVDY50W
配列番号34 NcVVDY50W−TDP−43−mCherry
配列番号36 mCherry−TDP−43(AA105〜414)−NcVVDY50W
1.Cry2olig融合タンパク質アミノ酸配列:
A)完全長アルファシヌクレイン(asyn)タンパク質レポーターなし
配列番号42 Cry2olig−asyn
配列番号44 Cry2olig−asyn−mCherry
A)完全長アルファシヌクレイン(asyn)タンパク質レポーターなし
配列番号47 Asyn−NcVVDY50W
配列番号49 mCherry−Asyn−NcVVDY50W
配列番号55 mCherry−Tau
1.Cry2olig融合タンパク質アミノ酸配列:
A)完全長FUSタンパク質レポーターなし
配列番号90 Cry2Olig−FUS
配列番号91 Cry2Olig−FUS−mCherry
配列番号92 VfAU1(A8QW55):
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、開示されている本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物および刊行物が引用されている対象の題材は参照により明確に取り込まれている。
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に多数の変更および改変を加えることが可能であること、本発明の精神から逸脱することなくそのような変更および改変を行うことが可能であることを認識する。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内に入るようなすべての等価な変形形態に及ぶことが意図されている。
Claims (42)
- 光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがNcVVDである、請求項2に記載のヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRY2OLIGである、請求項2に記載のヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRYPHRである、請求項2に記載のヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがLOVドメインを含む、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがPHRドメインを含む、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTDP−43である、請求項8に記載のヌクレオチド配列。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項8に記載のヌクレオチド配列。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTauである、請求項8に記載のヌクレオチド配列。
- 光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクター。
- 光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞。
- 光誘発オリゴマー形成ドメイン;および
神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメイン
を含むキメラポリペプチド。 - 細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを前記細胞中に導入するステップ;
前記キメラポリペプチドを発現するステップ;ならびに
青色光を用いた刺激により前記キメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法。 - 前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがNcVVDである、請求項16に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRY2OLIGである、請求項16に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRYPHRである、請求項16に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがLOVドメインを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがPHRドメインを含む、請求項15に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される、請求項15〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTDP−43である、請求項22に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項22に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTauである、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項26に記載の方法。
- 前記青色光が405nm〜499nmの波長を有する、請求項15〜27のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第1のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ;
前記キメラポリペプチドを発現するステップ;
前記細胞を含む培養培地中に前記作用物質を導入するステップ;
青色光を用いた刺激により前記キメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ;ならびに
前記作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法。 - 前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、CRYPHR、CRY2OLIG、NcVVD、NcVVDY50W、NcLOV、VfAU1、YtvA、EL222、RsLOV、およびAsLOV2からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがNcVVDである、請求項30に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRY2OLIGである、請求項30に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがCRYPHRである、請求項30に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがLOVドメインを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記光誘発オリゴマー形成ドメインがPHRドメインを含む、請求項29に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、TDP−43、アルファシヌクレイン、Tau、TIA1、SOD1、ハンチンチン、アタキシン2、hnRNPA2B1、EWS RNA結合タンパク質1、およびTATAボックス結合タンパク質因子15からなる群から選択される、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTDP−43である、請求項36に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項36に記載の方法。
- 神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがTauである、請求項36に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項29〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記青色光が405nm〜499nmの波長を有する、請求項29〜41のいずれか一項に記載の方法。
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