JP2020508973A - 核酸ライブラリーの調製方法ならびにその方法を行うための組成物及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
上記で概説したように、1つ以上の核酸ライブラリーの調製方法を提供する。1つのライブラリーまたは複数のライブラリーを単一のRNA試料から調製してよい。例えば、いくつかのケースでは、1つの免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをRNA試料から調製してよい。いくつかのケースでは、発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを単一のRNA試料から調製する。
上述のように、本開示の方法で作製するライブラリーは、作製した産物二本鎖cDNAから作製してよい。「産物二本鎖cDNA」とは概して、逆転写反応から作製した、テンプレート核酸の相補体を含む二本鎖DNAを意味する。産物二本鎖cDNAは、逆転写反応を用いて、テンプレートRNAから作製してよく、この場合、例えばmRNAテンプレートを含むいずれかのRNAテンプレートを用いてよい。したがって、提供する方法は、逆転写反応(以下にさらに詳細に説明されているテンプレートスイッチング逆転写反応など)の使用を通じて、RNA試料に存在するテンプレートRNAから産物二本鎖cDNAを作製することを含んでよい。
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号01)
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
CCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGA(配列番号02、T細胞レセプターアルファ鎖C領域、ヒト、GenBank:AY247834.1、AAO72258.1、UniProtKB:P01848)
という核酸配列によってコードされる。
PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号03、UniProtKB:P01849)または
PNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(配列番号04、GenBank:AAA53226.1)
というアミノ酸配列を有し、これらの配列はそれぞれ、
CCATACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT(配列番号05)、
CCAAACATCCAGAACCCAGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCTCAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACTCCCAAATCAATGTGCCGAAAACCATGGAATCTGGAACGTTCATCACTGACAAAACTGTGCTGGACATGAAAGCTATGGATTCCAAGAGCAATGGGGCCATTGCCTGGAGCAACCAGACAAGCTTCACCTGCCAAGATATCTTCAAAGAGACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGTGATGCCACGTTGACCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATATGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACTCCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCGGGATTTAACCTGCTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGT(配列番号06、GenBank:U07662.1)
という核酸配列によってコードされる。
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(配列番号07、UniProtKB:P01850、GenBank:CAA25134.1)
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
GAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(配列番号08、GenBank:EF101778.1、X00437.1)
という核酸配列によってコードされる。
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG(配列番号09、UniProtKB:A0A5B9、GenBank:AAA60662.1)
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
GACCTGAAAAACGTGTTCCCACCCGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTATGCCTGGCCACAGGCTTCTACCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTCACCTCCGAGTCTTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAG(配列番号10、GenBank:L34740.1)
という核酸配列によってコードされる。
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS(配列番号11、UniProtKB:P01852)
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
GAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGATTACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAAGCCACCCTGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGCTATGGTCAAAAGAAAGAATTCATGA(配列番号12、GenBank:FJ188408.1)
という核酸配列によってコードされる。
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNS(配列番号13、UniProtKB:P01851)
というアミノ酸配列を有し、この配列は、
GAGGATCTGAGAAATGTGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAAAGCAGAGATTGCAAACAAACAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAGGCCTACAAGGAGAGCAATTATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCCTCGAAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAGTGGCCAGAGGGCTCACCCAAACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGAATCACTTCAGCATCCTATCATCAGGGGGTTCTGTCTGCAACCATCCTCTATGAGATCCTACTGGGGAAGGCCACCCTATATGCTGTGCTGGTCAGTGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAAAAAAAATTCCTGA(配列番号14、GenBank:U46841.1)
という核酸配列によってコードされる。
上記で概説したように、いくつかのケースでは、本明細書に記載されているように、RNA試料を単一細胞から抽出して、1つ以上のライブラリーを作製してよい。そして、このような「単一細胞ライブラリー」は、さらなるダウンストリームアプリケーション(シークエンシングアプリケーションなど)で用いてよい。本明細書で使用する場合、「単一細胞」とは、1つの細胞を指す。テンプレートRNAの供給源として有用な、及び/または単一細胞ライブラリー(発現ライブラリー及び/または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーなど)の作製に有用な単一細胞は、該当する組織、または生検標本、血液試料もしくは細胞培養液から採取することができる。加えて、特定の器官、組織、腫瘍、新生物などに由来する細胞を採取して、本明細書に記載されている方法で用いることができる。
上記で概説したように、いくつかのケースでは、提供する方法は、作製した産物二本鎖cDNAの1つ以上の末端を末端捕捉することを含んでよい。特定の実施形態では、このような末端捕捉では、タグメンテーション反応を利用してよく、この反応では、1つ以上のタグメンテーション反応成分を用いてよい。用いるタグメンテーションプロセスは、様々なものであり、例えば、タグメンテーション反応による5’末端捕捉、タグメンテーション反応による3’末端捕捉、またはこれらを組み合わせたものを挙げてよい。
上記で概説したように、本開示の方法の態様は、テンプレートスイッチング逆転写反応の使用を伴ってよい。例えば、いくつかのケースでは、本開示の方法は、テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、産物二本鎖cDNAを核酸試料から作製することを含んでよい。したがって、いくつかのケースでは、テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、二本鎖cDNAをテンプレート核酸から作製してから、1つ以上のライブラリー(発現ライブラリー及び/または免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーなど)を調製するために別々に用いることができる別々の反応混合物に、その二本鎖cDNAを分割してよい。
テンプレートスイッチング逆転写反応では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを用いてよい。「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」とは、核酸ポリマー化反応の際に、ポリメラーゼが初期テンプレート(例えば、テンプレート核酸(例えばRNAテンプレート))からスイッチする対象であるオリゴヌクレオチドテンプレートを意味する。この意味から、テンプレートは、「ドナーテンプレート」と称してよく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、「アクセプターテンプレート」と称してよい。本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、2〜500ヌクレオチド、例えば2〜200ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドマルチマーである。オリゴヌクレオチドは、合成したものであっても、酵素によって作製したものであってもよく、いくつかの実施形態では、10〜50ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマーを含んでも(すなわち、オリゴリボヌクレオチドまたは「RNAオリゴヌクレオチド」であっても)、デオキシリボヌクレオチドモノマーを含んでもよい(すなわち、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは「DNAオリゴヌクレオチド」であってもよい)。オリゴヌクレオチドは、例えば、10〜20ヌクレオチド、21〜30ヌクレオチド、31〜40ヌクレオチド、41〜50ヌクレオチド、51〜60ヌクレオチド、61〜70ヌクレオチド、71〜80ヌクレオチド、80〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチドまたは150〜200ヌクレオチド、最長で500ヌクレオチド以上の長さであってよい。
いくつかのケースでは、本開示の方法は、二本鎖産物cDNAを作製すること、及び/またはテール配列を有するテンプレート核酸のテール配列と相補的である配列を有するプライマーを用いて、そのテンプレート核酸を増幅することを含んでよい。「テール配列」という用語は、本明細書で使用する場合、概して、テンプレート核酸の3’末端に存在するポリヌクレオチド領域であって、1種類のヌクレオチド種(例えば、A、C、G、Tなど)で構成されている領域を指す。いくつかのケースでは、第1鎖相補デオキシリボ核酸(cDNA)プライマーは、全体または一部において、テール配列と相補的であってよい。例えば、mRNAテンプレートのポリ(A)テールは、テール配列の非限定的な例の1つである。したがって、第1鎖cDNAプライマーは、いくつかのケースでは、mRNAテンプレートのポリ(A)テールと相補的であるポリ(T)配列を含むか、またはそのポリ(T)配列からなってよい。
単一産物核酸プライマー(単一産物核酸合成プライマー(例えば、第1鎖cDNAプライマー)または第1鎖プライマーともいう)は、テンプレート結合ドメインを含む。例えば、その核酸は、テンプレート核酸、例えば、mRNAなどにハイブリダイズするように構成されている第1の(例えば3’)ドメインを含んでよく、テンプレート核酸にハイブリダイズしない第2の(例えば5’)ドメインとみなしてよい1つ以上の追加のドメイン、例えば、以下にさらに詳細に説明されているようなノンテンプレート配列ドメインを含んでも含まなくてもよい。このテンプレート結合ドメインの配列は独立して、規定のものであっても、任意のものであってもよい。特定の態様では、テンプレート結合ドメインは、規定配列、例えば、ポリdTまたは遺伝子特異的配列を有する。別の態様では、テンプレート結合ドメインは、任意の配列(例えば、ランダムヘキサマー配列のようなランダム配列)を有する。テンプレート結合ドメインの長さは、様々であってよいが、いくつかのケースでは、このドメインの長さは、5〜50nt(6〜25ntなど、例えば、6〜20nt)の範囲である。
いくつかのケースでは、テンプレートスイッチング逆転写反応混合物に混ぜ合わせるポリメラーゼは、テンプレートスイッチングすることができ、そのポリメラーゼは、ポリマー化のためのテンプレートとして第1核酸鎖を用いた後、第2のテンプレート核酸鎖の3’末端にスイッチして、同じポリマー化反応を継続する。いくつかのケースでは、テンプレートスイッチングできるポリメラーゼは、逆転写酵素である。テンプレートスイッチングできる逆転写酵素であって、本開示の方法を実施するために有用である逆転写酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループIIイントロン由来逆転写酵素、ならびにこれらの変異体、バリアント、誘導体もしくは機能的断片、例えば、RNase Hマイナス型酵素またはRNase H低減型酵素が挙げられるが、これらに限らない。例えば、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV RT)またはBombyx mori逆転写酵素(例えば、Bombyx moriR2非LTRエレメント逆転写酵素)であってよい。テンプレートスイッチングできるポリメラーゼであって、本開示の方法を実施するために有用なポリメラーゼは、市販されており、Takara Bio USA,Inc.(Mountain View,CA)から入手可能なSMARTScribe(商標)という逆転写酵素及びPrimeScript(商標)という逆転写酵素が挙げられる。
記載されている方法の態様は、いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列の使用を含んでよい。「ノンテンプレート(non−templated)配列」と「ノンテンプレート(non−template)配列」という用語は概して、本開示の方法に関与する配列のうち、テンプレートに対応しない配列(例えば、テンプレートに存在しないか、テンプレートにおける相補的配列を有さないか、テンプレートに存在したり、テンプレートにおける相補的配列を有したりする可能性が低い配列)を指す。ノンテンプレート配列は、テンプレート、例えばRNAまたはDNAテンプレートを鋳型としない配列であるので、例えば、延伸反応の際、対応するテンプレートの非存在下で付加でき、例えば、テンプレート指向性ではないターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼによって付加されるヌクレオチドである。核酸へのノンテンプレート配列の付加は必ずしも、延伸反応に限定する必要はない。例えば、いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、そのノンテンプレート配列を核酸にライゲーションすることを通じて付加してよい。いくつかのケースでは、ノンテンプレート配列は、トランスポザーゼ介在性反応を通じて、例えば、該当する核酸にノンテンプレート配列を付加するタグメンテーション反応を通じて付加してよい。したがって、ノンテンプレート配列は、様々なものであってよく、様々な手段を通じて、テンプレート配列に付加してよい。
上記で概説したように、本明細書に記載の方法は、例えばテンプレートスイッチング逆転写反応、核酸増幅反応、末端捕捉反応、タグメンテーション反応などを含む特定の核酸反応を含んでよい。このような反応における反応混合物成分は、その反応の生成物を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。例えば、いくつかのケースでは、産物二本鎖cDNAを生成するために十分な条件下でテンプレートスイッチング逆転写反応の反応成分を混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、核酸増幅反応の反応成分は、増幅産物核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、末端捕捉反応の反応成分は、末端捕捉核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。いくつかのケースでは、タグメンテーション反応の反応成分は、タグメンテーション済み核酸を生成するために十分な条件下で混ぜ合わせる。
本開示の態様は、組成物及びキットも含む。本開示の組成物及びキットは、例えば、本開示の方法に関して上記で説明した反応混合物成分のいずれかのうちの1つ以上を含んでよい。例えば、本開示の組成物及びキットは、核酸試料(例えば、RNA試料、RNAとDNAが組み合わさった試料など)、増幅ポリメラーゼ(例えば耐熱性ポリメラーゼなど)、逆転写酵素(例えば、テンプレートスイッチングできる逆転写酵素など)、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、末端捕捉プライマー、免疫レセプター特異的プライマー、タグメンテーション反応の1つ以上の成分、dNTP、塩、金属補因子、1つ以上のヌクレアーゼインヒビター(例えば、RNaseインヒビター及び/またはDNaseインヒビター)、1つ以上の分子クラウディング剤(例えばポリエチレングリコールなど)、1つ以上の酵素安定化成分(例えばDTT)、あるいはいずれかの他の所望のキット成分(複数可)を含んでよい。
本開示の方法は、免疫細胞レセプターレパートリー解析及び/または別々に調製した2つ以上のシークエンシングライブラリーの解析を用いるアプリケーション(このような解析を順次または同時に行うことのできる場合を含む)を含め、様々なアプリケーションで有用である。
単一細胞由来の遺伝子発現差解析及びTCRプロファイリングを複合する際に用いるライブラリーの作製に用いるプロセス全体を示している全体概略図が図5に示されている。
このプロトコールの最初の部分では、テンプレートスイッチング逆転写反応を通じて、投入単一細胞から採取したmRNA試料から二本鎖cDNAを作製した。単一細胞mRNA試料を96ウェルプレートのウェルに分散させ、単一細胞mRNA試料から第1鎖を合成するために、各ウェルにおいて、T細胞レセプター(TCR)dTプライマーと逆転写酵素(RT)とを使用した。RTのターミナルトランスフェラーゼ活性によって、合成された第1鎖をテーリングした。そのテール付きヌクレオチドにSMART−Seq Indexed Oligonucleotideをハイブリダイズさせて、RTのテンプレートスイッチングと、合成された第1鎖の伸長とを行い、SMART−Seq Indexed Oligonucleotideをテンプレートとするインデックスとプレ増幅PCRプライマー結合部位配列とを含めた。
配列差解析用シークエンシングライブラリーの調製は、5’末端捕捉によって行った。簡潔に述べると、TnRP1トランスポゾン及びTnPR2トランスポゾンとTn5トランスポザーゼとを用いて、産物二本鎖cDNAをタグメンテーションした。タグメンテーションによって、完全5’末端(すなわち、インデックスとプレ増幅PCRプライマー結合部位配列が保持されている5’末端)と、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインが導入されたタグメンテーション済み3’末端とを有する産物二本鎖cDNA断片が得られた。2つの5’末端捕捉プライマー、すなわち、プレ増幅PCRプライマー結合部位配列にハイブリダイズする第1のプライマー(「5’末端捕捉プライマー1」)と、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズする第2のプライマー(「5’末端捕捉プライマー2」)とを用いて、タグメンテーション済み5’断片を増幅し、シークエンシングアダプター配列を導入した。第1のプライマー(「5’末端捕捉プライマー1」)は、P7、i7、Read2及びSMART配列を含んでいた。第2のプライマー(「5’末端捕捉プライマー2」)は、P5、i5及びTn Read1配列を含んでいた。増幅後、ライブラリーが完成し、シークエンシングできる状態となった。
TCRプロファイリング解析用のTCR特異的ライブラリーの調製は、チューブ内で、TCR特異的増幅と、配列アダプターの付加とを用いて行った。TCR特異的増幅は、SMART Primer1(Read2配列とSMART配列を含む)と、ヒトTCRアルファ/ベータ鎖定常領域に特異的なプライマー(「TCRa/b Human Primer1」)とを用いて行った。増幅の第1ラウンド(「PCR 1」)では、SMART Primer1はプレ増幅PCRプライマー結合部位配列にハイブリダイズし、TCRa/b Human Primer1はTCRアルファ/ベータ鎖定常領域にハイブリダイズした。増幅の第2ラウンド(「PCR2」)は、TCR Primer2 Forward HT Index(Read2配列にハイブリダイズし、P7配列及びi7配列を導入する)と、TCR a/b Human Primer2 Reverse HT Index(増幅TCRアルファ/ベータ定常領域配列にハイブリダイズし、Read1配列、i5配列及びP5配列を導入する)を用いて行った。増幅後、ライブラリーが完成し、シークエンシングできる状態となった。
単一細胞を96ウェルプレートの個々のウェル内の溶解バッファーにソーティングした。続いて、そのプレート(横列ごとにユニークインデックス付きSMART−Seqオリゴヌクレオチドを含む(A〜H、図7))に、逆転写試薬を加えた。そのプレートの各ウェルで、RTとプレ増幅PCR工程を行い、縦列ごとに産物をプールし、そのcDNA分子の由来元である個別の細胞に従ってバーコードを付与したcDNA分子の混合物をそれぞれ含む12個のプールを得た。その後のライブラリー構築工程は、(以下にさらに詳細に説明されているように、)12個のプールのそれぞれに対して行い、調製する必要があるライブラリーの数を96個から12個に減少させた。バーコードを含めることにより、各プールにおいて、シークエンシングデータのデマルチプレックスが可能になり、それにより、TCR−α及びTCR−βサブユニットにおいて、単一細胞の分解と、配列情報の対合とが可能になる。
a.2つのプライマーの媒介によるcDNA合成
マルチサンプルナノディスペンサー(MSND)形状でも、単一細胞TCRプロファイリングを試験した。WaferGen(Fremont,CA)ICELL8(登録商標)MSNDシステムを用いて、細胞と試薬とをナノリットルの体積で、ICELL8(登録商標)チップのウェルに分注した。ワークフローは概して、図10に概説されている。
図12A〜12Dには、上記実施例の変形形態のうち、ICELL8(登録商標)MSNDシステムを用いてcDNAを作製する際に、単一のプライマーを使用し、さらに、そのcDNAを本発明の実施形態に従って用いる変形形態が例示されている。上記の実施例3aにおけるように、WaferGen(Fremont,CA)ICELL8(登録商標)MSNDシステムを用いて、細胞と試薬とをナノリットルの体積で、ICELL8(登録商標)MSNDチップのウェルに分注する。
1.リボ核酸(RNA)試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法であって、
(a)テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、産物二本鎖cDNAをRNA試料から作製することと、
(b)作製した産生二本鎖cDNAを第1の反応混合物と第2の反応混合物とに分割することと、
(c)産生二本鎖cDNAを末端捕捉して、発現ライブラリーを第1の反応混合物から作製し、産物二本鎖cDNAの免疫細胞特異的cDNAを増幅して、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを第2の反応混合物から作製することと
を含む、方法。
2.末端捕捉と増幅とを同時に行う、付記1に記載の方法。
3.末端捕捉と増幅とを順次に行う、付記1に記載の方法。
4.RNA試料を細胞試料から得る、付記1〜3のいずれかに記載の方法。
5.RNA試料を単一細胞から得る、付記1〜3のいずれかに記載の方法。
7.単一細胞はB細胞である、付記5に記載の方法。
8.分割の前に、複数の単一細胞RNA試料から作製した産物二本鎖cDNAをプールすることをさらに含む、付記5〜7のいずれかに記載の方法。
9.産物二本鎖cDNAを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、産物二本鎖cDNAの作製元である単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、付記5〜8のいずれかに記載の方法。
10.プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、付記9に記載の方法。
12.セルソーターを用いて、単一細胞を単離することをさらに含む、付記11に記載の方法。
13.セルソーターはフローサイトメーターである、付記12に記載の方法。
14.セルソーターはマルチウェルベースのシステムである、付記12に記載の方法。
15.発現ライブラリーは、5’末端ライブラリーである、付記1〜14のいずれかに記載の方法。
17.発現ライブラリーと、免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとをシークエンシングすることをさらに含む、付記1〜16のいずれかに記載の方法。
18.シークエンシングした発現ライブラリーの発現差解析をさらに含む、付記17に記載の方法。
19.発現差解析は全トランスクリプトーム解析(WTA)を含む、付記18に記載の方法。
20.発現差解析はターゲット発現解析を含む、付記18または19に記載の方法。
22.免疫細胞レセプター特異的cDNAは、免疫細胞レセプター配列の5’末端を含む、付記1〜21のいずれかに記載の方法。
23.免疫細胞レセプター特異的cDNAは、完全長免疫細胞レセプター配列を含む、付記1〜22のいずれかに記載の方法。
24.増幅作業は、第2の反応混合物と、5’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、付記1〜23のいずれかに記載の方法。
25.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの1つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、付記24に記載の方法。
27.1つ以上の鎖は、TCR−α鎖、TCR−β鎖またはこれらの両方である、付記25または26に記載の方法。
28.免疫細胞レセプターは、B細胞レセプター(BCR)である、付記25に記載の方法。
29.1つ以上の鎖は、免疫グロブリン鎖である、付記25または28に記載の方法。
30.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記24〜29のいずれかに記載の方法。
32.5’増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記24〜31のいずれかに記載の方法。
33.末端捕捉は、第1の反応混合物と末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記1〜32のいずれかに記載の方法。
34.末端捕捉は、5’末端捕捉を含む、付記33に記載の方法。
35.5’末端捕捉は、第1の反応混合物と5’末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記34に記載の方法。
37.末端捕捉は、3’末端捕捉を含む、付記33に記載の方法。
38.3’末端捕捉は、第1の反応混合物と3’末端増幅プライマーとを接触させることを含む、付記37に記載の方法。
39.3’末端増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記38に記載の方法。
40.末端捕捉は、タグメンテーションを行って、タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを産物二本鎖cDNAに付加することを含む、付記1〜39のいずれかに記載の方法。
42.タグメンテーションは、産物二本鎖cDNAとTn5トランスポザーゼとを接触させることをさらに含む、付記40または41に記載の方法。
43.産物二本鎖cDNAを作製することは、産物二本鎖cDNAを生成するために十分な条件下で、
RNA試料と、
第1鎖相補デオキシリボ核酸(cDNA)プライマーと、
3’ハイブリダイゼーションドメイン及び5’アダプター配列結合ドメインを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと、
逆転写酵素と、
dNTPと
を反応混合物において混ぜ合わせることを含む、付記1〜42のいずれかに記載の方法。
44.単一細胞のゲノムDNA(gDNA)をシークエンシングすることをさらに含む、付記1〜43のいずれかに記載の方法。
45.単一細胞のgDNAを、シークエンシングの前に単離することをさらに含む、付記44に記載の方法。
47.免疫座特異的シークエンシングは、T細胞レセプター(TCR)座特異的シークエンシングを含む、付記46に記載の方法。
48.免疫座特異的シークエンシングは、B細胞レセプター(BCR)座特異的シークエンシングを含む、付記46または47に記載の方法。
49.単一細胞のgDNAをシークエンシングすることは、全ゲノムシークエンシングを含む、付記44〜48のいずれかに記載の方法。
50.発現ライブラリーは、完全長発現ライブラリーである、付記1〜49のいずれかに記載の方法。
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、
末端増幅プライマーと
を含むキット。
52.ポリ(dT)プライマーをさらに含む、付記51に記載のキット。
53.5’増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記51または52に記載のキット。
54.5’増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記51〜53のいずれかに記載のキット。
55.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記51〜54のいずれかに記載のキット。
57.末端増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記51〜56のいずれかに記載のキット。
58.末端増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記51〜57のいずれかに記載のキット。
59.末端増幅プライマーは、5’末端増幅プライマーである、付記51〜58のいずれかに記載のキット。
60.末端増幅プライマーは、3’末端増幅プライマーである、付記51〜58のいずれかに記載のキット。
62.5’増幅プライマーは、5’アダプター配列またはその相補体を含む、付記61に記載のキット。
63.末端増幅プライマーは、5’アダプター配列またはその相補体を含む、付記61または62に記載のキット。
64.5’増幅プライマーの5’部分と同一の配列を含む第2の5’増幅プライマーを含む、付記51〜63のいずれかに記載のキット。
65.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの部分と同一の配列を含む第2の免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーを含む、付記51〜64のいずれかに記載のキット。
67.その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの3’部分である、付記65に記載のキット。
68.タグメンテーション反応を行うための1つ以上の成分をさらに含む、付記51〜67のいずれかに記載のキット。
69.タグメンテーション反応を行うための1つ以上の成分は、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインを含むトランスポゾン核酸、
タグメンテーション後増幅プライマー結合ドメインにハイブリダイズするタグメンテーション後増幅プライマー、
トランスポザーゼまたは
これらを組み合わせたもの
を含む、付記68に記載のキット。
70.トランスポザーゼは、Tn5トランスポザーゼである、付記69に記載のキット。
(a)複数の各単一細胞からRNA試料を単離することと、
(b)テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、RNA試料からインデックス付き産物二本鎖cDNAを作製することと、
(c)作製したインデックス付き産物二本鎖cDNAをプールすることと、
(d)インデックス付き産物二本鎖cDNAの免疫細胞特異的cDNAを増幅して、単一細胞インデックス付き免疫細胞特異的cDNAを含む免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
を含む方法。
72.単一細胞は、T細胞である、付記71に記載の方法。
73.単一細胞は、B細胞である、付記71に記載の方法。
74.インデックス付き産物二本鎖cDNAを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、付記71〜73のいずれかに記載の方法。
75.プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、付記74に記載の方法。
77.インデックス付き免疫細胞レセプター特異的cDNAは、免疫細胞レセプター配列の5’末端を含む、付記71〜76のいずれかに記載の方法。
78.インデックス付き免疫細胞レセプター特異的cDNAは、完全長免疫細胞レセプター配列を含む、付記71〜77のいずれかに記載の方法。
79.増幅は、プールしたインデックス付き産物二本鎖cDNAと、5’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、付記71〜78のいずれかに記載の方法。
80.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの1つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、付記79に記載の方法。
82.1つ以上の鎖は、TCR−α鎖、TCR−β鎖またはこれらの両方である、付記81に記載の方法。
83.免疫細胞レセプターは、B細胞レセプター(BCR)である、付記80に記載の方法。
84.1つ以上の鎖は、免疫グロブリン鎖である、付記83に記載の方法。
85.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記79〜84のいずれかに記載の方法。
87.5’増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記79〜86のいずれかに記載の方法。
88.単一細胞を生体試料から得る、付記79〜87のいずれかに記載の方法。
89.セルソーターを用いて、単一細胞を単離することをさらに含む、付記88に記載の方法。
90.セルソーターは、フローサイトメーターである、付記89に記載の方法。
92.単一細胞のゲノムDNA(gDNA)をシークエンシングすることをさらに含む、付記71〜91のいずれかに記載の方法。
93.単一細胞のgDNAを、シークエンシングの前に単離することをさらに含む、付記92に記載の方法。
94.単一細胞のgDNAをシークエンシングすることは、免疫座特異的シークエンシングを含む、付記92または93に記載の方法。
95.免疫座特異的シークエンシングは、T細胞レセプター(TCR)座特異的シークエンシングを含む、付記94に記載の方法。
97.単一細胞のgDNAをシークエンシングすることは、全ゲノムシークエンシングを含む、付記92〜96のいずれかに記載の方法。
98.免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、付記71〜97のいずれかに記載の方法。
99.5’アダプター配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
5’アダプター配列を含む5’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと
を含むキット。
100.テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、インデックス付与配列を含む、付記99に記載のキット。
102.5’増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記99〜101のいずれかに記載のキット。
103.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、インデックス付与配列を含む、付記99〜102のいずれかに記載のキット。
104.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記99〜103のいずれかに記載のキット。
105.キットは、ポリ(dT)プライマーを含む、付記99〜104のいずれかに記載のキット。
107.第2の5’増幅プライマーを含む、付記99〜106のいずれかに記載のキット。
108.第2の5’増幅プライマーは、1つ以上のシークエンシングプラットフォームアダプターコンストラクトを含む、付記107に記載のキット。
109.第2の5’増幅プライマーは、5’増幅プライマーの5’部分と同一の配列を含む、付記107または108に記載のキット。
110.第3の5’増幅プライマーをさらに含む、付記107〜109のいずれかに記載のキット。
112.第3の5’増幅プライマーは、第2の5’増幅プライマーの5’部分と同一の配列を含む、付記110または111に記載のキット。
113.第2の5’増幅プライマーは、5’増幅プライマーに結合された5’ノンテンプレート配列に存在するプライマー結合部位にハイブリダイズする配列を含む、付記107または108に記載のキット。
114.免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの部分と同一の配列を含む第2の免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーを含む、付記99〜113のいずれかに記載のキット。
115.その部分は、免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーの5’部分である、付記99〜114のいずれかに記載のキット。
本願は、米国特許法第119(e)条に従い、2017年2月16日に出願した米国特許仮出願第62/459,858号の出願日に基づく優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は、参照により本明細書に援用される。
Claims (15)
- リボ核酸(RNA)試料から発現ライブラリーと免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーとを調製する方法であって、
(a)テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、RNA試料から産物二本鎖cDNAを作製することと、
(b)作製した産物二本鎖cDNAを第1の反応混合物と第2の反応混合物とに分割することと、
(c)前記産物二本鎖cDNAを末端捕捉して、前記第1の反応混合物から発現ライブラリーを作製し、前記産物二本鎖cDNAの免疫細胞特異的cDNAを増幅して、前記第2の反応混合物から免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
を含む、方法。 - 前記RNA試料を細胞試料から得る、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA試料を単一細胞から得る、請求項2に記載の方法。
- 前記単一細胞は、T細胞またはB細胞である、請求項3に記載の方法。
- 複数の単一細胞RNA試料から作製した産物二本鎖cDNAを、前記(b)での分割前にプールすることをさらに含む、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記産物二本鎖cDNAを作製する際に用いるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、前記産物二本鎖cDNAの作製元である単一細胞を特定するインデックス付与配列を含む、請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーまたはオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドである、請求項6に記載の方法。
- 前記発現ライブラリーと前記免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記前記(c)での増幅は、前記第2の反応混合物と、5’増幅プライマー及び免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーとを接触させることを含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーは、免疫細胞レセプターの1つ以上の鎖の定常領域に特異的にハイブリダイズする、請求項9に記載の方法。
- 前記免疫細胞レセプターは、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)である、請求項10に記載の方法。
- 前記産物二本鎖cDNAを作製することは、前記産物二本鎖cDNAを生成するために十分な条件下で、
前記RNA試料と、
第1鎖相補的デオキシリボ核酸(cDNA)プライマーと、
3’ハイブリダイゼーションドメイン及び5’アダプター配列結合ドメインを含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドと、
逆転写酵素と、
dNTPと
を反応混合物において混ぜ合わせることを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。 - 5’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと、
末端増幅プライマーと
を含む、キット。 - 複数の単一細胞から免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを調製する方法であって、
(a)前記複数の各単一細胞からRNA試料を単離することと、
(b)テンプレートスイッチング逆転写反応を用いて、前記RNA試料からインデックス付き産物二本鎖cDNAを作製することと、
(c)作製したインデックス付き産物二本鎖cDNAをプールすることと、
(d)前記インデックス付き産物二本鎖cDNAの免疫細胞特異的cDNAを増幅して、単一細胞インデックス付き免疫細胞特異的cDNAを含む免疫細胞レセプターレパートリーライブラリーを作製することと
を含む、方法。 - 5’アダプター配列を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
前記5’アダプター配列を含む5’増幅プライマーと、
免疫細胞レセプター特異的増幅プライマーと
を含む、キット。
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